Особенности токсического действия 2,4,6-тринитротолуола на штаммы Escherichia coli

Дениварова, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности токсического действия 2,4,6-тринитротолуола на штаммы Escherichia coli
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности токсического действия 2,4,6-тринитротолуола на штаммы Escherichia coli"

На правах рукописи

Дениварова Наталья Александровна

ОСОБЕННОСТИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА НА ШТАММЫ ESCHERICHIA COLI

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань

-fOQc. —

-2006

во' - о

Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии кафедры микробиологии ГОУВПО "Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина"

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Куриненко Борис Михайлович

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, старший преподаватель КГМА Кипенская Лариса Викторовна (Казанская медицинская академия, г. Казань)

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Галина Ивановна Эль-Регистан (Институт микробиологии РАН, г. Москва)

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики РАН, г. Казань

Защита состоится JfCCUsZtfiP. 2006 г в jf^ на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета.

Автореферат разослан _ ¥ CbSUfCf C^ 2006 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного Совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ншроароматические соединения традиционно используют в качестве взрывчатых веществ и сырья для производства красителей, синтетических полимеров и растворителей: Они известны так же как избирательно действующие лекарственные препараты и пестициды. Большинство из них высокотоксичные и трудноразлагаемые неприродные соединения, относящиеся к числу экологически опасных веществ. .

Одним из представителей полинитроароматических соединений является 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ) - вещество, отличающееся выраженными токсическими свойствами и устойчивостью к биодеградации. Как следствие деятельности военных отраслей промышленности и военных объектов в различных регионах мира выявлены большие территории, загрязненные остатками взрывчатых смесей, основным компонентом которых: является ТНТ [Fernando et al., 1990; Comfort et al., 1995; Scheibner et al., 1997]. С увеличением уровня производства ТНТ, вызванного потребностями военных, возрастает значение ремедиации мест производства ТНТ, оказывающего вредное влияние на окружающую среду.

В настоящее время наряду с физическими и физико-химическими способами детоксикации отходов, загрязненных ТНТ, разрабатываются подходы для их биоре-медиации с использованием микроорганизмов: грибов [Fernando et al., 1990; Hawarl et al., 1999], анаэробных [Boopathy, Kulpaing, 1992; Boopathy et al., 1993] и аэробных бактерий [Наумова с соавт., 1979; Наумова с соавт., 1988; Boopathy et al., 1994; Kala-fut et al., 1998]. Механизм биотрансформации ТНТ аэробными и аэротолерантными микроорганизмами интенсивно исследуется [Boopathy et al., 1994; Fuller, Manning, 1997; French et al., 1998; Kalafut et al., 1998; Наумов с соавт., 1998, 1999; Hawari et al., 2000; Esteve-Nunez et al., 2001; Зарипов с соавт., 2002; Zaripov et al, 2002].

Известно, что аэробные грамотрицательные и грамположительные бактерии различаются по чувствительности к токсическому действию ТНТ [Наумова с соавт., 1982.а] и по стратегии трансформации ксенобиотика [Kalafut et al., 1998]. Отмечается . высокая устойчивость к токсическому действию ксенобиотика у грамотрицательных микроорганизмов по сравнению с - грам-положительными. Вероятно, это является причиной преобладания грамотрицательных бактерий в почвах загрязненных ксенобиотиком. Механизм такой устойчивости может быть обусловлен различными причинами. В том числе наличием в структуре клеточной стенки внешней липопротеидной мембраны (ВЛПМ), выполняющей функцию дополнительного защитного барьера клетки и препятствующего одномоментному поступлению в клетку высоких концентраций ксенобиотика. Однако известно, что стабильность и проницаемость ВЛПМ штаммов грамотрицательных видов может существенно разли-

чаться. Следствием этого возможны внутривидовые отличия в устойчивости штаммов к токсическому действию ксенобиотиков, в том числе и ТНТ. Нельзя исключить, что подобные различия могут сказаться и на особенностях стратегии трансформации ксенобиотика устойчивыми и чувствительными штаммами. В частности, стратегия трансформации чувствительными штаммами грамотрицательных бактерий может быть зависима от токсического пресса ксенобиотика, подобно стратегии, описанной нами ранее для аэробной Bacillus subtilis SKI, чувствительной к токсическому действию ТНТ. Несмотря на привлекательность высказанных предположений, мы не нашли их экспериментального подтверждения. ..,■•:,

Токсическое действие различных веществ может не только подавлять жизнеспособность микроорганизмов, но и вызывать их адаптацию к новым условиям существования, механизмы которой могут быть разнообразными. В основе адаптации микроорганизмов к токсическим веществам нередко лежит использование как специальных ферментов детоксикации, так и различных ферментных систем обмена веществ клетки. Количество и последовательность использования ферментных систем обмена веществ клетки для детоксикации будут зависеть от совокупности их свойств и, в частности, от устойчивости ферментов к инактивирующему (ингиби-рующему) действию ксенобиотика и от значения каталитической константы в реакциях превращения ксенобиотика как субстрата. Исходя из этого, логично предположить, что концентрация ТНТ может оказать решающее значение на его трансформацию той или иной ферментной системой клетки, что, возможно, и определяет особенности так называемой стратегии трансформации. Адаптационные процессы к неблагоприятным условиям среды обитания не ограничиваются реакциями детоксикации, а затрагивают целый ряд морфофизиологических показателей клеток [Пронин с соавт., 1982; Мулюкин с соавт., 1996; Мулюкин с соавт., 1997; Мулюкин, 1998; Головлеа, 1998; Куриненко с соавт., 2003]. Влияние высоких концентраций ТНТ на адаптационные изменения метаболизма и морфофизиологические показатели клеток грамотрицательных бактерий — деструкторов практически не исследованы, несмотря на то, что такие исследования имеют несомненное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследования. В связи с выше изложенным, цель работы - установить различия в чувствительности к токсическому действию 2,4,6- тринитротолуола штаммов Escherichia coli, отличающихся барьерными свойствами внешней липопротеидной мембраны, и оценить адаптационные изменения штамма Escherichia coli, способного к полной элиминации ксенобиотика, в ответ на токсический стресс.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи

исследования:

1. Разработать метод определения барьерных свойств внешней липо-протеидной мембраны грамотрицательных бактерий. Провести сравнение барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны исследуемых штаммов Escherichia coli.

2. Оценить способность штаммов, различающихся стабильностью и проницаемостью внешней липопротеидной мембраны, к деструкции ксенобиотика.

3. Определить влияние различных концентраций 2,4,6-тринитротолуола на изменение стратегии его трансформации штаммами Escherichia coli, различающимися стабильностью и проницаемостью внешней липопротеидной мембраны.

4. Используя традиционные методы микробиологических исследований и проточную цитофлуориметрию установить характер воздействия высоких концентраций 2,4,6-тринитротолуола на морфофизиологические свойства клеток штамма Escherichia coli К12, способного к полной элиминации ксенобиотика.

Научная новизна работы. Разработан метод оценки барьерных свойств ВЛПМ грамотрицательных бактерий, основанный на различии в чувствительности штаммов Е. coli к анионному поверхностно активному веществу - натриевой соли ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты (Аэрозоль ОТ, АОТ) и основному фуксину.

Впервые установлено, что штаммы одного и того же вида грамотрицательных бактерий, различающиеся по чувствительности к токсическому действию ксенобиотика, адаптируются к токсическим концентрациям, используя как стратегию нитровосстановления, так и денитритации. С увеличением концентрации ксенобиотика происходило изменение стратегии его трансформации с образования , продуктов нитровосстановления на образование нитритов, как у изученной ранее грамположительной В. subtilis SKI, чувствительной к токсическому действию ТНТ [Куриненко с соавт., 2003].

Впервые установлено, что изменение стратегии трансформации ксенобиотика различными штаммами одного и того же вида грамотрицательных бактерий, различающихся барьерными свойствами внешней липопротеидной мембраны, зависит от концентрации ТНТ. Смена образования продуктов нитровосстановления на продукты денитритации происходит при более низкой концентрации ксенобиотика у штамма, обладающего менее стабильной и более проницаемой ВЛПМ. ,

Впервые, на примере штамма Е. coli К12, обладающего наиболее стабиль-

ной и наименее проницаемой внешней липопротеидной мембраной, установлено, что действие высокой концентрации ТНТ(200мг/л) в аэробных условиях сопровождается изменением морфологических показателей клеток: уменьшением размеров, увеличением их плотности и изменением морфологии части клеток популяции с палочковидной на кокковидную.

Впервые, с помощью метода проточной цитофлуориметрии, установлено, что ТНТ оказывает ингибирующее действие на механизмы, ответственные за энергетический статус клеток Е. coli, что проявляется в снижении их трансмембранного потенциала (Дф).

Впервые также установлено различие в так называемом энергетическом профиле популяции - в количественном распределении клеток популяций контроля и «ТНТ-клеток» по значению Дф. В обеих популяциях, в зависимости от фазы роста в контроле и концентрации ТНТ в «ТНТ-клетках», имелись субпопуляции с высоким и низким значением А-ф. В контроле бимодальное распределение клеток по значению Дф имело место в лаг-фазе и при переходе в стационарную фазу роста. Для «ТНТ-клеток» бимодальное распределение по значению Дф определялось во всем диапазоне высоких концентраций ТНТ.

Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены доказательства того, что изменение стратегии трансформации ТНТ зависящее от концентрации ксенобиотика и впервые описанное нами для аэробной грамположи-тельной В. subtilis SKI [Куриненко с соавт., 2003], получило подтверждение для гра-мотрицательной Е. coli. Это обосновывает необходимость выяснения механизма переключения стратегии нитровосстановления на денитритацию и выяснения молекулярного механизма денитритации, который до сих пор не известен. Знание деталей этих механизмов представляет интерес для фундаментальной науки, в частности раздела, изучающего регуляцию метаболизма микроорганизмов в экстремальных условиях жизнеобеспечения.

Установлено, что ТНТ в токсических концентрациях вызывает структурно-функциональные перестройки клеток Е. coli, что проявляется в уменьшении размеров, и увеличении удельной плотности, подавлении аккумуляции энергии. Эти перестройки обратимы и со снижением концентрации ксенобиотика происходит нормализация морфофизиологических показателей клеток. Эти'данные имеют практическое значение. Их целесообразно учитывать при определении кинетических, параметров роста бактерий в условиях токсического стресса. Пренебрежение этими дан- -ными при определении кинетических параметров роста бактерий, культивируемых в условиях токсического стресса, может привести к некорректным выводам, если эти параметры сформулированы на основе оптической плотности культуры. '

Переключение стратегии трансформации ТНТ имеет не только научное, но и практическое значение. Его необходимо учитывать при использовании аэробных грамотрицательных бактерий или сообщества микроорганизмов для биодеградации отходов, содержащих ксенобиотик.

Основные положения, выносимые не защиту.

1. Вид Е. coli демонстрирует высокую вариабельность барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны.

2. Штамм Е. coli Kl 2 со стабильной внешней липопротеидной мембраной по сравнению со штаммом Е. coli 055 с более проницаемой и менее стабильной ВЛПМ обладает способностью к более быстрой и полной элиминации ТНТ из среды культивирования.

3. Токсическое действие ТНТ по отношению к шт. Е. coli Kl 2 проявляется в диссоциации культуры на две жизнеспособные субпопуляции, характеризующиеся выраженными морфологическими и физиолого-биохимическими отличиями.

4. Клетки Е. coli KI2, культивируемые в присутствии высоких концентраций ТНТ, отличается более мелкими размерами, увеличением удельной плотности, повышенной проницаемостью ВЛПМ.

5. Высокая концентрация ТНТ приводит к снижению скорости утилизации глюкозы штаммом Е. coli Kl2, уменьшению в клетках штамма количества восстановленных никотинамидадениндинуклеотидов и увеличению восстановленных фла-вопротеидов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в течение 2001-2005гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета «Молекулярные механизмы ответа клетки на раздражение. Влияние природы и силы раздражителя, функционального состояния клетки и степени ее дифференцированности на содержание клеточного ответа» (№ гос. регистрации 01.2.00.1.15733, научный руководитель д.б.н. проф. Б.М. Куриненко). Постановка задачи диссертационного исследования принадлежит научному руководителю работы д.б.н. проф. Б.М. Куриненко. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Трансмембранную разность электрических потенциалов (трансмембранный потенциал - Агр) бактерий, проницаемость внутренней плазматической мембраны, прямое светорассеяние FSC (показатель размера клетки) и боковое светорассеяние SSC (показатель гранулярности цитоплазмы) определяли совместно с д.м.н. проф. Г.В. Черепневым и врачом-лаборантом Т.А. Велижинской, на проточном цитофлуо-риметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA) на базе лаборатории иммунологии Республиканской Клинической Больницы № 2 Министерства Здравоохранения Республики Татарстан. Определение количества окисленных и восстановленных кофакто-

ров проводили совместно с к.б.н. Р.Э. Давыдовым на спеюрофлуориметре «SIGNE -4M» на базе лаборатории инженерной энзимологии Казанского Государственного Университета им. В.И. Ульянова-Ленина.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях КГУ , (Казань, 2001, 2002, 2003, 2004),, школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003, 2004), ХП и XIII юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001, 2005)..

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность: научному руководителю доктору биологических наук профессору Б.М. Куриненко, за чуткое руководство; кандидату биологических наук Г.Ю. Яковлевой за поддержку, помощь в выполнении и внимательное отношение к работе; кандидату биологических наук Р.Э. Давыдову за определите количества окисленных и восстановленных кофакторов и участие в обсуждении результатов; доктору медицинских наук Г.В. Черепневу и врачу-лаборанту Т.А. Велижинской; за возможность осуществления цитофлуори-метрии на базе лаборатории иммунологии РКБ №2 МЗ РТ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, включает 4 таблицы, 18 рисунков. Библиография содержит 173 источника, из них 120 зарубежных авторов. .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Микроорганизмы, среды и условия культивирования

Объектом исследования служили штаммы Е. coli Kl 2, Е. coli 055, Е. coli 020, Е. coli 25927, coli В¡2, E. coli 0124, E. coli K2KS, E. coli 209, E. coli 168, E. coli 026 из коллекции музея Казанской государственной медицинской академии.

Инокулят выращивали в колбах на 100 мл на мясопептонном бульоне (МПБ) 16-18 ч при 30°С в условиях принудительной аэрации и вносили в среду до конечной концентрации 3,4-107 клеток/мл. Культивирование. вели в колбах на 250 мл на качалке при 120 об./мин на синтетической среде следующего состава (г/л): (NH4)2S04 - 0.5; MgS04-7H20 - 0.25; NaCl - 0.5; глюкоза - 3.0; ТНТ - 0.2; фосфатный буфер (0.2 M КНгР04/ Na2HP04 , pH 7.0)- 4 % (об /об.). .

ТНТ, предварительно растворенный в этаноле, вносили перед автоклавирова-нием в подогретую до 80°С среду до конечной концентрации 20 - 200 мг/л.

2. Микробиологические методы

2.1. Определение концентрации биомассы. Концентрацию биомассы опреде-

ляли нефелометрическим методом, измеряя светорассеяние, вызываемое суспензией клеток микроорганизмов, на фотоколориметре КФК-2-УХЛ4.2 с красным светофильтром, при длине волны 670 нм [Методы общей бактериологии, 1983].

2.2. Подсчет общего количества бактериальных клеток. Подсчет велся в счетной камере Горяева-Тома [Методы общей бактериологии, 1983].

2.3. Определение количества живьгх клеток микроорганизмов. Жизнеспособность определяли путем высева на плотные питательные среды и подсчета числа ко-лониеобразующих единиц (КОЕ) [Методы общей бактериологии, 1983].

2.4. Микроскопическое наблюдение. Проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Jena (ГДР) с фазово-контрастным устройством. Фотографировали цифровой фотокамерой NIKON Coolpix SI с использованием иммерсионной системы, с объективом х 100, и окуляром х 15.

2.5: Определение размеров клеток. Определение размеров клеток популяции проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Jena (ГДР) и окулярного винтового микрометра МОВ-1-15Х [Методы общей бактериологии, 1983].

2.6. Определение показателя преломления бактериальных клеток. Для расчета удельной плотности клеток использовали фотометрическое определение показателя преломления бактерий экстраполяционно-графическнм методом [Фихман, 1967].

2.7. Определение барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны (ВЛГГМ). Барьерные свойства ВЛПМ оценивали по разнице в КОЕ, выросших на мясопептонном агаре (МПА) и МПА с добавлением фуксина в концентрации аналогичной его количеству в дифференциально-диагностической среде Эндо (0,2 г/л), а также по разнице в КОЕ, выросших на МПА и МПА с АОТ в концентрации 10"3 % и МПА с АОТ в той же концентрации, но с добавлением фуксина [Оригинальный метод автора].

3. Химические и биохимические методы

3.1. Определение эффективности трансформации ТИТ. Эффективность трансформации оценивали по убыванию концентрации ТНТ в культуральной жидкости. Для определения ТНТ использовали метод, основанный на цветной реакции ТНТ с Na2S03 в щелочных условиях [Лурье, Рыбникова, 1974].

3.2. Интегральная оценка количества продуктов нитровосстановления (ПНВ1. Суммарное количество ПНВ определяли с помощью цветной реакции с п-диметиламинобензальдегидом по методике, описанной Наумовой с соавт. [1983].

3.3. Выделение и идентификация метаболитов трансформации ТНТ. Идентификацию продуктов превращения ТНТ проводили, сравнивая величины Rf в двух системах растворителей с аналогичными параметрами метчиков, синтезированных и

предоставленных Наумовым A.B.: 2-амино-4,6-динитротолуол (2-А), 4-амино-2,6-динитротолуол (4-А) и 2,4-диамино-6-нитротолуол (2,4-ДА).

3.4. Определение количества нитритов. Определение проводили по общепринятой методике с реактивом Грисса [Hanson, Phillips, 1981].

3.5. Определение концентрации глюкозы. Определение осуществляли ферментативным методом [Bergmeyer et al.,1974].

3.6. Определение количества окисленных и восстановленных кофакторов. Определение проводили спектрофлуориметрически [Лукьянова с соавт., 1982; Harrison, Chance,. 1970] на спектрофлуориметре «SIGNE - 4M» (г. Рига).

4. Метод проточной цитофлуорнметрии

Трансмембранную разность электрических потенциалов (трансмембранный потенциал - Дф) бактерий, прямое светорассеяние FSC (показатель размера клетки) и боковое светорассеяние SSC (показатель гранулярности цитоплазмы) [Müller et al., 2000], проницаемость плазматической мембраны [Herrera et al., 2002] определяли на проточном цитофлуориметре Facs Calibur (Becton Dickinson, USA).

5. Статистическая обработка результатов

Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе «Microsoft Excel». В работе все эксперименты были проведены не менее чем в пяти повторностях. Группу данных считали однородной, если среднсквадра-тическое отклонение а в ней не превышало 13 %. Различие между группами считали достоверным при критерии вероятности Р<0,05.

Результаты проточной цитофлуорнметрии анализировали на рабочей станции Macintosh Quadra 650 в программе Cell Quest (Becton Dickinson) с применением статистики Колмогорова-Смирнова. Для корректного сопоставления Д\р в клетках неодинакового размера сравнивали только нормированные «сигнал минус шум»-гистограммы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка барьерных свойств внешней лнпопротеидной мембраны штаммов Е. coli. Для оценки барьерных свойств внешней лнпопротеидной мембраны (ВЛПМ) исследуемых штаммов Е. coli мы использовали различие в их чувствительности к АОТ [Hancock et al., 1984; Tomlins et al., 1972] и основному фуксину.

С этой целью мы сравнивали способность различных штаммов Е. coli расти на NOTA содержащем фуксин в концентрации 0,2 г/л, 0,5 г/л, 1 г/л и на средах,' содержащих фуксин 0,2 г/л и АОТ в концентрации 10"1 %, 10"3 %, 10"5 %. С помощью этих тестов был проведен скрининг 10 штаммов Е. coli. Из них было отобрано два штамма - Е. coli Kl2 и Е. coli 055. '

Как видно из рис. 1, фуксин вплоть до концентрации 2 г/л не оказывал влияния на количество КОЕ штамма Е. coli К12. Количество КОЕ штамма Е. coli 055

достоверно уменьшалось, начиная с концентрации 0,2 г/л, а при 1-2 г/л полностью подавлялось.

Рис.1. Количество колониеобразующих единиц клеток К coli штаммов К12 (а) и 055 (б), выросших на МП А с различной концентрацией фуксина (г/л). За 100 % принимали количество КОЕ выросших на МПА без фуксина. На этом и на последующих рисунках достоверные отличия от контроля (Р<0.05) обозначается *.

Добавление к МПА с фуксином (0,2 г/л) АОТ в концентрациях от 10'5% до 10"1 % (рис. 2) не влияло на количество КОЕ штамма Е. coli Kl 2, но оказывало си-нергидный с фуксином подавляющий эффект на клетки штамма Е. coli 055.

ш §

Sts

10* ю"

10'

АОТ, %

10060-

бош О

20-

(б)

ЕЦЗМПА

МПА + АОТ + фуксин

Ю-

•й

10"4 1<Г* 10*

АОТ, %

10"'

Рис. 2. Количество колониеобразующих единиц клеток К coli штаммов К12 (а) и 055 (б), выросших на МПА и на МПА с фуксином (0,2 г/л) в присутствии различных концентраций АОТ. За 100 % принимали количество КОЕ выросших на МПА без фуксина и АОТ.

Влияние ТНТ на рост и деструктивные свойства Е. coli К12 и Е. coli 055 В экспериментах использовался широкий диапазон концентраций ТНТ - от 20 мг/л до 200 мг/л. Штамм Е. coli KI2 в присутствии высоких концентраций ксено-

биотика способен расти на среде с ТНТ во всем диапазоне исследуемых нами концентраций нитроарила, и к 8ч культивирования оптическая плотность культур в опытных вариантах вплоть до концентрации 200 мг/л достоверно не отличалась от контроля (рис.3 а).

Рис. 3. Динамика роста клеток Е. coli штаммов К12 (а) и 055 (б) на синтетической среде с различными концентрациями ТНТ: 1-20 мг/л; 2-50 мг/л; 3-100 мг/л; 4-150 мг/л; 5 - 200 мг/л.

Штамм Е. coli Kl 2 к 8ч полностью элиминировал ТНТ из среды культивирования с исходной концентрацией 20 мг/л, 50 мг/л и 100 мг/л, и на 94 % и 83 % при начальной концентрации 150 мг/л и 200 мг/л соответственно.

Внесение ксенобиотика в среду культивирования оказывало ингиби-рующее действие на рост Е. coli 055 (рис.3 б). При внесении в среду культивирования ТНТ в концентрации 20 мг/л и 50 мг/л, рост К coli 055 наблюдался на 4ч культивирования, когда ксенобиотик в среде практически не определялся. Штамм Е. coli 055, как и описанная нами ранее В. subtilis SKI [Кури-ненко с соавт., 2003], элиминировал ксенобиотик из среды культивирования, при исходной концентрации 20 мг/л и 50 мг/л в значительно меньшей степени чем Е. coli Kl2, то же касается и концентрации 100 мг/л, 150 мг/л и 200 мг/л.

Ранее мы высказали предположение о том, что в метаболической адаптации микроорганизмов к токсическому действию ксенобиотиков значительную роль может играть смена ферментных систем детоксикации [Куриненко с соавт., 2003]. Основываясь на этом предположении, мы определили особенности стратегии трансформации ТНТ двумя штаммами Е. coli, определив природу образующихся продуктов нитровосстановления и способность к образованию нитритов.

Как видно из рис. 4, при концентрациях ксенобиотика до 50 мг/л для штамма К coli 055 и до 100 мг/л для Е. coli Kl 2 происходила трансформация ТНТ с образованием ПНВ. При дальнейшем увеличении концентрации ТНТ количество ПНВ снижалось, и в среде начинали накапливаться нитриты. То есть оба штамма способны трансформировать ТНТ, используя стратегию нитровосстановления и денитри-

тации ксенобиотика. Вместе с тем, система редукции, ответственная за образование ПНВ, у клеток штамма Е. coli 055 инакти-вировалась раньше, чем у штамма Е. coli К12. Соответственно в процесс трансформации ТНТ у штамма Е. coli 055 раньше, чем у штамма Е. coli К12 включалась система денит-ритации ксенобиотика.

Рис. 4. Динамика образования продуктов трансформации ТНТ через 8ч культивирования Е. coli штаммов К12 (а) и 055 (б) на синтетической среде с различными концентрациями ксенобиотика.

Представленные нами данные свидетельствуют о том, что различные штаммы одного и того же вида грамотрицательных бактерий могут различаться по чувствительности к токсическому действию ТНТ. Они способны адаптироваться к токсическим концентрациям ТНТ, используя как стратегию нитровосстановления, так и денитритации ксенобиотика, как и ранее изученная нами В. subtilis SKI [Куриненко с соавт., 2003]. Более высокая чувствительность к токсическому действию ТНТ клеток штамма Е. coli 055 и переключение метаболизма со стратегии нитровосстановления на денитритацию при более низких концентрациях ксенобиотика по сравнению со штаммом Е. coli Kl 2, находятся в соответствии с нарушением барьерной функции его ВЛПМ. А переключение стратегии трансформации у обоих штаммов с увеличением концентрации ТНТ является доказательством роли токсического пресса в этом переключении. Очевидно, что переключение стратегии трансформации ТНТ штаммом Е. coli К12 с образования ПНВ на денитритацию, свидетельствует о подавлении ксенобиотиком системы редукции, что следует рассматривать как проявление токсического действия ТНТ в отношении и

конц. ТНТ, мг/л

этого штамма К coli.

Ранее нами было показано, что адаптационные механизмы чувствительной к токсическому действию ТНТ В. subtilis SKI, наряду с переключением стратегии нитровосстановления на денитритацию ксенобиотика, также включают в себя целый ряд морфофизиологических изменений клеток [Куриненко с соавт., 2003]. Следует ожидать, что подобные изменения либо отсутствуют, либо носят другой характер у бактерий, способных трансформировать высокие концентрации ксенобиотика. Учитывая это обстоятельство, дальнейшая работа велась со штаммом Е. coli Kl2, с использованием ТНТ в концентрации 200 мг/л.

Влияние ТНТ на морфологию и размеры клеток Е. coli К12. Мы определили интенсивность роста Е. coli Kl2, оценивая его по изменению D67o, общему количеству клеток и количеству колониеобразующих клеток (КОЕ) культуры в присутствии 200 мг/л ТНТ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что D670 культуры в присутствии ТНТ на 2ч и 4ч роста были выше, чем в контроле, и становились равными контролю, начиная с 6ч культивирования (рис.5 а). Более высокие значения D67o отмечались при высоких концентрациях ТНТ в среде культивирования (100 - 150 мг/л). Снижение D670 в опыте до значений в контроле происходило при значительном снижении концентрации ксенобиотика до 18 ± 2 мг/л и ниже.

В отличие от Dew, общее количество клеток в контроле в течение всего времени культивирования достоверно превышало количество клеток в опыте. Это же относилось и к количеству КОЕ (рис. 9 б).

время, ч

Рис. 5. а- рост Е. coli К12 в единицах D670 (А) и изменение концентрации ТНТ (Б): 1,А - без ТНТ; 2,А — с ТНТ (200 мг/л); б - общее количество (А) и количество колониеобразующих клеток (Б) Е. coli К12: 1 — без ТНТ; 2-е ТНТ (200 мг/л).

Таким образом, увеличение D67o культуры Е. coli Kl 2, растущей в присутствии высоких концентраций ТНТ, не было связано с увеличением количества клеток, а вероятнее всего, как и в случае с В. subtilis SKI [Куриненко с соавт., 2003], связано с изменением морфологии или физических свойств клеток.

Микроскопическое исследование показало, что в контроле клетки сохраняли палочковидную форму и подвижность в течение всего срока культивирования. На фиксированных окрашенных препаратах они были представлены в виде одиночных палочек или коротких цепочек. Клетки, растущие в присутствии ТНТ («ТНТ-клетки») претерпевали морфологические изменения. Начиная со 2ч культивирования, клетки были представлены двумя формами: 85-90% - палочки, хорошо окрашивались фуксином, как и клетки в контроле, и 10-15% - круглые (кокковидные) клетки, мельче контрольных в нативных препаратах, мало подвижны и хорошо преломляли свет. К 4ч количество палочковидных форм значительно снижалось и составляло 25-30%, а количество кокковидных форм возрастало до 70-75%. Палочковидные формы «ТНТ-клеток» преимущественно одиночны, тогда как в контроле наоборот, значительная часть клеток была представлена цепочками. К 6ч в среде с ТНТ было обнаружено 60-70% палочковидных форм клеток и 30-40% кокковидных. На 8ч в опытном варианте сохранялось около 5-10% кокковидных клеток, остальные 90-95% - палочковидные клетки и цепочки палочковидных клеток, хорошо окрашиваемых, подвижных.

Наряду с изменением формы, клетки опытных вариантов отличались от контроля своими размерами. Размер клеток оценивали микрометрически, а также методом проточной цитометрии. Полученные при этом результаты совпадают. На рис. 6 представлены данные по изменению размеров клеток, полученные методом проточной цитометрии. Размер контрольных клеток

уменьшается лишь к 8ч культивирования. «ТНТ-клетки» уже через 15 мин. культивирования при сохранении палочковидной формы становились мельче контрольных, еще более уменьшаясь ко 2ч и 4ч культивирования, но к 6ч размер их несколько увеличивался и к 8ч превышал размер клеток в контроле.

Рис. 6. Изменение размеров клеток Е. coli Kl2: 1 - без ТНТ; 2-е ТНТ (200 мг/л). Данные полученные методом проточной цитометрии, представленные в условных единицах (у.е.).

Так как изменение морфологии и размеров «ТНТ-клеток» в процессе культивирования не подчинялось принципу «все или ничего» это свидетельствует о гетерогенности популяции Е. coli К12. Эта гетерогенность проявлялась в различном отношении, по крайней мере, двух субпопуляций клеток к токсическому действию ТНТ. Вероятно, палочковидные формы «ТНТ-клеток», обнаруживаемые при микроскопическом исследовании, о чем говорилось ранее, по неизвестной причине более устойчивы к токсическому действию ксенобиотика.

Изменение показателя преломления и гранулярности клеток Е. coli К12, культивируемых с ТНТ. Изменение морфологии и уменьшение размеров клеток не могли объяснить отмеченную выше неадекватность изменений оптической плотности и количества клеток Е. coli К12, культивируемых в присутствии ТНТ (рис. 5 а,б).

В связи с этим представлялось необходимым определить показатель преломления клеток Е. coli К12. Показатель преломления клеток контроля достигает максимума ко 2ч культивирования, после чего начинает снижаться. Показатель преломления «ТНТ-клеток» также увеличивается со 2ч, к 4ч достоверно превышая показатель преломления клеток контроля, достигая значений, которые сохраняются на 6 - 8ч культивирования. Подобное изменение показателя преломления бактериальных клеток, культивируемых в присутствии 200 мг/л ТНТ, наблюдалось и у исследуемой ранее В. subtilis SKI, культивируемой в аналогичных условиях [Куриненко с соавт., 2003]. Показателем, адекватным показателю светопреломления, при методе проточной цито-метрии, является гранулярность (боковое светорассеяние) клетки (рис. 7).

Причиной увеличения показателя преломления, как и гранулярности, может быть увеличение концентрации клеточных макромолекул, конденсация внутриклеточных структур или появление новых внутриклеточных образований. Каждое из этих равновероятных изменений структуры клеток приведет к увеличению их оптической плотности.

Рис. 7. Изменение гранулярности клеток Е. coli К12: 1 - без ТНТ; 2-е ТНТ (200 мг/л). Данные полученные методом проточной цитометрии, представленные в условных единицах (у.е.).

воемя. ч

Влияние ТИТ на проницаемость внешней липопротеиднон мембраны (ВЛПМ) и плазматической мембраны клеток К сои К12.

Морфофизиологические изменения клеток Е.соИ К12 в присутствии высоких концентраций ТНТ позволяют предположить, что они вызваны массивным поступлением ксенобиотика или продуктов его метаболизма к чувствительным к токсическому действию клеточным мишеням. В этом случае следовало ожидать ослабления барьерной функции внешней липопротеидной мембран и плазматической мембраны в процессе культивирования с ксенобиотиком. На рис.8 представлены результаты проверки этого предположения.

время, ч время, ч

Рис. 8. Количество колониеобразующих единиц Е. coli Kl2, выросших на МПА, МПА с АОТ (10 3 %), МП А с фуксином (0,2 г/л) и МПА с АОТ (Ю-3 %), и фуксином (0,2 г/л) (а - без ТНТ; б - с ТНТ (200 мг/л)). За 100 % принимали количество КОЕ, выросших на МПА.

Как видно из представленных данных в присутствии АОТ и фуксина количество КОЕ со 2ч культивирования с ТНТ уменьшалось по сравнению с контролем. Изменение чувствительности к фуксину у клеток, культивируемых в присутствии ТНТ, вызвано увеличением проницаемости ВЛПМ, однако появление чувствительности к АОТ не позволяет исключить и структурные перестройки ВЛПМ.

Так как нельзя исключить влияния ТНТ на проницаемость плазматической мембраны, мы оценили ее с помощью проточной цитофлуориметрии. Доля клеток контроля и «ТНТ-клеток», окрашенных пропидиум йодидом, -т.е. клеток с проницаемой плазматической мембраной, не превышает 2-4%.

Известно, что одним из критериев жизнеспособности клеток бактерий является целостность ее плазматической мембраны. Отсутствие влияния ксенобиотика (продуктов его метаболизма) на проницаемость плазматической мембраны свидетельствует о том, что клетки Е. coli К12, несмотря на токси-

ческое действие ксенобиотика, сохраняют жизнеспособность. Однако, увеличение 2,4,6-тринитротолуолом проницаемости ВЛПМ и отсутствие влияния ксенобиотика (продуктов его метаболизма) на проницаемость плазматической мембраны позволяют предположить, что мишень(и) действия ксенобиотика на клетку локализована(ы) в компартментах, ограниченных ВЛПМ и плазматической мембраной клетки.

Влияние ТНТ на содержание кофакторов клеток Е. coli К12 культивируемых в присутствии ТНТ и на катаболизм глюкозы. Отмеченное ранее изменение стратегии трансформации высоких концентраций ТНТ Е. coli К12 с образования продуктов нитровосстановления на продукты денитритации ксенобиотика вероятнее всего связано с нарушением функционирования системы ответственной за восстановление нитрогрупп ароматического кольца. В особенности с таким её элементом, как восстановленные кофакторы, необходимые для нитровосстановления ТНТ [Наумова с соавт., 1982а, Kalafut et al., 1998].

Влияние ТНТ на количество восстановленных никотинамидадениндинуклео-тидов - НАД (НАДФ) - и окисленных флавопротеидов (ФП) - в «ТНТ-клетках» представлено на рис. 9. Динамика исследуемых кофакторов в контрольном варианте характерна для метаболизирующей культуры в период активного роста [Евтодиенко, Акименко, 1998]. Из рис. 9 следует, что количество восстановленных НАД (НАДФ) в «ТНТ клетках» значительно снижается после 4ч культивирования. Количество окисленных ФП также снижается, что свидетельствует об увеличении их восстановленных форм. Но поскольку это не приводило к смене стратегии трансформации ТНТ, увеличение количества восстановленных флавиновых нуклеотидов свидетельствует о том, что они не участвуют в образовании продуктов нитровосстановления.

Рис. 9. Содержание восстановленных НАД (НАДФ) (а) и окисленных ФП (б) в клетках Е. coli Kl2 на синтетической среде: 1 - без ТНТ; 2-е ТНТ (200 мг/л).

Образование восстановленных кофакторов зависит от эффективности катаболизма глюкозы. На рис. 10 представлены данные по удельной скорости утилизации глюкозы. Более высокая скорость утилизации на 2ч культивирования по сравнению с контролем, вероятно, связана с использованием кофакторов для интенсификации процессов жизнеобеспечения клеток и максимальной скорости элиминации ТНТ.

Рис. 10. Удельная скорость утилизации глюкозы Е. coli К12: 1 - без ТНТ; 2 - с ТНТ(200 мг/л).

Падение удельной скорости утилизации глюкозы на 4ч совпадает с тем, что между 4ч и 6ч количество НАДН (НАДФН) (рис. 9 а) уменьшается. Это коррелирует со снижением скорости образования продуктов нитровосстановления ТНТ и свидетельствует о подавлении ключевых элементов системы редукции. Однако при этом продолжается процесс элиминации нитрогрупп ксенобиотика. Увеличение скорости утилизации глюкозы на 6ч не приводит к увеличению количества восстановленных НАД (НАДФ). Количество продуктов нитровостановления практически не увеличивается. Однако при этом увеличивается как количество КОЕ, так и общее количество клеток (рис. 9 б). Вероятно, после уменьшения количества ТНТ (до 50 мг/л) интенсивно функционирующей системой денитритации ксенобиотика, остаточное количество восстановленных НАД (НАДФ) используется для обеспечения процессов, необходимых для деления и роста клеток.

Подавление 2,4,6-тринитротолуолом аккумуляции энергии и изменение энергетического профиля популяции клеток Е. coli К 12. Следствием подавления ТНТ восстановительных систем бактерий помимо подавления освобождения энергии в дыхательной цепи следует ожидать подавления работы А цН- генераторов которые у Е. coli представлены: НАДН (НАДФН) - CoQ - редуктазой и цитохром ок-сидазой [Скулачев, 1989]. Уменьшение Д(Ян+ сопровождается снижением трансмембранного потенциала Дгр, которое можно определить с помощью потенциал-чувствительного флуорохрома 3,3'-дигексилоксакарбоцианин йодида (DiOC(,(3)).

На рис. 11 представлены данные по изменению значений Дц> в клетках контроля Е. coli Kl2 и в клетках, культивируемых в присутствии ТНТ («ТНТ-клетках»),

В клетках контроля Д"ф достигает максимального значения на 2ч культивирования, после чего начинает снижаться. Однако вплоть до 6ч его уровень сохраняет более

высокое значение по сравнению с клетками начала лаг-фазы. Только в клетках 8 часовой культуры Дг|> становится ниже, чем в клетках начала лаг-фазы. ТНТ изменяет динамику Дф клеток - на 2ч Дф, как и в контроле, увеличивается. Однако, если в клетках контроля это увеличение составляет 2,4 раза, то в «ТНТ-клетках» - 1,6. На 4ч и 6ч Дф значительно ниже, чем в клетках начала лаг-фазы.

время, ч

Рис. 11. Влияние ТНТ на мембранный потенциал Е. соИ К12, нормированный к размеру клеток: 1 - без ТНТ; 2-е ТНТ(200 мг/л).

Представляет интерес факт неоднородности популяции клеток контроля и «ТНТ клеток» по значению Дф. В обеих популяциях имелись субпопуляции с более высоким значением Дф (рис. 12; в левых пиках гистограмм Дф-«низкие» клетки, в правых - Дф-«высокие» клетки). В момент внесения инокулята как клетки контроля, так и «ТНТ-клетки» представляли собой клетки начала лаг-фазы. Таким образом, клетки начала лаг-фазы неоднородны по энергетическому статусу. Мы предположили, что в лаг-фазе к размножению готова лишь небольшая часть клеток -Дф-«высокие» клетки, возможно они же и колониеобразующие клетки. При переходе популяции клеток в контроле к экспоненциальному росту (с 2ч по 6ч) соотношение между Дф-«низкими» и Дф-«высокими» клетками смещалось в сторону последних. Гистограммы Дф приобретают унимодальный характер и смещаются вправо, в сторону более высоких значений. К 8ч культивирования (фаза замедления роста и переход к ранней стационарной фазе) гистограмма Дтр снова приобретает бимодальный характер. Таким образом, в стационарной, как и в лаг-фазе клетки представлены двумя субпопуляциями, различающимися величиной Дор.

Гистограммы Дф «ТНТ-клеток», в отличие от клеток контроля, сохраняют бимодальный характер по 6ч культивирования включительно. И только на 8ч смещаются вправо, в сторону больших значений Дф. Гистограмма приобретает унимодальный характер, что совпадает с элиминацией ТНТ из среды культивирования и увеличением размеров клеток.

Рис. 12. Изменение мембранного потенциала клеток Е. сой К12: а - за первые. 15 мин.; б - на 2ч; в - на 4ч; г-на 6ч; д - на 8ч культивирования; 1 - клетки без ТНГ; 2 - с ТНТ (200 мг/л). На оси ординат - количество клеток; на оси абсцисс - мембранный потенциал, выраженный в условных единицах флуоресценции красителя--ОЮСб(3).

Таким образом; ТНТ оказывает ингибирующее действие на механизмы, ответственные за энергетический статус бактерий. Это проявляется к снижение их мембранного потенциала; о чем свидетельствует смещение с 4ч по 6ч пиковс гистограмм-Дф-«низких» и Дар-«высоких» «ТНТ-клеток» влево. Вместе с тем, в. условиях: периодического культивирования ингибирование механизмов, обеспечивающих высокий уровень Дф, не летально. Оно носит транзиторный характер - после элиминации ксенобиотика эти механизмы активируются, обеспечивая восстановление: Дг|1 в зоне: Лгр - «высоких» «ТНТ - клеток» гистограммы.

Ранее было показано, что на ряду с уменьшением размеров часть «ТНТ-клеток» претерпевает морфологические изменения, превращаясь, в-округлые -кокковидные клетки. При этом часть клеток, сохраняющая палочковидную формуя-увеличивается по мере снижения: в среде, концентрации ТНТ. Мы расценили, зтсгкак' гетерогенность культуры; причина которой,:возможна связана с различием .в чувствительности к токсическому действию- ТНТ.. В условиях токсическогто- пресса-культура гетерогення' таюке по величине Д-ф; четко разделяясь на Д4г-«низ«ие>^и-Д-ф-«высокие»1 «ТГЕГ-клетки». Возможно;:это -не частный случай, клегки-'коктрол* также гетерогснны по величине Дг|>, но эта гетерогенность выражена меньше;.чем; в .

клетках опыта; й проявляется в начале- лаг фазь? при переходе кг стационарной фазе

роста культуры. Можно предположить, что неблагоприятные для роста и размножения клеток условия независимо от их природы могут индуцировать гетерогениза-цию популяции с целью ее сохранения при помощи части клеток, наиболее устойчивых к гибельным для большинства членов популяции условиям.

ВЫВОДЫ

1. Среди проанализированных штаммов Escherichia coli барьерные свойства внешней липопротеидной мембраны варьируют от штамма Escherichia coli Kl2, характеризующегося наиболее стабильной и наименее проницаемой внешней липопротеидной мембраной, до штамма Escherichia coli 055, с наименее стабильной и наиболее проницаемой внешней липопротеидной мембраной.

2. Штамм Escherichia coli К12 в условиях периодического восьмичасового культивирования способен практически полностью трансформировать максимальную концентрацию 2,4,6-тринитротолуола (200мг/л), тогда как штамм Escherichia coli 055 трансформировал 2,4,6-тринитротолуол в этих условиях на 42 %.

3. Для трансформации 2,4,6-тринитротолуола штаммы Escherichia coli К12 и Escherichia coli 055 используют стратегии нитровосстановления и денитритации. У штамма Escherichia coli 055 переключение стратегии нитровосстановления на де-нитритацию происходит при более низкой концентрации 2,4,6-тринитротолуола, чем у штамма Escherichia coli Kl 2, что совпадает с различиями в барьерных свойствах внешней липопротеидной мембраны, определяющей чувствительность к токсическому действию 2,4,6-тринитротолуола.

4. Токсическое действие 2,4,6-тринитротолуола в отношении штамма Escherichia coli К12, сопровождается морфологическими изменениями: уменьшением размеров клеток, увеличением удельной плотности и переходом части клеток популяции с палочковидной на кокковидную форму; физиологическими изменениями: снижением скорости утилизации глюкозы, уменьшением уровня восстановленных пиридиновых и окисленных флавиновых кофакторов

5. В присутствии 2,4,6-тринитротолуола у клеток Escherichia coli К12 зафиксировано снижение трансмембранного потенциала и изменение энергетического профиля популяции в целом. Тем не менее, на фоне выраженного токсического эффекта, популяция эффективно элиминирует ксенобиотик, нормализуя не только морфофизические характеристики, но и трансмембранный потенциал и его популя-ционный профиль. :

6. Разработан метод определения барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны грамотрицательных бактерий, основанный на различии в чувствительности штаммов Escherichia coli к анионному поверхностно активному веществу

- натриевой соли ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты (Аэрозоль ОТ, АОТ) и основному фуксину.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Куриненко Б.М. Особенности токсического действия 2,4,6 - тринитротолуола в отношении Escherichia coli К12 / Б.М. Куриненко, Н.А. Дениварова. Р.Э. Давыдов, Г.Ю. Яковлева // Прикл. биохимия и микробиология.- 2006.- Т.42,- № 4.

2. Куриненко Б.М. Чувствительность различных штаммов Escherichia coli к токсическому действию 2,4,6 - тринитротолуола / Б.М. Куриненко, Н.А. Дениварова. Г.Ю. Яковлева // Прикл. биохимия и микробиология,- 2005.- Т.41,- № 1,- С.53-57.

3. Куриненко Б.М. Особенности токсического эффекта 2,4,6 - тринитротолуола в отношении Bacillus subtilis SKI / Б.М. Куриненко, Г.Ю. Яковлева, Н.А. Дениварова. Ю.В. Абреимова//Прикл. биохимия и микробиология.-2003.- Т.39.-№ 2.-С.194-198.

4. Куриненко Б.М. Влияние токсических концентраций 2,4,6 — тринитротолуола на физические свойства и морфологию клеток Bacillus subtilis SKI / Б.М. Куриненко, Г.Ю. Яковлева, Н.А. Дениварова. Ю.В. Абреимова // Прикл. биохимия и микробиология,- 2003.- Т.39,- № 3,- С.313-317.

5. Куриненко Б.М. Влияние различных концентраций 2,4,6 - тринитротолуола на стратегию его трансформации штаммом Bacillus sp. SKI / Б.М. Куриненко, Г.Ю. Яковлева, Н.А. Дениварова. Ю.В. Абреимова; Казанский гос.ун-т.-Казань, 2002,-19с.- Деп. В ВИНИТИ 14.01.2002; № 59-В2002.

6. Дениварова Н.А. Влияние концентрации 2,4,6- тринитротолуола на использование Bacillus sp. SKI различных ферментативных систем его трансформации / Н.А. Дениварова^ Г.Ю. Яковлева, Ю.В. Абреимова, Б. М. Куриненко // Ферменты микроорганизмов: Сборник докладов XII юбилейной конференции, Казань 2001г.-Казань,2001.-С.108-109.

7. Дениварова Н.А. Влияние барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны Escherichia coli на стратегию трансформации 2,4,6-тринитротолуола / Н.А. Дениварова, Г.Ю. Яковлева, Б.М. Куриненко // Биология наука XXI века: Сборник тезисов / 7-ая Пущинская конференция молодых ученых, Пущино 14-18 апреля 2003 г. - Пущино, 2003. - С.272.

8. Дениварова Н.А. Влияние 2,4,6-тринитротолуола на физические свойства и морфологию клеток Escherichia coli К12 / Н.А. Дениварова. Г.Ю. Яковлева, Б.М. Куриненко // Биология наука XXI века: Сборник тезисов / 8-ая Пущинская конференция молодых ученых, Пущино 17-21 мая 2004 г. - Пущино,2004. -С.147.

9. Дениварова Н.А. . Влияние барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны на использование Escherichia coli различных ферментативных систем для де-токсикации 2,4,6-тринитротолуола/ Н.А. Дениварова, Г.Ю. Яковлева, Б.М. Куринен-

ко //"Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" ХШ международная конференция, Казань 4-8 апреля, сб. тезисов Казань 2005 - с. 27-28.

Подписано к печати 15.06.2006 г. Формат 60x84 1/16 Тираж 100 Заказ 1 /2

ООО "Изображение" 420107 г, Казань« ул. М.Салимжанова, 14

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дениварова, Наталья Александровна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1.Метаболизм и биологические эффекты нитроароматических соединений.

1.1 .Ароматические нитросоединения, их химические характеристики и практическое применение.

1.2.Пути биотрансформации некоторых представителей нитроароматических соединений. i 1.3.Генотоксические свойства нитроарилов.

1.4.Токсические свойства нитроарилов.

Глава 2.Строение и свойства клеточной стенки грамотрицательных бактерий.

2.1.Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий. д 2.2.Вариабельность барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны грамотрицательных бактерий.

Глава 3.Жизнеспособное, но некультивируемое состояние аспорогенных бактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности токсического действия 2,4,6-тринитротолуола на штаммы Escherichia coli"

Актуальность проблемы. Нитроароматические соединения традиционно используют в качестве взрывчатых веществ и сырья для производства красителей, синтетических полимеров и растворителей. Они известны так же как избирательно действующие лекарственные препараты и пестициды. Большинство из них высокотоксичные и трудноразлагаемые неприродные соединения, относящиеся к числу экологически опасных веществ.

Одним из представителей полинитроароматических соединений является 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ) - вещество, отличающееся выраженными токсическими свойствами и устойчивостью к биодеградации. Как следствие деятельности военных отраслей промышленности и военных объектов в различных регионах мира выявлены большие территории, загрязненные остатками взрывчатых смесей, основным компонентом которых является ТНТ [Fernando et al., 1990; Comfort et al., 1995; Scheibner et al., 1997]. С увеличением уровня производства ТНТ, вызванного потребностями военных, возрастает значение ремедиации мест производства ТНТ, оказывающего вредное влияние на окружающую среду.

В настоящее время наряду с физическими и физико-химическими способами детоксикации отходов, загрязненных ТНТ, разрабатываются подходы для их биоремедиации с использованием микроорганизмов: грибов [Fernando et al, 1990; Hawarl et al., 1999], анаэробных [Boopathy, Kulpaing, 1992; Boopa-thy et al., 1993] и аэробных бактерий [Наумова с соавт., 1979; Наумова с со-авт. 1988; Boopathy et al., 1994; Kalafut et al., 1998]. Механизм биотрансформации ТНТ аэробными и аэротолерантными микроорганизмами интенсивно исследуется [Boopathy et al., 1994; Fuller, Manning, 1997; French et al., 1998; Kalafut et al., 1998; Наумов с соавт., 1998, 1999; Hawari et al., 2000; Esteve-Nunez et al., 2001; Зарипов с соавт., 2002; Zaripov et al., 2002].

Известно, что аэробные грамотрицательные и грамположитель-ные бактерии различаются по чувствительности к токсическому действию ТНТ [Наумова с соавт., 1982 а] и по стратегии трансформации ксенобиотика [Kalafut et al., 1998]. Отмечается высокая устойчивость к токсическому действию ксенобиотика у грамотрицательных микроорганизмов по сравнению с грамположительными. Вероятно, это является причиной преобладания грамотрицательных бактерий в почвах загрязненных ксенобиотиком. Механизм такой устойчивости может быть обусловлен различными причинами. В том числе наличием в структуре \у клеточной стенки внешней липопротеидной мембраны (ВЛПМ), выполняющей функцию дополнительного защитного барьера клетки и препятствующего одномоментному поступлению в клетку высоких концентраций ксенобиотика. Однако известно, что стабильность и проницаемость ВЛПМ штаммов грамотрицательных видов может существенно различаться. Следствием этого возможны внутривидовые отличия в устойчивости штаммов к токсическому действию ксенобиотиков, в том числе и ТНТ. Нельзя исключить, что подобные различия могут сказаться и на особенностях стратегии трансформации ксенобиотика устойчивыми и чувствительными штаммами. В частности, стратегия трансформации чувствительными штаммами грамотрицательных бактерий может быть зависима от токсического пресса ксенобиотика, подобно стратегии, описанной нами ранее для аэробной Bacillus subtilis SKI, чувствительной к токсическому действию ТНТ. Несмотря на привлекательность высказанных предположений, мы не нашли их экспериментального подтверждения.

Токсическое действие различных веществ может не только подавлять жизнеспособность микроорганизмов, но и вызывать их адаптацию к новым щ условиям существования, механизмы которой могут быть разнообразными. В основе адаптации микроорганизмов к токсическим веществам нередко лежит использование как специальных ферментов детоксикации, так и различных ферментных систем обмена веществ клетки. Количество и последовательность использования ферментных систем обмена веществ клетки для детоксикации будут зависеть от совокупности их свойств и, в частности, от устойчивости ферментов к инактивирующему (ингибирующему) действию ксенобиотика и от значения каталитической константы в реакциях превращения ксенобиотика как субстрата. Исходя из этого, логично предположить, что концентрация ТНТ может оказать решающее значение на его трансформацию той или иной ферментной системой клетки, что, возможно, и определяет особенности так называемой стратегии трансформации. Адаптационные процессы к неблагоприятным условиям среды обитания не ограничиваются реакциями детоксикации, а затрагивают целый ряд морфофизиологических показателей клеток [Пронин с соавт., 1982; Мулюкин с соавт., 1996; Мулюкин с соавт., 1997; Мулюкин, 1998; Головлев, 1998; Куриненко с соавт., 2003]. Влияние высоких концентраций ТНТ на адаптационные изменения метаболизма и морфофизиологические показатели клеток грамотрицательных бактерий - деструкторов практически не исследованы, несмотря на то, что такие исследования имеют несомненное теоретическое и практическое значение.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Разработать метод определения барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны грамотрицательных бактерий. Провести сравнение барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны исследуемых штаммов Escherichia coli.

Впервые установлено, что штаммы одного и того же вида грамотрицательных бактерий, различающиеся по чувствительности к токсическому действию ксенобиотика, адаптируются к токсическим концентрациям, используя как стратегию нитровосстановления, так и денитритации. С увеличением концентрации ксенобиотика происходило изменение стратегии его трансформации с образования продуктов нитровосстановления на образование нитритов, как у изученной ранее грамположительной В. subtilis SKI, чувствительной к токсическому действию ТНТ [Куриненко с соавт., 2003].

Впервые, на примере штамма Е. coli К12, обладающего наиболее стабильной и наименее проницаемой внешней липопротеидной мембраной, установлено, что действие высокой концентрации ТНТ(200мг/л) в аэробных условиях сопровождается изменением морфологических показателей клеток: уменьшением размеров, увеличением их плотности и изменением морфологии части клеток популяции с палочковидной на кокковидную.

Впервые также установлено различие в так называемом энергетическом профиле популяции - в количественном распределении клеток популяций контроля и «ТНТ-клеток» по значению А\|/. В обеих популяциях, в зависимости от фазы роста в контроле и концентрации ТНТ в «ТНТ-клетках», имелись субпопуляции с высоким и низким значением Д\|/. В контроле бимодальное распределение клеток по значению Д\|/ имело место в лаг-фазе и при переходе в стационарную фазу роста. Для «ТНТ-клеток» бимодальное распределение по значению А\|/ определялось во всем диапазоне высоких концентраций ТНТ.

Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены доказательства того, что изменение стратегии трансформации ТНТ зависящее от концентрации ксенобиотика и впервые описанное нами для аэробной грамположительной В. subtilis SKI [Куриненко с соавт., 2003], получило подтверждение для грамотрицательной Е. coli. Это обосновывает необходимость выяснения механизма переключения стратегии нитровосста-новления на денитритацию и выяснения молекулярного механизма денитри-тации, который до сих пор не известен. Знание деталей этих механизмов представляет интерес для фундаментальной науки, в частности раздела, изучающего регуляцию метаболизма микроорганизмов в экстремальных условиях жизнеобеспечения.

Установлено, что ТНТ в токсических концентрациях вызывает структурно-функциональные перестройки клеток Е. coli, что проявляется в уменьшении размеров, и увеличении удельной плотности, подавлении аккумуляции энергии. Эти перестройки обратимы и со снижением концентрации ксенобиотика происходит нормализация морфофизиологических показателей клеток. Эти данные имеют практическое значение. Их целесообразно учитывать при определении кинетических параметров роста бактерий в условиях токсического стресса. Пренебрежение этими данными при определении кинетических параметров роста бактерий, культивируемых в условиях токсического стресса, может привести к некорректным выводам, если эти параметры сформулированы на основе оптической плотности культуры.

Основные положения, выносимые не защиту.

1. Вид Е. coli демонстрирует высокую вариабельность барьерных свойств внешней липопопротеидной мембраны.

2. Штамм Е. coli К12 со стабильной внешней липопротеидной мембраной по сравнению со штаммом Е. coli 055 с более проницаемой и менее стабильной ВЛПМ обладает способностью к более быстрой и полной элиминации ТНТ из среды культивирования.

3. Токсическое действие ТНТ по отношению к шт. Е. coli К12 проявляется в диссоциации культуры на две жизнеспособные субпопуляции, характеризующиеся выраженными морфологическими и физиолого-биохимическими отличиями.

4. Клетки Е. coli К12, культивируемые в присутствии высоких концентраций ТНТ, отличаются более мелкими размерами, увеличением удельной плотности, повышенной проницаемостью ВЛПМ.

5. Высокая концентрация ТНТ приводит к снижению скорости утилизации глюкозы штаммом Е. coli К12, уменьшению в клетках штамма количества восстановленных никотинамидадениндинуклеотидов и увеличению восстановленных флавопротеидов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в течение 2001-2005гг. проводится в соответст-■Щ вии с планом НИР Казанского государственного университета «Молекулярные механизмы ответа клетки на раздражение. Влияние природы и силы раздражителя, функционального состояния клетки и степени ее дифференцированное™ на содержание клеточного ответа» (№ гос. регистрации 01.2.00.1.15733, научный руководитель д.б.н. проф. Б.М. Куриненко). Постановка задачи диссертационного исследования принадлежит научному руко-У водителю работы д.б.н. проф. Б.М. Куриненко. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Трансмембранную разность электрических потенциалов (трансмембранный потенциал - А\|/) бактерий, проницаемость внутренней плазматической мембраны, прямое светорассеяние FSC (показатель размера клетки) и боковое светорассеяние SSC (показатель гранулярности цитоплазмы) определяли v« совместно с д.м.н. проф. Г.В. Черепневым и врачом-лаборантом Т.А. Велижинской, на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA) на базе лаборатории иммунологии Республиканской Клинической Больницы № 2 Министерства Здравоохранения Республики Татарстан. Определение количества окисленных и восстановленных кофакторов проводили совместно с к.б.н. Р.Э. Давыдовым на спектрофлуориметре «SIGNE - 4М» на щ базе лаборатории инженерной энзимологии Казанского Государственного

Университета им. В.И. Ульянова-Ленина.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях КГУ (Казань, 2001, 2002, 2003, 2004), школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003, 2004), XII и XIII юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю доктору биологических наук профессору Б.М. Куриненко, за чуткое руководство; кандидату биологических наук Г.Ю. Яковлевой за поддержку и внимательное отношение к работе; кандидату биологических наук Р.Э. Давыдову за определение количества окисленных и восстановленных кофакторов и участие в обсуждении результатов; доктору медицинских наук Г.В. Черепневу и врачу-лаборанту Т.А. Велижинской; за возможность осуществления цитофлуориметрии на базе лаборатории иммунологии РКБ №2 МЗ РТ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, включает 4 таблицы, 18 рисунков. Библиография содержит 173 источников, из них 120 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дениварова, Наталья Александровна

выводы

1. Среди проанализированных штаммов Escherichia coli барьерные свойства внешней липопротеидной мембраны варьируют от штамма Escherichia coli К12, характеризующегося наиболее стабильной и наименее проницаемой внешней липопротеидной мембраной, до штамма Escherichia coli 055, с наименее стабильной и наиболее проницаемой внешней липопротеидной мембраной.

3. Для трансформации 2,4,6-тринитротолуола штаммы Escherichia coli К12 и Escherichia coli 055 используют стратегии нитровосстанов-ления и денитритации. У штамма Escherichia coli 055 переключение стратегии нитровосстановления на денитритацию происходит при более низкой концентрации 2,4,6-тринитротолуола, чем у штамма Escherichia coli К12, что совпадает с различиями в барьерных свойствах внешней липопротеидной мембраны, определяющей чувствительность к токсическому действию 2,4,6-тринитротолуола.

4. Токсическое действие 2,4,6-тринитротолуола в отношении штамма Escherichia coli К12, сопровождается морфологическими изменениями: уменьшением размеров клеток, увеличением удельной плотности и переходом части клеток популяции из палочковидной в кокковидную форму; физиологическими изменениями: снижением скорости утилизации глюкозы, уменьшением уровня восстановленных пиридиновых и окисленных флави-новых кофакторов

6. Разработан метод определения барьерных свойств внешней липо-протеидной мембраны грамотрицательных бактерий, основанный на различии в чувствительности штаммов Escherichia coli к анионному поверхностно т активному веществу - натриевой соли ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты (Аэрозоль ОТ, АОТ) и основному фуксину. t

Заключение

Различные штаммы одного и того же вида грамотрицательных бактерий могут различаться по стабильности и проницаемости ВЛПМ, что отражается на их чувствительности к токсическому действию ТНТ. Они способны адаптироваться к токсическим концентрациям ТНТ используя как стратегию нитровосстановления, так и денитритацию ксенобиотика, как и ранее изученная нами В. subtilis SKI [Куриненко с соавт, 2003]. Более высокая чувствительность к токсическому действию ТНТ у клеток штамма Е. coli 055 и переключение его метаболизма со стратегии нитровосстановления на денитритацию при более низких концентрациях ксенобиотика по сравнению со штаммом Е. coli К12, находятся в соответствии с нарушением барьерной функции его ВЛПМ, а образование нитритов у обоих штаммов с увеличением концентрации ТНТ, является доказательством роли токсического пресса в переключении стратегии трансформации ксенобиотика обоими штаммами.

Результаты наших исследований, опубликованные ранее, и представленные в этой работе, а также цитированные в разделе 1.2. работы [Labidi et al. 2001, Martin et al.,1997] о влиянии состава среды на природу продуктов биотрансформации ТНТ, дают основание полагать, что выбор пути трансформации ксенобиотика определяется не только видовыми особенностями микроорганизмов-деструкторов, но и условиями, в которых идет процесс трансформации (концентрация ксенобиотика, источник питания деструктора), что открывает возможность для разработок технологии направленной деструкции ТНТ с образованием продуктов, не обладающих токсическими и генотоксическими свойствами.

Из сравнения изменений морфофизиологических показателей клеток Е. coli К12, с данными аналогичных исследований В. subtilis SKI [Куриненко с соавт, 2003], видно, что действие высоких концентраций ТНТ на оба вида имело общие черты. С увеличением концентрации ксенобиотика происходило изменение стратегии его трансформации с образования продуктов нитровосстановления на образование нитритов, связанное с нарушением функции системы редукции клеток. В обоих случаях при высокой концентрации ТНТ уменьшалось количество КОЕ. Обнаруженные нарушения в регуляции окислительно-восстановительных процессов и появление «карликовых» и кокко-видных форм бактерий, увеличение показателя преломления (гранулярности), характерны для промежуточной стадии между вегетативными клетками и некультивируемым состоянием (НС) [Головлев с соавт, 1998; Литвин с соавт, 2000; Соколенко с соавт, 2002.; Диденко с соавт, 2000]. Предполагают, что весьма существенна для поддержания НС-фенотипа конденсация нуклео-ида [Головлев с соавт, 1998], что показано для НС-фенотипа Salmonella typhymurium [Диденко с соавт, 2000]. Это может быть одной из причин увеличения коэффициента преломления, установленного нами для «ТНТ-клеток» В. subtilis SKI и Е. coli К12. Таким образом, нельзя исключить, что токсический стресс, вызванный высокими концентрациями ТНТ, способствует переходу аэробных грамположительных и грамотрицательных бактерий к НС-фенотипу.

Способность к полной элиминации ТНТ в условиях периодического культивирования не является свидетельством устойчивости к токсическому действию ксенобиотика. Определение грамотрицательных клеток Е. coli как устойчивых к токсическому действию ТНТ [Наумова с соавт, 1982] не соответствует действительности. Тем не менее, E.coli К12, несмотря на чувствительность к токсическому действию ТНТ и подавление системы редукции, в отличие от В. subtilis SKI, сохраняет способность к полной элиминации ксенобиотика. Это может быть обусловлено более эффективным по сравнению с В. subtilis SKI использованием системы денитритации ксенобиотика. Предполагают, что денитритация нитроарилов осуществляется при участии восстановленного глутатиона [Murphy et al, 1982; Renner et al, 1984]. Кроме того, динамика морфологических форм Е. coli К12 на фоне снижающейся концентрации ТНТ (количественные соотношения палочковидных и кокковид-ных форм) и количество КОЕ, позволяют допустить способность кокковид-ных форм клеток или, по крайней мере, их части, к элиминации ксенобиотика. После чего наблюдается обратный переход клеток из промежуточной стадии НС-фенотипа в вегетативные клетки, о чем свидетельствует увеличение КОЕ и «нормализация» морфофизиологических особенностей клеток. т

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дениварова, Наталья Александровна, Казань

1. Амерханова Н.Н. 2,4,6-тринитротолуол как источник питания для бактерий / Н.Н. Амерханова, Р.П. Наумова // Микробиология.-1979.- Т.48.-№ 3. - С.393-395.

2. Бабусенко Е.С. Исследование мембраннотропных ауторегуляторных факторов метаноокисляющих бактерий / Е.С. Бабусенко, Г.И. Эль-Регистан, Н.Б. Градова, А.Н. Козлова, Г.А. Осипов // Успехи химии.-1991.- Т.60,-Вып.11.-С.23 62-23 73.

3. Батраков С.Г. Тирозол-ауторегуляторный фактор dl дрожжей Sac-charomyces cerevisiae / С.Г. Батраков, Г.И. Эль-Регистан, Н.Н. Придачина, В.А. Ненашева, А.Н. Козлова, М.Н. Грязнова, И.Н Золотарев // Микробиоло-ГИЯ.-1979.- Т.62.-Вып.1 С.633-638.

4. Бошнаков Р.Х. Дифференциальная экспрессия генов в культивируемых и некультивируемых формах Salmonella typhimurium / Р.Х. Бошнаков, Ю.М. Романова, Н.А. Зигангирова, А.Л. Гинцбург // Вестник РАМН.- 2001.-№ 1,- С.8-12.

5. Герчук М. П. Четвертично-аммониевые соли / М.П. Герчук, В.П. Эрекаев // М.:Химия.- 1960.- 59с.

6. Головенко Н. Механизмы реакционного метаболизма ксенобиотиков в биологических мембранах / Н. Головенко. // Киев: Наукова Думка.-1985.- С.184-185.

7. Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий / Е.Л. Головлев // Прикл. биохимия и микробиология.- 1998. -Т.67.- № 6.- С.725-735.

8. Горелик М. Основы химии и технологии ароматических соединений / М.Горелик, Л.Эфрос // М.: Химия.- 1992. С.640.

9. Гусев М.В. Микробиология/М.В. Гусев, Л.А. Минеева // Издательство московского университета.-1985.- С.325-327.

10. Давиденко Т. Ферментативное восстановление нитросоединений / Т. Давиденко, И. Романовская, Г. Бондаренко // Итоги науки и техники ВИ

11. НИТИ. Сер. Биол. химия.- 1990.- Т.34. -119с.

12. П.Зарипов С. А. Начальные этапы микробного метаболизма 2,4,6-тринитротолуола / С.А. Зарипов // Автореф. дис. на соискание уч. степ, канд. биол. наук. Казань.- 2002.- 19с.

13. Зарипов С.А. Альтернативные пути начальной трансформации 2,4,6-тринитротолуола дрожжами / С.А. Зарипов, А.В. Наумов, Е.В. Никитина, Р.П. Наумова//Микробиология.- 2002.- Т.71.- № 5. С.648-653.

14. Карамова Н.С. Мутагенная активность 2,4,6-тринитротолуола: роль метаболизирующих ферментов / Н.С. Карамова, О.Н. Ильинская, О.Б. Иванченко // Генетика микроорганизмов.- 1994.- Т.30.- № 6.- С.898-902.

15. Каррер П. Курс органической химии. 2 изд. / П. Каррер // Ленинград: ГНТИ Хим. Лит.- 1962.- 204с.

16. Кривец И.А. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием поверхностно-активных веществ / И.А. Кривец // Химия и технология воды.-1984.- Т.6.- № 5.- С.455-463.

17. Куриненко Б.М. Биотехнология антибиотиков кн. «Микробная биотехнология» / Б.М. Куриненко П Казань: Унипресс: ДАС.- 2000.

18. Куриненко Б.М. Особенности токсического эффекта 2,4,6 тринитротолуола в отношении Bacillus subtilis SKI / Б.М. Куриненко, Г.Ю. Яковлева, Н.А. Дениварова, Ю.В. Абреимова // Прикл. биохимия и микробиология.-2003.- Т.39.- № 2.- С.194-198.

19. Лукьянова Л.Д. Кислородзависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние / Л.Д. Лукьянова, Б.С. Балмуханов, А.Т. Уголев // М.: Наука.- 1982.-300с.

20. Лукьянчук В. Сродство к биомембранам как показатель биологической активности 2,4- динитрофенола и его алкилпроизводных / В. Лукьянчук, С.Могилевич, Б. Клебанов // Докл. АН УССР. Сер.Б.Геол, хим. и биол. нау-КИ.-1983.- Т.6.- №4.- С.76-78.

21. Лукьянчук В. Динитрофенольные соединения: токсикология, терапия и профилактика интоксикаций (обзор литературы) / В. Лукьянчук // Гигиена труда и проф. заболеваний.- 1987.- Т.7.- № 1.- С.42-45.

22. Лурье Ю. Химический анализ производственных сточных вод / Ю. Лурье, А. Рыбников //М.:Химия.- 1974. С.258-287.

23. Мельников Н. Химия и технология пестицидов / Н. Мельников // М.: Химия.- 1974,-768с.

24. Методы общей бактериологии //М.: Мир.- 1983. Т.1. - 535 с.

25. Миллиареси Е. Химия ароматических соединений. Методические разработки / Е. Миллиареси, Э. Нифантьев // М.: Изд-во МГПИ.- 1984.- Ч.1.-136с.

26. Мулюкин А.Л. Образование покоящихся форм Bacillus subtilis и Micrococcus luteus / А.Л. Мулюкин, К.А. Луста, М.Н. Грязнова, А.Н. Козлова, М.В. Дужа, В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.- 1996.- Т. 65.-Вып. 6.- С. 782-789.

27. Мулюкин А.Л. Образование покоящихся форм у неспорообразую-щих микроорганизмов / А.Л. Мулюкин // Автореферат дисс. канд. биол. наук. М.: Ин-т микробиологии РАН.- 1998.- 26с.

28. Наумов А.В. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола лактобацилла-ми с образованием токсичных гидроксиламинопроизводных / А.В. Наумов,хщ Е.С. Суворова, A.M. Воронин, С.К. Зарипова, Р.П. Наумова // Микробиология. 1999.- Т.68.- № 1.- С.65-71.

29. Наумова Р.П. Изучение первого этапа превращения тринитротолуола под действием Pseudomonas denitrificans / Р.П. Наумова, Н.Н. Амерханова,

30. Наумова Р.П. Бактериальная восстановительная трансформация ароматических нитросоединений / Р.П. Наумова, Н.Н. Амерханова, Т.О. Белоусова // Микробиология. 1982 б.- Т.51.- №5. - С.735-739.ф 35. Наумова Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений /

31. Р.П. Наумова//Казань: Изд. КГУ.- 1985.- С.196-226.

32. Наумова Р.П. Изучение возможности глубокой бактериальной деструкции 2,4,6-тринитротолуола / Р.П. Наумова, С.Ю. Селивановская, Ф.А. Мингатина // Микробиология. 1988. - Т.57.- №2. - С.218-222.

33. Новикова О. Д. Порины наружной клеточной стенки / О. Новикова // Автореф. дис. на соискание уч. степ. канд. биол. наук,- Владивосток.-1986.1. C.12-14.

34. Романова Ю.М. / Ю.М. Романова, A.JI. Гинцбург // Молекулярная генетика.- 1993.- №6.- С.34-37.

35. Романова Ю.М. Генетический контроль индукции некультивируе-мого состояния у патогенных бактерий / Ю.М. Романова, A.JI. Гинцбург // Микробиология.- 1996.- № 3.- С. 16-18.

36. Светличный В.А. Изучение содержания мембраноактивных ауторе-\ц гуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava / В.А.

37. Светличный, А.К. Романова, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.- 1986.-Т.55.- Вып. 1.- С. 55-59.

38. Северина JI.O. Бактериальные S-слои /J1.0. Северина // Микробио-логия.-1995.-Т.64.- №6.-С.725-733.

39. Селивановская С.Ю. Микробный метаболизм ароматических нитро-t и аминосоединений в связи с биотехнологией очистки сточных вод / С.Ю.

40. Селивановская // Диссер. на соискание уч. степ. канд. биол. наук. Казань. -1986.- 153с.

41. Сидоренко С.В. Место бактерий в живой природе / С.В. Сидоренко // -Москва,- 2000.

42. Скрябин Г. Использование микроорганизмов в органическом синтезе / Г. Скрябин, JI. Головлева // М.: Наука. -1976.- 136с.

43. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран / В.П. Скулачев // М.:Наука.- 1989.- С.188-191.

44. Ставская С.С. Микробиологическая очистка воды от поверхностно активных веществ/ С.С Ставская, В.М. Удод, А.А. Таранова, И.А. Кривец // Киев.: Наук. Думка.- 1988,- 157с.

45. Суворова Е.С. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола молочнокислыми бактериями / Е.С. Суворова //Автореф. дис. на соискание уч. степ. канд. биол. наук.- Пущино.- 1999. 17с.

46. Супотницкий М. В. Протективные свойства порообразующих белков патогенных бактерий / М.В. Супоницкий // Вестник Российской академии медицинских наук. 1996.- № 8.- С. 18-22.т

47. Шварц А. Поверхностно- активные вещества / А. Шварц, Дж. Пери II Мл Медицина.- 1953,- С.54-67.

48. Шварц А. Поверхностно- активные вещества и моющие средства / А. Шварц, Дж. Пери // М: Медицина,- 1960. С.45-78.ij| 53. Штюпель Г. Синтетические моющие средства / Г. Штюпель // М.:

49. Медицина.- I960.- С.42-78.

50. Ahlborg G. Mutagenic activity and metabolites in the urine of workers exposed to trinitrotoluene (TNT) / G.Ahlborg, P.Einisto, M. Sorsa // British Journ. of Industr. Med.- 1988.- V.45.- № 2.- P.353-358.

51. Amgar A. Jur I'activeite antibacterienne in vitro do methoxy-7-nitro-2-v* naphto(2,l-b)furanne R700. / A.Amgar, R. Cavier, J. Buisson, R. Royer // Ann.

52. Phann. Fr.-1983.- V.41.- № 2.- P.283-285.

53. Anshou Z. A. Clinical study of trinitrotoluene cataract / Z.A. Anshou // Polish Journ. Of Occupan. Medicine.- 1990.- V.3.- № 1.- P. 171-176.

54. Ashby J. Nongenotoxicity of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) to the mouse bone marrow and rat liver: implications for its carcinogenicity / J.Ashby,

55. B.Burlinson, P.Lefevre, J. Topham // Toxicology.- 1985.- V.58.- №1.- P.14-19.

56. Baumeister W. Electron Microscopy of Proteins. Membrane Structur / W. Baumeister, J. R. Harris, R.W. Home //London: Acad. Press. Inc.- 1987.- V.6.-109p.

57. Beland F. The in vitro metabolic activation of nitro polycyclic aromatic hydrocarbons / F. Beland, R. Heflich, R. Howard, P. Fu // In Harvey R. (Ed.). Polycyclic hydrocarbons and carcinogenesis.- Washington, DC.: Amer. Chem. Soc.- 1985.- P.371-376.

58. Bennett J. Prospects of fungal bioremediation of TNT munition waste / J. Bennett // Internat. Biodeterioration and Biodegradation.- 1994.- V.34.- № 1.- P. 21-34.

59. Bergmeyer H.U. Methods of enzymatic analysis / H.U. Bergmeyer,

60. E. Bert, F. Schmidt // (Ed.) N.Y.: Acad.Press.- 1974.- V.3.- P.l 196.

61. Beveridge T.J. // Int. Rev.- 1981.- V.72.- 229p.

62. Beveridge T.J./ T.J. Beveridge, L.L. Gracham // Microbiol. Rev.- 1991.-V.55.- 684p.

63. Boopathy R. Trinitrotoluene (TNT) as a sole nitrogen source for a sul-fate-reducing bacterium Desulfovibrio sp. (B strain) isolated from an anaerobic digester/ R. Boopathy, C.F. Kulpa // Curr. Microbiol. 1992.- V.25.- №4.- P.235-241.

64. Boopathy R. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by Desulfovibrio sp. (B strain) / R. Boopathy, C.F. Kulpa, M. Wilson // Appl. Microbiol. Bio-technol.- 1993.- V39.- №2,- P.270-275.

65. Boopathy R. Biotransformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by a Methanococcus sp. (strain B) isolated from a lake sediment / R. Boopathy, C.F. Kulpa // Can. J. Microbiol.- 1994.- V.40.- № 2.- P.273-278.

66. Boopathy R. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by a Pseudomonas consortium under aerobic conditions / R. Boopathy, J. Manning, C. Montemagno, C. Kulpa// Curr. Microbiol.- 1994.- V.28.- № 1. -P.131-137.

67. Boopathy R. Characterization of partial anaerobic metabolic pathway for 2,4,6-trinitrotoluene degradation by a sulfate-reducing bacterial consortium/ R. Boopathy, J.F. Manning // Can. J. Microbiol.- 1996. V.42.- № 12. - P. 12031208.

68. Bryant C. Purification and characterization of an oxygen insensitive NAD(P)H nitroreductase from Enterobacter cloacae / C. Bryant, M. DeLuca // Journ. Biol. Chem.- 1991,- V.226.-№ 12.-P.4119-4125.

69. Bruhn C. Nitrosubstituted aromatic compounds as nitrogen source for bacteria / C. Bruhn, H. Lenke, H. Knackmuss // Appl. Environ. Microbiol.- 1987.-V.53.- № 2.- P.208-210.

70. Bumpus J.A. Biodegradation of 2,4,6 trinitrotoluene by Phanerochaete chrysosporium: identification of initial degradation products and discovery of a TNT metabolite that inhibits lignin peroxidases / J.A. Bumpus, M. Tatarko // Curr.

71. Microbiol. 1994. - V.28.- №1.- P.185-190.

72. Colwer R.R. Viable but nonculturable Vibrio holerai 01 revert to a cul-turable state in the human intestine / R.R. Colwer, P.Bryton,. A.Hug et al. // World J. Microbiol. Biotechnol.- 1996.- V.12.- № 4.- P.28-31.

73. Couch D. The mutagenicity of dinitrotoluenes in Salmonella typhimurium / D. Couch, P. Allen, D. Abernethy // Mut. Research.- 1981.- V.90.- № 3.-P.373-380.

74. Dillert R. Photocatalytic degradation of trinitrotoluene and other ni-troaromatic compounds/ R. Dillert, M. Brandt, I. Fornefett, U. Siebers, D. Bahne-mann // Chemosphere.- 1995,- V.30.- № 10.- P.2333-2341.

75. Djerassi L. Hemolytic crisis in G6PD-deficient individuals in the occupational setting / L. Djerassi // Int.Arch.Occup.Environ.Health.- 1998.- V.71.-№ 1.-P.26-28.

76. Dodard S.G. Ecotoxicity characterization of dinitrotoluenes and some of щ their reduced metabolites /S.D. Dodard, A.Y. Renoux, J. Hawari, G. Ampleman,

77. S. Thiboutot, G.I. Sunahara // Chemosphere.- 1999.- V.38.- №9.- P.2071-2079.

78. Doolittle D. The influence of intestenial bacteria, sex of the animal and position of the nitrotoluene izomers in vivo/ D. Doolittle, J. Sherrill, B. Butter-worth // Cane. Res.- 1983,- V.43.- №11.- P. 2836-2842.

79. Dougherty R. Failure of 2,4-dinitrotoluene to induce dominant lethal m mutations in rat / R. Dougherty, G. Simmon, K. Canpbell, I. Barzelleca // Pharmacol.- 1978.- V.20.- №1.- P.155-161.

80. Dubin M. Effect of 5-nitroindole on adenylate energy charge, oxidative phosphorylation, and lipid peroxydation in rat hepatocytes / M. Dubin, P. Carrizo, A. Biscardi, S. Villami, A. Stoppani// Biochem. Pharmacjl.- 1994.- V.48.- №7.-P.1483-1492.

81. Duque E. Construction of a Pseudomonas hybrid strain that mineralizes 2,4,6-trinitrotoluene / E. Duque, A. Haidour, F. Godoy, T.L. Ramos // J. Bacterid.-1993,- V.175.- №8. P.2278-2283.

82. Ebringen L. Mutagenicity of nitrofuran drugs in bacterial systems / L. Ebringen, M. Bencova // Folia Microbiol.- 1980.- V.25.- №2.- P.388-396.

83. Einisto P. Role of bacterial nitroreductase and o-acetyltransferase in1. urine mutagenicity assay of rat exposed to 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) / P. Einisto

84. Mut. Research.-1991.- V.262.- №1.- P. 167-169.

85. Ellis H. Mammalian toxicity of munition compounds. Summary of toxicity of nitrotoluenes / H. Ellis, G.B. Hong, C. Lee // AD A080146 Kansas City: Midwest Research Institute. MO. DAMP-17-76-C-6066.- 1980.- 120p.

86. Esteve-Nunez A. Biological degradation of 2,4,6-trinitrotoluene /

87. A. Esteve-Nunez, A. Caballero, J.L. Ramos // Microbiol. Mol. Biol. Rev.- 2001.-V.65.- № 3.- P.335-352.

88. Fernando T. Biodegradation of TNT (2,4,6-trinitrotoluene) by Phanero-chaete chrysosporium / T. Fernando, J.A. Bumpus, S.D. Aust // Appl. Environ. Microbiol.- 1990.-V.56.- № 6.- P. 1666-1671.

89. Fewson C. Biodegradation of aromatics with industrial relevance / In Leisenger Т., Cook A., Huttler R., Nuesch J. (Eds.) // Microbial degradation of xeno-biotics and recalcitrant compounds.- London: Academic Press.-1981.- P.141-179.

90. French C.E. Aerobic degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Enterobac-ter cloacae PB2 and by pentaerythritol tetranitrate reductase / C.E. French, S. Nicklin, N.C. Bruce // Appl. Environ. Microbiol- 1998,- V.64.- №8,- P.2864-2868.

91. French C.E. Biodegradation of explosives by transgenic plants expressing pentaerythritol tetranitrate reductase / C.E. French, S.J. Rosser, G.J. Davies, S. Nicklin, N.C. Bruce //Nat. Biotechnol.- 1999.- V.17.- № 5.- P.491-494.

92. Fu P. Metabolism of nitro polycyclic aromatic hydrocarbons / P. Fu // Drug Metabol.- 1990.- У22.- № 2. P.209-268.

93. Fuller M.E. Aerobic gram-positive and gram-negative bacteria exhibitdifferential sensitivity to and transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) / M.E. Fuller, J.F. Jr. Manning // Curr. Microbiol.- 1997.- V. 35.- № 2.- P.77-83.

94. Funk S. Full-scale anaerobic bioremediation of trinitrotoluene (TNT) contaminated soil a US EPA SITE program demonstration / S. Funk, D. Crawford, R. Crawford // Appl. Biochem. and Biotechnol.- 1995.- V.51.- № 3,- P.625-633.

95. A 93. Funk S. Full-scale anaerobic bioremediation of trinitrotoluene (TNT)contaminated soil- a US EPA SITE program demonstration/ S. Funk, D. Crawford, R. Crawford // Appl. Biochem. and Biotechnol.- 1995.- V.51.- № 3.- P.625-633.

96. Gibson T. Sources of direct-acting nitroarene mutagens in airborne particulate matter / T. Gibson// Mut. Research.- 1983.-V.122,- № 2.- P.l 15.

97. Hancock R.E. Solubilization of membranes by detergents / R.E. Hancock //Annual. Revol. Microbial.- 1984,- V.38.- P.237-243.

98. Hannink N. Phytodetoxification of TNT by transgenic plants expressing a bacterial nitroreductase / N. Hannink, S.J. Rosser, C.E. French, A. Basran, J.A. Murray, S. Nicklin, N.C. Bruce // Nat. Biotechnol.- 2001.- V.19.- №12,-P.1168-1172.

99. Hanson R.S. Chemical Composisition Manual of methods for general bacteriology / R.S. Hanson, J.A. Phillips // Washington, D.C.: American Society for Microbiology.-1981. P.328-364.

100. Hao O.J. Wet air oxidation of trinitrotoluene manufacturing red water / O.L. Hao, K.K Phull, A.P. Davis, J.M. Chen, S.W. Maloney // Water Environ. Res.- 1993.- V.65.- № 2.- P.213-220.

101. Harrison D.E.F. Fluorimetric technique for monitoring changes in the level of reduced nicotinamide nucleotides in continuous cultures of microorganisms/ D.E.F. Harrison, B. Chance // Appl. Microbiol.- 1970.- V.19.- №.3.- P.446-450.

102. Harvey P. Veratril alkogol as a mediator and the role of radical cations in lignin biodegradetion by Phanerochaeta chrysosporium / P. Harvey, H. Schoe-maker, J. Palmer // FEBS Lett.- 1986.- V.195.- №2.- P.242-248.

103. Hawari J. Microbial degradation of explosives: biotransformation versus mineralization / J. Hawari, S. Beaudet, A. Halasz, S. Thiboutot, G. Ampleman // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2000.- V.54.- №5.- P.605-618.

104. Heinemets F. The use of metabolites in the restoration of the vability of heat and hemicaly inactivated Escherichia coli / F. Heinemets, W.W Taylor, J.J. Lehman // J. Bacteriol.- 1953.- V.67.- P.5-14.

105. Howard P. Reduction of carcinogen 1-nitropyrene to 1-aminopyrene by rat intestenial bacteria / P. Howard P, F.Beland, C. Cerniglia // Carcinogenesis.-1983.-V.4.-№8.- 985p.

106. Hudock G. Biological effects of trinitrotoluene/ G. Hudock, D. Gring // Contract N00164-69-c0892. Norfolk, Va: Naval. Eniron. Health Center. 1970.

107. Jarvis A.S. Assessment of the effectiveness of composting for the reduction of toxicity and mutagenicity of explosive-contaminated soil / F.S. Jarvis, V.A. McFarland, M.E. Honeycutt // Ecotoxicol. Environ. Saf.- 1998.- V.39.- №2,-P.131-135.

108. Jiang Q.-G. The reductive activation of trinitrotoluene in the rat liver,brain kidney and testes / Q.-G. Jiang, J. Cui // Journ. Health Toxicol.- 1987.- V.I.-№ 1.-P.37-39.

109. Jie Li. Persistent ethanol drinking increases liver injury inducted by trinitrotoluene explosure: an in plant case-control study / Jie Li, J. Quan-Guan, Wei-Dong Zh. // Human and Experim. Toxicology.- 1991.- V.10.- № 2,- P.405-409.

110. Kalafut T. Biotransformation patterns of 2,4,6-trinitrotoluene by aero-4 bic bacteria / T. Kalafut, M. Wales, V. Rastogi, R. Naumova, S. Zaripova, J. Wild

111. Curr. Microbiology.- 1998.- V.36.- № 1.- P.45-54.

112. Kaprely ants A.S. Dormansy in non-sporulating bacteria / A.S. Kaprelyants, J.C Gotchalc, D.B. Kell // FEMS Microbiol. Rev.- 1993.-V.140.- P.-271-286.

113. Kleiner A. Digestive function of the small intestine in patients chronically intoxicated with toluene nitro derivatives / A. Kleiner, Y. Stovpivskaya // Gig. Tr. Prof. Zabol.-1981.- V.2.- № i. p.23-26.

114. Labidi M. Biotransformation and partial mineralization of the explosive 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by rhizobia / M. Labidi, D. Ahmad, A. Halasz , J. Hawari // Can. J. Microbiol.- 2001.- V.47.- № 6.- P.559-566.

115. Lachance B. Citotoxic and genotoxic effects of energetic compounds on bacterial and mammalian cells in vitro / B. Lachance, P.Y. Robidoux, J. Hawari, G. Ampleman, S. Thiboutot, G.I. Sunahara//Mutat. Res.- 1999.- V.444.1.- P. 25-39.

116. Lenke H. Inital hydrogenation during catabplism of picric acid by Rhodococcus erythrofilis HL 24-2 / H. Lenke, H.-J. Knackmuss // Appl. Environ. Microbiol.- 1992.- V.58.- №7.- P.2933-2937.

117. Levine B. Toxic interaction of the munitions compounds TNT and RDX in F344 rats / B. Levine, E. Furedi, D. Gordon, E. Barkley, P. Lish // Fund.m103

118. And Appl. Toxicology.- 1990a.- V.15.- №2,- P.373-380.

119. Levine B. Six month oral toxicity study of trinitrotoluene in beagle dogs / B. Levine, J. Rust, E. Barkley, P. Lish // Toxicology.- 19906,- V.63.- №2.-P.233-244.

120. Lewtas J. Nitroarenes: their detection, mutagenicity and occurrence in the environment / J. Lewtas, M. Nishioka // New York: Plenum Press. 1990. -P.61-72.

121. Loomis A.K. Alginate encapsulation of the white rot fungus Phanero-chaete chrysosporium / A.K. Loomis, A.M. Childress, D. Daigle, J.W. Bennett // Curr. Microbiol.- 1997.- V.34,- №2,- P.127-130.

122. Martin J.L. Denitration of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas savas-tanoi / J.L. Martin, S.D. Comfort, P.J. Shea, T.A Kokjohn, R.A. Drijber // Can. J. Microbiol.- 1997.- V.43.- № 5.- P.447-455.

123. Marvinsikkema F. Degradation of nitroaromatic compounds by micro-organismis / F. Marvinsikkema, J. Debont // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1994.-V.42.- №4.-P.499-507.

124. McCann J. Detection of carcinogens as mutagens in Salmonella microsome test: assay of 300 chemicals / J. McCann, E. Choi, E. Yamasaki, B. Ames. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1975.- V.72.- №5.- P.5135-5139.

125. McCormick M.G. Microbiol transformation of 2,4,6-trinitrotoluene and other nitroaromatic compounds / M.G. McCormick, F.E. Feeherri, H.S. Levinson // Appl. Environ. Microbiol.- 1976.- V.31.- № 6.- P.949-953.

126. Murphy S.E. Biotransformation of the fungicide pentachloronitroben-zene by Tetranymena thermophila / S.E. Murphy, A. Drotar, R. Fall // Chemos-phere.- 1982.- V.ll.- №1.- P.33-39.

127. Nakamura H. Genetic determination of resistans to acriflavine,phenethy alcohol and sodium dodecyl sulphate in Escherichia coli /Н. Nakamura // J. Bacterid.- 1968.- V.96.- P.987-996.

128. Preuss A. Anaerobic transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)/ A. Preuss, J. Fimpel, G. Diekert // Arch. Microbiol.- 1993.-V.159.- № 4.- P.345-353.

129. Renner G. Nguyen Phuc-trung Mechanisms of the reductive denization ф of pentachloronitrobenzene (PCNB) and the reductive dechlorinathion of hexachloro benzene. // Xenobiotica.- 1984,- V.14.- №9.- P.705-710.

130. Rickert D. Metabolism of nitroaromatic compound / D. Rickert // Drug Metabol. Rev.- 1987.- V.18.- №l.-P.23-53.

131. Robidoux PY. Acute toxicity of 2,4,6-trinitrotoluene in earthworm (Eisenia andrei) / PY. Robidoux, J. Hawari, S. Thiboutot, G. Ampleman, G.I. Suщ nahara // Ecotoxicol. Environ. Saf.- 1999.- V.44.- №3.- P.311-321.

132. Rosenkranz H. Mutagenicity of metronidazole: activation by mammalian liver microsomes / H. Rosenkranz, W. Speck // Biochem. Biophys. Res. Com-mun.- 1975.- V.66.- №4,- P.520-525.

133. Rosenkranz H. Activation of nitrofurantoin to a mutagen by rat liver nitroreductase / H. Rosenkranz, W. Speck // Biochem. Pharmacol.- 1976.- V.25.6,- P.l555-1556.

134. Rosenkranz E. Evidence for the existence of distinct nitroreductases in Salmonella typhimurium: roles in mutagenesis / E. Rosenkranz, E. McCoy, E.R. Mermelstein, H. Rosenkranz // Carcinogenesis.- 1982.- Y.3.- № 1.- P. 121-123.

135. Sabbioni G. Determination of hemoglobin adducts in workers exposed to 2,4, 6-trinitrotoluene / G. Sabbioni, J. Wei, Y.Y. Liu // J. Chromatogr. B. Bio-med. Appl.- 1996.- V.682.- №2.- P.243-248.

136. Scheibner K. Screening for fungi intensively mineralizing 2,4,6-trinitrotoluene / K. Scheibner, M. Hofrichter, A. Herre, J. Michels, W. Fritsche //

137. Appl Microbiol Biotechnol.- 1997,- V.47.- №4,- P.452-457.

138. Schiff W. Detergent over sensitive strains of Escherichia coli suitable for biological containment / W. Schiff, L. Klingmuller // FEMS Microbiol. Lett.-1981.- V.12.- P.269-272.

139. Schoffield K. Aromatic nitration / K. Schoffield // Cambridge: Cambridge University Press.- 1980.- 376 p.щ 148. Simini M. Evaluation of soil toxicity at Joliet army ammunition plant /

140. M. Simini, R. Wenstel, R. Checkai, C. Phillips // Environm. toxicology and chemistry.- 1995.- V.14.- №4,- P.623-630.

141. Simmon V. In vitro assays for recombinogenic activity of chemical carcinogens and related compounds with Saccharomyces cerevisiae D3 // Journ. Natl. Cancer Inst.- 1979.- V.62.- №5.- P.901-907.

142. Sleytr U.B. / U.B. Sleytr, P. Messner // J. Bacterid.- 1988.- V.170.-2891p.

143. Smock L. The toxic effects of trinitrotoluene (TNT) and its primary degradation products on two species of algae and the fathead minnow / L. Smock, D. Stoneburnes, J. Clark // Water Res. 1976. - V. 10.- № 4. - P. 537-543.

144. Spain J.C. Biotransformation of nitroaromatic compounds (review) / ц J.C. Spain // Annu.Rev. Microbiol.- 1995.- V.49.- №4.- P.523-555.

145. Spanggord R.J. Mutagenecity of tetranitroazoxytoluenes: a preliminary f| screening in Salmonella typhimurium strains ТА 100 and ТА 100 NR / R.J.

146. Spanggord, K.R. Stewart, E.S. Riccio // Mutation Research Environ. Mutagenesis and Related Subjects.- 1995.- V.335.- №3.- P.207-211.

147. Stanier R.Y. The main outlines of bactreial classification / R.Y. Stanier, C.B. Niel // J. Bacterid.- 1941.- V.42.- P.437-466,

148. Swisher R.D. Surfactant biodegradation. 2 nd ed. rev. end expand / R.D. Swisher // New York, Basel: M. Dekker.- 1987.- 1085 p.

149. Sunahara G.I. Ecotoxicological characterization of energetic substances using a soil extraction procedure / G.I. Sunahara, S. Dodard, M. Sarrazin, L.

150. Paquet, J. Hawari, C.W. Greer, G. Ampleman, S. Thiboutot, A.Y. Renoux // Ecotoxicol. Environ. Saf.- 1999.- V.43.- №2.- P. 138-148.

151. Tan E.L. Mutagenicity of trinitrotoluene and its metabolites formed during composting / E.L. Tan, C.H. Ho, W. H. Griest, R.L. Tyndall // J. Toxicol. Environ. Health.- 1992.- V.36.- №3,- P.165-175.

152. Tokiwa H. Muatgenic assay of aromatic nitrocompounds with Salmo-y nella typhimurium / H. Tokiwa, R. Nakagawa, Y. Ohnishi // Mut. Research.1981.- V.91.- № 3,- P.321-327.

153. Vorbeck C. Identification of a hydride-Meisenheimer complex as a metabolite of 2,4,6 trinitrotoluene by a Mycobacterium strain / C. Vorbeck, H. Lenke, P. Fischer, H.J. Knackmuss // J. Bacterid.- 1994.- V.176.- №3.- P.932-934.

154. Vorbeck C. Initial reductive reactions in aerobic microbial metabolism ^ of 2,4,6-trinitrotoluene / C. Vorbeck, H. Lenke, P. Fisher, J. Spain, H.-J. Knackmuss // Appl. Environ. Microbiol.- 1998.- V.64.- №.1.- P.246-252.

155. Wentz C.A. / C.A. Wentz // New York: McGraw-Hill, Inc.- 1989.120p.

156. Won W.D. Metabolic disposition of 2,4,6 trinitrotoluene/ W.D. Won, R.G. Heckley, D.J. Glover // Appl. Microbiol.- 1974.- V.27.- №3.- P.513-516.

157. Won W.D. Toxicity and mutagenicity 2, 4, 6 trinitrotoluene and its microbial metabolites / W.D.Won, L.H. Disalvo, J. Ng // Appl.Environ.Microbiol.-1976,- V.31.- №4.-P.576-580.

158. Zaripov S.A. Models of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) initial conversion by yeasts / S.A. Zaripov, A.V. Naumov, J.F.Abdrakhmanova , A.V. Garusov, R.P. Naumova // FEMS Microbiology Letters.- 2002,- V.217.- P.213-217.

159. Zitting A. Acute toxic effects of trinitrotoluene on rat brain, liver and kidney: role of radical production/ A. Zitting, G. Szumanska, J. Nickels, H. Savolainen // Arch. Toxicol.- 1982.- V.51.- № 1.- P.53-64.

Информация о работе

Дениварова, Наталья Александровна
кандидата биологических наук
Казань, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Особенности токсического действия 2,4,6-тринитротолуола на штаммы Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы