Восстановление ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола как путь его деградации

Зиганшин, Айрат Мансурович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Восстановление ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола как путь его деградации
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Восстановление ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола как путь его деградации"

На правах рукописи

ЗИГАНШИН АЙРАТ МАНСУРОВИЧ

ВОССТАНОВЛЕНИЕ АРОМАТИЧЕСКОГО КОЛЬЦА 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА КАК ПУТЬ ЕГО ДЕГРАДАЦИИ

03 00 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□31-75889

Казань-2007

003175889

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета им В И Ульянова-Ленина

Научный руководитель Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук, профессор Наумова Римма Павловна

доктор ветеринарных наук, профессор Госманов Рауис Госманович (Казанская государственная академия ветеринарной медицины им Н Э Баумана, г Казань)

доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович (Институт биологии УНЦ РАН, г Уфа)

Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН, г Казань

Защита диссертации состоится «29» ноября 2007 г в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212 081 08 при Казанском государственном университете по адресу 420008, г Казань, ул Кремлевская, д 18, главное здание, ауд 211

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им Н И Лобачевского при Казанском государственном университете

Автореферат разослан «¿к » октября 2007 ?

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук ^ / 3 И Абрамова

Актуальность проблемы. Производство и использование различных высокоустойчивых синтетических соединений приводит к загрязнению окружающей среды Среди них большую опасность представляет 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ, тротил), наиболее -часто применяемое взрывчатое вещество, синтез и использование которого приводит к загрязнению почв, воздуха, поверхностных ' я грунтовые вод ТНТ и продукты его нитровосстановдения относятся к числу токсичных, потенциально мутагенных ,и устойчивых загрязнителей, способных длительное время циркулировать в природных системах (Rieger, Knackmuss,. 1995, Spam et al, 2000) Агентство по защите окружающей среды США отнесло ТНТ к числу наиболее опасных загрязнителей биосферы, и, в связи с этим, предотвращение контаминации И ремедиация ТНТ-загрязнённых территорий признаны необходимыми в местах его производства и использования (Fiorella, Spam, 1997) ^

Обезвреживание объектов, загрязненных взрывчатыми веществами, прежде всего ТНТ, базируется на применении физических, химических и биологических методов К примеру, сжигание является одним из наиболее эффективных, радикальных методов уничтожения ТНТ в загрязненных почвах, однако этот подход относится к наиболее энергоемким Кроме tefо, его реализация сопряжена с дополнительными экологическими проблемами, в частности, с полной деградацией почвы, с выбросом в окружающую среду оксидов азота (Rodgers, Bunce, 2001)

Основные преимущества биоремедиации заключаются в ее экологичности и низкой стоимости (Rodgers, Bunce, 2001)

Известны два альтернативные пути биологической трансформации ТНТ микроорганизмами Первый из них затрагивает восстановление нитрогрупп ТНТ и ведет к генерации высокотоксичных соединении, в частности гидроксиламино-динитротолуолов (ГАДНТ) в качестве основных метаболитов (Hughes et al, 1998,'Наумов с соавт , 1999, Zaripov et al, 2002, Зарипов с соавт , 2004) В то время как данный путь биотрансформации ТНТ является почти универсальным не только для прокариот, но и для высших эукариот, альтернативный механизм обнаружен лишь у довольно узкого круга В этом случае восстановительная атака направлена не на нитрогруппы, а на ароматическое кольцо ксенобиотика, причем редукция основана -на присоединении гидрид-ионов с образованием ТНТ-гидридных комплексов (Vorbeck et al, 1998, Williams et al, 2004) Принципиальное значение имеет тот факт, что именно гидридное восстановление ТНТ может сопровождаться элиминацией нитрогрупп, что означает переключение на пути метаболизма гораздо менее устойчивых соединений, с сокращенным количеством нитрогрупп Недостатком большинства работ данного направления (Kim, Song, 2000, Jain et al, 2004, Wilhams et al, 2004) является то, что образующиеся нитриты анализировались только колориметрическим методом, основанным на реакции Грисса, что означает необходимость подтверждения полученных данных с применением более специфичных методов

Очевидно, что применение микроорганизмов, способных к гидридной редукции ТНТ и последующей деградации образовавшихся комплексов при обезвреживании ТНТ-загрязненных объектов, перспективно с точки зрения эффективности биоремедиации

ТНТ, помимо экологических аспектов его трансформации, представляет интерес как модель поведения нитроарилов в организме высших эукариот, поскольку они не только контактируют с этим веществом в условиях промышленных производств военного профиля, но и находятся под воздействием лекарств и пестицидов, молекулы которых содержат нитроароматические фрагменты

Цель данной работы - осуществить идентификацию и разностороннюю характеристику совокупности гидридных комплексов -интермедиатов восстановительной атаки 2,4,6-тринитротолуола дрожжами Оценить роль внешних физико-химических факторов с точки зрения глубины деструкции 2,4,6-тринитротолуола

Основные задачи исследования:

• выделить из природных и антропогенных источников обитания микроорганизмы, способные к гидридной атаке молекулы 2,4,6-тринитротолуола и денитрации образовавшихся гидридных комплексов,

• изучить влияние аэрации на рост изолятов, трансформирующих 2,4,6-тринитротолуол по пути редукции его ароматического кольца, и связанную с этим глубину разложения ксенобиотика,

• охарактеризовать углеродсодержащие метаболиты трансформации 2,4,6-тринитротолуола выделенными штаммами с применением нового ВЭЖХ-диодного метода в сочетании с масс-спектрометрией,

• выявить неорганические продукты денитрации 2,4,6-тринитротолуола и расширить представления о механизме отщепления нитрогрупп от исходного ксенобиотика,

• оценить возможность превращения индивидуальных гидридных комплексов 2,4,6-тринитротолуола как в абиотических условиях, так и под действием клеток дрожжей, реализующих механизм редукции токсиканта по пути присоединения гидрид-ионов к его бензольному кольцу,

• оценить возможности использования выделенных и изученных в данной работе изолятов с точки зрения биоремедиации объектов, загрязненных 2,4,6-тринитротолуолом

Научная новизна. В результате широкого с<рининга микроорганизмов в настоящей работе выделены 2 штамма дрожжей - Yarroшa кро1уиса КН-115 и Сеогпскит сапйьйит АЫ-24, которые восстанавливают ТНТ по пути присоединения гидрид-ионов к его ароматическому кольцу и одновременно отщепляют нитрогруппы от образовавшихся метаболитов На основе способности дрожжей к трансформации исходного токсиканта по данному пути впервые обнаружены восемь гидридных комплексов ТНТ, тогда как ранее в литературе сообщалось о существовании лишь пяти форм Выявлен и охарактеризован также дигидридный комплекс ТНТ, существование

которого раньше базировалось только на предположениях Все обнаруженные интермедиа™ в данной работе охарактеризованы с применением усовершенствованных аналитических методов-, что позволило представить их хроматографические, спектрофотометрические и масс-спектральные характеристики

Установлена способность дрожжей к разрушению трех ТНТ-гидридных комплексов с промежуточной аккумуляцией нитрит-ионов Впервые доказано образование нитрат-иона как результата окисления дрожжами ранее выделившегося нитрит-иона Способность к денитрации ТНТ в сочетании с окислением нитрит-иона в нитрат-ион , изучаемыми дрожжами уникальна и представляет интерес с точки зрения биоремедиации ТНТ-загрязненных объектов

Выявлено стимулирующее влияние аэрации и снижения рН, среды на деградацию ТНТ-гидридных комплексов дрожжами Y lipolytica AN-L15 и G candidum AN-Z4 - , -

Впервые осуществленная ВЭЖХ-очистка восьми гидридных форм ТНТ позволила продемонстрировать возможность их взаимного абиотического превращения Доказано непосредственное участие дрожжей в элиминации нитрогрупп из интермедиатов гидридного восстановления ТНТ,

Практическая значимость. Способность детектировать метаболиты превращения ТНТ по альтернативным путям его восстановления очень важна с позиций оценки эффективности ремедиации ТНТ-загрязненных объектов Совершенствование методов обнаружения данных интермедиатов, несомненно, способствует пониманию более глубоких механизмов трансформации исходного взоывчатого вещества Так, примененный в данной работе новый ВЭЖХ-диодный метод разделения продуктов нитроредукции ТНТ, разработанный коллегами из Университета штата Монтана (США) под руководством профессора Р Герлаха, позволил раздетить и идентифицировать углеродсодержащие метаболиты восстановления ароматического кольца, что не было достигнуто ни в одной из предшествующих работ Наша работа позволила по-новому взглянуть на механизм трансформации ТНТ низшими эукариотами, обнаружить нитрит- и нитрат-ионы, которые являются индикаторами частичной минерализации исходного токсиканта Раскрытие данного механизма в будущем должно повысить эффективность технологий по обезвреживанию ТНТ-загрязненных территорий

Дрожжи Y lipolytica AN-L15 и G candidum AN-Z4, выделенные нами из нефтезагрязненных торфяников и отходов нефтехимии, являются доминирующими микроорганизмами в этих антропогенных местообитаниях Их поистине удивительная способность выживать и доминировать в таких экстремальных условиях, в сочетании с уникальным механизмом деградации ТНТ, делает данные штаммы перспективными с точки зрения биоремедиации промышленных отходов, загрязненных взрывчатыми веществами

Связь работы с научными программами. Исследования поддержаны федеральными программами "Развитие научного потенциала высшей школы"

РНП 2 1 1 1005, РНП 2 1 1 3222 и "Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники ' ГК 02 43411 3020, ГК 02 512 11 2050, ГК ФЦКП КГУ 02 451 11 7019, Комиссией Европейских Сообществ, грант ICA2-CT-2000-10006 Авторские исследования получили персональную поддержку Магистерской/Аспирантской Программы Фулбрайта (США) (Institute of International Education Grantee ID 15061570) Положения, выносимые на защиту.

1 С применением усовершенствованных физико-химических методов идентифицированы и охарактеризованы восемь гидридных комплексов, которые являются интермедиатами трансформации 2,4,6-тринитротолуола дрожжами Y arroma lipolytica AN-L15 и Geotrichum candidum AN-Z4

2 Установлена возможность взаимного абиотического превращения индивидуальных гидридных форм 2,4,6-тринитротолуола, не сопровождающегося элиминацией нитрогрупп

3 Трансформация 2,4,6-тринитротолуола штаммами Yatrowia lipolytica AN-LIS и Geotrichum candidum AN-Z4 через образование промежуточных гидридных комплексов ведет к минерализации исходного ксенобиотика

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на школах-конференциях молодых ученых "Экотоксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии" (Пущино-Тула, 2006) и "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003, 2005, 2006), научных конференциях "Биотехнология - охране окружающей среде" (Москва, 2006) и "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), международной конференции "Issues and solutions m discovery and use of novel biomolecules biodiversity and environment" (Pushchmo, 2004)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ Благодарности. Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю д б н, профессору кафедры микробиологии КГУ Начмовой Римме Павловне за предоставление интересной темы диссертационной работы, за ценные идеи в процессе ее выполнения Благодарность выражается профессору Герлаху Робину (Center for Biofilm Engineering, Montana State University, USA) за приглашение автора в рамках Магистерской/Аспирантской Программы Фулбрайта, за предоставление экспериментального оборудования для выполнения научно-исследовательской работы, за помощь в освоении приборов и методов, в интерпретации результатов Автор признателен к б н Наумову А В за предоставление уникальных штаммов микроэукариот (Candida spp), за помощь в создании базовых позиций в изучении малоизвестного пути превращения ТНТ На первых этапах освоения ВЭЖХ-анализа большую помощь автору оказали к х н Гарусов А В (кафедра микробиологии КГУ), к б н Шурхно Р А и Абдульханов А Г (Тат НИИСХ)

Автор искренне признателен Программе Фулбрайта (США) за предоставление уникальной возможности выполнить часть экспериментальной работы в университете Соединенных Штатов и также

считает своим приятным долгом принести благодарность аспирантам и студентам НИЛ ЭББ КГУ, особенно Науменко Е А и Хиляс И В

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 22 рисунка Цитируемая литература включает 150 источников, из них 143 иностранных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Источники и условия выделения микроорганизмов. Для скрининга микроорганизмов, способных к гидридному восстановлению ароматического кольца ТНТ в сочетании с его денитрацией, использовали 428 изолятов, предварительно полученных в НИЛ ЭББ КГУ при посевах воды водоемов -рек Волги и Казанки (в 'пределах города Казани), активного ила аэротенков, очищающих сточные воды химического и нефтехимического комплексов, незагрязненных черноземных почв, нефтезагрязненных почв нефтедобывающего региона Татарстана, замазученных торфяников Западной Сибири, твердых' отходов нефтехимии, на агаризованкые среды мясо-пептонный агар для аэробных тетеротрофов и среду Сабуро для дрожжей

