Структурная организация и механизмы действия ФМН-зависимых рибопереключателей у бактерий

Склярова, Светлана Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная организация и механизмы действия ФМН-зависимых рибопереключателей у бактерий
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и механизмы действия ФМН-зависимых рибопереключателей у бактерий"

На правах рукописи

Склярова Светлана Анатольевна

Структурная организация и механизмы действия ФМН-зависимых рибопереключателей у бактерий

Специальность 03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

005547881

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИГенетика»)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор ФГУП «ГосНИИГенетика»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Институт молекулярной генетики РАН

кандидат биологических наук Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ)

Миронов Александр Сергеевич

Хмель Инесса Александровна Закатаева Наталия Павловна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

[ « Н> МСии^ 2014 года в^'^Юа:

Защита диссертации состоится « С-'» /УиЛ-И,—•_2014 года в ^Чга заседании

Диссертационного Совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан

ОМАеЛ^- 2014

года

Ученый секретарь Диссертационного Совета, / Т. Л. Воюшина

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Одним из важнейших условий для жизнедеятельности микроорганизмов в меняющихся условиях окружающей среды является способность точного и своевременного контроля экспрессии их генов для обеспечения нормального роста и развития. Традиционно считалось, что функцию генетических регуляторов в клетке могут выполнять исключительно соединения белковой природы. Однако, в последнее время, появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что молекулы РНК обладают широким спектром регуляторных функций в контроле клеточного метаболизма у бактерий. За последнее десятилетие наши представления о регуляторных функциях РНК в клетке значительно расширились благодаря открытию так называемых сенсорных РНК или рибопереключателей. Такие рибопереключатели располагаются в 5'-лидерных областях мРНК генов, экспрессию которых они модулируют. Важным свойством рибопереключателей является их способность напрямую, без помощи белковых посредников, распознавать и связывать определенные клеточные метаболиты. В результате специфического связывания с метаболитом происходит такое изменение конформации лидерной мРНК, которое приводит к выключению или, реже, включению экспрессии прилегающих генов. Многочисленные исследования структуры и механизмов действия сенсорных РНК показали, что регуляция экспрессии генов с участием рибопереключателей широко распространена в мире бактерий, архей, растений, грибов и водорослей. Так, было показано, что рибопереключатели играют ключевую роль в регуляции ряда оперонов B.subtilis и E.coli, контролирующих биосинтез витаминов, аминокислот, нуклеотидов, ионов металлов и других жизненно важных соединений. Некоторые рибопереключатели осуществляют генетический контроль вирулентности у патогенных видов, поэтому рациональный дизайн соответствующих лигандов представляет перспективную стратегию поиска антимикробных соединений для терапевтического применения. Кроме того, изучение структурно-функциональной организации природных рибопереключателей может способствовать разработке синтетических рибопереключателей для направленной реконструкции метаболизма бактерий, например, с целью утилизации нежелательных гербицидов.

генов у бактерий, а также имеет разнообразные практические перспективы в самых различных сферах биотехнологии и медицины.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение структурной организации и механизмов действия представителей класса ФМН-зависимых рибопереключателей на моделях rib-оперона B.subtilis, гена ураА B.subtilis, а также гена ribB E.coli.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Установление структуры и особенностей функциональной активности внутренних промоторов r/6-оперона B.subtilis, а также сопоставление основного промотора с внутренними промоторами с точки зрения их значимости для регуляции генов биосинтеза рибофлавина.

2. Проведение детального анализа структурно-функциональной организации лидерной области гена ураА B.subtilis и выявление регуляторных элементов, участвующих в контроле экспрессии этого гена.

3. Изучение роли Rho-фактора в ФМН-зависимой регуляции лидерной мРНК гена ribB E.coli.

Научная новизна и практическая значимость.

С помощью экспериментов по достройке праймера были определены старты транскрипции внутренних промоторов r/6-оперона B.subtilis. С использованием метода RT-qPCR показано, что в отличие от основного промотора, расположенного перед первым геном r/6-оперона, транскрипционные активности внутренних промоторов не зависят от внутриклеточного содержания ФМН.

На модели гена ураА B.subtilis выявлен комбинативный механизм действия рибопереключателей, который осуществляется как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Результаты экспериментов по транскрипции in vitro показали, что связывание лидерной мРНК этого гена с ФМН приводит к преждевременной терминации транскрипции путем формирования структуры Ä/го-независимого терминатора, локализованного в области 210-240 нуклеотидов. С другой стороны, методом тоупринт анализа, было продемонстрировано, что в присутствии ФМН рибосома не может связаться с лидерной мРНК вследствие формирования шпильки секвестра, блокирующего сайт связывания рибосомы (SD-последовательность). Кроме того, результаты сравнительного анализа продуктов гидролиза мРНК в присутствии ФМН и его отсутствии, показали, что в последнем случае в формировании альтернативных структур (антитерминатора и антисеквестра) принимает участие одна и та же область лидерной мРНК. На основании

полученных данных предложена динамическая модель ФМН-зависимого фолдинга лидерной мРНК гена ураА.

На модели гена ribB E.coli выявлен новый механизм регуляции с участием рибопереключателей, основанный на Rho-зависимой терминации транскрипции. Установлено, что изменение конфигурации рибопереключателя в результате связывания с ФМН приводит к подавлению дальнейшей транскрипции структурной части гена ribB E.coli в результате Rho-зависимой терминации.

Результаты диссертационного исследования расширяют представление о возможных механизмах действия рибопереключателей у бактерий. Подходы и методы, используемые в настоящей работе, могут быть полезны для обнаружения механизмов контроля экспрессии других генов с участием сенсорных РНК. Полученные в работе результаты могут быть использованы в дальнейшем в прикладных целях, в частности, для увеличения активности имеющихся штаммов-продуцентов рибофлавина на основе B.subtilis.

Положения, выносимые на защиту.

1. Главный вклад в контроль экспрессии генов биосинтеза рибофлавина у В. subtilis вносит расположенный перед первым структурным геном пй-оперона промотор PI, регуляция которого осуществляется ФМН-зависимым рибопереключателем на уроне терминации транскрипции. Активность внутренних промоторов rib-оперона Р2 и РЗ не регулируется флавинами.

2. Регуляция гена ураА B.subtilis, кодирующего транспортер рибофлавина, осуществляется с участием ФМН-зависимого рибопереключателя как на уровне терминации транскрипции в результате формирования Л/го-независимого терминатора, так и на уровне инициации транскрипции путем формирования шпилечной структуры секвестра, блокирующего сайт связывания рибосомы.

3. ФМН-зависимый рибопереключатель, расположенный в лидерной мРНК гена ribB E.coli, контролирует Rho-зависимую терминацию транскрипции этого гена.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология Наука XXI века» (г.Пущино, 16-21 апреля 2012 года), выступление на конференции было отмечено как «лучший устный доклад»; на 38-ом Международном Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (ФЕБО) «Биологические механизмы» (г. Санкт-Петербург, 6 - 11 июля 2013 года). Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре секций «Молекулярная биология» и «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 28 ноября 2013 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них три в журналах, входящих в список, рекомендованный ВАК.

Структура работы

Диссертация изложена на 132 листах машинописного текста, включая 35 рисунков и 6 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (159 наименований).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение структурно-функциональной организации внутренних промоторов рибофлавинового оперона В. subíilis.

Рибофлавиновый оперон В. яиЬИШ (п'6-оперон) состоит из 5 неперекрывающихся генов, и имеет три регуляторных элемента - регуляторная зона гЛО, в состав которой входит основной промотор Р1, расположенная перед первым структурным геном оперона, а также два дополнительных внутренних промотора Р2 и РЗ, первый из которых расположен в дистальной области гена рибофлавинсинтазы НЪВ, а второй - в интергеноте длиной 113 пар нуклеотидов, отделяющей ген гЛТот гена люмазинсинтазы пЬН (рис. 1).

Р1 Р2 РЗ

Г о г* г-♦

л мьв пЬБ пЬА пЬН пЬТ 9

1 [^РЫ * » » ——

Рисунок 1. Структура рибофлавинового оперона. Жирными стрелками на рисунке показано взаимное расположение и направление транскрипции пяти генов п'6-оперона -1чЬй, г\ЪВ, пЬА, >чЬН и гг'АГ. Тонкими стрелками обозначено направление транскрипции с промоторов Р1. Р2 и РЗ в /-/¿-опероне. Шпилечные структуры показывают локализацию Юго-независимых терминаторов транскрипции.

С основного промотора пй-оперона Р1 осуществляется транскрипция всех генов г1Ъ-оперона в виде одной полицистронной мРНК. Регуляция транскрипции, в случае промотора Р1, осуществляется с помощью ФМН-зависимого рибопереключателя. В результате непосредственного

взаимодействия флавинов (как правило, ФМН) с лидерной мРНК изменяется ее пространственная структура таким образом, что образуется шпилька Юю-независимого терминатора, которая прерывает дальнейшую транскрипцию всей структурной части (МИгопоу, е? а1. 2002). Ключевую роль в этом процессе играет целостность консервативного участка лидерного транскрипта - так

называемого ^-элемента, формирующего структуру домена связывания флавинов (Се1/апс1, е/ а1. 1999; КИ, е? а1. 1992).

Данный раздел посвящен определению структуры внутренних промоторов п'6-оперона, а также установлению особенностей их функциональной активности.

Чтобы выяснить вклад внутренних промоторов Р2 и РЗ в уровень транскрипции соответствующих генов, а также установить, оказывают ли регуляторное влияние флавины на транскрипцию, осуществляемую с этих промоторов были сконструированы транскрипционные фьюзы г1ЬР1.3-Ьас2. С этой целью соответствующие промоторные области Р1, Р2 и РЗ были клонированы в составе экспрессионного интегративного вектора рБв 268, содержащего репортерный ген 1ас1, а затем интегрированы в амилазный локус хромосомы штамма В. виЬйШ ЮСН25 и его изогенного варианта ЯК25-С1, содержащего мутацию в гене пЪС, которая нарушает синтез эндогенного ФМН. У полученных штаммов изучался уровень транскрипции с каждого промотора путем определения активности (3-галактозидазы (рис. 2).

На основании сравнения уровней экспрессии р-галактозидазы у транскрипционных фюзов пЬР,_3- 1ас2 в клетках штамма дикого типа 11КН25 можно заключить, что транскрипционная активность промотора Р2 в десятки раз меньше активности основного промотора п'6-оперона Р1, тогда как промотор РЗ, напротив, превосходит по эффективности транскрипции основной промотор Р1 примерно в 5 раз.

1.1. Оценка силы промоторов пЬ-оперона.

Я 600

ч;

| 500

Рисунок 2. Оценка силы промоторов Р1, Р2 и РЗ /7й-оперона. Высота столбцов соответствует уровню (3-гапактозидазной активности, выраженной в единицах Миллера, для транскрипционных фьюзов /-¡ЬР 1-з-1ас2, интегрированных в амилазный локус хромосомы штаммов-реципиентов дикого типа ЯКН25 и его изогенного варианта ЛК25-С1, содержащего мутацию в гене г1ЬС, которая нарушает синтез эндогенного ФМН.

я с;

Р1 Р2 РЗ

СШКН25 44 2,5 300

НРК25-С1 450 3,9 392

Сравнение уровня активности р-галактозидазы под контролем промоторов PI, Р2 и РЗ в клетках штаммов RKH25 и RK25-C1 позволяет оценить влияние флавинов на экспрессию каждого промотора. Из данных, представленных на рис. 2 видно, что на фоне мутации ribCl существенно увеличивается только активность промотора Р1 (в 10 раз), что объясняется действием ФМН-зависимого рибопереключателя. Активность промотора РЗ у обоих штаммов находится примерно на одном уровне, а в отношении Р2 однозначный вывод сделать нельзя, из-за слишком низких значений активности.

1.2. Изучение уровня транскрипции генов rib-оперона с помощью RT-

qPCR

Для того чтобы ответить на вопрос, являются ли Р2 и РЗ промоторы флавин-регулируемыми, был использован метод RT-qPCR, который позволяет более точно определить относительное изменение количества транскрипта по соответствующей кДНК. Для проведения RT-qPCR были синтезированы четыре пары праймеров, комплементарные соответственно ribG, ribB, ribA и пйГ генам в составе гй-оперона. В качестве количественного контроля суммарной РНК в реакциях обратной транскрипции использовали пару праймеров комплементарных участку гена, кодирующего 16S РНК.

Для этого эксперимента была использована суммарная РНК, выделенная из пары изогенных штаммов (SS131 ribC? и SSC133 ribCl), содержащих инсерцию ribB::Mutin2. В этих штаммах происходит преждевременная терминации транскрипции с основного промотора Р1 на Rho-независимом терминаторе, расположенном внутри интегрированной в ген ribB плазмиды pMutin2. Следовательно, транскрипция ribG и ribB генов должна происходить с промотора PI, а транскрипция гена ribA может осуществляться только с собственного промотора Р2, а гена ribT как с Р2, так и с РЗ промоторов. Таким образом, сравнение уровня транскрипции генов ribA и ribT в штаммах SS131 rib(f и SSC133 ribCl позволяет оценить наличие или отсутствие флавин-зависимой регуляции внутренних промоторов Р2 и РЗ.

Результаты эксперимента представлены на рис. 3. На фоне мутации ribCl в клетках штамма SSC133 по сравнению с клетками штамма SS131, которые этой мутации не содержат, наблюдался высокий уровень транскрипции только двух генов - ribG (в 35 раз) и ribB (в 45 раз). Что касается генов ribA и ribT, то под действием мутации ribCl относительный уровень экспрессии этих генов не изменялся. Таким образом, на основании данных, полученных методом RT-qPCR можно сделать заключение о том, что внутренние промоторы Р2 и РЗ rib-оперона не регулируются флавинами.

3,5

\ !

! , к , —,

10 12 14 16 18 20 22 24 26 26 30 32 34

ПЦР циклы

16Б лЬв пЬВ пЬА пЬТ

1ККН25пЬВ::ти«п2 ОКК25-С1 пЬВ::ггш(1п2

Рисунок 3. Оценка влияния флавинов на промоторы /-/'й-оперона с помощью ИТ^РСЯ.

(А) График накопления флуоресцентного сигнала в логарифмических координатах в зависимости от ПЦР цикла. (Б). Относительный уровень экспрессии генов г/6-оперона для пары изогенных штаммов, содержащих инсерцию г1ЬВ::МиИп2 (88131 гЛС* и 88С133 пЬСГ).

В итоге проведенной работы была установлена структура внутренних промоторов Р2 и РЗ г/6-оперона В.эиЫШз (данные не приведены), определена транскрипционная активность этих промоторов и представлены

доказательства, что активность обоих промоторов Р2 и РЗ не подвержена регуляции с участием флавинов. Полученные результаты указывают на то, что основной вклад в регуляцию генов биосинтеза рибофлавина у В.яиЫШз вносит основной промотор г/6-оперона, подверженный негативной регуляции с участием ФМН-зависимого рибопереключателя.

2. Исследование регуляции экспрессии гена ураА ВлиЫНк.

У бактерий В. зиЫШв продукт гена ураА участвует в транспорте рибофлавина из окружающей среды в клетку. Первоначально функция гена ураА в качестве транспортера флавинов была предсказана на основании компьютерного анализа, а затем подтверждена экспериментально результатами генетического и биохимического анализа (Кгепех'а, е1 а1. 2000,Vogl, е1 а1. 2007, Ои, а а1. 2009). Что касается регуляции гена ураА, то она обусловлена присутствием в его регуляторной области эволюционно-консервативного участка, //«-элемента, который обнаружен с помощью компьютерного анализа перед генами биосинтеза рибофлавина у бактерий различных таксономических групп (Се1/апс1, е/ а1. 1999; УИгезсИак, е? а1. 2002). На основании структурно-функционального анализа г/и-элемента гена ураА методом гидролиза РНК

(Winkler, et al. 2002) была предложена модель, согласно которой регуляция этого гена осуществляется не на уровне терминации транскрипции, как в случае гг'6-оперона, а в результате формирования альтернативных структур, одна из которых (в присутствии ФМН) приводит к образованию секвестра трансляции, блокирующего сайт связывания рибосомы SD. Однако прямых доказательств, что секвестрирование SD в присутствии ФМН приводит к подавлению трансляции гена ура А в работе (Winkler, et al. 2002) получено не было.

2.1. Изучение экспрессии транскрипционных и трансляционных фьюзов ypaA-LacZ в клетках штамма В. subtilis RKH25 и его изогенного варианта В. subtilis RKH25-C1.

Для проверки модели регуляции гена ураА, основанной на изменении конформации рибопереключателя, был проведен сайт-направленный мутагенез лидерной области гена ураА (рис. 8). Так, мутация М5 (G95—>А), расположенная в аптамерной части ФМН-зависимого рибопереключателя, согласно данным рентгеноструктурного анализа комплекса /"/«-элемента с ФМН (Serganov et al., 2009), должна оказывать влияние на эффективность связывания ФМН. Мутация Mil (А255—>Т; С256—>Т) располагается в экспрессионной платформе и влияет на стабильность шпильки секвестора. В то время как делеция r/и-элемента (Arfn) должна приводить к конститутивной экспрессии гена ураА с потерей чувствительности к ФМН.

Результаты эксперимента по определению активности (3-галактозидазы для транскрипционных и трансляционных фьюзов лидерной области гена ураА дикого типа и ее мутантных вариантов с репортерным геном lacZ без собственного промотора приведены в таблице 1.

На фоне мутации ribCl в случае лидерной области дикого типа наблюдается увеличение в уровне экспрессии репортерного гена для транскрипционного фьюза в 3,6 раза, а для трансляционного - в 12,3 раза (табл. 1). Эти данные свидетельствуют о том, что контроль экспрессии тепаураА у В. subtilis, опосредованный действием эндогенного ФМН, может осуществляться как на уровне трансляции, так и на уровне транскрипции. Нуклеотидная замена G95—>А (М5) в лидерной области приводит к высокому уровню дерепрессии репортерного гена для всех рассматриваемых фьюзов ypaA-LacZ. Такой результат свидетельствует о том, что мутация М5 отменяет негативный эффект ФМН на экспрессию гена ураА.

Таблица 1*

Мутант Нуклеотидная замена Транскрипционные фьюзы ypaA-LacZ Трансляционные фьюзы ypaA-LacZ

В. subtilis RKH25 В. subtilis RKH25-C1 В. subtilis RKH25 В. subtilis RKH25-C1

wt - 205 (3,6) 737 173 (12,3) 2140

М5 G95—>А 880 1635 1431 2281

МП А255—>Т; С256—Т 10 162 33 80

Л rfn A(16A-189G) И 16 4 5

*Культуры штаммов B.subtilis выращивались на полноценной среде LB с добавлением хлорамфеникола 10 мкг/мл. Ночную культуру разводили в 25 раз свежей средой и растили при 37°С в течении 2,5-3 часов до достижения СЮбоо=0.5-0.6. Активность ß-галактозидазы выражена в единицах Миллера. В скобках приведены значения уровня репрессии активности ß-галактозидазы в присутствии эндогенного ФМН. Приведенные значения - средние из 4 независимых определений.

Результаты определения активности ß-галактозидазы у штаммов, содержащих трансляционные фьюзы мутантной лидерной области Ml 1 с геном lacZ показывают, что усиление секвесторной шпильки приводит к практически полному подавлению экспрессии гена ураА как в присутствии (штамм RKH25), так и в отсутствии (штамм RKH25-C1) эндогенного ФМН. В случае транскрипционных фьюзов, содержащих лидерную область с мутацией Ml 1, значения активности ß-галактозидазы также снижаются. Из этого следует, что формирование шпилечной структуры секвестра трансляции и ее стабилизация в присутствии ФМН играет ключевую роль в ФМН-зависимой регуляции гена ураА.

Делеционный мутант лидерной области гена ураА (Аrfn), лишенный аптамерной части, демонстрирует, вопреки ожиданиям, существенное снижение активности ß-галактозидазы во всех рассматриваемых фьюзах. Похоже, что такая делеция не только устраняет чувствительность к ФМН, но и препятствует формированию альтернативных шпилечных структур, образование которых характерно для механизма действия рибопереключателей по принципу негативной регуляции в отсутствии лиганда, и которые способствуют экспрессии прилегающих генов.

2.3. Влияние ФМН на формирование ЗОБ-инициаторного комплекса на лидерной мРНК гена ураА B.subtilis.

Для получения прямого доказательства, что ФМН стабилизирует шпилечную структуру секвестра и препятствует связыванию 30S субъединицы рибосомы с SD-последовательностью, мы воспользовались методом тоупринт-анализа (Hartz, et al. 1988). Этот метод позволяет оценить доступность SD-

последовательности для связывания с ЗОБ субъединицей рибосомы с помощью реакции обратной транскрипции, которая прерывается в результате формирования 308-инициаторного комплекса в положении +16-+18 относительно первого нуклеотида инициирующего кодона (тоупринт-сигнал).

В отсутствие 308 субъединицы рибосомы, в процессе реакции обратной транскрипции происходит беспрепятственное удлинение праймера на матрице ураЛ-мРНК дикого типа, о чем свидетельствует образование продуктов реакции размером, соответствующем остановке в положении ШЗЗ и С2\4 относительно старта транскрипции (рис.4). Преинкубация матрицы в присутствии ЗОБ субъединицы и тРНК0"1", но в отсутствии ФМН приводит к появлению нового сигнала, размер которого соответствует ожидаемому продукту реакции обратной транскрипции, который должен появляться при ее торможении в положении 11317 в результате формирования инициирующего трансляцию комплекса. Из этого следует,

МП

РМЫ - - - + - - - +

ЗОБ + - + + + - + +

ТКЫЛ'™' - + + + - + + +

с т а с;

с т а о

Шы»

ШШ'Щ,

«!, -а»,-

МЯщА

шзз

0214

Рисунок 4. Влияние ФМН на формирование ЗОв инициаторного комплекса на ураА- мРНК дикого типа и содержащей мутацию М11. Стрелками слева показано положение йо и и+17 нуклеотидов. Стрелками справа указаны продукты реакции обратной транскрипции, размер которых соответствует остановке в соответствующем положении относительно старта транскрипции.

о с т в А А А б Т А А А А А А А Т

+17Т'

и317

что в отсутствии ФМН область мРНК, содержащая SD последовательность доступна для связывания с 30S субъединицей рибосомы. Однако если перед добавлением в преинкубационную смесь 30S субъединицы и тРНК'Ме® сначала внести 100 мкМ ФМН, то образования продукта U317 не наблюдается, и вновь появляются продукты реакции обратной транскрипции U233 и G214. На основании этих данных можно заключить,что в присутствии ФМН SD-последовательность оказывается недоступной для связывания 30S субъединицы рибосомы в результате формирования шпилечной структуры секвестра (рис.8). Это заключение подтверждается результатами тоупринт-эксперимента с мутантной матрицей Mil, которая содержит нуклеотидные замены, стабилизирующие шпильку секвестра трансляции.

2.4. Транскрипция in vitro генаураА на твердой фазе.

На следующем этапе мы исследовали влияние ФМН на транскрипцию гена ураА, поскольку данные in vivo (табл.1) не исключают такую вероятность. Для этого мы воспользовались методом проведения реакции транскрипции in vitro на твердой фазе. Преимущество такого подхода заключается в том, что инициирующий элонгационный комплекс иммобилизуется на твердой подложке, что позволяет в процессе реакции менять состав транскрипционной смеси, и таким образом, избавляться от не включенных в растущую цепь мРНК нуклеозидтрифосфатов, а также продуктов терминации. Анализ продуктов реакции транскрипции в 8% ПААГ показывает (рис. 5), что добавление ФМН вызывает преждевременную терминацию транскрипции в положении, соответствующему примерно 240 нуклеотиду. Удаление из геля указанного фрагмента после отмывки РНК свидетельствует о том, что фрагмент -240 н. является продуктом терминации транскрипции, а не результатом остановки РНК-полимеразы на так называемых сайтах паузы.

Рисунок 5. Терминация транскрипции in vitro гена ураА в зависимости от присутствия ФМН. Справа обозначен размер соответствующих транскриптов для РНК-маркера. Положение ФМН-зависимой терминации обозначено стрелкой.

FMN _ _ + + Marker Wash - + - +

■ 400 350 300

у _:> : ая> тИР" 250

Шш 200

|j| 150

2.5. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ypaA-LacZ в клетках штамма В. subtilis RibBllO.

Анализ нуклеотидной последовательности лидерной мРНК гена ураА на предмет формирования шпилечных структур позволил идентифицировать наиболее вероятную структуру Rho-независимого терминатора транскрипции (шпилька VIII на рис. 8), формирование которого происходит в присутствии ФМН. Чтобы выяснить регуляторную роль шпильки VIII в экспрессии гена ураА, мы провели сайт-направленный мутагенез лидерной области и ввели нуклеотидные замены М9 (C212--G; C213->G) и MIO (G231->C; G232->C), нарушающие целостность у основания шпильки. Влияние полученных мутаций мы оценивали с помощью транскрипционных фьюзов лидерной области гена ураА с репортерным геном lacZ.

Чтобы выяснить, какую роль в ФМН-зависимой регуляции транскрипции гена ураА играет целостность лидерной области, были получены траснкрипционные фьюзы лидерных областей гена ураА различной протяженности с репортерным геном lacZ без собственного промотора. Так в состав лидерной области длиной 155 н. входит только т/я-элемент, длиной 214 н. содержит дополнительно шпильку VII (рис.8), длиной 256 н. включает шпильку терминатора, длиной 300 н. - полноразмерная лидерная область.

Определение активности р-галактозидазы проводили в клетках штамма B.subtilis ribBllO, у которого мутация в гене ribB, кодирующем один из ферментов биосинтеза рибофлавина, приводит к ауксотрофии по этому _Таблица 2

Мутант Длина лидерной области от старта транскрипции, н Активность Р-галактозидазы Репрессия

- Рибофлавин 50цМ

wt 155 348 294 1,2

wt 214 156 98 1,6

wt 256 141 37 3,8

wt 300 388 110 3,5

M9 C212—>G; C213—*G 300 405 342 1,2

M10 G231—*C; G232—>C 300 239 285 0,8

M9/10 C212—»G; C213—>G; G231—»C; G232—»C 300 240 170 1,4

Клетки растили на минимальной среде Спицайзена (0,4% глюкоза, 0,05% СА, 5мкг/мл Lys, Cml 5 мкг/мл) с добавлением рибофлавина 0,1 цМ при выращивании ночной культуры, утром клетки отмывали и разбавляли в 25 раз свежей средой без рибофлавина и с добавлением 50 цМ рибофлавина и растили при 37°С в течении 2,5-3 часов. Активность р-галактозидазы выражена в единицах Миллера. Приведенные значения - средние из 3 независимых определений.

компоненту. Таким образом, были смоделированы два физиологических условия в клетке: дерепрессия на фоне отсутствия эндогенного ФМН, и репрессия - когда в ростовую среду добавляется рибофлавин, превращающийся в ФМН внутри клетки.

В случае лидерной области, содержащей только аптамерную часть рибопереключателя, а именно r/и-элемент, наблюдается высокий уровень экспрессии репортерного гена независимо от ФМН (табл.2). Из этого следует, что в отсутствие экспрессионной платформы связывание ФМН с аптамерным участком рибопереключателя не оказывает регуляторного влияния на инициацию транскрипции с нативного промотора гена ураА. Увеличение лидерной области до 214 н. приводит к заметному снижению активности р-галактозидазы, однако чувствительность экспрессии данной конструкции к присутствию ФМН весьма незначительная. Наблюдаемое падение экспрессии репортерного гена, вероятнее всего, связано с действием шпильки VII (рис. 8), формирование которой, по-видимому, происходит независимо от ФМН. В то же время, в случае конструкции протяженностью 256 н., которая содержит шпильку VIII (рис.8) добавление рибофлавина в ростовую среду приводит к почти 4-х кратному снижению активности Р-галактозидазы (табл. 2). В случае полноразмерной лидерной области гена ураА в условиях дерепрессии наблюдаются высокие значения активности Р-галактозидазы (388 ед. по Миллеру), как и в случае лидерной области, в состав которой входит только rfh-элемент (348 ед. по Миллеру). При этом добавление рибофлавина понижает уровень экспрессии реперного гена lacZ в 3,5 раза. Таким образом, полученные данные свидетельствует о том, что негативная регуляция транскрипции гена ураА с помощью ФМН осуществляется посредством формирования Rho-независимого терминатора.

Оценить значение целостности терминаторной шпильки для регуляции гена ураА позволяют данные по определению активности Р-галактозидазы у транскрипционных фьюзов мутантных лидерных областей с геном lacZ. Так, у мутанта М9 и М10 наблюдались высокие значения активности Р-галактозидазы независимо от ФМН. Следовательно, дестабилизация терминаторной шпильки, вызванная внесением мутаций в левое и правое «плечо» шпильки VIII, соответственно (рис. 8), устраняет негативное влияние ФМН на транскрипцию гена ураА. В случае совмещения в одном геноме мутаций М9 и MIO (М9/10), комбинация которых восстанавливает целостность терминаторной шпильки, экспрессия реперного гена не достигает уровня дикого типа, однако чувствительность к действию ФМН восстанавливается.

2.6. Транскрипция лидерной мРНК гена ураА дикого типа и ее мутантных вариантов в системе in vitro.

Чтобы выяснить влияние мутаций на формирование Rho-независимого терминатора транскрипции, была проведена серия опытов по транскрипции in vitro с ДНК-матрицами, содержащими лидерную область гена ураА с нуклеотидными заменами.

Как следует из данных, представленных на рис. 6, в случае матрицы дикого типа добавление ФМН в транскрипционную смесь приводит к формированию четко выраженного сигнала размером —240 нуклеотидов. У мутанта М9, содержащего нуклеотидные замены, приводящие к разрушению терминаторной шпильки полоса длинной 240 нуклеотидов, соответствующая преждевременной терминации, исчезает независимо от присутствия ФМН. У двойного мутанта М9/10, восстанавливающего целостность терминаторной шпильки VIII (рис. 8), преждевременная терминация транскрипции вновь наблюдается, причем даже в отсутствии ФМН, что подтверждает наше предположение о нарушении у этого мутанта формирования структуры анти- терминатора транскрипции. Как и следовало ожидать, у мутанта Mil, содержащего нуклеотидные замены в области секвестра трансляции эффективность преждевременной терминации транскрипции неотличима от дикого типа.

М9 M9/10-S Mil wt

Рисунок 6. Транскрипция in vitro лидерной области гена ураА дикого типа и ее 5 _ + + ФМН мутантных вариантов в зависимости от

40о 50цМ присутствия ФМН. Слева от рисунка указан

350 """«a*®fc»размер соответствующих транскриптов для

зоо ЩГ'Л : - ; -НИ«£ Ш. IR РНК-маркера. Положение ФМН-зависимой

250 иищ Щим т терминации обозначено стрелкой

200 » ' - - *

150 #§§§

100 —•

2.7. Изучение вторичной структуры лидерной мРНК гена ураА методом гидролиза РНК ("In line probing").

Чтобы уточнить модель регуляции гена ураА с участием ФМН-связывающего рибопереключателя, необходимо было выявить альтернативные регуляторные элементы (анти-терминатор и анти-секвестр), которые реализуются в процессе фолдинга лидерной мРНК в отсутствии ФМН. Для

этого мы воспользовались методом спонтанного гидролиза РНК или «In line probing», суть которого заключается в том, что та область РНК, которая не связана с метаболитом и находится в одноцепочечной форме, подвергается более эффективному спонтанному расщеплению посредством внутренней трансэстерификации.

На рисунке 7 А представлен опыт по гидролизу лидерной мРНК размером 380 нуклеотидов. В области сайта связывания рибосомы (SD) обнаруживаются значительные структурные изменения в профиле гидролиза РНК в зависимости

7А

М NR Т10Н" - +

400 350

300

250

200

150

7Б М NR ОН"Т1

250

-г

g145 g144

g131 g130

100

g95 g94

200

■1

150

G145 • G144

G131 ■ G130

Рисунок 7. Спонтанный гидролиз мРНК гена ураА, длинной 380 (А) и 240 (Б) нуклеотидов. Первая дорожка соответствует РНК-маркеру, длина транскриптов которого обозначена слева от рисунка. Вторая дорожка соответствует РНК, которая не подвергалась расщеплению (N11); Т1 - продукты специфического расщепления РНК с помощью РНКазы Т1, ОН" - продукты щелочного гидролиза РНК. Пунктирными линиями на рисунке обозначены области с различной степенью расщепления в зависимости от присутствия ФМН. Последовательность вО обозначена сплошной линией. Стрелками справа указаны соответствующие продукты реакции, идентифицированные в результате специфического действия РНКазы Т1.

от ФМН: в отсутствие ФМН нуклеотиды 290-294 подвержены более активному гидролизу, т.е., вероятно, находятся в одноцепочечной конфигурации, тогда как в присутствии ФМН устойчивы к гидролизу из-за формирования двунитевой шпилечной структуры IX секвестра (рис. 8). В то же время нуклеотиды 144-147 характеризуются повышенным уровнем гидролиза в присутствии ФМН, но устойчивы к гидролизу в отсутствии ФМН. Из чего следует, что указанные нуклеотиды могут быть вовлечены в формирование структуры потенциального анти-секвестра трансляции, наиболее вероятная последовательность которого обозначена на рис.8.

Поскольку в районе локализации предполагаемого терминатора транскрипции (нуклеотиды 210-240) профиль гидролиза не меняется в зависимости от ФМН, было высказано предположение, что участки антисеквестра и анти-терминатора могут перекрываться. Поэтому был проведен опыт по гидролизу РНК на укороченной матрице лидерной мРНК, длиной 240 нуклеотидов, которая не содержит последовательности секвестра трансляции (рис. 7Б). В этом случае нуклеотиды 206-210 в отсутствии ФМН менее подвержены гидролизу и, по-видимому, вовлекаются в формирование потенциального анти-терминатора с теми же нуклеотидами, локализованными в положении, которые, как было показано выше, участвуют в формировании анти-секвестра трансляции. Об этом свидетельствует менее эффективный гидролиз РНК в районе 144-148 нуклеотидов в отсутствии ФМН.

Данные по спонтанному гидролизу РНК свидетельствуют о том, что, по-видимому, в образовании анти-терминатора транскрипции и анти-секвестра трансляции, участвует одна и та же область лидерной мРНК, входящая в состав правого плеча шпильки I. Для интерпретации полученных данных мы выдвигаем гипотезу «динамической регуляции» экспрессии гена ураА с участием ФМН зависимого рибопереключателя. В отсутствии ФМН в процессе транскрипции гена ураА, сначала формируется структура анти- терминатора, позволяющая дальнейшую транскрипцию структурной части гена. Далее по мере удлинения транскрипта мРНК, включающего полноразмерную лидерную область, происходят структурные изменения в конфигурации мРНК-транскрипта, в результате чего образуется структура анти-секвестра, разрешающая трансляцию гена ураА.

А"»

ии„

с. i

М5

IV га

¿'/'•Ус""*-

•'о.'«

о с. ~ ,

и"

. с»

™ л.

ФМН

♦ V*

О »20

* VI А°и*с о0исио*

А ,30 и-А

о0 и-А но

VII

о'А

и и и и л-и

А-и А-и

и-А

VIII

с-с

и А и А

М9/10

°ос=оа° е.с

" - А С = о М9

о-и

А-и

'АААииисАиАибАисАД ибедевиисдиА-исииирссилйссидАиииисоАААС ' 4---- J_I__Л

. я - и -ш 1 с -о

С = <5

С-С 290

Гйи! 260- и А

х X

и и и и и и А и и й С С и С С Л А А А С АриЗ<

V к V к т

и-А

|С = й А А и 0 л АСибАААбиАААААААииА... 3'

йг/п^

1*0

с=е

Ц-А

го и-А но С»6 К-А

А^бОАббиКС

VIII

Ц-А 1ЬА

С« б

г»

1ААС1

¡10

иииииили

Терминатор

А-и С,< С=<3 Ц-А и-А Ц-А

С1^

С=Й Ц-А

260-и

Ц-А

Секвестор

1«

—

гоо

С и

20- и С

210

и-А Ц-А

6=С210

Ае=С

с| ди.О

6-С 140 А-и А-и

5 3

-РММ ->

Элонгация мРНК цепи

С и

20-и

Анти-терминатор

ВД Ц-А

и-А 255 &С 6»С

А-и-и

й=с-и

А-и

е-и м А-и

А-и

й-СвАб.........ААООАбАС

290

Анти-секвестор

БО

Рисунок 8 . Модель регуляции экспрессии гена ура/1 В. $иЫШ8 с помощью ФМН -зависимого рибопереключателя. (А) Вторичная структура лидерной области в присутствии ФМН. (Б) Регуляторные элементы, реализующиеся в зависимости от ФМН. Шпилечные структуры пронумерованы римскими цифрами. Соответствующие нуклеотидные замены выделены рамкой. Делеционный мутант показан фигурной скобкой. Сайт связывания рибосомы БО выделен красным цветом. Область аптамерной части ФМН-завивисимого рибопереключателя, участвующего в формировании альтернативных структур выделена маркером. Положение тоупринт-сигнала обозначено жирным шрифтом и стрелкой.

3. Исследование регуляции экспрессии гена ribB E.coli.

Методами сравнительного компьютерного анализа регуляторных областей rib-генов у бактерии E.coli был обнаружен консервативный rfn-элемент только перед структурным геном ribB, который кодирует 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу (Vitreschak, et al. 2002). В работе (Еремина, et al. 2008) было показано, что регуляция экспрессии этого гена осуществляется с помощью ФМН-зависимого рибопереключателя. Так, связывание ФМН с лидерной областью гена ribB у E.coli, приводит к формированию шпильки секвестра трансляции, блокирующего сайт связывания рибосомы (рис. 9). Имеются указания на то, что помимо контроля экспрессии гена ribB на уровне инициации трансляции может иметь место регуляция этого гена на транскрипционном уровне. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что в клетках E.coli идентифицирована малая РНК sroG, соответствующая лидерной области гена ribB (Peters, et al. 2009; Vogel, et al. 2003). Структура этой малой РНК содержит лиганд-связывающий домен и не содержит Rho-независимого терминатора. Изучению регуляции транскрипции гена ribB E.coli и будет посвящен данный раздел.

3.1. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ribB-LacZ в клетках штамма E.coli АМ4002.

Поскольку в лидерной области гена ribB не обнаружен Rho-независимый терминатор транскрипции, мы предположили, что образование короткого транскрипта, соответствующего по длине малой РНК sroG, может происходить в результате Rho-зависимой терминации. Для проверки этого предположения,

с g

... g а 80 IV u . а

VII

III

9.60 с. . .„'•."с

„gc.ggac а9 са \

' ^100

U с

ccgg ■

Rfn- элемент 9®ocu,

я SD

а 240

II »

uucugguaac----

225

Секвестор

Анти-секвестор

Рисунок 9. Структура ФМН-зависимого рибопереключателя гена пЬВ Е.соЧ в зависимости от ФМН. Нуклеотиды, формирующие стебель шпильки анти-секвестора в отсутствии связывания с ФМН, выделены серым цветом. Соответствующие нуклеотидные замены выделены рамкой и обозначены фигурной скобкой.

мы изучали эффект специфического ингибитора Шю-фактора антибиотика бицикломицина (ВСМ) на изменение активности (3-галактозидазы для транскрипционных фьюзов лидерной области гена пЪВ дикого типа, а также ее мутантные варианты М1 и М2 с репортерным геном 1ас2 без собственного промотора. Нуклеотидные замены, соответствующие мутации М1 (А11—>Т, 012—>С, 013—>С, 014—>С, С15—*Т), стабилизируют конфигурацию рибопереключателя «+ФМН». Пространственная структура лидерной области с нуклеотидными заменами М2 (в 140—>А, в 142—*А, 0144—>А) независимо от присутствия ФМН принимает конфигурацию рибопереключателя «-ФМН» (рис.9).

Активность Р-галактозидазы у транскрипционных фьюзов пЪВ-Ьас2 измерялась в клетках штамма Е.соИ АМ4002, у которого наличие Тп5 в гене пЪВ нарушает биосинтез рибофлавина, а наличие ТпЮ в гене 1ас2 позволяет использовать этот штамм в качестве реципиента для полученных конструкций. Результаты эксперимента представлены на рисунке 10. В случае транскрипционного фьюза лидерной области дикого типа с геном 1ас7. в присутствии рибофлавина активность (3-галактозидазы снижается почти в 5 раз. Однако добавление ВСМ снимает репрессирующее действие рибофлавина -предшественника ФМН. Внесение мутаций М1 и М2, стабилизирующих две альтернативные структуры рибопереключателя независимо от присутствия ФМН, позволяет оценить влияние конфигурации рибопереключателя на возможность Ито-зависимой терминации транскрипции гена пЪВ. В случае мутантной лидерной области М1 независимо от присутствия рибофлавина в среде происходит подавление экспрессии репортерного гена.

Рисунок 10. Влияние

бицикломицина на активность р-галактозидазы для

транскрипционных фьюзов пЬВ-

LacZ. Культуры клеток Е.соИ АМ4002, содержащие

транскрипционные фьюзы

лидерной области гена г1ЬВ дикого типа и ее мутантных вариантов М1 и М2 с репортерным геном 1ас7, выращивали при 30°С в течение ночи на полноценной среде ЬВ с добавлением 50 цМ рибофлавина и 50 мкг/мл ампициллина. Затем клетки отмывали и разбавляли в 25 раз свежей средой, содержащей либо нет 50 цМ рибофлавина и/или с 25 мкг/мл ВСМ в зависимости от варианта. Клетки растили при 30°С в течение 2-2,5 часов до средней экспоненциальной фазы роста.

6,000

5,000

Так, уровень активности ß-галактозидазы остается низким в условиях дерепрессии и соответствует значению, характерному для транскрипционного фьюза лидерной области дикого типа с lacZ в присутствии рибофлавина. Добавление ВСМ в случае мутантной лидерной области М1 приводит к значительному увеличению активности ß-галактозидазы независимо от присутствия рибофлавина в ростовой среде. Для транскрипционных фьюзов лидерной области с мутацией М2, имитирующей структуру рибопереключателя «-ФМН», наблюдаются высокие значения активности ß-галактозидазы и добавление ВСМ не сказывается на изменении этих значений.

Результаты проведенных экспериментов позволяют заключить, что преждевременная терминация транскрипции гена ribB в присутствии ФМН обусловлена действием Rho-фактора. Более того, эндогенный ФМН приводит к Rho-зависимой терминации вследствие определенной конфигурации рибопереключателя, реализующейся при взаимодействии ФМН с rfn-элементом, что подтверждается данными транскрипционных фьюзов мутантных лидерных областей М1 и М2 с геном lacZ.

3.2. Изучение транскрипции гена ribB на фоне ингибирования Rho-фактораметодом RT-qPCR.

Чтобы оценить эффект специфического ингибитора Rho-фактора ВСМ на транскрипцию гена ribB E.coli в условиях репрессии рибофлавином, мы воспользовались методом количественной ПЦР сопряженной с обратной транскрипцией. Для этого эксперимента была выделена суммарная РНК из штамма E.coli АМ4002 pMZ25, содержащего плазмиду с транскрипционным фьюзом лидерной области гена ribB дикого типа с репортерным геном lacZ без собственного промотора. Рекомбинантный штамм растили на полноценной LB-среде в присутствии 50(хМ рибофлавина и либо с добавлением 25 мкг/мл ВСМ, либо в его отсутствии. Для реакции обратной транскрипции использовали по 0,05 мкг суммарной РНК в качестве матрицы. В результате проведенного эксперимента (рис. 11) мы обнаружили, что добавление ВСМ при выращивании клеток в условиях репрессии, способствует 8-кратному увеличению количества полноразмерного транскрипта (фрагмент 2). Увеличение в 3,5 раза уровня транскрипции лидерной области гена ribB под действием ВСМ (фрагмент 1), по-видимому, связано со сквозной транскрипцией, осуществляемой с расположенного выше промотора.

Рисунок II. Влияние ВСМ на транскрипцию гена rib В Е.соН в условиях репрессии рибофлавином. (А)

Структура плазмиды pMZ25, в полилинкерную область которой был клонирован фрагмент лидерной области гена ribB с нативным промотором. за которой расположен структурный ген lacZ. Цифрами 1 и 2 обозначены фрагменты, за амплификацией которых следили с помощью количественной ПЦР. (Б) График накопления флуоресцентного сигнала в логарифмических координатах в зависимости от ПЦР-цикла. (В) Относительный уровень транск-р ищии о бшстей I и 2 с ribß-промотора. Амплификация

области 16S рРНК и области мРНК гена, кодирующего деформилазу (dej) была проведена для внутреннего контроля. Относительный

уровень транскрипта отражает количество мРНК. выделенной из клеток, выращенных в условиях репрессии рибофлавином при добавлении ВСМ по отношению к мРНК, выделенной из клеток, выращенных без ВСМ.

3.3. Влияние Rho-фактора на элонгацию транскрипции гена ribB в очищенной системе in vitro.

Результаты экспериментов по проведению реакции транскрипции in vitro свидетельствуют о том, что в случае лидерной области дикого типа добавление ФМН в отсутствии Rho-фактора, не влияет на процесс транскрипции, и мы наблюдаем накопление продукта реакции, размером 324 н (рис. 12). При добавлении Rho-фактора в реакционную смесь характер транскрипции меняется. В отсутствии трансляции Rho-фактор стимулирует терминацию транскрипции лидера дикого типа, при этом в присутствии ФМН преждевременная терминация наступает значительно раньше (показано сплошной линией на рис. 12) и происходит с большей эффективностью, по сравнению с тем, когда ФМН в реакционную смесь не добавляли. В случае мутации Ml, которая имитирует структуру рибопереключателя «+ФМН», Rho-зависимая терминация происходит независимо от присутствия ФМН и наблюдается в том же положении, как при транскрипции лидерной области

дикого типа в присутствии ФМН. В случае мутации М2, стабилизирующей альтернативную конфигурацию рибопереключателя, Шю-зависимая терминация существенно ослабляется (количество полноразмерного транскрипта составляет 70%) и происходит в положении, характерном для реакции транскрипции лидерной области дикого типа без ФМН.

Дикий тип М1 М2

р-фактор + - + -

Рисунок 12. Транскрипция лидерных областей гена ribB дикого типа, а также ее мутантных вариантов в очищенной системе in vitro в присутствии ФМН и/или Rho-фактора. Сплошной красной линией показана область Rho-зависимой терминации, наблюдаемой для лидерной области дикого типа в присутствии ФМН. Прерывистой красной линий показана область Rho-зависимой терминации, наблюдаемой для лидерной области дикого типа без ФМН.

Полученные данные свидетельствуют о том, что вероятность Rho-зависимой терминации определяется пространственной структурой рибопереключателя. Так, связывание ФМН с /"/«-элементом, приводит к формированию такой конфигурации рибопереключателя, которая позволяет Rho-фактору терминировать транскрипцию структурной части гена ribB, до того как синтезируется SD-последовательность. Таким образом, помимо контроля трансляции гена ribB. ФМН-связывающий рибопереключатель регулирует транскрипцию гена ribB на уровне Rho-зависимой терминации.

ВЫВОДЫ

1. Определены старты транскрипции внутренних промоторов Р2 и РЗ rib-оперона B.subtilis. Показано, что главную роль в регуляции экспрессии генов пй-оперона играет основной промотор PI. Установлено, что транскрипционная активность промотора РЗ в 5 раз выше чем у основного промотора PI, тогда как активность промотора Р2 на два порядка ниже. В отличие от промотора PI, экспрессия с промоторов Р2 и РЗ не регулируется флавинами.

2. Связывание ФМН с лидерной областью гена ураА B.subtilis приводит к формированию Rho-независимого терминатора транскрипции, снижающего уровень экспрессии структурной части гена.

3. Установлено, что формирование инициаторного комплекса 30S субъединицы рибосомы с SD-последовательностью лидерной мРНК гена ураА B.subtilis блокируется в присутствии ФМН. Таким образом, регуляция экспрессии гена ураА B.subtilis осуществляется как на уровне терминации транскрипции, так и на уровне инициации трансляции.

4. В формировании альтернативных структур (анти-терминатора и антисеквестра), обеспечивающих эффективную экспрессию гена ураА B.subtilis, участвует одна и та же область лидерной мРНК. Предложена динамическая модель ФМН-зависимого фолдинга лидерной мРНК гена ураА, объясняющая комбинативное действие рибопереключателя на уровне транскрипции и трансляции.

5. На модели гена ribB E.coli обнаружен новый механизм регуляции с участием рибопереключателей, действующий на уровне Rho-зависимой терминации транскрипции. В присутствии ФМН в лидерной мРНК гена ribB происходит формирование структуры, обеспечивающей связывание фактора Rho, что приводит к подавлению дальнейшей транскрипции структурной части гена ribB E.coli в результате Rho-зависимой терминации.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Склярова С.А., Кренева Р.А, Перумов Д.А., Миронов A.C. Характеристика внутренних промоторов оперона биосинтеза рибофлавина у Bacillus subtilis //Генетика. 2012. Т48. №10. С. 1-9

2. Hollands К., Proshkin S., Sklyrova S., et al. Riboswitch control of Rho-dependent transcription termination // Proc Natl Acad Sei USA. 2012. 109(14). P. 5376-81

3. Склярова С.A., Миронов А.С.Механизм регуляции гена ураА Bacillus subtilis с участием ФМН-связывающей сенсорной РНК//Генетика. 2014.Т50.№3. С. 36*f-368

4. Склярова С.А., Прошкин С.А., Миронов A.C. Сенсорная РНК контролирует Ä/го-зависимую терминацию транскрипции лидерной области гена ribB Е. coli. Материалы 16-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология Наука XXI века» Пущино, 1621 апреля 2012 г.,

5. Sklyarova S., Mironov A. The transcriptionally- and translationally acting ypaA riboswitch in Bacillus subtilis II FEBS J. 2013 Jul. 280 Suppl 1. C.45

Заказ № 25-а/03/2014 Подписано в печать 12.03.2014 Тираж 55 экз. Усл. п.л. 1.2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Склярова, Светлана Анатольевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ»

(ФГУП «ГОСНИИГЕНЕТИКА»)

04201456151

На правах рукописи

Склярова Светлана Анатольевна

Структурная организация и механизмы действия ФМН-зависимых рибопереключателей у бактерий

Специальность 03.02.07 - Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор,

Миронов Александр Сергеевич

Москва 2014

Оглавление стр.

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................9

1. Биосинтез рибофлавина и его производных у бактерий...................10

1.1. Пути биосинтеза рибофлавина у бактерий..............................................10

1.1.1. ГТФ-циклогидролаза II.....................................................................12

1.1.2. Редуктаза и дезаминаза.....................................................................13

1.1.3. Дефосфорилирование 5-амино-6-(рибитиламино)-2,4(1Н,ЗН)-пиримидиндион-5'-фосфата..................................................................................13

1.1.4. 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтаза..................................14

1.1.5. Люмазинсинта...................................................................................14

1.1.6. Рибофлавинсинтаза...........................................................................15

1.1.7. Биосинтез флавиновых нуклеотидов, ФМН и ФАД......................16

1.2. Гены биосинтеза рибофлавина и его производных................................17

2. Регуляция экспрессии генов посредством рибопереключателей у бактерий................................................................................................................22

2.1. Разнообразие рибопереключателей у бактерий......................................23

2.2. Аналоги лигандов рибопереключателей как антимикробные соединения.........................................................................................................27

2.3. Механизмы действия рибопереключателей............................................29

2.3.1. Роль Шю-фактора в регуляции экспрессии генов с участием рибопереключателей.....................................................................................33

2.4. Структурная организация рибопереключателей.....................................35

2.5. ФМН-связывающие рибопереключатели................................................38

2.5.1. Пространственная структура ^-элемента....................................39

2.5.2. Механизмы действия ФМН-связывающих

рибопереключателей.....................................................................................41

2.5.2.1. Регуляция генов, вовлеченных в биосинтез рибофлавина......41

2.5.2.2. Регуляция генов, вовлеченных в транспорт рибофлавина......43

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................46

3.1. Бактериальные штаммы и плазмиды........................................................46

3.2. Состав питательных сред, используемых для выращивания бактерий.....................................................................................................47

3.3. Выделение хромосомной ДНК из бактерий B.subtilis...........................48

3.4. Выделение плазмидной ДНК из E.coli....................................................49

3.5. Трансформация бактерий.........................................................................49

3.5.1. Трансформация Е. coli......................................................................49

3.5.2. Трансформация В.subtilis.................................................................49

3.6. Конструирование транскрипционных фьюзов ribP 1.3-lacZ в гене атуЕ хромосомы B.subtilis..........................................................................................50

3.7. Конструирование транскрипционных фьюзов, локализованных в области п'6-оперона B.subtilis..........................................................................51

3.8. Сайт-направленный мутагенез..................................................................52

3.9. Конструирование транскрипционных и трансляционных фьюзовураА-lacZ в гене атуЕ хромосомы B.subtilis...........................................................53

3.10. Конструирование транскрипционных фьюзов ribB-lacZ..............54

3.11. Определение активности Р-галактозидазы....................................55

3.11.1. В культуре клеток Е. coli..................................................................55

3.11.2. В культуре клеток B.subtilis..............................................................55

3.12. Выделение суммарной РНК из бактериальных клеток.................56

3.13. Определение старта транскрипции.................................................57

3.14. Транскрипция in vitro.......................................................................58

3.15. Транскрипция in vitro на твердой фазе...........................................58

3.15.1. Определение расположения Rho-независимого терминатора транскрипции генаураА B.subtilis......................................................................59

3.15.2. Транскрипция лидерной области гена ribB E.coli в очищенной системе in vitro......................................................................................................60

3.16. Анализ формирования 308-инициаторного комплекса на мРНК (тоупринт-анализ)..................................................................................................61

3.17. Анализ вторичной структуры РНК («In-line probing»)..................62

3.18. Количественная ПЦР (RT-qPCR).....................................................63

РЕЗУЛЬТАТЫ.....................................................................................................66

4. Изучение структурно-функциональной организации внутренних промоторов рибофлавинового оперона В. subtilis.........................................66

4.1. Определение старта транскрипции внутренних промоторов Р2 и РЗ rib-оперона..............................................................................................................67

4.2. Оценка силы промоторов r/6-оперона....................................................70

4.3. Определение уровня транскрипции генов ribB, rib А и ribT в составе г/6-оперона........................................................................................................71

4.4. Изучение уровня транскрипции генов r/6-оперона с помощью RT-qPCR...................................................................................................................73

5. Исследование регуляции экспрессии гена ураА B.subtilis........................80

5.1. Определение структуры промотора гена ураА B.subtilis........................81

5.2. Изучение экспрессии транскрипционных и трансляционных фьюзов ypaA-LacZ в клетках штамма В. subtilis RKH25 и его изогенного варианта В. subtilis RKH25-C1..........................................................................................82

5.3. Влияние ФМН на формирование 308-инициаторного комплекса на лидерной мРНК тен&ураА B.subtilis................................................................86

5.4. Транскрипция in vitro тепа.ураА на твердой фазе...................................88

5.5. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ypaA-LacZ в клетках штамма В. subtilis RibB 110..............................................................................90

5.6. Транскрипция лидерной мРНК гена ураА дикого типа и ее мутантных вариантов в системе in vitro.............................................................................94

5.7. Изучение вторичной структуры лидерной мРНК гена ураА методом гидролиза («In line probing»)............................................................................96

6. Исследование регуляции экспрессии гена ribB E.coli............................102

6.1. Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ribB-LacZ в клетках штамма E.coli АМ4002...................................................................................102

6.2. Определение доли полноразмерного транскрипта гена ribB методом «достройки праймера»....................................................................................106

6.3. Изучение транскрипции гена ribB на фоне ингибирования Rho-фактора

методом RT-qPCR...........................................................................................107

6.4. Влияние Rho-фактора на элонгацию транскрипции гена ribB в

очищенной системе in vitro............................................................................109

ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................................114

ВЫВОДЫ............................................................................................................121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................122

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы

Одним из важнейших условий для жизнедеятельности микроорганизмов в меняющихся условиях окружающей среды является способность точного и своевременного контроля экспрессии их генов для обеспечения нормального роста и развития. Традиционно считалось, что функцию генетических регуляторов в клетке могут выполнять исключительно соединения белковой природы. Однако, в последнее время, появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что молекулы РНК обладают широким спектром регуляторных функций в контроле клеточного метаболизма у бактерий. За последнее десятилетие наши представления о регуляторных функциях РНК в клетке значительно расширились благодаря открытию так называемых сенсорных РНК или рибопереключателей. Такие рибопереключатели располагаются в 5-лидерных областях мРНК генов, экспрессию которых они модулируют. Важным свойством рибопереключателей является их способность напрямую, без помощи белковых посредников, распознавать и связывать определенные клеточные метаболиты. В результате специфического связывания с метаболитом происходит такое изменение конформации лидерной мРНК, которое приводит к выключению или, реже, включению экспрессии прилегающих генов. Многочисленные исследования структуры и механизмов действия сенсорных РНК показали, что регуляция экспрессии генов с участием рибопереключателей широко распространена в мире бактерий, архей, растений, грибов и водорослей. Так, было показано, что рибопереключатели играют ключевую роль в регуляции ряда оперонов В.яиЫШя и Е.соН, контролирующих биосинтез витаминов, аминокислот, нуклеотидов, ионов металлов и других жизненно важных соединений. Некоторые рибопереключатели осуществляют генетический контроль вирулентности у патогенных видов, поэтому рациональный дизайн соответствующих лигандов представляет перспективную стратегию поиска антимикробных соединений для терапевтического применения. Кроме того,

изучение структурно-функциональной организации природных рибопереключателей может способствовать разработке синтетических рибопереключателей для направленной реконструкции метаболизма бактерий, например, с целью утилизации нежелательных гербицидов.

Таким образом, изучение представителей различных классов рибопереключателей имеет важное фундаментальное значение, поскольку расширяет представление о возможных механизмах регуляции экспрессии генов у бактерий, а также имеет разнообразные практические перспективы в самых различных сферах биотехнологии и медицины.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение структурной организации и механизмов действия представителей класса ФМН-зависимых рибопереключателей на моделях r/6-оперона B.subtilis, тепаураА B.subtilis, а также гена ribB E.coli.

В процессе работы решались следующие задачи:

3. Изучение роли Rho-фактора в ФМН-зависимой регуляции лидерной мРНК гена ribB E.coli.

Научная новизна и практическая значимость

С помощью экспериментов по достройке праймера были определены старты транскрипции внутренних промоторов п'Ь-оперона B.subtilis. С использованием метода RT-qPCR показано, что в отличие от основного промотора, расположенного перед первым геном rib-оперона, транскрипционные активности внутренних промоторов не зависят от внутриклеточного содержания ФМН.

На модели гена ураА B.subtilis выявлен комбинативный механизм действия рибопереключателей, который осуществляется как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Результаты экспериментов по транскрипции in vitro показали, что связывание лидерной мРНК этого гена с ФМН приводит к преждевременной терминации транскрипции путем формирования структуры Rho-независимого терминатора, локализованного в области 210-240 нуклеотидов. С другой стороны, методом тоупринт анализа, было продемонстрировано, что в присутствии ФМН рибосома не может связаться с лидерной мРНК вследствие формирования шпильки секвестра, блокирующего сайт связывания рибосомы (SD-последовательность). Кроме того, результаты сравнительного анализа продуктов гидролиза мРНК в присутствии ФМН и его отсутствии, показали, что в последнем случае в формировании альтернативных структур (антитерминатора и антисеквестра) принимает участие одна и та же область лидерной мРНК. На основании полученных данных предложена динамическая модель ФМН-зависимого фолдинга лидерной мРНК гена ураА.

На модели гена rib В E.coli выявлен новый механизм регуляции с участием рибопереключателей, основанный на Rho-зависимой терминации транскрипции. Установлено, что изменение конфигурации рибопереключателя в результате связывания с ФМН приводит к подавлению дальнейшей транскрипции структурной части гена rib В E.coli в результате Rho-зависимой терминации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Биосинтез рибофлавина и его производных у бактерий

Рибофлавин (или витамин В2) относится к группе водорастворимых витаминов и является необходимым элементом питания человека и животных. Впервые рибофлавин был открыт в 1879 году ученым Блисом как «желтый пигмент» молока и получил название лактофлавин. Его химическая структура была расшифрована Паулем Каррером (Цюрих, Швейцария) и Ричардом Куном (Гейдельберг, Германия) в 1930 году. За исследования в области каротиноидов и витаминов они были удостоены Нобелевской премией по химии в 1937 и 1938 годах, соответственно. Используемое в настоящее время название «рибофлавин», отражает наличие сахарного спирта рибита в его молекуле, а также желтый цвет вещества.

Рибофлавин, как правило, не участвует в метаболических процессах внутри клетки напрямую. Его биологическая роль связана с тем, что он служит предшественником для синтеза флавиновых коферментов, таких как флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). Флавокоэнзимы, которые образуются в результате связывания флавиновых коферментов с белками, катализируют широкий спектр окислительно-восстановительных реакций в биологических системах, поскольку они способны переносить как один, так и два электрона от атомов водорода и гидрид-ионов. Кроме того, флавины участвуют во многих других физиологических процессах, таких как светочувствительность, биолюминесценция, циркадные ритмы, репарация ДНК.

В настоящее время в промышленности большая часть рибофлавина производиться с помощью микробного синтеза. В качестве продуцентов используются специальные штаммы бактерий Bacillus subtilis, плесени Ashbya gossypii и дрожжей Candida famata (Candida flareri). Если раньше сверхпродуценты рибофлавина получали методом классической селекции, то в настоящее время высоко-эффективные штаммы-продуценты совершенствуются с помощью современных подходов к метаболической

инженерии, которые включают сверхэкспрессию структурных и регуляторных генов биосинтеза рибофлавина, а также гены, вовлеченные в биосинтез пуринового предшественника рибофлавина - гуанозин-5-трифосфата (ГТФ).

1.1. Пути биосинтеза рибофлавина у бактерий

В отличие от животных и некоторых прокариотов (некоторые лактобактерии), все растения и грибы, а также большинство бактерий способны синтезировать рибофлавин de novo. Биохимические пути синтеза рибофлавина у растений, бактерий и грибов весьма похожи, но не являются полностью идентичными.

Биосинтез рибофлавина, представленый на рис. 1, начинается с одной молекулы ГТФ и двух молекул рибулозо-5'-фосфата. ГТФ-циклогидролаза II (рис. 1, реакция 1) катализирует освобождение формиата от имидазольного кольца и высвобождение пирофосфата боковой цепи нуклеотидного предшественника, что приводит к образованию 2,5-диамино-6-(рибозиламино)-4(ЗН)-пиримидинон-5'-фосфата. На следующих этапах биосинтеза (рис. 1, реакция 2-6) происходит гидролитическое удаление аминогруппы в положении 2, уменьшение боковой цепи и дефосфорилирование с образованием 5-амино-6-(рибитиламино)-2,4(1Н,ЗН)-пиримидиндиона. Очередность процессов дезаминирования и редукции боковой цепи варьирует в разных таксономических группах. В эубактериях стадия дезаминирования предшествует стадии уменьшения боковой цепи, в то время как у дрожжей и грибов данные процессы происходят в обратной последовательности [47; 48; 119]. Следует отметить, что 5-амино-6-(рибитиламино)-2,4(1Н,ЗН)-пиримидиндион-5'-фосфат не является субстратом для 6,7-диметил-8-рибитиллюмазинсинтазы. Это соединение проходит стадию дефосфорилирования перед дальнейшим превращением. К настоящему моменту об этом важном этапе в биосинтезе рибофлавина ничего не известно. Далее дефосфолирированное производное

ОООо-сн.

<лд

Qo— сн2

h2n

OH OH

GTP

HCOO pp,

" nh N'^ "NH

Qo—ch2

hjn hn

ll I

CHjOH

c=o I

H—С—OH

I л

CHjoQ

Ribulose-5-phosphate

2,5-diamino-6-ribosylamino-4(3H)-pyrimidinedione 5'-phosphate

5-amino-6-ribosylamino-2,4(1 H,3 H)-py ri mid med ione 5'-phosphate

chj

c=o

3,4-dihydroxy-

2-butanone

4-phosphate

2,5-diamino-6-ribitylamino-4(3H)-pyrimidinedione 5'-phosphate

5-amino-6-ribitytamino-2,4(1 H,3H)-pyrimidinedione 5-phosphate

5-amino-6-ribitylammo-2,4(1H,3H)-pyrimidinedione

6,7-dimethyl-8-ribityllumazine

OH OH

Flavin aden

Информация о работе

Склярова, Светлана Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.02.07

Диссертация

Структурная организация и механизмы действия ФМН-зависимых рибопереключателей у бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы