Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Начальные этапы микробного метаболизма 2,4,6-тринитротолуола

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зарипов, Сергей Александрович

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 2,4,6-Тринитротолуол

1.1 2,4,6-Тринитротолуол в биосфере

1.2 Превращение 2,4,6-тринитротолуола в биологических 11 системах

1.2.1. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола у животных

1.2.2. Микробный метаболизм 2,4,6-тринитротолуола

1.2.2.1 Трансформация ТНТ путем восстановления 19 ароматического кольца

1.2.2.2 Трансформация ТНТмикромицетами

2. Токсические и мутагенные свойства 2,4,6-тринитротолуола

2.1 Токсичность 2,4,6-тринитротолуола

2.2 Генотоксичность тринитротолуола 30 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

1. Микроорганизмы и условия культивирования

2. НП-ПЦР Фингерпринтинг геномов и выделение тотальной ДНК

3. Чувствительность штаммов к ТНТ

4. Изучение трансформации ТНТ микроорганизмами

4.1 Трансформация ТНТ растущими культурами

4.2 Трансформация ТНТ клеточными суспензиями

5. Определение острой токсцчности

6. Химические анализы

7. Химический синтез стандартов 2АДНТ, 4АДНТ и ГАДНТ

8. Статистическая обработка результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выделение и идентификация микроорганизмов деструкторов 40 ТНТ

2. Трансформация ТНТ микроорганизмами ~ представителями 46 различных физиолого-таксономических групп

2.1 Трансформация ТНТ клеточными суспензиями

2.2 Трансформация ТНТ в ростовых условиях

3. Трансформация ТНТ дрожжами как модель сочетания 59 альтернативных механизмов атаки ксенобиотика

3.1 Трансформация ТНТ клеточными суспензиями дрожжей

3.2 Возможность использования ТНТ дрожжами в качестве 67 единственного источника азота

4. Токсикологические аспекты микробной трансформации 2,4,6- 69 тринитротолуола

Обсуждение результатов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Начальные этапы микробного метаболизма 2,4,6-тринитротолуола"

Актуальность проблемы. Охрана окружающей среды и природных ресурсов от загрязнения веществами антропогенного происхождения, способными аккумулироваться в живых организмах и вызывать нежелательные изменения обменных процессов, является актуальной проблемой современности.

Среди синтетических веществ, загрязняющих биосферу, большую категорию представляют ароматические нитросоединения, к которым относится 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ). В результате деятельности промышленных объектов по производству и утилизации взрывчатых веществ, а также при непосредственном использовании последних происходит загрязнение окружающей среды соединениями данной группы. Загрязнение объектов окружающей среды ТНТ привлекает к себе все большее внимание общественности, ученых и специалистов, поскольку в последние годы стала известна чрезвычайная устойчивость этого вещества и его метаболитов в окружающей среде и в живых организмах. Большое количество ТНТ было произведено во время Второй Мировой войны, однако большая часть этого загрязнителя почвы сохранилась до настоящего времени. Даже по истечении 50 лет после загрязнения почвы ТНТ обнаруживался в ней в значительных концентрациях, вплоть до 9600 мг/кг (George et al, 2000). Столь медленная скорость биологической трансформации и биодеградации ТНТ может свидетельствовать об ингибировании ксенобиотиком метаболической активности микроорганизмов. Несмотря на то, что известен широкий круг микроорганизмов способен в той или иной мере трансформировать ТНТ (Gorontzy et al., 1994; Spain, 1995; Lewis et al., 1997; Hawari, 2000), но даже в оптимальных условиях это вещество лишь на доли процента, или в лучшем случае на несколько процентов вовлекается в процессы биологического разложения, тогда как основная часть в виде вторичных продуктов циркулирует и аккумулируется в природных сферах и биоте.

Благодаря наличию трех заместителей в виде нитрогрупп, ТНТ обладает высокой электрофильностью. Поэтому основным путём биотрансформации этого ксенобиотика является его восстановительное превращение. Согласно данным многих авторов, большинство аэробных бактерий осуществляют восстановление ТНТ с образованием моноаминопроизводных (McCormick et al., 1976; Naumova et al., 1979; Spanggord et al., 1981; Duque et al., 1993; Crawford, 1995; Rieger , Knackmuss, 1995; Fuller, Maning, 1997; Hawari et al., 1998; Vorbeck et al., 1998; Kalafut et al., 1998). Наиболее полное восстановление ТНТ до 2,4,6-триаминотолуола зафиксировано лишь у строго анаэробных микроорганизмов (Preuss et al., 1992; Funk et al., 1993; Lewis et al., 1997; Khan et al., 1997; Hawari et al., 1998). Несмотря на то, что целым рядом исследователей была показана принципиальная возможность частичной минерализации данного соединения (Funk et al., 1993, Michels, Gotshalk, 1994), крайне низкий уровень этой минерализации свидетельствует о существовании метаболических барьеров на ключевых этапах превращений. Поэтому актуальной остается проблема ограниченного ферментативного воздействия большинства микроорганизмов на данный ксенобиотик и факторов, контролирующих эти процессы и препятствующих минерализации ТНТ и его вовлечению в циклы углерода и азота. В связи с этим важное значение имеет прогнозирование поведения этого соединения в природных сферах и в живых организмах. Для объективной оценки механизмов, ограничивающих его трансформацию, необходимо изучить начальные этапы превращения ТНТ широким кругом микроорганизмов, поскольку именно эти этапы могут быть ответственны за торможение дальнейших превращений данного соединения и его токсические эффекты.

