Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые подходы к конструированию рекомбинантных штаммов - продуцентов рибофлавина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые подходы к конструированию рекомбинантных штаммов - продуцентов рибофлавина"

На правах рукописи

Для служебного пользования Экз. Н £2>

СЖоУЬ/ КоОЪ

ШТАШЮВ - ПРОДУЦЕНТОВ РИБОФЛАВИНА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации в? оеисканае ученой сггп™-кгндцдаг^ геологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научные руководители:

кандидат биологических наук Ю.А.В.Йомантас кандидат биологических наук Н.В.Стойнова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. А.С.Миронов кандидат биологических наук Л.В.Генинг

Ведущая организация -

Отделение молекулярной и радиационной биофизики Санкт-Петербургского Института ядерной физики им.Б.П.Константинова РАН

Защита состоится г. в л 1 час. мин

на заседании Диссертационного совета Д 098.12.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и . селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИ Генетика.

час.^

« й<бса1Ъ§>

Автореферат разослан " г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук ' ¡^Ц^. В.И.Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Клетки бзгшпт широко используются з качестве продуцентов ряда биологически активных веществ - ферментов, антибиотиков, гжно-:сгтолст. В последнее время на основе ВясШиб заЫШБ был создан ряд продуцентов рибофлавина. Рибофлавин {витамин В2) используется в составе ряда медицинских и кормовых препаратов, а также б шг-промышленности. Животные клетки не способны синтезировать рк-Софггсш '' дся*нн получал» сгс с яда?»*. Недсс^^гск рибофлавина в организме приводит к нарушению белкового обмена, замедлению роста. Рибофлавин относится к группе коферментных витаминов и является предшественником флавиновых коферментов - флавинаденинмононуклео-тида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД), которые входят в состав многих окислительно-восстановительных ферментов-флавопроте-идов.

Оукествувдие в настоящее время микробиологические способы получения рибофлазива основаны на использовании в качестве продуцентов дражней и дрогякеподобиых грибов Егето1Ьес1т гвЬуа и А5ЬЬуИ В0551р1, синтезирующих до 6 г/дг рибофлавина за 160 часов культивирования, а такле бацилл. По сравнению с грибными продуцентами бациллярные обладают рядом преимуществ: она имеют более высокую скорость роста на простых питательных средах, синтезируемый клетками рибофлавин секреткрузтсл в куяътуразьвую жидкость, что упрекает его выделение и очистку. Бациллы обладают мойным пентозным циклом, обеспечивающим высокий уровень накопления промежуточных метаболитов, тем самым сннтез рибофлавина не лимитируется ттулом предшественников, в частности пуринов. Бактерии В. зиЫШг: относятся к микроорганизмам, генетический аппарат которых достаточно хорсто изучен, что поаволяет использовать для создания штаммов-продуцентов методы генетической инженерии. Кроме того, биосинтез рибофлавина у В. зиЫШв и его регуляция подробно изучались на протяжении многих лет как у нас в стране, так и за рубежом.

Результатом проводимой в течение ряда лет в ГосНШ генетики работы явилось создание серии рекомбинантных промышленных штаммов ВасИ1и5 внЫШб и Ват Низ ату1о11цие?ас1епв, способных накапливать в оптимальных условиях около 10 г/л рибофлавина за 60 часов культивирования. Сверхсинтез рибофлавина у этих штаммов обеспечи-

вается присутствием рекомбинантной плаэмады phiX45, имеющей в свое составе клонированный рибофлавиновый оперон В. subtilis. Однако плазмидные штаммы-продуценты как правило характеризуются рядом не достатков: нестабильностью при длительной ферментации; трудностям в подборе и обеспечении оптимальной дозы клонированных генов; ограничениями на использование плазмидных штаммов в промышленности.

Основная цель настоящей работы заключалась в разработке' новь подходов к конструированию рекомбинантных штаммов-продуцентов на основе В. subtilis, связанных с интеграцией в хромосому гетероло-гичных фрагментов ДНК, обеспечивающих сверхсинтез целевого продук та. В качестве модели была использована интеграция рибофлазиновог оперона В. amyloliquefaciens в хромосому штамма В. subtilis - про дуцента рибофлавина. В задачи исследования входило

- создание интегративных векторов, включающих клонированный дерепрессированный rib-оперон В. amyloliquefaciens-,

- введение rib-оперона В. amyloliquefaciens в хромосому модельного штамма В. subtilis путем встраивания гетерологичного фрагмента в триптофавовый оперон;

- введение rib-оперона В. amyloliquefaciens в случайным образом -выбранный локус хромосомы модельного штамма В. subtilis ("random integration");

- создание штаммов В. subtilis - продуцентов рибофлавина с интегрированной копией rib-оперона В. amyloliquefaciens;

- конструирование штаммов-продуцентов с дупликацией и амплификацией rib-оперона В. amyloliquefaciens в хромосоме

В. subtilis;

- анализ стабильности и продуктивности полученных штаммов -продуцентов рибофлавина.

Научная новизна и практическая ценность работы

Предложена альтернативная модель конструирования рекомбинантных штаммов-продуцентов. Вместо' использования плазмидных векторов для введения в клетку необходимых генов модель предполагает интеграцию гетерологичных фрагментов ДНК, ответственных за биосин тез целевого продукта, 'непосредственно в хромосому-штамма-продуцента. ~

Сконструированы-интегративные векторы pES8, pACYC184-Rib-CmR и рЕК14 для введения дерепрессированного рибофлавинового оперона В. amyloliquefaciens в хромосому В. subtilis.

Рибсфлазкновый оперон В. amyloliquefaciens интегрирован в область триптофанового оперона хромосомы В. suhtilis: как модельного шт?«ма В. subtilis ribS850, так и итамиа - продуцента рибофлавина У25.

РкбофлзхикоЕкй оперон В. amyloliquefaciens интегрирован в случайный локус хромосомы В. subtilis, использованная схема интеграции, в отличие от применяемых ранее, позволила избегать дополнительного этапа промежуточного клонирования гетерологичннх фрагментов ДНК в Е. coli. Отобраны стабильные варианты интеграции во Кгшйеяяу, позучег Сетжаатхвая 'штамм-продуцент Y51, синтезирующий в три раза больпез количество рибофлавина, нетели шташ-реципиент.

, Сконструированы бесплазмидкые рекомбннактные ата><олы-продуценты Y64-5 и Y64-20 с дупликацией и ашлификацией rib-оперона В. axiyloliquefaciens в хромосоме В. subtilis;

Проведен анализ стабильности и продуктивности полученных штаммов - продуцентов рибофлавина, который показал, что наибольшее количество рибофлавина синтезируют плазмидный штамм В.subtilis Y51/pMX45, имеющий в хромосоме дополнительную копию дерепрессированного rib-оперсна В. amyloliqusfaciens (около 5-7 г/л при культивировании в колбах и 14-15 г/л - з лабораторном ферментере) и бесплазмидный штамм В. subtilis Y64-20, имеющий в хромосоме тандемкую амплификацию дерепрессированного rib-оперона В. asryloliquefaciens (около 8-9 г/л при культивировании в колбах). Достигнутый уровень продуктивности превышает уровень продуктивности плазмидных штаммов-продуцентов В. subtilis, применяемых в настоящее время в промышленности для микробиологического. синтеза рибофлавина.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, ' обзора литературы, экспериментальной части, включающей обсуждение результатов и выводы.

Материал изложен в 5 главах, включает 16 рисунков и 6 таблиц. Список цитированной литературы содержит 143 наименования.

Апробация. Результаты работы были представлены на на семинарах отдела биотехнологии ГосНШ генетика (ГосНШ генетика, Москва, 1995,1996), на 3_й^аучной конференции ГосНШ генетика (ГосНШ генетика, Москва, 1996) 1.

- б -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все исходные штаммы были получены из Всероссийской коллекцш промышленных микроорганизмов (ВКШ) при ГосНИИ генетики. В работ« использовали В. awloliquefaciens А50 ribOl (АЕ451), В. subtilis ribG850, ribBlíO, ribAS29, ribHlB, ribD107 мутанты, а также их гесЕ-производные и штамм - продуцент рибофлавина В. subtilis 24/рМХ45 гесЕ4. E.coli К-12: TG-1 (lac pro)thi strA supE endA sbc hsdR F'traD36 proAB lac z MIS; BSV-18 ribA::Tn5.

В работе использовали плазмады из лабораторной коллекции: P30R2, pUCÎQ-CwR, рКМ2, рЕП7, pACYC184, pUC7-CmR. Плазмида pBT61, содержащая клонированный гесЕ ген В. subtilis и плаамида рВТбЭ, содержащая тот же ген, инактивированный встраиванием гена cat, 61 ли любезно предоставлены нам доктором J.C. Alonso (ФРГ).

Среды. Для выращивания бактериальных культур использовали бульон Хоттингера или L-бульон. Минимальной средой для бацилл ел? жила среда Спицайзена, а для Е. coli - среда Адамса. Соответствуй щие твердые среды содержали 1.5Z агара.

Антибиотики применяли в следующих концентрациях: эритромицин (Em) - 10 мкг/мл, канамицин (Km) - 7 мкг/мл, ампициллин (Ар) - 100 мкг/мл, тетрациклин (let) - 25 мкг/мл, хлорамфеникол (Cm): для £. coli - 10 мкг/мл, для В. subtilis - 5 мкг/мл.

