Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация микробных тест-систем для скрининга на генотоксичность химических соединений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Модификация микробных тест-систем для скрининга на генотоксичность химических соединений"

п КИЕШСТЕРШО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ

и 3- ОДзляб'инский государственный вздецинсквй янстнтдт

^ < ,„„1>АЕВА Людмила Павловна

УДК 579.253.44:47—575.224.46.044:6—57.086.132

На правах рзкапкса

( I I

МОДИФИКАЦИЯ МИКРОБНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ СКРИНИНГА НА ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИИ

03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертация, на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь — 1993

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук ст. н. с. Демаков В. А.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Бухарин О. В.; доктор медицинских наук, профессор Квндрашова 3. Н.

Ведущее учреждение: Институт микробиологии РАН.

Защита состоится- _ 1994 г.

в_часов на заседании специализированного совета

К.084.04.03 по присуждению степени кандидата биологических наук Челябинского государственного медицинского института по адресу: 454 092, Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться ,в библиотеке Челябинского медицинского института.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Проблема научно обоснованной охраны природной среды в настоящее время признана одной из наиболее актуальных для человечества [Алпатьев А.И., 1983; Лекявичус Р. К., 1983]. Чтобы оградить биосферу и человека от отрицательного влияния различных химических соединений» необходимо изучение их свойств и воздействия на биологические системы. Ряд химических соединений способны взаимодействовать с молекулами ЛИК. вызывая изменения в ее структуре и, как следствие, влияя на точность механизма передачи информации. Генетические изменения являются причиной значительной доли заболеваний, однако, до сих пор не ясно, в какой мере присутствующие в окружающей среде химические вещества обуславливают возникновение наследственных заболеваний. Актуальной задачей при решении данной проблемы в целом является скрининг химических веществ, вызывающих мутагенный, как наиболее опасный для генофонда видов, и канцерогенный эффекты [Поликарпов Г.Г., Цдаугина В.Г.,1985; Турусов B.C., Парфенов Ю.Д., 1986; Fischbein L., Flamm W.G., Falk H.L., 1970].

В сложившихся условиях первостепенной задачей является создание и совершенствование экспресс-методов для тестирования вновь синтезируемых соединений с целью определения их биологического действия на живые организмы. В литературе описано более сотни тест-систем для исследования генотоксичности веществ в которых используют тест-объекты различного уровня биологической организации - от бактериофагов до млекопитающих [Абилев С.К..Порошенко Г.Г. 1986; Гигиенические критерии окружающей среды. Серия 51, 1989; Foriin

L., Andereson Т., Koivussari V., Haneeon Т., 1904].

Краткосрочные тесты с использованием бактерий в качестве индикаторов, для выявления мутагенного потенциала химических веществ согласно многочисленным исследованиям являются наиболее приемлимыми в настоящее время в.м., мс сапп у.,

yamasaki е., 197э; Демаков В.А., Колотое В.М., Еремина A.A., 1981, Фонштейн Л.М., Абилев С.К.. Бобринев Е.В., 1985;].

Бактериальные тест-системы имеют ряд несомненных преимуществ по сравнению исследованиями на высших организмах: в одном

тесте может быть изучена популяция состоящая из многих миллионов клеток с относительно коротким периодом размножения; возникшие нарушения в геноме бактерий проявляются Фенотипически ухе в следующем поколении; тесты относительно просты и доступны.

Другими, не менее эффективными тестами для исследования генотоксичности химических веществ, являются дрожжевые тест-системы. Следует отметить, что дрожжевым тестам присуши все перечисленные положительные качества бактериальных систем. Дрожки и грибы в отношении сложности генетического материала занимают промежуточное положение между бактериями и клетками млекопитающих. Биологическая организация дрожжевых клеток обнаруживает очень большое сходство с клетками высших организмов вследствие наличия дифференцированного ядра, содержащего ядрышко. Тесты с использованием дрожжей, таких как

8«ссЬ«готусв» сегеуХвАа», ПРИГОДНЫ ДЛЯ ВЫЯВЛ6НИЯ ШИРОКОГО

спектра генетических изменений.

Известно, что у бактерий и дрожжей отсутствуют некоторые Ферменты, необходимые для метаболизма различных мутагенных и канцерогенах соединений, присущие высшим формам живых организмов. Поэтому микробные тест-системы должны быть дополнены необходимыми препаратами микросомальных формантов млекопитающих или других высших организмов. При этом в тесте появляются возможность улавливать видовые особенности метаболизма исследуемых химических соединений. Кроме того, как правило, исследования проводят на нескольких тестерных штаммах, что обусловлено избирательностью действия химических соединений.

Паль и задачи. Основной целью данной работы была разработка подходов к оптимизации, а так же повышению чувствительности и воспроизводимости результатов бактериальных и дрожжевых тестов, используемых для оценки мутагенной активности химических веществ, посредством введения в систему очищенных разновидовых микросомальных Фракций. В связи с чем были сформулированы следующие задачи:

1.Шлучение очищенных препаратов микросом - биокомпонентов бактериальных тест-систем;

2.Исследование биотрансформирующей активности полученных препаратов в краткосрочных бактериальных и дрожжевых тестах:

3.Определение условий стабилизации микросомальных фракций, используемых в бактериальных и дрожжевых тест-системах;

4.Создание оптимальных режимов хранения полученных препаратов и определение сроков их пригодности для использования в микробиологических тестах.

Научная новизна. Впервые на бактериальных и дрожжевых тестах скринирования мутагенов дана сравнительная оценка биотрансформирующей активности разновидовых мембранных препаратов различной степени очистки, полученных из печени кур, крыс, плаценты человека, растений как между видами, так и с фракциями используемыми в классических вариантах бактериальных тестов. Проведено определение оптимальных условий стабилизации полученных мембранных препаратов. В результате исследований определены оптимальные сроки использования в краткосрочных бактериальных тестах полученных препаратов микросом; доказана адекватность применения метода сублимационного высушивания для их стабилизации. Результаты исследований позволяют рекомендовать новые подхода к усовершенствованию бактериальных тест-систем скрининга веществ на мутагенность.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований модифицировании бактериальные и джрожжевые тесты, используемые для определения мутагенной активности химических соединений, посредством изменения качественного состава биокомпонентов системы. Определены необходимые параметры получения высокоочищенных микросомальных препаратов, обладающих значительно большей биотрансформирующей активностью, чем у используемых в классических вариантах бактериальных и дрожжевых тестов. Даны рекомендации по стабилизации полученных фракций. На основе проведенных в микробных тест-системах исследований получены мембранные препараты, сохраняющие активность в течение 1-1,5 лет (период наблюдения). Применение указанных препаратов в бактериальных тестах позволит практическим лабораториям отказаться от необходимости содержания животных« сократить объем подготовительных работ, стандартизировать схемы проведения анализов» повысить воспроизводимость и достоверность

результатов. Введение в тест-систему мембранных препаратов» обладающих значительно более высокой активностью по сравнению с 3-9, позволит проводить выявление слабых и средних мутагенов окружающей среды. Результаты исследований внедрены в практику в лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ; прошли испытание в НИИ онкологии им.Н.Н.Петрова г.Санкт-Петербург, Институте канцерогенеза РАМН г.Москва.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на:

-всесоюзной конференции "Штохром Р-450 и охрана внутренней среды человека" (Москва,1985); школе молодых ученых "Проблемы экологического мониторинга и научные основы охраны природы на Урале" (Свердловск,1935); на выездном заседании Секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" ГКНТ СМ СССР (Ордженикидзе, 1985); конференции молодых ученых "Экологические системы Урала" (Свердловск,1987), "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1987), конференции "Здоровье населения - критерий качества окружающей среды" (Пермь,1987); всесоюзном симпозиуме "Объем и методы генотоксической оценки побочных эффектов биологически активных веществ" (Ленинград,1989); региональной школе семинаре молодых ученых и специалистов "Актуальные проблемы экологии: Экологические системы в естественных и антропогенных условиях среды" (Уфа,1989); Международной конференции "Цитохром Р-450 - структура и функции. Биохимические и биофизические аспекты" (Москва,1991); Международном симпозиуме "Проблемы токсикологии и прикладной экологии" (Москва-Пермь.1991), Международном симпозиуме "Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология" (Москва-Пермь, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 144 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 5 рисунков. Список литературы содержит 267 наименований работ: 1Е1 на русском и 156 иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1.Материалы и метопы исследования.

Основные химические соединения, среды, ингредиенты питательных и физиологических сред, буферных растворов: D-бИОТИН (Serva), L-гисТИДИН (Reanal), динатриевая СОЛЬ ГЛКЖ030-6-ф0Сф0РН0Й КИСЛОТЫ фирмы И ЭДГА (Fer»k), никотинамидаденин-динуклеотид-фосфат динатриевая соль (Reanal); бычий альбумин (Koch-Light.), гемоглобин (Reanal), "-кето-глутарат Na фирмы Merck; набор реактивов для электрофореза в полиакриламидном геле (Reanal), Coomassí g_2So (Serva); отечественные химические реактивы использовали квалификации "х.ч."; мясо-пептонный агар рН=7.4-7.6; мясо-пептонный бульон рН-7.4-7.6, изготовленные в НПО "Биомед", бакто-агар (oifko Lab.).

Для работы использованы следующие индикаторные культуры:

Salmonella typhimurium. ОСНОВНОЙ ИСПОЛЬЗуеМЫЙ ШТаММ ТА

1535 и дополнительные - ТА 98 и ТА 100 несут мутации, обуславливающие дефектность липополисахаридного , комплекса клеточной стенки. Гистидан зависимые штаммы ТА 1535 и ТА 100 регистрируют действие мутагенов. индуцирующие нарушения типа замены пар оснований. Штамм ТА 98 позволяют обнаружить мутагенный эффект химических веществ, действующих по типу сдвига рамки считывания. Штаммы были получены от доктора Эймса в 1978 году из коллекции отделения биохимии Калифорнийского университета.

Sacharomyces serevisiae. Для ТвСТИРОВаНИЯ ПРИМвНЯЛИ ШТаММЫ

Т1 [ (ПГ-154) а/. ade2-192. adt?2-Q45, R«d, и TS. t

(ПГ-155) a/, ade2-192, ade2-Q45, rad, rad] сконструированные в , Отделе радиационной генетики Ленинградского института ядерной Физики. Наличие в генотипе штамма Т2 мутации rad2, блокирующей эксцезионную репарацию,- обеспечивает высокую чувствительность к действию химических мутагенов. Штаммы получены из лаборатории химического мутагенеза ВНИИ ГИНТОКС г.Киев.

Стандартные мутагены: использовали М-нитрозо-М-метилмоче-вину и бенз(а)пирен Фирмы (sigma); 2-ацетил-аминофлуорен

(Koch-Light); циклофосфан (циклофосфамид), изготовленный Саранским заводом медицинских препаратов; фенобарбитал, изготовленный Шосткинским заводом химреактивов.

Животные и биологические препараты. Для выделения микросомальных фракций и реализации метода использовали следующие материалы» печень 100 крыс линии wistar массой тела 150*30 г. (питомник АМН СССР "Столбовая"); печень кур породы Леггорн петушков массой 1000 - 200 г. С птицефабрика "Калининская" Пермской обл.); плаценту человека, полученную в родильных домах г.Перми; луковицы тюльпана сорта Гибриды Дарвина (Ботанический сад унивеситета г.Перми).

Получение препаратов s~9. а также очистку исходных микросомальных Фракций s~9 всех видов проводили методом дифференциального центрифугирования [Остерман Л.А.. 1981].

Для сохранения активности полученных препаратов использовали криоконсервацию и лиофилизацию. Процесс лиофилизации проводили по режиму интерферона (Регламент 32-82 от 22.04.82.).

В модифицированных бактериальных и дрожжевых тестах проводили оценку биотрансформирующей активности Ферментного комплекса микросомальных Фракций [Павлов D.H., Хромов-Борисов H.H.,1983; Simmon v.F.,1979] по способности метаболизировать (активировать) стандартный мутаген.

Статистический анализ экспериментальных данных проводили с помощью общепринятого _ стандартного метода вариационной статистики СЛакин Г.Ф.,1990. Плохинский H.A., 1980. Рокицкий А.П.,1973]. Достоверность различий ( Р ) оценивали по ^критерию Стыодента (р<0.05). При математической обработке результатов использовали методы корреляционного и дисперсионного анализа [Плохинский H.A., 1980].

Определение концентрации белка в препаратах, полученных из

Тканей ЖИВОТНЫХ, ПРОВОДИЛИ ПО ЛОУРИ [Lowry O.N. ,1<?51 ]; в

растительных препаратах - по Бузун и соавт. [Бузун, 1982]. Качественный состав исследуемых препаратов проводили электрофорезом в градиентном полиакриламидном геле (ПААГ) со ступенчатой буферной системой по Laemmly U.K. [Laemmly U.K.,1970].

Степень контаминации ферментами митохондрий и лизосом устанавливали по активности катепсина [Покровский A.A.,1969], и глутаматдегидрогеназы [Покровский A.A. .1969].

2.Результаты и обсуждение.

Комплекс выполненных работ включает отработку усовершенствованных вариантов бактериальных и дрожжевых тестов на гснотоксичность химических соединеий на основе использования в системе биопрепаратов, имеющих качественные отличия от применяемых в классических схемах экспериментов. В связи с этим разработана и апробирована схема получения нативных высокоочищенных микросомальных фракций; определена зависимость активности исследуемых препаратов от концентрации белка и степени очистки; проведен сравнительный анализ трансформирующего потенциала микросомальных фракций печени крыс, кур. плаценты человека и луковиц тюльпана в бактериальных и дрожжевых тестах.

Известно, что во фракциях s-9, используемых в классическом варианте теста Эймса, концентрация белка варьирует в значительных пределах в зависимости от физиологического статуса организма, вида ткани, а также от серии препарата. Этим объясняются значительные колебания уровня биотрансформирующего потенциала в бактериальных тестах. Для устранения указанных недостатков, а также оптимизации используемых микробиологических методов были получены препараты чистых микросом.

Получение и очистку препаратов для исследований проводили методом дифференциального центрифугирования по схеме, представленной на рисунке 1. На каждом этапе центрифугирования проводили отбор образцов для исследований активности в тестах

SALMONELLA / МИКрОСОМЫ.

Чистоту полученных фракций контролировали энзиматически. Для этого вели определение следующих маркерных ферментов: для митохондрий - глутаматдегидрогеназы; для лизосом - катепсина. Активность этих ферм!нтов обнаружена только в супернатантных .препаратах S-9, з-1^ и s_iso, в мембранных препаратах М-1 и М-2 отсутствует.

Оценку активности полученных препаратов микросом проводили в бактериальном тесте Эймса. Тестирование мутагенного действия химических соединений следует рассматривать как многостадийную и разветвленную систему скрининга. На первом этапе исследований решается вопрос оказывает ли данное химическое соединение

Рис.1. Схема получения препаратов мембран. Условные обозначения:

&-9, Э-К, 5-150 - супернатантные препараты; М-1 и М-2 - мембранные препараты; I, П, Ш, 1У - этапы очистки препаратов

мутагенное действие. На следующем этапе необходимо установить для каких видов растений и животных это соединение мутагенно и насколько велика его опасность для человека.

Учитывая то обстоятельство, что у части химических соединений мутагенным эффектом обладают лишь их продукты, в последнее время возрос интерес к изучению путей метаболизма ксенобиотиков; ведется интенсивный поиск тканевых препаратов, способных активировать мутагены [Ames e.N.,McCann Y., Yamasaki е.,1975; Cheh Albert M., Hopper Alan В., Henke Craig, et.al.,

1990]. Отсюда логически следует вывод о целесообразности проведенного отбора для исследований тех видов организмов, которые находятся на разных уровнях организации: растения, птицы, грызуны, человек.

Нами проведены сравнительные исследования в бактериальных и дрожжевых тестах мембранных препаратов, выделенных из печени животных (крысы, куры), плаценты (человек) и луковиц растений (тюльпан). При выборе объектов исследований учитывали частоту использования их в экспериментах (в частности на микроорганизмах)» степень изученности объекта, способность трансформировать стандартные промутагены и мутагены.

Определение биотрансформирующей активности полученных препаратов проводили в классическом бактериальном тесте Эймса на Salmonella typhimurium, штаммы ТА 1535, ТА 100 и ТА 98. а также В дрожжевых тестах Ha Saccharomyces cerevisiae, штаммы TI и Т2.

При исследовании в бактериальных и дрожжевых тестах установлено, что мембранные препараты обладают значительными преимуществами по сравнению с s-9. Так например, использование мембранных препаратов в бактериальных тестах позволяет более адекватно определить видоспецифичность мутагенного воздействия тестируемых химических соединений. На рисунке 2. представлены результаты сравнительных исследований мутагенного воздействия цнклофосфана в бактериальных тестах при использовании препаратов з-' и М-1 крыс, кур, человека и растений.

По методическим особенностям теста Salmonella / микросомы количество собственно микросом. вводимых в тест-систему с препаратом различно, т.к. фракции s-ч качественно (спектр белковой контаминации) в большей или меньшей степени

PHB./мГ.бЕЛКА ?000v-

еооо.

S ООО.

4 ооо.

s ооо.

I

i ООО.

1 ООО .

RAT

CHlKEN HUMAN TULPAN

Puc.2. WyTflrHHMOE B03-.flEUCT&ME UUK/lOcpOCqsflMfl b tecth S/ilmoneLlfl / MUKPOCOMM

отличаются, по этой причине возможно снижение воспроизводимости результатов эксперимента. Как следствие, используемая бактериальная модельная система не отражает адекватно Функционирование Ферментов монооксигеназного комплекса и потенциальную мутагенную активность тестируемого вещества i" vivo, с другой стороны мембранные фракции М-1 (М-2, М-3) имеют незначительные различия в содержании белка, и применение их в бактериальных тестах позволяет уменьшить вариабельность данных уровня биотрансформирующей активности между сериями. Следует особо отметить тот Факт, что обнаруженные флуктации в концентрации белка не приводят к изменениям в уровне трансформирующего потенциала мембранных препаратов. По нашему мнению, применение препаратов М-1 в тестах salmonella / микросомы позволяет оценить функциональный статус собственно монооксигеназного комплекса. Таким образом. использование мембранных препаратов М-1 в краткосрочных микробных тестах обеспечивают более воспроизводимые условия тестирования по сравнению с s-4. Имеющиеся незначительные различия в уровне биотрансформирующего потенциала препаратов М-1 некоторых из исследованных видов (птицы, человек), вероятно, можно объяснить присутствием в их рационах питания витаминных, гормональных добавок и биостимуляторов, приводящим к функциональным сдвигам в монооксигеназной системе. Аналогичное воздействие может оказывать и применение некоторых лекарственных препаратов.

Полученные препараты микросом были изучены в бактериальных тест-системах с использованием , дополнительных штаммов salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100. В результате проведенных исследований установлено, что все полученные препараты активно метаболиэируют циклофосфан, 2-ААФ и бенз(а)пирен, при этом проявляют определеную видоспецифичность и субстратспе-цифичность, которая более четко выявляется при использовании мембранных препаратов. На рисунке 4 представлены данные по определению мутагенного воздействия бенз(а)пирена и 2-ААФ в тестах Salmonella/ микросомы при использовании препаратов s-<?, м-1 и М-2 печени кур и плаценты человека. При этом, нами установлено, что мутагенный эффект бенз(а)пирена и 2-ААФ значительно выше при использовании в тесте препаратов плаценты человека, чем печени кур.

Вопросом, требующим специальных исследований при изучении конкретного химического соединения, является межвидовая и индивидуальная чувствительность организмов к мутагенному действию данного соединения. Адекватную оценку активности тестируемого соединения можно получить экспериментально, только используя различные тесты и тест-объекты. Целью такой оценки является определение степени мутагенной активности изучаемого вещества и, если это возможно, экстраполяция ее к определенному уровню потенциальной генетической опасности для человека. Показательны в этом отношении подходы, предложенные для оценки мутагенной активности лекарств [Зацепилова Т.А.. Пашин Ю.В., 1980] и пестицидов СБияшев Г.З., Сартаев A.C., Махмудов А.Т., 1986; Katz м-> Heddle I.,Salamone M.F., 1983]. ОДНИМ ИЗ анализируемых параметров является степень выраженности мутагенного эффекта, который определяется как кратность превышения частоты мутаций над спонтанным уровнем (слабый, средний, сильный).

Использование мембранных препаратов в бактериальных тестах позволит Фиксировать не только сильные, но, что особенно важно, средние и слабые мутагенные химические соединения (что очень сложно, а порой и невозможно при использовании в микробных тестах Фракции s-9). •

С целью определения возможности использования полученных препаратов в тестах на других микроорганизмах, а также экстраполяции полученных результатов на высшие организмы, были проведены исследования в дрожжевых тестах. На рисунке 3. представлены результаты применения мембранных препаратов и Фракций S-9 на дрожжевых штаммах Saceharomyces cerevisiae fl И Т2. При этом установлено, что мембраны М-1 более эффективны, чем s-9 для обоих вариантов опыта.

Таким образом, в ходе исследований детально отработаны новые модификации краткосрочных бактериальных и дрожжевых тест-систем на основе использования качественно измененных биокомпонентов системы. Бактериальные и дрожжевые тесты в данной модификации более чувствительны, стабильны, а полученные результаты адекватно отражают биотрансформирующие Функции монооксигенаэной системы. Установлено, что полученные препараты микросом достаточно длительное время (до 1,5-2 лет) пригодны

Колоний-мутАнтоа

chiken

cd human

Рис.З. Мутагенный

ЭФФЕКТ ЦНКЛОФОСФЯНЯ е> тесте Sflcchflromyces/ МИКРОСОМЫ

BENZ-A-PYRENE

2-AAF

2500

2000-

1500

1000-

500

i

j>

S-9 M-1 M-2 S-9 M-1 M-2TS-9 M-1 M-2 S-9 M-1 M-2

HUMAN

CHICKEN

Рис.4. МатдгЕиныи эффект бенз-д-лиренд и 2-ДАсР в тестё ол1топеЦд/микрлгомы

О

для использования в бактериальных и дрожжевых тестах. Наряду с решением конкретных задач, предложенная работа способствует разработке ряда перспективных направлений. По отработанной методике возможно получение и применение высокоочишенных микросомальных препаратов из тканей других, не изученных в настоящей работе видов организмов, их лиофилизация. Кроме этого не исключается расширение сферы применения высокоочишенных микросомальных фракций, в частности, на культурах клеток. Представляет не меньший интерес дальнейшая очистка мембранных препаратов, изучение функционального состояния различных подфракций мембран (применение градиентного центрифугирования). Большое значение имеет разработка оптимальных схем использования плаценты человека в исследованиях мутагенного воздействия различных факторов окружающей среды.

ВЫВОДЫ.

1.Предложены новые варианты бактериальных и дрожжевых тестов на генотоксичость химических соединений на основе качественного изменения биокомпонентов системы.

2. Методом дифференциального центрифугирования получены микросомальные препараты из печени крыс, кур, плаценты человека и растений. Установлена прямая зависимость между уровнем биотрансФормирующего потенциала и степенью очистки фракций. Максимальным биотрансформирующим потенциалом обладают мембранные препараты М-1 и М-2 всех исследованных видов.

3. Максимальная стабильность микробных тест - систем достигается при использовании микросомальных препаратов, полученных методом сублимационного высушивания. Замороживание ведет к частичной потере активности в тесте ЗАимоыЕи-А/микросомы уже в первые два месяца. При изучении в бактериальных тестах биотрансФормирующего поетнциала установлено, что в течение одного года препараты всех исследованных видов теряют более 50% активности, исключение составляют препараты мембран печени кур (М-1) и растений (М-2).

4. Процесс лиофилизации не оказывает какого-либо отрицательного воздействия на активность препаратов исследованных

видов. Лиофилизированные препараты разной степени очистки стабильны в течение всего периода наблюдений как при исследовании в бактериальных тест-системах, так и в дрожжевых.

5. Максимальным биотрансформирующим потенциалом обладают препараты мембран плаценты человека. Активность данных препаратов выше в среднем на порядок по сравнению с исходными Фракциями.

6. Использование мембранных препаратов в бактериальных (Salmonella typhimurium) у\ дрожжевых (Saccharomyces cerevisza)

тест-системах позволяет значительно ПСЕНОить чувствительность данных методов.

7. Наличие разновидовых мембранных фракций и их использование в бактериальных и дрожжевых тест-системах дает возможность выявлять особенности метаболизма химических соединений организмами различного уровня организации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Раева Л.П., Коробов В.П., Пшеничнов Р.А., Раев М.Б. Трансформирующая активность разновидовых микросомальных препаратов в зависимости от степени их Фракционирования //В кн.: Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека. Материалы всесоюзной конференции - Пущино, 1985. - С.52-53.

Й.Раева Л.П., Раев М.Б. Сравнительная оценка трансформирующей активности разновидовых микросомальных препаратов на разных степенях обработки с использованием микробных тест-систем //В кн.: Проблемы экологического мониторинга и научные основы охраны природы на Урале. Тезисы конференции. Свердловск, 1985. - С.46.

3.Раева Л.П. Получение и испытание лиофилизированного препарата очищенных микросом для целей генетического контроля //В кн.:Генетические аспекты проблемы человек и биосфера. Тезисы докладов на конференции. - Орджоникидзе, 1986, - С.109.

4.Раева Л.П. Использование микросомальной фракции луковиц тюльпана для исследований мутагенных факторов окружающей среды //В кн.: Экологические системы Урала. Тезисы докл. конференции молодых ученых. - Свердловск, 1987. - С.42.

5.Раева Л.П., Кожина Л.Н. Растительная микросомальная фракция в выявлении мутагенных соединений окружающей среды //В кн.:Изучение,охрана и рациональное использование природных ресурсов. Тезисы докладов конференции молодых ученых. - Уфа, 1987. - С. 139.

6.Раева Л.П., Еремина A.A. Применение высокоочищенной микросомальной Фракции плаценты человека в выявлении мутагенных Факторов окружающей среди //В кн. Здоровье населения - критерий качества окружающей среды.Тезисы докл. - Пермь,1987. - С.66-67.

7.РаеЕа Л.П. Использование высокоочищенных препаратов микросом в тесте Эймса для выявления мутагенных соединений //В кн. Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ. Материалы всесоюзного симпозиума. -Ленинград,1989. - С. 80.

б.Раева Л.П. К вопросу мутагенных соединений окружающей среды в тесте SaimoneUa/MUKpofcOMU //В кн. Актуальные проблемы экологии: экологические системы в естественных и антропогенных условиях среды. Материалы региональной школы-семинара молодых ученых и специалистов. - Свердловск,1989.

9.Раева Л.П. Некоторые аспекты оценки мутагенной активности загрязнителей окружающей среды в тесте Salmonella / микросомы //В кн. Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов. Материалы научной конференции. - Уфа,1989.

- Т.2 - С.160.

Ю.Пшеничнов P.A., Кожина Л.Н., Раева Л.П. Исследование природных популяций E.coii для создания системы пространственно

- временного мониторинга вида //Материалы конференции. Душанбе, 1989. - С.

11.Раева Л.П. Получение и оценка трансформирующей активности микросомальной Фракции разной степени очистки из печени активированных крыс //В кн. Факторы и механизмы регуляции развития бактериальных популяций. - Свердловск, 1990.

- С.121-123.

12.Раева Л.П., Лемаков В.А. Экологические аспекты использования очищенных микросомальных препаратов в дрожжевых тестах //Тезисы докладов Международной конференции "Биохимия и биофизика цитохрома Р-450; структура и функции, биотехнологические и экологические аспекты" - Москва,1991. - С.126.

13.Раева Л.П., Демаков В.А. Использование высокоочищенных микросомальных фракций печени кур в краткосрочных тестах для оценки мутагенной опасности химических соединений //Тезисы докладов Международного симпозиума "Проблемы токсикологии и прикладной экологии". -Москва-Пермь,1991. - С.247.

14.Л.П.Раева, В.А.Демаков Изучение потенциальной генотоксичности загрязнений окружающей среды в модифицированных микробных тестах.//Тез. докл. Международного симпозиума "Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология". -Москва-Пермь, 1993. -С.213.