Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансформация 2,4,6-тринитротолуола молочнокислыми бактериями

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суворова, Елена Степановна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

имени Г. К. СКРЯБИНА

Суворова Елена Степановна Трансформация 2,4,6-тринитротолуола

молочнокислыми бактериями

03.00.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

удк 577.121.9+577.124.23+577.152.1

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН

Научные руководители:

А. М. Воронин

кандидат биологических наук А. В. Наумов

Пущино- 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. Введение 1

2. Обзор литературы 5

2.1. Восстановление арильных нитрогрупп 5

2.2. Основные пути микробного метаболизма ТНТ 7

2.2.1. Трансформация ТНТ в аэробных условиях 7

2.2.2. Трансформация ТНТ в анаэробных условиях 10

2.3. Нитроредуктазы 13

2.3.1. Кислород-нечувствительные нитроредуктазы 14

2.3.2. Кислород-чувствительные нитроредуктазы 19

2.4. Молекулярные основы токсичности нитроароматических соединений 20

2.4.1. Цитотоксичность нитроароматических соединений 22

2.4.2. Генотоксичность нитроарилов 25

3. Материалы и Методы 29

3.1. Микроорганизмы и условия культивирования. 29

3.2. Идентификацию молочнокислых бактерий. 29

3.3. НП-ПЦР Фингерпринтинг геномов и выделение тотальной ДНК лактобацилл 29

3.4. Проверка чувствительности штаммов к ТНТ 29

3.5. Эксперименты по трансформации ТНТ 3 0

3.5.1. Трансформация ТНТ клеточными суспензиями 30

3.5.2. Трансформация ТНТ суспензиями протопластов 3 0

3.5.3. Трансформация ТНТ клеточными экстрактами 31

3.6. Тест на восстановление мембранонепроницаемых

акцепторов электронов 31

3.7. Определение ферментативных активностей 31

3.8. Очистка нитроредуктаз Ь./егтепШт В83601 32 3.8.1. Нитроредуктаза 1 3 2

3.8.2. Нитроредуктаза 2 33

3.9. Определение кинетических параметров нитроредуктаз 33

3.10. Определение молекулярного веса нитроредуктаз 33

3.11. Определение типа флавиновых кофакторов 3 3

3.12. Аналитические методы 34

3.12.1. НРЬС-анализ 34

3.12.2. ТЬС-анализ 34

3.12.3. Масс-спектрометрический анализ 3 5

3.12.4. !Н-ЯМР - анализ 35

3.12.5. Химический синтез стандартов: 2-АДНТ, 4-АДНТ и ГАДНТ 35

3.13. Определение концентрации белка 3 6

3.14. 808-РААС электрофорез 36

4. Обоснование выбора объекта исследования 37

5. Результаты 39

5.1.Выделение и идентификация лактобацилл, способных трансформировать ТНТ 39

5.1.1. Идентификация изолятов с использованием классических физиолого-биохимических тестов 39

5.1.2. Использование фингерпринтинга геномов для дифференциации изолятов лактобацилл 42

5.2. Метаболизм ТНТ, ксенобиотика из класса полинитроароматических соединений 44

5.2.1. Активность трансформации ТНТ и ингибирование роста лактобацилл, осуществляющих гомо- и гетероферментативное брожение 44

5.2.2. Идентификация основных продуктов трансформации ТНТ лактобациллами 45

5.2.3. Активность оксидоредуктаз молочнокислого брожения исследуемых штаммов лактобацилл 47

5.2.4. Нитроредуктазная активность клеточных экстрактов лактобацилл 50

5.2.5. Ингибирование активности ключевых дегидрогеназ лактобацилл

под действием ТНТ и ГАДНТ 52

5.2.6. Локализация нитроредуктазной активности в клетках

Ь./егтепШт В83601 и Ь.р1агйагит В83604 53 5.3. Очистка и характеристика нитроредуктаз штамма Ь./егтепШт В83601 55

5.3.1. Выделение и очистка нитроредуктазы (НР1) из мембранной фракции 56

5.3.2. Очистка внутриклеточной нитроредуктазы (НР2) штамма

Ь. /егтеШитВ^3601 56

5.3.3. Анализ кофакторной специфичности НР1 и НР2 57

5.3.4. Влияние температуры на активность и стабильность НР1 и НР2 58

5.3.5. рН-зависимость активности НР1 и НР2 58

5.3.6. Кинетические параметры НР1 и НР2 59

5.3.7. Молекулярный вес и субъединичный состав НР1 и НР2 60

5.3.8. Ингибиторы ферментативной активности нитроредуктаз

штамма Ь. /егтепШт В83601 60

5.3.9. Определение спектра утилизуемых нитроароматических субстратов НР1 и НР2 62