Для определения продукции рибофлавина бактерии выращивали 72 часа в колбах при температуре 37°С на среде, содержащей 12У. сахарозы, 2% сухих дрожжей, 0,6% мочевины, 0,05% MgSÛ4x7 Н2О. Концентрацию ввделяемого рибофлавина определяли спектрсфотометри-ческим методом при длине волны 445 нм. Упаривание культуральной жидкости в ходе ферментации при определении продукции рибофлавин, не учитывали.

Трансформацию штаммов В. subtilis проводили по модифицированной методике Анагностопулоса и Спицайзена (Anagnostopoulos an Spizizen, 1961) а Е. coli - по модифицированному методу Козна (Kohen et.al., 1972).

Выделение хромосомной ДНК осуществляли по модифицированному методу Клотса и Зимма (Klots and Zimm, 1972).

Выделение плазмидной ДНК проводили по модифицированному методу щелочной денатурации Бирнбойма и Доли ( Birnboim and Doll, 1979). При необходимости подученные препараты плазмидной ДНК очи щади от пршеси хромосомы равновесным центрифугированием в гради

. )

?нте хлористого цезия с бромистым этидием (Маниатис и др., 1984).

Ферменты получали из фирмы "Fermentas" (Литовская республика) . Реакции" прсподиэта в стандартных условиях. Электрофорез фрагментов ДНК проводили в 0.8 % агарозе.

Активность рибойшавинсинтазы определяли по методу Вреслера с ¡^пользованием б,7-диметил-8-рибитшишмазина в качестве субстрата (Бреслер и др;, 1972).. Активность фермента выражалась з нМоль образовавшегося рибофлавина на мг белка в минуту.

-Фаги. В работе использовали фаги Е40 (Ю. Йомантас, ГосНЖ генетика) и AR9 (Р.Азизбекян, ГосНйй генетика). Трансдукцию фагом E4Q клеток В. subtilis проводили по методике Ю.Йомантаса (ГосНИИ генетика). ■

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Рад недостатков, характерных для плазмидных продуцентов, вынуждает к поиску альтернативных подходов. Целью настоящей работы была разработка метода интеграции чужеродных генов в хромосому

В. subtilis и изучение возможностей этого метода для конструирования рекомбивантных штаммов.

1. Разработка метода интеграции чуиерЬдши генов в хромосому 3. subtilis на модели рнбофлавинового оперона В. anyloliqiiefacieiis

Среди известных методов интеграции чужеродных генов в хромосому В. subtilis мы выбрали способы, связанные с использованием в качестве интегративных векторов плазмид, не реплицирующихся в бациллах.

i. i. йсисхруирование иитегратишшх векторов pES8 и рЕК14

Для введения fîb-оперона В. amyloiiquefacisns в хромосому В. subtilis был сконструирован вектор pES8 (рис.1).

При конструировании мы использовали плазмиду p30R2 из лабораторной коллекции. Эта плазмида содержит клонированный rlb-оперон из штамма В. amyloiiquefaciens А50 ribOl. Операторная мутация ribOl, обусловливающая дерепрессию оперона, позволяет штамму накапливать около 20- мкг/мл рибофлавина. Ранее в нашей лаборатории была определена нуклеотидная последовательность клонированного оперона (ЕШЬ Х95955) :

Полученный вектор pES8 содержит плазмиду pUC19, ген усчзйчи-

Рис. 1. Конструирование интегративного вектора pES8

вости к хлорамфениколу (cat), экспресмфующикся в бациллах, и ри-бофлавиковый оперон В. amylaliguefacians А50 ribOl. Плазмида pES8 реплицируется в клетках Е. coli, но не может "существовать в клетках 5. subtilis в автономном состоянии, так как не имеет репликона грашгсшжительных бактерий.

Аналогичным образом был сконструирован и друг'ой вектор, маркированный геном устойчивости к кзначицину (Km) рЕК14 АрР* КлР Rib Он объединяет в себе плазмиду £. coli pUClQ, ген устойчивости к ка-намицину (Кпё), экспрессирующийся в бациллах, и рибофлавиновый оперон В. зщ/lcliquefaciens AS) ribOl. Этот вектор также реплицируется только в клетках Е. coli.

Оба сконструированных вектора - pES8 и рЕК14 - не имеют фрагментов, гомологичных хромосоме В. subtilis. Поэтому, чтобы интегрировать эти плазмиды в хромосому, необходимо включить в их состав фрагменты ДНК, имеющие гомологию с хромосомой В. subtilis. В этом случае плазмида может интегрироваться в хромосому путем гомологичной рекомбинации.

1.2. Интеграция рибсфлявинового оперона В. smylcliquefcciens в триптсфананнй оперон В. subtil is

Нестабильность рекомбинанткых штаммов-продуцентов, как правило, коррелирует с уровнем экспрессии клонированных генов. Поэтому для создания стабильных рекомбинантных итзммоз-продуцентов необходимо подобрать оптимальный уровень экспрессии. Одним из способов такой оптимизации монет быть последовательная интеграция клонированных генов в хромосому реципиентного штамма. Первым этапом в реализации такого подхода была интеграция плазмиды pES8, содержащей клонированный rib-оперон В. amyloliquefaciens, в триптсфансвкй оперон модельного штамма В. subtilis ribSSSO.

Схема интеграции плазмида представлена на рис.2. ДНК плазмиды рсГб расщепляли BainHl рестриктазой и дотировали со смесью EcoRl-BglZ, SíflS-Psti ДКК фрагментов тркптофанокого оперона хромосомы В. subtilis, имевшихся на плазмиде p£D7 (pUC18-trp В.su). Лигированкой смесью трансформировали клетки В. subtilis ribGSSO. Отбирали.CsR Ribt Trp~ трансформанты, выделяющие в среду рибофлавин, но нуядавдиесячв"триптофане. Так как pES8 не имеет репликона, обеспечивающего автономную репликацию плазмиды в клетках В. subtilis, Есе трансформанты ..с Rib+ аif1 Тгр~ фенотипом содержат интегрированную в хромосому, внутрь триптофанового оперона, плаз-

В. эй. пЬС850

I

В.ат. гсЬ-орегоп СтБ пЪ(*,В1РА,Н,Б

В.зи. пЬС850 1грЕ Ь-рБ, 1грС,Р,В,А

£

В. зи. Т2 пЬС850 1гр::рЕ36 (СпхН, ШЬ+, Тгр-)

Рис. 2. Интеграция ркбофлавиноваго опероиа В. ату1оПф1еГас1ет13 внутрь триптсфановаго операнд В. гиЫлПз

- il -

миду pES8, имеющую рибофлазиновый оперон В. amyloliquefaciens и ген устойчивости к хлорамфениколу. Так был получен интегрант Б. subtilis 72 ribG350 (del ribG-rlbS); trp::pES8 (del trpD), имеющий Rib"' CiiiR Ггр" фенотип. Штамм-интегрант 72 выделял в среду рибофлавин и не рос ка минимальной среде из-за делеции в трилтофано-зом опероне. Штамм Г2 был стабилен и сохранял признаки устойчивости к хлсрзггфэвкгаяу и синтеза рибофлавина в течение 20 генерации при росте в среде без антибиотика.

По-видимому, интеграция в хромосому нереплицируш.ейся в Са-чи-о.иал проходила через две точки рекомбинации с за-

мещением частя тркятофзнозого оперона. .Tsiosî обраасш, ь :фагссому (в триптофановьгй оперон) интегрирован рибофлавиновьш оперен В. amyloliquefaciens, ген хлорамфениколацеткл трансферазы (cat), обеспечивающий устойчивость клеток к хлорамфениколу, и плазмида PUC19.

1.3. Интеграция рибофлавинового оперона В. smylolîquefaciens

в вибранзкй елугайннм сбрагом жжус хромосомы В. subtilis

("random integration")

Для интеграции гетерологичных генов (генов рибофлавинового оперона В. amyloliquefaciens) в хромосому В..subtilis з данном случае мы использовали рекомбинационное встраивание кольцевой ДНК по механизму Кзшбелла.

ДНК плазмкды рЕК14 расщепляли зндонуклеазой BawHl, смешивали с БаяйЗ-фрагкентами хромосомной ДНК 3. subtilis и обрабатывали по-линуклеотидлигазой. Полученную смесь использовали для трансформации клето:: 8. subtilis ribG850. Отбирали КяР Rib* трансформанты, выделяющие в среду рибофлавин. Так как рЕК14 не имеет регшгкона, обеспечивающего автоиошгуа репликацию плазмиды ь клетках В.subtilis, все отобранные трансформанты содержат интегрированную в хромосому плазмиду рЕК14. Схема интеграции представлена на ркс.З, В уедевких нашего эксперимента на 5 мкг ДНК и 1 m реципк-ентных клеток было получено около 1000 клонов.

Примерно 1% титегоантов являлись ауксстрофзми и не росли на минимальной среде. Большинство интегрантов с высокой частотой теряли устойчивость--я хлорамфгникаяу и способность синтезировать рибофлавин при росте в среде без антибиотика, однако, примерно 2Z из проверенных клонов стабильно наследовали эти признаки в неселективных условиях.

ЕсоШ

В. эиМЩБ БЖ ааЪ ,

ВашШ

^аэе

Ф

В. зиЬиИБ пЪС850

V

ааЪ

В. ату1о^иеГас1еп8 ^ г1Ь-орегсп ф

КтР.

ааЪ

В. эиЪиШ ВК53г1ЬС850 ааЪ::рЕК14 (ШЪ+ КтЯ)

Рис. 3. Интеграция рхбофлавинавого оперона В. ащу1оЗлдиеГас1епз в случайным образом выбранный локус хромосомы В. бнЫлИб

Считается, что нестабильность интегрантов обусловлена прямыми повторами, - образующимися з процессе рекомбинации по механизму Кэмпбедла. Механизм образования стабильных интегрантов неизвестен. Можно предположить, что стабильность зависит от длины повторов -чем короче повтор, тем стабильней интегрант.

Предложенный нами метод позволяет путем относительно простой процедуры интегрировать чужеродные гены в различные участки хромосомы В. subttlis. Аналогичный подход был использован ранее финскими исследователями для интеграции гена альфа-амилазы В. а™/1 ohquefaciens в хромосому В. subtilis (Kallio et al, 1987), но в этой работе, в отличие от нашей, после получения рекомбинанткьк плазмид in vitro проводили их амплификацию в клетках £. coli. Нем удалось обойтись без этапа промежуточного клонирования, что значительно упрощает всю процедуру интеграции. Кроме того, известно, что в некоторых случаях при клонировании бациллярных генов в Е. coli в них с достаточно высокой частотой могут происходить перестройки. Это обстоятельство следует учитывать особо при конструировании штаммов-продуцентов, когда по тем или иным причинам невозможно контролировать сохранение активности.продуктов всех генов поело промежуточного клонирования. В таких случаях, чтобы уменьшить вероятность полной или частичной инактивации клонированных генов, следует по возможности избегать этапов промежуточного клонирования.

По сравнению с методом интеграции гетерологичкых генов в определенный локус хромосомы (в нашем случае - в триптофановый опе-рон - см. разд. 1.2), предложенный ¡.тетод является более универсальным, так как не требует предварительного клонирования генов - мишеней для интеграции.

Среди стабильных интегоантов был отобран штамм ВК53, который сохранял признаки устойчивости к каклшцину л синтеза рибофлавина в течение по крайней мере 20 генераций при росте в среде без антибиотика. Генетическое картирование, проведенное при помощи фага AR9, позволило определить, что в Еггаме Щ53 локус, в который интегрирована плазмида pEKl-1, и;годится зйгиеи гришт-фанового оперо-на, так как 51% транедуго-антов к прототрофии у ixpC2 реципиент приобрели устойчивость к канамицину.

2. Создание штаммов В. хиЬЫИв - продуцентов рибофлавина с интегрированной копией оЬ-оперона В. аяу1о12цие?зс1 епя

На этом этапе работы мы попытались выяснить, каким образом введение дополнительных гетерологичных копий г1Ь-оперона сказывается на продуктивности штаммов, синтезирующих рибофлавин.

В качестве исходного штамма для конструирования реципиента, необходимого для введения в хромосому г!Ь-оперона В. ату1оНсзие£ас1еп5, мы использовали продуцент рибофлавина В.зиЬЫИз 24/рМХ45 гесЕ4. Ок содержит плазмиду рМХ45, в состав которой входит гхЬ-оперон В. 5иЬЫИ$. На элиминировали из штата плазмиду 0X45 и восстановили способность к рекомбинации, используя клонированный ка плазмиде рВТ61 гесЕ ген. Трансформанты, отобранные аа згаризованной 1В среде с канамицином, пересевались ка 1В среду,. содержащую 0,05 мкг/ки митомицина С. В этих условиях вырастали крупные -колонии рекомбинантов, востановивших в хромосоме дикую аллель гесЕ гена. Среди них мы отбирали чувствительные к ка-намицину колонии, потерявшие плазмиду рВГ61. Плазмиду рМХ45 мы элиминировали выращивая клетки в ЬВ среде без эритромицина при высокой температуре Полученный штамм В. БиЬЫНэ ¥25, ко-

торый продуцировал рибофлавин, имел гес+ генотип и не содержал плаамид, мы использовали в качестве реципиента для введения дополнительных гетерологичных копий гИэ-опёрона.

Первый этап работы заключался во введении в полученный реци-пиентный штамм гИэ-оперона В. апу1аИдиеГас1еп£ в составе плазмиды р3002, а также анализе влияния плазмиды на стабильность и продуктивность штамма.

Клетки В. зиЫШв ¥25 мы трансформировали ДНК плазмиды рЗОИ2. Полученный штамм У25/рЗОЙ2, имел в 2 раза большую ферментативную активность рибофлавинситазы и продуцировал в 2 раза больше рибофлавина, чем бесплазмидшй штамм У25 (табл.1). Такой прирост продуктивности и активности рибофлавинсинтааы примерно соответствует низкой копийности плазмиды, несущей дополнительные копии ри-бофдавинового оперона (известно, что плазмиды с тем же репликоном присутствуют в клетке в количестве 1-3 копий).

Однако, при ферментации или длительном хранении штамма У25/рЗЗИ2 популяция клеток культуры становилась неоднородной. В культуре появлялось от 5% до 40% клонов, потерявших повышенную продуктивность. 'Зти клоны быстрее росли, бьши устойчивы к эритромицину, сохранили плазмиду, но имели мутировавший и уже не функци-

онирующий рибсфлавиновый оперон В. amyloliquefaciers. Выделив плазмиду из мутантных клонов, мы провели комплементационный анализ, трансформируя плазмидной ДНК разные ауксотрофные по рибофлавину мутанты В. subtilis.' Мы определили, что, плазмиды из разных мутантных клонов содержали мутации в разных генах rib-оперона В. amyloliquefaciens. Таким образом, было показано, что плазмида p30R2 з продуцирующем рибофлавин дерепрессированном штамме нестабильна. Однако, как показали опыты, плазмида p30R2 оставалась стабильной в лабораторном штамме дикого типа В. subtilis 168 trp02. Мы предположили, что нестабильность плазмиды p30R2 в штамме Y25/p30R2 связана с высокой и непосильной для клетки экспрессией Tib-генов.

В связи с этим, мы решили постепенно увеличивать дозу rib-генов, последовательно интегрируя в хромосому клетки дополнительные копии рибофлавинового оперона В. amyloliquefaciens.

Для переноса интегрированного рибофлавинового оперона В. amyloliquefaciens из модельного В. subtilis Т2 ribG850 trp::pES8 (del trpD) штамма в продуцент В. subtilis Y25 мы использовали транедуцируюшй фаг Е40. Отбор транедуктантов вели по признаку устойчивости к хлорамфениколу. Ген хлорамфеникол ацетилт-рзнсферазы интегрирован в хромосому В. subtilis рядом с интегриро-' ванным рибофлавиновым опероном В. amyloliquefaciens и при транедукции переносится совместно. В результате был получен штамм Б. subtilis Y43 trp: :pES8 (Rib'* Cirp Trp"). Этот штамм имеет две копии рибофлавиновых генов в хромосоме: одна В. subtilis, вторая -В. amyloliquefaciens. Приведенные в табл.1 данные указывают на тс, что продукция рибофлавина и ферментативная активность рибофла-винсинтазы (продукта гена ribB) болыге у штамма, который имеет большее количество рибофлавиновых оперонов. Однако, в отличие от плазмидного ита)ма Y25/p30R2, бесплазмидный штамм-интегрант Y43 был стабилен. При ферментации, длительном хранении или выращивании не менее 20 генераций в аалгещзняой срсч е без аитз^гг-тга. популяция клеток Y43 штамма остава/гсъ однородной. В культуре не появлялись клоны, потерявшие продуктивность или устойчивость к хлорамфе-николу, что указывает на стабильность интегрированной структуры.

Таблица 1. Продукция рибофлавина и активность рибофлавинсинтазы у штаммов Б. subtilis

Штамм Рибофлавин (г/Л) Активность рибофлавинсинтазы (нМ/мг мин)

Y2S 0,9 0,6

Y25/P30R2 2,1 1,6

. Y24/pMX45 4.0 1,3

Y43 1.6 1,9

Аналогичным образом, при помощи трзнсдукцш фагом AR9, мы переносили интегрированную копию рибофлавинового оперона В. amyloliquefaciens из модельного штамма 'В', subtilis BK53'ribG850~ aab::pEK14 Rib* КпР в продуцент В. subtilis Y25. Отбор трансдук-тантов вели по признаку устойчивости к канамнцину. В результате бшг получен штамм В. subtilis Y49 aab::pEK14 Rib+ КпР. Этот штамм имеет две копии рибофлавиновых генов в хромосоме: одна -В. subtilis, вторая - В. amyloliquefaciens, и синтезирует в два раза больше рибофлавина, чем исходный'штамм Y25 (табл.2).

Для последующего введения плазмид с гомологичными хромосомным фрагментами ДНК в штамм Y49 была введена мутация recE:":cat, нарушающая гомологичную рекомбинацию. Эту мутацию мы перенесли в штамм Y49 из линеаризованной плаамиды рВГбЗ recE::cat трансформацией. Отбор трансформантов осуществляли по признаку устойчивости к хло-рамфениколу. Таким образом, был получен штамм В. subtilis Y51 sab: :-рЕК14 гесЕ:;cat (Rib+ КпР СпР}, синтезирующий б три раза больше рибофлавина, чем исходный штат Y25 (табл.2).

С целью повышения продуктивности, в штамм Y51 вводили как плазмиду p30R2, содержащую rib-оперон В. amyloliquefaciens, так и плазмиду рМХ45, содержащую rib-оперон В. subtilis. Наибольшее ко-

личество рибофлавина синтезировал штамм В. subtilis Y5i/pMX45 - в 5 раз больше, чем исходный штамм Т25 (табл. 2).

Таблица 2. Продукция рибофлавина у штаммов В. subtilis с интегрированной копией rib-оперона В. amyloliquefaciens

Штамм Рибофлавин

(г/Л)

YZ5 0,9

Y49 2,5

Y5Î 3,3

Y51/pMX45 5,2

Таким образом получен рекомбинантный штамм В. subtilis Y51/pMX45, имекпядй в одной бактериальной клетке не менее четырех шбофлавиновых оперонов и сиь ";.:ируящий около 5-7 г/л рибофлавина при культивировании в колбах и около 14-15 г/л - в лабораторном ферментере, с коэффициентам конверсии сахарозы ско;ю 9%. Этот уровень продуктивности превышает уровень продуктивности штаммов, используемых в настоящее вро;я в промышленности дли микробиологического синтеза рибофлавин?:.

3. Конструирование пгга^жй-гпрояупеитсга с регулируемой дозо/î генов биосинтеза рибофлавина Введение в хромосому продуцента гегеролоплшой кс;п:и рибофлавинового оперона увеличивает его щюдукгив»-^ "я>, ко не позволяет

тем не менее достичь уровня накопления рибофлавина, характерного для штаммов, содержащих полный rib-оперон в составе плазмиды. Последнее обстоятельство возможно указывает - на то, что уровень синте-

за предшественников рибофлавина (гуанозинтрифосфата и рибуло-зо-5-фосфата) достаточен и возможности увеличения продуктивности штамма за счет введения дополнительных копий rib-спгрока не исчерпаны. Поскольку rib-оперон В. amyloliquefaciens в клетках продуцента чрезвычайно нестабилен в составе плазмиды, 'мы предполагали необходимым постепенно увеличивать дозу генов биосинтеза рибофлавина при помощи контролируемой амшшфикации rib-оперона В. amyloliquefaciens непосредственно в хромосоме В. subtilis.

С этой целью был. сконструирован интегративный вектор . pACYC184-Rib-Cm (рис.. 4а), который содержал плазмиду PACYC184, реплицирующуюся в Е. coli, но не в бациллах; рибофлавиновый оперон В. amyloliquefaciens; а также экспрессирующийся в бациллах ген хлорамфеникол ацетклтрансферазы (cat) из плазмиды ,рС194. Полученная плазмида может встраиваться в хромосому В. subtilis Y49 aab: :рЕК14 путем гомологичной рекомбинации.

Трансформируя клетки продуцента Y49 препаратом нативной плазмиды pACYC184-Rib-Cm и отбирая устойчивые к хлорамфениколу (5 мкг/мл) клоны, мы получили штамм В. subtilis Y64-5, содержащий плазмиду pACYC184-Rib-Cm, интегрированную в хромосому в соответствии с моделью Кзмпбелла (рис. 4Ь). Гек хлорамфеникол ацетилтранс-фераэы (cat) в хромосоме штамма Y64-5 фланкирован прямыми повторами rib-оперона. Известно, что для подобных структур при увеличении концентрации хлорамфеникола в ростовой среде возможен отбор образующихся в ходе репликации вариантов с увеличенным числом копий cat гена. При этом в состав тандемно амплифицирующейся единицы входит ritronepoH В. amyloliquefaciens (рис. 4с).

Амплификация rib-оперона проводилась ступенчато: клетки штамма Y64-5, устойчивые к 5 мкг/мл хлорамфеникола (Cm), выращивали в течение суток в жидкой полноценной среде, содержащей 10 мкг/мл Cm, после чего высевали на агаризованную среду с той же концентрацией Ст. Среди выросших на увеличенной дозе Cm клеток-амллификантов выбирали варианты с максимальной продуктивностью, полученный штамм обозначали Y64-10 (две последние цифры указывают на пороговый уровень устойчивости к Cm). Описанную процедуру повторяли, последовательно увеличивая концентрацию хлорамфеникола до 60 мкг/мл. Таким

BamHI

BaraHI

b)

aab

Y49

ScoRi

KmR

EcoRl

aab

Rib B.am.

c)

aab

KmR

CmR

^ Integration

aab

Y64-5

Rib B.am. Rib'B.am.

, KmR ^ „ CmR aab _ Rib B.am._

Amplification CmR

Rib B.su.

Rib B:su.

CmR

Y64-20

—^Rib B.am. Rib B.am. Rib B.su.

amplifies ■' ;m unit

Pkc. 4. a - ;!Trrf?rpaTHBnaii >nsnicp pAC'fCiBl-V>Ab-C,r.;

b - ero iaiTorpasTfin a j.vo'.ii.r.nuy n. s'&tilis; c - aMumiiwaqua -p:36o$jsH:-Jinoiioro •.-«i'poHa e zpomocom«?

образом была получена серия штаммов - продуцентов рибофлавина, с тандемко амплифицированным внутри хромосомы рибофлавиновым оперо-ном В. amyloliquefariens (В. subtilis Y64-5, Y64-10, Y64-20, Y64-40), у которых, как мы предполагали., увеличение числа копий оперона коррелировало с повышением уровня устойчивости штаммов к хлорамфеникшу.

Анализ продуктивности полученных штаммов (табл. 3) показал, что оптимальным для синтеза рибофлавина является увеличение копий-ности rib-оперона в хромосоме, соответствующее пороговой, устойчивости к 20 мкг/мл Cta.' Дальнейшая' амплификация приводит к снижению продуктивности, что связано по-видимому с "передозировкой генов", ведущей к нестабильности штамма. Таким образом, " наибольшей продуктивностью обладал штамм В. subtilis Y64-20, накапливающий до 8,3 г/л рибофлавина, что в 2,5 раза больше, чем продуктивность штамма Y49 с одной дополнительной копией rib-оперона в хромосоме, в 1,2 раза выше, чем у штамма Y64-5 с дуплицированной копией rib-оперона в хромосоме, в 1,5 раза выше, чем у штамма Y51/pMX45 с дополнительной копией rib-оперова в хромосоме и в составе плазмиды.

Таблица 3. Продукция рибофлавина штаммами-продуцентами S. subtilis с разным числом копий rib-оперона

Штамм Число копий рибсфгавинового оперона Рибофлавин

из В. subtilis из В. amyloliquefaciens (Г/л)

Y49 1 1 3.2

Y64-5 1 2 6.2

YÔ4-2D 1 >3 8.3

Y51/pMX45 1+2* 1 5.2

* 1- rib-оперон в составе хромосомы и 2 г в составе плазмидных ко-

пий

Как известно, тандемная амплификация генов внутри хромосомы вообще говоря нестабильна в отсутствие поддерживающей селекции, в

особенности если экспрессия этих генов негативно сказывается на росте клеток. Мы провели изучение стабильности штамма В. subtilis Y64-20 в ходе ферментации в неселективных условиях. Выяснилось, что при культивировании штамма происходит накопление клеток, потерявших способность к сверхсинтезу рибофлавина, причем часть таких ¡клеток сохраняла прежний уровень устойчивости к Ст. Последнее обстоятельство указывает на то, что потеря способности к сверхсинтезу связана как со снижением числа амплифицируемых фрагментов, так и с накоплением повреждений внутри rib-оперона. Было показано также, "ire добавление хлорамфеникола в ферментационную среду не увеличивает уровень нэконления рибофлавина. Следует, однако, учесть, что в условиях нашего зкепершента степень деградации антибиотика в ходе культивирования не контролировалась.

Можно предположить, что явление нестабильности штамма В. subtilis Y64-20 не связано с гомологичной рекомбинацией, поскольку введение мутации гесЕ: : tefc, инактивирущей ген гесЕ встраиванием гена устойчивости к тетрациклину, не повышает продуктивности и стабильности штамма.

Таким образом, полученные штаммы требуют дальнейшего изучения с целью подбора оптимальных условий хранения и ферментации. Тем не менее, контролируемая амплификация рибофлавкнового оперона в хромосоме представляется перспективным методом конструирования штаммов С. subtilis - продуцентов рибофлавина.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы интегративные векторы pESS, pACYC184-Rib-CmR и рЕК14 для введения чужеродных генов в хромосому В. subtilis.

2. Разработан метод интеграции чужеродных геноз в хромосому В. subtilis на модели рибофлавинового оперона В. аттуJoliquefaciens. Рибофлавиновый оперон интегрирован в разные локусы хромосомы.

3. Разработана методология контролируемой амплификации генов биосинтеза рибофлавина в клетках В. subtilis.

4. Сконструированы бесплазмидные рекомбинантные штаммы-продуценты В. subtilis YG4-5 и Y64-20 с дупликацией и контролируемой амплификацией рибофлавинового оперона В. amyloliquefaciens в хромосоме.

5. Характеристики полученных штаммов-продуцентов В. subtilis позволяют использовать эти. штаммы для промышленного .производства рибофлавина.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО TBE ДИССЕРТАЦИЙ

1. Стойнова Н.В., Абалакина Е.Г., Чень Сюнь, Люи Хун, Перумов Д.А., Кренева P.A., Гусаров И.И., Подчерняев Д.А., Йомантас Ю.В., Козлов Ю.И. Конструирование рекомбинантных штаммов - продуцентов рибофлавина. I. Клонирование и экспрессия рибофлавинового оперона Bacillus amyloliquefaciens в клетках Bacillus subtilis. //Биотехнология, 1996, НИ, стр. 3-6.

2. Стойнова Н.В., Абалакина E.F., Чень Сюнь, Люи Хук, Перумов Д.А., Кренева P.A., Гусаров И.И., Подчерняев Д. А., Йомантас Ю.В., Козлов Ю.И. Конструирование рекомбинантных штаммов - продуцентов рибофлавина. II. Разработка методов' интеграции чужеродных генов в xpoMocoMy ,Bacillus subtilis на модели рибофлавинового оперона , Bacillus amyloliquefaciens. //Биотехнология, 1996, N11, стр. '7-10.

СЛил- "Хил.