Предварительный скрининг чистых культур изолятов на способность трансформировать ТНТ по альтернативным путям осуществляли с использованием десятикратно разбавленных мясо-пептонного бульона и жидкой среды Сабуро, ' содержащих ТНТ в концентрации 0 22 мМ О функционировании того или иного пути свидетельствовало характерное окрашивание сред темно-красное в случае гидридного пути, ведущего к образованию ТНТ-моногидридных комплексов, и светло-зеленое в случае мононитровосстановления, сопряженного с аккумуляцией ГАДНТ Содержание нитрит- и нитрат-ионов оценивали (как указано ниже) у тех штаммов, которые продуцировали ТНТ-гидридные комплексы

Идентификация дрожжей. Родовая и видовая принадлежность дрожжей, выделенный в результате вышеуказанного скрининга, была проведена с использованием определителя Барнета (Barnett et al, 1983) Видовая принадлежность дрожжей была уточнена по результатам секвенирования D2 региона большой субъединицы рРНК в лаборатории MIDILABS (www midilabs com)

Культивирование дрожжей. Эксперименты по динамике трансформации ТНТ проводили со штаммами дрожжей Yarrowia lipolytica AN-L15, выделенным из загрязненных нефтью торфяников (Лангепас, Западная Сибирь), и Geotrichum candidum AN-Z4, выделенным из нефтешлама - отхода нефтехимического предприятия "Нижнекамск-нефтехим" (Нижнекамск, Татарстан) В отдельных опытах использовали Candida spp AN-L7, AN-L13 AN-L14, AN-L20 - изоляты, выделенные в прежней работе (Zaripov et al, 2002) из нефтезагрязненных торфяников Западной Сибири

Дрожжи поддерживали в аэробных условиях на агаризованной среде Сабуро, содержащей (г/л дистиллированной воды) глюкозу - 10 0, пептон -10 0, дрожжевой экстракт -5 0, NaCl - 0 25, агар - 20 0 Для изучения трансформации ТНТ использовали синтетическую среду, содержащую (мМ) глюкозу - 28, (NH4)2S04 - 7 6, MgS04 - 2 Фосфатный буфер (рН 6 0-7 0) стерилизовали отдельно и вносили перед инокуляцией в конечной концентрации 16 мМ ТНТ вносили из расчета 440 мкМ в растворе этанола (0 8 мл 95 6% этанола в 50 мл среды) В отсутствие ТНТ (контроль) в состав синтетической среды также входил этанол в том же количестве

При изучении динамики превращения ТНТ дрожжи предварительно культивировали в жидкой среде Сабуро с соответствующим рН (AN-L15 в течение одних, AN-Z4 - двух суток), клетки осаждали центрифугированием при 8000g в течение 5 мин и дважды отмывали фосфатным буфером (с соответствующим рН) с последующей инокуляцией синтетических сред с тем же рН в конических колбах на 250 мл при объеме среды 50 мл Культивировали в аэробных условиях во встряхиваемых колбах (150 об/мин), в статических (без встряхивания) и строго анаэробных условиях (в анаэробном боксе) при 30"С Исходная оптическая плотность клеток после инокуляции дрожжей соответствовала Ада 0 2

Световая микроскопия. При микроскопировании клеток дрожжей применяли микроскоп Nikon Eclipse Е-800, оснащенный охлажденной CCD флюоресцентной камерой и програмным обеспечением MetaVue (Universal Imaging Corporation)

Определение способности дрожжей к гетеротрофной нитрификации. Способность выделенных штаммов микроэукариот окислять ионы аммония с образованием нитроанионов была исследована на среде, содержащей (мМ) глюкозу - 28, (NH4)2S04 - 7 6, MgS04 - 2, Na2HP04 - 1 94, KH2P04 - 14 06 (рН 6 0) Способность дрожжей к окислению нитрит-иона была испытана на аналогичной среде с дополнительно внесенным NaN02 в количестве 0 24 мМ Дрожжи инокулировали до конечной A60u 1 0 и культивировали аэробно во встряхиваемых колбах (150 об/мин) при 30°С

Спектрофотометрия. Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer, USA) Клеточную массу оценивали, измеряя оптическую плотность при 600 нм Контролем служила освобожденная от клеток культуральная жидкость

Высокоэффективная жидкостная хроматография. ТНТ и метаболиты альтернативных путей его восстановления анализировали на хроматографе Agilent 1100 Series HPLC, оснащенном автоматическим пробоотборником, инжектором, коллектором фракций, диодным детектором, предколонкой Supelcosil LC-8 и колонкой Supelcosil octyl С-8 (150х 4 6 мм, 5мкМ) УФ-видимые спектры каждого пика были получены при их сканировании в диапазоне 190-700 нм, детекция при 254, 476 нм Разделение интермедиатов проводили при 36°С и 50°С после фильтрации проб через 0 2 мкМ фильтры (Spartan 13/0 2 RC, Whatman) и их введения в хроматограф в

количестве 10 мкл Метод, применявшийся в данной работе, был разработан коллегами из Университета штата Монтана (США) (Borch, Gerlach, 2004)

Хроматография при 36°С позволяла хорошо разделить 2-гидроксиламино-4,6-динитротолуол (2-ГАДНТ) и 4-гидроксиламино-2,6-динитротолуол (4-ГАДНТ), однако сопровождалась коэлюцией 4-амино-2,6-динитротолуола (4-АДНТ) и 2,4-динитротолуола (2,4-ДНТ) Повышение температуры от 36°С до 50°С приводило к четкому разделению 4-АДНТ и 2,4-ДНТ, но вело к частичной коэлюции 4-ГАДНТ и ТНТ В связи с этим пробы анализировали при двух указанных температурах

Масс-спектрометрия. Масс-спектрометрический анализ методом негативной химической ионизации при атмосферном давлении (НХИ-МС) ТНТ и его интермедиатов проводили на Ion Tiap Mass Spectrometer 6300 Series Agilent SL НХИ-МС анализ метаболитов осуществляли после получения их отдельных фракций с последующим ,введением в масс-спектрометр Параметры масс-спектро.метрии газовый поток азота варьировали в диапазоне 1-7 л/мин, температура сухого газа и испарителя 350°С, поток короны 30000 нА, капиллярное напряжение 1800 В

Хромато-масс-спектрометрия. Для дополнительной идентификации 2,4-ДНТ использовали хромато-масс-спектрометрию на приборе 6890N Network GC System, оснащенном массовым детектором 5973 Network, автоматическим пробоотборником 7683 Series, инжектором 7683В Series (Agilent Technologies), колонкой 30 м х 0 25 мм с толщиной пленки 0 25 мкм (Elite-5MS) Подвижная фаза - гелий, скорость потока 37 см/сек Температуры инжектора и детектора 240°С и 250°С, соответственно Температуру повышали от 120°С до 240°С со скоростью 6°С/мин

Пробы анализировали после полной экстракции этиловым эфиром неполярных компонентов из 10 мл культуральной жидкости Полученный экстракт выпаривали в вакууме, сухой остаток перерастворяли в 0 1 мл ацетона, доводили гексаном до 1 мл и вводили в прибор в количестве 1 мкл

Ионная хроматография. Нитрит- и нитрат-ионы анализировали с помощью ионного хроматографа Dionex (USA), оснащенного градиентным насосом GP40, детектором проводимости CD20, автоматическим пробоотборником AS40, предколонкой IonPac8 AG9-HC (4 х 50 мм) и разделительной колонкой IonPac8, AS9-HC (4 х 250 мм) Элюцию проводили 9 мМ раствором Ыа2СОз со скоростью 1 0 мл/мин В качестве стандартов для построения калибровочных графиков использовали NaN02 и NaNO^

Органические кислоты, экскретируемые дрожжами, анализировали ионной хроматографией с использованием разделительной колонки IonPac" ASI 1 (4mm, 10-32, P/N 44076) Элюцию проводили в градиентном режиме со скоростью 1 мл/мин системой растворителей бидистиллированная вода, 1 мМ NaOH и 100 мМ NaOH В первые 2 мин хроматографии мобильная фаза состояла из 90% бидистилированной воды и 10% 1 мМ NaOH В следующие 3 мин количество 1 мМ NaOH повышали до 100%, а в последующие 10 мин снижали содержание 1 мм NaOH до 65% и увеличивали количество 100 мМ

NaOH до 35% В течение следующей 1 мин градиент возвращали к первоначальному уровню и оставляли неизменным еще 6 мин

Статистическая обработка результатов. В работе использовали стандартный пакет программ "Microsoft Office Excel 2003" Представление результатов в графиках среднее арифметическое и стандартное отклонение

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Выделение микроорганизмов, способных к гидридной атаке ТНТ

Выявление микроорганизмов, способных к возможно более глубокой деградации ТНТ, представляет интерес с фундаментальных позиций, а также в качестве научной основы соответствующих природоохранных технологий В связи с этим, скрининг на способность трансформировать данный токсикант по пути его гидридного восстановления и разложения сформировавшихся комплексов позволил ранжировать широкий круг микроорганизмов с точки зрения встречаемости этой биохимической активности

Подавляющее большинство (426 из 428) изолятов, независимо от их происхождения, атаковали ТНТ только по пути нитровосстановления, и лишь два штамма дрожжей (идентифицированные как Yarrowia hpolytica AN-L15 и Geotrichum candidum AN-Z4) проявили в качестве доминирующего механизма альтернативную биохимическую активность, хотя и менее выраженную по сравнению с таковой Candida sp AN-L13 в плане гидридного восстановления ТНТ (Zanpov et al, 2002)

Для сравнительного анализа продукции нитрит- и нитрат-ионов на синтетической среде с ТНТ были привлечены все дрожжи, восстанавливающие ТНТ по ароматическому кольцу, включая 4 изолята, выде!енные ранее из торфяников (Zanpov et al, 2002) Candida spp AN-L7, AN-L 13, AN-L 14, AN-L20 При этом наибольшая аккумуляция нитрит- и нитрат-ионов, освобожденных из молекулы ТНТ, выявлена у штаммов AN-L15 и AN-Z4, что и предопределило их выбор в качестве моделей для последующих экспериментов

2. Трансформация ТНТ штаммами дрожжей У lipolytica AN-L1S и G candidum AN-Z4

Эффективность технологий ремедиации ТНТ-загрязненных территорий зависит от методологической основы детекиии продуктов биологической и абиотической трансформации ТНТ в природных системах Недавние попытки наших партнеров из Университета штата Монтана (США) под руководством профессора Р Герлаха привели к разработке усовершенствованного ВЭЖХ-диодного метода разделения и идентификации интермедиатов конверсии нитрогрулп ТНТ (Borch, Gerlach, 2004) В частности, варьируя температуру хроматографического разделения и композиции элюентов, авторы усовершенствовали режим разделения изомерных 2-ГАДНТ и 4-ГАДНТ. тогда как в работах других исследователей в попытках разделения данных метаболитов не была преодолена их

коэлюция (Michels, Gottschalk, 1994, Vorbeck et al, 1998, Наумов с соавт, 1999, Hawari et al, 1999)

Основная часть нашей работы выполнена в рамках сотрудничества кафедры микробиологии КГУ и Центра инженерии биопленок Университета штата Монтана (США) Основываясь на применении нового метода ВЭЖХ-разделения нитроароматических соединений в сочетании с химическим ионизационным масс-спектрометрическим анализом более детально изучен механизм, затрагивающий редукцию ароматического кольца ТНТ на примере дрожжевых штаммов Y lipolytica AN-L15 и G candidum AN-Z4

Доминирующий путь превращения ТНТ изучаемыми дрожжами основан на присоединении гидрид-ионов к бензольному кольцу Нам впервые удалось показать, что гидридное восстановление ксенобиотика сопряжено с образованием восьми различных ТНТ-моно- и дигидридных комплексов, четкое ВЭЖХ-разделение которых представлено на рис 1 (на примере штамма AN-L15) В ранее опубликованных работах обнаружены лишь пять гидридных форм ТНТ (Vorbeck et al, 1998, Pak et al, 2000, Wilhams et al, 2004)

Все восемь метаболитов, обнаруженных и изученных в нашей работе, отнесены к ТНТ-гидридным комплексам на основе УФ-видимых спектров, молекулярных масс и на основе их способности к взаимной трансформации, в том числе в абиотических условиях (в отсутствие дрожжевых клеток) Их времена удерживания в условиях ВЭЖХ, УФ-видимые максимумы и молекулярные массы приведены в табл 1

Анализ фрагментов, образовавшихся при химической ионизации органических интермедиатов ионной структуры (ТНТ-гидридные комплексы), позволил дифференцировать их следующим образом, в зависимости от m/z главных ионов с m/z 227 (С-1 моногидридный комплекс (1-НГ-ТНТ, соединение 8), С-3 моногидридный комплекс (3-НГ-ТНТ, соединение 7), два изомера З-НГ-ТНТ (соединения 1 и 5), потеря протона во время НХИ-МС), с m/z 228 (С-3,С-5 дигидридный комплекс (3,5-2Н~-ТНТ, соединение 4), потеря протона во время НХИ-МС) и с m/z 230 (три протонированных изомера С-3,С-5 дигидридного комплекса (изомеры 3,5-2Н~- ТНТН*, соединения 2, 3, 6))

Если существование 3-НГ-ТНТ и трех комплексов с молекулярной массой 230 было известно ранее (Vorbeck et al, 1998, Pak et al, 2000, Wilhams et al, 2004), то соединения 1 и 5, по-видимому, являются изомерами 3-Н~-ТНТ, которые не были обнаружены ранее Их спектральные и хроматографические характеристики впервые представлены в данной работе Нами также впервые был идентифицирован и охарактеризован 1-ТГ-ТНТ (табл 1)

В связи с тем, что и ТНТ, и его моногидридные комплексы образуют главный ион с m/z 227 во время масс-спектрометрического анализа, главное отличие масс-спектра ТНТ от масс-спектров гидридных комплексов - это отсутствие ионов с m/z 181-183 Сходные результаты были получены и в другой работе (Ymon et al, 1995), авторы которой проанализировали ТНТ и

Рис. 1. Разделение метаболитов, образуемых дрожжами У. Иро1уЧса АЫ-1Л5 при трансформации ТНТ. ВЭЖХ-хроматограммы получены при 36°С (А) и 50°С (Б), детекция при 254 и 476 нм. Численные обозначения на пиках соответствуют соединениям, представленным в табл. 1. Амино-динитротолуолк (АДНТ) и гидроксиламино-мононитротолуолы (ГАМНТ) не представлены на хроматограмме. так как они никогда не наблюдались совместно со всеми ТНТ-гидридными комплексами.