5.3.10. Интермедиаты и продукты реакций нитровосстановления, катализируемых нитроредуктазами НР1 и НР2 63

6. Обсуждение результатов 65

7. Заключение 77

8. Выводы 79

9. Литература 80

Список сокращений

МКБ молочнокислые бактерии

НР1, НР2 нитроредуктазы 1 и 2, соответственно

ТНТ 2,4,6-тринитротолуол

ТНБК 2,4,6-тринитробензойная кислота

2,4-ДНТ 2,4-динитротолуол

НБ нитробензол

2-ГАДНТ 2-гидроксиламино-4,6-динитротолуол

4-ГАДНТ 4-гидроксиламино-2,6-динитротолуол

2-АДНТ 2-амино-4,6-динитротолуол 4-АДНТ 4-амино-2,6-динитротолуол 2,4-ДАНТ 2,4-диамино-6-нитротолуол 2,4-ДА-6-ГАТ 2,4-диамино-6-гидроксиламинотолуол ТАТ 2,4,6-триаминотолуол

ФГ флюроглюцин

ПГ пирогаллол

ТХУ трихлоруксусная кислота

ТТХ 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид

ТНС тетразолий нитросиний

Г-6-Ф глюкозо-6-фосфат

Г-6-ФДГ глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа

3-ФГА 3-фосфоглицеральдегид

3-Ф-ГДГ 3-фосфоглицеральдегиддегидрогеназа

Ф-6-Ф фруктозо-6-фосфат

Ф-6-ФДГ фруктозо-6-фосфатдегидрогеназа

Риб-5-Ф рибозо-5-фосфат

Ас-СоА ацетил коэнзим А

EDTA этилендиамин тетрауксусная кислота

DTT дитиотрейтол

NAD+ (NADH) никотинамидадениндинуклеотид (восстановленный)

КАОР+ (ИАБРН) никотинамидадениндинуклеотид фосфат

(восстановленный)

БАБ флавинадениндинуклеотид

БМЫ флавинмононуклеотид

4-нитрохинолин-1 -оксид

тьс тонкослойная хроматография

НРЬС высокоэффективная жидкостная хроматография

1. Введение

1.1. Актуальность проблемы. Устойчивое функционирование биосферы предполагает вовлечение химических соединений антропогенного происхождения в природные биогеохимические циклы. К числу экологически опасных, трудно-разлагаемых соединений относятся нитроароматические ксенобиотики, производство которых обусловлено использованием в ряде отраслей промышленности и сельского хозяйства. Кроме традиционного применения в качестве взрывчатых веществ, сырья и полупродуктов для производства красителей, синтетических полимеров и растворителей, они известны как избирательно токсические вещества для медицины и сельского хозяйства - лекарства и пестициды.

Одним из наиболее экологически опасных полинитроарилов является взрывчатое вещество, 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ). Проблема биодеградации ТНТ привлекла к себе особенно пристальное внимание в последние годы в связи с выявлением новых фактов загрязнения ^Ёрриторий, связанных с производством и использованием взрывчатых веществ. Даже в случае прекращения их производства, а также операций с боеприпасами, ТНТ продолжает обнаруживаться спустя 50 лет на территориях заводов соответствующего профиля и военных баз, причем его содержание достигает величин, измеряемых десятками и сотнями мг кг*1 загрязненных почв, что, в свою очередь, ведет к загрязнению грунтовых вод (Gard et al., 1995, Comfort et al., 1995).

Биотрансформация нитроароматических соединений, особенно производных бензола, толуола, полициклических углеводородов, в большинстве случаев включает в качестве первого этапа восстановление нитрогрупп. Независимо от того, имеет ли место вначале одно- или двухэлектронная атака арильных нитрогрупп, последующие этапы их полного восстановления соответствуют общей схеме (Spain, 1995):

Aryl-N02 -> Aryl-NO Aryl-NHOH -> Aryl-NH2 Наличие трех нитрогрупп у ароматического кольца ТНТ обуславливает его выраженную электрофильность, снижающуюся уже после восстановления первой нитрогруппы. Поэтому образование моноаминопроизводных ТНТ характерно

для его микробной атаки, и триада: ТНТ, 2-амино-4,6-динитротолуол (2-АДНТ) и 4-амино-2,6-динитротолуол (4-АДНТ) циркулирует в объектах окружающей среды (Pereira et al., 1979, Neumeier et al., 1990), в организме человека (Woolen et al., 1988; Liu et al., 1995), в растениях (Harvey et al., 1990). Хотя авторы нескольких работ продемонстрировали принципиальную возможность полного разложения ТНТ (Наумова с соавт., 1988, Funk et al., 1993, Bumpus, Tatarko, 1994; Michels, Gottschalk, 1994) актуальной остается проблема ограниченного воздействия многих микроорганизмов на данный ксенобиотик и факторов, ограничивающих этот процесс. Это подтверждают новые работы с использованием равномерно меченого [14С]ТНТ (Pasty-Grigsby et al., 1996, Boopathy, Manning, 1996).

Ограниченная трансформация ТНТ привлекает внимание и в связи с тем, что образование Aryl-NO и Aryl-NHOH как интермедиатов трансформации нитро-арилов может быть основой их метаболической активации, ответственной за токсические и генотоксические эффекты исходных соединений (Feifer et al, 1986, Einisto et al, 1991, Rafii et al, 1994, Neumann et al, 1995, Spanggord et al, 1995). Сравнительное изучение мутагенной активности ТНТ и устойчивых продуктов его нитровосстановления свидетельствует о вероятной генотоксичности его ре-акционноспособных интермедиатов - нитрозо- и/или гидроксиламинопроизвод-ных (Spanggord et al, 1995).

Многочисленные данные о невозможности существенной минерализации ТНТ при моделировании его биодеградации в различных условиях, с использованием разных микроорганизмов, а также неэффективность большинства известных биотехнологий в отношении рекультивации ТНТ-загрязненных территорий (Hoffsommer, Rosen, 1972, Bennett, 1995, Palmer et al, 1997, Shen et al, 1997) свидетельствуют о необходимости выявления «узких мест» на путях биодеградации данного ксенобиотика.

С учетом реальных масштабов локального и рассеянного загрязнения ТНТ, в том числе выявленного у отдельных групп населения, представляет интерес выбор в качестве модели для исследования трансформации ТНТ микроорганизмов, способных функционировать в условиях специализированных технологий реме-диации ТНТ-загрязненных почв, с использованием отходов некоторых пищевых

производств. С этих позиций заслуживают внимания бактерии, осуществляющие молочнокислое брожение органических субстратов растительного происхождения. Самостоятельный интерес представляет то, что эти бактерии входят в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных. Более того, лечебные препараты на основе живых клеток молочнокислых бактерий (пробиотики) широко используются, в соответствии с концепцией И. И. Мечникова для оздоровления человека и животных путем усиления роли данной группы микроорганизмов в составе микробных популяций пищеварительного тракта.

1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение особенностей трансформации ТНТ молочнокислыми бактериями из различных экологических ниш. Ставились следующие задачи:

• выделить из различных мест обитания молочнокислые бактерии, способные расти в присутствии ТНТ и идентифицировать их;

• выяснить возможность трансформации ТНТ полученными изолятами, изучить пути его превращения наиболее активными штаммами и идентифицировать основные метаболиты;

• оценить в исследуемых штаммах активность ключевых оксидоредуктаз молочнокислого брожения, участвующих в формировании пула восстановительных эквивалентов, потребляемых в реакциях нитроредукции ТНТ, и влияние на их активность как исходного ксенобиотика, так и продуктов его частичного нитровосстановления;

• очистить и охарактеризовать ферменты, ответственные за нитроредукцию ТНТ у наиболее активного штамма молочнокислых бактерий.

1.3. Научная новизна. Проведенное исследование впервые выявило способность микроорганизмов осуществлять практически полное (до 95-97%) превращение высоких концентраций ТНТ (400-600 мкМ) в продукты его ограниченного нитровосстановления - изомерные гидроксиламинодинитротолуолы (ГАДНТ), что несоизмеримо выше масштабов образования этих метаболитов всеми из-

вестными микроорганизмами, способными к трансформации ТНТ. Комплексное изучение возможностей трансформации данного ксенобиотика целыми клетками, клеточными экстрактами и изолированными нитроредуктазами позволило выявить лимитирующий этап в механизме трансформации ТНТ. Сущность этого «узкого места» (или одного из таких мест) заключается в ингибировании ключевых оксидоредуктаз молочнокислого брожения, ответственных за создание пула редуцирующих эквивалентов. Получены в очищенном состоянии и охарактеризованы две новые нитроредуктазы, проявляющие активность по отношению к ТНТ.

1.4. Практическая значимость. С учетом реальных масштабов локальной и рассеянной контаминации трйнитротолуолом почв и водных ресурсов, важное значение имеет прогнозирование поведения этого ксенобиотика в природных сферах и в организме человека. В этой связи могут быть использованы полученные данные о трансформации ТНТ в экологически опасные продукты его ограниченного восстановления, ответственные за проявление его генотоксических свойств. Обнаруженный в данной работе механизм торможения более глубокой трансформации ТНТ, опосредованный ингибированием ключевых оксидоредуктаз, может служить моделью при выявлении факторов, лимитирующих биодеградацию ТНТ и ответственных за неэффективность известных биотехнологий применительно к минерализации и детоксикации данного вещества.

Выявлен новый аспект реальной опасности контакта человека и животных с ТНТ, поскольку лактобациллы, трансформирующие ТНТ в метаболиты с токсическими и мутагенными свойствами, принадлежат к нормальной микрофлоре пищеварительного тракта, а также являются основой пробиотических препаратов, используемых для коррекции этой микрофлоры и для повышения иммунного статуса человека.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

В последнее время внимание большого числа исследователей направлено на решение острой экологической проблемы - ремедиации объектов окружающей среды от остатков взрывчатых смесей и продуктов их трансформации в естественных условиях. К самым распространенным соединениям этого ряда относятся нитрозамещенные ароматические соединения, такие как тринитротолуол (ТНТ), тринитробензойная кислота (ТНБК), тринитрофенол или пикриновая кислота (ТНФ), К-метил->1,2,4,6-тетранитроанилин (TETRIL), 2,2',4,4',6,6'-гексанитро-дифениламин (HEXIL). Загрязнение окружающей среды соединениями аналогичной природы происходит также при производстве и использовании пестицидов, лекарств, красителей.

Недавние исследования выявили ряд микробных систем, осуществляющих трансформацию или полную минерализацию нитроараматических соединений. Однако, как отмечено в обзоре Спейна (Spain, 1995), процесс биодеградации этого класса ксенобиотиков требует преодоления ряда барьеров, обусловленных: а) - токсичностью нитроароматических соединений для микроорганизмов, б) - их низкой растворимостью и высокой сорбционной способностью, в) - одновременным присутствием, смеси нитроароматических соединений и г) - отсутствием в микробных сообществах специфических катаболических систем для эффективной деградации нитроароматических ксенобиотиков. Однако, тот факт, что нитроорганические соединения встречаются в природе, например, хлорамфени-кол, пиролнитрин, нитроспорин, 3-нитропропионовая кислота и соответствующий спирт, может влиять на адаптацию микроорганизмов и их способность к деградации аналогичных по природе ксенобиотиков.

За последние несколько лет интенсивные исследования биоразложения нитроароматических соединений привели к значительному прогрессу в понимании микробных механизмов деградации этого класса ксенобиотиков.

2.1. Восстановление арильных нитрогрупп. Первоначальная ферментативная (или микробная) атака полинитроароматических соединений может затрагивать как нитрогруппы, так и ароматическое кольцо. Однако, в биологических систе-

мах наиболее распространен механизм нитровосстановления. Вероятно большинство живых организмов способны катализировать трансформацию арильных нитрогрупп, чему во многом способствуют особенности ее химии.

Нитрогруппа существует как резонансный гибрид. Поскольку атомы кислорода являются более электроотрицательными, чем атом азота, поляризация N-0 связи является причиной того, что атом азота в составе нитрогруппы несет частичный положительный заряд и выступает как электрофил. Поэтому, самое общее направление атаки нитрогрупп в биологических системах - это их восстановление (рис.1) (Spain, 1995). Нитрогруппы и аминогруппы относительно стабильны. Однако, в результате промежуточных реакций восстановления нитрогруппы до аминогруппы образуются реактивные интермедиаты - нитрозо- и гид-роксиламинопроизводные. Они настолько электрофильны, что могут взаимодействовать с биомолекулами, вызывая токсический, канцерогенный и мутагенный эффекты.

N+ I

R

V"

R

1ё

о;

а; р

N

R

О,

ё/Н+

2ё/Н+

V н\ /ОН

„ Y 2ё/2Н» Y 2ё/Н+э L\

mi. r R 4 R

ОН * ОН"

V

Рис.1. Восстановление нитрогрупп по одноэлектронному и двухэлектронному механизмам (Spain, 1995).

Известны два основных механизма первоначального нитровосстановления, одно- и двухэлектронный. Одноэлектронное восстановление нитрогрупп приводит к образованию нитроанионного радикала, который в аэробных условиях окисляется кислородом до исходной молекулы с образованием супероксида.

Восстановление нитрогрупп путем последовательного присоединения пар электронов, донорами которых обычно служат восстановленные пиридиннукле-

отиды, происходит с накоплением или промежуточным образованием нитрозо-, гидроксиламино- и аминопроизводных соответствующих соединений.

Доступность нитрогрупп для восстановительной атаки зависит от их количества у ароматического кольца, природы и