Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процесса и создание технологии биосинтеза L-триптофана штаммом-продуцентом Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование процесса и создание технологии биосинтеза L-триптофана штаммом-продуцентом Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15"

На правах рукописи

РГВ од

2 2 д::;

Сенаторова Валентина Николаевна

Исследование процесса и создание технологии биосинтеза

L-триитофана штаммом-продуцентом Bacillus subtUis ВНИИгснетнка-15.

03.00.23 - Биотехнология

Аатореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2000

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте биосинтеза белковых веществ (ГосНИИсинтезбелок)

Научный руководитель: - доктор технических наук, ст. н. сотр.

Музыченко Леонид Афанасьевич

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук, профессор

Грачева Ирина Михайловна

- кандидат технических наук, Максимова Екатерина Анатольевна

Ведущая организация: - АООТ «Бнохиммаш»

Защита состоится ХИ 2000г. в -^^часов на заседа-

нии диссертационного совета Д 053.34.13. в Российском химнко-технологическом университете им. ДЖМенделеева (125047, Москва, Миусская пл., 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского химико-технологического университета им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан » XI 2000г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук / И.И.Гусева

Абба. 26-1. ъчл- 13 о

А г А О Л О. <4 А _ А <2. ^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. L-триптофан - незаменимая для человека н животных аминокислота, играет существенную роль в обмене веществ живых организмов. Недостаток его приводит к различным заболеваниям: рак, диабет, туберкулез, пеллагра, различные заболевания нервной системы, у животных снижаются привесы, развивается анемия.

L-триптофан применяется в медицинской практике в составе кровезаменителей, для лечения умственно отсталых детей, как транквилизатор; в качестве пищевых добавок (в составе аминокислотных смесей) для спортсменов в период тренировок; в сельском хозяйстве доя балансировки кормов с целью повышения привесов.

Учитывая, что потребность нашей страны в медицинском L-триптофане около 50 т/год, а в кормовом - около 200 т/год, создание технологии биосинтеза L-триптофана представляется актуальным.

Цель работы. Разработка и совершенствование технологии биосинтеза L-тршгтофана, позволяющей наладить промышленное производство и максимально снизить себестоимость конечного продукта, включает в себя: изучение динамики, стехиометрии, путей биосинтеза, подбор оптимальных условий культивирования (оптимизация состава питательной среды), изучение влияния условий культивирования на морфологию клеток штамма-продуцента L-тршттофана Bacillus subtilis ВНИИгенетнка-15; подбор адекватной модели роста, биосинтеза, потребления редуцирующих веществ и кислорода; разработка технологии биосинтеза (определение параметров периодического, полупериодического, отьемно-доливного процессов биосинтеза); опытно-промышленное опробование разработанной технологии.

Научная новизна. Для штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетнка-15 впервые определены морфометрические характеристики и влияние на них условий культивирования,

показано, что даже кратковременное нахождение клеток продуцента в лимите по кислороду ведет к их значительному лизису,

установлено, что источником ростового фактора при биосинтезе триптофана является кукурузный экстракт,

подобрана и проверена на адекватность математическая модель биосинтеза триптофана, учитывающая рост, биосинтез и потребление редуцирующих веществ и кислорода

Впервые разработана и опробована в опытно-промышленных условиях технология биосинтеза L-триптофана на штамме-продуценте Bacil-

lus subtilis ВНИИгенетика-15, подобрана адекватная математическая модель роста, биосинтеза и потребления субстрата, проведена работа по определению влияния условий культивирования на морфометрические характеристики клеток продуцента.

Практическая ценность. Разработанная технология позволяет организовать в нашей стране производство кристаллического кормового и медицинского L-триптофана микробиологическим способом на простых минеральных средах с конкурентоспособной себестоимостью по сравнению с зарубежными аналогами. Проведено успешное опытно-промышленное опробование разработанной технологии на различных заводах СССР.

Апробация. Результаты работы докладывались на четырех научных конференциях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи, получено 2 авторских свидетельства, результаты были опубликованы в материалах четырех научных конференций.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения и 5-ти глав, библиографического описания (147 наименований) и изложена на 156 стр. машинописного текста.

В первой главе показана актуальность работы, сделан аналитический обзор публикаций на тему работы и представлены основные положения, выносимые на захщпу.

Вторая глава и третья глава содержат экспериментальную часть работы, в которой подбираются оптимальные компоненты питательной среды, и проводится морфометрический анализ влияния условий культивирования на клетки продуцента.

Четвертая и пятая главы посвящены подбору адекватных моделей роста, биосинтеза, потребления редуцирующих веществ и кислорода; в ней изложены основные принципы разработки технологии биосинтеза L-тршггофана, сравнительные характеристики полупериодического и огьем-но-доливного способов ведения процесса биосинтеза, осуществлен расчет оптимальных условий проведения технологического процесса, представлены результаты опытно-промышленного опробования разработанной технологии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1.Лптерату|)нын обзор.

В литературном обзоре L-трипгофан подробно охарактеризован как кормовая добавка, рассмотрено его применение в качестве биологически активной пищевой добавки и лекарственного средства. Указывается, что интерес к производству L-триптофана, во всем мире очень велик. Объ-

,ibi производства аминокислот возрастают, основными производителями являются Япония и США.

Рынок аминокислот растет со скоростью 12-15% в год

С целью правильного понимаши процессов, происходящих при юсинтезе L-триптофана, принятия решений при создании питательных >ед н получения верных объяснений возникающих затруднений при реа-тацин технологического процесса в главе 1 подробно рассмотрены био-шические процессы, ведущие к образованию L-триптофана.

Также сделан обзор литературы по известным способам микробио-)гического синтеза, разработанным зарубежными и отечественными авто-

1МИ.

На основании материалов, рассмотренных в главе 1, сделан вывод том, что

получение одной из незаменимых аминокислот — L-)иптофана с целью использования его в качестве биологически ак-шнон пищевой и кормовой добавки — важная народно-хозяйственная дача

и сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 2. Материалы и методы.

В этой главе приводится краткая характеристика штамма-юдуцента L-триптофана, методика его поддержания и хранения; методи-получения посевного материала и проведения опытов в колбах и лабора-рных ферментерах; методы аналитического и морфометрического кон-оля; методика обработки результатов экспериментов.

Для сравнительной оценки перспективности различных источни-в углерода, с целью их практического применения мы использовали, ко-|фициент экономической эффективности (Q3, руб/кг), который является рощенным вариа1Ггом приведенных затрат.

Глава 3. Определение оптимальных условий культивирования.

В результате первоначальных исследований была определена пи-гельнал среда для биосинтеза штамма-продуцента L-тршггофана Bacillus itilis ВНИИгенетика-15 следующего состава (г/л): сахароза или сахар-рец - 100,0; кукурузный экстракт - 25,0; КН2РО< - 0,6; К2НРО„ - 1,4; 'S04-7H20 - 1,0; NaCl - 0,5; мочевина - 5,0 (контроль).

В качестве источников углерода, позволяющих заменить сахар в гательной среде для биосинтеза L-триптофана, были испытаны глюкозо-держащне отходы различных производств: ферментативный гцдролизат шолигнина (отход производства фурфурола при гидролизе древесины), пасса свекловичная и тростниковая, патока зеленая (отход крахмало-

паточного производства), зерновой ферментолизаг, заваренная кукурузная мука, гидролизат крахмала из зерна.

При изучении влияния различных ростовых веществ на биосинтез Ь-триптофана помимо обычного товарного кукурузного экстракта использовали: очищенный кукурузный экстракт; замочную воду, полученную при замачивании зерна; (Ьерменголизат БВК и дрожжевой гидролизат: аминокислоты (треонин, лизин, аргинин, аланин, валин, пролин, тирозин, серии, глутаминовая кислота, фенилаланин, глицин, триптофан), входящие в состав кукурузного экстракта. Опыт по влиянию аминокислот проводился методом случайного баланса на фоне 1,5% содержания товарного кукурузного экстракта в питательной среде. Были испытаны также следующие источники азота: мочевина, (Ш^ЫРО^ (N114)2804, (Ш^СО;,.

Полученные при этом результаты приводятся в таблицах 1-3.

Таблица 1.

Использование различных источников углерода для биосинтеза

Ь-триптофана.

Источник углерода т, РВ, % <х*>, %

г\л нач. кон. руб/кг

1 2 3 4 5 6

1. Меласса

Тростниковая - н\очшценная 5,5 8,6 5,7 18,3 167,7

-очищенная (рН 6.0, 20 мин. 6,0 8,6 1,6 8,6 183,4

80°С) Свекловичная

- н/очищенная 4,7 7,0 1,0 7,8 250,9

- очищенная 6,0 8,0 - 7,5 211,7

Контроль 8,5 10,0 1,0 9,4 226,5

2. Патока зеленая 7,4 10,0 1,6 8,8 174,4

Контроль 7,1 226,5

З.Гидролизат лигноцсллюлозы - н\очшценный - очищенный (к-та) - очищенный (ультрафильтрация) 4.5 5,7 5.6 6,0 7,0 4,0 0 0,27 6,2 8,1 15,1 281,1 263,5

4.Гидролизат древесины 100% 8,5

75%+сахароза 6,9 8,5 4,1 15,7

5.Гидролизат крахмала зерна + замочная вода 7,1 10,0 2,4 9,2 183,8

Контроль 6,6 226,5

1 2 3 4 5 6

6. Заваренная кукурузная мука

Обработка после прогрева 5,8 2,3 0,58 34,1

до70°С амилосубтапином,

ЗОмнн.+сгернлиз.

Амилосубтилин+глюкавоморнн 7,75 10,0 2,7 10,6

Контроль 7,05 226,5

7. Фугат осахаренного зерна 7,7 10,0 0,73 8,3

Контроль 6,25

8.3ерновой ферментолизат 9,0 10,0 2,2 11,5

Контроль 8,4 226,5

Коэффициент конверсии

Из анализа дашшх таблицы 1 видно, что все исследованные источники углерода утилизируются штаммом Вас. ¿иЫШх ВНИИгенетика-15, по выход Ь-триптофана и конверсия различны..

Был сделан вывод, что сахар-сырец (или сахароза) - наиболее предпочтительный источник углерода в составе питательной среды для биосинтеза Ь-триптофана.

Из опробованного альтернативного сырья лучшие результаты по продуктивности получены на гшокозе, гидролнзате крахмала зерна, зерновых ферментолнзатах.

Опыты с источниками азота (табл. 2) показали, что (ИН^ИРО^ отрицательно влияет на бносингетнческую активность культуры. Соли (N111)2504 и ЫН4ЫОз в составе среды снижают выход Ь-триптофана.

Хорошие результаты дала замена мочевины на (МК))2СОз в соотношении 1:4 и 2:3, На основании проделанных опытов в качестве основного источника азота была принята мочевина.

Таблица 2.

Влияние различных источников азота на биосинтез Ь-триптофана

Исследуемый фактор Т, г\л РВ, % а,% руб/кг

нач. кон

1 2 3 4 5 6

Различные соли аммония

(т,ЬНР04 7 г\л 3,9 10,0 4,8 7,5 510,8

(ЫКЦЬБО, 10 г\л 1,8 7,2 6,4

ЩШ3 5 г\л 5,3 3,8 8,5 266,7

(ЫН,)2СОз (100%) 1,9 3,8 3,1

1 2 3 4 5 6

(20%+80% мочевины) 7,6 1,0 8,4 193,8

(40%+60% мочевины) 7,2 0,6 199,7 7,7

(60%+40% мочевины) 5,6 2,6 7,6 275,4

(80%+20% мочевины) 3,7 2,2 4,7 555,6

0,8% мела + 0,1% (МН4)2504 +0,1% мочевины 6,3 2,2 8,1

Мочевина75%+25%(т,)2504 на 19 час. роста + подтитр. ЫаОН 6,2 0,8 6,7

Контроль (мочевина 0,5%) 7,2 0,24 7,8 226,5

Результаты опытов, приведенные в табл.3..показывают, что культура способна утилизировать широкий спектр источников амншюго азота, но кукурузный экстракт - более предпочтительный компонент питательной среды.

Таблица 3.

Влияние различных источников ростовых факторов на биосинтез Ь-триптофана_____

Источник ростового факто- Т, г\л РВ, % а, % 0»

ра нач. кон. руб/кг

1 2 3 4 5 6

Кукурузный экстракт - неочищенный (контроль) 6,5 10,0 1,4 9.1 226,4

- очищенный 7,8 2,2 9,6 244,0

Замочная вода

20% (по объему) 30% 7,3 7,9 10,0 - 7,3 7,9 183,13

40% . 8,1 - 8,1

БВК

Ферментолнзат БВК Автолизат БВК 6,0 4,5 10,0 - 6,0 4,5 -

Однако необходимо отмстить, что разработанная технология биосинтеза Ь-триптофана на гидролизате крахмала зерна позволяет использовать замочную воду в качестве источника ростовых факторов вместо кукурузного экстракта. При этом выход конечного продукта повышается на 10%. КЖ содержит меньше пигментов, что упрощает процесс очистки.

Сравнение результатов, полученных в опыте по влиянию аминокислот на биосинтез Ь-триптофана (метод случайного баланса) с аналогичным, рапсе проведенным, исследованием штамма Вас. ьиЫШз 3557, показало, что при селекции штамма ВНИИгенетнка-15 были произведены суще-

ственные изменения в процессах метаболизма по сравнению с типичными для Вас. subtilis процессами. Присутствие L-аргинина среди положительно влияющих аминокислот подтверждает высказанную ранее гипотезу о роли мочевины в биосинтезе L-триптофана.

С целью создания дополнительных приемов контроля за развитием культуры Вас. subtilis ВНИИгенетика-15 были изучены морфометрнческне характеристики клеток в регламентных условиях и при их отклонениях от оптимума (в условиях с пониженной аэрацией).

Исследование морфологии культуры Вас. subtilis проводили при культивировании в ферментере. Морфометрнческне измерения (I, d; Ко- I/d, К- SAO производили на тотальных препаратах в просвечивающем электронном микроскопе JEM-6G-JEOL. Полученные результаты представлены на рис. 1.

Проведенные эксперименты по культивированию Вас. subtilis в различных условиях подтверждают правильность сделанных предположений о существовании корреляции между физиологическим состоянием культуры и морфометрическими характеристиками клеток, а также правильность выбора параметра K(S/V) для оценки физиологического состояния штамма-продуцента. Проведенные эксперименты убедительно доказывают недопустимость пребывания клеток продуцентов L-триптофана в условиях лимита по кислороду, так как в это время не только тормозится биосинтез, но и происходят необратимые морфометрнческне изменения и массовая гибель клеток.

Зависимость ОП н К от времени

1

а

Ц85 Ц8

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Время, час

-ф-СП-О-К

Зависимость Ро2 и Хлпшрошпшыч" клеток от времеш!

100 да

, 60 ¿*>

20 О

■ > г ■

Яш

80

ю 5 40 Ё-й

20 I 0

О 5 10 15 20 25 30 35 40

Время, час

• Ра2, %-Р-Мшзф. кл., %

Зависимость рН и Кмшшклеток от времени

Д5 , ......25

5 10 15 Я 2 30 ® 41

Время, час

рН -О- N >н I юга*; %

Зависимость длшил п диаметра 1С.1С1 ок от времен»

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Время, час

"♦"ДнНЮЕКЦММ-в— Дле^ММ

Ъшиснмость Ти времени

0 5 10 15 3) 25 30 35 40 -Т,1/л ЧЭ-ЬЬ Время, час

Заи а пссть ГО 111Чк1 в и им* от едосн

5,5 Ю

5

45

4 г, * 6

33 и 3 ю" с. 4

25 2

2 0

-Щ •/• N101 ВШХ7№

Рнс. 1. Мормометрические и физиологические характеристики штамма-продуцента Вас. виЫШз ВНИИгенетика-15 при культивировании в регламентных условиях.

Глава 4. Изучение динамики роста и биосинтеза.

В работах, посвященных разработке технологии биосшггеза Ь-трнптофана, приводятся либо данные по содержанию Ь-триптофана в культуральной жидкости, либо динамика изменения концентрации биомассы, триптофана и редуцирующих веществ в ходе периодического процесса биосшггеза.

В то же время, создание математической модели биосшггеза Ь-триптофана, даже по уже полученным данным позволило бы существенно облегчить анализ достигнутых результатов и определить пути их оптимизации.

Для создания такой модели нами были использованы усредненные данные нескольких операций, проведенных в условиях экспериментально-технологического центра ГосНИИсинтезбелок (табл. 4).

Таблица 4.

Динамика роста и биосинтеза L-триптофана штаммом Вас. subtilis ВНИИгенетика-15

Продолжительность процесса, час (1) 0 4 8 12 16 20 22,5 Погрешность

Оптическая плотность, ад. (X) Эксп. .007 .015 .052 .112 .177 .292 .337 ±0,01

Выч. .007 .019 .048 .107 .195 .295 .340 ±0,01 4

Концентрация триптофана, г/л (Р) Эксп. 0 0,1 0,6 0,9 2,8 5,0 6,2 ±0,3

Выч. 0 0.1 0.56 1.40 2.46 4.95 6.27 ±0,3

Концентрация РВ, г/л (Я Эксп. 94 93 89 80 63 46 31 ±3

Выч. 94 93.1 88.2 79.3 67.8 42.6 31.00 ±3.19

Скорость потребления 02, г/л-час, (\УП) Эксп. - 0.27 1.28 3.32 4.07 4.20 4.72 ±0.4

Выч. 0.47 1.43 2.27 3.87 5.02 4.77 ± 0.53

Сульфитное число, гОг/л-час, (К,.а) Эксп. 2.25 2.25 2.25 4.0 4.9 6.0 6.0 ±0.3

Проверка на адекватность модели Моно после приведения ее к интегральной форме

t= J_. (i. in 2L+

Xj X„ fi_.X_

■ Ln ——--

x„„-x

np

(1)

np a i m np

где Х„р - некоторое предельное значе1ше X, определяемое начальным значением R(R<>), которое достигается при t=oo

дала: Цт = - .2707, KR= - 1.0947, Х„р= 0.535. Средняя квадратичная погрешность при определении X = ± 0.010.

Предложенный метод дает отрицательные значения ц.т и Kr , которые не имеют физического смысла, хотя и удовлетворительно описывает экспериментальные данные. Уравнение Моно можно переписать в более удобном виде, используя (im* =- и KR*=-KR

X X

np

dX _ .

хпр-х+к\

X

(2)

Полученный результат можно использовать для практических рас-

четов.

С целью придания коэффициентам используемой модели физического смысла мы рассмотрели уравнение Моно «усложненное» добавлеш!-ем сомножителя, учитывающего ингибирование роста неким продуктом (т.е. уравнение Моно-Иерусалимского), в котором предположили, что концентрация этого продукта пропорциональна концентрации биомассы. Тогда

Х_„ - X 1

•X

dX

np

di

xnp-x+KR

1 + К.-Х

(3)

где Ki-эмпирическая константа ("константа ингибирования") При отсутствии ингибирования (К| = 0) уравнение (3) переходит в уравнение Моно. Легко видеть также, что при Kr » Хпр-Х уравнение (3) приобретает вид (2).

После интегрирования уравнение (3) приобретает вид

г .. \

1+—

, X Ко •ln— + —

■ np у

Мт №т

• 1п ——-1

х„„-х

пр

где Х„ - начальная концентрация биомассы

Было найдено, что Мш=.303, Кк=.0507, К; = 4.515, Х„р = 0.36.

1

пр

Выше было показано, что источником ростового фактора при биосинтезе L-триптофана является кукурузный экстракт и, поэтому мы можем считать лимитирующей концентрацию кукурузного экстракта. Это предположение было проверено в полупериодическом процессе с подачей подпитки, содержащей кукурузный экстракт. Стехиометрическнй коэффициент а определялся как средневзвешенное значение «массы» продуцента в биореакторе Gx = V-X, где V - объём культуральнон жидкости, и общего количества внесенного кукурузного экстракта Gr = Cr0'Vo + cRf Vf по формуле

N

« - -И-jj--(5)

T.GI

/=1

Для определения стехнометрического коэффициента а были использованы данные, приведенные в таблице 5. Этот эксперимент является

продолжением эксперимента, описанного в таблице 4.

Таблица 5.

Результаты полупериодического культивирования штаммапродуцента

Время, час. 22,5 24 28 32 36 40 44 46

Чл 10,05 10,17 10,48 10,81 11,14 11,49 11,84 12,03

X™3, ед. ОП .368 - .752 - • .794 .835 .876 .894

X", ед. ОП .489 - .616 - .768 .823 .896 .925

Стехиометрический коэффициент а оказался равным 1.516. В периодическом процессе Х„р = 0.01516сЕо± 0.046

Для описания процесса биосинтеза было использовано уравнение Людекннга и Пайри

(1Р (IX и „ и

—= ар- + Ьр-Х или Цр = ар-рх + Ьр (6)

где Р - концентрация продукта, Яр и Ьр - эмпирические константы.

С помощью подстановки Х*сИ =-преобразуем (6) к виду

М*

(1Р = ар-(1Х+ Ьр- —

Л

и, поскольку при I = О Р=0,

/У

Р = ар-(Х - Хо) + Ьр --(7)

Их

Применяя для конкретного решения (8) модель МоноИерусалимского, получим после интегрирования

Мт

Р =

2//« Р.

.(1 + КгХпр).Ь^-^ = ар.(Х-Х0) + Ь;-2

пр

(8)

где г = [(1 -К^Кр) *20 + —+ КЕ*(1 +

Далее определяем ар=5.46 и Ьр= 1.62. Вычисленные, с применением этих коэффициентов, значения концентраций Ь-триптофана приводятся в таблице 4.

Можно предположить, что источник углерода при микробиологическом синтезе расходуется в трех основных процессах: затраты на синтез биомассы, затраты на синтез продукта, затраты на метаболические процессы.

Иначе говоря,

с® ах и „ ¡л3

--= а*--+ ЬЬ*Х + с,---(9)

с// ей Л

где - а„ Ь, и с, - эмпирические константы, Б - концентрация источника углерода.

Если связь между ростом и бносшггезом описывается уравнением

(7), то

7 С V V

--=а/--+ Ь,*-Х =(3^,+ Ь5)-Х (10)

(И ¿1 е а/ и Ь/ - эмпирические константы

Далее, по аналогии с описанием процесса биосинтеза, получим

50 - Б = а/'го + (11)

где а,* =68.12 и Ь/ = 13.68. Значения Б, вычисленные с использованием уравнения (Ц) приводятся в таблице 4.

В связи с низкой растворимостью кислорода в воде скорость его потребления можно принять равной скорости растворения

Кьа-(Р - я) = \У0 (12)

где Кьа - объемный коэффициент массопередачи кислорода, г 02/л-час-атм, Р - среднее давление воздуха в слое культуралыюй жидкости,

атм.(в нашем случае Р=1), л -концентрация растворенного кислорода в долях от насыщения при атмосферном давлении воздуха.

С другой стороны, поскольку кислород также является субстратом, можно записать, что \У0=(аоцх + Ь0)-Х. Обрабатывая эти данные с использованием уравнения (12) и значений щ, рассчитанных по уравнению (3) с применением определенных ранее ц,„, Кг, К*, Хпр, а также X3, мы получили значения а0= 81.5; Ь0=11.1 и вычислили \¥0 (см. табл. 4). Поскольку в ходе биосинтеза скорость роста (\Ух=цхХ) проходит через максимум, значение \У0 также должно иметь максимум. Решая уравнение dWo/dt = 0 получим для уравнения Моно-Иерусалимского соотношение

и =-о- (13)

к и а{[ ' +--]Х-\}

Для используемых нами значений параметров значение Х„„ при котором достигается минимум концентрации растворенного 02 и максимум \У0 - 30,2. При этом \Уот=5,04, я™ = 0,16 (при Кьа = 6).

В итоге процесс биосинтеза Ь-триптофана, показатели которого приведены в таблице 4, адекватно описывается моделью

^=0.303.. А' А

(II 0.0507 + 0.36 - X 1 + 4.515 • X

с1Р _ йХ , „

— = 5.45--+ 1.63-X (14)

Л й1

— = -Гб8.12- +13.68-

а { (И )

1У

Кьа(1-тс) = 81.5--+ 11,1 -X

(11

Глава 5. Разработка технологии биосинтеза.

С целью продления фазы логарифмического роста, что позволит повысить концентрацию конечного продукта, мы использовали дробную подачу дополнительной питательной среды (подпитки).

Процесс исследовался в следующих направлениях:

определение оптимального состава подпитки по основным компонентам питательной (по плану полного факторного эксперимента),

выбор параметра, позволяющего определить момент подачи подпитки (РВ, рН, Ро2, ЕН, а также ССЪ и 02 на выходе);

Выяснилось, что концентрация растворенного кислорода в среде -наиболее четкий и оперативный показатель, позволяющий определить момент подачи подпитки.

Процесс биосинтеза Ь-триптофана с подпиткой по датчику Ро2 позволил увеличить выход конечного продукта в среднем на 30%.

Далее во избежание лимитирования по кислороду в логарифмической фазе роста был разработан процесс с подпиткой и регулированием аэрации. Условия аэрации изменяли так, чтобы Рог не опускался ниже 15%. С помощью этого технологического приема удалось повысить концентрацию триптофана в конце ферментации на 20%, съем с единицы объема за счет увеличения объема подпитки, скорость и продуктивность биосинтеза.

На способ получено авторское свидетельство, составлены лабораторный и опытно-промышленный регламенты.

Результаты описанных выше исследований суммированы в таблицах 6 и 7.

Таблица 6.

Результаты экспериментального исследования полупериодического процесса биосинтеза Ь-грмтгофана._

Условия культивирования Т, г/л РВ,% а, С!э,

Нач. Кон. % руб/кг

1 2 3 4 5 6

1. Подпитка по Рог

У0=1,5 л У„=0,025 л, Ус=1,4 л, 8,3 10,0 - 7,3 196,3

У0=1,5л У„=0,1л,Ус=1,44л, 10,0 0,5 8,1 166,2

У„=15 л У„=3,7 л, Ус=16,8 л, 10,75 - 6?5 192,4

1 2 3 4 5 6

2. Подпитка по рО^+с. ч.

У0=1,5 л У„=0,537 л, Ус=1,9 л, 11,6 10,0 1,3 7,0 194,3

У0=1,5 л У„=0,169 л, Ус=1,5 л, 12,25 0,24 8,9 145,2

Уо=13,0лУп=2,8л,Ус=12 л, 12,4 1,2 6,5 184,9

3. Подпитка по рН, Ро7 +с.ч.

(на очнщ. кук. экстракте),

Ро2

Уо=10л Уа=5,43л ,УС=14,3 л, 13,2 10,8 2,15 193,0

Уо=10 л Уп=3,32л, Ус= 11,5л, 12,6 9,4 0,7 179,9

Уо=1,5лУ„=0,6л,Ус=1,71л, 7,3 7,2 0 10,6 415,9

У0=1,5л У„=0,14л, Уе=1,425л, 7,5 8,4 0,5 5,8 271,7

У0=1,5 л У„=0,227 л, Ус=1,7 л, 6,2 6,8 0,3 6,4 341,7

РН У0=1,5 л Уп=0,24 л,Ус=1,415 л 8?8 8,9 2,0 11,6 259,0

У0 - нач. объём питательной среды; Уп - объём подпитки, Ус - объём слива

Таблица 7.

Результаты оптимизации состава питательной среды и подпитки.

Условия культивирования Т, г/л РВ, % 0,% О,

р^кг

Нач. Кон.

1 2 3 4 5 6

Оптими- Сахар, кукурузный экс-

зация тракт, мочевина (Сим-

пита- плекс-метод)

тельной РВ=10,0%; кук.э.=2,5; 6,9 10,0 3,6 10,8 226,5

среды мочев.=0,5 (контроль)

Оптими- 1. Сахар. кук.э.. мочеви- 8,7 10,0 0,2 7,7

зация на (ПФЭ) 5,4 1,2 5,9

состава РВ=35%; кук.э.=15%; 8,5 2,1 6,7

подпит- мочев.=2,0% 8,3 1,6 6,6

ки Контроль 7,6 0,3 6,2 226,5

2. Подтпта без кук. .э.

сахар и мочевина раздельно

У0=1,5л У„=0,34л Ус.=1,6л 11,25 9,0 1,0 6,7 187,2

Уо=1,5лУп=0,43лУс=1,7л 10,0 9,4 1,8 6,3 225,9

С целью исключения потерь времени на загрузку ферментера, его стернлизацгао и выращивание посевного материала часто используют отъ-емно-доливной способ ведения процесса ферментации.

Известный способ получеши Ь-триптофана отьемно-долнвным способом для шт. 3557 предусматривал проводить слив ЮК при достижении концентрации РВ = 3,0%, что не всегда соответствует моменту смены фаз, а слив во второй фазе приводит к снижению активности культуры в последующих циклах.

Мы попытались устранить этот недостаток, определяя момент сли-ва-долива по сигналам датчиков Ро2 или рН.

Отъемно-доливной способ по сигналу датчика Ро2 или рН позволил стабилизировать процесс на протяжении 10-12 циклов и получать в среднем 6 г/л Ь-триптофана каждые 12-14 час. роста (табл.8). Продуктивность процесса возросла в 3 раза но сравнению с периодическим процессом. Недостатком этого способа ферментации является нашпше остаточных Сахаров в КЖ (2,5-3,0%), что приводит к необходимости использовать на стадии выделения ионный обмен.

Оптимальный объем слива 85%. Время цикла 12±2 час. роста, Т=б,5±1,0 г/л, РВОС1,Т.=2,2±1,0 %, продуктивность процесса 0,222 г/л час.

При реализации этого способа стоки с ионообменных колонн поле выделения Ь-триптофана, содержащие 3,0-3,5% РВ, используют для приготовления исходной питательной среды.

Таблица 8.

Результаты биосинтеза Ь-триптофана штаммом Вас. 5мШ/лВНИИгенетика-15 отьсмно-доливным методом.

Условия проведения процесса Т, г/л Концентрация РВ, % а,%

начало конец

1 2 3 4 5

Опгьелшо-доливной

способ

по РВ

4 долива 144 час. 5,0 10,0 3,3

Уо=15 л

по р02

1.(24час.) 6,0 9,3 2,8 9,2

2.(13 час.) 6,4 9,2 3,5 11,2

3.(15 час.) 7,7 8,0 2,8 11,9

4.(14 час.) 5,3 8,5 3,6 12,3

5.(14 час.) 5,3 6,4 2,1 12,3

6.(14 час.) 5,3 6,4 2,1 12,3

7.(17 час.) 7,4 8,4 2,4 12,3

8.(19 час.) 4,7 8,7 1,7 7,8

9.(18 час.) 4,4 8,4 1,2 6,1

10.(10 час.) 2,8 7,5 2,7 5,8

11.(15 час.) 4,4 9,0 2,5 6,8

IIa способ получено авторское свидетельство, составлены лабораторный и опытно-промышленный регламенты.

Разработанные в лабораторных условиях процессы ферментации) прошли опробование на опытно-промышленной установке института (V=30 л, 100 л), на опытно-промышленной установке Киевского завода бактериальных препаратов (V=630 л), на Фрунзенском заводе антибиотиков (V=2 м3, 16 м ), Степногорском заводе «Прогресс» (V=630 л), Бердском заводе биопрепаратов (V=I6 м3).

Таблица 9

Результаты опытно-промышленных испытании._

Завод Способ ферментации Объём биореактора Т, г/л а,%

1 2 3 4 5

Киевский завод бакпрепа-ратов 1981 г. Подпитка по Ро2 и pH 1,2 м3 6,1 4,4

1982 г. и 630 л 9,6 1,1

1984 г. Отьем-долив 630 л 5,5-7,2 (4 цикла) 2,5-3,8

1 2 3 4 5

Фрунзенский Подпитка по Р02 16 м1 8,7 2,2

завод анти- ирН

биотиков

1983г.

1989 г. м 2 м' 5,6; 6,4 3,3

Степногорск, к 630 л 6,4 0,7

завод «Про- 8,2 0,9

гресс», 1993г. 6,6 0,0

8,2 0,9

Бердский за- 16 м' 7,8 0,3

вод биопрепа- 8,2 0,3

ратов, 1999 г.

Результаты оформлены актами испытаний, составлены опытно-промышленные регламенты.

На опытно-промышленных установках перечисленных заводов проходило освоение лабораторных регламентов с целью разработки опытно-промышленных регламентов и получения опытных партий Ь-триптофана.

С использованием математической модели (14) мы определили оптимальную стратегию проведения технологического процесса:

- процесс проводится периодически до достижения Хт, при этом должны максимально использоваться массообменные возможности биореактора: выбирается максимально допустимое значение КЭ0, затем рассчитывается соответствующее ему значение Б0

если вычисленное значение Бо>150 г/л, излишнее количество вводится в виде концентрированной добавки (5Р=600 г/л) так, чтобы всегда г/л

по достижении Х=Хт, в КЖ добавляется ростовой фактор вычисленными порциями через заданные промежутки времени, так чтобы

^гтр^^прт.

Ниже приводится результаты расчета процесса при использовашш биореакгора, обеспечивающего скорость растворения кислорода при атмосферном давлении 5 кг СУм'час (давление под крышкой Р =1,9). Процесс проводится в биореакторе объемом 100 м' в течение 48 час. Начальный объём У0=55 м\ 5о=150 г/л. КЭ„=42 г/л.

Прн этом Хт=55,57 и тт=25,1 ч, Рт=10,1 г/л; 05=5о-5= 100,7 г/л. Начало подачи подпитки - 26 час. и далее через 2 часа. Результаты расчета приведены в таблице 10.

Таблица 10.

Результаты расчета процесса биосинтеза Ь-тригггофана с подачей

г, час 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

ед. ОП 58,5 63,4 67,1 69,9 72,0 73,6 74,9 75,8 76,5 77,1 77,5 77,8

ХипСП 64,3 66,7 69,2 713 73,0 74,4 75,4 76,2 76,8 77^ 77,7 77,9

цх,1Аис .0472 .0332 .0239 .0175 .0129 .0096 .0072 .0054 .0041 .0031 .0023 .0018

\Ур, г/л час 1,07 1,13 1,17 1,20 т 1,24 1,25 1.25 1Д7 1,27 1,28 1,28

ДКЭ.кг 16 86 91 77 62 49 38 29 22 17 13 10

1,1 3,4 6.5 9,0 11,1 12,7 14,0 15,0 15,7 163 16,7 17,1

Р, г/л 10,9 12,6 14,0 15,5 17.0 18,6 20,2 21,9 23,7 25,4 27,2 29,0

Бг/л 51 54 63 68 68 64 58 49 39 27 15 2

Уд. расход Б, г/г 1033 10.08 9.87 9.68 9.52 939 9.28 9.18 9.09 9.02 8.95 8.89

Выводы.

1. Культура Вас. зиЫШя ВНИИгенетика-15 способна утилизировать такие источники углерода как сахар, глюкозу, патоку зеленую, ферментативный пщролизат целлолигнина, мелассу, заваренную кукурузную муку, осахаренную кукурузную муку, осахаренное зерно (с помощью ({юр-ментов и посредством гидролиза), однако сахар-сырец является предпочтительным источником углерода в составе питательной среды для промышленного биосинтеза Ь-триптофана.

2. В качестве источника аминного азота при биосинтезе Ь-триптофана культурой Вас. тЬИИя ВНИИгенетика-15 могут быть использованы кукурузный экстракт, ферментолизаты БВК, дрожжевые БВК, замочная вода, однако в качестве основного источника ростовых факторов в составе питательной среды для культивирования продуцента Ь-триптофана следует принять кукурузный экстракт.

3. Основным источником азота при биосинтезе Ь-триптофана культурой Вас. яиЫШз ВНИИгенетика-15 является мочевина.

Возможна частичная замена мочевины на (ЫНОгСОз в соотношении 2:3.

4. При изучении морфометрических характеристик процесса показано, что, в результате даже незначительного пребывания при низкой кон-

центрацин растворенного кислорода, клетки бактерий Вас. яиЬНИз ВНИИ-генетика-15 лизируют, число лизиро ванных клеток в процессе ферментации постепенно увеличивается, достигая к концу процесса 50% и более, при этом скорость биосинтеза Ь-трнптофана снижается.

5. Подобранные модели роста, биосинтеза, потребления РВ и 02 адекватно описывают указанные процессы.

6. Экспериментальное изучение полуперноднческого процесса культивирования показало, что

подачу подпитки при биосинтезе Ь-трнптофана следует проводить по показаниям датчика Рог или рН;

определен состав подпитки;

нельзя допускать лимитирование по 02.

На основании математической модели разработаны условия оптимального проведения полупериодического процесса.

7. Определены условия проведения отъемно-долнвного процесса:

отъем-долнв следует осуществлять по показаниям датчика Ро2

или рН;

оптимальный объем слива культуральной жидкости 85% от исходного объема;

состав доливной среды готовят с учетом разбавления оставшимся объемом КЖ;

в течение 10-12 циклов удельные скорости роста и биосинтеза не снижаются;

8. Проведено, с положительными результатами, опытно-промышленное опробование процесса с подпиткой и отъемно-долнвного способа культивирования на различных заводах Советского Союза и России.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Музыченко JI.A., Альховская Л.Л., Сенаторова В.Н., Русинов В.А. Авторское, свидетельство «Способ получения L-триптофана» №1202266, 1984 г.

2. Музыченко Л.А., Альховская Л.Л., Сенаторова В.Н. Сравнительный анализ различных способов получения L-трипгофана. // Тезисы докл. Всес. конференции «Перспективы создания лекарственных средств с использованием биотехнологию), 1985 г.

3. Музыченко Л.А., Альховская Л.Л., Сенаторова В.Н. Изучение влияния условий культивирования на биосинтез Ь-триптофана.//Тезисы докладов конф. «Управляемое культивирование микроорганизмов», 1986 г.

4. Нестерова И.В., Моносов Э.З., Сенаторова В.Н., Альховская Л.Л., Кантере В.М., Музыченко Л.А., Фадеева ЕЮ. Ультраструктурные изменения клеточной стенки Вас. subtilis. - продуцента триптофана в динамике роста при периодическом культивировании //Сб. «Материалы Y1 научной конференции молодых ученых МТИПП. Секция пищевой химии и биохимии, -М., 22-24 окг. 1986 г.»

5. Музыченко Л.А., Альховская Л.Л., Сенаторова В.Н. Особенности динамики роста и биосинтеза триптофана культурой Вас. subtilis. Тезисы докладов 1Y Всесоюзной конференции «Аминокислоты для с/х, пищ. пром-сги, медицины и научных исследований», 1988 г.

6. Музыченко Л.А, Сенаторова В.Н.,., Альховская Л.Л., Моносов Э.З., Нестерова И.В., Кантере В.М. Морфометрический анализ развития микроорганизмов.//Биотехнологня, - М., 1990 г. №4.

7. Сенаторова В.Н., Музыченко Л.А., Альховская Л.Л., Горлова Т.В., Павлова Т. А., Русинов В. А., Сорвихина Е.Ф. Авторское свидетельство «Способ получения L-триптофана № 1822884, 1990г.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Сенаторова, Валентина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Использование L-триптофана в кормовых целях 1.1.1. L-триптофан как кормовая добавка

1.2. Актуальность проблемы сбалансированного питания 1.2.1. Химическая характеристика и функции триптофана в организме человека. Применение его в медицине и фармакологии

1.3. Пути биосинтеза ароматических соединений у Bacillus subtilis

1.4. Цитоморфологические исследования Bacillus subtilis

1.5. Состояние исследований в области создания технологии производства триптофана

1.6. Цели и задачи исследования

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Краткая характеристика штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика

2.2. Оптимизация питательной среды

2.2.1. Источники углерода

2.2.2. Ростовые вещества и источники азота

2.3. Цитоморфологические исследования

2.4. Изучение динамики роста и биосинтеза

2.5. Опытно-промышленная проверка

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ЗЛ. Выбор источника углерода

3.2. Выбор источника азота

3.3. Изучение влияния различных ростовых факторов на рост продуцента и биосинтез триптофана

3.4. Влияние условий культивирования на морфологию клеток штамма-продуцента и связь ее с интенсивностью роста и продуктивностью

3.4.1. Исследование морфологии культуры Bacillus subtilis в регламентных условиях культивирования

3.4.2. Исследование морфологии культуры Bacillus subtilis в измененных условиях культивирования

4. ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ РОСТА И БИОСИНТЕЗА

4.1. Модель роста

4.2. Выбор адекватной модели биосинтеза

4.3. Выбор адекватной модели потребления источника углерода

4.4 Выбор адекватной модели потребления кислорода

5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БИОСИНТЕЗА

5.1. Определение требований к культуральной жидкости и формулирование критерия оптимальности

5.2. Определение параметров полупериодического процесса

5.3. Определение параметров отъемно-доливного процесса

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование процесса и создание технологии биосинтеза L-триптофана штаммом-продуцентом Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15"

Известно, что белки различных продуктов отличаются по составу, который определяет их питательную ценность. Растительные белки, в отличие от животных, дефицитны по одной или нескольким аминокислотам. Добавление недостающих компонентов позволяет повысить усвояемость пищи и, следовательно, приблизиться к решению проблемы нехватки продовольствия.

Необходимость получения аминокислот в промышленном масштабе определяется их потребностью. Она существует в основных отраслях народного хозяйства - медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве.

Среди доступных способов получения аминокислот микробиологическое производство имеет множество преимуществ, и данная работа посвящена разработке технологии получения одной из незаменимых аминокислот - L-триптофана при культивировании штамма-продуцента Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15 на простой минеральной среде.

На основании литературных данных по биосинтезу L-трипто-фана и способам получения определены стехиометрические коэффициенты, позволяющие оптимизировать состав питательных сред.

Бактерии рода Bacillus subtilis имеют сложные ультраструктурные перестройки при переходе от вегетативных форм к образованию эндоспор. Однако в результате генетико-селекционных трансформаций данный штамм утратил четко выраженные формы циклических изменений. С целью создания новых приемов контроля за развитием культуры Bacillus subtilis ВНИИгенетика-15 изучали цито-морфологические изменения в различных фазах роста и условиях культивирования, а также корреляционные связи полученных 5 параметров с физиологическими характеристиками бактерий в процессе роста.

В опытных условиях определяли режимы и способы ферментации. На основании полученных экспериментальных данных построены математические модели роста, биосинтеза и потребления субстрата.

Разработанные процессы опробованы в производственных условиях на нескольких заводах. Масштабирование параметров процесса с учетом конкретных условий производства показало технологичность и воспроизводимость лабораторных результатов. 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Использование Ь-триптофана в кормовых, пищевых и медицинских целях.

1.1.1. Ь -триптофан как кормовая добавка

Ь-триптофан является гетероциклической аминокислотой, входящей в состав многих белков, но обычно в небольшом количестве. По химической структуре это (3-индолил-а-пропионовая кислота. В кристаллическом виде Ь-триптофан является белым или слегка желтоватым порошком, растворимым в воде (1Д4 г на 100 мл воды при 25°С). Он разлагается при температуре 282°С. Молекулярный вес Ь-триптофана 204,22. Ь-триптофан оптически активен.

В белках млекопитающих обнаружен Ь-изомер триптофана. Водные растворы Ь-триптофана имеют слабокислую реакцию. Путем синтеза получены Б-изомер триптофана и БЬ-триптофан. Установлено, что Б-триптофан является очень сладким, Ь-триптофан -пресным [1, 2]. При кислотном гидролизе белков триптофан разрушается, поэтому для его определения и выделения из белков применяется щелочной гидролиз при температуре 100-110°С .

Для животных и человека Ь-триптофан является незаменимой аминокислотой, т.к. они не способны его синтезировать; в их организме Ь-триптофан появляется лишь в результате распада белков. Это означает, что животные и человек должен получать его только с пищей в составе белка. Следует отметить, что соотношения между незаменимыми аминокислотами в пище должны соответствовать составу белка данного животного и его физиологическому состоянию, которое определяется полом и возрастом. Не касаясь здесь пока проблем питания человека, остановимся на вопросах кормления сельскохозяйственных животных и птицы. Ученые уже давно определили их потребности во всех незаменимых аминокислотах, в том 7 числе и в Ь-триптофане. Учитывая, что существуют определенные нормы расхода корма, суточная потребность в аминокислотах задается в г/кг корма и в г/кг «сырого протеина» - содержание общего азота, умноженное на 6.25. В таблицах 1.1 -1.3 указана эта потребность для наиболее используемых в сельскохозяйственном производстве свиней, кур-несушек и бройлеров.

Таблица 1.1

Потребность в Ь-триптофане для свиней. (АДМ)[3]

Вес животных, кг 5-10 10-20 20-50 50-80 80-110

Затраты корма, 0,375 1,0 2,33 2,56 2,92 кг/сутки

Содержание в корме Ь-триптофана, г/кг 1,9 1,7 1,5 1,4 1,2

Доля триптофана в 0,90 0,94 0,94 0,93 0,86 сыром протеине, %

Таблица 1.2

Потребность в Ь-триптофане для кур-несушек. [4] (ВНИТИП).

Возраст птицы, недель 1-7 8 - 16 17-20 21 -45 > 46

Затраты корма, г/сутки (в среднем за период) 23 37 66 124 120

Содержание в корме Ь-триптофана, г/кг 2.0 1.5 1.6 1.7 1.6

Доля Ь-триптофана в сыром протеине,% 0.87 0.86 0.85 0.85 0.85 8

Таблица 1.3

Потребность в Ь-триптофане для бройлеров. (ВНИТИП)

Возраст птицы, недель 1 - 3 4 - 5 6 - 7

Затраты корма, г/сутки (в среднем за период) 35 86 135

Содержание в корме Ь-трипто-фана, г/кг 2.3 2.1 2.0

Доля Ь-триптофана в сыром протеине,% 0.86 0.86 0.86

Анализ аминокислотного состава различных компонентов кормов указывает на относительно низкое содержание Ь-триптофана в зерновых компонентах кормов. Соответствующие данные приводятся в таблице 1.4.

Таблица 1.4.

Аминокислотный состав некоторых компонентов кормов.

Наименование компонента Содержание Ь-триптофана, г/кг Доля L-триптофана в сыром протеине,%

1 2 3

Кукуруза 0.8 0.89

Пшеница 1.5 1.3

Ячмень 1.3 1.18

Овес 1.5 1.43

Рожь 1.1 0.96

Горох 1.6 0.78

Отруби пшеничные 2.0 1.33 9

1 2 3

Мука рыбная 6.5 1.03

Мука мясокостная 3.4 0.89

Дрожжи кормовые 6.4 1.31

Шрот подсолнечниковый 4.3 1.19

Шрот соевый 5.9 1.40

Барда послеспир-товая (сухая) 7.7 1.96

Основной компонент кормов - злаковые - содержат недостаточное количество сырого протеина и, следовательно, незаменимых аминокислот (кроме Ь-триптофана это - в первую очередь - Ь-лизин,' Ь-метионин и Ь-треонин). Поэтому в корма вносят т.н. «протеиновые добавки» - содержащие большое количество сырого протеина рыбную или мясокостную муку, кормовые дрожжи, соевый и подсолнечниковый шрот. При этом дефицит Ь-триптофана снимается. Однако в последнее время для устранения этого дефицита резко возросло применение более дешевых кормовых аминокислот: Ь-лизина и Ь-метионина. В этом случае необходимо применение добавок Ь-триптофана [4].

1.2. Актуальность проблемы сбалансированного питания.

Стремительный рост народонаселения земного шара породил одну из острейших проблем современности - дефицит животного белка в питании человека. В некоторых странах жители получают до 90% белков из растительной пищи, в основном хлебных злаков (пшеница, овес, кукуруза, рис и др.). Содержание белков в такой

10 пище низкое и они неполноценны [5]. Это объясняется тем, что одна или несколько незаменимых аминокислот присутствуют в них в слишком малом количестве. Если белок характеризуется низкой биологической ценностью, он должен присутствовать в пище в очень больших количествах, чтобы обеспечить потребность организма в дефицитной аминокислоте, прочие аминокислоты окажутся в избытке и не будут усваиваться организмом, что создаст повышенную нагрузку на почки и печень [6]. Для полного усвоения белок должен содержать незаменимые аминокислоты в определенных соотношениях, причем, эталоном служит белок куриного яйца.

В таблице 1.5. представлено содержание незаменимых аминокислот в различных белках [5].

Таблица 1.5.

Содержание аминокислот в различных природных белках, (%)

Аминокислота Кормовые дрожжи Ячмень Рыба Молоко Яичный белок

1 2 3 4 5 6

Ь-Лизин 2,9 2,4 9,5 9,0 6,3

Ь-Метионин 0,5 1,1 2,7 2,4 5,2

Ь-Триптофан 1,1 1,1 1,4 1,3 3,7

Ь-Гистидин 2,9 2,1 2,2 2,7 2,4

Ь-Аргинин 2,9 4,3 7,5 3,5 5,7

Ь-Валин 3,6 5,1 5,5 6,7 7Д

Ь-Лейцин 3,4 6,7 8,0 9,9 9,2

Ь-Изолейцин 1,3 4,5 5,8 6,5 7,0

Ь-Фенилаланин 2,6 5Д 4,4 5,1 7,7

Ь-Треонин 2,6 3,5 4,2 4,7 4,0

11

По питательной ценности в первом ряду стоят белки материнского молока (90-97%), яиц, коровьего молока, сыра, мяса, рыбы (80-90%) и дрожжей (77%). Далее зерновые, среди которых наименьшей питательной ценностью обладают белки пшеничной муки (54%) [6 ].

Таблица 1.6. иллюстрирует качество некоторых пищевых белков.

Таблица 1.6.

Качество белков некоторых пищевых продуктов [6]

Продукт Химическая Биологическая ценность*-1 ценность**^

Женское молоко 100 95

Говядина 98 93

Яйцо 100 87

Коровье молоко 95 81

Кукуруза 49 36

Очищенный рис 67 63

Белый хлеб 47 30

Химическая ценность - определяется аминокислотным составом по сравнению с белком яиц

Биологическая ценность - определяется наличием в белке всех незаменимых аминокислот в необходимых пропорциях и в доступной форме (принимается равной 100)

Ежедневно молодым мужчинам рекомендуется потреблять 54 г белков, однако при этом подразумевается, что в пищу входят самые разнообразные белки растительного и животного происхождения. Из приведенных в табл. 1.7.данных следует, что, по крайней мере, 12 из 54 г белка должны приходиться на долю незаменимых аминокислот.

12

Таблица 1.7.

Суточная потребность в незаменимых аминокислотах для молодых мужчин [6]

Аминокислота Граммы Аминокислота Граммы

Аргинин 0» Метионин 2,02

Гистидин 2) Фенилаланин 2,02

Изолейцин 1,30 Треонин 0,91

Лейцин 2,02 Триптофан 0,46

Лизин 1,50 Валин 1,50

1-) Необходим только новорожденным и растущим детям

2) Незаменим, но точная потребность пока не установлена

Белки значительно различаются по аминокислотному составу. Для ликвидации дисбаланса аминокислоты используют в чистом виде. Добавление всего нескольких десятых долей процента недостающей аминокислоты во многих случаях приводит к повышению ценности*-1 белка более, чем на 100% [5 ].

Главным потребителем аминокислот является пищевая промышленность. Вопросы обогащения пищевых продуктов незаменимыми аминокислотами, сбалансирования рационов, т.е. добавки к малоценным белкам недостающих аминокислот, широко освещены в отечественной [8, 9] и зарубежной литературе [10].

Проводятся интенсивные исследования по возможному использованию Ь-треонина и БЬ-триптофана для обогащения продуктов питания, особенно в Японии. Употреблению этих лимитирующих аминокислот в пищевой промышленности препятствует высокая цена на них. Среди возможных сфер применения этих и других аминокислот рассматривают питание детей, обогащение низкокалорийной пищи, диетическое питание и даже специальное питание для космонавтов.

Питательная ценность или качество белка зависят от его аминокислотного состава и усвояемости

13

Многие аминокислоты обладают своим уникальным вкусом и являются элементами вкуса пищевых продуктов. Характерный вкус индивидуальных аминокислот изучен многими исследователями. Б-изомеры горьких аминокислот обычно сладкие. Ь-триптофан в два раза менее горек, чем кофеин, а Б-триптофан в 35 раз слаще сахарозы.

Как синергист, интенсифицирующий сладость сахарина и устраняющий присущий сахарину неприятный привкус, могут применяться Б- и БЬ-триптофан [11].

Наиболее дефицитны в продуктах четыре незаменимые амино-кислоты:Ь-лизин,Ь-метионин, Ь-треонин и Ь-триптофан. Такими аминокислотными добавками можно повысить качество белков злаков, делая их эквивалентными казеину. Количество используемых аминокислот колеблется между 0,1-0,4% от полного веса рациона. Исключение составляет Ь-триптофан, который следует добавлять в количестве не более 0,07% [9].

При обогащении растительных рационов аминокислотными добавками необходим учет их сбалансированности по аминокислотному составу. Так, рис, пшеницу, сорго следует обогащать Ь-лизином и Ь-треонином, кукурузу - Ь-триптофаном, соевую и арахисовую муку - Ь-метионином.

Все сказанное выше обусловило необходимость получения аминокислот в промышленных масштабах. В настоящее время мировой уровень производства аминокислот превысил миллион тонн в год. Основными способами получения аминокислот являются:

- экстракция белковых гидролизатов растительного сырья - старый способ, нерациональное использование сырья исключает его использование;

- химический синтез - достаточно эффективен, позволяет получить соединения любой структуры и использовать не пищевое сырье, достигая высокой концентрации продук

14 та, но таким способом получают только рацемические формы;

- микробиологический метод - основан на способности многих микроорганизмов синтезировать аминокислоты.

В последние годы прочные позиции начинает занимать комбинированный химико-микробиологический метод синтеза, при котором исходное соединение получают в результате химических реакций, а конечная стадия осуществляется за счет активности ферментных систем соответствующих штаммов микроорганизмов [12].

Получение одной из незаменимых аминокислот -Ь-триптофана с целью использования его в качестве биологически активной пищевой добавки - важная народно-хозяйственная задача.

1.2.1 .Химическая характеристика и функции Ь-триптофана в организме человека. Применение его в медицине и фармакологии.

Установлено, что в сутки взрослому человеку необходимо принимать с пищей 7,2-7,3 мг Ь-триптофана на 1 кг веса тела, ребенку - 30 мг/кг, грудным детям - 13-16 мг/кг. В случаях, когда женское молоко не содержит достаточного количества Ь-триптофана, ребенок отстает в развитии.

Свободный Ь-триптофан, который образуется при расщеплении пищевых белков ферментами желудочно-кишечного тракта, либо всасывается через стенку кишечника и попадает в кровь, либо подвергается расщеплению бактериями кишечника. Резорбирован-ный Ь-триптофан используется для ресинтеза белков, часть его выделяется из организма и часть подвергается обмену (схема 1.1).

15

Триптофан

Ресинтез белков Выделение Обмен Расщепление бактериями ндол Скатол

Кинуренин Серотонин Триптамин

Схема 1.1. Использование принятого с пищей триптофана [13].

Исключение из пищи всех аминокислот приводит к обеднению организма белком, что сопровождается потерей веса, анемией, общей атрофией мышц. При этом организм становится более восприимчивым к инфекциям и хуже переносит травмы и заболевания. С появлением очищенных рационов из аминокислот стало возможным исследовать изменения, возникающие при исключении одной незаменимой аминокислоты из состава рациона, полноценного в других отношениях. В опытах на животных, лишенных какой-либо одной незаменимой аминокислоты, наиболее отчетливо проявляется потеря аппетита; потребление пищи резко снижается уже после первого дня, что сопровождается немедленным отрицательным балансом азота. (Считается, что субъект находится в азотистом равновесии, когда количество азота, принятого с пищей, равно количеству азота, выводящемуся из организма. Если количество принятого азота больше, то имеет место положительный азотистый баланс, в противном случае - отрицательный) [9].

Так, у животных недостаточность Ь-триптофана вызывает помутнение роговицы, катаракту, выпадение шерсти, анемию, поражение зубов. У цыплят при недостаточности Ь-триптофана возникает повышение потребности в никотиновой кислоте.

16

К числу процессов обмена Ь-триптофана в организме человека относятся превращения Ь-триптофана в никотиновую кислоту через кинуренин и окисление и декарбоксилирование Ь-триптофана с образованием 5-окситриптамина (серотонина). В нормальных условиях на долю каждого из этих процессов приходится лишь несколько процентов всего подвергающегося превращению в организме Ь-триптофана.

У больных с далеко зашедшим злокачественным карциноидом обмен Ь-триптофана протекает преимущественно по пути превращения его в серотонин, что приводит к снижению синтеза никотиновой кислоты и развитию белковой недостаточности.

Лимитирующей в синтезе серотонина является стадия, катализируемая триптофангидроксилазой. Блокирование синтеза его или разрушение этой области приводит к нарушению сна или непрерывному бодрствованию.

Подобно тому, как Ь-метионин тесно связан в обмене с витамином В12, Ь-триптофан связан с никотиновой кислотой. Установлено, что никотиновая кислота образуется в организме из Ь-триптофана, но с весьма неблагоприятным коэффициентом - на образование одной части никотиновой кислоты затрачивается 50-60 частей Ь-триптофана. Введение никотиновой кислоты прекращает расходование Ь-триптофана на ее образование [14].

Отсутствие Ь-триптофана в пище человека и животных ведет к тяжелым нарушениям типа авитаминоза (пеллагра, характерные симптомы которой - дерматиты на открытых участках кожи лица, шеи, нарушения деятельности желудочно-кишечного тракта и нервной системы, дерматит, диарея, дименеция), что связано с пониженным обменом в направлении никотиновой кислоты[13].

Показано, что исключением Ь-триптофана из пищи можно вызвать пеллагру, а добавлением Ь-триптофана пеллагра излечивается.

17

Недостаток белка в пище создает условия для быстрого образования витаминной недостаточности (белки - это якорь, удерживающий витамины).

Витамин В6 - пиридоксальфосфат - как кофермент принимает участие в синтезе всех аминокислот и также в обмене Ь-триптофана. В результате окислительного распада Ь-триптофана образуются аминокислоты - кинуренин и 3-оксикинуренин. Под влиянием фермента кинуреазы кинуренин гидролизуется на аланин и антраниловую кислоту. Подобным же образом 3-оксикинуренин превращается в 3-оксиантраниловую кислоту - предшественник никотиновой кислоты. Незначительная часть Ь-триптофана путем окисления, а затем и декарбоксилирования превращается в серото-нин (5-окситриптамин), концентрирующийся в значительных количествах в нервной системе.

Витамин Вб у человека и млекопитающих вступает в действие в стадии образования кинуренина, осуществляет его расщепление.

Существует и другой путь обмена Ь-триптофана, состоящий в том, что при содействии аминоферазы из кинуренина образуется кинуреновая и ксантуреновая кислоты.

В случае недостатка витамина Вб наблюдается повышенное образование как кинуренина, так и ксантуреновой кислоты с их выделением из организма в большом количестве. При определении содержания пиридоксина в моче после приема 1 г витамина Вб и ксантуреновой кислоты после приема 10 г Ь-триптофана выяснилось, что приблизительно половина из 144 больных диабетом страдают недостатком витамина Вб в организме. Установлено, что витамин Вб усиливает эффект при лечении диабета инсулином. Под влиянием Вб удалось уменьшить дозу инсулина.

Производные Ь-триптофана, образующиеся в процессе его деградации в организме, занимают одно из центральных мест среди причин возникновения диабета. К ним относится хинальдиновая и

8-оксихинальдиновая кислоты. Их образование происходит нефер-ментативно из соответственно кинуреновой и ксантуреновой кислот. Предполагается, что механизм их диабетогенного действия двоякий: ингибирование синтеза проинсулина рибосомами эндо-плазматической сети |3-клеток и инактивация инсулина путем связывания и выведения цинка.

Полученные данные подтверждают значение витамина В6 для физиологического обмена Ь-триптофана как фактора, обеспечивающего завершение полного цикла превращений данной аминокислоты. Это, в свою очередь, обеспечивает образование никотиновой кислоты (витамин РР) и серотонина [15].

При исключении Ь-триптофана из пищи уменьшается его содержание в плазме крови и снижается накопление витамина А, интенсивность обмена Ь-триптофана. Наблюдается дегенерация гладких и поперечно-полосатых мышц и повреждения миокарда.

Регуляторные функции Ь-триптофана выявляются при изучении физиологических и фармакологических влияний на функциональное состояние организма. Так недостаточность Ь-триптофана или исключение его из пищи даже на непродолжительное время приводит к понижению содержания белков в сыворотке крови и органах [14].

Ряд исследователей изучал действие предшественника серотонина - 5-окситриптофана на мозг животного. Известно, что недостаток серотонина в мозгу вызывает шизофрению. Сам серотонин не обладает способностью проникать из крови в мозг, поэтому его введение неэффективно. Однако периодическое введение 5-окситриптофана в кровь животного заметно увеличивает содержание серотонина в мозгу. Появились патенты на использование 5-окси-Ь и 5-окси-БЬ-триптофана для лечения нарушений мозга, регулирования кровяного давления и в качестве антидепрессантов. Созданы также композиции, полезные для лечения депрессий, содержащие Ь-триптофан и 5-окситриптофан, триптофан лития или комбинацию Ь-триптофана, пиридоксина, аскорбиновой кислоты и Сахаров.

Соли ацетилтриптофана и Ь-орнитина, Ь-аргинина, Ь-гистидина снижают содержание холестерина и могут применяться для лечения циррозов. Ь-триптофан входит также в составы для лечения печени и ожирения [11].

Важными направлениями использования Ь-триптофана в медицине являются применение его в составе аминокислотных смесей для парентерального питания ослабленных больных в послеоперационный период для компенсации значительных потерь крови, а также в качестве вспомогательного средства при лечении умственно отсталых детей, в частности, больных болезнью Дауна[16].

1.3. Пути биосинтеза ароматических соединений у

Вас. ятлЬИПб.

Для правильного понимания процессов, происходящих при микробиологическом биосинтезе Ь-триптофана, необходимо знать биохимические реакции, ведущие к его образованию. Это поможет принимать правильные решения при создании питательных сред и находить верные объяснения возникающих затруднений при реализации технологического процесса.

Как правило, пути синтеза незаменимых аминокислот сложнее и длиннее путей синтеза заменимых: первые обычно включают от пяти до пятнадцати этапов, а вторые лишь в редких случаях насчитывают пять. Неспособность высших животных синтезировать незаменимые аминокислоты объясняется отсутствием у них одного или двух ферментов, необходимых для этого синтеза. Наибольшей сложностью отличаются пути, ведущие к синтезу таких незаменимых аминокислот как Ь-фенилаланин, Ь-триптофан и Ь-гистидин, молекулы которых содержат бензольные кольца или гетероциклы. Синтез таких колец, особенно двух конденсированных колец Ь

20 триптофана, - сложный процесс, включающий целый ряд ферментативных этапов[17].

Ведущую роль в расшифровке механизма биосинтеза ароматических соединений у микроорганизмов сыграло исследование серии биохимических мутантов, блокированных на различных этапах этого пути. В настоящее время определена последовательность биохимических реакций, ведущих к синтезу ароматических метаболитов, выявлены ферменты, осуществляющие эти реакции, и идентифицированы промежуточные продукты. Установлено, что большинство микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам, имеют сходные пути биосинтеза ароматических соединений, хотя различные группы и виды могут отличаться механизмами регуляции этого синтеза[18].

Ароматические аминокислоты Ь-триптофан, Ь-фенилаланин и Ь-тирозин синтезируются в клетках растений и микроорганизмов, тогда как для человека и животных Ь-триптофан и Ь-фенилаланин являются незаменимыми аминокислотами, а Ь-тирозин в них образуется путем гидроксилирования Ь-фенилаланина[19].

Общий путь биосинтеза ароматических соединений (рис. 1) состоит из семи реакций, которые последовательно превращают эрит-розо-4-фосфат и фосфоенолпируват в хоризмовую кислоту, представляющую собой точку разветвления путей синтеза следующих конечных продуктов: аминобензойной кислоты, никотиновой, фо-лиевой кислот, витаминов группы К, убихинонов, а также аминокислот: фенилаланина, тирозина и триптофана. Ароматические аминокислоты составляют 99% от веществ, образуемых из хоризмо-вой кислоты.

Первый фермент общего участка цепи - дезокси-арабино-гептулозонат-7-фосфат-синтетаза (ДАГФ-синтетаза) катализирует реакцию конденсации эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата с образованием 7-углеродного ациклического соединения у Вас.

21

БиЫШв, в отличие от эитеробактерий и грибов, не имеет множественных форм.

Следующая реакция - образование соединения с ароматическим кольцом - дегидрохинной кислоты. Пять последующих реакций, катализируемых ферментами дегидрокиназой, дегидрошики-матредуктазой и хоризматсинтетазой, превращают дегидрохинную кислоту в хоризмовую.

Путь биосинтеза Ь-триптофана (рис. 2) состоит из пяти этапов, последовательно катализируемых пятью ферментами. Антранилат-синтетаза (АС) - первый специфический фермент триптофановой ветви, участвует в реакции превращения хоризмовой кислоты в ан-траниловую.

Фосфорибозилтрансфераза (ФРТ) катализирует присоединение фосфорибозила к антраниловой кислоте. После перегруппировки атомов, производимой фосфорибозилантранилатизомеразой, следующий фермент - индолглицерофосфатсинтетаза присоединяет пиррольный цикл к бензольному кольцу. За последнюю реакцию синтеза ответственен фермент триптофансинтетаза (ТС), состоящий из двух идентичных полипептидов: А и В. Каждый белок в отдельности имеет низкую активность.

Рис. 1. Биосинтез ароматических соединений [ 20, 21, 22].

Рис. 2. Схема биосинтеза триптофана у Bacillus subtilis

Рис. 3. Схема биосинтеза фенилаланина и тирозина

25

Субъединица А катализирует реакцию: индолглицерофосфат индол + глицерофосфат; субъединица В реакцию: индол + серин Ь-триптофан. Реакция: индолглицерофосфат + серин Ь-триптофан + глицерофосфат осуществляется только комплексом.

Путь биосинтеза Ь-тирозина и Ь-фенилаланина (рис. 3) также начинается от хоризмовой кислоты, которая с помощью фермента хоризматмутазы превращается в префеновую кислоту. Далее префе-новая кислота под действием ферментов префенатдегидрогеназы и трансаминазы превращается в Ь-тирозин; префенатдегидратаза и соответствующая трансаминаза катализируют образование Ь-фенилаланина.

У большинства изученных микроорганизмов регуляторный контроль общего участка цепи ароматических соединений сосредоточен на первом аллостерическом ферменте - ДАГФ-синтетазе, представленном системой изоферментов, контролируемых соответствующими конечными продуктами: ДАГФфен-Ь-фенилаланином, ДАГФтир - Ь-тирозином, ДАГФтрп - Ь-триптофаном.

ДАГФ-синтетаза у Вас. БиЪиНз в отличие от всех изученных микроорганизмов представлена одним белком, поэтому регуляторный контроль этого фермента у Вас, зиЬиИй значительно отличается от контроля у микроорганизмов с множественными формами ДАГФ-синтетазы. Показано, что первый фермент общего участка пути у Вас. БиЬиив не ингибируется конечными продуктами. Однако, этот фермент заметно ингибируется промежуточными метаболитами ароматического пути: префеновой и хоризмовой кислотами. Префе-новая кислота является главным ингибитором ДАГФ-синтетазы.

Хоризмовая кислота в этом отношении менее эффективна. Количественные различия в ингибировании ДАГФ-синтетазы префеновой и хоризмовой кислотами, по-видимому, биологически оправданы: префеновая кислота является предшественником тирозина и фени-лаланина, которые составляют 80% от концентрации всех ароматических аминокислот и ингибирует ДАГФ-синтетазу в 8-10 раз сильнее, чем хоризмовая кислота.

Активность ДАГФ-синтетазы у дикого типа штаммов Вас. впЬИИз значительно выше, чем это необходимо для удовлетворения потребности клеток в трех ароматических аминокислотах. Так, например, некоторые регуляторные мутанты выделяли в среду избыток одной из трех ароматических аминокислот без дополнительного увеличения уровня синтеза ДАГФ-синтетазы.

Особенностью ДАГФ-синтетазы Вас. subtilis является то, что она образует ферментный комплекс с шикимакиназной и низкоактивной формой хоризматмутазы[23].

Показано, что активность шикиматкиназы находится не только под контролем префената и хоризмата, но также зависит от уровня АТФ в клетке. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что именно шикиматкиназа, как объект более сложного контроля, является ключевым ферментом пути ароматического биосин-теза[18].

Остальные ферменты общего участка ароматического синтеза не ингибируются конечными продуктами.

У всех исследованных микроорганизмов Ъ-триптофан ингибирует активность первого аллостерического фермента собственного пути биосинтеза - антранилатсинтетазы (АС), катализирующего превращение хоризмовой кислоты и аммония в антраниловую кислоту и пируват. В отличие от других микроорганизмов антрани-латсинтетаза у Вас. 8иЪ1Ш$ не образует белковых комплексов ни с фосфорибозилтрансферазой (ФРТ), ни с другими ферментами триптофановой ветви пути. Было установлено, что у Вас. БиЬиИй, также как и у других бактерий, этот фермент представлен двумя субъединицами: Е и X. Субъединица Е, обладающая антранилатсинтетазной активностью, в свободном виде очень лабильна и может существовать только в комплексе с субъединицей X, которая сохраняется и при 100-кратной очистке фермента.

Антранилатсинтетазная активность специфически ингибирует-ся только Ь-триптофаном. Установлено, что ингибирование конкурентно по отношению к хоризмату.

Последний фермент биосинтеза Ь-триптофана - триптофансин-тетаза у Вас. яи^Шя состоит из двух полипептидов, А и В, представляющих собой белковый комплекс, осуществляющий превращение индолглицерофосфата в Ь-триптофан. Ретроингибированию со стороны конечного продукта фермент не подвергается.

Относительно остальных ферментов пути биосинтеза Ь-триптофана известно, что они белковых агрегатов не образуют, ал-лостерическими свойствами не обладают и не ингибируются конечными продуктами.

Таким образом, регуляторный контроль Ь-триптофанового участка пути осуществляется посредством ретроингибирования АС и координированной репрессии синтеза АС и всех последующих ферментов конечным продуктом, у Вас. зиЬиНБ репрессия имеет не меньшее значение, т.к. максимальные уровни репрессии и ингиби-рования примерно одного и того же порядка.

У микроорганизмов существуют катаболические энзимы, которые разрушают некоторые аминокислоты и позволяют использовать их в качестве источника углерода. Высокая концентрация аминокислоты в клетке стимулирует синтез этих ферментов. Если организм лишить определенного катаболического фермента, можно получить мутанты с заблокированными реакциями деградации соответствующей аминокислоты.

28

Триптофаназа - индуцибельный катаболический фермент, катализирует превращение Ь-триптофана в индол, аммиак и пирови-ноградную кислоту. Действие триптофаназы - пример механизма, который контролирует уровень метаболического пула Ь-триптофана и является серьезной помехой для сверхпродукции аминокислоты.

Показано, что у Вас. subtilis индол может выделяться в результате двух механизмов:

1) путем деградации индолглицерофосфата при катализе трип-тофансинтетазой;

2) путем разложения Ь-триптофана триптофаназой. Однако, активной триптофаназы у Вас. виЫШз не обнаружено.

Хоризматмутаза - осуществляет свое действие в точке разветвления путей биосинтеза ароматических аминокислот, что определяет ее особое значение в регуляции синтеза этих соединений.

Хоризматмутаза Вас. зиЫШя не подвергается отрицательному аллостерическому контролю со стороны Ь-тирозина и Ь-фенилаланина или положительному контролю со стороны Ь-триптофана. Обнаружено, что хоризматмутаза ингибируется префе-новой кислотой. Ингибирование конкурентно по отношению к хо-ризмату. Поскольку префенат представляет собой простую перегруппировку молекулы хоризмата, префеновая кислота действует по способу классического субстратного аналога.

Итак, биосинтез ароматических аминокислот находится у микроорганизмов под строгим регуляторным контролем. В связи с этим избыточный синтез Ь-триптофана из простых источников углерода и азота, сопровождающийся его выделением в среду, возможен только в результате мутационного нарушения механизмов репрессии и ретроингибирования. Помимо этого у Вас. зиЬНИя эффективность проявления указанных мутаций зависит от определенного ге-нотипического фона: генетически обусловленного уровня активности фермента хоризматмутазы.

29

Помимо указанных путей, предполагающих наследственное изменение свойств микроорганизмов, при получении Ь-триптофана микробиологическим способом довольно часто используется способность многих из них трансформировать его предшественники^].

Эксперименты по изучению физиологии штамма Вас. ячЬиНз 3557 были начаты во ВНИИгенетика Л.Э. Семеновой под руководством Н.И. Ждановой и Л.А. Минеевой и затем продолжены Л.Э. Семеновой и Е.А. Максимовой под руководством Л.А.Музыченко.

Были проведены лабораторные исследования и опытно-промышленные испытания. Подучены данные по динамике потребления аминокислот и мочевины в течение процесса.

Показано, что в течение 6-12 час. полностью потребились Ь-лейцин, Ь-изолейцин, Ь-фенилаланин, Ь-аланин, Ь-валин, Ь-глутаминовая кислота.

На 25 час. появляется Ь- глутамин и затем Ь-глицин. К концу ферментации (на 48 час.) в среде обнаружены вновь Ь-глутаминовая кислота, Ь-валин, Ь-аланин и Ь-тирозин.

Мочевина расходуется к концу первых суток.

Кроме того, для выявления сравнительной значимости различных аминокислот был использован метод случайного баланса [24, 25].

Результаты этого эксперимента выявили положительное влияние Ь-гистидина и отрицательное влияние Ь-метионина, что прямо следует из схемы регуляции.

Отрицательное влияние треонина авторы объясняют тем, что он ингибирует гомосеринкиназу, что приводит к усилению расхода Ь-гомосерина на биосинтез Ь-метионина. Предполагается, что и Ь-лизин положительно влияет на биосинтез триптофана путем инги

30 бирования аспартилкиназы и блокирования образования Ь-метионина.

Однако с этой точки зрения, добавление Ь-аспарагиновой кислоты должно было бы ухудшить процесс, т.к. приводит к усилению биосинтеза аминокислот аспарагинового семейства, в том числе и Ь-метионина. По-видимому, здесь в результате накопления оксал-ацетата усиливается его декарбоксилирование с образованием ФЕП. Причиной отрицательного влияния Ь-изолейцина может быть накопление Ь-треонина и связанное с ним увеличение концентрации Ь-метионина.

Аналогично внесение валина может привести к возрастанию пула «активного ацетальдегида». Таким образом, биосинтез Ь-изолейцина должен ускориться с вытекающими отсюда последствиями.

Добавление Ь-аланина может увеличить концентрацию пиру-вата и интенсифицировать работу цикла трикарбоновых кислот, поставляющего в клетку Ь-глутаминовую кислоту, а, следовательно, и Ь-глутамин. Правда, известно, что в ряде случаев аланин может ин-гибировать образование глутамина [26], что, видимо, компенсирует его активизирующую роль

Поскольку Ь-серин является одним из субстратов триптофан-синтетазы, очевидно, положительное влияние избытка Ь-глицина, тормозящего сток Ь-серина на его образование, ясно.

В то же время, Ь-серин ингибирует биосинтез Ь-триптофана. Это становится понятным с учетом того, что он участвует в блоке равновесных реакций, который охватывает значительную часть реакций гликолиза, фосфоглюконатного пути и пути биосинтеза Ь-серина и Ь-глицина. Компонентами этого блока являются предшественники Ь-триптофана и ароматических аминокислот: эритрозо-4-фосфат, фосфоенолпируват, Ь-серин, рибозо-5-фосфат. Введение избытка Ь-серина нарушает равновесие, причем доля Ь-серина воз

3 1 растает, а доля остальных метаболитов уменьшается. При добавлении Ь-серина часть его обратимо превратится в оксипируват, что нарушит соотношение «глутамат/кетоглутарат» - изменение его в сторону увеличения уменьшает концентрацию в сторону всех компонентов, а концентрацию серина увеличивает.

Биосинтез Ь-триптофана стехиометрически сбалансированный процесс, поэтому вызванное снижением концентрации исходных веществ замедление процесса в целом не может быть скомпенсировано увеличением концентрации Ь-серина.

Ь-глицин в этом процессе играет сложную роль. С одной стороны, он, являясь компонентом гликолитического блока, играет роль аналогичную Ь-серину в качестве источника азота для Ь-глутаминовой кислоты. Более того, он является энергичным ингибитором превращения Ь-глутаминовой кислоты в Ь-глутамин. В то же время Ь-глицин, взаимодействуя с глиоксиловой кислотой «бай-пасирует» в цикле трикарбоновых кислот реакцию образования Ь-глутаминовой кислоты. Кроме этого, взаимодействуя с глутаминци-стеином, он стимулирует расход Ь-глутаминовой кислоты на образование глутатиона. По-видимому, два последних процесса играют большую роль. Взаимодействием с Ь-глутаминовой кислотой, видимо и объясняется положительная роль Ь-цистеина.

Так как мочевина при культивировании данного штамма является предпочтительным источником азота, логично предположить, что положительное влияние Ь-аргинина на процесс биосинтеза Ь-триптофана следует рассматривать совместно с влиянием мочевины. По-видимому, Ь-аргинин, разлагаясь до Ьгорнитина, является донором мочевины и, таким образом, ускоряет процесс биосинтеза Ь-триптофана.

Возможны две гипотезы вовлечения мочевины в метаболизм:

1. Мочевина принимает участие в реакции с Ь-глутаминовой кислотой, давая Ь-глутамин, который исполь

32 зуется далее в реакции образования антраниловой кислоты. Эта реакция энергетически более выгодна, чем реакция прямого аминирования Ь-глутаминовой кислоты аммиаком.

2. Мочевина, взаимодействуя с АТФ, образует карба-моилфосфат. Образовавшийся карбамоилфосфат непосредственно принимает участие в аминировании хоризмовой кислоты.

Второе предположение объясняет защелачивание, происходящее при биосинтезе, и интенсивное выделение СОг, сопряженное с биосинтезом триптофана.

Обе гипотезы требуют присутствия мочевины в среде в заметных количествах в течение всего биосинтеза, т.к. клетка не может запасти в себе значительные количества как карбамоилфосфата, так и Ь-глутамина.

Поэтому следует предположить, что мочевина «запускает» какой-то процесс, а далее необходимость в ней отпадает.

Таким образом, возможно непосредственное аминирование хоризмовой кислоты либо Ь-аргинином, либо Ь-аргининфосфатом, который может образовываться в условиях избытка АТФ. (Кстати, таким образом, понижая концентрацию АТФ, Ь-аргинин может активировать гликолиз на стадии фосфорилирования фруктозо-6-фосфата).

В результате этой реакции образуется Ь-цитруллин:

Ь-аргинин + хоризмовая кислота —> Ь-цитруллин + антранило-вая кислота + пируват

Далее Ь-цитруллин обычной реакцией с Ь-аспарагиновой кислотой превращается в Ь-аргинин. Фумаровая кислота, образующаяся на этой стадии, переходит в цикле трикарбоновых кислот в оксалацетат и далее, с участием Ь-глутаминовой кислоты, снова в Ь-аспартат.

33

Таким образом, роль мочевины, возможно, сводится к переводу некоторого количества Ь-орнитина дополнительно в Ь-аргинин.

Предложенная гипотеза объясняет также и положительное влияние Ь-аспарагиновой кислоты. Кроме того, данный механизм обеспечивает снижение концентрации Ь-глутаминовой кислоты и объясняет отсутствие отрицательной реакции полиферментной системы на ингибирующее влияние глицина и аланина при аминирова-нии Ь-глутамата в Ь-глутамин.

Естественно, предлагаемый механизм не исключает участия в аминировании хоризмата и Ь-глутамина.

Итак, в результате логического анализа автором цитируемой работы было объяснено отклонение от «литературной» модели биосинтеза введением гипотетической реакции аминирования хоризмо-вой кислоты Ь-аргинином. Показано также важное влияние на биосинтез Ь-триптофана процессов образования его предшественников, также предполагается наличие влияния на процесс концентрации растворенного СО2, т.к. при малых его количествах будет происходить интенсификация цикла трикарбоновых кислот, со сгоранием в нем метаболитов гликолиза и накоплением повышенных концентраций Ь-глутаминовой кислоты. При высоких же концентрациях интенсифицируется сток продуктов гликолиза на образование Ь-аспарагиновой кислоты, и, следовательно, ускорение процесса аминирования хоризмата.

В первом случае мы будем иметь избыток Ь-серина и недостаток эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата.

Во втором случае будет накапливаться антраниловая кислота при недостатке Ь-серина[27].

34