Таблица 1

Метаболиты, обнаруженные на разных этапах при варьировании условий трансформации ТНТ штаммами Y lipolytica AN-LIS и G candidum AN-Z4_

№ Соединение НХИ-МС" ВЭЖХ 36°С, мин5 ВЭЖХ -50°С, мин5 Спектро-фотометрия"

1 Изомер 3-Н~-ТНТ 227 48 46 261,445

2 3,5-2Н~-ТНТН+ 230 52 4 8 266, 426

3 3,5-2Н"-ТНТ Н+ 230 5 3 49 263,478

4 3 5-2Н~-ТНТ 228 5 7 5 3 325,512

5 Изомер 3-Н -ТНТ 227 59 5 4 262,465

б 3;5-2Н -ТНТН+ 230 67 60 263,491

7 3-Н -ТНТ 227 99 8 1 256,480, 550

8 1-Н"-ТНТ 227 12 3 98 251,478, 551

9 2-ГАДНТ 212 14 8 124 228,265, 356

10 ТНТ 227 154 137 230

11 4-ГАДНТ 212 160 134 232,350

12 2,4-ДНТ 181 177 15 4 250

13 2-АДНТ 196 170 144 232, 274, 385

14 4-АДНТ 196 17 6 14 9 235, 372

15-16 ГАМНТ 167 10 9/11 1 - -

° Гтавные ионы, обнаруженные во время масс-спектрометрического анализа ° Времена удерживания в условиях ВЭЖХ при двух температурах разделения " УФ-видимые максимумы поглощения..

3-Н~-ТНТ (соединение 7) методом НХИ-МС

Применение усовершенствованного метода разделения нитроароматических соединений позволило нам впервые идентифицировать 3,5-2Н~-ТНТ В то время как ранее существование данного метаболита базировалось лишь на предположениях (Vorbeck et al, 1998), нами было достигнуто его отделение от трех изомеров 3,5-2Н~-ТНТН~, что позволило впервые получить его истинные масс-, УФ-видимый спектры

Трансформация ТНТ штаммами Y lipolytica AN-L15 и G candidum AN-Z4 вела не только к синтезу восьми гидридных комплексов ТНТ, но и к редукции нитрогрупп с образованием 2-ГАДНТ, 4-ГАДНТ, 2-амино-4,6-динитротолуола (2-АДНТ) и 4-амино-2,6-динитротолуола (4-АДНТ) (табл 1 ) Времена удерживания, масс- и УФ-видимые спектры биологически образовавшихся ГАДНТ и АДНТ при конверсии ТНТ полностью соответствовали таковым, полученным при анализе химических стандартов

Начальный этап трансформации ТНТ, независимо от условий эксперимента (аэрации и исходного рН среды), сопровождался как аккумуляцией темно-красных ТНТ-моногидридных комплексов, так и продуктов мононитроредукции исходного токсиканта Внесение клеток штамма AN-L15 до конечной Абоо 0 2 в среду (рН 6 0), содержащую ТНТ (440

мкМ), на начальном этапе вело к доминирующему накоплению 3-Н -ТНТ и к минорным метаболитам -1-Н"-ТНТ, 2-ГАДНТ и 4-ГАДНТ (рис 2)

После 10 ч роста штамма Y hpolytica AN-L15 происходило частичное превращение 3-Н~-ТНТ в ряд других ТНТ-гидридных комплексов, однако на данном этапе эксперимента их концентрация оставалась незначительной (рис 2А) На данном этапе начиналась и аккумуляция нитритов, что было надежно подтверждено ионной хроматографией (рис 2Б)

Второй этап культивирования дрожжей, наряду с увеличением концентрации ГАДНТ, сопровождался убылью 3-Н~-ТНТ и одновременным масштабным синтезом еще 6 ТНТ-моногидридных и дигидридных комплексов К тому же, стадия убыли 3-НГ-ТНТ сопровождалась и аккумуляцией 2,4-ДНТ (58 мкМ) и нитрат-иона (рис 2) Время удерживания 2,4-ДНТ в условиях ВЭЖХ представлено в табл 1, оно идентично таковому коммерческого препарата, УФ спектры и масс-спектры обоих соединений также были сходными (табл 1) Образование 2,4-ДНТ было подтверждено также хромато-масс-спектрометрией, время его удерживания в условиях газовой хроматографии 7 5 мин

Продукция 2,4-ДНТ дрожжами начиналась исключительно на стадии убьпи 3-Н~-ТНТ и продолжалась вплоть до его полного исчезновения Параллельно ионная хроматография выявила аккумуляцию нитрат-иона, тогда как концентрация нитрит-иона, увеличиваясь очень медленно, оставалась на низком уровне Образование нитрат-иона продолжалось и после полного исчезновения из среды 3-Н~-ТНТ, то есть на стадии постепенной убыли изомеров З^-гГГ-ТНТНГ, что свидетельствует о существовании и другого механизма отщепления нитрогрупл от молекулы ТНТ (рис 2) В контрольном варианте, в отсутствие ТНТ, появления N0?" и "NOi" не обнаружены, что свидетельствует в пользу непосредственного участия ТНТ в их образовании

Дальнейшее культивирование Y hpolytica AN-L15 вело к снижению концентрации динитротолуола и появлению еще двух дополнительных пиков в условиях ВЭЖХ с временами удерживания 10 9 и 111 мин (анализ образцов при 36°С) (табл 1) НХИ-МС обоих метаболитов выявила образование доминирующего иона с m/z 167, что позволило отнести их к продуктам мононитроредукции 2,4-ДНТ - 2-гидроксиламино-4-мононитротолуолу (2-ГАМНТ) и 4-гидроксиламино-2-мононитротолуолу (4-ГАМНТ) Данные метаболиты выделялись в среду и при замене ТНТ на 2,4-ДНТ, что говорит о непосредственном участии 2,4-ДНТ в их образовании В свою очередь, такие возможные продукты разложения 2,4-ДНТ как мононитротолуолы или их производные отсутствовали среди метаболитов

Интересно, что на стадии превращения 3-Н~-ТНТ в изомеры 3,5-2Н -ТНТН* и 2,4-ДНТ, трансформация оставшегося ТНТ шла преимущественно по пути нитроредукции с образованием 2-ГАДНТ и 4-ГАДНТ, при этом концентрация 4-ГАДНТ превышала количество его изомера примерно в 2 раза (рис 2) Концентрация же ГАДНТ, образовавшихся на стадии убыли 3-Н~-ТНТ, была несколько выше остаточного ТНТ как источника ГАДНТ, что

позволяет предполагать возможное части 3-1Г-ТНТ обратно в ТНТ с продукты мононитроредукции.

Время, ч

Рис. 2. Образование метаболитов при трансформации ТНТ штаммом Y. lipolytica AN-L15 в аэробных условиях роста (рН 6.0; принудительна аэрация). Символы: (А) ■, ТНТ; д, 3-ЬГ-ТНТ (мкМ); о, 1-Н~-ТНТ; сумма

соединений 1, 2, 3, 4, 5 и 6, выраженная как площадь их ВЭЖХ-пиков. (Б) 2-ГАДНТ; о, 4-ГАДНТ; О, нитрит-ион; нитрат-ион; 2,4-ДНТ; л, ГАМНТ. (В) Изменение рН среды во время роста Y. lipolytica AN-L15. Символы: рост и динамика рН в отсутствие ТНТ; рост и д, динамика рН в присутствии ТНТ.

абиотическое превращение некоторой его уже последующей конверсией в

Время, ч

1501 Б

120 -

Время, ч

Рис. 3. Образование метаболитов в ходе трансформации ТНТ штаммом У. lipolytica AN-L15 в статических условиях роста (рН 6.0; без встряхивания). Символы: (А) в, ТНТ; д, 3-Н"-ТНТ (мкМ); о, 1-КГ-ТНТ; •, сумма соединений 1, 2, 3, 4, 5 и 6, выраженная как площадь их ВЭЖХ-пиков. (Б) », 2-ГАДНТ; о, 4-ГАДНТ; О, нитрит-ион; нитрат-иок; п, 2,4-ДНТ; д, 4-АДНТ. (В) Изменение рН среды во время роста У. lipolytica AN-L15. Символы: ■, рост и А. динамика рН в отсутствие ТНТ; о, рост и Д, динамика рН в присутствии ТНТ.

В связи с известным фактом продуцирования многими дрожжами органических кислот (Anastassiadis et al, 2002), необходимо было оценить динамику рН ростовой среды во время роста Y lipolytica AN-L15

Инокуляция среды до А60о 0 2 в отсутствие ТНТ вела к быстрой инициации роста, тогда как присутствие ТНТ ингибировало начальный рост изучаемого штамма (рис 2В), когда рост активизировался исключительно на стадии масштабного превращения 3-Н~-ТНТ в ТНТ-гидридные формы и 2,4-ДНТ Конечная же биомасса в данных условиях через 60 ч достигала примерно одного уровня с вариантом в отсутствие ТНТ

Измерение рН показало резкое подкисление среды в процессе роста Y lipolytica AN-L15, причем присутствие ТНТ ингибировало также и синтез органических кислот Следует отметить, что продукция 2,4-ДНТ и образование N03" начинались только после снижения рН среды с 6 0 до 4 2 (рис 2Б, В) Анализ образцов ионной хроматографией показал наличие в них цитрата, сукцината и пирувата, выделение которых обусловило резкое подкисление среды в присутствии дрожжей

Первоначальный этап превращения ТНТ в ростовой среде (рН 7 0) штаммом Y lipolytica AN-LI5 был сходен с таковым в условиях исходного рН 6 0 в тот же период времени Убыль 3-НГ-ТНТ (285 мкМ) также сопровождалась снижением рН среды (до 5 5) и появлением в среде 2,4-ДНТ и аккумуляцией нитрита Количество же динитросоединения составило лишь 12 мкМ при концентрации нитрит-иона на уровне 84 мкМ Дальнейший рост клеток вел к резкому падению рН среды до 3 7 и одновременному превращению NO2" в нестехиометрическое количество NO3", максимальное количество которого составило 68 мкМ

На стадии превращения нитрит-иона обнаружен 4-АДНТ (6 мкМ) время удерживания которого в условиях ВЭЖХ, данные спектрофотометрии и НХИ-МС представлены в табл 1 и соответствовали таковым химического стандарта Максимальные зафиксированные концентрации 2-ГАДНТ и 4-ГАДНТ составили 51 и 76 мкМ, соответственно

Рост дрожжей также активизировался только на стадии снижения концентрации 3-НГ-ТНТ, конечная же биомасса достигала уровня, отмеченного в отсутствие ТНТ, однако с замедлением на 36 ч

Сопоставление результатов, полученных при разных значениях рН среды роста, свидетельствует о том, что сдвиг рН всего лишь на единицу существенно влияет на темпы преобразования ТНТ-гидридных комплексов Очень важно, что смещение рН в нейтральную область ведет к снижению темпов частичной минерализации

Рис 3 иллюстрирует динамику трансформации ТНТ, появления метаболитов и изменение рН среды во время роста Y lipolytica AN-L15 при начальном рН 6 0 в статических условиях Отсутствие активной аэрации несколько замедляло трансформацию ксенобиотика в 3-НГ-ТНТ, а последнего в гидридные формы и 2,4-ДНТ Однако общие тенденции конверсии ТНТ данным штаммом в этих условиях были сходны с рассмотренными выше На стадии уменьшения количества 3-ЬГ-ТНТ (точнее, при снижении рН среды с

5 7 до 3 7) также наблюдалась продукция небольшого количества 2,4-ДНТ (до 13 мкМ) Нитрит-ион появился уже на начальных этапах трансформации ТНТ Интересно отметить, что снижение рН среды ниже 4 2, как и в условиях активной аэрации, сопровождалось окислением выделившихся нитритов, хотя темпы и масштабы продукции нитрат-иона несоизмеримо меньше

Рост Y hpolytica AN-L15 в присутствии ТНТ активизировался, также как и в выше рассмотренных случаях, на стадии убыли З-НГ-ТНТ Однако сниженная аэрация среды сильно отразилась на способности изучаемого штамма расти как в отсутствие, так и в присутствии ТНТ Так, конечный урожай клеточной массы в обоих случаях достиг примерно одного уровня, но был ниже таковых, полученных в аэробных условиях (рН 6 0) (рис 2В, ЗВ)

Смещение рН среды в область 7 0 привело к аналогичным динамикам убыли ТНТ и в дальнейшем сформировавшегося доминирующего 3-ЕГ-ТНТ (263 мкМ) во время роста Y hpolytica AN-L15 с таковыми, описанными выше для начального рН среды 6 0 в статических условиях.

