Участие активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола

Науменко, Екатерина Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Участие активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола"

На правах рукописи

НАУМЕНКО Екатерина Анатольевна

УЧАСТИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ПРОЦЕССЕ АЭРОБНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

>-. и i

7Т1

¿l4,'U

Казань - 2008

003445917

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета им В И Ульянова-Ленина

Научный руководитель Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Наумова Римма Павловна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Коксин Владимир Петрович (Лаборатория биохимии РЦПБ СПИД, г Казань)

доктор биологических наук, профессор Леонтьевский Алексей Аркадьевич (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН, г Пущино)

Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН, г Казань

Защита диссертации состоится «25» сентября 2008 г в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212 08108 при Казанском государственном университете по адресу 420008, г Казань, ул Кремлевская, д 18, главное здание, ауд 211

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им Н И Лобачевского при Казанском государственном университете

Автореферат разослан «¿3» августа 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

3 И Абрамова

Актуальность проблемы. Присутствие устойчивых химических токсикантов в окружающей среде вызывает всеобщую озабоченность в связи с воздействием этих загрязнителей на природные объекты и организм человека Антропогенное влияние на окружающую среду приводит к ее загрязнению химически синтезированными соединениями - ксенобиотиками, которые содержат элементы химической структуры, редко или никогда не встречающиеся в природе В связи с этим такие ксенобиотики не распознаются существующими ферментами биодеградации и, как следствие, они циркулируют и накапливаются в живых организмах и окружающей среде [Наумова, 1985, Peres, Agatos, 2000] Нитроароматические соединения, одна из широко распространенных групп ксенобиотиков, используются в качестве взрывчатых веществ, гербицидов, инсектицидов, а также как сырье для производства полимеров, красителей, лекарств Нитроарилы составляют группу важных экологически опасных загрязнителей в связи с их относительной стабильностью в биосфере, а также токсическими и мутагенными эффектами Среди нитроароматических соединений наибольшее распространение получил 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ), который несколько десятилетий использовался в качестве основного компонента взрывчатых смесей Широкое применение ТНТ в ходе двух мировых войн привело к загрязнению наземных и водных экосистем

Токсичность ТНТ и его метаболитов показана в различных тест-системах, от клеток бактерий до млекопитающих [Lachance et al, 2004] Нитроарилы, в том числе ТНТ, выступают как причина апластической анемии, нарушений функций печени, развитие катаракты Кроме того, показана мутагенная активность ТНТ и его метаболитов по отношению к микроорганизмам и культурам клеток млекопитающих.

Абсолютное большинство микроорганизмов способно тем или иным образом воздействовать на молекулу ТНТ Наиболее распространенным путем микробной трансформации данного соединения в аэробных условиях является последовательный двухэлектронный восстановительный механизм, приводящий к превращению нитрогруппы через нитрозо- и гидроксиламино-в аминогруппу Наиболее полная восстановительная трансформация ТНТ до триаминотолуола выявлена только у строго анаэробных микроорганизмов [Preuss et а!, 1992, Funk et а!, 1993]. Возможно почти стехиометрическое восстановление ТНТ в ГАДНТ представителями родов Lactobacillus [Наумов с соавт , 1999] и Pseudomonas [Зарипов с соавт, 2004]

Несмотря на интерес исследователей к проблеме трансформации ТНТ, ряд принципиальных аспектов взаимодействия ксенобиотика с клетками остается неизученным В частности, обращает на себя внимание трт факт, что вся мировая и отечественная литература, посвященная ТНТ, рассматривает либо восстановление его ннтрогрупп, либо гидридное ,восстановление ароматического кольца В то же время практически отсутствуют сведения о вовлечении кислорода в данный процесс и связанное с ним образование активных форм кчслорода (АФК) в системе ТНТ-Сактериальные клетки

Цель данной работы - охарактеризовать участие активных форм кислорода в процессе трансформации 2,4,6-тринитротолуола клетками различного уровня организации

Основные задачи исследования:

1 Выделить из различных источников обитания и идентифицировать микроорганизмы, трансформирующие 2,4,6-тринитротолуол по пути восстановления его нитрогрупп с преимущественным образованием гидроксиламинодинитротолуолов в качестве метаболитов

2 Выявить особенности образования активных форм кислорода метаболически различными штаммами с применением метода электронного парамагнитного резонанса, а также спектрофотометрически

3 Охарактеризовать кинетические параметры трансформации 2,4,6-тринитротолуола, сопряженной с генерацией супероксидного анион-радикала

4 Охарактеризовать особенности трансформации 2,4,6-тринитротолуола культивируемыми растительными клетками

5 Выявить изменение физиологического состояния клеток различного уровня организации при взаимодействии с 2,4,6-тринитротолуолом

Научная новизна. Впервые методом ЭПР-спектроскопии, а также с применением спектрофотометрического анализ^., выявлено, что контакт бактериальных клеток с ТНТ сопряжен с генерацией АФК, в частности, супероксид-аниона и гидроксильного радикала, во внеклеточном пространстве, тогда как взаимодействие клеток с другими полинитроарилами не приводит к образованию АФК Проведено детальное изучение качественных и количественных характеристик образования кислородных радикалов на начальном этапе трансформации ТНТ у микроорганизмов из различных физиолого-таксономических групп Показана генерация наиболее реактивной формы кислорода гидроксильного радикала при воздействии ТНТ на клеточную суспензию Lactobacillus plantarum, а также вторичное образование данного типа АФК на более поздних этапах трансформации ксенобиотика штаммом Bacillus cereus Впервые выявлена роль ТНТ как индуктора окислительного стресса в культуре клеток растений С применением оригинального подхода с привлечением хелаторов и комплексного соединения железа получены приоритетные данные, свидетельствующие о роли ионов металлов с переменной валентностью в инициации трансформации ТНТ по пути одноэлектронного восстановления В работе впервые охарактеризована роль клеточной поверхности бактерий и ассоциированных с ней переходных металлов в процессе трансформации ТНТ Впервые при использовании метода двойного флуоресцентного окрашивания показано изменение проницаемости клеток различного уровня организации в ответ на воздействие ТНТ

Практическая значимость. Показанная в работе внеклеточная аккумуляция АФК на раннем этапе микробной трансформации ТНТ представляет интерес в связи с высокой токсичностью кислородных радикалов Обнаруженное нами образование АФК клеточными суспензиями при контакте с ТНТ может вносить решающий вклад в проявление

токсических и генотоксических эффектов ТНТ в отношении организмов разного эволюционного уровня В целом, результаты данной работы позволяют по-новому взглянуть на механизмы развития профессиональных заболеваний при контакте с данным ксенобиотиком в условиях производства Обнаружение закономерностей и предполагаемого механизма генерации АФК в процессе трансформации ТНТ бактериальными клетками позволяет пересмотреть концепцию начального этапа его микробного метаболизма Установленная индукция окислительного стресса при взаимодействии растительных клеток с ТНТ in vitro имеет значение для определения оптимальных условий трансформации ксенобиотика т vivo при разработке стратегии фиторемедиации ТНТ-загрязненных территорий

Связь работы с научными программами. Работа поддержана федеральными программами "Развитие научного потенциала высшей школы" РНП 2 1 1 1005, РНП 2 1 1 3222 и "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники" ГК 02 434 11 3020, ГК 02 512 11 2050, ГК ФЦКП КГУ 02 451 117019, Комиссией Европейских Сообществ (грант ICA2-CT-2000-10006), индивидуальным грантом КГУ (2008 г)

Положения, выносимые на защиту:

1 С применение метода электронного парамагнитного резонанса, а также спектрофотометрического анализа выявлено, что начальный этап аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуота бактериями сопряжен с образованием активных форм кислорода

2 У микроорганизмов из различных таксономических групп выявлены различия качественных и количественных характеристик генерации активных форм кислорода в ответ на контакт клеток с 2,4,6-тринитротолуолом

3 Трансформация 2,4,6-тринитрототуола клетками различного уровня организации сопряжена с изменением клеточной поверхности как барьера проницаемости

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на школах-конференциях молодых ученых "Экотоксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии" (Пущино-Тула, 2006) и "Биочогия - наука XXI века" (Пущино, 2004, 2005, 2006, 2007), "Ломоносов-2007" (Москва,2007), научных конференциях "Биотехнология -охране окружающей среды" (Москва, 2004, 2005, 2006), "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), "Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития" (Киров, 2007), "Современные проблемы экологии микробиологии и иммунологии" (Екатеринбург-Пермь, 2007), "Биосистемы организация, поведение, управление" (Нижний Новгород, 2007), международной конференции "Modem development of magnetic resonance" (Kazan, 2007), а также на итоговых конференциях КГУ (2005-2008)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы

Благодарности. Выражаю глубокую признательность моему научному руководителю Наумовой Римме Павловне за разработку интересной научной темы и внимательное отношение к работе Благодарю всех тех, кто помогал мне в работе над диссертацией Гафарова Арслана Булатовича за помощь в идентификации микроорганизмов, Силкина Николая Ивановича и Родионова Александра за проведение ЭПР-спектроскопт, Шурхно Равилю Абдулловну за помощь в проведении ВЭЖХ, Гордона Льва Хаймовича и Валитову Юлию Наильевну за предоставление возможности постановки манометрических опытов и обсуждение полученных результатов, Сальникова Вадима Владимировича и Мухитова Александра Ринатовича за помощь в проведении флуоресцентной микроскопии, Румянцеву Наталью Ивановну за предоставление культуры растительных клеток, а также коллектив Лаборатории экологической биотехнологии и биомониторинга, в особенности Ложкина Андрея Петровича и Зиганшина Айрата Мансуровича, а также студентов - Субхангулову Айгуль Расыковну и Сырову Анну Викторовну Отдельная благодарность инженерам кафедры микробиологии -Мочаловой Наиле Касимовне и Пономаревой Альфие Зарифовне

Структура и объем диссертации Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 37 рисунков Диссертация состоит из следующих разделов введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 195 источников, из них 169 на иностранном языке

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактериальные штаммы и культура растительной ткани. В работе использовали репрезентативные штаммы ТНТ-трансформирующих микроорганизмов Bacillus cereus ZS18, Pseudomonas putida EN1582, выделенные из отходов нефтехимического производства, а также Lactobacillus plantarum IL1 Трансформацию ТНТ и образование АФК изучали также на клетках неморфогенного каллуса гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L) Gaertn линии 1-10, полученной из незрелого зародыша и состоящей из клеток паренхимного типа [Румянцева с соавт, 1992,1998]

Определение видовой принадлежности бактериальных штаммов

Выделение геномной ДНК Микроорганизмы выращивали на соответствующих твердых питательных средах (Bacillus sp и Pseudomonas на среде МПА, Lactobacillus sp на среде МРС (DeMan-Rogosa-Sharpe) [De Man el al, I960]) Выделение ДНК проводили согласно стандартной процедуре mimPrep

Попимеразная цепная реакция (ПЦР) Для проведения ПЦР использовали смесь следующего состава 200 мкМ dNTP, 1 5 мМ MgCl2, 200 пкМ праймеров (forward primer 63f (CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC),

reverse primer 1387r (GGG CGG WGT GTA CAA GGC), 1324 bp) [Marchesi, et al, 1998], 2 5 мкл буфера 10X, O 5 ед ДНК-полимеразы В кюветы для ПЦР вносили 24 мкл данного раствора и 1 мкл образца ДНК Для проверки успешности процесса использовали стандартные маркеры

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 2400 (PerkinElmer, США) по следующей программе денатурация 94°С 5 мин, денатурация 94°С, 2 мин, отжиг 55°С, 30 сек, наращивание72°С, 2 мин (30 циклов), завершение 72"С, 7 мин, подготовка к хранению 10°С

Секвенирование продукта ПЦР Секвенирование проводили на секвенаторе Beckman Coulter CEQ 2000XL по стандартной процедуре согласно протоколу Beckman Установленные нуклеотидные последовательности 16S рДНК синтезированной на матрице 16S рРНК изучаемых штаммов сравнивали с последовательностями базы данных GenBank и RibosomalDataBaseProjectlI

Трансформация ТНТ клеточными суспензиями бактерий. Бактерии предварительно культивировали до поздней экспоненциальной фазы роста Клетки осаждали центрифугированием (9000g, 15 мин), дважды отмывали ЗОмМ Na2HP04 / 20 мМ КН2Р04 (рН 7 0) и ресуспендировали в ТНТ-содержащем буфере до оптической плотности (Atoo) 0 1, 0 5 или 10 В опытах с мертвыми клетками отмытую клеточную суспензию предварительно выдерживали в водяной бане (100°С, 15 мин) С целью определения влияния хелатирующих агентов на процесс трансформации ТНТ клетки отмывали буфером, содержащим ЭДТА или 2,2'-бипиридил ТНТ вноси™ перед автоклавированием до конечной концентрации 100 мг/л

Трансформация ТНТ клеточными суспензиями каллусной ткани. Каллус предварительно культивировали на агаризованной среде RX [Румянцева с соавт, 1998] Каллусные культуры поддерживали в термостате при температуре 26+ 2°С, в темноте, на каллусогенной среде RX, рН 5 5 -5 б Для получения клеточной суспензии каллусную массу переносили с агаризованной среды RX в 50мМ K-Na фосфатный буфер (рН 7 0), содержащий ТНТ Инкубировали при 25°С в аэрируемых условиях

Трансформация ТНТ ферроцнанидом (Kí[Fe(CN)<¡]). Реакцию инициировали внесением K4[Fe(CN)6]*3H20 (10"2мМ) в 50мМ фосфатный буфер, содержащий ТНТ (100 мг/л) Об образовании феррицианида (K^FeíCN),;]) судили по увеличению поглощения при 320 нм

Высокая эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов трансформации ТНТ. ВЭЖХ-анализ в освобожденных от клеток инкубационных смесях проводили на хроматографе Senes 200 (Perkin Elmer, США), в обращенно-фазовом варианте с использованием колонки (150 х 4.60 мм С18, Phenomenex) с детектором длин волн при 254 нм Элюцию проводили в изократическом режиме системой растворителей ацетонитрил-вода (40 60) при скорости 0 5 мл/мин и температуре 30°С

Определение потребления кислорода клеточными суспензиями. Потребление кислорода определяли манометрическим методом Варбурга

Потребление Ог инкубационными смесями с плотностью бактериальной суспензии Абоо= 2 0 измеряли в том же буфере при концентрациях ТНТ 50 и 100 мг/л

Определение активных форм кислорода (АФК)

Определение супероксидного анион-радикала (Oj) адренохромным методом К 2 мл освобожденной от клеток инкубационной жидкости добавляли 200 мкл 0 1% водного раствора гидрохлорида эпинефрина и после 15-минутной инкубации проводили измерения при 480 нм против освобожденной от клеток неокрашенной инкубационной жидкости на спектрофотометре Lambda 35 (Perkrn Elmer, США)

ЭПР-спектрометрия АФК ЭПР-спектры супероксида регистрировали на спектрометре ESP-300 (Bruker, Германия), при комнатной температуре (-25°С), СВЧ мощность 50 мВт, СВ частота 9 8 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0 5 Гаусс Tirón (50 мМ) добавляли к исследуемым растворам после отделения клеток, pH доводили до 9 5-10 Образцы в объеме 20 мкл помещали в стеклянные капилляры Образование О2- и гидроксильного радикала ("ОН) регистрировали также с примерением спиновой ловушки DMPO при следующих параметрах ЭПР-спектрометрии комнатная температура (~25°С), СВЧ мощность 20 мВт, модуляция поля 100 кГц, амплитуда ВЧ модуляции 10 Гаусс, константа времени 164 мсек Аутентичные (эталонные) спиновые аддукты получали, применяя модельные системы образования АФК. Для генерации О2" использовали ксантин-ксантиноксидазную реакцию ОН генерировали в реакционной системе Фентона

Определение физиологического статуса бактериальных и растительных клеток в процессе трансформации ТНТ

Определение клеточной проницаемости методом флуоресцентного окрашивания Флуоресцентную микроскопию бактерий и клеток каллусной культуры проводили с применением конфокального лазерного флуоресцентного микроскопа LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия) Определение физиологического состояния растительных и бактериальных клеток в процессе трансформации ТНТ проводили с использованием двойного окрашивания двумя флуоресцентными красителями пропидиум иодидом (PI) и 4,б-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлоридом (DAPI) [Shi et al, 2007] Полученные изображения анализировали с помощью компьютерной программы Carl Zeiss Advanced Imaging Microscopy 4 0

Определение жизнеспособности клеток к\ пьтуралъными методами Для определения способности бактериальных клеток, подвергнутых воздействию ТНТ, к пролиферации проводили их высев на МПА на различных этапах трансформации ТНТ Учет КОЕ и диаметра колоний проводили через 24, 48 и 72 ч Способность к размножению культивируемых растительных клеток, взаимодействовавших с ТНТ, изучали высевом на агаризовнную среду RX отфильтрованных клеток, отобранных через 2 мин и 2 ч после начала трансформации ТНТ Через 7 сут определяли уровень прироста сырой биомассы каллуса Рост суспензионной культуры гречихи

татарской в присутствии различных концентраций ТНТ проводили в темноте в условиях принудительной аэрации Уровень прироста биомассы измеряли через 7 сут культивирования

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с использованием стандартного пакета Microsoft Office Excel 2007 Обработку данных ЭПР-спектроскопии проводили в программной среде Origin 7 5 Результаты представлены в виде средних значений со стандартными отклонениями (М±ш) В экспериментах по флуоресцентному окрашиванию клеток представлены репрезентативные данные Для оценки статистической значимости различий между опытной и контрольной выборками использовали критерий Стьюдента, принимая /?<0 05 за достоверный уровень значимости

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выделение и идентификация микроорганизмов

Источниками выделения бактериальных штаммов, осуществляющих преимущественно восстановление нитрогрупп, служили почва, нефтехимические шламы и кисломолочные продукты Были отобраны 3 штамма, однонаправленно трансформирующих ТНТ по пути нитроредукции с образованием изомерных ГАДНТ в качестве мажорных метаболитов, способные к росту при высоких концентрациях ТНТ (100-200 мг/л) На основании физиолого-биохимических признаков данные штаммы были предварительно отнесены к родам Bacillus (Bacillus sp ZS 18), Pseudomonas {Pseudomonas sp EN1582) и Lactobacillus (Lactobacillus sp IL1) Для определения видовой принадлежности выделенных штаммов была проведена их идентификация с применением методов молекулярной биологии на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рДНК, комплементарной 16S рРНК

Секвенирование проводили по стандартной процедуре согласно протоколу фирмы Beckman Результаты сравнения установленных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК изучаемых штаммов с последовательностями базы данных GenBank и RibosomalDataBaseProjectll позволили с вероятностью 89-99% идентифицировать штамм Bacillus sp ZS18 как Bacillus cereus, штамм Pseudomonas sp EN 1582 как Pseudomonas putida, штамм Lactobacillus sp IL-1 как Lactobacillus plantarum

2. Трансформация ТНТ интактными бактериальными клетками

Скрининг ряда грамположительных и грамотрицательных штаммов

показал, что внесение клеточной массы в инкубационную смесь или ростовую среду сопровождается убылью некоторого количества ТНТ Это начальное снижение (в пределах 4-9 мг/л) могло быть связано либо с сорбцией ТНТ бактериальными клетками, либо с его трансформацией в пределах соответствующих концентраций Отделение клеток от инкубационных смесей с последующей экстракцией эфиром или хлороформом не выявили присутствия ТНТ, связанного с клетками

Проведенный ВЭЖХ-анализ инкубационных смесей после отделения клеток выявил в качестве основных метаболитов изомерные ГАДНТ Причем, в случае L plantarum IL-1 и Р putida EN1582 имело место практически стехиометрическое превращение ТНТ в ГАДНТ, не сопровождающееся образованием моноаминопроизводных в течение всего времени эксперимента (3 ч) Начальный этап трансформация ТНТ В cereus ZS18 также не был сопряжен с образованием АДНТ, но после второго часа инкубации происходило дальнейшее восстановление ксенобиотика с появлением моноаминопроизводных в инкубационной смеси При этом концентрации 4АДНТ была незначительной и составляла 6 5-8 3 мкМ (рис 1)

4ГАДНТ

Рис 1 ВЭЖХ инкубационной смеси при трансформации ТНТ (440 мкМ) иитактными клетками ВасШиз сегеш через 3 ч посте начала инкубации

3. Трансформация ТНТ термически инактивированными бактериальными клетками

Моментальная убыль некоторого количества ТНТ непосредственно после внесения клеток, позволила предполагать неферментативную природу начального этапа его трансформации бактеритми Для подтверждения данного предположения необходимо было испытать инактивированные бактериальные клетки, неспособные к росту на питательных средах

Внесение в инкубационную смесь нежизнеспособных, термически инактивированных клеток В сегеш 2518 способствовало менее масштабному, чем в варианте с интактными клетками, однако закономерному снижению концентрации ТНТ (рис 2)

О 50 100 150 200 350

Время мик

Рис. 2. Динамика убыли ТНТ в процесс инкубации клеток В. сегеиз 2518 (А60о=1.0) фосфатном буфере с ТНТ (100 мг/л): 1 живые клетки + ТНТ: 2 - термичесю инактивированные клетки + ТНТ; 3 - ТН" без клеток.

Характерно, что в процессе продолжительной инкубации таких клеток с ксенобиотиком обычно детектируемые с применением ВЭЖХ-анализа метаболиты, такие как ГАДНТ и АДНТ, не были выявлены.

4. Трансформация ТНТ культивируемыми клетками гречихи татарской Fagopyrum сШапсит (Ъ.) СаегЧп

По результатам тестов на фитотоксичность ТНТ для изучения трансформирующей активности клеточных культур растений оптимальной можно считать концентрацию ксенобиотика 50 мг/л [Уапёк е? а/., 2003; КапизЬуШ ег а/., 2007].

Инкубация суспензии растительных клеток в фосфатном буфере с ТНТ приводила к закономерному снижению его концентрации. Для полной конверсии ТНТ в продукты его четырехэлектронного восстановления суспензией каллусных, клеток требовалось 6 ч.

ВЭЖХ-анализ показал, что суспензионная культура Р. иисичсит трансформирует ТНТ по пути нитровосстановления. При этом в течение первого часа инкубации определялись изомерные ГАДНТ, далее происходила их конверсия в АДНТ, более масштабная, чем в случае бактериальных клеток (табл.).

Таблица

Метаболиты, обнаруженные в процессе трансформации ТНТ суспензией клеток Р. ¡Шапсит

Соединение Времена удерживаний в 0 условиях ВЭЖХ (30 С), мин Концентрация метаболитов через 3 ч инкубации, мкМ (нач. концентрация ТНТ 220 мкМ)

4-ГАДНТ 7.7 15.1

2-ГАДНТ 7.9 10.3

2-АДНТ 9.8 21.2

4-АДНТ 11.2 46.3

ТНТ 16.0 102.6

Согласно данным некоторых исследователей [Ramishvih et al, 2007], убыль ТНТ в инкубационной смеси, содержащей суспензию растительных клеток, может быть обусловлена не только его превращением до известных метаболитов, но и адсорбцией ксенобиотика на поверхности клеток каллуса Кроме того, ряд авторов отмечает, что метаболиты ТНТ также способны к необратимому связыванию с компонентами клеточных стенок, в частности, с лигниноподобными структурами, что может проявляться в отсутствии баланса между концентрацией исходного ксенобиотика и обнаруживаемых методом ВЭЖХ метаболитов [Hughes et al, 1997, Vanderford et al, 1997, Hannink et al, 2002] Результаты, полученные нами при анализе хроматограмм, позволяют считать, что адсорбции на поверхностных структурах клеток изучаемой нами культуры подвергается не более 10% ТНТ и не более 3-5% от общего количества метаболитов нитроредукции 5. Потребление кислорода суспензией бактериальных клеток Для изучения роли кислорода в системе, содержащей ТНТ и клетки В cereus ZS18, было проанализировано суммарное потребление кислорода в течение 2 ч Установлено, что ТНТ усиливает потребление кислорода клеточной суспензией в 1 5-2 раза по сравнению с контролем (эндогенное дыхание в отсутствие глюкозы и ТНТ) Характерно, что превышение уровня потребчения кислорода находилось в прямой зависимости от концентрации ТНТ (рис 3)

Бремя мин

Рис 3 Динамика потребления кислорода в системе покоящиеся клетки Bacillus cereut ZS18 (А600=2 0)+ТНТ в отсутствие экзогенного дыхательного

субстрата Потребление кислорода 1 и 2 - при концентрации ТНТ 100 и 50 мг/л, соответственно, 3 эндогенное дыхание в отсутсгвие ТНТ, 4 - то же, что 1, но при добавтении 1 мг/мл NaNj, 5 - то же, что 4, но при концентрации ТНТ 50 мг/л, 6 - то же, что 4, но в отсутствие ТНТ

Для дифференциации собственно дыхательной активности клеток и нереспираторного потребления кислорода использовали дыхательный яд -азид натрия (№N3) Уже в дозе 1 мг/мл №N3 полностью блокировал как субстрат-индуцированное (глюкозное), так и эндогенное дыхание, не предотвращая при этом потребления кислорода в присутствии ТНТ (рис 3) 6. Образование АФК в процессе трансформации ТНТ Феномен «недыхательного» потребления кислорода и его масштабы позволили предположить участие активных форм кислорода в трансформации ТНТ Действительно, анализ образования 02" с применением

реакции супероксид-зависимого превращения эпинефрина в адренохром свидетельствовал о немедленном образовании данного радикала после внесения бактериальных клеток в инкубационную смесь, содержащую ТНТ (рис.4).

Рис. 4. Динамика образования супероксида А - в процессе трансформации ТНТ (100 мг/л) клеточной суспензией В. сегет Т& 18; Б - то же, что А, но с добавлением 400 ед/мл СОД.

В качестве более специфичного и чувствительного метода определения генерации АФК использовали ЭПР-спектроскопию с применением двух спиновых ловушек: Tirón и DMPO, переводящих чрезвычайно нестабильные радикалы кислорода в относительно более стабильную форму. С целью определения специфичности данных ловушек применительно к Oi и ЮН, а также для получения стандартных ЭПР-спектров использовали модельные реакции образования свободных радикалов - ксантиноксидазную реакцию и реакцию Фентона.

Выявлено, что как Tirón, так и DMPO при взаимодействии с реакционной смесью, содержащей образуют ЭПР-детектируемые

спиновые аддукты: Tiron-семихинон и DMPO-OOH, соответственно, которые имеют характерные спектры (рис.5).

Рис. 5. Эталонные ЭПР-спектры аддуктов

спиновых ловушек с 02'~ Tíron-семихинона (А) и ДМПО-ООН (Б).

Спиновые аддукты ловушек с ЮН также обладают определенными характеристиками ЭПР-линий (рис.6).

Рис б Эталонные ЭПР-спектры аддуктов

спиновых ловушек с •ОН Tiron-'OH (А) и ДМПО-ОН (Б)

' ^ ^ ив« амо ' ** 3—5 3600 яо ам

Матигим пела Гаусс М»гмиг*ов пол» Гаусс

Сопоставление эталонных спектров с регистрируемыми в системе ТНТ+бактериальные клетки показало, что начальный этап трансформации ТНТ действительно сопряжен с генерацией 02", который неизменно регистрировали в любых вариантах ТНТ+клетки при использовании спиновых ловушек Продукция супероксида начиналась непосредственно в момент внесения суспензии клеток в ТНТ-содержащий фосфатный буфер В большинстве случаев концентрация Обыла максимальной через 15-60 мин от начала инкубации и достигала 15-20 мМ Полная конверсия ТНТ в ГАДНТ приводила к прекращению генерации (V Оказалось, что термическая обработка клеток, использованная нами для исключения участия ферментов в изучаемых процессах, не предотвращала образования АФК, хотя приводила к резкому снижению их уровня по сравнению с живыми клетками (рис 7)

Рис 7 ЭПР-спектры аддуктов спиновых ловушек с 02*"", записанные А - через 15 мин после внесения интактных клеток В cereus ZS18 в фосфатный буфер, Б - то же, что А, но при концентрации ТНТ 100 мг/л, В - то же, что Б, но после внесения термически инактивированных клеток, Г - то же, что Б, но спектр записан через 180 мин после внесения ^VVVVi4'— клеток

Изучение зависимости уровня образования Ог~ в начальный момент времени от концентрации ТНТ выявило, что в диапазоне концентраций 25100 мг/л имела место пропорциональная зависимость уровня генерации 02' от концентрации ксенобиотика, в то время как повышение концентрации от 100 до 150 мг/л проявлялось лишь в незначительном увеличении концентрации супероксида

При варьировании клеточной плотности суспензии живых клеток и клеток, инактивированных термическим воздействием наблюдали усиление

ЭПР-сигнала при повышении клеточной плотности живых клеток, тогда как изменение количества мертвых клеток не позволяло выявить пропорциональную зависимость

Анализ эталонных спектров спиновых аддуктов и их сравнение с регистрируемыми в процессе трансформации ТНТ клетками В cereus ZS18, выявил сочетание в одном спектре ЭПР-линий, характерных для Tiron-семихинона и аддукта Tirón с «ОН Это позволило сделать вывод, что в изучаемой нами системе имеет место генерация 02'~ и вторичное образование •ОН Следует отметить, что совместное присутствие Ог'~ и »ОН было характерно для поздней стадии инкубации клеток в растворе ТНТ (60-120 мин), тогда как в течение первых 15 мин в системе определялся

Рис 8 ЭПР-спектр аддуктов Tirón- АФК, записанный в процессе трансформации ТНТ штаммом В cereus ZS18 через 60 мин после внесения клеток

* - линии ЭПР, соответствующие Oi"~

исключительно 02" (рис 8)

3496 ям 3430 14® 34М Я86 3496 Э500 3SQ2 SSO«

Магхигтее лом Гцсс

В процессе трансформации ТНТ другим модельным штаммом, Р putida ENI582, также имело место образование Следует отметить, что уровень генерации 02'~ в данной системе был выше, чем в случае трансформации ТНТ клетками В cereus ZS18 При этом вторичное образование ЮН не наблюдалось даже на более поздних этапах трансформации ТНТ (рис.9)

Рис 9 ЭПР-спектры аддуктов Tirón- О2 записанные в процессе трансформации ТНТ штаммом Р putida ENI 582 через 60 мин после внесения клеток

г 1»- I I—■ 1 1 I >—I I 1 < i—>—i—■—1—■ 3486 3489 3490 3402 34S4 3496 349Í 3500 3502 3504 Магнитное поле Гаусс

Изучение генерации АФК в процессе трансформации ТНТ клетками L plantarum IL-1 не выявило образования супероксида Спектры ЭПР, регистрируемые в данной системе относились исключительно к аддуктам Tirón с «ОН (рис 10)

Рис 10 ЭПР-спектр аддукта Ттоп-ЮН, записанный в процессе трансформации ТНТ штаммом Ь рЬЫагит 1Ь-1

I—'-1-■-1-'-1-■-1-■-1-'-1—■—т—'-1-- I '

Э4Вв 3403 3400 3492 3494 3466 3498 3500 3602 Э534

Магнитное поле Гвусс

Обращает на себя внимание, что контакт бактериальных клеток с другими нитроароматическими соединениями (ТНБК, ТНФ, 2,4ДНТ), а также стабильными метаболитами нитроредукции ТНТ (2АДНТ, 4АДНТ), внесенными в систему в концентрации, эквивалентной молярному содержанию ТНТ, не приводил к образованию кислородных радикалов, что было зафиксировано с привлечением ЭПР-спектроскопии по отсутствию характерных спектров аддуктов спиновых ловушек

7. Образование АФК в процессе трансформации ТНТ культивируемыми клетками К {Шагкит

Для культуры каллусных клеток гречихи татарской было характерно образование некоторого фонового уровня АФК независимо от взаимодействия с ТНТ. Однако контакт культивируемых клеток с ТНТ в условиях клеточной суспензии приводил к достоверному повышению этого уровня При этом, в отличие от суспензии бактериальных клеток, совместное образование Ог'~ и «ОН в суспензии каллусных клеток было характерно уже для раннего этапа инкубации

8. Влияние хелатирующих агентов на биотрансформацию ТНТ и образование АФК

С целью выяснения роли клеточной поверхности и, в частности, структур, содержащих ионы металлов с переменной валентностью, в снижении концентрации ТНТ и в образовании <Э2'~, была предпринята обработка клеток В сегеия 2Б18 хелатирующими агентами (ЭДТА и 2,2'-бипиридилом) перед их внесением в ТНТ-содержащую инкубационную смесь Обработка клеток как ЭДТА, так и бипиридилом, приводила к торможению трансформации ТНТ и значительно снижала уровень продукции супероксида (рис 11)

Рис. 11. Влияние хелатирукнцих агентов на уровень образования О;* в системе клетки В сегеиь 2Э18 + ТНТ

9. Небиологическая трансформация ТНТ ферроцианидом (К4[Ре(С\)6!)

Внесение К^Ре^^Об] в фосфатный буфер с ТНТ способствовало немедленному снижению концентрации ксенобиотика на 15% в течение первых 15 мин трансформации. Далее происходило восстановление концентрации ТНТ практически до исходного значения. При этом образование каких-либо продуктов восстановления ТНТ, детектируемых методом ВЭЖХ, не наблюдалось.

Взаимодействие данного комплексного соединения с ТНТ приводило к образованию красной кровяной соли (К.3[Те(СН)6]), что было определено спектрофотометрически по поглощению при 340 нм. ЭПР-спектроскопия показала генерацию уровень которого был сравним с таковым,

регистрируемым при трансформации ТНТ бактериальными клетками (рис Л 2).

Рис. 12. Э1ТР- спектр Ткоп-семихинона. записанный через 15 мин после инициации трансформации ТНТКзрчДОЭД.

54Э4 3496 3498 : итное поле Гаусс

10. Оценка физиологического состояния клеток методом флуоресцентного окрашивания

С использованием лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии в нашем эксперименте удалось показать, что уже через 2 мин

экспозиции бактериальных клеток в фосфатном буфере с ТНТ происходят их функциональные изменения, связанные с изменением проницаемости мембран, что было выявлено по окрашиванию клеток Р1 Флуоресцентная микроскопия, проведенная после конверсии 50% ТНТ в ГАДНТ, также выявила изменения проницаемости мембран либо нарушение их целостности Таким образом, контакт бактериальных клеток с ТНТ в условиях клеточных суспензий приводит к усилению их проницаемости, что, безусловно, может быть связано с образованием АФК

Что касается культивируемых клеток гречихи татарской, то наблюдаемая картина была аналогичной контакт каллусных клеток с ТНТ в концентрации 50 мг/л приводит к окрашиванию 100% ядер Р1

11. Определение жизнеспособности клеток В. сегеиз и К ¡Шапсит культуральным методом

Несмотря на то, что клетки, подвергнутые воздействию ТНТ, проявляли признаки изменения проницаемости клеточных мембран или нарушения их целостности, они не теряли способности к формированию колоний при посеве на оптимальную питательную среду При этом наблюдалось замедление роста, которое может быть связано с тем, что клеткам, имеющим изменения в мембране, для перехода к размножению необходимо репарировать эти нарушения Полученные данные позволяют говорить о бактериостатическом эффекте ТНТ, который, безусловно, связан с нарушением проницаемости клеточных мембран, которое успешно преодолевается клетками при росте на богатой питательной среде Наблюдаемый эффект ТНТ по отношению к бактериям, вероятно, связан с генерацией АФК и сопутствующими изменениями липидных структур мембран

Сравнение способности к регенерации каллусной ткани клетками, подвергнутыми воздействию ТНТ, с контролем (клетками, суспендированными в фосфатном буфере без ТНТ) показало, что контакт растительных клеток с ТНТ в течение 2 ч приводит к их гибели Следовательно, трансформация большей части ТНТ каллусными клетками происходит уже после прекращения их жизнеспособности

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ТНТ относится к наиболее широко распространенным компонентам взрывчатых смесей, применяемых со времени первой мировой войны Токсический, мутагенный и канцерогенный потенциалы данного соединения были выявлены с привлечением тест-организмов различного эволюционного уровня от бактерий до млекопитающих [Амерханова, Наумова, 1979, \Vyman е/ а1, 1992, Вгап5-^е1, 1996, ГшЬе, Норег, 2002, Бака, М , 2004, ЬасЬапсе, 2004] С учетом реальных масштабов загрязнения тринитротолуолом почв и водных ресурсов, большое значение имеет изучение механизмов развития токсических проявлений при контакте с данным ксенобиотиком, а также прогнозирование его поведения в природных сферах и в организме человека

Ранее в качестве первых стабильных метаболитов данного соединения обнаруживались, как правило, аминодинитротолуолы (АДНТ) ГАДНТ впервые были обнаружены методом ВЭЖХ в качестве основных метаболитов ТНТ у микромицета Phanerochaete clvysosporiitni [Michels, Gottshalk, 1994] В дальнейшем эти продукты четырехэлектронного восстановления нитрогруппы ТНТ оказались его ключевыми метаболитами у широкого круга грамположительных и грамотрицательных бактерий [Наумов с соавт, 1998, Зарипов с соавт , 2004]

Предпринятое нами измерение концентрации ТНТ в момент контакта бактериальных клеток с данным соединением (в условиях инкубации клеточных суспензий с ТНТ) выявило его закономерную убыль (4-9% от исходной дозы) Согласно результатам манометрических опытов, потребление кислорода при инкубации клеточных суспензий возрастает (до 15-2 раз) в варианте клетки + ТНТ по сравнению с уровнем эндогенного окисления в варианте без ТНТ Это позволило предположить, что контакт клеток с ТНТ сопровождается генерацией АФК Действительно, методом ЭПР-спектроскопии с использованием Tirón и DMPO в качестве спиновых повушек, а также колориметрическим методом на основе превращения эпинефрина в адренохром мы обнаружили образование 0{~ с последующим его преобразованием в ЮН

Образование АФК, а также моментальный характер ответной реакции в начале контакта клеток с ТНТ позволили предположить ее неферментативную природу, аргументом в пользу которой служат и результаты опытов с мертвыми клетками, а именно, убыль около 20% исходного ТНТ в сочетании с появлением сигнала ЭПР

Согласно нашей гипотезе, в силу высокой электрофильности молекулы ТНТ она способна к одноэлектронному восстановлению за счет неспецифических редуктантов, в том числе, ассоциированных с компонентами клеточной поверхности, содержащих ионы металлов с переменной валентностью (таких как железо или марганец) Присутствие переходных металлов на поверхности бактериальных клеток может быть обусловлено различными механизмами в клетки бактерий железо из окружающей среды может транспортироваться низкомолекулярными хелатирующими агентами - сидерофорами, связывающими Fe (III) [Raymond 1994, Eisendle et al, 2004], другим механизмом попощения железа из внеклеточной среды служит восстановление хелатированного Fe (III) на поверхности клетки с участием редуктаз плазматической мембраны [Geoigatsou, Alexandraki, 1994, Georgatsou, Alexandraki, 1999] Совокупность приведенных данных позволила предположить существование редокс-цикла с участием ТНТ и кислорода Образующийся при одноэлектронном восстановлении нитроанионный радикал нестабилен и реокисляется киспородой с образованием супероксид-аниона и регенерацией исходного соединения (рис 13)

-0-

Рис 13

функционирующего на начальном этапе трансформации ТНТ аэробными бактериями

внеклеточного

Предполагаемая схема редокс-цикла,

ТНТ

н*троани>+нь ирадлал ТИТ

В случае мертвых клеток данный шунт не сопряжен с дальнейшей трансформацией ТНТ по традиционному пути восстановления его нитрогрупп, независимо от присутствия глюкозы как потенциального донора этектронов

Показанное нами совместное присутствие 02' и ЮН на поздних этапах трансформации ТНТ клетками В сета ZS-18 вероятнее всего является следствием вторичного образования гидроксильного радикала в реакции Фентона Но нельзя не принимать во внимание существование иного механизма формирования ЮН, основанного на взаимодействии металла активного центра СОД с Н20г, что было показано методом ЭПР [У1гп е1 а!,

В числе немногих примеров индуцированного ксенобиотиками образования микроорганизмами внеклеточного супероксид-аниона известна продукция данного радикала при взаимодействии клеток Escherichia coh с гербицидом паракватом [Hassan, Fndovich, 1978, Carr et al, 1986] Другой гербицид - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) - известен как индуктор апоптоза [Kaioumova et al, 2001], а также ассоциирован с лимфомой и другими видами рака [Tuschl, Shwab, 2003] Прооксидантный эффект данного соединения показан при использовании дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве экспериментальной эукариотической модели [Teixeira et al, 2004] Токсические эффекты муравьиной кислоты, широко применяемой в современной химической промышленности, также связывают с образованием свободных радикалов [Dikalova et al, 2001]

Предпринятое нами изучение формирования АФК при взаимодействии бактериальных клеток с другими ароматическими соединениями (ТНБК, ТНФ, 2,4-ДНТ, 2,6-ДНТ), а также метаболитами ТНТ (2-АДНТ, 4-АДНТ), проявляющими токсический эффект по отношению к различным тест-объектам, не выявило присутствия свободных радикалов в течение всего времени инкубации В совокупности с вышесказанным данный феномен позволяет сделать вывод о том, что в случае ТНТ имеет место одноэлектронное восстановление молекулы ксенобиотика с вовлечением кислорода в данный процесс, нехарактерное для других нитроароматических соединений

Принципиальная возможность одноэлектронного восстановления ТНТ в литературе прогнозируется некоторыми авторами в связи с реакцией, катализируемой «кислород-чувствительной» нитроредуктазой, исходным донором электронов для которой является NAD(P)H, а разобщение двухэлектронного потока происходит на уровне флавинов В результате

1990]

этого процесса предполагается образование нитроанионного радикала, который может являться предшественником нитрозодинитротолуола, но может быть окислен молекулярным кислородом с регенерацией исходного ксенобиотика и образованием 02" [Spain, 1995, Esteve-Nünez et al, 2001] Нами показана возможность принципиально иного механизма внеклеточной генерации 02" непосредственно при контакте микробных клеток с ТНТ за счет неферментативного редокс-превращения, ассоциированного с клеточной поверхностью с участием ионов металлов с переменной валентностью Существование такого редокс-цикла подтверждается тем, что взаимодействие не только живых, но и мертвых бактериальных клеток с ТНТ приводило к появлению СЬ'" во внеклеточном пространстве Более того, небиологическая трансформация ТНТ при взаимодействии с желтой кровяной солью также сопровождалось генерацией 02'~

Обнаруженная в нашей работе внеклеточная аккумуляция 02" на раннем этапе микробной трансформации ТНТ представляет интерес в связи с высокой токсичностью данного радикала, которая проявляется в окислении пипидов мембран, а также фрагментации ДНК, в развитии воспаления, в повреждении сосудов [Halliwell, Guttendge, 1984, Huycke,ei al, 2002] Данные эффекты частично связаны с собственной токсичностью О? одним из проявлений которой служит ингибирование ключевых ферментов клетки [Carlioz, Touati, 1986], Fe-S-содержащих белков, но основную роль, вероятно, играет образование вторичных, более активных форм кислорода, в том числе Н202 и 'ОН

Поскольку обнаруженное нами образование супероксида клеточными суспензиями при контакте с ТНТ является общим для репрезентативных представителей родов Bacillus, Lactobacillus и Pseudomonas, вполне вероятно, что микрофлора человека и высших животных, подвергающихся воздействию данного ксенобиотика, также способствует внеклеточному образованию супероксидного радикала, что может вносить решающий вклад в проявление токсических и генотоксических эффектов ТНТ

Для более широкого обоснования концепции вовлечения кислорода в процесс трансформации ТНТ с образованием АФК мы изучали взаимодействие с данным ксенобиотиком культивируемых клеток растений как модели высших эукариот Применение асептических каллусных культур для изучения ТНТ-трансформирующей активности позволяет исключить участие микроорганизмов, а также связывания ксенобиотика с гумусовыми соединениями в почве Использованная нами культура клеток гречихи татарской трансформировала ТНТ по пути восстановления нитрогрупп с образованием ГАДНТ в качестве ранних метаболитов, что является важным аргументом в пользу универсальности основного механизма конверсии ксенобиотика как прокариотами, так и эукариотами Следует, однако, отметить, что наблюдалась более глубокая трансформация нитроарила, приводящая к накоплению моноаминопроизводных в качестве основных метаболитов при продолжительной инкубации растительных клеток в присутствии ТНТ, что может быть связано с наличием большего по

сравнению с бактериальными клетками пула восстановительных эквивалентов, а также разнообразием ферментативных систем редуктазной направленности

Растения часто подвергаются общему физиологическому стрессу, неотъемлемой составляющей которого является окислительный стресс Культивируемые растительные клетки испытывают влияние окислительного стресса в процессе роста в нормальных условиях на поздних стадиях развития культуры [Zhao et al, 2005], а также по'ц влиянием ряда факторов среды и условий культивирования [Cassels, Curry, 2001] Кислородные радикалы образуются в растительных клетках in vivo и in vitro как побочные продукты нормального окислительного метаболизма Изучение изолированных плазматических мембран различных растений, в том числе обработанных элиситорами, выявило NADPH-супероксид-синтазную активность [Auh and Murphy, 1995] Контакт суспензии культивируемых растительных клеток с ТНТ в нашем эксперименте приводил значительному повышению уровня образования АФК по сравнению с наблюдаемым в культуре независимо от воздействия ксенобиотика Таким образом, ТНТ по отношению растениям может рассматриваться как индуктор окислительного стресса

Ввиду высокой реакционной способности АФК нельзя исключать возможности нарушений поверхностных структур клетки за счет взаимодействия со свободными радикалами Показанное нами с применением метода флуоресцентного окрашивания увеличение проницаемости поверхности клеток различного эволюционного уровня при взаимодействии с ТНТ мы связываем с генерацией АФК, сопутствующей метаболически не опосредованной и опосредованной трансформации данного ксенобиотика клетками про- и эукариот Нарушение проницаемости мембранных структур, вероятно, связано с реакцией перекисного окисления липидов, которая играет важную роль в развитии клеточной патологии [Владимиров, Арчаков, 1972, Владимиров, 2000]

Таким образом, вероятной причиной изменений в проницаемости мембраны как бактериальных, так и растительных клеток является генерация АФК, в частности, супероксида, который способен атаковать жирнокислотные цепи фосфолипидов, содержащие сопряженные двойные связи, с образованием гидрофобных радикалов, взаимодействующих друг с другом

выводы

1 Из различных источников обитания выделены и идентифицированы три репрезентативных штамма микроорганизмов, трансформирующих 2,4,6-тринитротолуол по пути нитроредукции с образованием гидроксиламинодинитротолуолов в качестве основных метаболитов

2 Впервые показано, что для штаммов с различными типами метаболизма характерно образование активных форм кислорода на начальном этапе трансформации 2,4,6-тринитротолуола Более поздние этапы нитроредукции ТНТ штаммом Bacillus cereus ZS18 сопряжены со вторичным образованием гидроксильного радикала, что нехарактерно для штамма Pseudomonas putida ENI 582 В процессе же трансформации 2,4,6-тринитротолуола клеточной суспензией Lactobacillus plantarum IL1 в системе обнаруживался исключительно гидроксильный радикал

3 Увеличение концентрации 2,4,6-тринитротолуола и количества интактных клеток приводило к усилению генерации супероксидного анион-радикала Зависимость концентрации детектируемого супероксида от количества термически инактивированных клеток отсутствовала

4 Трансформация 2,4,6-тринитротолуола суспензией растительных клеток Fagopyrum tataricum происходит по механизму нитровосстановления и сопряжена с усилением фонового уровня оксидативного стресса в культуре

5 Контакт клеток различного уровня организации с 2,4,6-тринитротолуолом приводит к изменению их физиологических свойств, что выражается в увеличении проницаемости мембран, замедлении роста колоний бактерий и гибели каллусных клеток в культуре растительной ткани

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Зиганшин А М Гидридное восстановление 2,4,6-тринитротолуола дрожжами - путь к его глубокой деструкции / А М Зиганшин, А В Наумов, Е С Суворова, Е. А. Науменко, Р П Наумова // Микробиология - 2007 -Т 76, № 6 - С 766-773

2 Науменко Е. А. Участие кислорода в бактериальной трансформации 2,4,6-тринитротолуола / Е А Науменко, А В Наумов, Е С Суворова, Р Герлач, А М Зиганшин, А П Ложкин, Н И Силкин, Р П Наумова // Биохимия - 2008 - Т 73, №4 -С 568-575

3 Науменко Е. А. Образование активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола бактериями / Е А Науменко, А В Наумов, А М Зиганшин, А. П Ложкин, Н И Силкин, Р П Наумова, Казан roc ун-т - Казань, 2006 - 20 с - Деп в ВИНИТИ 27 12 2006, № 1617-В2006

4 Науменко Е.А. Начальные продукты трансформации 2,4,6-тринитротолуола грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами // в сборнике научных трудов Международного биотехнологического центра МГУ - М Спорт и Культура, - 2004 - С 54-55

5 Костычева Ю Ф К вопросу о ремедиадии почв, загрязненных взрывчатыми веществами / Ю Ф Костычева, А М Зиганшин, Е.А. Науменко, А В Наумов // Тез докл науч конф «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» -М Макс Пресс, - 2004 - С 101-102.

6 Костычева Ю Ф Метаболический блок на пути трансформации 2,4,6-тринитротолуола / Ю Ф Костычева, С А Зарипов, Е.А. Науменко, Р П Наумова // Тез докл 8-й Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино- 2004 -с 151

7 Науменко Е.А. Токсикологические аспекты микробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола // В сб науч студ работ ((Биотехнология - охране окружающей среды» - М Графикон-принт, - 2005 -С 339-341

8 Науменко Е.А. Оценка острой токсичности экологически опасных нитросоединений в тесте MICROTOX ™ / Е А Науменко, А П Ложкин, А М Зиганшин, Р П Наумова // Доклады Московского общества испытателей природы - 2006 - т 39, - с 238

9 Зиганшин А М Механизмы метаболической активации и детоксикации экологически опасных нитроароматических ксенобиотиков / А М Зиганшин, Е.А. Науменко, А П Ложкин, Р П Наумова // В сб статей Росс школы-конф молодых ученых «Экотоксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии» - Пущино-Тула - 2006 -С 70-72

10 Зиганшин А М Восстановление ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола дрожжами - обитателями нефтезагрязненных почв и нефтешламов / А М, Зиганшин, А И Гиндуллин, Е.А. Науменко, Р П Наумова // Доклады Московского общества испытателей природы - 2006 -т 39,-с 220

11 Сырова А В Оценка токсичности экологически опасных нитроароматических ксенобиотиков / А В Сырова, Е.А. Науменко, А П Ложкин // Тез докл международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» - Москва-2007 -с 118-119

12 Хиляс И В Микроорганизмы-деструкторы химических загрязнения осадков и почв /ИВ Хиляс, Е.А. Науменко // Тез докл международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» -Москва-2007 - с 123

13 Naumenko Е.А. Generation of superoxide m 2,4,6-trmitrotoluene microbial transformation / E A Naumenko, A P Lozhkm, A M Ziganshm, R P Naumova, N I Silkm // Abstracts of the international conference "Modem development of magnetic resonance" - Kazan - 2007 - p 213-214

14 Зиганшин A M Гидроксиламины как основные метаболиты трансформации 2,4,6-тринитротолуола / AM Зиганшин, Е.А. Науменко, А П Ложкин, А Н Крицкая, Р П Наумова // Тез докл 9-й Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино-2005 -с 102

15 Науменко Е.А., Динамика токсичности в процессе биотрансформации 2,4,6-тринитротолуола / Е А Науменко, А П Ложкин, А М Зиганшин, Р П

Наумова // Тез докл 10-й Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино- 2006 -с 204

16 Хиляс И В Редукция ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола -путь , ведущий к его разрушению /ИВ Хиляс, А М Зиганшин, Е.А. Науменко, Р П Наумова // Тез докл Региональной конф молодых ученых с межд участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» - Екатеринбург-Пермь - 2007 -с 29-30

17 Субхангулова А Р Оценка функционального состояния бактериальных клеток в процессе трансформации 2,4,6-тринитротолуола / АР Субхангулова, А П Ложкин, Е.А. Науменко, А Р Мухитов, В В Сальников, Р П Наумова // Материалы Всеросс науч -практ конф с межд участием «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» -Киров-2007 - с 198-200

18 Сырова А В Экспресс-биотестирование для оценки токсического потенциала 2,4,6-тринитротолуола и его метаболитов // А В Сырова, А П Ложкин, А А Данилова, Е.А Науменко, Р П Наумова // Материалы Всеросс науч -практ конф с межд участием «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» - Киров-2007 - с 195-197

19 Сырова А В Трансформация 2,4,6-тринитротолуола молочнокислыми бактериями - путь к его частичной детоксикации /А В Сырова, А П Ложкин, Е.А. Науменко, РП Наумова // Тез докл 11-й Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино- 2007 -с 48

20 Субхангулова А Р К вопросу о биологической трансформации 2,4,6-тринитротолуола /АР Субхангулова, Е.А. Науменко, А П Ложкин, Р П Наумова // Тез докл 11-й Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» - Пущино- 2007 -с 47

21 Хиляс ИВ Гидридное восстановление 2,4,6-тринитротолуола несовершенными грибами родов Candida и Geotrichum /ИВ Хиляс, Е.А. Науменко, А П Ложкин, А М, Зиганшин, Р П Наумова // Тез докл 11 -й Пущинской школы-конф молодых ученых «Биология - наука XXI века» -Пущино-2007 -с 51

22 Ложкин А П Метаболическая активация и детоксикация тринитротолуола в процессе трансформации молочнокислыми бактериями, выделенными из нефтешлама / А П Ложкин, Е.А. Науменко // Материалы 60-й студ конф биологич факультета «Биосистемы организация, поведение, управление» -Нижний Новгород-2007 - с 49-51

Отпечатано е ООО «Печатный двор» г г Казань, у т. Журналистов, 1/16, пф.207 ТеЛ -272-74-59, 541-76-41, 541-76-51 Лицензия ПД-№7-0215,от 01,11.2001 г У Выдана Поволжским межрегиональным ' территориальным управлением МПТР РФ Подписано в печать 21 08 2008г Усл. п.л 1,5 Заказ М К-6558. Тираж 100 зкз. Формат 60x841/16 Бумага офсетная. Печать - ризография

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Науменко, Екатерина Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола (ТНТ).

1.1.1. Аэробная трансформация ТНТ микроорганизмами.

1.1.2. Трансформация ТНТ растениями.

1.2. Токсичность и мутагенная активность ТНТ и его метаболитов

1.2.1. Токсические эффекты ТНТ.

1.2.2. Мутагенная активность ТНТ и его метаболитов.

1.3. Биологические эффекты активных форм кислорода (АФК).

1.3.1. Характеристика основных типов АФК, механизмы их образования в организмах разного эволюционного уровня.

1.3.2. Методы определения АФК в биологических системах.

1.4. Транспорт железа: сидерофоры, железоредуктазная активность.

Роль железа в развитии патологических состояний.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы и реагенты.

2.2. Бактериальные штаммы и культура растительной ткани.

2.3. Определение видовой принадлежности бактериальных штаммов.

2.3.1. Выделение геномной ДНК.

2.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.3.3. Секвенирование продукта ПЦР.

2.4. Трансформация ТНТ.

2.4.1. Трансформация ТНТ клеточными суспензиями бактерий.

2.4. 2. Трансформация ТНТ клеточной суспензией каллусной ткани

2.4.3. Трансформация ТНТ ферроцианидом.

2.4.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов трансформации ТНТ.

2.5. Определение потребления кислорода клеточными суспензиями

2.6. Определение активных форм кислорода (АФК).

2.6.1. Определение супероксидного анион-радикала (О2") адренохромным методом.

2.6.2. ЭПР-спектроскопия АФК.

2.7. Определение физиологического статуса бактериальных и растительных клеток в процессе трансформации ТНТ.

2.7.1. Определение клеточной проницаемости методом флуоресцентного окрашивания.

2.7.2. Определение жизнеспособности клеток культуральными методами.

2.8. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Выделение и идентификация микроорганизмов.

3.1.1. Выделение бактериальных штаммов и определение их родовой принадлежности.

3.1.2. Видовая идентификация штаммов.

3.2. Трансформация ТНТ клеточными суспензиями.

3.2.1. Трансформация ТНТ интактными бактериальными клетками

3.2.2. Трансформация ТНТ термически инактивированными бактериальными клетками.

3.2.3. Трансформация ТНТ клетками гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.

3.3. Потребление кислорода суспензией бактериальных клеток.

3.4. Образование АФК в процессе трансформации ТНТ.

3.4.1. Внеклеточная продукция АФК в процессе микробной трансформации ТНТ.

3.4.2. Образование АФК в процессе трансформации ТНТ культивируемыми клетками F. tataricum.

3.5. Оценка роли ионов железа в трансформации ТНТ и образовании АФК.

3.5.1. Влияние хелатирующих агентов на биотрансформацию ТНТ и образование АФК.

3.5.2. Небиологическая трансформация ТНТ ферроцианидом (K4[Fe(CN)6]).

3.6. Функциональные изменения клеток в процессе трансформации

3.6.1. Оценка физиологического состояния клеток методом флуоресцентного окрашивания.

3.6.2. Определение жизнеспособности клеток В. cereus и F. tataricum культуральным методом.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола"

Актуальность работы. Присутствие устойчивых химических токсикантов в окружающей среде вызывает всеобщую озабоченность в связи с воздействием этих загрязнителей на природные объекты и организм человека. Антропогенное влияние на окружающую среду приводит к ее загрязнению химически синтезированными соединениями — ксенобиотиками, которые содержат элементы химической структуры, редко или никогда не встречающиеся в природе. В связи с этим такие ксенобиотики не распознаются существующими ферментами биодеградации и, как следствие, они циркулируют и накапливаются в живых организмах и окружающей среде [Наумова, 1985; Peres, Agatos, 2000]. Нитроароматические соединения, одна из широко распространенных групп ксенобиотиков, используются в качестве взрывчатых веществ, гербицидов, инсектицидов, а также как сырье для производства полимеров, красителей, лекарств. Нитроарилы составляют группу важных экологически опасных загрязнителей в связи с их относительной стабильностью в биосфере, а также токсическими и мутагенными эффектами. Только небольшое число ароматических соединений, содержащих одну нитрогруппу, синтезируется микроорганизмами, в частности, описаны хлорамфеникол [Vats et al., 1987], ауреотин [Не, Hertwerck, 2003], фидолопин [Ayer et al., 1984], нитропиолюторин [Ohmori et al., 1978] и оксипирролнитрин [Hashimoto, Hattori, 1966]. Основное загрязнение окружающей среды нитросоединениями происходит за счет различных видов деятельности человека.

Среди нитроароматических соединений наибольшее распространение получил 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ), который несколько десятилетий использовался в качестве основного компонента взрывчатых смесей. Широкое применение ТНТ в ходе двух мировых войн привело к загрязнению наземных и водных экосистем. В частности, обширному загрязнению 4 подверглись территории Германии и США. Известно о сбросе неиспользованных боеприпасов в Средиземное море, а также о загрязнении ряда районов Адриатического моря в ходе недавнего конфликта в Косово [Delia Torre et al., 2006].

Токсичность THT и его метаболитов показана в различных тест-системах, от клеток бактерий до млекопитающих [Lachance et al., 2004]. Нитроарилы, в том числе ТНТ, выступают как причина апластической анемии, нарушений функций печени, развития катаракты. Кроме того, показана мутагенная активность ТНТ и его метаболитов по отношению к микроорганизмам и культурам клеток млекопитающих.

Абсолютное большинство микроорганизмов способно тем или иным образом воздействовать на молекулу ТНТ. Наиболее распространенным путем микробной трансформации данного соединения в аэробных условиях является последовательный двухэлектронный восстановительный механизм, приводящий к превращению нитрогруппы через нитрозо- и гидроксиламино-в аминогруппу. Наиболее полная восстановительная трансформация ТНТ до триаминотолуола выявлена только у строго анаэробных микроорганизмов [Preuss et al., 1992; Funk et al., 1993].

В аэробных условиях для подавляющего большинства микроорганизмов наиболее характерно образование изомерных ГАДНТ в качестве основных метаболитов ТНТ и отсутствие дальнейшего их масштабного восстановления до моноаминопроизводных. Возможно почти стехиометрическое восстановление ТНТ в ГАДНТ представителями родов Lactobacillus [Наумов с соавт., 1999] и Pseudomonas [Зарипов с соавт., 2004].

Вопрос о возможности одноэлектронного восстановления ТНТ в литературе предполагается с участием «кислород-чувствительной» нитроредуктазы, исходным донором электронов для которой является NAD(P)H, а разобщение двухэлектронного потока происходит на уровне флавинов [Spain, 2000].

Несмотря на интерес исследователей к проблеме трансформации ТНТ, ряд принципиальных аспектов взаимодействия ксенобиотика с клетками остается неизученным. В частности, обращает на себя внимание тот факт, что вся мировая и отечественная литература, посвященная ТНТ, рассматривает либо восстановление его нитрогрупп, либо гидридное восстановление ароматического кольца. В то же время практически отсутствуют сведения о вовлечении кислорода в данный процесс и связанное с ним образование активных форм кислорода (АФК) в системе ТНТ-бактериальные клетки.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - охарактеризовать участие активных форм кислорода в процессе трансформации 2,4,6-тринитротолуола клетками различного уровня организации. Ставились следующие задачи:

1. Выделить из различных источников обитания и идентифицировать микроорганизмы, трансформирующие 2,4,6-тринитротолуол по пути восстановления его нитрогрупп с преимущественным образованием гидроксиламинодинитротолуолов в качестве метаболитов

2. Выявить особенности образования активных форм кислорода метаболически различными штаммами с применением метода электронного парамагнитного резонанса, а также спектрофотометрически

3. Охарактеризовать кинетические параметры трансформации 2,4,6-тринитротолуола, сопряженной с генерацией супероксидного анион-радикала

4. Охарактеризовать особенности трансформации 2,4,6-тринитротолуола культивируемыми растительными клетками

5. Выявить изменение физиологического состояния клеток различного уровня организации при взаимодействии с 2,4,6-тринитротолуолом

Научная новизна. Впервые методом ЭПР-спектроскопии, а также с применением спектрофотометрического анализа, выявлено, что контакт бактериальных клеток с ТНТ сопряжен с генерацией АФК, в частности, супероксид-аниона и гидроксильного радикала, во внеклеточном пространстве, тогда как взаимодействие клеток с другими полинитроарилами не приводит к образованию АФК. Проведено детальное изучение качественных и количественных характеристик образования кислородных радикалов на начальном этапе трансформации ТНТ у микроорганизмов из различных физиолого-таксономических групп. Показана генерация наиболее реактивной формы кислорода гидроксильного радикала при воздействии ТНТ на клеточную суспензию Lactobacillus plantarum, а также вторичное образование данного типа АФК на более поздних этапах трансформации ксенобиотика штаммом Bacillus cereus. Впервые выявлена роль ТНТ как индуктора окислительного стресса в культуре клеток растений.

С применением оригинального подхода с привлечением хелаторов и комплексного соединения железа получены приоритетные данные, свидетельствующие о роли ионов металлов с переменной валентностью в инициации трансформации ТНТ по пути одноэлектронного восстановления. В работе впервые охарактеризована роль клеточной поверхности бактерий и ассоциированных с ней переходных металлов в процессе трансформации ТНТ.

Впервые при использовании метода двойного флуоресцентного окрашивания показано изменение проницаемости клеток различного уровня организации в ответ на воздействие ТНТ.

Практическая значимость. Показанная в работе внеклеточная аккумуляция АФК на раннем этапе микробной трансформации ТНТ представляет интерес в связи с высокой токсичностью кислородных радикалов, представляющих опасность окисления мембранных липидов, а также фрагментации ДНК, развитии воспаления, повреждения сосудов. Обнаруженное нами образование АФК клеточными суспензиями при контакте с ТНТ может вносить решающий вклад в проявление токсических и генотоксических эффектов ТНТ в отношении организмов разного эволюционного уровня. В целом, результаты данной работы позволяют по-новому взглянуть на механизмы развития профессиональных заболеваний при контакте с данным ксенобиотиком в условиях производства. Обнаружение закономерностей и предполагаемого механизма генерации АФК в процессе трансформации ТНТ бактериальными клетками позволяет пересмотреть концепцию начального этапа его микробного метаболизма. Установленная индукция окислительного стресса при взаимодействии растительных клеток с ТНТ in vitro имеет значение для определения оптимальных условий трансформации ксенобиотика in vivo при разработке стратегии фиторемедиации ТНТ-загрязненных территорий.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа поддержана федеральными программами "Развитие научного потенциала высшей школы" РНП.2.1.1.1005, РНП.2.1.1.3222 и "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники" ГК 02.434.11.3020, ГК 02.512.11.2050, ГК ФЦКП КГУ 02.451.11.7019, Комиссией Европейских Сообществ (грант ICA2-СТ-2000-10006), индивидуальным грантом КГУ (2008 г.). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Видовую идентификацию штаммов микроорганизмов осуществляли на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН в Лаборатории биологии плазмид. ЭПР-спектроскопию проводили на кафедре электроники и радиоспектроскопии КГУ. Конфокальная флуоресцентная микроскопия выполнена в Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН.

Положения, выносимые на защиту:

1. С применением метода электронного парамагнитного резонанса, а также спектрофотометрического анализа выявлено, что начальный этап аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола бактериями сопряжен с образованием активных форм кислорода

2. У микроорганизмов из различных таксономических групп выявлены различия качественных и количественных характеристик генерации активных форм кислорода в ответ на контакт клеток с 2,4,6-тринитротолуолом 3. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола клетками различного уровня организации сопряжена с изменением клеточной поверхности как барьера проницаемости

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на школах-конференциях молодых ученых "Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии" (Пущино-Тула, 2006) и "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004, 2005, 2006, 2007), "Ломоносов-2007" (Москва,2007), научных конференциях "Биотехнология — охране окружающей среды" (Москва, 2004, 2005, 2006), "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), "Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития" (Киров, 2007), "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" (Екатеринбург-Пермь, 2007), "Биосистемы: организация, поведение, управление" (Нижний Новгород, 2007), международной конференции "Modern development of magnetic resonance" (Kazan, 2007), а также на итоговых конференциях КГУ (2005-2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 21 научная работа, в том числе 2 статьи и одна депонированная рукопись.

Структура и объем диссертации Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 37 рисунков. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 195 источников, из них 169 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Науменко, Екатерина Анатольевна

выводы

1. Из различных источников обитания выделены и идентифицированы три репрезентативных штамма микроорганизмов, трансформирующих 2,4,6-тринитротолуол по пути нитроредукции с образованием гидроксиламинодинитротолуолов в качестве основных метаболитов

2. Впервые показано, что для штаммов с различными типами метаболизма характерно образование активных форм кислорода на начальном этапе трансформации 2,4,6-тринитротолуола. Более поздние этапы нитроредукции 2,4,6-тринитротолуола штаммом Bacillus cereus ZS18 сопряжены со вторичным образованием гидроксильного радикала, что нехарактерно для штамма Pseudomonas putida EN1582. В процессе же трансформации 2,4,6-тринитротолуола клеточной суспензией Lactobacillus plantarum IL1 в системе обнаруживался исключительно гидроксильный радикал

3. Увеличение концентрации 2,4,6-тринитротолуола и количества интактных клеток приводило к усилению генерации супероксидного анион-радикала. Зависимость концентрации детектируемого супероксида от количества термически инактивированных клеток отсутствовала

4. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола суспензией растительных клеток Fagopyrum tataricum происходит по механизму нитровосстановления и сопряжена с усилением фонового уровня оксидативного стресса в культуре

5. Контакт клеток различного уровня организации с 2,4,6-тринитротолуолом приводит к изменению их физиологических свойств, что выражается в увеличении проницаемости мембран, замедлении роста колоний бактерий и гибели каллусных клеток в культуре растительной ткани

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую признательность моему научному руководителю Наумовой Римме Павловне за разработку интересной научной темы и внимательное отношение к работе.

Благодарю всех тех, кто помогал мне в работе над диссертацией: Гафарова Арслана Булатовича за помощь в идентификации микроорганизмов, Силкина Николая Ивановича и Родионова Александра за проведение экспериментов по ЭПР-спектроскопии и интерпретацию результатов, Шурхно Равилю Абдулловну за проведение ВЭЖХ, Гордона Льва Хаймовича и Валитову Юлию Наильевну за предоставление возможности постановки манометрических опытов и обсуждение полученных результатов, Сальникова Вадима Владимировича и Мухитова Александра Ринатовича за помощь в проведении флуоресцентной микроскопии, Румянцеву Наталью Ивановну за предоставление культуры растительных клеток, а также коллектив Лаборатории экологической биотехнологии и биомониторинга, в особенности Ложкина Андрея Петровича и Зиганшина Айрата Мансуровича, а также студентов -Субхангулову Айгуль Расыковну и Сырову Анну Викторовну. Отдельная благодарность инженерам кафедры микробиологии - Мочаловой Наиле Касимовне и Пономаревой Альфие Зарифовне.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В сложившейся на сегодняшний день концепции биотрансформации ТНТ основное внимание сконцентрировано на двух альтернативных механизмах конверсии данного устойчивого ксенобиотика: последовательном двухэлектронном восстановлении нитрогрупп и восстановлении ароматического кольца. Следует отметить, что в природе первый путь является доминирующим, тогда как альтернативная восстановительная атака ТНТ нехарактерна для большинства организмов. При этом роль кислорода в процессе трансформации нитроарила четко не обозначена. Более того, несмотря на теоретическую возможность одноэлектронного восстановления ТНТ, экспериментальные доказательства образования АФК и их вовлечения в начальный этап трансформации данного соединения аэробными бактериями до настоящего момента не были получены.

Применение в данной работе оригинального подхода, включающего определение уровня потребления кислорода клеточными суспензиями и ЭПР-спектроскопию, позволило впервые выявить генерацию АФК на раннем этапе трансформации ТНТ микроорганизмами с различным типом метаболизма и клетками высших эукариот, а также охарактеризовать качественные и количественные характеристики образования кислородных радикалов.

На основании скрининга ряда штаммов бактерий выявлен моментальный характер снижения концентрации ТНТ, не связанный с его сорбцией клетками. Характерно, что даже термически инактивированные, не способные к образованию колоний клетки способны к снижению концентрации ТНТ. В совокупности эти данные позволяют предполагать неферментативную природу начального этапа трансформации ТНТ, сопряженного с генерацией АФК.

Предположение об участии ионов металлов с переменной валентностью, ассоциированных с клеточной поверхностью на самых ранних этапах трансформации ТНТ было проверено нами с привлечением обработки клеток хелатирующими агентами и анализа взаимодействия ксенобиотика с комплексным соединением двухвалентного железа. Полученные данные позволили предположить существование редокс-цикла с участием ТНТ и кислорода, в котором в качестве донора электронов могут выступать структурные элементы поверхности клеток, содержащие ионы металлов с переменной валентностью. Образующийся нитроанионный радикал, существование которого экспериментально не доказано, нестабилен и способен в аэробных условиях передавать избыточный электрон на кислород с образованием Ог и регенерацией исходного соединения.

Привлечение культивируемых клеток эукариот позволило выявить, что начальные этапы трансформации ТНТ и сопровождающие этот процесс свободно-радикальные превращения носят универсальный характер для клеток различного уровня организации. При этом показанное нами нарушение проницаемости клеток, вероятнее всего, связано именно с генерацией АФК, которые служат триггерным механизмом развития ПОЛ

В целом, выявление генерации АФК на раннем этапе биотрансформации ТНТ вносит существенный вклад в понимание механизмов развития токсических эффектов данного ксенобиотика в организмах различного эволюционного уровня, а также будет способствовать совершенствованию общей концепции биодеградации ТНТ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Науменко, Екатерина Анатольевна, Казань

1.Н. Сравнительное исследование острой токсичности а-тринитротолуола и продуктов его биодеградации для гидробионтов Текст./ Н.Н. Амерханова, Р.П. Наумова // Биологические науки. - 1979. - № 2. - С.26-31.

2. Амерханова, Н.Н. Микроорганизмы разрушающие 2,4,6-тринитротолуол. Текст./ Н.Н. Амерханова, Р.П. Наумова // Сборн. аспир. работ. Сер.Биол. Изд-во Казанск. унив.-та., 1975. С. 144 -146.

3. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах Текст./ Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков // М.: Наука, 1972.-252 с.

4. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах Текст./ Ю.А. Владимиров // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т. 6, № 12. - С. 13-19.

5. Грибова, И.А. Изменение крови при воздействии низких концентраций тринитротолуола (клинико-экспериментальные исследования) Текст./ И.А. Грибова, Р.А. Габулгалимова, Е.Г. Дымова, Г.Б. Попова // Гигиена труда и проф. заболеваний. 1983.- №9. - С.24

6. Грушко, Я.М. Вредные неорганические соединения в промышленных сточных водах Текст./ Я.М. Грушко // Л.гХимия. 1979. -160 с.

7. Дымова, В.Г. Гигиеническое значение загрязнений кожных покровов химическими веществами, проникающими через кожу и методы их оценки. Текст./ В.Г. Дымова // Гигиена труда в химической и химико-фармацевтической промышленностити; М.: Мир. -1956. - С.16-25.

8. Зарипов, С.А. Альтернативные пути начальной трансформации 2,4,6-тринитротолуола дрожжами Текст./ С.А. Зарипов, Е.В. Никитина, А.В. Наумов, Р.П. Наумова // Микробиология. 2002. - Т.71, № 5. - С.648-653.

9. Зарипов, С.А. Начальные этапы трансформации 2,4,6-тринитротолуола микроорганизмами Текст./ С.А. Зарипов, А.В. Наумов, Е.С. Суворова, А.В. Гарусов, Р.П. Наумова // Микробиология. — 2004. Т.73, № 5. - С.472-478.

10. Камнев, А.А. Физико-химические и экологические аспекты взаимодействия индолил-3-уксусной кислоты с железом (III) Текст./ А.А. Камнев, Ю.Д. Перфильев // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. — 2000. — Т.41, № 3. С.205-210.

11. Карамова, Н.С. 2,4,6-триниротолуол и 2,4-диамино-6-нитротолуол: отсутствие гесА-зависимого мутагенеза Текст./ Н.С. Карамова, И.И. Мынина, Г.Г. Гараева, О.Б. Иванченко, О.Н. Ильинская // Генетика. -1995. Т.31. — С.617-621.

12. Манойлова, И.К. Влияние тринитротолуола на глаз. Текст./ И.К. Манойлова // Сб. Науч. работ Воен.-мед. фак. при Куйбышевском мед. Институте. 1977. - вып. 7. - С. 113.

13. Маянский, А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге Текст./ А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. — Новосибирск: Наука. — 1983. — 264 с.

14. Наумов, А.В. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола лактобациллами с образованием токсичных гидроксиламинопроизводных Текст./ А.В. Наумов, Е.С. Суворова, A.M. Воронин, С.К. Зарипова, Р.П. Наумова// Микробиология. 1999. - Т.68, №1. - С.65-71. .

15. Наумов А.В. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола молочнокислыми бактериями с образованием гидроксиламинодинитротолуолов Текст./ А.В. Наумов, С.К. Зарипова, Е.С.

16. Суворова, Э.Т. Хамидуллина, A.M. Воронин, Д.Р. Вайлд, Р.П. Наумова // Докл. Акад. Наук. 1998. - Т.361, №2. - С.264-267.

17. Наумова, Р. П. Превращение 2,4,6-тринитротолуола в условиях кислородного и нитратного дыхания Pseudomonas fluorescens Текст./ Р. П. Наумова, С. Ю. Селивановская, И. Е. Черепнева // Прикладн. биохим. микроб. 1988. - Т.24, №.4. -С.493-498.

18. Наумова, Р.П. Превращение 2,4,6-тринитротолуола под действием микроорганизмов Текст./ Р.П Наумова, Т.О Белоусова., Р.М Гилязова // Прикл. биохим. и микробиол. 1982 - Т.18, №1. - С.85-90.

19. Наумова, Р. П. Микробный метаболизм неприродных соединений Текст. / Р.П. Наумова. — Казань: Изд-во Казанского университета, 1985. 240с.

20. Осипов, А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме Текст./ А.Н. Осипов, О.А. Азизова, Ю.В. Владимиров // Успехи биол. химии 1990.-Т.31,№6.-С. 180-208.

21. Роговская, И.И. Влияние ТНТ на микроорганизмы и биохимические процессы самоочищения воды. / Роговская И.И. // Микробиология.- 1961 Т.20, №3. - С.265-272.

22. Румянцева, Н.И. Особенности морфогенеза в длительно культивируемых каллусах гречихи Текст./ Н.И. Румянцева, Сальников В.В., Федосеева Н.В., Лозовая Н.В., Лозовая В.В. // Физиол. раст. 1992. — Т.39, №1. - С. 143-151.

23. Скулачев, В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода Текст./ В. П. Скулачев // Соросовский образовательный журнал. — 2001. — Т.7, №6. — С.4-10.

24. Экспериментальные методы химической кинетики: учебное пособие Электронный ресурс./ 2007. Режим доступа: http://www.chem.msu.su/rus/teaching/kinetics-exp/ - свободный.

25. Adams, R.M. Global climate change and U.S. agriculture Text./ R.M.Adams, C. Rosenzweig, R.M. Peart, J.T. Ritchie, B.A. McCarl, J.D. Glyer, R.B. Curry, J.W. Jones, K.J. Boote, L.H. Allen, Jr. // Nature 1990. - V.345. -P.219-224.

26. Ahlborg, G.Jr. Urinary screening for potentially genotoxic exposures in a chemical industry Text. / G.Jr.Ahlborg, B. Bergstrom, C. Hogstedt, P. Einisto, M. Sorsa // Br. J. Ind. Med. 1985. - V.42, No 4. - P.691-699.

27. Ambruso, D.R. Lactoferrin enhances hydroxyl radical production by human neutrophils, neutrophil particulate fractions, and an enzymatic generating system D.R. Ambruso, R.B Johnston Jr. Text./ J. Clin. Invest. 1981. - Y.67. - P. 352-360

28. Askerlund, P. NAD(P)H oxidase and peroxidase activities in purified plasma membranes from cauliflower inflorescences Text./ P. Askerlund, C. Larsson, S. Widell, I.M. MMler // Physiol. Plant. 1987. - V.71. - P.9-19.

29. Auh, C.K. Plasma membrane redox enzyme is involved in the synthesis of 0{ and H202 by Phytophtora elicitor stimulated rose cells Text./ C.K. Auh, T.R. Murphy // Plant. Phisiol. 1995. - V.107. - 1241-1247.

30. Ayer, S. Phidolopin, a new purine derivative from the bryozoan Phidolopora pacifica II S. Ayer, R.J. Andersen, H. Cun-Heng, J. Clardy // J. Org. Chem. V.49. - P.3869-3870.

31. Bannister, J.V. An EPR study of the production of superoxide radicals by neutrophil NADPH oxidase Text./ J.V. Bannister, P. Bellavite, M.C. Serra, P.J. Thornalley, F. Rossi // FEBS Lett. 1982. - V.145, No 2. -P.323-326.

32. Barber, M.J. Superoxide production during reduction of molecular oxygen by assimilatory nitrate reductase Text./ MJ. Barber, C.J. Kay // Arch. Biochem. Biophys. 1996. - V.326. - P.227-232.

33. Barchini, E. Extracellular iron reductase activity produced by Listeria monocytogenes Text./ E. Barchini, R.E. Coward // Arch. Microbial. 1996. -V.166. -P.51-57.

34. Bhadra, R. Confirmation of conjugation processes during TNT metabolism by axenic roots Text./ Environ. Sci. Technol. / R. Bhadra, D.G. Wayment., J.B. Hughes, J.V. Shanks // 1999.- V.33 -P.446-452.

35. Bhuyan, K.C. Regulation of hydrogen peroxide in eye humors. Effect of 3-amino-lH-l,2,4-triazole on catalase and glutathione peroxidase of-rabbit eye

36. Text./ K.C. Bhuyan, D.K. Bhuyan // Biochim. Biophys. Acta. 1977. - V.497. -P.641-651.

37. Bielski, B.H. A study of the reactivity of H02/02- with unsaturated fatty acids B.H. Bielski, R.L. Arudi, M.W. Sutherland Text./ J. Biol. Chem. -1983. V.258, No 8. -P.4759-4761.

38. Boopathy, R. Nitroaromatic compounds serve as nitrogen source for Desulfovibrio sp. (B. strain) Text./ R. Boopathy, C.F. Kulpa // Can. J. Microbiol.- 1993. -V. 34. P. 430-433.

39. Boopathy, R. Trinitrotoluene as a sole nitrogen source for a sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio sp. (B strain) isolated from an anaerobic digester Text./ R. Boopathy, C.F. Kulpa // Curr. Microbiol. 1992. - V. 25. - P. 235-241.

40. Bowern, N. Inhibition of autoimmune neuropathological process by treatment with an iron-chelating agent Text./ N. Bowern, I.A. Ramshaw, I.A. Clark, P.C. Doherty // J. Exp. Med. 1984 - V.160. - P. 1532-1543.

41. Bryant, C. Purification and characterization of an oxygen-insensetive NAD(P)H nitroreductase from Enterobacter cloacae Text. / C. Bryant, M. DeLuca // J. Biol. Chem. 1991.-V.266. - P.4119-4125.

42. Bultreys, A. Production and comparison of peptide siderophores from strains of distantly related pathovars of Pseudomonas syringae and Pseudomonas viridiflava LMG 2352 Text./ A.Bultreys, I. Gheysen // Appl. Environ. Microbiol.- 2000. — V.66. P.325-331

43. Carlioz, A. Isolation of superoxide dismutase mutants in Escherichia coli: is superoxide dismutase necessary for aerobic life Text. / A. Carlioz, D. Touati // EMBO. 1986. - V.5. - P.623-630.

44. Carr, R.J.G. Toxicity of paraquat to microorganisms Text./ R.J.G. Carr, R.F. Bilton, T. Atkinson // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V.52, No 6. -P.l 112-1116.

45. Chandra, A.M.S. Hematological effects of 1,3,5-trinitrobenzene (TNB) in rats in vivo and in vitro Text./ A.M.S. Chandra, C.W. Quails, G. Reddy, J.H. Meinkoth // J. Toxicol, and Environ. Health. 1995. - V.46. - P. 57-72.

46. Chekol, Т.A study of the use of alfalfa (Medicago sativa L.) for phytoremediation of organic contaminants in soil Text./ T. Chekol, L.R. Vough // Remediation J. 2001. - V.11. - P.89-101.

47. Clark, I.A. Evidence for reactive oxygen intermediates causing hemolysis and parasite death in malaria Text./ I.A. Clark, N.H. Hunt // Infect Immun.- 1983.-V.39, No 1.-P.1-6.

48. Cowart, R.E. Differential effects of iron on the growth of Listeria monocytogenes: minimum requirements and mechanism of acquisition Text./ R.E. Cowart, B.G. Foster //J. Infect. Dis. 1985. - V.151. - P.721-730.

49. Cruz-Uribe, O. Comparison of TNT removal from seawater by three marine macroalgae Text. / O. Cruz-Uribe, D. P. Cheney, G. L. Rorrer // Chemosphere. 2007. - V.67. - P. 1469-1476.

50. Cunningham, S.D. Phytoremediation of soils contaminated with organic pollutants Text./ S.D. Cunningham, T.A. Anderson, A.P. Schwab, F. Hsu / Adv. Agron. 1996. - V.56. - P.55-114.

51. De Man, J.C. A medium for the cultivation of lactobacilli Text./ J.C.De Man, M.Rogosa, M.T.Sharpe // J. Appl. Bacteriol. 1960. - V.23. - P. 130-135.

52. Dikalova, A.E. An in vivo ESP spin-trapping study: free radical generation in rats from formate intoxication role of the Fenton reaction Text./ A.E. Dikalova, M.B. Kadiiska, R.P. Mason // PNAS. - 2001. - V.98, No 24. -P.13549-13553.

53. Dilley, J.V. Short-term oral toxicity of 2,4,6-trinitrotoluene in mice, rats and dogs Text./ J.V. Dilley, C.A. Tyson, R.J. Spanggord, D.P. Sasmore, G.W. Newell, J.C. Dacre // J. Toxicol. Environ. Health. 1982. - V. 9. - P. 565-585.

54. Djerassi, L. Hemolytic crisis in G6PD-deficient individuals in the occupational setting Text./ L. Djerassi // Int. Arch. Occup. Environ. Health. -1998. V.71.-P.26-28.

55. Dodard, S.G. Ecotoxicity characterization of dinitrotoluenes and some of their reduced metabolites Text./ S.G. Dodard, A.Y. Renoux, J. Hawari, G. Ampelman, S. Thiboutot, G.I. Sunahara // Chemosphere. 1999. - V.38, No 9. -P.2071-2079.

56. Duque, E. Construction of a Pseudomonas hybrid strain that mineralizes 2,4,6-trinitrotoluene Text./ E. Duque, A. Haydour, F. Godoy, J.L. Ramos // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 2278-2283.

57. Elroy-Stein, O. Impaired neurotransmitter uptake in rat PC 12 cells overexpressing human Cu/Zn-superoxide dismutase. Implication for gene dosage effects in Down's syndrome Text./ O. Elroy-Stein, Y. Groner // Cell 1988. -V.52. — P.259-267

58. Esteve-Nunez, A. Biological degradation of 2,4,6-trinitrotoluene / A. Esteve-Nunez, A. Caballero, J.L. Ramos // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - V. 65.-P. 335-352.

59. Farr, S. Oxygen-dependent mutagenesis in Escherichia coli lacking superoxide dismutase Text./ S. Farr, R. D'Ari, D Touati // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. — V.83. -P.8268-8272.

60. Finkelstein, E. Production of hydroxyl radical by decomposition of superoxide spin-trapped adducts Text./ E. Finkelstein, G.M. Rosen, E.J. Rauchman // Mol. Pharmacol. 1982. - V.21. - P.826-265.

61. Flint, D. H. The inactivation of Fe-S cluster containing hydrolyases by superoxide Text. / D. H. Flint, J. F. Tuminello, N. H. Emptage // J. Biol. Chem. 1993. - V.268. - P.22369-22376.

62. Flitter, W. Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of iron salts. What is the physiological iron chelator? Text./ W. Flitter, Rowley D.A., B. Halliwel // FEBS Lett. 1982. - V.158. -P.310-312.

63. Floyd, R.A. Direct demonstration that ferrous ion complexes of di-and triphosphate nucleotides catalyse hydroxyl free radical formation from hydrogen peroxide Text./ R.A. Floyd // Arch. Biochem. Biophys. 1983. - V.225 -P. 263-270.

64. French, P.D. Aerobic degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Enterobacter cloacae PB2 and by pentaerythritol tetrenitrate reductase Text./ P.D. French, S. Nicklin, N.C. Bruce // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, No 8. -P. 2864-2868.

65. Fridovich, I. Superoxide anion radical, superoxide dismutases, and related matters / I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1997. - V.272, No 30. - P.18515-18517.

66. Frische, T Soil microbial parameters and luminescent bacteria assays as indicators for in situ bioremediation of TNT-contaminated soils Text./ T. Frische, H. Hoper // Chemosphere. 2003 - V.50, No 3. - P. 415-427.

67. Frishe, T. Screening for soil toxicity and mutagenicity using luminescent bacteria a case study of the explosive 2,4,6, - trinitrotoluene Text./ T. Frishe // Ecotoxicology and Environmental Safety. - 2002 - V.51. - P.133-144.

68. Fuller, M.E. Aerobic gram-positive and gram-negative bacteria exhibit differential sensitivity to and transformation of 2,4,6-trinitrotoluene Text./ M.E. Fuller, J.F. Manning // Curr. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 77-83.

69. Funk, S.B. Initial-phase optimization for bioremediation of munition compound-contaminated soils / S.B. Funk, D.J. Roberts, D.L. Crawford, R.L. Crawford // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 2171-2177.

70. Funk, S. B. Full-scale anaerobic bioremediation of trinitrotoluene contaminated soil Text. / S. B. Funk, D. L. Crawford, R. L. Crawford, G. Mead, W. Davis-Hooker//Appl. Biochem. Biotechnol. 1995. - V.51. -P.625-633.

71. Georgatsou, E. Regulated expression of the Saccharomyces cerevisiae Frelp/Fre2p Fe/Cu reductase related genes Text./ Georgatsou, D. Alexandraki // Yeast 1999. - V.15. - P.573-584.

72. Georgatsou, E. Two distinctly regulated genes are required for ferric reduction, the first step of iron uptake in Saccharomyces cerevisiae Text./ E. Georgatsou, D. Alexandraki // Molecular and Cellular Biology — 1994. V.14, No 5. -P.3065-3073.

73. George, S.E. Use of a Salmonella microsuspension bioassay to detect the mutagenicity of munitions compounds at low concentrations Text./ S.E. George G. Huggins-Clark, L.R Brooks // Mutat. Res. 2001. - V.490, No 1. -P.45-56.

74. Gong, P. Soil-based phototoxicity of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) to terrestrial higher plants Text. / P. Gong, В. M. Wilke, S. Fleischmann // Arch. Environ. Cont. Toxicol. 1999. - V.36. - P. 152-157.

75. Gorontzy, T. Microbial degradation of explosives and related compounds Text./ T. Gorontzy //Crit. Rev. Microbiol. 1994. - V.20. - P.265-284.

76. Gorontzy, T. Microbial transformation of nitroaromatic compounds under anaerobic conditions Text./ T. Gorontzy, J. Kuver, K.-H. Blotevogel // J. Gen. Microbiol. 1993. - V.139. - P. 1331-1336.

77. Greenstock, C.L. The oxidation of tiron by superoxide anion. Kinetics of the reaction in aqueous solution in chloroplasts Text./ C.L. Greenstock, R.W. Miller // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V.396, No 1. -P.ll-16.

78. Haidour, A. Identification of products resulting from the biological reduction of 2,4,6-trinitrotoluene, 2,4-dinitrotoluene, and 2,6-dinitrotoluene by Pseudomonas sp. Text. / A. Haidour, J.L. Ramos // Environ. Sci. Technol. — 1996. V.30. — P.2365-2370.

79. Halliwel, B. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease Text./ B. Halliwel, J.M.C. Gutterige // Biochem J. 1984. - V.219. - P.l-14.

80. Hannink, N. K. Phytoremediation of explosives Text. / N. K. Hannink, S. J. Rosser, N. C. Bruce // Crit. Rev. Plant. Sci. 2002. - V.21. - P.511-538.

81. Hannink, N.K. Phytodetoxification of TNT by transgenic plants expressing a bacterial nitroreductase Text./ Nat. Biotechnol. 2001. - V.19. -P.l 168-1172.

82. Hashimoto, M. Oxypyrrolnitrin: a metabolite of Pseudomonas Text./ M. Hashimoto, K. Hattori // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1966 - V. 14, No 11. -P.1314-1316.

83. Hassan, H.M. Superoxide radical and the oxygen enhancement of the toxicity of paraquat in Escherichia coli Text./ H.M. Hassan, I. Fridovich // The Journal of Biological Chemistry. 1978. - V.253, No 22 - P.8143-8148.

84. Hathaway, J. A. Subclinical effects of trinitrotoluene: a review of epidemiology studies Text. / J. A. Hathaway // ed. D. E. Rickert; Toxicity of nitroaromatic compounds. Washington D. C.: Hemisphere Publishing Corporation. - 1985. -P.255-274.

85. He, J. Interation as programmed event during polycetide assembly; molecular analysis of the aureotin biosynthesis gene cluster Text./ J. He, C. Hertwerck// Chem. Biol. 2003. -V. 10. - P. 1225-1232.

86. Honeycutt, M.E. Cytotoxicity and mutagenicity of 2,4,6-trinitrotoluene and its metabolites / M.E. Honeycutt; A.S. Jarvis; V.A. McFarland'. // Ecotoxicol. Environ. Safety. 1997. -V. 35, No 3. - P. 282-287.

87. Howard, D.H. Hydroxamate siderophores of Histoplasma capsulatum Text./ D.H. Howard, R. Rafit, A. Tiwari, K.F. Faull // Infection and Immunity -2000. V.68, No 4. - P.2338-2343.

88. Hughes, J.S. Transformation of TNT by aquatic plants and plant tissue cultures Text./ J.S. Hughes, J. Shanks, M. Vanderford, J. Lauritzen, R. Bhadra // Environ. Sci. Technol. 1997. - V. 31. - P. 266-271

89. Huycke, M.M. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA Text./ M.M. Huycke // Carcinogenesis. 2002. - V.23, No 3 - P.529-536.

90. Jacobs, A. Iron overload clinical and pathologic aspects Text./ Semin. Hematol.-l 1977. - V.14, No 1-P.89-113.

91. Janzen, E.G. A critical review of spin-trapping in biological systems Text./ E.G. Janzen // Free radicals in biology. Volume 4; ed. W.A. Pryor.— N.Y.: Academic Press, 1980.-P.l 16-154.

92. Kaioumova, D. Induction of apoptosis in human lymphocytes by the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid Text./ D. Kaioumova, C. Susal, G. Opelz // Hum. Immunol. 2001. - V.62. - P.64-67.

93. Kaplan, D.L. Mutagenicity of 2,4,6-trinitrotoluene-surfactant complexes Text./ D.L. Kaplan, A.M. Kaplan // Bull. Environm. Contam. Toxicol. 1982. — V.28. - P.33-38.

94. Kawano, T. Roles of reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction Text./ T. Kawano // Plant Cell. Rep. 2003. - V.21, No 5. - P.829-837.

95. Kirking, M.H. Treatment of chronic iron overload Text./ M.H. Kirking // Clin. Pharm. 1991. - V.10. -P.775-783.

96. Kitzler, J.W. Effects of paraquat on Escherichia coli: differences between В and K-12 strains Text./ J.W. Kitzler, H. Minakami, I. Fridovich // Journal of Bacteriology. 1990. - V.172, No 2. - P.686-690.

97. Klausmeier, R.E. Effect of trinitrotoluene on microorganisms Text./ R.E. Klausmeier, J.L. Osmon, D.R. Walls // Dev. Ind. Microbiol. 1974. - V.15 -P. 309-317.

98. Klebanoff, S.J. The Neutrophil: Function and Clinical Disorders Text./ S.J. Klebanoff, R.A. Clark // Amsterdam: Elsevier/North Holland. 1978. -810 p.

99. Korshunov, S. Detection and quantification of superoxide formed within the periplasm of Escherichia coli Text./ S. Korshunov, J.A. Imlay // Journal of Bacteriology. 2006. - V. 188, No 17. - P.6326-6334.

100. Krithika, R.A Genetic locus required for iron acquisition in Mycobacterium tuberculosis Text./ R. Krithika, U. Marathe, P. Saxena, M.Z. Ansari, D Mohanty, R.S. Gokhale // PNAS. 2006. - V.103, No 7. - P.2069-2074.

101. Kurup, C.K.R. Oxidative phosphorylation in fractionated bacterial extracts. XXIX The involvement of non-heme iron in the respiratory pathways of Mycobacterium phlei Text./ C.K.R. Kurup, A.F. Brodie // J. Biol. Chem. 1967.- V.242. P.5830-5837.

102. Kuthan, H. A quantitative test for superoxide radicals produced in biological systems Text./ H. Kuthan, V. Ullrich, R.W. Estabrook // Biochem. J. -1982. V.203. -P.551-558.

103. Lachance, B. Cytotoxic and genotoxic effects of energetic compounds on bacterial and mammalian cells in vitro Text./ B. Lachance, P.Y. Robidoux, J. Hawari, G. Ampleman, S. Thiboutot, G.I. Sunahara // Mutat. Res. -1999.-V. 444.-P. 25-39.

104. Lachance, B. Toxicity and bioaccumulation of reduced TNT metabolites in the earthworm Eiseria andrei exposed to amended forest soil Text./ B. Lachance, A.Y. Renoux, M Sarrazin, J. Hawari, G.I. Sunahara // Chemosphere.- 2004 V.55. - P.1339-1348.

105. Ledenev, A.N. A simple assay of the superoxide generation rate with Tiron as an EPR-visible radical scavenger Text./ A.N. Ledenev, A.A.

106. Konstantinov, E.Y. Popova, E.K. Ruuge // Biochem. Int. 1986. - V.13. - P.391-396.

107. Lee, H. Bacterial mutagenicity, metabolism, and DNA adduct formation by binary mixtures of benzoa.pyrene and 1-nitropyrene [Text]/ H. Lee, S.H. Cherng, T.Y. Liu // Environ. Molecular. Mutagenesis. 1994. - V.24, No 3. -P. 229-234.

108. Lewine, B.S. Six month oral toxicity study of trinitrotoluene in beagle dogs Text./ B.S. Levine, J.H. Rust, J.J. Barkley, E.M. Furedi, P.M. Lish // Toxicology. 1990. - V.63. -P.233-244.

109. Liu, H. X. Some altered concenrations of elements in semen of workers exposed to trinitrotoluene Text./ H.X. Liu, W.U Qin., G.R Wang., Y.X. Yang, Y.X. Chang, Q.S. Yiang // Occupt. Environ. Medicin. 1995. - V.52, No 12. -P.842-845.

110. Medina, V.F. Treatment of trinitrotoluene by crude plant extracts Text./ V.F. Medina, S.L. Larson, L. Agwaramgbo, W. Perez, L. Escalon // Chemosphere. 2004. - V. 55. - P. 725-732.

111. Michels, J. Pathway of 2,4,6-trinitrotoluene degradation by Phanerochaete chrysosporium. Text./ J. Michels, G. Gottschalk // In J. C. Spain (ed.), Biodegradation of nitroaromatic compounds. — 1995. New York: Plenum Press.-P. 135-149.

112. Minakami, H. Effect of рН, glucose, and chtlating agents on lethality of paraquat to Escherichia coli Text./ H. Minakami, J.W. Kitzler, I. Fridovich // Journal of Bacteriology. 1990. -V. 172, No 2.-P.691-695.

113. Misra, H.P. The generation superoxide radical during the autooxidation of hemoglobin Text./ H.P. Misra, I. Fridovich // J. Biol.Chem. — 1972. V.247, No 21. - P.6090-6092.

114. Misra, H.P. The univalent reduction of oxygen by reduced flavins and quinines Text./ H.P. Misra, I. Fridovich // Journal of Biological Chemistry. — 1972.-V. 247, No 1.-P.188-192.

115. Mojovic, M. Oxygen radicals produced by plant plasma membranes: an EPR spin-trap study Text./ M. Mojovic, M. Vuletic, G.G. Bacic, Z. Vucinic // J. Exp. Bot. 2004. - V.55, No 408. - P.2523-2531.

116. Moore, D.R. Effects of iron and phytic acid on production of extracellular radicals by Enterococcus faecalis / D.R. Moore, Y. Kotake, M.M. Huyckle // Exp. Biol. Med. 2004. - V.229. - P. 1186-1195.

117. Mustafa, M.G. Biochemical basis of ozone toxicity Text./ Free Radic. Biol. Med. 1990. - V.9. - P.245-265.

118. Neilands, J.B. Microbial iron transport compounds (siderochromes) Text./ J.B. Neilands // Inorganic biochemistry; ed. G.I. Eichhorn. — Amsterdam: Elsevier Press, 1973. P.l67-202.

119. Nepovim, A. In-vitro degradation of 2,4,6-trinitrotoluene using plant tissue cultures of Solarium aviculare and Rheum palmatum Text./ A. Nepovim, M. Hubalek, R. Podlipna, S. Zeman, T. Vanek // Eng. Life Sci. 2004. - V. 4. - P. 46-49.

120. Neumann, H-G. Toxic equivalence factors, problems and limitations. Text./ H-G. Neumann //Food Chem. Toxicol. 1996. -V .34. -P. 1045-1051.

121. Newman, L. A. Phytodegradation of organic compounds Text. / L. A. Newman, С. M. Reynolds // Current Opinion in Biotechnology. 2004. — V.15.- P.225-230.

122. O'Connell, M.J. Radiation-induced generation and properties of lipid hydroperoxide in liposomes Text./ M.J. O'Connell, A. Garner // Int. J. Rad. Biol.- 1983. V.44. - P.615-625.

123. Ohmori, T. Production of pyoluteorin and its derivatives from n-paraffin by Pseudomonas aeruginosa S10B2 Text./ Agric. Biol. 1978. — V.42 — P.2031-2036.

124. Peres, C.M. Biodegradation of nitroaromatic pollutants: from pathways to remediation Text./ C.M. Peres, S.N. Agathos // Biotechnol. Ann. Rev. 2000. - V.6. - P .197-220.

125. Preuss, A. Anaerobic transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) Text./ A. Preuss, J. Fimpel, G. Dickert // Arch. Microbiol. 1993. - V. 159. - P. 345-353.

126. Preuss, A. Anaerobic transformation of 2,4,6-TNT and other nitroaromatic compounds Text. / A. Preuss, P.-G. Rieger // In J. C. Spain (ed.), Biodegradation of nitroaromatic compounds. New York: Plenum Press. — 1995. -P.69-85.

127. Raymond, K.N. Recognition and transport of natural and synthetic siderophores by microbes Text./ K.N. Raymond // Pure Appl. Chem. 1994. -V.66, No 4. — P.773-781.

128. Rieble, S. Aromatic nitroreductase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium Text./ S. Rieble, D.K. Joshi, M.H. Gold // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994. - V.205. - P.298-304.

129. Rowley, D.A. DNA-damage by superoxide-generating systems in relation to the mechanism of action of the anti-tumor antibiotic adriamycin Text./ D.A. Rowley // Biochem. Biophis. Acta. 1983. - V.761. - P.86-93.

130. Sabbioni, G. Comparison of hemoglobin binding, mutagenicity, and carcinogenicity of arylamines and nitroarenes / G. Sabbioni, O.Sepai. // Chimia. -1995.-V.49-P. 374-380.

131. Sabbioni, G. Hemoglobin adducts, urinary metabolites and heslth effects in 2,4,6-trinitrotoluenenexposed workers Text./ G. Sabbioni // Carcinogenesis. 2005. - V. 26, No 7. - P. 1272-1279.

132. Saka, M. Developmental toxicity of P,P'~ dichlorodipheniltrichloroethanole, 2,4,6-trinitrotoluene, their metabolites, and benzopyrene in Xenopus laevis embryons Text./ M. Saka // Environ. Toxicol. Chem. 2004. - V.23. - P. 1065-1073.

133. Sandermann, H. Plant metabolism of xenobiotics Text./ H.Sandermann // Trends Biochem. Sci. 1992. - V.17. - P.82-84.

134. Sawier, D.T. The redox chemistry of superoxide ion Text./ D.T. Sawyer, M.T. Gibian//Tetrahedron. 1979.- V.35.-P. 1471-1481.

135. Scott, M.D. Superoxide dismutase-rich bacteria. Paradoxical increase in oxidant toxicity Text. / M.D. Scott, S.R. Meshnick, J.W. Eaton // J. Biol. Chem. 1987. -V. 262, No 8. - P.3640-3645.

136. Scott, M.D. Superoxide dismutase amplifies organismal sensitivity to ionizing radiation. Text. / M.D. Scott, S.R. Meshnick, J.W. Eaton // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264, No 5. - P.2498-2501.

137. Sens, С. Distribution of 14C-TNT and derivatives in different biochemical compartments of Phaseolus vulgaris Text. / C. Sens, P. Sheidemann, D. Werner // Environ. Sci. Pollut. Res. 1998. - V.5. - P.202-208.

138. Sens, C. The distribution of 14C-TNT and derivatives in different biochemical compartments of the monocotiledonous Triticum aestivum Text. / C. Sens, P. Sheidemann, D. Werner//Environ. Pollut. 1999. - V.104. -P.l 13-119.

139. Shi, L. Limits of propidium iodide as a cell viability indicator for environmental bacteria Text./ L. Shi, S. Giinter, T. Hubschmann, L.Y. Wick, H. Harms, S. Miiller // Cytometry Part A. 2007. - V.71A. - P.592-598.

140. Siciliano, S.D. Reduction in denitrification activity in field soils exposed to long term contamination by 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) / S.D. Siciliano, R. Roy, C.W. Greer // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - V. 32. - P. 61-68.

141. Spain, J.C. Biodegradation of nitroaromatic compounds and explosives Text./ J.C. Spain, J.B. Hughes, H.-J. Knackmuss. — Boca Raton: Lewis Publishers, FL, 2000. 540 p.

142. Spain, J.C. Biodegradatoin of nitroaromatic compounds Text./ J.C. Spain // Annu. Rev. Microbiol. 1995. - V.49. - P.525-555.

143. Spector, A. Oxidative stress-induced cataract: mechanism of action Text./A. Spector//FASEB.-V.9.-P.l 173-1182.

144. Stahl, J. Properties of a transplasma membrane redox system of Phanerochaete chrysosporium Text./ J. D. Stahl, S. D. Aust //Arch. Biochem. Biophys.-1995. V.320, No 2. -P.369-374.

145. Stahl, J.D. Metabolism and detoxification of TNT by Phanerochaete chrysosporium Text./ J.D. Stahl, S.D. Aust // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1993. V. 192. - P. 477^182.

146. Stoebner, J.A. Iron-regulated hemolysin production and utilization of heme and hemoglobin by Vibrio cholera Text./ J.A. Stoebner, S.M.Payne // Infect Immun.- 1988.-V.56, No 11.-P.2891-2895.

147. Sunahara, G.I. Ecotoxicity characterization of dinitrotoluenes and some of their reduced metabolites Text./ G.I. Sunahara, S.G. Dodard, A.Y. Renoux, J. Hawari, G. Ampelman, S. Thiboutot // Chemosphere. 1999. - V.38, No 9.-P.2071-2079.

148. Takata, H. Cyclization reaction catalyzed by branching enzyme Text./ H. Takata, T. Takaha, S. Okada, M. Takagi, T. Imanaka // J. Bacteriol. -1996.-V. 178, No 6. -P.1600-1606.

149. Talmage, S.S. Nitroaromatic munition compounds: environmental effects and screening values Text./ S.S. Talmage, D.M. Opresko, CJ. Maxwell, C.J.E. Welsh, F.M. Cretella, P.H. Reno, F.B. Daniel // Rev. Environ. Contam. Toxicol. 1999 -V. 161. - P. 1-156.

150. Tarpey, M.M. Methods of detection of vascular reactive species: nitric oxide, superoxide, hydrogen peroxide, and peroxynitrite Text./ M.M. Tarpey, I. Fridovich // Circulation Research. 2001. - V.89, No 3. - P. 224-236.

151. Thierfelder, L. Familial Hypertrophic Cardiomyopathy Locus Maps to Chromosome 15q2 Text./ L. Thierfelder, C. MacRae, H. Watkins, J.

152. Tomfohrde, M. Williams, W. McKenna, K. Bohm, G. Noeske, M. Schlepper, A. Bowcock, H. Vosberg, J.G. Seidman, C. Seidman // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. - V.90. - P.6270-6274.

153. Turner, M.J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radicals with substituted pyrrolin 1-oxides Text./ M.J. Turner, G.M. Rosen // J. Med. Chem. -1986. V.29. - P.2439-2444.

154. Tuschl, H. Cytotoxic effects of the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid in HepG2 cells Text./ H. Tuschl, C. Schwab / Food Chem. Toxicol. 2003. - V.41. - P.385- 393.

155. Vanderford, M. Phytotransformation of trinitrotoluene (TNT) and distribution of metabolic products in Myriophyllum aquaticum Text./ M. Vanderford, J.V. Shanks, J.B. Hughes // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 277-280.

156. Vanek, T. Phytoremediation of selected explosives Text. / T. Vanek, A. Nepovim, R. Podlipna, S. Zeman, M. Vagner // Water, Air, Soil Pollut. 2003. -V. 3.-P. 259-267.

157. Van Gestellen, P. Solubilization and separation of a plant plasma membrane NADPH-O2" synthase from other NAD(P)H oxidoreductases Text./ P. Van Gestellen, H. Asard, RJ. Caubergs // Plant. Physiol. 1997. - V.l 15. - P.543-550.

158. Vasques-Vivar, J. Superoxide anion formation from lucigenin: an electron spin resonance spin-trapping study Text./ FEBS Lett. 1997. - V.403. -P.127-130.

159. Vats, S. Transductional analysis of chloramphenicol biosynthesis genes in Streptomyces venezuelae Text./ J. Bacteriol. — 1987. — V.l69. — P.3809-3813.

160. Vorbeck, C. Identification of a hydride-Meisenheimer complex as a metabolite of 2,4,6-trinitrotoluene by a Mycobacterium strain Text./ C. Vorbeck, H. Lenke, P. Fischer, H.-J. Knackmuss // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 932934.

161. Vorbeck, С. Initial reductive reactions in aerobic microbial metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene Text./ C. Vorbeck , H. Lenke, P. Fischer, J. Spain, HJ. Knackmuss // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64, No 1. -P.246-252.

162. Vuletic, M. Production and scavenging of reactive oxygen species in isolated maize root plasma membranes Text./ M.Vuletic, V. Hadzi-Taskovic1. V V

163. Sukalovic, A. Liszkay, Z Vucinic // Free Rad. Res.- 2003. — V.37, suppl.2. P. 11.

164. Wang, C.Y. Phitotransformation of TNT in Myriophillum aquaticum: A Complex Pathway Through Hydroxylamino Intermediates Text./ C.Y. Wang, J.B. Hughes // Battle Press 2001. - V.5. - P.85-95.

165. Ward, N.G. Skin conductance: a potentially sensitive test for depression Text./ N.G. Ward, H.O. Doerr, M.C. Storrie // Psych. Res. 1983. -V.10. -P.295-302.

166. Watanabe, T. Mutagenicity of nitrodibenzopyranones in the Salmonella plate-incorporation and microsuspension assay Text./ T.Watanabe, MJ.Kohan, D. Walsh, L.M. Ball, D.M. DeMarini, J. Lewtas // Mutat. Res. 1995. -V.345.-P. 1-9.

167. Won, W.D. Toxicity and mutagenecity of 2,4,6-trinitrotoluene and its microbial metabolites Text./ W.D Won, L.H. Disalvo, J. Ng // Appl. Environ. Microbiol. 1976. - V.34, No 4. - P.576-580.

168. Woollen, B.H. Trinitrotoluene: assesment of occupational absorption during manufacture of explosives Text./ B.H. Woollen, M.G. Hall, R.Craig, G.T. Steel // British J. Industrial Medic. 1986. - V.43, No 31. - P.576-580.

169. Wyman, J.F. Acute toxicity, distribution, and metabolism of 2,4,6-trinitrophenol (picric acid) in fischer 344 rats Text./ J.F. Wyman, M.P. Serve,

170. D.W. Hobson, L.H. Lee, D.E Uddin // J. Toxicol. Environ. Health. 1992. - V.37. -P.313-327.

171. Yim, M.B. Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical production from hydrogen peroxide Text./ M.B. Yim, P.B. Chock, E.R. Stadtman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V.87. - P.5006-5010.

172. Yinon, J. Toxicity and metabolism of explosives Text. / J. Yinon. -Boca Raton: CRC Press Inc, FL, 1990. p.

173. Zhao, J. Oxidative stress in plant cell culture: a role in production of р-thujaplicin by Cupressus lusitanica suspension culture Text. / J. Zhao, K. Fujita, K. Sakai // Biotechnol. Bioengin. 2005. - V.90, No 5. - P.621-631.

174. Zhao, H. Synthesis and biochemical application of a solid cyclic nitrone spin trap: a relatively superior trap for detecting superoxide anions and glutathiyl radicals Text./ Free Rad. Biol. Med. 2001. - V.31, No 5. - P.599-606.

Информация о работе

Науменко, Екатерина Анатольевна
кандидата биологических наук
Казань, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Участие активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы