Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генотоксические эффекты 2,4,6-тринитротолуола и его метаболитов: роль процессов биотрансформации

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генотоксические эффекты 2,4,6-тринитротолуола и его метаболитов: роль процессов биотрансформации"

На правах рукописи

ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ 2,4,6 - ТРИНИТРОТОЛУОЛА И ЕГО

МЕТАБОЛИТОВ: РОЛЬ ПРОЦЕССОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ

03. 00. 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

Л

и

Л

У

КАЗАНЬ -1996

Рабата выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферменто Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

академик АН РТ, доктор биологических наук, профессор И.Б. Лещинская

кандидат биологических наук, доцент О.Н. Ильинская

доктор медицинских наук, доцент В.В. Семенов (Казанский государственный медицинский институт)

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник АЛ. Еремина

(Институт экологии и генетик» микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь)

Ведущая организация: Институт общей генетики

им. Н.И. Вавилова РАН, ]-. Москва

Защита диссертации состоится "¿2 " 1996 г. в часов на заседай!

диссертационнго Совета К 053.29.19. при Казанском государствен» университете им. В.И. Ульянова-Ленина, 420008 г. Казань, ул. Ленина, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственно университета

Автореферат разослан и 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат биологических наук А.Н. Аскаро

_____________________________________________________ВВЕДЕНИЕ_________________________________________

Актуальность темы. Одной из важнейших проблем современности является загрязнение окружающей среды факторами, способными оказывать негативное влияние на генетический аппарат клеток. Особый риск представляют собой химические соединения в силу их разнообразия и специфичности генотоксическото действия.

2,4,6-Тршпггротолуол (ТНТ) - представитель класса ароматических нитросоединсний, используемый при производстве взрывчатых веществ. ТНТ относится к числу опасных и труднодоступных для биодеградации неприродных соединений. В настоящее время хорошо изучены некоторые закономерности микробного метаболизма ТНТ, что обусловлено поиском эффективных путей биодеструкции данного соединения (Наумова, 1985; Kaplan, 1992; Prcuss et al., 1993; Marvinsikkcma and Debont, 1994). Установлено, что ТНТ оказывает выраженное токсическое действие на организмы разного уровня, может вызывать тяжелые осложнения и нарушения некоторых физиологических функций у млекопитающих (Levine et ut. 1990, Ryoii uni Ross, 1930). Несмотря на то, что имеются отдельные факты, свидетельствующие о способности ТНТ индуцировать мутации в Salmonella typhimurium (Won et al., 1976; Spanggord et al., 1982, Tan ei al., 1992), природа генотоксическото действия данного . соединения изучена недостаточно.

Представляет значительный интерес оценка роли ферментных

реакций, вовлеченных в метаболизм ТНТ, в генотоксичности данного соединения. Особого внимания заслуживает исследование мутагенной активности отдельных интермедиатов биотрансформации ТНТ.

Практически неизученным остается вопрос об участии репаративных систем клетки, и в особенности "ошибочной" SOS-репарации, в мутагенном действии ТНТ.

На сегодняшний день имеется лишь ограниченное число противоречивых по своему характеру данных, касающихся генотоксичности ТНТ в клетках млекопитающих, хотя необходимость такой информации для понимания механизмов биологических эффектов ТНТ очевидна.

Цель и задачи исследования

Данная работа проведена с целью оценки генотоксическо) потенциала ТНТ в динамике бактериальной трансформации характеристики генотоксического действия ряда его метаболитов в серн тест-систем in vitro и in vivo.

Б соответствии с поставленной целью были определены следую 1Щ задачи:

1. Изучить характер трансформации ТНТ клетками S. typhimurium.

2. Оценить мутагенный потенциал ТНТ и его метаболитов i тестерных штаммах S. typhimurium.

3. Изучить динамические изменения мутагенной активности ТНТ процессе бактериального метаболизма.

4. Исследовать роль бактериальных нитроредуктаз, ацетилтрансфераз цитохром P-450-зависимой системы ферментов млекопитающих мутагенезе, индуцируемом ТНТ в S. typhimurium.

5. Определить способность ТНТ и его метаболитов индуцировать SOÍ ответ в клетках Е. сой.

6. Изучить возможность генотоксического действия ТНТ в клепа млекопитающих в системе in vivo.

Научная новизна работы- Впервые изучена динамика процес< трансформации ТНТ клетками S. typhimurium. Показано, что метаболически активность тестерных штаммов ТА 100 и ТА 98 существенно отличается с таковой у штаммов, дефектных по "классическим" нитроредуктазам (ТА 1( NR) и О-ацетилтрансфсразе (ТА 100/1,8 DNPg). Изучен характер начальнь этапов трансформации ТНТ клетками тестерных штаммов S. typhimurium, качестве мажорного метаболита идентифицирован 2-амино-4,< динитротолуол. Оценена способность клеток различных штаммов , typhimurium сорбировать (поглощать) ТНТ, доказана обусловленность это] процесса метаболической активностью тестерных штаммов и, в частносп активностью ферментов нитроредукции.

Установлено, что ключевую роль в мутагенезе, индуцируемом ТНТ клетках S. typhimurium, играют "классические" нитроредуктазы и ( ацетилтрансфераза.

Проведена сравнительная оценка мутагенной активности гол идентифицированных интермедиатов бактериального метаболизма ТН'

Впервые оценена генотоксическая активность безазотистого метаболита-----------

ТНТ фенолышй природы------фяорогяющша. Установлено, что среди

»дезинфицированных производных ТНТ генотоксический эффект наиболее выражен у 2-амино-4,6-динитротолуола - мажорного метаболита начальных этапов трансформации ТНТ клетками S. typhimurium. ■

Впервые показано, что ТНТ и его метаболиты не проявляют выраженной SOS-индуцирующей активности в клетках Е. coli PQ 37. Таким образом, мутагенез, индуцируемый ТНТ в клетках бактерий, можно рассматривать как гес Л-незшшснмый.

С помощыо млхроядерного теста In vivo получены новые результаты, свидетельствующие о возможности генотоксического действия ТНТ в организме млекопитающих.

Практическая ценность работы. Результаты исследования гснотоксичности ТНТ и его производных позволяют дать конкретные рекомендации по прогнозированию генетической опасности данных соединений и могут быть использованы при обосновании подходов к разработке практических методов, направленных на ограничение генотоксических эффектов аромалпеских тиросоединений.

Проведенные исследования вносят практический вклад в методику тестирования потенциальных мутагенов, подчеркивая необходимость знаний о биотрансформации исследуемого соединения в оценке его генотоксического потенциала.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на VII Межреспубликанской Научной Конференции ВУЗов '"Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений" (Казань, 1994), на I Республиканской Научной Конференции "Актуальные экологические проблемы республики Татарстан" (Казань, 1995), па Итоговой Научной Конференции КГУ (1995), на VII Европейском Конгрессе по Биотехнологии (Франция, Ницца, 1995), на Международном Симпозиуме "Beijerinck Centennial. Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications" (Нидерланды, Гаага, 1995), на Международной конференции "Environmental Pollution (ICEP* 95) (Санкт-Петербург, 1995).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследуемые соединения, ТНТ получен из Научно-производственного объединения "Азот" (г. Казань). Для дополнительной очистки ТНТ перекристаллизовывали из этанола. Чистоту соединения контролировали ТСХ и по ИК-спекгру поглощения (Stewart et al., 1986). 2-Амино-4,б-дшштротолуол (2АДНТ), 4 - амин о-2,6-динитротголуол (4АДНТ), 2,4-диамино-6-нитротолуол (2,4-ДАШТ) предоставлены Лабораторией Экологической Биотехнологии КГУ (г. Казань). Флороглюцин (ФГ), пирогаллол (ПГ) - производства Serva, FRG4

Бактериальные штаммы. В работе использованы тестерные штаммы S. typhirnurium ТА 98 (hisD3052 tfa AuvrB bio " pKm 101) и ТА 100 (hisD3052 ifa AuvrB bio - pKm 101), полученные из Института по БИХС, г. Купавна; ТА IOONR (дефектен по "классическим" нитроредуктазам), ТА 100/1,8DNP6 (дефектен по £>-ацетилтрансферазе), любезно предоставленные Dr. Н. Hayatsu, Okayama University, Japan; E. coli PQ 37 (F" thr leu his-4 pyrD galE galK or galT lacAU169 srl300::Tnl0 rpoB tpsL uvrA rfa trp::Muc+ sfiA::Mud (Ap,lac)cts), wp 2 (trp- E), pol k~(trp~ 65 sul malB polA), uvr A-(trp'65 sul uvrAISS), lex A- (C 561 trp' E lex A), tec A" (trp- 65, rec А), полученные из ГосНИИ Генетики, г. Москва.

При изучении трансформации ТНТ клетки S. typhirnurium экспоненциальной фазы роста (концентрация клеток 108 - 109 кл/мл) инкубировали в минеральной среде на основе солевого концетрата (Stm) (Фонютейн с соавт., 1985): 100 мл Stm, разбавленного дистиллированной водой 1:1, 0.4 мл 2% раствора MgS04, 5 мл 40% раствора глюкозы. Определение ТНТ в культуральной жидкости проводили по методу, описанному Лурье и Рыбниковой (1974). Для определения ариламйнов использовали колориметрический метод, основанный на цветной реакции ариламинов с /»-диметиламинобензальдегидом (Наумова с соавт., 1986). Идентификацию метаболитов ТНТ осуществляли методоми ТСХ на пластинках "Silufol UV-254" и ИК-спектроскопии эфирных экстрактов культуральной жидкости. ИК-спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Specord М 80, совмещенном с компьютером PC/AT.*

* - Работа выполнена совместно с профессором А.И. Фишманом и доцентом А. И. Скворцовым (кафедра общей физики Казанского государственного университета).

Тест Эймса и тест SalmoneHa/мпкросошл проводили согласно методическим указаниям Maron and Ames (1983) на штаммах S. typhimurium ТА 98, ТА 100, ТА 100NR и ТА 100/1,8DNP6. Для метаболической активации in vitro использовали шпсросомную активирующую смесь (MAC) на основе S9 фракции печени крыс и планеты человека, предоставленных Институтом экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь. О мутагенной активности судили по кратности превышения числа his+ ревертантов, индуцированных исследуемым соединением над спонтанным фоном мутирования (более чем в два раза) и наличию дозо-зависимого эффекта.

SOS-хромотедт. SOS-тадуцирующую активность исследуемых соединений изучали на штамме Е. coli PQ 37 по методу, описанному Quillardet and Hofnung (1985). SOS-ответ, индуцируемый исследуемым соединением, расценивали как положительный при наличии дозо-зависимого эффекта и факторе индукции SOS-ответа IF > 1.5.

Гест на ЛНК-поврсждающую активность основан на сравнительной оценке выживаемости штамма Е. coli wp 2 и дефектных по ферментам репарации штаммов pol A", rec A", lex A", uvr А-. В работе использована суспензионная модификация теста. О ДНК-повреждающей активности исследуемого соединения судили по индексу выживаемости, I, представляющему собой отношение выживаемости мутанттшх бактерий к выживаемости бактерий дикого типа в % (Абилев и Порошенко, 1986).

Микроялерный тест на эритроцитах периферической крови мышей СВАхС5713 L/G проводили согласно методическим указаниям, описанным Shmid (1975), Журковым с соавт. (1986).

Статистическая обработка результатов. Результаты теста Эймса обрабатывали с помощью программы "AMES", разработанной А.Н. Ильинским для персональных компьютеров. Статистическую обработку результатов остальных экспериментов проводили согласно общепринятым методам (Плохинский, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Трансформация ТНТ тестерными штаммами S. typhimurJum.

Для изучения процесса трансформации ТНТ клетками S. typhimurium использованы штаммы ТА 100, ТА 98, 100NR, ТА 100/1,8 DNP6. Выбор

штаммов был обусловлен их применением в качестве тсст-обьектов при исследовании мутагенной активности ТНТ.

Как видно из рис. 1А, тестерные штаммы ТА 100 и ТА 98 за 3 часа инкубации трансформируют до 95 % ТНТ (исходная концентрация 100 мкг/мл). При этом в среде культивирования происходит постепенное накопление ариламинов (рис. 1Б).

Б

60 90 120 Время, мин.

60 90 120 150 180 Время, иин.

Рис. 1 Динамика трансформации ТНТ (исходная концентрация 100 мкг/мл) (А) и образования ариламинов (Б) тесгерными штаммами S. typhimurium ТА 98 Л- ), ТА 100 (~ о~ ), ТА 100 NR

( — •—), ТА 100/1,8 DNP6(-А- ).

Штамм ТА 100NR, дефектный по "классическим" нитроредукгазам, трансформировал лишь около 30 %, а штамм ТА 100/1,8 DNP6 около 50 % ТНТ, содержащегося в инкубационной среде (рис. 1А). Концентрация образующихся ариламинов была очень низкой и составляла всего 1-2 мкг/мл (рис. 1Б). В ИК-спектрах экстрактов культур альной жидкости при инкубации клеток штаммов ТА 100NR и ТА 100/1,8 DNP6 с ТНТ интенсивные полосы поглощения, характерные для ТНТ (705, 719, 735, 760, 768, 794 см"1 - рис.2а), сохранялись в течение всего периода инкубации. Полученные результаты доказывают необходимость участия ферментог нитроредукции в метаболизме ТНТ клетками S. typhimurium.

Как видно из рис. 3, ИК-спектры экстрактов культур альной жидкости в динамике биотрансформации ТНТ штаммом S. typhimurium ТА 1(К характеризуются наличием полос поглощения, соответствующих 2АДН1 (рис. 26). Таким образом, трансформация молекулы ТНТ клетками

а

б

Рис. 2 ИК-спектры: а- ТНТ, б - 2АДНТ, в - 4АДНТ.

0.55

0.5

и 0.45

с * В о 0.4

о 3 0.35

0.3

«г

<г 8

к &

0.4

2 й

т о

8 о 0.3

| 8 0.25 О ® 0.2

0.15

0.3

Рис. 3 ИК-спехтры эфирных экстрактов культуралькой жидкости в динамике трансформации ТНТ клетками тесгерного штамма .У. ¡урЫтипит ТА 100. (а - 5 мин., б- 20 мин., в - 40 мин., г - 60 мин.)

S. typhimurium начинается с восстановления нитрогруппы в о-положении. 2АДНТ является мажорным метаболитом первых этапов биотрансформации ТНТ клетками S. typhimurium, хотя качественный анализ эфирного экстракта культуралкной жидкости методом ТСХ позволил выявить образование еще двух метаболитов, R/ которых соответствовали 4АДНТ и 2,4ДА6НТ. Наши результаты находятся в согласии с данными других авторов, свидетельствующими о преобладании 2АДНТ по сравнению с другими аминопроизводными, образующимися при метаболизме ТНТ Е. coli (Наумова с соавт., 1983), Pseudomonas denitrißcans (Наумова с соавт., 1982), Phanemchccle chrysosporium (Stahl and Aust, 1993).

2. Мутагенная активность ТНТ на SL typhimurjum. роль

метаболизирующих ферментов Исследование мутагенной активности ТНТ на тестерных штаммах S. typhimurium ТА 98 и ТА 100 показало, что соединение индуцирует генные мутации типа замены пар оснований и сдвига рамки считывания, вызывая значительное дозо-зависимос превышение над спонтанным фоном мутирования: до 5 раз на штамме ТА 98 и 11 раз на штамме ТА 100 (рис. 4).

ТА 98 ТА 100

Рис.4 Мутагенная активность ТНТ на штаммах S. typhimurium ТА 98 и ТА 100 (1). К-контроль; концентрации ТНТ: 0.1, 1, 10, 100 мкг/чашку. 2 - Вариант с метаболической активацией in vitro MAC на основе S9 фракции печени крыс. * - Р< 0.05, ** - Р < 0.001.

Полученные результаты, характеризующие мутагенный эффект ТНТ на S. typhimurium, согласуются с данными других авторов (Won et ah, 1976; Spanggord et a!., 1982; Tan et al, 1992).

Известно, что важную роль в метаболизме ксенобиотиков в организме млекопитающих играет цитохром P-450-зависимая система ферментов. Для выяснения значения данной системы в мутагенном действии ТНТ нами был изучен эффект ТНТ на тестерных штаммах S. typhimurium в присутствии микросомной активирующей смеси (MAC) на основе S9 фракций печени крыс и плаценты человека. Установлено, что S9 фракция плаценты человека практически не модифицирует мутагенный потенциал ТНТ (число колоний his+ ревертантов, индуцированных ТНТ в концентрации 100 мюг/чашку в 3.86 раза превышает спонтанный фон мутирования для штамма ТА 98 и в 10.8 раз для штамма ТА 100). В то же время MAC на основе S9 фракции печени крыс значительно снижает мутагенную активность исследуемого соединения (рис,4).

Таким образом, трансформация ТНТ микросомными ферментами млекопитающих в системе in vitro не сопряжена с образованием более мутагенных интермедиатов ТНТ, напротив, некоторые ферментные реакции вероятно даже способствуют инактивации исходного соединения или продуктов его бактериального метаболизма. Обнаруженные нами различия в степени ингибирования мутагенного эффекта ТНТ S9 фракциями печени крыс и плаценты человека очевидно обусловлены видовыми и тканевыми различиями в метаболизме ксенобиотиков.

Далее нами был изучен эффект ТНТ на штаммах S. typhimurium ТА 100NR и ТА 100/1,8DNP6, дефектных соответственно по "классическим" нитроредуктазам и О-ацетилтрансферазе - ферментам, играющим важную роль в метаболизме нитроаренов (Rosenkranz et al, 1982; McCoy et al., 1983). ТНТ в исследованном диапазоне концентраций не проявил мутагенного эффекта на штамме ТА 100NR. Штамм ТА 100/1,8 DNPg также был нечувствителен к действию ТНТ. Число колоний his+ ревертантов, индуцированных ТНТ, практически не превышало спонтанный фон мутирования (рис.5). Полученные результаты доказывают вовлеченность бактериальных нитроредуктаз и ацетилтрансфераз в генотоксическое действие ТНТ.

MAC на основе S9 фракции печени крыс не модифицировала эффект ТНТ на нггаммах S. typhimurium ТА 100NR и ТА 100/1,8 DNP6 (рис. 5), что еще раз свидетельствует о превалирующей роли бактериальных ферментов в метаболической активации данного соединения. В связи с этим

представлялось интересным оценить мутагешгуто активность ТНТ в динамике бактериальной трансформации.

350

& 300

+ и

3 50 ■

О ----,-1-,

0 0.1 1 10 100 ТНТ, нот/чашку

Рис. 5 Эффект ТНТ на штаммах гурЫтипит ТЛ 100 N11 (— « —) и ТЛ 100/1,8 (— А— ) без метаболической активации и в

присутствии S9 фракции печени крыс: ТА 100 N1^. (—— о — ), ТА 100/1,8 ОКР6 (— Л — ).

Нами установлено, что мутагенный эффект культуралыюй жидкости при культивировании клеток тестерного штамма ТА 100 (урМтипит в присутствии ТНТ имеет тенденцию к повышению. В условиях наших экспериментов пик активности наблюдался через 80-100 мин. после начала инкубации. Далее происходит некоторое снижение мутагенной активности. Такое изменение генотоксического эффекта культуральной жидкости, очевидно обусловлено качественным и количественным соотношением интермедиатов, образующихся при метаболизме ТНТ.

3. Сравнительная оценка мутагенной активности метаболитов ТНТ.

В работе исследована мутагенная активность трех аминопроизводцых ТНТ: 2АДНТ, 4АДНТ, 2,4ДА6НТ и двух метаболитов ТНТ фенольной природы: флороглюцина (ФГ) и пирогаллола (ПГ).

Как отмечалось выше, 2АДНТ является преобладающим метаболитом начальных этапов трансформации ТНТ ¡урМтипит. В связи с этим,

представлялось особенно важным изучение возможности генотоксическогс действия данного соединения.

2АДНТ в тесте Эймса вызывал значительное превышение числа колоний his+ ревертантов над спонтанным фоном мутирования тестерньга бактерий: до 11 раз на штамме ТА 98 и до 14 раз на штамме ТА 100 (рис. 6). Обнаруженный эффект носит дозо-зависимый характер. В наивысшей из исследованных концентраций (100 мкг/чашку) наблюдается некоторое снижение мутагенной активности 2АДНТ, что обусловлено токсическим действием соединения на тестерные штаммы. Интересно отметить, что MAC на основе S9 фракции печени крыс значительно снижала обнаруженный мутагенный эффект 2АДНТ.

2 АД НТ,мкг/чашку

Рис. 6 Мутагенная активность 2АДНТ на штаммах

S. typhimurium ТА 98 (-А-), ТА 100 (-•-) без

метаболической активации in vitro и в присутствии S9 фракции печени крыс: ТА 98 ( Д ), ТА 100 ( о ).

В отличие от 2АДНТ, продукт восстановления нитрогругаш в р-иоложении - 4АДНТ оказывал лишь незначительный мутагенный эффект на штаммы S. typhimurium независимо от присутствия MAC.

Результаты исследования 2,4ДА6НТ в ' тестах Эймса и Salmonella/мшросомы показывают, что соединение в исследованном диапазоне концентраций ивдуцирует генные мутации в S. typhimurium -среднее число his+ ревертантов превышало спонтанный фон мутирования до 3-х раз, что свидетельствует о слабой мутагенной активности соединения. MAC способствовала инактивации исследуемого соединения -

в данном варианте мы не наблюдали выраженного мутагенного эффекта 2ДДА6НТ.

Исследование мутагенной активности ПГ и ФГ представляло особый интерес, поскольку эти соединения, в отличие от предыдущих, являются безазотистыми метаболитами ТНТ. Возможность образования данных мстоболшов была показана при исследовании биодеструкции ТНТ нггаммом Pseudomonas fluorescens В-3468 (Наумова с соавт., 1988) и Phanerochaete dirysoiporium (Flink et al., 1993).

Результаты наших исследований показывают, что ФГ практически не оказывает мутагенного действия на тестерные штаммы S. typhimurium. Другой метаболит фенольной природы - ПГ индуцирует обратные мутации к гистидиновой прототрофности в клетках тестерных штаммов S. typhimurium, демонстрируя дозо-зависимый эффект. Вероятно, освобождение молекулы ТНТ от нитрогрупп определяющее, но не достаточное условие для полной генотоксической инактивации соединения.

4. ДНК-повреждающая активность ТНТ.

При сравнительном анализе выживаемости штаммов Е. coli, дефектных по определенным ферментам репарации, установлено, что ТНТ в исследованных концентрациях оказывает ингибирующее действие на рост всех тестерных штаммов (табл. 1). Но эффект наиболее выражен для штаммов uvrA" и pol А",- мутантных по генам, кодирующим синтез важнейших ферментов системы эксцизионной репарации ДНК.

Таблица 1

ДНК-повреждакяций эффект ТНТ

Штаммы ТНТ, мкг/мл

5 50

Выживаемость, % г I Выживаемость, % I

wp 2 80.6 66.8

u vr А' 56.0 0.69 34.0 0.50

pol А- 70.5 0.87 45.8 0.69

гсс А" 67.5 0.83 50.5 0.75

lex А" 71.0 0.88 58.4 0.87

Примечание. I - индекс выживаемости

ТНТ также оказывал негативное влияние на рост штамма гее А", хотя ; данном случае эффект был несколько ниже, чем для uvr А" и pol А мутантов. Следует отметить, что наименее чувствительным к действию ТН' оказался штамм, дефектный по гену lex А, кодирующем синтез белка Lex А репрессора всех генов, контролирующих SOS-ответ клетки. Итак результаты наших исследований свидетельствуют, что ТНТ в основное индуцирует повреждения ДНК, которые не могут быть устранены из-з! дефектов в системе эксдизионной репарации (в частности недостаточное^ Uvr АВС-нуклеазы и ДНК-полимеразы I) и, как следствие, оказываю' негативное влияние на жизнеспособность клеток тестерных бактерий.

5. SOS-индуцирующий эффект ТНТ и его метаболитов.

Индукция мутаций под действием химических соединений предполагает два основных механизма: гес Л-зависимый и гес А-независимый (Quillardet and Hofnung, 1988). гес .¿-независимый мутагене: является следствием повреждений ДНК, которые ведут непосредственно » ошибкам в спаривании оснований. Вместе с тем некоторые типы повреждений ДНК индуцируют SOS-ответ, объединяющий целый каскал внутриклеточных реакций, в том числе и "ошибочную" SOS-репарацию Одним из важнейших последствий SOS-ответа является гес ^-зависимый, или SOS-мухагенез (Kushner, 1989). Способность ТНТ и его метаболитов индуцировать SOS-ответ клетки, оценивали в SOS-хромотесте на штамме Е coli PQ 37. ТНТ ни в одной из исследованных концентрациях не обладал выраженной SOS-ивдуцирующей активностью. SOS-ответ клеток Е. coli PQ 37 на действие ТНТ в исследованном диапазоне концентраций не является дозо-зависимым. Наивысший фактор индукции (IF) для ТНТ (5 мкг/мл) равен 1.8. Для сравнения: IF для митомицина С (2 мкг/мл) равен 17.5.

Метаболиты ТНТ - 2АДНТ, 4АДНТ, 2,4-ДАНТ, ФГ и ПГ в исследованном диапазоне концентраций также продемонстрировали слабую SOS-индуцирующую активность в клетках Е. coli PQ 37. Практически во всех случаях IF был меньше 1.5. Некоторым исключением является 4ДАНТ - IF для этого соединения несколько выше 1.5, однако обнаруженный эффект не является дозо-зависимым.

Суммируя результаты исследования ТНТ и его метаболитов в SOS-хромотесте, мы склонны считать, что SOS-репарация не играет

значительной роли в генотоксичеком действии исследуемых соединений, — следовательно, мутагенез, индунир^мый ТНТ в клетках бактерий, не является гес Л-зависимым.

6. Генотоксичность ТНТ в клетках млекопитающих in vivo.

Для определения возможности генотоксического действия ТНТ в организме млекопитающих нами был использован микроядерный тест на эритроцитах периферической крови мышей линии СВАхС5713 L/G. Микроядра представляют собой ацентрические фрагменты, образующиеся в результате структурных нарушений хромосом. Считается, что частота индукции микроядер отражает частоту хромосомных аберраций (Абилев и Порошенко, 1986; Ильинских с соавт., 1992). Результаты исследования ТНТ' в микроядерном тесте представлены на рис. 7.

8 в

о и о

° а I

i a I в *h*

il Mj

Г

-L

□ к

О 5

ЕЁ ю

га 2о

24 48

Время, ч.

Рис. 7 Частота индукции микроядер в эритроцитах

периферической крови мышей линии СВАхС5713 L/G при действии ТНТ (5, 10, 20 мг/кг). * - Р< 0.05, " - P¿ 0.001.

ТНТ в исследованном диапазоне концентраций вызывал дозо-заш1Симое повышение частоты индукции микроядер в эритроцитах периферической крови мышей линии СВАхС5713 L/G. Количество микроядер (на 1000 эритроцитов), индуцированных ТНТ в наивысшей из исследованных концентраций, в 4 раза превышало спонтанный уровень индукции микроядер. Установлено, что эффект ТНТ наиболее выражен через 48 ч. после введения соединения животным. В целом результаты микроядерного теста свидетельствуют о возможности генотоксического действия ТНТ в клетках млекопитающих ¡n vivo.

ВЫВОДЫ

1. ТНТ иццуцирует генные мутации типа замены пар оснований и сдвига рамки считывания в клетках S. typhimurium, вызывая значительное дозо-зависимое превышение над спонтанным фоном мутирования.

2. Мутагенный эффект ТНТ при метаболизме S. typhimurium подвержен динамическим изменениям, что свидетельствует об определяющей роли процессов биотрансформации в проявлении генотоксических свойств исследуемого соединения.

3. Трансформация ТНТ тестерными штаммами S. typhimurium ТА 98 и ТА 100 осуществляется при участии ферментов нитроредукции. Первым этапом процесса является восстановление нитрогруппы в о-положенин с образованием мажорного метаболита 2ДЦНТ. 4АДНТ и 2.4ДА6НТ идентифицированы в качестве минорных метаболитов начальных этапов трансформации ТНТ.

4. "Классические" нитроредуктазы и О-ацетилтрансфераза играют ключевую роль в мутагенезе, индуцируемом ТНТ у бактерий. Мутагенный эффект ТНТ практически не изменяется в присутствии S9 фракции плаценты человека и значительно снижается под действием микросомных ферментов печени крыс.

5. Мутагенный потенциал в ряду исследованных метаболитов ТНТ убывает последовательно: 2-амино-4,6-динитротолуол—* 2,4-диамино-6-нитротолуол —*4-амино-2,6-динитротолуол—> пирогаллол—» флороглюцин.

6. Мутагенез, индуцирумый ТНТ в клетках бактерий, можно рассматривать как гаь4-независимый, поскольку ТНТ и его метаболиты не проявляют выраженной SOS-индуцирующей активности в клетках Е. сой PQ 37.

7. ТНТ вызывает дозо-зависимое повышение частоты индукции микроядер в эритроцитах периферической крови мышей линии СВАхС5713 L/G, что свидетельствует о возможности генотоксического действия соединения в клетках млекопитающих in vivo.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карамова Н.С., Ильинская О.Н., Иванченко О.Б. Мутагенная активность 2,4,6-тринитротолуола: роль метаболиэирующих ферментов. // Генетика. - 1994. - Т. 30. - N 7. - С. 898-907.

2. Добровольская М.Л.. Карамова Н.С., Черепнев Г.В. Микроядерный тсст в оценке стабильности генома. / Тезисы докладов VII Межреспубликанской научной конференция ВУЗов "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений, Казань,1994. - С. 87-88.

3. Hinskaya O.N., Karamova N.S., Ivanchenko О.В. Metabolism and mutagenicity of 2,4,6-TNT in Salmonella. /Abstr. 7th Eur.Congr. on Biotechnol., Nice, Feb. 19-23, 1995.-Vol.4.-P.97.

4. Ильинская О., Иванченко О. Б., Карамова Н. С., Черепнева И. Е. Оценка генотоксичности в экологическом мониторинге природных комплексов Татарстана / Материалы I Республиканской научной конференции "Актуальные экологические проблемы республики Татарстан", Казань. - 1995. - С. 190.

5. Карамова Н.С., Мышша И.И., Гараева Г.Г., Иванченко О.Б., Ильинская О.Н. 2,4,6-Тринитротолуол и 2,4-диамино-б-нитротолуол: отсутствие гесЛ-зависимого мутагенеза? // Генетика. - 1995. - Т. 31. - N 5. -С. 617-621.

6. Hinskaya О., Karamova N., Ivanchenko О. 2,4,6-Trinitrotolucne: mutagenicity and metabolism in Salmonella / Abstr. of the 1995 Internationa] Co-Conference on ICEP'95-ICONE'95, 17-24 July 1995, S¡..Petersburg, Russia.-P.18.

7. Karamova N., Hinskaya O., Ivanchenko O. 2,4,6-Trinitrotoluene: genotoxicity on E. coli PQ 37 (SOS chromotest) / Abstr. of Beijcrinck Centennial. Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications, 10-14 December 1995, The Hague, The Netherlands. - P. 538-539.

8. Ильинская O.H., Иванченко О.Б., Карамова H.C., Ремизов А.Б., Скворцов А.И., Фишман А.И. Зависимость величины индуцированного 2,4,6-тринитротолуолом мутагенеза от физиологического состояния тестерных штаммов Salmonella typhimurium. // Микробиология (принято к печати 12.10.1995).

Автор глубоко признателен своим научным руководителям академику АН РТ профессору И.Б. Лещинской, доценту О.Н. Ильинской за неоценимую помощь в создании настоящей работы и выражает искреннюю благодарность профессору А.И. Фишману, доценту А.И. Скворцову за интересные идеи и совместную работу.