Данные условия, наряду с продукцией 2-ГАДНТ (47 мкМ), 4-ГАДНТ (56 мкМ) и 4-АДНТ (15 мкМ), привели к появлению в среде небольшого количества 2-АДНТ (8 мкМ) (результаты ВЭЖХ-диодного анализа и масс-спектрометрии представлены в табл 1 )

Однако в этих условиях такой продукт отщепления от молекулы 3-Н~-ТНТ как 2,4-ДНТ обнаружен не был, отсутствовал также и нитрат-ион Отсутствие последних двух метаболитов можно объяснить слабым подкислением среды (с рН 7 0 до 4 8 в течение 96 ч эксперимента) в статических условиях, что, по-видимому, и является главным условием образования 2,4-ДНТ и окисления N02 в N03" Максимальная концентрация нитрит-иона была зафиксирована на уровне 95 мкМ

Ростовые кривые, полученные в данных условиях, были сходными с описанными выше при исходном рН 6 0 в статических условиях

Сходные результаты получены и для штамма G candidum AN-Z4 за исключением увеличения количества продуктов нитроредукции в статических условиях

Предполагаемые пути трансформации ТНТ штаммами дрожжей Y hpolytica AN-L15 и G candidum AN-Z4 приведены на рис 4

Трансформация молекулы ТНТ по пути редукции нитрогрупп штаммом AN-L15 являлась менее масштабной, так как общее количество продуктов восстановления нитрогрупп никогда не превышало 30% от суммы всех образовавшихся метаболитов В случае штамма AN-Z4 гидридный путь также являлся доминирующим, но количество интермедиатов нитроредукции увеличивалось в статических условиях (с 33% до 45%) Концентрации же 4-ГАДНТ и 4-АДНТ превышали количества их изомеров (2-ГАДНТ и 2-АДНТ), что сходно с результатами других исследователей о преимущественной ориентации биологического восстановления нитрогрупп ТНТ, направленного на М02-группу в пара положении (Hawan et al, 1998, Esteve-Nunez et al ,2001, Borch et al, 2005)

рН <4 2 NOj -»-NO.

-Биологическая трансформация

--^ Абиотическая трансформация

: ■ ' Биологическая и/или абиотическая трансформация

Изомер 3,5 2Н ТНТН- #2 m/z230

рН < 4 2 NO.-»-h

Рис 4 Предполагаемые пути трансформации ТНТ штаммами дрожжей Y hpolytica AN-L15 и G, candidum AN-Z4 и возможная абиотическая конверсия сформировавшихся ТНТ-гидридных комплексов

Восстановление ароматического кольца ТНТ изученными штаммами дрожжей, помимо образования метаболитов органической природы, вело и к аккумуляции неорганических соединений азота, что согласуется с позицией ряда исследователей (Kim, Song, 20006, Jain et al, 2004, Williams et al, 2004), считающих данный путь "продуктивным" путем трансформации ТНТ В связи с тем, что выявление нитритов и их количественное определение имеет исключительное значение для оценки эффективности механизма и глубины деструкции ТНТ, критику Ворбек с соавторами (Vorbeck et al, 1998) в адрес работ с использованием колориметрического метода, дающего ложноположительную реакцию на нитриты в сложных средах, в частности, в присутствии 3-Н~-ТНТ, следует адресовать и к результатам работ данных авторов

Так как штаммы Y lipolytica AN-L15 и G candidum AN-Z4 относятся к дышащим дрожжам, неспособным сбраживать сахара, их рост, кислотообразование и трансформация ТНТ в большой мере зависели от аэрации среды Так, слабая аэрация (статические условия) вела к торможению роста, низкому выходу клеточной массы, слабому подкислению среды и замедленной трансформации ТНТ.

Заслуживает внимания то, что рост дрожжей в ТНТ-содержащей среде начинался только на стадии формирования дигидридных комплексов ТНТ. Это может быть результатом токсичности ТНТ, его моногидридных форм или соединений, образующихся во время их продукции и деградации.

3. Превращение нитрит-иона в присутствии и в отсутствие дрожжевых клеток

В нашей работе впервые показана способность микроэукариот Y. lipolytica AN-L15 и G. candidum AN-Z4 к окислению нитрит-иона с образованием нитрат-иона (рис. 5). Этот механизм функционировал как при окислении N02", выделявшегося в среду роста в результате разрушения ТНТ-гидридных комплексов, так и при превращении экзогенного нитрита, вносимого к растущей культуре дрожжей. рН-зависимость данного процесса указывает на существование фермента, катализирующего данный процесс (этот механизм инициировался при снижении рН среды ниже 4.2).

В литературе имеются сведения о способности некоторых дрожжей и грибов к гетеротрофной нитрификации (Kuenen, Robertson, 1994; Falih, Wainwright, 1995). Гетеротрофные нитрификаторы окисляют широкий ряд восстановленных азотсодержащих соединений, однако неспособность получать энергию из этих реакций требует присутствия органических источников редуцирующих эквивалентов. Субстратами для нитрификации грибами в большинстве случаев являются ионы аммония и алифатические азотсодержащие соединения. Имеются сообщения и о вовлечении нитрита в гетеротрофную нитрификацию у грибов. К примеру, Aspergillus wentii был способен окислять нитрит-ион в нитрат-ион (Kuenen, Robertson, 1994).

Рис. 5. Окисление нитрит-иона штаммами Y. lipolytica AN-L15 (А) и G. candidum AN-Z4 (Б) в отсутствие ТНТ. Символы: в, нитрит-ион; нитрат-ион; д, изменение рН.

До нашего исследования в литературе не была известна способность дрожжей Yarrowia lipolytica и Geotrichum candidum окислять нитрит-ион с образованием нитрат-иона. Ввиду того, что нитрит-ион токсичен для дрожжей в связи с образованием азотистой кислоты при низких значениях рН среды (Бабьева, Голубев, 1979), не исключено функционирование

механизма защиты клеток от этого метаболита, результатом чего является его постепенное превращение в нитрат-ион.

Наши исследования показали также возможность абиотического превращения нитрит-иона, проявлявшуюся исключительно при значениях рН ниже 4.5. Неустойчивость азотистой кислоты в водных растворах с образованием нитрат-иона и окиси азота - известный науке факт (Беляев, 2003):

ЗНМО,

НЫОз + 2ЫС)| + Н20

В нашем случае количество образовавшегося нитрат-иона в отсутствие клеток дрожжей было гораздо ниже такового, образующегося в их присутствии, что может свидетельствовать об участии биологического фактора в реализации данного механизма.

4. Трансформация ВЭЖХ-очищенных ТНТ-гидридных комплексов

В нашей работе впервые изучена зависимость стабильности ВЭЖХ-очищенного 3-КГ-ТНТ от рН среды в отсутствие дрожжевых клеток. Установлено, что подкисление способствует, наряду с обратной трансформацией 3-НГ-ТНТ в исходный ксенобиотик, продукции его двух потенциальных изомеров и 3,5-2НГ-ТНТ (рис. 6). Масштабы образования этих же метаболитов в абиотических условиях в сравнении с их продукцией дрожжевыми клетками были очень низкими. В связи с тем, что рН среды в присутствии клеток снижается очень быстро, нельзя исключить и абиотическое превращение части 3-ЕГ-ТНТ как обратно в ТНТ, так и в соединения 1, 4 и 5.

160 -| 140 -120-

I 5 ?

80 1 60 1 40 н 20 1

о ,

рН=7.0 рН=6.0 И З-Н-ТНТ I

рН=5.0 рН=4.0 рН=3.0 ТНТ □ Сумма соединений 1,4 и 5

рН=2.5

Рис. 6. Абиотическая трансформация ВЭЖХ-

очищенного 3-Н~-ТНТ при различных значениях рН (после 30 мин). Концентрация З-РГ-ТНТ и ТНТ выражена в мкМ, количество соединений 1, 4 и 5 -как общая сумма их ВЭЖХ-пихов (детекция при 476 нм).

ВЭЖХ-разделение и очистка метаболитов в сочетании с высушиванием в вакууме позволили исследовать индивидуальные ТНТ-гидридные комплексы. С позиций теоретических представлений о механизмах гидридного восстановления ТНТ серьезный интерес представляет выявленное нами сочетание биологических и чисто химических превращений интермедиатов данного восстановления. Если ранее при спонтанном абиотическом превращении химически синтезированного З-ЕГ-ТНТ единственным обнаруженным продуктом был ТНТ (УогЬеск ег а1., 1998; Рак

еГ а1, 2000), то наша работа наряду с этим демонстрирует способность З-ЬГ-ТНТ абиотически превращаться в его изомеры (соединения 1 и 5) и 3,5-2Н -ТНТ Нами выявлена способность и других пяти гидридных форм ТНТ (за исключением изомера 3,5-2Н~-ТНТН+ (соединения 2) и 1-БГ-ТНТ) к взаимопревращениям в отсутствие клеток дрожжей (табл 2, рис 4) Принципиально важно, что все небиологические реакции протекали без элиминации нитрогрупп

Таб пица 2

Абиотическая конверсия ТНТ-гидридных комплексов

# 1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8

# 1 70% - - 67 5% - 1 5% -

#2 - 95% 29% 3% - 15% - -

#3 - - 57% 2% - 69% - -

#4 - - - 76% 2% - 1% -

V; #5 23% - - - 20% - 1% -

#6 - - 14% - - 16% - -

#7 7% - - 18% 9% - 11% -

#8 - - - - - - - 98%

ТНТ - - - 1% 1 5% - 85 5% -

" Метаболиты очищены и собраны автоматическим коллектором фракций во время ВЭЖХ-диодного анализа высушены в вакууме перерастворены в фосфатном буфере (рН 7 0) и инкубированы в отсутствие клеток в течение 24 ч при 30°С " Метаболиты обнаруженные после 24 ч инкубации

Инкубация индивидуальных ТНТ-гидридных комплексов (за исключением 1-ЬГ-ТНТ) в присутствии изучаемых микроэукариот вела к аккумуляции соединения 2 и его постепенному исчезновению и параллельно с накоплением нитрит-иона, в дальнейшем окисляющегося в нитрат-ион По-видимому, дрожжевым штаммам Y lipolytica AN-L15 и G candidum AN-Z4, помимо первого механизма элиминации нитрогрупп из 3-Н"-ТНТ с одновременным образованием 2,4-ДНТ, свойственен и путь деградации исходного ксенобиотика, протекающий через разрушение соединения 2

Третий путь отщепления нитрогруппы от ТНТ включал предшествующее образование 1-Н~-ТНТ

Дрожжи Y lipolytica AN-L15 и G candidum AN-Z4, выделенные нами из нефтезагрязненных торфяников и нефтешламов, относятся к числу доминирующих микроорганизмов в этих антропогенных местообитаниях Способность выживать и доминировать в таких экстремальных условиях, в сочетании с уникальным механизмом деградации ТНТ, делает данные

микроорганизмы перспективными с точки зрения биоремедиации

промышленных отходов, загрязненных взрывчатыми веществами

ВЫВОДЫ

1 Из антропогенных экосистем выделены два дрожжевых штамма Yartowia hpolytica AN-L15 и Geotrichum candidum AN-Z4, оказавшиеся способными к доминирующему превращению 2,4,6-тринитротолуола по пути атаки его бензольного кольца и денитрации образовавшихся гидридных комплексов Изучаемые дрожжи способны, хотя и в меньшей мере, и к альтернативному превращению исходного ксенобиотика — восстановлению его нитрогрупп

2 Выявлено решающее значение аэрации для роста изучаемых дрожжей, а также вызываемого ими кислотообразования и связанной с ними глубины деструкции молекулы 2,4,6-тринитротолуола

3 ВЭЖХ-диодный и масс-спектрометрический анализ интермедиатов трансформации 2,4,6-тринитротолуола дрожжами по пути восстановления ароматического кольца позволил обнаружить восемь гидридных комплексов, три из которых выделены и охарактеризованы впервые Наряду с этим идентифицирован дигидридный комплекс, формирование которого раньше основывалось лишь на предположениях В качестве метаболитов, образующихся при реализации механизма двухэлектронного нитровосстановления, обнаружены изомерные гидроксиламино-динитротолуолы и амино-динитротолуолы В числе органических интермедиатов идентифицированы 2,4-динитротолуол и продукты его нитроредукции - гидроксиламино-мононитротолуолы

4 Денитрация 2,4,6-тринитротолуола происходила на уровне двух его моногидридных и одного протонированного дигидридного комплексов В качестве продукта отщепления нитрогруппы выявлен нитрит-ион, дальнейшее биоокисление которого в кислой среде вело к аккумуляции нитрат-иона

5 Абиотическая трансформация шести из восьми индивидуальных гидридных комплексов выявила возможность их взаимопревращений без денитрации, тогда как присутствие дрожжей вело к их деструкции и накоплению нитрит-иона с последующим его окислением в нитрат-ион

6 Штаммы дрожжей Yarrowia hpolytica AN-L15 и Geotrichum candidum AN-Z4, в связи с их уникальной способностью к углубленной деградации 2,4,6-тринитротолуола, перспективны с точки зрения создания биотехнологий для ремедиации территорий, загрязненных взрывчатыми веществами

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Зиганшин А М. Гидридное восстановление 2,4,6-тринйтротолуола дрожжами - путь к его глубокой деструкции / A M Зиганшин, А В Наумов, Е С Суворова, Е А Науменко, Р П Наумова // Микробиология -2007 -Т 76, № 6 - С 1-8

2 Ziganshin A. M. Production of eight different hydride complexes and nitrite lelease from 2,4,6-trmitrotoluene by Yarrowia lipolytica / A M Ziganshm, R Gerlach, T Borch, A V Naumov, R P Naumova // Appl Environ Microbiol -2007 -V 73 -doi 10 1128/AEM 01296-07

3 Науменко E А Участие кислорода в бактериальной трансформации 2,4,6-тринитротолуола / Е А Науменко, А В Наумов, Е С Суворова, Р Герлах, А. М. Зиганшин, А П Ложкин, Н И Силкин, Р П Наумова // Биохимия -2008 - Т 73, № 2 - С 215-225

4 Науменко Е А Образование активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола бактериями / Е А Науменко, А В Наумов, А. М. Зиганшин, А П Ложкин, Н И Силкин, Р П Наумова, Казан гос ун-т - Казань, 2006 - 20 с -Деп в ВИНИТИ 27 12 2006, № 1617-В2006

5 Galiev R A Ecologically hazardous petrochemical sludges as a nutrient source for microorganisms / R A Galiev, A. M. Ziganshin, О I Yakusheva, E V Nikitma, S A Zanpov, A V Naumov // Environ Radioecol Appl Ecol -2003 - V 9,№4-P 18-28

6 Наумова P П Методы химического мониторинга нефтезагрязненных осадков и почв Методическое пособие / Р П Наумова, Е В Никитина, О И Якушева, С К Зарипова, А В Гарусов, А. М. Зиганшин - Казань Изд-во Казан ун-та, 2004 - 24 с

7 Зиганшин А. М. Механизмы метаболической активации и детоксикации экологически опасных нитроароматических ксенобиотиков / А М Зиганшин, Е А Науменко, А П Ложкин, Р П Наумова // Сборник материалов Российской школы-конференции молодых ученых "Экотоксикология современные биоаналитические системы, методы и технологии" — Пушино-Тула, 2006 - С 70-72

8 Зиганшин А. М. Гидроксиламины как основные метаболиты трансформации 2,4,6-тринитротолуола прокариотами / А М Зиганшин, Е А Науменко, А П Ложкин, А Н Крицкая, Р П Наумова // Сборник тезисов 9-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" - Пушино, 2005 - С 192

9 Naumov А V Microorganisms carrying out "productive" transformation of ecologically hazardous mtroaromatics / A V Naumov, A. M. Ziganshin // International Conference Science and Business Partnerships m Action "Issues and Solutions in Discovery and Use of Novel Biomolecules Biodiversity and Environment" - Pushchino, 2004 -P 213

10 Зиганшин A. M. Восстановление ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола дрожжами - обитателями нефтезагрязненных почв и нефтешламов / AM Зиганшин, А И Гиндуллин, Е А Науменко, Р П Наумова // Доклады Московского общества испытателей "Биотехнология - охране окружающей среде" - Москва, 2006 - С 220

11 Костычева Ю Ф К вопросу о ремедиации почв, загрязненных взрывчатыми веществами / Ю Ф Костычева, А. М, Зиганшин,

Е А Науменко, А В Наумов // Сборник тезисов научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" - Казань,

2004 - С 101

12 Науменко Е А Динамика токсичности в процессе биотрансформации 2,4,6-тринитротолуола / Е А Науменко, А П Ложкин, А. М Зиганшин, Р П Наумова // Сборник тезисов 10-ой международной Путинской школы-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН - Пущино, 2006 - С 204

13 Абдрахманова Ю Ф Токсикологические аспекты микробной конверсии 2,4,6-тринитротолуола / Ю Ф Абдрахманова, С А Зарипов, А. М. Зиганшин, Н В Тимофеева, Р П Наумова // Сборник тезисов 7-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" - Пущино, 2003 - С. 260

14 Зарипов С А Альтернативные пути трансформации 2,4,6-тринитротолуола дрожжами / С А Зарипов, Ю Ф Абдрахманова, Н В Тимофеева, А. М. Зиганшин, Р П Наумова // Сборник тезисов 7-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" - Пущино, 2003 - С 273

15 Аникеев О Трансформация 2,4,6-тринитротолуола дрожжами / О Аникеев, В Пантюхин, А. М. Зиганшин // Сборник материалов XII всероссийских юношеских чтений имени В И Вернадского - Москва,

2005 - С 324-327

Е-шай автора а 2^апзЪт06@МЪг^Ъ1'Л'еЬ о^

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПДМ7-0215 от 01.112001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ Подписано в печать 2210.2007г Уел п.л1,5 Заказ № К-6468. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зиганшин, Айрат Мансурович

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 2,4,6-Тринитротолуол (ТНТ) и формирование основополагающей концепции его микробного метаболизма

2. Токсичность и мутагенность ТНТ

3. Аэробный метаболизм ТНТ у прокариот

4. Анаэробный метаболизм ТНТ у прокариот

5. Метаболизм ТНТ у грибов

6. Метаболизм ТНТ у растений

7. Взаимодействие ТНТ и его интермедиатов с органическим матриксом почвы

8. Метаболизм динитротолуолов микроорганизмами 41 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 45 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Источники и условия выделения микроорганизмов

2. Выделение и идентификация дрожжей

3. Культивирование дрожжей в отсутствие и в присутствии ТНТ

4. Световая микроскопия

5. Определение способности дрожжей утилизировать нитриты и нитраты

6. Определение способности дрожжей к гетеротрофной нитрификации

7. Аналитические методы

7.1. Спектрофотометрия

7.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография

7.3. Масс-спектрометрия

7.4. Хромато-масс-спектрометрия

7.5. Ионная хроматография

7.5.1. Определение нитрит- и нитрат-ионов

7.5.2. Определение органических кислот

8. Химические реактивы

9. Статистическая обработка результатов 51 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выделение и идентификация микроорганизмов, способных к редукции ароматического кольца ТНТ

2. Трансформация ТНТ штаммом Y. lipolytica AN-L

2.1. Конверсия ТНТ в аэробных условиях роста при рН 6.

2.1.1. Начальный этап трансформации ТНТ

2.1.2. Анализ продуктов восстановления ароматического кольца ТНТ

2.1.3. Второй этап трансформации ТНТ

2.1.4. Рост дрожжей и продукция органических кислот

2.1.5. Трансформация ТНТ в условиях роста при повышенной моляр-ности фосфатного буфера

2.2. Конверсия ТНТ в аэробных условиях роста при рН 7.

2.3. Конверсия ТНТ в статических условиях роста на уровне рН 6.0-7.

2.4. Конверсия ТНТ в анаэробных условиях роста

3. Трансформация ТНТ штаммом G. candidum AN-Z

4. Трансформация ВЭЖХ-очищенных ТНТ-гидридных комплексов

4.1. Стабильность С-3 моногидридного комплекса ТНТ

4.2. Абиотическое взаимопревращение ТНТ-гидридных комплексов

4.3. Трансформация индивидуальных ТНТ-гидридных комплексов клетками дрожжей

5. Превращение нитрит-иона в присутствии и в отсутствие дрожжевых клеток

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Восстановление ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола как путь его деградации"

Актуальность проблемы. Производство и использование различных высокоустойчивых синтетических соединений приводит к загрязнению окружающей среды. Среди них большую опасность представляет 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ, тротил), наиболее часто применяемое взрывчатое вещество, синтез и использование которого приводит к загрязнению почв, воздуха, поверхностных и грунтовых вод. ТНТ и продукты его нитровосстановления относятся к числу токсичных, потенциально мутагенных и устойчивых загрязнителей, способных длительное время циркулировать в природных системах (Rieger, Knackmuss, 1995; Spain et al., 2000). Агентство по защите окружающей среды США отнесло ТНТ к числу наиболее опасных загрязнителей биосферы, и, в связи с этим, предотвращение контаминации и ремедиация ТНТ-загрязненных территорий признаны необходимыми в местах его производства и использования (Fiorella, Spain, 1997).

Постоянное воздействие ТНТ и метаболитов его нитроредукции на организм человека может привести к развитию таких заболеваний как апластическая анемия, катаракта, нарушение функционирования печени, образование опухолей в мочевыводящей системе (Hathaway, 1985; Yinon, 1990; Leung et al., 1995). Предотвратить поступление этих соединений в организм человека можно, создавая и совершенствуя технологии, направленные на элиминацию ТНТ и продуктов его трансформации из ТНТ-загрязненных объектов.

Обезвреживание объектов, загрязненных взрывчатыми веществами, прежде всего ТНТ, базируется на применении физических, химических и биологических методов. К примеру, сжигание является одним из наиболее эффективных, радикальных методов уничтожения ТНТ в загрязненных почвах, однако этот подход относится к наиболее энергоемким. Кроме того, его реализация сопряжена с дополнительными экологическими проблемами, в частности, с полной деградацией почвы, с выбросом в окружающую среду оксидов азота (Rodgers, Bunce, 2001).

Основные преимущества биоремедиации заключаются в ее экологичности и низкой стоимости (Rodgers, Bunce, 2001; Esteve-Nunez et al., 2001).

Начиная с середины 90-х годов прошлого столетия, представления о путях микробной трансформации ТНТ претерпели значительные изменения, что касается, в частности, пересмотра доминирующего положения амино-динитротолуолов (АДНТ) как основных метаболитов ТНТ. Оказалось, что барьер на пути восстановительной трансформации его нитрогрупп находится преимущественно на этапе, который предшествует образованию АДНТ. Аккумуляция гидроксиламино-динитротолуолов (ГАДНТ) как мажорных метаболитов сначала была продемонстрирована на отдельных штаммах, в том числе на молочнокислых бактериях (Наумов с соавт., 1999), на облигатно анаэробных клостридиях (Huang et al., 2000) и на дрожжах (Зарипов с соавт., 2002), а затем и на широком круге прокариот (Зарипов с соавт., 2004).

Школой Г.-И. Кнакмусса (Vorbeck et al., 1994; Vorbeck et al., 1998) инициированы исследования альтернативного направления биотрансформации ТНТ, основанной на его гидридном восстановлении. Данный путь превращения исходного токсиканта впервые был выявлен на примере штамма Mycobacterium sp, strain HL 4-NT-l, он вел к образованию С-3 моногидридного комплекса ТНТ (3-Н~-ТНТ). Дальнейшая атака этого метаболита вела к аккумуляции ТНТ-дигидридного комплекса (3,5-2ЬГ-ТНТ), протонирование которого сопровождалось формированием трех дополнительных изомеров (3,5-2Н~-ТНТ'Н+). Совокупность последующих работ данного направления выявила способность к гидридной трансформации ТНТ лишь у узкого круга микроорганизмов (French et al., 1998; Рак et al., 2000; Kim, Song, 20006; Kim et al., 2002; Zaripov et al., 2002; Jain et al., 2004).

Если атака нитрогрупп ТНТ ферментативными системами микроорганизмов ведет к генерации высокотоксичных нитрозо- и гидроксиламино-динитротолуолов (Leung et al., 1995; Zaripov et al., 2002), то механизм атаки ароматического кольца с участием гидрид-иона может способствовать более глубокой трансформации ТНТ с выделением азота в виде NO2". Возможность такой денитрации в трех первых работах (French et al., 1998; Kim et al., 2002; Jain et al., 2004) была предположена через разрушение ТНТ-гидридных комплексов, хотя идентификация нитрита была осуществлена с использованием лишь цветной реакции Грисса, которая требует подтверждения. Согласно другой версии (Рак et al., 2000), отщепление нитрит-иона может происходить не только на уровне интермедиатов гидридного пути, но и при взаимодействии (в том числе и небиологическом) продуктов превращения ТНТ по обоим альтернативным направлениям.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы состояла в следующем: осуществить идентификацию и разностороннюю характеристику совокупности гидридных комплексов - интермедиатов восстановительной атаки 2,4,6-тринитротолуола дрожжами. Оценить роль внешних физико-химических факторов с точки зрения глубины деструкции 2,4,6-тринитротолуола. Были поставлены следующие задачи:

• выявить неорганические продукты денитрации 2,4,6-тринитротолуола и расширить представления о механизме отщепления нитрогрупп от исходного ксенобиотика;

• оценить возможности использования выделенных и изученных в данной работе изолятов с точки зрения биоремедиации объектов, загрязненных 2,4,6-тринитротолуолом.

Научная новизна. В результате широкого скрининга микроорганизмов в настоящей работе выделены 2 штамма дрожжей - Yarrowia lipolytica AN-L15 и Geotrichum candidum AN-Z4, которые восстанавливают ТНТ по пути присоединения гидрид-ионов к его ароматическому кольцу и одновременно отщепляют нитрогруппы от образовавшихся метаболитов. На основе способности дрожжей к трансформации исходного токсиканта по данному пути впервые обнаружены восемь гидридных комплексов ТНТ, тогда как ранее в литературе сообщалось о существовании лишь пяти форм. Выявлен и охарактеризован также 3,5-2Н~-ТНТ, существование которого раньше базировалось только на предположениях. Все обнаруженные интермедиаты в данной работе охарактеризованы с применением усовершенствованных аналитических методов, что позволило представить их хроматографические, спектрофотометрические и масс-спектральные характеристики.

Установлена способность дрожжей к разрушению трех ТНТ-гидридных комплексов с промежуточной аккумуляцией нитрит-ионов. Впервые доказано образование нитрат-иона как результата окисления дрожжами ранее выделившегося нитрит-иона. Способность к денитрации ТНТ в сочетании с окислением нитрит-иона в нитрат-ион изучаемыми дрожжами уникальна и представляет интерес с точки зрения биоремедиации ТНТ-загрязненных объектов.

Выявлено стимулирующее влияние аэрации и снижения рН среды на деградацию ТНТ-гидридных комплексов дрожжами Y. lipolytica AN-L15 и G. candidum AN-Z4.

Впервые осуществленная ВЭЖХ-очистка восьми гидридных форм ТНТ позволила продемонстрировать возможность их взаимного абиотического превращения. Доказано непосредственное участие дрожжей в элиминации нитрогрупп из интермедиатов гидридного восстановления ТНТ.

Практическая значимость. Способность детектировать метаболиты превращения ТНТ по альтернативным путям его восстановления очень важна с позиций оценки эффективности ремедиации ТНТ-загрязненных объектов. Совершенствование методов обнаружения данных интермедиатов, несомненно, способствует пониманию более глубоких механизмов трансформации исходного взрывчатого вещества. Так, примененный в данной работе новый ВЭЖХ-диодный метод разделения продуктов нитроредукции ТНТ, разработанный коллегами из Университета штата Монтана (США) под руководством профессора Р. Герлаха, позволил разделить и идентифицировать углеродсодержащие метаболиты восстановления ароматического кольца, что не было достигнуто ни в одной из предшествующих работ. Наша работа позволила по-новому взглянуть на механизм трансформации ТНТ низшими эукариотами, обнаружить нитрит- и нитрат-ионы, которые являются индикаторами частичной минерализации исходного токсиканта. Раскрытие данного механизма в будущем должно повысить эффективность технологий по обезвреживанию ТНТ-загрязненных территорий.

Дрожжи Y. lipolytica AN-L15 и G. candidum AN-Z4, выделенные нами из нефтезагрязненных торфяников и отходов нефтехимии, являются доминирующими микроорганизмами в этих антропогенных местообитаниях. Их поистине удивительная способность выживать и доминировать в таких экстремальных условиях, в сочетании с уникальным механизмом деградации ТНТ, делает данные штаммы перспективными с точки зрения биоремедиации промышленных отходов, загрязненных взрывчатыми веществами.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Зиганшин, Айрат Мансурович

выводы

1. Из антропогенных экосистем выделены два дрожжевых штамма Yarrowia lipolytica AN-L15 и Geotrichum candidum AN-Z4, оказавшиеся способными к доминирующему превращению 2,4,6-тринитротолуола по пути атаки его бензольного кольца и денитрации образовавшихся гидридных комплексов. Изучаемые дрожжи способны, хотя и в меньшей мере, и к альтернативному превращению исходного ксенобиотика - восстановлению его нитрогрупп.

2. Выявлено решающее значение аэрации для роста изучаемых дрожжей, а также вызываемого ими кислотообразования и связанной с ними глубины деструкции молекулы 2,4,6-тринитротолуола.

3. ВЭЖХ-диодный и масс-спектрометрический анализ интермедиатов трансформации 2,4,6-тринитротолуола дрожжами по пути восстановления ароматического кольца позволил обнаружить восемь гидридных комплексов, три из которых выделены и охарактеризованы впервые. Наряду с этим идентифицирован дигидридный комплекс, формирование которого раньше основывалось лишь на предположениях. В качестве метаболитов, образующихся при реализации механизма двухэлектронного нитровосстановления, обнаружены изомерные гидроксиламино-динитротолуолы и амино-динитротолуолы. В числе органических интермедиатов идентифицированы 2,4-динитротолуол и продукты его нитроредукции - гидроксиламино-мононитротолуолы.

4. Денитрация 2,4,6-тринитротолуола происходила на уровне двух его моногидридных и одного протонированного дигидридного комплексов. В качестве продукта отщепления нитрогруппы выявлен нитрит-ион, дальнейшее биоокисление которого в кислой среде вело к аккумуляции нитрат-иона.

5. Абиотическая трансформация шести из восьми индивидуальных гидридных комплексов выявила возможность их взаимопревращений без денитрации, тогда как присутствие дрожжей вело к их деструкции и накоплению нитрит-иона с последующим его окислением в нитрат-ион.

6. Штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica AN-L15 и Geotrichum candidum AN-Z4, в связи с их уникальной способностью к углубленной деградации 2,4,6-тринитротолуола, перспективны с точки зрения создания биотехнологий для ремедиации территорий, загрязненных взрывчатыми веществами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе проведенного широкого скрининга микроорганизмов из различных антропогенных и природных экониш были выделены 428 изолятов, из которых только 2 штамма дрожжей, идентифицированные как Y. lipolytica AN-L15 и G. candidum AN-Z4, оказались способными к альтернативным направлениям трансформации ТНТ с доминированием гидридного восстановления ароматического кольца ТНТ и продуцирующие относительно наибольшее количество NO2" и NO3". Результаты проведенного скрининга свидетельствуют об уникальности гидридного механизма восстановления ТНТ, включающего деградацию образовавшихся ТНТ-гидридных комплексов, что несвойственно для подавляющего большинства испытанных микроорганизмов.

Несмотря на длительную историю изучения механизмов превращений ТНТ организмами разного эволюционного уровня, концепция биотрансформации ТНТ еще далека от завершения. Совершенствование этой концепции в решающей степени зависит от методического уровня детекции интермедиатов превращения этого токсиканта.

Применение нового ВЭЖХ-диодного метода позволило идентифицировать интермедиа™ обоих путей восстановления ТНТ штаммами Y. lipolytica AN-L15 и G. candidum AN-Z4. Так, если нитроредукция вела к образованию гидроксиламино-динитротолуолов и амино-динитротолуолов, то в результате гидридного восстановления бензольного кольца исходной молекулы наблюдалась временная аккумуляция восьми ТНТ-гидридных комплексов.

Анализ фрагментов, образовавшихся при химической ионизации органических интермедиатов ионной структуры, позволил дифференцировать их следующим образом, в зависимости от m/z главных ионов: с m/z 227 (1-FT-THT, З-ЬГ-ТНТ и два его изомера), с m/z 228 (3,5-2Н~-ТНТ) и с m/z 230 (три изомера 3,5-2H~-THrbf).

В данной работе впервые обнаружены следующие гидридные комплексы: 1-ЬГ-ТНТ, два изомера 3-ЬГ-ТНТ и 3,5-2Н~-ТНТ, определены их спектральные и хроматографические характеристики; изучена стабильность всех ВЭЖХ-очищенных гидридных форм ТНТ в абиотических условиях (буферный раствор, рН 7.0).

Проведенные нами исследования выявили способность изученных дрожжей не только к синтезу ТНТ-гидридных комплексов из ТНТ, но и к осуществлению их более глубокой деструкции с освобождением азота в виде нитрит- и нитрат-ионов. Впервые предложена схема, включающая три потенциально возможных пути деградации ТНТ в направлении его минерализации. Первый путь основан на разложении 3-РГ-ТНТ при одновременном формировании 2,4-ДНТ, второй - на деструкции 1-Н~-ТНТ, третий - на деградации одного из изомеров З^^РГ-ТНТ'Н*. Все три механизма обеспечивают частичное освобождение углеродного скелета ТНТ от азотсодержащих заместителей, сопровождающееся выделением в среду нитрит- и нитрат-ионов. Данная схема впервые основана на сочетании биологической и абиотической трансформации всех восьми ВЭЖХ-очищенных ТНТ-гидридных комплексов.

Установлена способность Y. lipolytica AN-L15 к синтезу сукцината, цитрата и пирувата, a G. candidum AN-Z4 - сукцината, цитрата и изоцитрата, что сопряжено со снижением внеклеточного рН. Подкисление среды до рН ниже 4.2 выявлено в качестве условия окисления нитрит-иона дрожжевыми клетками и превращения С-3 моногидридного комплекса ТНТ в динитротолуол.

Дрожжи Y. lipolytica AN-L15 и G. candidum AN-Z4, выделенные нами из нефтезагрязненных торфяников и отходов нефтехимии - нефтешламов, относятся к числу доминирующих микроорганизмов в этих антропогенных местообитаниях. Способность выживать и доминировать в таких экстремальных условиях, в сочетании с уникальным механизмом деградации ТНТ, делает данные микроорганизмы перспективными с точки зрения биоремедиации промышленных отходов, загрязненных взрывчатыми веществами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зиганшин, Айрат Мансурович, Казань

1. Бабьева И.П. Методы выделения и идентификации дрожжей / И.П. Бабьева, В.И. Голубев. - М.: Пищевая промышленность, 1979. - 120 с.

2. Беляев А.В. Химико-технологические проблемы платиновых металлов при переработке отработанного ядерного топлива / А.В. Беляев // Ж. структурной химии. 2003. - Т. 44. - С. 39-47.

3. Зарипов С.А. Альтернативные пути начальной трансформации 2,4,6-тринитротолуола дрожжами / С.А. Зарипов, А.В. Наумов, Е.В. Никитина, Р.П. Наумова // Микробиология. 2002. - Т. 71. - С. 648-653.

4. Зарипов С.А. Начальные этапы трансформации 2,4,6-тринитротолуола микроорганизмами / С.А. Зарипов, А.В. Наумов, Е.С. Суворова, А.В. Гарусов, Р.П. Наумова // Микробиология. 2004. - Т. 73. - С. 472-^78.

5. Карамова Н.С. 2,4,6-Тринитротолуол и 2,4-диамино-6-нитротолуол: отсутствие гесА-зависимого мутагенеза / Н.С. Карамова, И.И. Мынина, Г.Г. Гараева, О.Б. Иванченко, О.Н. Ильинская // Генетика . 1995. — Т, 31. -С. 617-621.

6. Наумов А.В. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола лактобациллами с образованием токсичных гидроксиламинопроизводных / А.В. Наумов, Е.С. Суворова, A.M. Воронин, С.К. Зарипова, Р.П. Наумова // Микробиология. 1999. - Т. 68. - С. 56-62.

7. Наумова Р.П. Изучение возможности глубокой бактериальной деструкции 2,4,6-тринитротолуола / Р.П. Наумова, С.Ю. Селивановская, Ф.А. Мингатина // Микробиология. 1988. - Т. 57. - С. 218-222.

8. Anastassiadis S. Citric acid production by Candida strains under intracellular nitrogen limitation / S. Anastassiadis, A. Aivasidis, C. Wandrey // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 60. - P. 81-87.

9. Angermaier L. On nitroaryl reductase activities in several Clostridia / L. Angermaier, H. Simon // Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1983. - V. 364. -P. 1653-1663.

10. Bakhtiar R. Covalent binding of 2,4,6-trinitrotoluene to human hemoglobin. Evidence for protein adducts probed by electrospray ionization mass spectrometry / R. Bakhtiar, K.H. Leung // Rapid Commun. Mass Spectrom. -1997.-V. 11.-P. 1935-1937.

11. Banerjee H.N. Cytotoxicity of TNT and its metabolites / H.N. Baneijee, M. Verma, L.H. Hou, M. Ashraf, S.K. Dutta // Yale J. Biol. Med. 1999. - V. 72. - P. 1-4.

12. Barnett J. Yeasts: characteristics and identification / J. Barnett, R. Payne, D. Yarrow. Great Britain: Cambridge University Press, 1983. - 811 p.

13. Bausum H.T. Biodegradation of 2,4- and 2,6-dinitrotoluene by freshwater microorganisms / H.T. Bausum, W.R. Mitchell, M.A. Major // J. Environ. Sci. Health. 1992. - V. 27. - P. 663-695.

14. Berthe-Corti L. Cytotoxicity and mutagenicity of a 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) and hexogen contaminated soil in Salmonella typhimurium and mammalian cells / L. Berthe-Corti, H. Jacobi, S. Kleihauer, J. White // Chemosphere. -1998.-V. 37.-P. 209-218.

15. Blasco R. Characterization of a nitrophenol reductase from the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus E1F1 / R. Blasco, F. Castillo // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 1774-1778.

16. Bollag J.-M. Incorporation of xenobiotics into soil humus / J.-M. Bollag, M.J. Loll // Experientia. 1983. - V. 39. - P. 1221-1231.

17. Boopathy R. Nitroaromatic compounds serve as nitrogen source for Desulfovibrio sp. (B. strain) / R. Boopathy, C.F. Kulpa // Can. J. Microbiol. -1993.-V. 34.-P. 430-433.

18. Boopathy R. Trinitrotoluene as a sole nitrogen source for a sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio sp. (B strain) isolated from an anaerobic digester / R. Boopathy, C.F. Kulpa // Curr. Microbiol. 1992. - V. 25. - P. 235-241.

19. Bueding E. Metabolism of trinitrotoluene (TNT) in vitro / E. Bueding, N. Jollife // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1946. - V. 88. - P. 300-312.

20. Carpenter D.F. Microbial transformation of 14C-labeled 2,4,6-trinitrotoluene in an activated sludge system / D.F. Carpenter, N.G. McCormic, J.H. Cornell, A.M. Kaplan // Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 35. - P. 949-954.

21. Chang Y.-Y. Enhanced degradation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) in a soil column planted with Indian Mallow {Abutilon avicennae) / Y.-Y. Chang, Y.-S. Kwon, S.-Y. Kim, I.-S. Lee, B. Bae // J. Biosci. Bioeng. 2004. - V. 97. - P. 99-103.

22. Chernyavskaya O.G. Synthesis of a-ketoglutaric acid by Yarrowia lipolytica yeast grown on ethanol / O.G. Chernyavskaya, N.V. Shishkanova, A.P. H'chenko, T.V. Finogenova // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 53. -P. 152-158.

23. Coombs M. Determination of trinitrotoluene and metabolites in urine by means of gas-chromatography with mass detection / M. Coombs, V. Schillack // Int. Arch. Occup. Environ. Health. 1998. - V. 71. - P. 22-25.

24. Crawford R.L. The microbiology and treatment of nitroaromatic compounds / R.L. Crawford // Curr. Opin. Biotechnol. 1995. - V. 6. - P. 329-336.

25. Dilley J.V. Short-term oral toxicity of 2,4,6-trinitrotoluene in mice, rats and dogs / J.V. Dilley, C.A. Tyson, R.J. Spanggord, D.P. Sasmore, G.W. Newell, J.C. Dacre // J. Toxicol. Environ. Health. 1982. - V. 9. - P. 565-585.

26. Duque E. Construction of a Pseudomonas hybrid strain that mineralizes 2,4,6-trinitrotoluene / E. Duque, A. Haydour, F. Godoy,"J.L. Ramos // J. Bacteriol. -1993.-V. 175.-P. 2278-2283.

27. Ebert S. Function of coenzyme F420 in aerobic catabolism of 2,4,6-trinitrophenol and 2,4-dinitrophenol by Nocardioides simplex FJ2-1A / S. Ebert, P.-G. Rieger, H.-J. Knackmuss // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 26692674.

28. Ederer M.M. 2,4,6-Trinitrotoluene (TNT) transformation by Clostridia isolated from a munition-fed bioreactor: comparison with non-adapted bacteria / M.M. Ederer, T.A. Lewis, R.L. Crawford // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1997. -V. 18.-P. 82-88.

29. Eilers A. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by the white-rot fungus Bjerkandera adusta DSM 3375 depends on cytochrome P-450 / A. Eilers, E. Rungeling, U.M. Stundl, G. Gottschalk//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V. 53. - P. 75-80.

30. Esteve-Nunez A. Biological degradation of 2,4,6-trinitrotoluene / A. Esteve-Nunez, A. Caballero, J.L. Ramos // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - V. 65. -P. 335-352.

31. Esteve-Nunez A. Metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas sp. JLR11 / A. Esteve-Nunez, J.L. Ramos // Environ. Sci. Technol. 1998. - V. 32. -P. 3802-3808.

32. Esteve-Nunez A. Respiration of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas sp. strain JLR11 / A. Esteve-Nunez, G. Luchessi, B. Philipps, B. Schink, J.L. Ramos // J. Bacteriol. 2000. - V. 182.-P. 1352-1355.

33. Falih A.M.K. Nitrification in vitro by a range of filamentous fungi and yeasts / A.M.K. Falih, M. Wainwright // Lett. Appl. Microbiol. 1995. - V. 21. - P. 18-19.

34. Finogenova T.V. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects / T.V. Finogenova, I.G. Morgunov, S.V. Kamzolova, O.G. Chernyavskaya // Appl. Biochem. Microbiol. (Russia). 2005. - V. 41. - P. 418-425.

35. Fiorella P.D. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas pseudoalcaligenes JS52 / P.D. Fiorella, J.C. Spain // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63.-P. 2007-2015.

36. Freedman D.L. Aerobic biodegradation of 2,4-dinitrotoluene, aminonitrotoluene isomers, and 2,4-diaminotoluene / D.L. Freedman, R.S. Shanley, R.J. Scholze // J. Hazardous Materials. 1996. - V. 49. - P. 1-14.

37. French P.D. Aerobic degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Enterobacter cloacae PB2 and by pentaerythritol tetranitrate reductase / P.D. French, S. Nicklin, N.C. Bruce // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 28642868.

38. Fuller M.E. Aerobic gram-positive and gram-negative bacteria exhibit differential sensitivity to and transformation of 2,4,6-trinitrotoluene / M.E. Fuller, J.F. Manning // Curr. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 77-83.

39. Funk S.B. Initial-phase optimization for bioremediation of munition compound-contaminated soils / S.B. Funk, D.J. Roberts, D.L. Crawford, R.L. Crawford // Appl. Environ. Microbiol. 1993. -V. 59.-P. 2171-2177.

40. Research Institute, Project No. L6116, Study No. 9, Chicago, IL, 1984a. -DAMD17-79-C-9120. AD-A168 637.

41. George S.E. Use of a Salmonella microsuspension bioassay to detect the mutagenicity of munitions compounds at low concentrations / S.E. George, G. Huggins-Clark, L.R. Brooks // Mutat. Res. 2001. - V. 490. - P. 45-56.

42. Haidour A. Identification of products resulting from the biological reduction of 2,4,6-trinitrotoluene, 2,4-dinitrotoluene, and 2,6-dinitrotoluene by Pseudomonas sp. / A. Haidour, J.L. Ramos // Environ. Sci. Technol. 1996. -V. 30.-P. 2365-2370.

43. Haigler B.E. Biodegradation of 2-nitrotoluene by Pseudomonas sp. strain JS42 / B.E. Haigler, W.H. Wallace, J.C. Spain // Appl. Environ. Microbiol. 1994. -V. 60.-P. 3466-3469.

44. Hannink N.K. Uptake and metabolism of TNT and GTN by plants expressing bacterial pentaerythritol tetranitrate reductase / N.K. Hannink, S.J. Rosser, C.E. French, N.C. Bruce // Water, Air, Soil Pollut. 2003. - V. 3. - P. 251-258.

45. Hathaway J.A. Subclinical effects of trinitrotoluene: a review of epidemiology studies / J.A. Hathaway // In D.E. Rickert (ed.), Toxicity of nitroaromatic compounds. Hemisphere publishing corporation, Washington D.C., 1985. - P. 255-274.

46. Hawari J. Biotransformation of 2,4,6-trinitrotoluene with Phanerochaete chrysosporium in agitated cultures at pH 4.5 / J. Hawari, A. Halasz, S. Beaudet, L. Paquet, G. Ampleman, S. Thiboutot // Appl. Environ. Microbiol. 1999. -V. 65. - P. 2977-2986.

47. Hofmann K.W. Nitrite elimination and hydrolytic ring cleavage in 2,4,6-trinitrophenol (picric acid) degradation / K.W. Hofmann, H.-J. Knackmuss, G. Heiss // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 2854-2860.

48. Huang S. 2,4,6-Trinitrotoluene reduction by carbon monoxide dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum / S. Huang, P.A. Lindahl, C. Wang, G.N. Bennett, F.B. Rudolph, J.B. Hughes // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66.-P. 1474-1478.

49. Hughes J.B Reduction of 2,4,6-trinitrotoluene by Clostridium acetobutylicum through hydroxylamino intermediates / J.B. Hughes, C. Wang, K. Yesland, R.

50. Bhadra, A. Richardson, G. Bennet, F. Rudolph // Environ. Toxicol. Chem. -1998.-V. 17.-P. 343-348.

51. Hughes J.S. Transformation of TNT by aquatic plants and plant tissue cultures / J.S. Hughes, J. Shanks, M. Vanderford, J. Lauritzen, R. Bhadra // Environ. Sci. Technol. 1997. - V. 31. - P. 266-271.

52. Jain M.R. 2,4,6-Trinitrotoluene transformation by a tropical marine yeast, Yarrowia lipolytica NCIM 3589 / M.R. Jain, S.S. Zinjarde, D.D. Deobagkar, D.N. Deobagkar // Marine Pollut. Bullet. 2004. - V. 49. - P. 783-788.

53. Johnson G.R. Origins of the 2,4-dinitrotoluene pathway / G.R. Johnson, R.K. Jain, J.C. Spain // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 4219-4232.

54. Keith L.H. Priority pollutants: a perspective view / L.H. Keith, W.A. Telliard // Environ. Sci. Technol. 1979. - V. 13. - P. 416-423.

55. Kim H.-Y. Comparison of 2,4,6-trinitrotoluene degradation by seven strains of white rot fungi / H.-Y Kim, H.G. Song // Curr. Microbiol. 2000a. - V. 41. -P. 317-320.

56. Kim H.-Y. Degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Klebsiella sp. isolated from activated sludge / H.-Y. Kim, G.N. Bennett, H.-G. Song // Biotechnol. Lett. -2002.-V. 24.-P. 2023-2028.

57. Kim H.-Y. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene by white rot fungus Irpex lacteus / H.-Y. Kim, H.-G. Song // Biotechnol. Lett. 20006. - V. 22. - P. 969975.

58. Kuenen J.G. Combined nitrification-denitrification processes / J.G. Kuenen, L.A. Robertson // FEMS Microbiol. Rev. 1994. - V. 15. - P. 109-117.

59. Lachance B. Cytotoxic and genotoxic effects of energetic compounds on bacterial and mammalian cells in vitro / B. Lachance, P.Y. Robidoux, J. Hawari, G. Ampleman, S. Thiboutot, G.I. Sunahara// Mutat. Res. 1999. - V. 444. - P. 25-39.

60. Lang E. Fungi of a forest soil nitrifying at low pH values / E. Lang, G. Jagnow // FEMS Microbiol. Ecol. 1986. - V. 38. - P. 257-265.

61. Lendenmann U. Simultaneous biodegradation of 2,4-dinitrotoluene and 2,6-dinitrotoluene in an aerobic fluidizedbed biofilm reactor / U. Lendenmann, J.C. Spain, B.F. Smets // Environ. Sci. Technol. 1998. - V. 32. - P. 82-87.

62. Lenke H. Initial hydrogenation during catabolism of picric acid by Rhodococcus erythropolis HL 24-2 / H. Lenke, H.-J. Knackmuss // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 2933-2937.

63. Leung K.H. Mechanism of bioactivation and covalent binding of 2,4,6-trinitrotoluene / K.H. Leung, M. Yao, R. Stearns, S.-H.L. Chiu // Chem. Biol. Interact. 1995. - V. 97. - P. 37-51.

64. Lewis T.A. Products of anaerobic 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) transformation by Clostridium bifermentans / T.A. Lewis, S. Goszczynski, R.L. Crawford, R.A. Korus, W. Admassu // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 46694674.

65. Manning J.F. A laboratory study in support of the pilot demonstration of a biological soil slurry reactor / J.F. Manning, R. Boopathy, C.F. Kulpa // Report No. SFIM-AEC-TS-CR-94038, US Army Environmental Center, Aberdeen Proving Ground, MD, 1995. 5 p.

66. Martin J.L. Denitration of 2,4,6-trinitrotoluene by Pseudomonas savastanoi / J.L. Martin, S.D. Comfort, P.J. Shea, T.A. Kokjohn, R.A. Drijber // Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. - P. 447-455.

67. Mason R.P. The role of catalytic superoxide formation in the inhibition of nitroreductase / R.P. Mason, J.L. Holtzmann // Biochem. Biophys. Res. Comrnun. 1975. - V. 67. - P. 1267-1274.

68. McCormick N.G. Microbial transformation of 2,4,6-TNT and other nitroaromatic compounds / N.G. McCormick, F.E. Feeherry, H.S. Levinson // Appl. Environ. Microbiol. 1976. - V. 31. - P. 949-958.

69. Medina V.F. Treatment of trinitrotoluene by crude plant extracts / V.F. Medina, S.L. Larson, L. Agwaramgbo, W. Perez, L. Escalon // Chemosphere. 2004. -V. 55.-P. 725-732.

70. Montpas S. Degradation of 2,4,6-trinitrotoluene by Serratia marcescens / S. Montpas, J. Samson, E. Langlois, J. Lei, Y. Piche, R. Chenevert // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 291-294.

71. Moresi M. Effect of glucose concentration on citric acid production by Yarrowia lipolytica / M. Moresi // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1994. - V. 60.-P. 387-395.

72. Nepovim A. In-vitro degradation of 2,4,6-trinitrotoluene using plant tissue cultures of Solarium aviculare and Rheum palmatum / A. Nepovim, M. Hubalek, R. Podlipna, S. Zeman, T. Vanek // Eng. Life Sci. 2004. - V. 4. - P. 46^9.

73. Newman L.A. Uptake and biotransformation of trichloroethylene by hybrid poplars / L.A. Newman, S.E. Strand, N. Choe, J. Duffy, G. Ekuan, M. Ruszaj, B.B. Shurtleff, J. Wilmoth, P. Heilman, M. Gordon // Environ. Sci. Technol. -1997.-V. 31.-P. 1062-1067.

74. Nga D.P. NpdR, a repressor involved in 2,4,6-trinitrophenol degradation in Rhodococcus opacus HL PM-1 / D.P. Nga, J. Altenbuchner, G.S. Heiss // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - P. 98-103.

75. Nishino S.F. Aerobic degradation of dinitrotoluenes and pathway for bacterial degradation of 2,6-dinitrotoluene / S.F. Nishino, G.C. Paoli, J.C. Spain // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 2139-2147.

76. Nishino S.F. Mineralization of 2,4- and 2,6-dinitrotoluene in soil slurries / S.F. Nishino, J.C. Spain, H. Lenke, H.-J. Knackmuss // Environ. Sci. Technol. -1999.-V. 33.-P. 1060-1064.

77. Noguera D.R. Reduction and acetylation of 2,4-dinitrotoluene by a Pseudomonas aeruginosa strain / D.R. Noguera, D.L. Freedman // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 2257-2263.

78. Рак J.W. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene by purified xenobiotic reductase В from Pseudomonas fluorescens I-C / J.W. Рак, K.L. Knoke, D.R. Noguera, B.G. Fox, G.H. Chambliss // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 4742-4750.

79. Parrish F.W. Fungal transformation of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) / F.W. Parrish // Appl. Environ. Microbiol. 1977. -V. 34.-P. 232-233.

80. Pavlostathis S.G. Biotransformation of 2,4,6-trinitrotoluene in a continuous-flow Anabaena sp. system / S.G. Pavlostathis, G.H. Jackson // Wat. Res. -2002.-V. 36.-P. 1699-1706.

81. Peterson F.J. Oxygensensitive and insensitive nitroreduction by Escherichia coli and rat hepatic microcosomes / F.J. Peterson, R.P. Mason, J. Horspian, J.L. Holtzman // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254. - P. 4009-4014.

82. Peterson M.M. Germination and seedling development of switchgrass and smooth bromegrass exposed to 2,4,6-trinitrotoluene / M.M. Peterson, G.L. Horst, P.J. Shea, S.D. Comfort // Environ. Pollut. 1998. - V. 99. - P. 53-59.

83. Popp J.A. The hepatocarcinogenicity of dinitrotoluenes / J.A. Popp, T.B. Leonard // In D.E. Rickert (ed.), Toxicity of nitroaromatic compounds. -Hemisphere Publishing Corporation, Washington, 1985. P. 53-60.

84. Prescott D.M. Methods in cell biology. Volume XI. Yeasts cells / D.M. Prescott. New York: Academic Press, INC, 1975. - 346 p.

85. Preuss A. Anaerobic transformation of 2,4,6-TNT and other nitroaromatic compounds / A. Preuss, P.G. Rieger // In J.C. Spain (ed.), Biodegradation of nitroaromatic compounds. Plenum Press, New York, 1995. - P. 69-85.

86. Preuss A. Anaerobic transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) / A. Preuss, J. Fimpel, G. Dickert // Arch. Microbiol. 1993. - V. 159. - P. 345353.

87. Rieble S. Aromatic nitroreductase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium / S. Rieble, D.K. Joshi, M. Gold // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - V. 205. - P. 298-304.

88. Rodgers J.D. Treatment methods for the remediation of nitroaromatic explosives / J.D. Rodgers, N.J. Bunce // Wat. Res. 2001. - V. 35. - P. 21012111.

89. Rosenblatt D.H. Organic explosives and related compounds / D.H. Rosenblatt, E.P. Burrows, W.R. Mitchell, D.L. Parmer // In O. Hutzinger (ed.), Handbook of Environmental Chemistry. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, 1991.-P. 195-234.

90. Sax N.I. Hawley's Condensed Chemical Dictionary / N.I. Sax, R.J. Lewis. -New York: 11th ed. Van Nostrand Co., 1987. 1191 p.

91. Saxena A. Microbial mineralization of humic acid-3,4-dichloroaniline complexes / A. Saxena, R. Bartha // Soil Biol. Biochem. 1983. - V. 15. - P. 59-62.

92. Scheibner K. Conversion of aminonitrotoluenes by fungal manganese peroxidase / K. Scheibner, M. Hofrichter // J. Basic Microbiol. 1998. - V. 38. -P. 51-59.

93. Schnell S. Anaerobic aniline degradation via reductive deamination of 4-aminobenzoyl-CoA in Desulfobacterium anilini / S. Schnell, B. Schinck // Arch. Microbiol.-1991.-V. 155.-P. 183-190.

94. Shen C.F. Origin of p-cresol in the anaerobic degradation of trinitrotoluene / C.F. Shen, J.A. Hawari, G. Ampleman, S. Thiboutot, S.R. Guiot // Can. J. Microbiol. 2000. - V. 46. - P. 119-124.

95. Siciliano S.D. Reduction in denitrification activity in field soils exposed to long term contamination by 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) / S.D. Siciliano, R. Roy, C.W. Greer // FEMS Microbiol. Ecol. 2000.'- V. 32. - P. 61-68.

96. Sjoblad R.D. Oxidative coupling of aromatic compounds by enzymes from soil microorganisms / R.D. Sjoblad, J.-M. Bollag // Soil Biochem. 1981. - V. 5.-P. 113-152.

97. Snellinx Z. Microbial consortia that degrade 2,4-DNT by interspecies metabolism: isolation and characterization / Z. Snellinx, S. Taghavi, J. Vangronsveld, D. v.d. Lelie // Biodegrad. 2003. - V. 14. - P. 19-29.

98. Spain J.C. Biodegradation of nitroaromatic compounds / J.C. Spain // Annu. Rev. Microbiol. 1995. - V. 49. - P. 523-555.

99. Spain J.C. Biodegradation of nitroaromatic compounds and explosives / J.C. Spain, J.B. Hughes, H.-J. Knackmuss. FL: Lewis Publishers, Boca Raton, 2000.

100. Spanggord R.J. Biodegradation of 2,4-dinitrotoluene by a Pseudomonas sp. / R.J. Spanggord, J.C. Spain, S.F. Nishino, K.E. Mortelmans // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - P. 3200-3205.

101. Spencer J.F.T. Yeasts in natural and artificial habitats / J.F.T. Spencer, D.M. Spencer. Germany: Springer, 1997. - 382 p.

102. Stahl J.D. Biodegradation of 2,4,6-trinitrotoluene by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium / J.D. Stahl, S.D. Aust // In J.C. Spain (ed.), Biodegradation of nitroaromatic compounds. Plenum Press, New York, 1995. -P. 117-134.

103. Stahl J.D. Metabolism and detoxification of TNT by Phanerochaete chrysosporium / J.D. Stahl, S.D. Aust // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1993.-V. 192.-P. 477-482.

104. Stams A.J.M. The importance of autotrophic versus heterotrophic oxidation of atmospheric ammonium in forest ecosystems with acid soil / A.J.M. Stams, E.M. Flameling, E.C.L. Marnette // FEMS Microbiol. Ecol. 1990. - V. 74. -P. 337-344.

105. Stroo H.F. Heterotrophic nitrification in an acid forest soil and by an acid-tolerant fungus / H.F. Stroo, T.M. Klein, M. Alexander // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52. - P. 1107-1 111.

106. Tharakan J.P. Cometabolic biotransformation of trinitrotoluene (TNT) supported by aromatic and non-aromatic cosubstrates / J.P. Tharakan, J.A. Gordon//Chemosphere.- 1999.- V. 38.-P. 1323-1330.

107. Thiele S. Enzymatic transformation and binding of labeled 2,4,6-trinitrotoluene to humic substances during an anaerobic/aerobic incubation / S. Thiele, E. Fernandes, J.-M. Bollag // J. Environ. Qual. 2002. - V. 31. - P. 437-444.

108. Van Aken B. Biodegradation of 2,4,6-trinitrotoluene by the white-rot basidiomycete Phlebia radiata / B. Van Aken, K. Skubusz, H. Naveau, S.N. Agathos // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 813-817.

109. Vanderberg L.A Catabolism of 2,4,6-trinitrotoluene by Mycobacterium vaccae / L.A. Vanderberg, J.J. Perry, P.J. Unkefer // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V. 43. - P. 937-945.

110. Vanderford M. Phytotransformation of trinitrotoluene (TNT) and distribution of metabolic products in Myriophyllum aquaticum / M. Vanderford, J.V. Shanks, J.B. Hughes // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 277-280.

111. Vanek Т. Phytoremediation of selected explosives / T. Vanek, A. Nepovim, R. Podlipna, S. Zeman, M. Vagner // Water, Air, Soil Pollut. 2003. - V. 3. -P. 259-267.

112. Vasilyeva G.K. Bioremediation of 3,4-dichloroaniline and 2,4,6-trinitrotoluene in soil in the presence of natural adsorbents / G.K. Vasilyeva, L.P. Bakhaeva, E.R. Strijakova, P.J. Shea // Environ. Chem. Lett. 2003. - V. l.-P. 179-183.

113. Vorbeck C. Identification of a hydride-Meisenheimer complex as a metabolite of 2,4,6-trinitrotoluene by a Mycobacterium strain / C. Vorbeck, H. Lenke, P. Fischer, H.-J. Knackmuss // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 932934.

114. Vorbeck C. Initial reductive reactions in aerobic microbial metabolism of 2,4,6-trinitrotoluene / C. Vorbeck, H. Lenke, P! Fischer, J.C. Spain, H.-J. Knackmuss // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 246-252.

115. Walker J.E. Biological degradation of explosives and chemical agents / J.E. Walker, D.L. Kaplan // Biodegrad. 1992. - V. 3. - P. 369-385.

116. Wang C.-J. Interaction of 2,4,6-trinitrotolene (TNT) and 4-amino-2,6-dinitrotoluene with humic monomers in the presence of oxidative enzymes / C.-J. Wang, S. Thiele, J.-M. Bollag // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2002. -V. 42. - P. 1-8.

117. Watrous M.M. 2,4,6-Trinitrotoluene reduction by an Fe-only hydrogenase in Clostridium acetobutylicwn / M.M. Watrous, S. Clark, R. Kutty, S. Huang, F.B. Rudolph, J.B. Hughes, G.N. Bennett // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69.-P. 1542-1547.

118. Williams R.E. Biotransformation of explosives by the old yellow enzyme family of flavoproteins / R.E. Williams, D.A. Rathbone, N.S. Scrutton, N.C. Bruce II Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 3566-3574.

119. Wolper M.K. Nitroreductase activity of mammalian liver aldehyde oxidase / M.K. Wolper, J.R. Althans, D.G. Johns // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1973. - V. 185.-P. 202-213.

120. Won W.D. Toxicity and mutagenicity of 2,4,6-trinitrotoluene and its microbial metabolites / W.D. Won, L.H. Disalvo, J. Ng // Appl. Environ. Microbiol. 1976. - V. 31. - P. 576-580.

121. Yinon J. Reactions in the mass spectrometry. of a hydride Meisenheimer complex of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) / J. Yinon, J.V. Johnson, U.R. Bernier, R.A. Yost, H.T. Mayfield, W.C. Mahone, C. Vorbeck // J. Mass Spectrom. -1995.-V. 30.-P. 715-722.

122. Yinon J. Toxicity and metabolism of explosives / J. Yinon. Boston: CRC Press, 1990.- 145 p.

123. Zaripov S.A. Models of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) initial conversion by yeasts / S.A. Zaripov, A.V. Naumov, J.F. Abdrakhmanova, A.V. Garusov, R.P. Naumova // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 217. - P. 213-217.

Информация о работе

Зиганшин, Айрат Мансурович
кандидата биологических наук
Казань, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Восстановление ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола как путь его деградации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы