Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генотоксические эффекты 2,4,6-тринитротолуола и его метаболитов: Роль процессов биотрансформации
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Генотоксические эффекты 2,4,6-тринитротолуола и его метаболитов: Роль процессов биотрансформации"
г он
На правах рукописи
КАРАМОВА Назира Сунагатовна
ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ 2,4.6 - ТРИНИТРОТОЛУОЛА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ: РОЛЬ ПРОЦЕССОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ
03. 00. 07 - микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
КАЗАНЬ -1996
Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферменте Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина
Научные руководители: академик АН РТ,
доктор биологических наук, профессор И.Б. Лмцинская
кандидат биологических наук, доцент О.Н. Ильинская
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, доцент В.В. Семенов (Казанский государственный медицинский институт)
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник АЛ. Еремина
(Институт экологии и генетик микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь)
Ведущая организация: Институт общей генетики
им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва
Защита диссертации состоится " 1996 г. в часов на заседай
диссертационнго Совета К 053.29.19. при Казанском государственн университете им. В.И. Ульянова-Ленина, 420008 г. Казань, ул. Ленина, 18.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственн« университета
Автореферат разослан " " 1996 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета,
кандидат биологических наук А.Н. Аскар*
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Одной из важнейших проблем современности является загрязнение окружающей среды факторами, способными оказывать негативное влияние на генетический аппарат клеток. Особый риск представляют собой химические соединения в силу их разнообразия и специфичности генотоксичесхого действия.
2,4,6-Тринитротолуол (ТНТ) - представитель класса ароматических нитросоединений, используемый при производстве взрывчатых веществ. ТНТ относится к числу опасных и труднодоступных для биодеградации неприродных соединений. В настоящее время хорошо изучены некоторые закономерности микробного метаболизма ТНТ, что обусловлено поиском эффективных путей биодеструкции данного соединения (Наумова, 1985; Kaplan, 1992; Preuss et at., 1993; Marvinsikkema and Debont, 1994). Установлено, что ТНТ оказывает выраженное токсическое действие на организмы разного уровня, может вызывать тяжелые осложнения и нарушения некоторых физиологических функций у млекопитающих (Levine et di., 1990; Ryoii and Ross, T95Q>. Несмотря на то,- что имеются отдельные факты, свидетельствующие о способности ТНТ индуцировать мутации в Salmonella typhimurium (Won et al, 1976; Spanggord et al., 1982, Tan et al., 1992), природа генотоксического действия данного соединения изучена недостаточно.
Представляет значительный интерес оценка роли ферментных реакций, вовлеченных в метаболизм ТНТ, в генотоксичности данного соединения. Особого внимания заслуживает исследование мутагенной активности отдельных интермедиатов биотрансформации ТНТ.
Практически неизученным остается вопрос об участии репаративных систем клетки, и в особенности "ошибочной" SOS-репарации, в мутагенном действии ТНТ.
На сегодняшний день имеется лишь ограниченное число противоречивых по своему характеру данных, касающихся генотоксичности ТНТ в клетках млекопитающих, хотя необходимость такой информации для понимания механизмов биологических эффектов ТНТ очевидна.
Цель и задачи и исследования
Данная работа проведена с целью оценки генотоксическог потенциала ГОТ в динамике бактериальной трансформации ¡ характеристики генотоксцчеекого действия рада его метаболитов в сери тест-систем in vitro и in vivo.
У соответствии с поставленной целью были определены следую щи задачи:
1. Изучить характер трансформации ТНТ клетками S. typhimurium.
2. Оценить мутагенный потенциал ТНТ и его метаболитов н тестерных штаммах S. typhimurium.
3. Изучить динамические изменения мутагенной активности ТНТ процессе бактериального метаболизма.
4. Исследовать роль бактериальных нитроредуктаз, ацетилтрансфераз ; цитохром P-450-зависимой системы ферментов млекопитающих мутагенезе, индуцируемом ТНТ в S. typhimurium.
5. Определить способность ТНТ и его метаболитов индуцировать SOS ответ в клетках Е. coJi.
6. Изучить возможность генотоксического действия ТНТ в клетка млекопитающих в системе in vivo.
Научная новизна работы. Впервые изучена динамика процесс трансформации ТНТ клетками S. typhimurium. Показано, что метаболическа активность тестерных штаммов ТА 100 и ТА 98 существенно отличается с таковой у штаммов, дефектных по "классическим" нигроредуктазам (ТА 10 NR) и О-ацетилтрансферазе (ТА 100/1,8 DNPg). Изучен характер начальны этапов трансформации ТНТ клетками тестерных штаммов S. typhimurium, качестве мажорного метаболита идентифицирован 2-амино-4,( динитротолуол. Оценена способность клеток различных штаммов ¿ typhimurium сорбировать (поглощать) ТНТ, доказана обусловленность этот процесса метаболической активностью тестерных штаммов и, в части осп активностью ферментов нитроредукции.
Установлено, что ключевую роль в мутагенезе, индуцируемом ТНТ клетках S. typhimurium, играют "классические" нитроредукгазы и С ацетилтрансфераза.
Проведена сравнительная оценка мутагенной активности пят идентифицированных интермедиатов бактериального метаболизма ТНГ
Впервые оденет генотоксическая активность безазоотстого метаболита ТНТ фенольной природы - фяороглкщина. Установлено, что среди идентифицированных производных ТНТ генотоксический эффект наиболее выражен у 2-амино-4,6-динитротолуола - мажорного метаболита начальных этапов трансформации ТНТ клетками S. typhimurium.
Впервые показано, что ТНТ и его метаболиты не проявляют выраженной SOS-индуцирующей активности в клетках Е. coli PQ 37. Таким образом, мутагенез, индуцируемый ТНТ в клетках бактерий, можно рассматривать как гес Л-независимый.
С помощью микроядерного теста in vivo получены новые результаты, свидетельствующие о возможности генотоксического действия ТНТ в • организме млекопитающих.
Практическая ценность работы. Результаты исследования генотоксичности ТНТ и его производных позволяют дать конкретные рекомендации по прогнозированию генетической опасности данных соединений и могут быть использованы при обосновании подходов к разработке практических методов, направленных на ограничение генотоксических эффектов ароматических шмросоединений.
Проведенные исследования вносят практический вклад в методику тестирования потенциальных мутагенов, подчеркивая необходимость знаний о биотрансформации исследуемого соединения. в оценке его генотоксического потенциала.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на VII Межреспубликанской Научной Конференции ВУЗов "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений" (Казань, 1994), на I Республиканской Научной Конференции "Актуальные экологические проблемы республики Татарстан" (Казань, 1995), на Итоговой Научной Конференции КГУ (1995), на VII Европейском Конгрессе по Биотехнологии (Франция, Ницца, 1995), на Международном Симпозиуме "Beijerinck Centennial. Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications" (Нидерланды, Гаага, 1995), на Международной конференции "Environmental Pollution (ICEP* 95) (Санкт-Петербург, 1995).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследуемые соединения. ТНТ получен из Научно-производственного объединения "Азот" (г. Казань). Для дополнительной очистки ТНТ перекристаллизовывали из этанола. Чистоту соединения контролировали ТСХ и по ИК-спекгру поглощения (Stewart et al., 1986). 2-Амино-4,6-динитротолуол (2АДВД), 4-амино-2,6-динитротолуол (4АДНТ), 2,4-дизмино-б-шгтротолуол (2,4-ДА6НТ) предоставлены Лабораторией Экологической Биотехнологии КГУ (г. Казань). Флороглюдин (ФГ), пирогаллол (ПГ) - производства (Serva, FRG).
Бактериальные штаммы. В работе использованы тестерные штаммы S. typhimurium ТА 98 (hisD3052 rfa AuvrB bio - pKm 101) и ТА 100 (hisD3052 rfa AuvrB bio - pKm 101), полученные из Института по БИХС, г. Купавна; ТА 100NR (дефектен по "классическим" нитроредуктазам), ТА 100/1,8DNPe (дефектен по О-ацетилтрансферазе), любезно предоставленные Dr. Н. Hayatsu, Okayama University, Japan; E. coli PQ 37 (F* ihr leu his-4 pyrD galE galK or galT lacAU169 sri300::Tnl0 rpoB rpsL uvrA rfa trp::Muc+ sfiAr.Mua (Ap,lac)cts), wp 2 (tip- E), pol A-(hp- 65 sul malBpolA), uvr A-(trp-65 sul uvrA155), lex A- (C 561 trp- E lex A), rec A" (tip- 65, тес А), полученные из ГосНИИ Генетики, г. Москва.
При изучении . трансформации ТНТ клетки S. typhimurium экспоненциальной фазы роста (концентрация клеток 10s - 109 кл/мл) инкубировали в минеральной среде на основе солевого концетрата (Stm) (Фонштейн с соавт., 1985): 100 мл Stm, разбавленного дистиллированной водой 1:1, 0.4 мл 2% раствора MgS04, 5 мл 40% раствора глюкозы Определение ТНТ в культуральной жидкости проводили по методу, описанному Лурье и Рыбниковой (1974). Для определения арилашшог использовали колориметрический метод, основанный на цветной peaкцш ариламинов с jj-диметиламинобензальдегидом (Наумова с соавт., 1986) Идентификацию метаболитов ТНТ осуществляли методоми ТСХ нг пластинках "Silufol UV-254" и ИК-слектроскопии эфирных экстрактет культуральной жидкости. ИК-спектры поглощения регистрировали h¡ спектрофотометре Specord М 80, совмещенном с компьютером PC/AT.*
* - Работа выполнена совместно с профессором А.й. Фгапманом i доцентом А.И. Скворцовым (кафедра общей физики Казанскоп государственного университета).
Тест Эймса и тест SalmoneHa/мггкросомы проводили согласно методическим указаниям Maron and Ames (1983) на штаммах S. typhimurium ТА 98, ТА 100, ТА 100NR и ТА 100/1,8DNP6. Для метаболической активации in vitro использовали шпсросомную активирующую смесь (MAC) на основе S9 фракций печени крыс и плаценты человека, предоставленных Институтом экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь. О мутагенной активности судили по кратности превышения числа his+ ревертантов, индуцированных исследуемым соединением над спонтанным фоном мутирования (более чем в два раза) и наличию дозо-зависимого эффекта.
SOS-хромотест. SOS-индуцирующую активность исследуемых соединений изучали на штамме Е. coli PQ 37 по методу, описанному Quillaidet and Hofhimg (1985). SOS-оггвет, индуцируемый исследуемым соединением, расценивали как положительный при наличии дозо-зависимого эффекта и факторе индукции SOS-ответа IF > 1.5.
Гест на ДНК-повреждаюшую активность основан на сравнительной оценке выживаемости штамма Е. coli wp 2 и дефектных по ферментам репарации штаммов pol A", rec A", lex A', uvr А". В работе использована суспензионная модификация теста. О ДНК-повреждающей активности исследуемого соединения судили по индексу выживаемости, I, представляющему собой отношение выживаемости мутантных бактерий к выживаемости бактерий дикого типа в % (Абилев и Порошенко, 1986).
Микрояаерный тест на эритроцитах периферической крови мышей СВАхС5713 L/G проводили согласно методическим указаниям, описанным Shmid (1975), Журковым с соавт. (1986).
Статистическая обработка результатов. Результаты теста Эймса обрабатывали с помощью программы "AMES", разработанной А.Н. Ильинским для персональных компьютеров. Статистическую обработку результатов остальных экспериментов проводили согласно общепринятым методам (Плохинский, 1978).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Трансформация ТНТ тестерными штаммами & typhimurium.
Для изучения процесса трансформации ТНТ клетками S. typhimurium использованы штаммы ТА 100, ТА 98, 100NR, ТА 100/1,8 DNP6. Выбор
s
штаммов был обусловлен их применением в качестве тест-объектов при исследовании мутагенной активности ТНТ.
Как видно из рис. 1А, тестерные штаммы ТА 100 и ТА 98 за 3 часа инкубации трансформируют до 95 % ТНТ (исходная концентрация 100 мкг/мл). При этом в среде культивирования происходит постепенное накопление ариламинов (рис. 1Б).
Рис. 1 Динамика трансформации ТНТ (исходная концентрация 100 мкг/мл) (А) и образования ариламинов (Б) тестерными штаммами £ typhimurium ТА 98 (~~ А ), ТА 100 о~ ), ТА 100 NR
( — .—), ТА 100/1,8 DNP6 (-4- ).
Штамм ТА 100NR, дефектный по "классическим" ншроредуктазам трансформировал лишь около 30 %, а штамм ТА 100/1,8 DNP« около 50 5 ТНТ, содержащегося в инкубационной среде (рис. 1А). Концентраци образующихся ариламинов была очень низкой и составляла всего 1-мкт/мл (рис. 1Б). В ИК-спектрах экстрактов культуральной жидкости пр инкубации клеток штаммов ТА 100NR и ТА 100/1,8 DNP6 с ТН интенсивные полосы поглощения, характерные для ТНТ (705, 719, 735, 76< 768, 794 см"1 - рис.2а), сохранялись в течение всего периода инкубацш Полученные результаты доказывают необходимость участия ферменте нитроредукции в метаболизме ТНТ клетками S. typhimurium.
Как видно из рис. 3, ЯК-спектры экстрактов культуральной жидкое-) в динамике биотрансформации ТНТ штаммом S. typhimurium ТА К характеризуются наличием полос поглощения, соответствующих 2ДДВ (рис. 26). Таким образом, трансформация молекулы ТНТ клетка?.»
А
5
30 60 90 120 150 180
Время, мин.
0 30 60 90 120 150 180 Время, пин.
Оптическая плотность
72?
Опга*есез.я плотность
о о
о и
735
0.4
зГ35 ¡I °-3
g S 0.25
0.2 0.15
Ji
0.3
a É 0^5
и ^
I § 0.15
J § 0.1
0.05
0.6
0.35 -'------
650 700 750 800 850
Волновое число, си"'
Рис. 3 ИК- спектры эфирных экстрактов культур алькой жидкости в динамике трансформации ТНТ клетками тесгерного штамма £ (урЫтигшт ТА 100. (а - 5 мин., б- 20 мин., в - 40 мин., г - 60 мин.)
S. typhimurium начинается с восстановления нитрогруппы в о-положении. 2АДНТ является мажорным метаболитом первых этапов биотрансформации ТНТ клетками S. typhimurium, хотя качественный анализ эфирного экстракта культуральной жидкости методом ТСХ позволил выявить образование еще двух метаболитов, Rf которых соответствовали 4АДНТ и 2ДЦА6НТ. Наши результаты находятся в согласии с данными других авторов, свидетельствующими о преобладании 2АДНТ по сравнению с другими аминопроизводными, образующимися при метаболизме ТНТ Е. coli (Наумова с соавт., 1983), Pseudomonas dettifrificans (Наумова с соавт., 1982), Phanerochaefe chrysosporium (Stahl and Aust, 1993).
2. Мутагенная активность ТНТ на S, typhimurium роль
метаболизирующих ферментов Исследование мутагенной активности ТНТ на тестерных штаммах S. typhimurium ТА 98 и ТА 100 показало, что соединение индуцирует генные мутации типа замены пар оснований и сдвига рамки считывания, вызывая значительное дозо-зависимое превышение над спонтанным фоном мутирования: до 5 раз на штамме ТА 98 и 11 раз на штамме ТА 100 (рис. 4).
600
fr
1 500 .5 \ 400 М и
о | зоо
II200
I100
Рис.4 Мутагенная активность ТНТ на штаммах S. typhimurium ТА 98 и ТА 100 (1). К-контроль; концентрации ТНТ: 0.1, 1, 10, 100 мкг/чашку. 2 - Вариант с метаболической активацией in vitro MAC на основе S9 фракции печени крыс. * - Р<, 0.05, ** - Р 5 0.05.
Полученные результаты, характеризующие мутагенный эффект ТНТ на S. typhimurium, согласуются с данными других авторов (Won et al., 1976; Spanggord et al., 1982; Tan et al., 1992).
Известно, что важную роль в метаболизме ксенобиотиков в организме млекопитающих играет цитохром P-450-зависимая система ферментов. Для выяснения значения данной системы в мутагенном действии ТНТ нами был изучен эффект ТНТ на тестерных штаммах S. typhimurium в присутствии микросомной активирующей смеси (MAC) на основе S9 фракций печени крыс и плаценты человека. Установлено, что S9 фракция плаценты человека практически не модифицирует мутагенный потенциал ТНТ (число колоний his+ ревертантов, индуцированных ТНТ в концентрации 100 мкг/чашку в 3.86 раза превышает спонтанный фон мутирования доя штамма ТА 98 и в 10.8 раз для штамма ТА 100). В то же время MAC на основе S9 фракции печени крыс значительно снижает мутагенную активность исследуемого соединения (рис.4).
Таким образом, трансформация ТНТ микросомными ферментами млекопитающих в системе in vitro не сопряжена с образованием более мутагенных интермедиатов ТНТ, напротив, некоторые ферментные реакции вероятно даже способствуют инактивации исходного соединения или продуктов его бактериального метаболизма. Обнаруженные нами различия в степени ингибирования мутагенного эффекта ТНТ S9 фракциями печени крыс и плаценты человека очевидно обусловлены видовыми и тканевыми различиями в метаболизме ксенобиотиков.
Далее нами был изучен эффект ТНТ на штаммах S. typhimurium ТА 100NR и ТА 100/1,8DNPg, дефектных соответственно по "классическим" нитроредуктазам и О-ацетилтрансферазе - ферментам, играющим важную роль в метаболизме нитроаренов (Rosenkranz et al., 1982; McCoy et a/., 1983). ТНТ в исследованном диапазоне концентраций не проявил мутагенного эффекта на штамме ТА 100NR. Штамм ТА 100/1,8 DNPg также был нечувствителен к действию ТНТ. Число колоний his+ ревертантов, индуцированных ТНТ, практически не превышало спонтанный фон мутирования (рис.5). Полученные результаты доказывают вовлеченность бактериальных нитроредуктаз и ацетилтрансфераз в генотоксическое действие ТНТ.
MAC на основе S9 фракции печени крыс не модифицировала эффект ТНТ на штаммах S. typhimurium ТА 100NR и ТА 100/1,8 DNP6 (рис. 5), чтс еще раз свидетельствует о превалирующей роли бактериальных ферментов е метаболической активации данного соединения. В связи с этим
представлялось интересным оценить мутагенную активность ТНТ в динамике бактериальной трансформации.
ТНТ, мкг/чашку
Рас. 5 Эффект ТНТ на штаммах S. typhimurium ТА 100 NR (— в—) и ТА 100/1,8 DNP$ (— А— ) без метаболической активации и в
присутствии S9 фракции печени крыс: ТА 100 NR (-о— ),
ТА 100/1,8 DNP6 (— А — ).
Нами установлено, что мутагенный эффект культуральной жидкости при культивировании клеток тестерного штамма ТА 100 S. typhimurium в присутствии ТНТ имеет тенденцию к повышению. В условиях наших экспериментов тис активности наблюдался через 80-100 мин. после начала инкубации. Далее происходит некоторое снижение мутагенной активности. Такое изменение генотоксического эффекта культуральной жидкости, очевидно обусловлено качественным и количественным соотношением интермедиатов, образующихся при метаболизме ТНТ.
3. Сравнительная оценка мутагенной активности метаболитов ТНТ.
В работе исследована мутагенная активность трех аминопроизводных ТНТ: 2АДНТ, 4АДНТ, 2,4ДА6НТ и двух метаболитов ТНТ фенольной природы: флороглюцина (ФГ) и пирогаллола (ПГ).
Как отмечалось выше, 2АДНТ является преобладающим метаболитом начальных этапов трансформации ТНТ S. typhimurium. В связи с этим,
представлялось особенно важным изучение возможности генотоксического действия данного соединения.
2АДНТ в тесте Эймса вызывал значительное превышение числа колоний his+ ревертантов над спонтанным фоном мутирования тестерных бактерий: до 11 раз на штамме ТА 98 и до 14 раз на штамме ТА 100 (рис. 6). Обнаруженный эффект носит дозо-зависимый характер. В наивысшей из исследованных концентраций (100 мкг/чашку) наблюдается некоторое снижение мутагенной активности 2АДНТ, что обусловлено токсическим действием соединения на тестерные штаммы. Интересно отметить, что MAC на основе S9 фракции печени крыс значительно снижала обнаруженный мутагенный эффект 2АДНТ.
В отличие от 2АДНТ, продукт восстановления нитрогруппы в р-ноложении - 4АДНТ оказывал лишь незначительный мутагенный эффект на штаммы S. typhimurium независимо от присутствия MAC.
Результаты исследования 2,4ДА6НТ в тестах Эймса и Salmonella/мжросомы показывают, что соединение в исследованном диапазоне концентраций ивдуцирует генные мутации в S. typhimurium -среднее число his+ ревертантов превышало спонтанный фон мутирования до 3-х раз, что свидетельствует о слабой мутагенной активности соединения. MAC способствовала инактивации исследуемого соединения -
1400
0 0.01 0.1 1 10 2 АДНТ.икт / чашку
10 100
Рис. 6 Мутагенная активность 2АДНТ на штаммах
S. typhimurium ТА 98 (-А- ), ТА 100 (-•-) без
метаболической активации in vitro и в присугсгиш S9 фракции печени крыс: ТА 98 ( Д ), ТА 100 ( о ).
в данном варианте мы не наблюдали выраженного мутагенного эффекта 2.4ДА6НТ.
Исследование мутагенной активности ПГ и ФГ представляло особый интерес, поскольку эти соединения, в отличие от предыдущих, являются безазотистыми метаболитами ТНТ. Возможность образования данных метоболитов была показана при исследовании биодеструкции ТНТ штаммом Pseudomonas fluorescein В-3468 (Наумова с соавт., 1988) и Phanerochaete chrysasporium (Funk et at, 1993).
Результаты наших исследований показывают, что ФГ практически не оказывает мутагенного действия на тестерные штаммы S. typhimurium. Другой метаболит фенолъной природы - ПГ индуцирует обратные мутации к шстидиновой лрототрофности в клетках тестерных штаммов S. typhimurium, демонстрируя дозо-зависимый эффект. Вероятно, освобождеш!е молекулы ТНТ от нитрогрупл определяющее, но не достаточное условие для полной генотоксической инактивации соединения.
4. ДНК-повреждающая активность ТНТ.
При сравнительном анализе выживаемости штаммов Е. coli, дефектных по определенным ферментам репарации, установлено, что ТНТ в исследованных концентрациях оказывает ингибирующее действие на рост всех тестерных штаммов (табл. 1). Но эффект наиболее выражен для штаммов uvrA" и pol А", мутантных по генам, кодирующим синтез важнейших ферментов системы эксцизионной репарации ДНК.
Таблица 1
ДНК-повреждающий эффект ТНТ
Штаммы ТНТ, мкг/мл
5 50
Выживаемость, % I Выживаемость, % I
wp 2 80.6 66.8
ют А" 56.0 0.69 34.0 0.50
pol А* 70.5 0.87 45.8 0.69
гсс А" 67.5 0.83 50.5 0.75
lex А" 71.0 5788 58.4 0.87
Примечание. I - индекс выживаемости
ТНТ также оказывал негативное влияние на рост штамма гес А", хотя в данном случае эффект был несколько ниже, чем для uvr А- и pol А~ мутантов. Следует отметить, что наименее чувствительным к действию ТНТ оказался штамм, дефектный по гену lex А, кодирующем синтез белка Lex А, репрессора всех генов, контролирующих SOS-ответ клетки. Итак, результаты наших исследований свидетельствуют, что ТНТ в основном индуцирует повреждения ДНК, которые не могут быть устранены из-за дефектов в системе эксцизионной репарации (в частности недостаточность Uvr АВС-нуклеазы и ДНК-полимеразы I) и, как следствие, оказывают негативное влияние на жизнеспособность клеток тестерных бактерий.
5- SOS-индуцирующий эффект ТНТ и его метаболитов.
Индукция мутаций под действием химических соединений предполагает два основных механизма: гес ^-зависимый и гес А-независимый (Quillardet and Hofnung, 1988). гес ^-независимый мутагенез является следствием повреждений ДНК, которые ведут непосредственно к ошибкам в спаривании оснований. Вместе с тем некоторые типы повреждений ДНК индуцируют SOS-ответ, объединяющий целый каскад внутриклеточных реакций, в том числе и "ошибочную" SOS-репарацию. Одним из важнейших последствий SOS-осшета является гес .¿-зависимый, или SOS-мутагенез (Kushner, 1989). Способность ТНТ и его метаболитов индуцировать SOS-ответ клетки, оценивали в SOS-хромотесте на штамме Е. coli PQ 37. ТНТ ни в одной из исследованных концентрациях не обладал выраженной SOS-ицдуцирующей активностью. SOS-ответ клеток Е. coli PQ 37 на действие ТНТ в исследованном диапазоне концентраций не является дозо-зависимым. Наивысший фактор индукции (IF) для ТНТ (5 мкг/мл) равен 1.8. Для сравнения: IF для митомицина С (2 мкг/мл) равен 17.5.
Метаболиты ТНТ - 2АДНТ, 4АДНТ, 2,4-ДАНТ, ФГ и ПГ в исследованном диапазоне концентраций также продемонстрировали слабую SOS-индуцирующую активность в клетках Е. coli PQ 37. Практически во всех случаях IF был меньше 1.5. Некоторым исключением является 4ДАНТ - IF для этого соединения несколько выше 1.5, однако обнаруженный эффект не является дозо-зависимым.
Суммируя результаты исследования ТНТ и его метаболитов в SOS-хромотесте, мы склонны считать, что SOS-репарация не играет
значительной роли в генотоксичеком действии исследуемых соединений, следовательно, мутагенез, индуцируемый ТНТ в клетках бактерий, не является гес yl-зависнмым,
б.Генотоксичность ТНТ в клетках млекопитающих т vivo.
Для определения возможности генотоксического действия ТНТ в организме млекопитающих нами был использован микроядерный тест на эритроцитах периферической крови мышей линии СВАхС5713 L/G. Микроядра представляют собой ацентрические фрагменты, образующиеся в результате структурных нарушений хромосом. Считается, что частота индукции микроядер отражает частоту хромосомных аберраций (Абилев и Порошенко, 1986; Ильинских с соавт., 1992). Результаты исследования ТНТ в микроядерном тесте представлены на рис. 7.
Рас. 7 Частота индукции микроядер в эритроцитах периферической крови мышей линии СВАхС5713 L/G при действии ТНТ (5, 10, 20 мг/кг). * - Ps 0.05, ** - Р<, 0.001.
ТНТ в исследовашгом диапазоне концентраций вызывал дозо-зависимое повышение частоты индукции микроядер в эритроцитах периферической крови мышей линии СВАхС5713 L/G. Количество микроядер (на 1000 эритроцитов), индуцированных ТНТ в наивысшей из исследованных концентраций, в 4 раза превышало спонтанный уровень индукции микроядер. Установлено, что эффект ТНТ наиболее выражен через 48 ч. после введения соединения животным. В целом результаты микроядерного теста свидетельствуют о возможности генотоксического действия ТНТ в клетках млекопитающих in vivo.
16
□ к £3 5
о
48
Время, ч.
ВЫВОДЫ
1. ТНТ индуцирует генные мутации тина замены пар оснований и сдвига рамки считывания в клетках S. typhimurium, вызывая значительное дозо-зависимое превышение над спонтанным фоном мутирования.
2. Мутагенный эффект ТНТ при метаболизме S. typhimurium подвержен динамическим изменениям, что свидетельствует об определяющей роли процессов биотрансформации в проявлении тенотоксических свойств исследуемого соединения.
3. Трансформация ТНТ тестерными штаммами S. typhimurium ТА 98 и ТА 100 осуществляется при участии ферментов нитроредукщш. Первым этапом процесса является восстановление нитрогруппы в о-положении с образованием мажорного метаболита 2АДНТ. 4АДНТ и 2,4ДА6НТ идентифицированы в качестве минорных метаболитов начальных этапов трансформации ТНТ.
4. "Классические" нитроредуктазы и О-ацетилтрансфераза играют ключевую роль в мутагенезе, индуцируемом ТНТ у бактерий. Мутагенный эффект ТНТ практически не изменяется в присутствии S9 фракции плаценты человека и значительно снижается под действием микросомных ферментов печени крыс.
5. Мутагенный потенциал в ряду, исследованных метаболитов ТНТ убывает последовательно: 2-амино-4,б-динитротолуол—► 2,4-диамино-б-нитротояуол —И-амино-2,6-динитротолуол—пирогаллол—» флороглюцин.
6. Мутагенез, ивдуцирумый ТНТ в клетках бактерий, можно рассматривать как гес-Л-независимый, поскольку ТНТ и его метаболиты не проявляют выраженной SOS -индуцирующей активности в клетках Е. coli PQ 37.
7. ТНТ вызывает дозо-зависимое повышение частоты индукции микроядер в эритроцитах периферической крови мышей линии СВАхС5713 L/G, что свидетельствует о возможности генотоксического действия соединения в клетках млекопитающих гп vivo.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Карамова Н.С., Ильинская О.Н., Иванченко О.Б. Мутагенная активность 2,4,6-тринитротолуола: роль метаболизирующих ферментов. // Генетика. - 1994, - Т. 30. - N 7. - С. 898-907.
2. Добровольская М.А., Карамова Н.С., Черепнев Г.В. Микроядерный тест в оценке стабильности генома, / Тезисы докладов VII Межреспубликанской научной конференция ВУЗов "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений, Казань,1994. - С. 87-88.
3. Ilinskaya O.N., Karamova N.S., Ivanchenko О-В. Metabolism and mutagenicity of 2,4,6-TNT in Salmonella. /Abstr. 7th Eur.Congr. on Biotechnol., Nice, Feb. 19-23, 1995.-Vol.4.-P.97.
4. Ильинская О., Иванченко О. Б., Карамова Н. С., Черепнева И. Е. Оценка генотоксичности в экологическом мониторинге природных комплексов Татарстана / Материалы I Республиканской научной конференции "Актуальные экологические проблемы республики Татарстан", Казань. - 1995. - С. 190.
5. Карамова Н.С., Минина И.И., Гараева Г.Г., Иванченко О.Б., Ильинская О.Н. 2,4,6-Тринитротолуол и 2,4-диамино-6-нитротолуол: отсутствие лесЛ-зависимого мутагенеза? // Генетика. - 1995, - Т. 31. - N 5. -С. 617-621.
6. Ilinskaya О., Karamova N., Ivanchenko О. 2,4,6-Trinitrotoluene: mutagenicity and metabolism in Salmonella / Abstr. of the 1995 International Co-Conference on ICEP'95-ICONE'95, 17-24 My 1995, St.Petersburg, Russia.-P.18.
7. Karamova N., Ilinskaya O., Ivanchenko O. 2,4,6-Trinitrotoluene: genotoxicity on E. coli PQ 37 (SOS chromotest) / Abstr. of Beijerinck Centennial. Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications, 10-14 December 1995, The Hague, The Netherlands. - P. 538-539.
8. Ильинская O.H., Иванченко О.Б., Карамова Н.С., Ремизов А.Б., Скворцов А.И., Фишман А.И. Зависимость величины индуцированного 2,4,6-тринитротолуолом мутагенеза от физиологического состояния тестерных штаммов Salmonella typhimurium. // Микробиология (принято к печати 12.10.1995).
Автор глубоко признателен своим научным руководителям академику АН РТ профессору И.Б. Лещинской, доценту О.Н. Ильинской за неоценимую помощь в создании настоящей работы и выражает искреннюю благодарность профессору А.И. Фишману, доценту А.И. Скворцову за интересные идеи и совместную работу.
- Карамова, Назира Сунагатовна
- кандидата биологических наук
- Казань, 1996
- ВАК 03.00.07
- Начальные этапы микробного метаболизма 2,4,6-тринитротолуола
- Изменение биологической активности чернозема выщелоченного при внесении 2,4,6-тринитротолуола
- Генотоксические эффекты 2,4,6-тринитротолуола и его метаболитов: роль процессов биотрансформации
- Участие активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола
- Биодеградация 2,4,6-тринитротолуола клетками дрожжей Yarrowia lipolytica в присутствии ферригидрита и в условиях полунепрерывного режима культивирования