Ограниченная трансформация ТНТ привлекает внимание и в связи с тем, что образование первичных интермедиатов трансформации нитроарилов может быть основой их метаболической активации, ответственной за токсические и генотоксические эффекты исходных соединений (Neumann et al., 1995, Spanggord et al., 1995). В этой связи актуальны исследования, направленные на выявление «узких мест», лимитирующих метаболизм ТНТ, который может служить моделью поведения токсичных и мутагенных полинитроароматических соединений.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - выявить наиболее характерные для прокариот и низших эукариот механизмы начального воздействия на ТНТ. Были поставлены следующие задачи:

• выделить из различных местообитаний, и прежде всего из антропогенных экологических ниш, микроорганизмы с разной степенью устойчивости к ТНТ;

• провести сравнительную оценку чувствительности к ТНТ и активности трансформации данного вещества у микроорганизмов, относящихся к различным физиолого-таксономическим группам;

• охарактеризовать особенности начальных этапов трансформации ТНТ широким кругом прокариот и низших эукариот;

• оценить характер и степень токсического действия ТНТ и его метаболитов на живые организмы.

Научная новизна. В настоящей работе создана коллекция микроорганизмов, принадлежащих к различным физиолого-таксономическим группам, устойчивых к высоким концентрациям 2,4,6-тринитротолуола и активно его трансформирующих. Получены данные в пользу гипотезы о разной чувствительности грамположительных и грамотрицательных бактерий к токсическому действию ТНТ. Продемонстрировано селекционирующее действие ТНТ на структуру микробного сообщества в направлении доминирования грамотрицательных бактерий. Вопреки общепринятой концепции метаболизма ТНТ у самых разных представителей биоты - от бактерий до человека базирующейся на моноаминопроизводных как основных продуктах превращений, наши результаты убедительно свидетельствуют о наиболее общем механизме ограниченной начальной трансформации ТНТ, сопряженном с аккумуляцией гидроксиламинодинитро-толуолов.

На примере дрожжей продемонстрирована модель реализации альтернативных путей начальной трансформации ТНТ - частичного восстановления или нитрогруппы, или ароматического кольца, или комбинации обоих указанных механизмов.

Выявлено стимулирующее влияние аэрации на продукцию гидридного комплекса ТНТ (Н-ТНТ), и стационарных условий на аккумуляцию ГАДНТ.

Путем экспресс тестирования острой токсичности выявлены принципиальные различия путей альтернативной восстановительной атаки ТНТ с позиций его детоксикации.

Практическая значимость. Полученные данные о трансформации ТНТ широким кругом микроорганизмов могут быть использованы при создании эффективных технологий биоремедиации ТНТ-загрязенных объектов. В этой связи актуальны данные о превращении ТНТ большинством микроорганизмов в экологически опасные метаболиты - гидроксиламино-производные, обладающие токсическими и генотоксическими свойствами. Поскольку часть изученных в нашей работе микроорганизмов выделена из объектов, имеющих непосредственный контакт с человеком (продукты питания, воздух, почва) вполне реальна опасность проникновения этих токсичных и мутагенных инетермедиатов нитровосстановлния ТНТ в человеческий организм.

Штамм Candida sp AN-L13 сочетающий способность к утилизации ТНТ в качестве источника азота с возможностью утилизировать сырую нефть и ряд индивидуальных алифатических и ароматических углеводородов, а так же микроорганизмы с аналогичными метаболическими возможностями заслуживают особого внимания с позиций биоремедиации территорий, загрязненных и взрывчатыми веществами, и нефтепродуктами.

Токсикологическое тестирование альтернативных путей трансформации ТНТ свидетельствует о важной роли пути через восстановление ароматического ядра ТНТ, который позволяет избежать резкого повышения острой токсичности уже на первом этапе трансформации ксенобиотика, что привлекательно с точки зрения создания катаболического потенциала для эффективной биодеградации ТНТ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Зарипов, Сергей Александрович

выводы

1. Установлено, что начальные этапы трансформации ТНТ большинством микроорганизмов сопряжены с образованием продуктов неполного нитровосстановления - гидроксиламинодинитротолуолов (ГАДНТ).

2. Концентрации аминодинитротолуолов (АДНТ) несоизмеримо меньше первоначального накопления ГАДНТ. В сочетании с обнаружением у ряда микроорганизмов интермедиатов частичного восстановления второй нитрогруппы - дигидроксиаминонитротолуолов это позволяет предполагать, что АДНТ не находится на главном пути аэробной трансформации ТНТ.

3. На примере дрожжей продемонстрирована модель реализации альтернативных механизмов начальной атаки ТНТ - частичного восстановления или одной из нитрогрупп, или ароматического кольца молекулы, ведущего к образованию гидридного комплекса ТНТ (Н-ТНТ).

4. Трансформация ТНТ в ГАДНТ сопровождается резким (10-кратным) возрастанием острой летальной токсичности на Paramecium caudatum, в то время как альтернативная конверсия ТНТ - Н-ТНТ сопряжена со снижением летального эффекта по сравнению с исходным ксенобиотиком.

5. Выделенный из замазученных торфяников штамм Candida sp. AN-LJ3 не имеет аналогов среди известных микроорганизмов по способности к детоксикации ТНТ благодаря его почти стехио метрическому превращению в Н-ТНТ и частичному использованию в качестве единственного источника азота.

Заключение

Таким образом, на основе скрининга широкого круга микроорганизмов (43 штаммов), выделенных из антропогенных и природных экологических ниш, а также коллекционных штаммов, можно с уверенностью утверждать, что начальные этапы трансформации ТНТ большинством микроорганизмов сопряжены с образованием изомерных гидроксиламинодинитротоуолов количество которых в ряде случаев сопоставимо с исходным ТНТ. Неполное нитровосстановление ТНТ, не сопряженное с дальнейшим (сопоставимым по масштабам и темпам) преобразованием интермедиатов по традиционной схеме нитроредукции, очевидно, отражает существование метаболического барьера у микроорганизмов. Ограниченность воздействия суспензий клеток микроорганизмов, вероятно, можно объяснить блокирующим действием ГАДНТ на некоторые физиологические функции клеток, и в первую очередь систему регенерации восстановленных кофакторов, необходимых для восстановления ТНТ, тем более что ранее применительно к молочнокислым бактериям было показано, что ГАДНТ может практически полностью ингибировать активность ключевых оксидоредуктаз лактобацилл (Наумов с соавт., 1999).

Поскольку часть изученных в нашей работе микроорганизмов выделена из объектов, имеющих непосредственный контакт с человеком (продукты питания, воздух, почва) вполне реальна опасность проникновения этих токсичных и мутагенных инетермедиатов нитровосстановлния ТНТ в организм животных и человека

Проведенные исследования показали, что альтернативная восстановительная атака ТНТ, заключающаяся в востановлении его ароматического ядра, нехарактерна для большинства прокариот. В то же время на примере представителей микроэукариот - дрожжей продемонстрирована модель трансформации ТНТ, которая отражает зависимость судьбы ксенобиотика от особенностей метаболического потенциала ферментирующих и дышащих дрожжей: если первые (сахаромицеты) трансформируют ТНТ по пути восстановления нитрогрупп, то вторые (представители рода Candida) либо восстанавливают ароматическое кольцо с образованием гидридного комплекса Мейзенхеймера, либо сочетают оба механизма начальной атаки. Аэробные условия стимулировали продукцию Н-ТНТ, тогда как ограниченная аэрация способствовала накоплению ГАДНТ. Кроме того, выявлена закономерная связь между способностью штамма использовать ТНТ в качестве источника азота и уровнем продукции этого метаболита, что позволяет предполагать важную роль гидридного комплекса в утилизации азота ТНТ микроорганизмами.

Токсикологическое тестирование, проведенное в соответствии с предложенной схемой альтернативной атаки ТНТ (рис. 19), свидетельствует о важной роли пути через восстановление ароматического ядра, который позволяет избежать резкого повышения острой токсичности уже на первом этапе трансформации ксенобиотика. Эти результаты подтверждают прогноз (Lenke et al., 2000) о привлекательной роли пути, ведущего к Н-ТНТ, с точки зрения создания катаболического потенциала для эффективной биодеградации ТНТ.

Штамм Candida sp. AN-ЫЗ, изолированный в числе доминирующих микроорганизмов из нефтезагрязненных торфяников (Лангепас, Западная Сибирь), способен утилизировать сырую нефть и ряд индивидуальных алифатических и ароматических углеводородов. С учетом этого данный штамм, а также другие микроорганизмы с аналогичными метаболическими возможностями заслуживают особого внимания с позиций биоремедиации территорий, загрязненных и взрывчатыми веществами, и нефтепродуктами.

Дальнейшие исследования в данном направлении продолжаются с целью выяснения причин и условий, определяющих реализацию того или иного механизма начальной атаки ТНТ, что может послужить основой для создания эффективных технологий биоремедиации нефтезагрязенных объектов окружающей среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зарипов, Сергей Александрович, Казань

1. Амерханова Н. Н., Наумова Р. П. Микроорганизмы разрушающие 2,4,6-тринитротолуол. // Сборн. аспир. работ. Сер.Биол. Изд-во Казанск. у нив.-та., 1975. -С.144-146.

2. Амерханова Н. Н., Наумова Р. П. Сравнительное исследование острой токсичности а-тринитротолуола и продуктов его биодеградации для гидробионтов. // Биологические науки. 1979.- № 2.- С. 26-31

3. Аргументы и Факты-Москва, N36, 1996

4. Бакаева Е. Н. Обоснование использования одноклеточных в биотестировании. // Инфузории в биотестировании. Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. Санк-Петербург: Архив ветеринарных наук, 1998. - с.26.

5. Грибова И.А., Габулгалимова Р.А., Дымова Е.Г., Попова Г.Б. Изменение крови при воздействии низких концентраций тринитротолуола (клинико-экспериментальные исследования) // Гигиена труда и проф. заболеваний. 1983.- №9. - С.24

6. Грушко Я. М. Вредные неорганические соединения в промышленных сточных водах. Л.:Химия, - 1979. - 160 с.

7. Дымова В.Г. Гигиеническое значение загрязнений кожных покровов химическими веществами, проникающими через кожу и методы их оценки. // В кн. Гигиена труда в хим. и хим. фармацевт, пром.-ти -М.: Мир, -1956. - С.16-25.

8. Карамова Н.С., Ильинская О.Н., Иванченко О.Б. Мутагенная активность 2,4,6 тринитротолуола: роль метаболизирующих ферментов. // Генетика микроорганизмов - 1994. - т.30., №7. - С.898-902.

9. Карамова Н.С., Мынина И.И., Гараева Г.Г, Иванченко О.Б, Ильинская О.Н. 2,4,6-триниротолуол и 2,4-диамино-6-нитротолуол: отсутствие гесА-зависимого мутагенеза. // Генетика. 1995. - т. 31. - с. 617-621.

10. Квасников Е.И., ГЦелокова И.Ф. Дрожжи. Биология. Пути использования. Киев: Наукова Думка - 1991. - 156 с.

11. П.Лазарев Н. В. Вредные вещества в промышленности. Л.: Химия, -1976. - С.252-489.

12. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, - 1990. - 352с.

13. Марченко Е. Н., Дымова Е. Г., Осина С. Н., Попова Г. Б., Грибова И. А., Пронькова Е. Н., Харламова С. Ф. Гигиена труда и состояние здоровья работающих в производстве тринитротолуола. // Гигиена труда и проф. заболеваний. 1975.- № 10.- С.1-6.

14. Методы общей бактериологии Под.ред. Ф.Герхардта. М.: Мир. -1984. 254с.

15. Наумов А. В., Суворова Е. С., Воронин А. М., Зарипова С. К., Наумова Р. П. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола лактобациллами с образованием токсичных гидроксиламинопроизводных. // Микробиология. 1999. - т. 68. - №1. - С.65-71.

16. П.Наумова Р. П., Белоусова Т. О., Гилязова Р. М. Превращение 2,4,6-тринитротолуола под действием микроорганизмов. // Прикл. биохим. и микробиол. 1982а -т.18, №1. - С.85-90.

17. Наумова Р. П., Селивановская С. Ю., Черепнева И. Е. Превращение 2,4,6-тринитротолуола в условиях кислородного и нитратногодыхания Pseudomonas fluorescens. //Прикладн. биохим. микроб.- 1988а. т.24, №. 4. -с. 493-498.

18. Наумова Р. П., Амерханова Н. Н., Белоусова Т. О. Бактериальная восстановительная трансформация ароматических нитросоединений. //Микробиол. 1982 б.- т.15, №5. - С.735-739.

19. Наумова Р. П., Амерханова Н. Н., Шайхутдинов В. А. Изучение первого этапа превращения тринитротолуола под действием Pseudomonas denitrificans. // Прикл. биохим. микробиол.- 1979.- т.15, №1.- С.45-50.

20. Наумова Р.П., Офицеров Е. Н., Белоусова Т.О., Селивановская С.Ю., Хисамутдинова JI. Ф. Пути биотрансформации 2,4,6-тринитротолуола. //Изв. АН СССР. Сер.Биол. 1986. - №2,-С.448-455.

21. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоула, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.: Мир, - 1997. - 432с.

22. Плохинский H.A. Биометрия. М.: Изд-во МГУ, - 1970. - 366с.

23. Роговская И.И. Влияние ТНТ на микроорганизмы и биохимические процессы самоочищения воды. //Микробиология.-1961 т.20, №3.-С.265-272.

24. Селивановская С. Ю., Ахметова Д. 3., Наумова Р. П. Заключительные этапы подготовительного обмена 2,4,6-тринитротолула у Pseudomonas fluorescens. II Микробиол. 1986. - т.55, №.6. - С.1040-1041.

25. Соболева А.П. О состоянии миокарда при хронической тринитротолуоловой интоксикации. // Гигиена труда и проф.заболеваний. 1960. - №11. - С.47-49.

26. Шахова Н.В. Катаракты при интоксикации некоторых нитросоединений и их морфологические особенности. //Тез. докл. конф. молодых научных работников. Инст. гигиены труда и проф. заболеваний. АМН СССР. М., - 1956. - С.25-27.

27. Ahlborg G.Jr., Bergstrom B., Hogstedt C., Einisto P., Sorsa M. Urinary screening for potentially genotoxic exposures in a chemical industry. // Br. J. Ind. Med. 1985. v.42, n. 4. - p.691-699.

28. Bader M., Goen T., Muller J., Angerer J. Analysis of nitroaromatic compounds in urine by gas chromatography mas spectrometry for the biological monitoring of explosives. // J Chromatogr B Biomed Sci Appl. -1998.-v.710, n.1-2. - P.91-99.

29. Berhe-Corti L., Jacobi H., Kleihauer S., Witte I. Cytotoxicity and mutagenicity of a 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) and hexogen contaminated soil in S. typhimurium and mamalian cells. // Chemosphere. 1995. - v.37, n.2. -P.209-218.

30. Boopathy R., Kulpa C. F. Trinitrotoluene (TNT) as a sole nitrogen sourse for a sulfate reducing bacterium, Desulfovibrio sp. (B strain) isolated from an anaerobic digester. // Curr. Microbiol. -1992. - v.25. - P.235-241.

31. Boopathy R., Kulpa C.F., Wilson M. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by Desulfovibrio sp. (B-strain). // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1993. v.39, n.2-p.270-275.

32. Bryant C., DeLuca M. Purification and characterization of an oxygen-insensetive NAD(P)H nitroreductase from Enterobacter cloacae. II J.Biol. Chem. -1991.-v.266, n.7 -P.4119-4125.

33. Bueding E., Jollife N. Metabolism of trinitrotoluene in vitro. //J. Pharmacol. Exp. Therap. 1946. - v.88. - P.300-312.

34. Chandra A.M.S., Quails C.W., Reddy G., Meinkoth J.H. Hematological effects of 1,3,5-trinitrobenzene (TNB) in rats in vivo and in vitro. 11 J. Toxicol, and Environ. Health. 1995. - v.46. -p. 57-72.

35. Channon H. G., Mills G. T., Williams R. T. The metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT).//Biochem. J. 1944. - v.38, n.l - P.70-85.

36. Consolo M.C., Monika A., Howard P.C. Mutagenicity of the phenolic microcomal metabolites of 3-nitrofluorantrene and 1-nitropyrene in strains of Salmonella typhimurium. II Mutat. Res. 1989. - v.210. -p. 263-269.

37. Cunningham M.L., Burka L.T., Matthews H.B. Metabolism, disposition, and mutagenicity of 2,6-diaminotoluene, a mutagenic noncancerogen. // Drug Metab. and Disposit.: Biol. Fate Chem. 1989.- v.17., n.6. -P.612-617.

38. Dilley J.V., Tyson C.A., Spanggord R.G., Sasmore D.A., Newell G.W., Dacre J.C. Short-term oral toxicity of 2,4,6-trinitrotoluene in mice, rats and dogs. // J. of Toxicol, and Environ. Health. 1982. - v.9, n.4 - P. 565-585.

39. Dixit R., Schut H. A.J., Klauning J. E., Stoner G.D. Metabolism and DNA binding of 2,6-dinitrotoluene in Fisher 344 rats and A/J mice. -1986. -v.82., n.l.- P. 53-61.

40. Djerassi L. Hemolytic crisis in G6PD-deficient individuals in the occupational setting. // Int Arch Occup Environ Health. 1998. - v.71. -P.26-28.

41. Dodard S.G., Renoux A.Y., Hawari J., Ampelman G., Thiboutot S., Sunahara G.I. Ecotoxicity characterization of dinitrotoluenes and some of their reduced metabolites // Chemosphere. 1999. - v.38.- n.9. - p.2071-2079.

42. Duque E., Haidour A., Godoy F., Ramos H. Contstraction of a Pseudomonas hydrid strain that mineralized 2,4,6-trinitrotoluen. // J. Bacteriol. 1993. -v.175. - P.2278-83.

43. Ellis E., Kuver J., Lindahl P.A., Mills G. T. Biological toxicity of nitroaromatic xenobiotixs // Xenobiotica. 1980. -v. 10, n 5 - p. 312-316.

44. Facchiani V., Griffiths L.A. The metabolic fate of nitroamide in rat. 1.Metabolism and excrection. // Xenobiotica. 1980a. - v. 10, n.4 - 289p.

45. Facchiani V., Griffiths L.A. Metabolism of nitroamide in rat. 2.Sites of nitroreduction. //Xenobiotica 1980. - v. 10, n.4 - 299p.

46. French P.D., Nicklin S., Bruce N.C. Aerobic degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Enterobacter cloacae PB2 and by pentaerythritol tetrenitrate reductase. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. № 8. P. 2864-2868.

47. Fu P.P., Heflich R.H., vonTungeln L.S., Yang D.T.C., Fifer E.K., Beland F.A. Effect of nitro group conformation on the rat liver microsomal metabolism and bacterial mutagenicity of 2- and 9-nitroantracene. // Carcinogenesis. 1986. - v.7. -p.ll.

48. Fuller M.E., Manning J.F. Aerobic Gram-positive and Gram-negative bacteria exhibit differential sensitivity to and transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) // Curr. Microbiol. 1997. - V.35. p.77-83.

49. Fuller M.E., Manning J.F. Evidence for differential effects of 2,4,6-trinitrotoluene and other munitions compounds on specific subpopulation of soil microbial communities // Environ. Tox. Chem. 1998. - V 17. p. 21852195.

50. Funk S., Roberts D., Crawford D., Crawford R. Initial-phase optimization for bioremediation of munition compound contaminated soils. //Appl. Environ. Microbiol., - 1993. - v.59., n.7 - P.2171-2177.

51. Gancedo C., Serrano R. Energy yielding metabolism. // The yeasts. - 2nd ed. / Ed. Rose A.H., Harrison J.S. - London etc.: Acad. Press. - 1989. - V.3. -P. 206-259.

52. George S.E., Huggins-Clark G., Brooks L.R. Use of a Salmonellamicrosuspension bioassay to detect the mutagenicity of munitions100compounds at low concentrations // Mutat. Res., 2001. - V.490, nl. - p.45-56.

53. Gorontzy T., Kuver J., Blotevogel K.-H. Microbial transformation of nitroaromatic compounds under anaerobic conditions. // J. Gen. Microbiol. -1993.-v.139.-P. 1331-1336.

54. Hatcher J.F., Yamamoto K., Ishikawa M., Brian G.T., Swaminathan S. Metabolic reduction of novel 3,4-dichloro-5-nitrofuranes in Salmonella typhimurium. // Environ. Molec. Mutagenesis. 1995. - v. 25. -p. 58-66.

55. Hawari J, Halasz A, Beaudet S, Paquet L, Ampleman G, Thiboutot S. Biotransformation of 2,4,6-trinitrotoluene with Phanerochaete chrysosporium in agitated cultures at pH 4.5. // Appl Environ Microbiol. -1999. v.65, n.7. - p.2977-86.

56. Hawari J., Beaudet S., Halasz A., Thiboutot S., Ampleman G. Microbial degradation of explosives: biotransformation versus mineralization. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - v.61. - p. 605-618.

57. Heflich R.H., Unruh L.E., Thornton-Manning J.R., von Tungeln L.S., Fu P.P. Mutagenicity of l-,3- and 6-nitrosobenzoa.pyrene in Salmonella typhimurium and Chinese hamster ovary cells. // Mutat. Res. 1989. - v.225. -p. 157-163.

58. Heijman C.G., Grieder E., Holliger C., Schwazenbach R.P. Reduction ofnitroaromatic compounds coupled to microbial iron reduction in laboratory101aquifer columns. // Environ. Science & Technol. 1995. - v.29., n.3. - P.775-783.

59. Honeycutt M.E.; Jarvis A.S.; McFarland V.A. Cytotoxicity and mutagenicity of 2,4,6-trinitrotoluene and its metabolites. // Ecotoxicol. Environ. Safety. -1996.-v. 35.-p. 282-287.

60. Huang S., Lindahl P.A., Wang C., Bennett G.N., Rudolph F.B., Hughes J.B. 2,4,6-trinitrotoluene reduction by carbon monoxide dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. -v. 66, n. 4.-p. 1474-1478.

61. Kalafut T, Wales ME, Rastogi VK, Naumova RP, Zaripova SK, Wild JR Biotransformation patterns of 2,4,6-trinitrotoluene by aerobic bacteria // Curr Microbiol. 1998. -v.36. - p.45-54.

62. Kim H.-Y., Song H.-G. Comparison of 2,4,6-trinitrotoluene degradation by seven strains of white rot fungi. // Current Microbiol. 2000. - v.41. n. 5. -p. 0317-0320.

63. Klausmeier R.E., Osmon J.L., Walls D.R. Effect of trinitrotoluene on microorganisms. // Dev. Ind. Microbiol. 1974. - v. 15 - P. 309-317.

64. Klehr H, Eyer P, Schafer W. On the mechanism of reactions of nitrosoarenes with thiols. Formation of a common intermediate "semimercaptal". // Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 1985. -v. 366, n. 8. - p. 755-60

65. Lee H., Cherng S.H., Liu T.Y. Bacterial mutagenicity, metabolism, and DNA adduct formation by binary mixtures of benzoa.pyrene and 1-nitropyrene. // Environ. Molecular. Mutagenesis. 1994. - v.24, n.3. - P. 229-234.

66. Lenke H., Achtnich C., Knackmuss H.-J. Perspectives of bioelimination of polynitroaromatic compounds. // Biodégradation of nitroaromatic compounds and explosives. / Spain J., Hughes J., Knackmuss H.-J.(Eds). 2000. London: CRC Press. P.91-126.

67. Lenke H., Knackmuss H. -J. Initial hydrogénation during catabolism of picric acid by Rhodococcus erythropolis HL 24-2. // Appl. Environm. Microbiol. -1992.- V. 58, n. 9.- P. 2933-2937.

68. Levine B.S., Rust J.H., Barkley J.J., Furedi E.M., Lish P.M. Six month oral toxicity study of trinitrotoluene in beagle dogs. // Toxicology. 1990. - v.63. -p.233-244.

69. Lewis T.A.; Ederer M.M.; Crawford R.L.; Crawford D.L. Microbial transformation of 2,4,6-trinitrotoluene. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. -1997.-v.18.-p. 89-96.

70. Liebmann H. Handbuch der Frish Wasserand Abswasser Riologie Bd. 2 Munich. Oldenburg, 1960. - P.87-91.

71. Liu H. X., Qin W. U., Wang G. R., Yang Y. X., Chang Y. X., Yiang Q. S. Some altered concenrations of elements in semen of workers exposed to trinitrotoluene. // Occupt. and Environ. Medicin. 1995. - v.52, n.12 -P.842-845.

72. Lodder J. The Yeasts. A taxonomic study. Amsterdam. -1970.

73. McCann J., Choi E., Yamasaki E., Ames B. Detection of carcinogens in Salmonella / microsome test: assay of 300 chemicals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1975. -V.72. -P.5135-5139.

74. McCormick M. G., Feeherry F. E., Levinson H. S. Microbiol transformation of 2,4,6-trinitrotoluene and other nitroaromatic compounds. // Appl. and Environm. Microbiol. -1976.- V. 31, n. 6.- P.949-958.

75. Michels J., Gottschalk G. Pathway of 2,4,6-trinitrotoluene degradation by Phanerochaete chrysosporium. II In Biodégradation of nitroaromatic compounds. 1995. - New York, Plenum.

76. Mori M., Matsuhashi T., Miyahara T., Shibata S., Izima S., Kozuka H. Reduction of 2,4-dinitrotoluene by Wistar rat liver microsomal and cytosol fractions. // Toxic. Appl. Pharmacol. -1984. v.76 -P. 105-112.

77. Neumann H.G., Albrecht O., Vandorp C., Zwirnerbaier I. Macromolecular adducts caused by environmental chemicals. // Clin. Chem. 1995. -v. 41: part 2, suppl. S, - p. 1835-1840.

78. Neumann, HG. Toxic equivalence factors, problems and limitations. // Food Chem. Toxicol. 1996.-v.34. -p. 1045-1051.

79. Nielsen A. T., Henry R.A., Norris W.P., Atkins R.A., Noore D.W., Coon C.L., Spanggord R.J., Son D.W.H. Synthetic routs to aminodinitrotoluenes. // J. Org. Chem. 1979. -v.14. -p.2499-2504.

80. Norambuena E., Videla L.A., Lissi E.A. Interaction of nitrobenzoates with haemoglobin in red blood cells and a haemolysate. // Human Experim. Toxicol. 1994.-v. 13.-p. 345-351.

81. Pak J.W., Knoke K.L., Noguera D.R., Fox B.G., Chambliss G.H. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene by purified xenobiotic reductase B from Pseudomonas fluorescens I-C // Appl. Environ. Microb. 2000. V. 66. n. 11. P. 4742-4750.

82. Parrish F. W. Fungal transformation of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. // Appl. Environ. Microbiol. -1977.- V. 34, n. 2.- p. 232-233.

83. Preuss A., Fimpel J., Dieckert Y. Anaerobic transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). // Arch. Microbiol. 1992. - v. 159. - P.345-353.

84. Rafii F., Selby A.L., Newton R.K., Cerniglia C.E. Reduction and mutagenic activation of nitroaromatic compounds by a Mycobacterium sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - v.60, n.12. - P. 4263-4267.

85. Reddy T.V., Olson G.R., Wiechman B., Reddy G., Robinson M., Torsella J.A., Daniel F.B. Fourteen-day toxicity study of 1,3,5-trinitrobenzene in Fischer 344 rats. // J. Appl. Toxicol. 1996. -v. 16. -p. 289-295.

86. Reichenbach H. Myxobacteria: A most peculiar group of social prokaryotes. 1984. (ijht. no cejihbahobckaa C.K)., 1986.)

87. Rickert D.E., Butterworth B.E., Popp J.A. Dinitrotoluene: acute toxicity, oncogenecity, genotoxicity and metabolism. //CRC Crit. Rev. in Toxicol. -1984. v.13, n.3. - P.217-234.

88. Rieble S., Joshi D. K., Gold M. H. Aromatic nitroreductase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1994 -v.205, n.l -P.298-304.

89. Roberts D.J., Crawford R.L. Microbial transformation of 2,4,6-trinitrotoluene. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1991. -v. 18. -p. 89-96.

90. Rodgers JD, Bunce NJ. Treatment methods for the remediation of nitroaromatic explosives. // Water Res. 2001. - v. 35. -n.9. -p.2101-11.

91. Rogosa M., Mitchell J.A., Wiesman R.F. A selective medium for isolation and enumeration of oral and fecal lactobacilli. // J.Bacteriol. 1951. -v.62. -p. 132-133.

92. Ross RH, Hartley WR. Comparison of water quality criteria and health advisories for 2,4,6-trinitrotoluene. // Regul. Toxicol. Pharmacol. 1990. -v.ll, n.2. - p. 114-117.

93. Sabbioni G., O.Sepai. Comparison of hemoglobin binding, mutagenicity, and carcinogenicity of arylamines and nitroarenes. // Chimia. -1995.-v.49-p. 374-380.

94. Sabbioni G., Wei J.F., Liu Y.Y. Determination of hemoglobin adducts in workers exposed to 2,4,6-trinitrotoluene. // J. Chromatogr. B-Biomedical Appl. 1996. -v. 682: 243-248.

95. Scheibner K., Hofrichter M., Herre A., Michels J., Fritsche W. Screening for fungi intensively mineralizing 2,4,6-trinitrotoluene. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V.47, p. 452-457.

96. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fugimoto E.K., Goeke N.M., Olsen B.J., Klenk D.S. Measurement of protein using bicinchoninic acid. // Anal. Biochem. 1995. -v.150.-p. 76-85.

97. Spain J. C. Biodegradatoin of nitroaromatic compounds. //Annu. Rev. Microbiol. 1995. - v.49. - P.525-555.

98. Spain J. Biodégradation of nitroaromatic compounds and explosives London: CRC Press. 2000. - 456p.

99. Spanggord R.J., Mortelmans K.E., Griffin A.F., Simmon V.F. Mutagenicity in Salmonella typhimurium and structure activity relationships of waste water components emanating from manufacture of trinitrotoluene. //Environ. Mutagen. - 1982. - v.4. - 163p.

100. Stahl J. D., Aust S. D. Properties of a transplasma membrane redox system of Phanerochaete chrysosporium. //Arch. Biochem. Biophys.-1995. -V.320. n.2. -p.369-374.

101. Stahl J., Aust S. Metabolism & detoxification of TNT by Phanerochaete chrysosporium. //Biochem. Biophys. Res. Commun. -1993a.- v.192, n.2 -P.477-482.

102. Stahl J.D., Aust S.D. Plasma membrane dependent reduction of 2,4,6-tinitrotoluene by Phanerochaete chrysosporium. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993b -v. 192, n.2 -P.471-476.

103. Sunahara G.I., Dodard S.G., Renoux A.Y., Hawari J., Ampelman G., Thiboutot S., Ecotoxicity characterization of dinitrotoluenes and some of their reduced metabolites // Chemosphere. 1999. - v.38.- n.9. - p.2071-2079.

104. Tan E.L., Ho C.H., Griest W.H., Tyndall R.L. Mutagenicity of trinitrotoluene and its metabolites formed during composting. // J. Toxicol. Environ. Health. 1992. - v. 36. - p. 165-175.

105. Thierfelder W., Masihi KN. Effects of trinitrotoluene (TNT) metabolites on chemiluminescence response of phagocytic cells. // Int. J. Immunopharmacol. 1995. - v.17. - n.5. - P.453-456.

106. Thornton-Manning J.R., Smith B.A., Beland F.A., Heflich R.H. Mutagenes and DNA adducts formation by 1-nitropyrene in Chinese hamster ovary cells without exogenous metabolic activation. // Toxicol. Appl. Pharm. 1991. - v. 109. - p. 538-546.

107. Vanderberg L., Perry J., Unkefer P. Catabolism of 3,4,6-trinitrotoluene by Mycobacterium vaccae. II Appl. Microbiol. Biotechnol. -1995.-V.43.-p. 937-945.

108. Vorbeck C., Lenke H., Fischer P., Spain J., Rnackmuss H.-J. Initial reductive reactions in aerobic microbial metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - v.64. - n.l. - P.246-252.

109. Vorbeck C., Lenke H., Fisher P., Knackmuss H.-J. Identification of a hydride- Meisenheimer complex as a metabolite of 2,4,6-trinitrotoluene by a Mycobacterium strain. // J. Bacteriol. 1994. - v. 176, n.3. - P. 932-934.

110. Wang C.Y., Bhadra R., Hughes J.B. Rapid separation of reduction products of 2,4,6-trinitrotoluene using TLC // Biotechnology Techniques. -1997.-V. 11. -n.7.-C. 519-521.

111. Wang C.-Y., Zheng D., Hughes J. B. Stability of hydroxylamino- and aminointermediates from reduction of 2,4,6-trinitrotoluene, 2,4-dinitrotoluene, and 2,6-dinitrotoluene. // Biotechnology Letters 2000. - v 22.-p. 15-19.

112. Watanabe T., Kohan M.J., Walsh D., Ball L.M., DeMarini D.M., Lewtas J. Mutagenicity of nitrodibenzopyranones in the Salmonella plate-incorporation and microsuspension assay. // Mutat. Res. 1995. -v.345. -p. 1-9.

113. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. // Nucleic Acid Res. 1990. -v. 18. -p. 7213-7218.

114. Won W. D., Disalvo L. H., James N. G. Toxicity and mutagenecity of 2,4,6-trinitrotoluene and its microbial metabolites. // Appl. Environ. Microbiol. 1976. - v.34, n.4. - P.576-580.

115. Won W. D., Heckley R. G., Glover D. J. Metabolic disposition of 2,4,6-trinitrotoluene. // Appl. Environ. Microbiol. 1974. - v.27, n.3. -P.513-516.

116. Woollen B.H., Hall M.G., Craig R., Steel G.T. Trinitrotoluene: assesment of occupational absorption during manufacture of explosives. // British J. Industrial Medic. 1986. - v.43, 31:576-580.

117. Wyman J.F., Serve M.P., Hobson D.W., Lee L.H., Uddin D.E. Acute toxicity, distribution, and metabolism of 2,4,6-trinitrophenol (picric acid) in fischer 344 rats. // J. Toxicol, and Environ. Health, 1992. -v.37. - p. 313327.

118. Yinon J., Hwang D. G. Identification of urinary metabolites of 2,4,6-trinitrotoluene in rats by liquid chromatography-mass-spectrometry. // Toxicol. Lett. 1985. - v.26, n.2-3. - P.205-209.

119. Zbarsky, V.L., Sonis, M.A., and Orlova, E.Y., Dinitro-phenylcarboxylic Acids in the Schmidt Reaction. // Zh. Prikl. Khim. 1971, - v. 44. - p. 2578-2579.

120. Zeyer J., Kearney P. C. Microbial metabolism of 14C. nitroanilines to [14C] carbon dioxide. // J. Agric. Food Chem. 1982. - v.31, n.2. - P.304-308.