Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотооксидазная активность и её роль в бактериальном фотосинтезе

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фотооксидазная активность и её роль в бактериальном фотосинтезе"

0&

д й «97

ПЕРМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

РЕМЕННИКОВ ВАЛЕНТИН ГРИГОРЬЕВИЧ

ФОТООКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ И ЕЕ РОЛЬ В БАКТЕРИАЛЬНОМ «ОТОСИНТЕЗЕ

( Микробиология - 03.00.07. )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пермь - 1996

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета им. И.В. Ломоносова и на кафедре физиологии растений и микробиологии биологического факультета Пермского государственного университета им. A.M. Горького

Научный консультант - доктор биологических наук,

профессор В.Д. Самуилов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.Н. Ивановский

доктор биологических наук

В.М. Горленко

доктор биологических наук

А.Ю. Семенов

Ведущая организация: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН (г. Пущино);

Защита состоится * Л/п .sZsгг._ 1997 г.

в часов на заседании диссертащюнного совета Д053. 05. 66 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 11S899, Москва, Воробьевы горн, МГУ, биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ

Автореферат разослан " 11 { 1997 г.

Ученый секретарь кандидат биологических наук

Н.Ф. Пискункова

Актуальность проблемы. Жизнь на Земле во всём её многообразии зависит от кислорода. Есть основание полагать, что молекулярный кислород присутствовал в атмосфере Земли ещё до появления жизни. Следовательно, проблема взаимодействия клетки с кислородом стара как сама жизнь и самая первая клетка, возникшая на планете, должна была иметь защитные механизмы, которые бы служили основой сохранения и эволюции жизни. ¡С таким механизмам детоксикации молекулярного кислорода, вероятно, следует отнести систему дыхания; эта первичная и древняя функция, по мнение академика В.П. Скулачева (1994), присуща и ныне существующим клеткам. Проблема защиты клетки от кислорода наиболее остро стоит у растений, которые не только поглощают кислород в процессе дыхания, но и продуцируют его в результате фотосинтеза.

Фотосинтез, который представляет собой комплекс последовательно протекающих процессов, обеспечивающих трансформацию солнечной энергии в химическую, является одной из актуальных и наиболее важных проблем современной биологии, а исследование энергопреобразующих систем аанимает центральное место в решении этой проблемы и ведется на разных уровнях -на растениях, водорослях и бактериях, на изолированных мембранах, белковых комплексах и модельных пигмент-содержащих системах. Комплексный подход к решению проблемы позволяет глубже понять не только механизм преобразования световой энергии, но даёт возможность выяснить этапы становления фотосинтетического аппарата и общие закономерности протекания фотосинтеза.

В связи с этим особое внимание исследователей обращено на фотосинтезирующие микроорганизмы, среди которых важное место занимают пурпурные бактерии, внесшие существенный вклад в понимание механизмов трансформации световой энергии при фотосинтезе. Фотосинтетический аппарат пурпурных бактерий, главной составной частью которого являются фотосинтетические реакционные центры, локализован в цитоплазматической мембране и внутриклеточных мембранных структурах - хроматофорах. Комплексы реакционных центров, являясь первичными преобразователями световой энергии, обеспечивают фотоиндуцированный пере-

нос электронов по циклической системе, функционирование которой приводит к генерации на сопрягающих мембранах электрохимического протонного градиента, и по нециклической системе, одним из проявлений которой является фотоиндуцированное поглощение кислорода - фотоокседазная активность.

Фотоокседазная активность, впервые обнаруженная Френчем ( Prench, 1940), вероятно, имеет большое физиологическое значение, смысл которого может заключаться в регуляции содержания кислорода в среде. В результате удаления (>£ за счет фо-тооксидааной реакции в среде создаются анаэробные условия, необходимые для роста бактерий. В связи с этим, заслуживает особое внимание исследование не только механизма этого эффекта, но и его связи с фотосинтезом (Шувалов и др., 1968).

Цель работы. Поскольку механизм фотооксвдазной реакции и её роль в бактериальном фотосинтезе оставались неизученными, то это и послужило целью исследований, которые проводились на клетках, изолировашых мембранах, комплексах реакционных центров и пигментах пурпурных и зеленых бактерий. Работа базируется на исследовдаиях, начатых на кафедре микробиологии ИГУ.

Конкретно задачи исследований сводились к изучению механизма фотооксвдазной реакции и её роли в детоксикации молекулярного кислорода и в генерации мембранного потенциала.

Научная новизна работы. Установлено, что изолированные мембраны и интактные клетки пурпурных и зеленых бактерий, инкубируемые с донорами электронов, при освещении поглощают кислород, т.е. обладают фотооксвдазной активностью. У разных бактерий компоненты,реагирующие с 09, имеют различную природу. Фотоокседазная реакция у несерной пурпурной бактерии Юю-dospirillm rubrum протекает при участии компонентов фотосинтетического реакционного центра и, наиболее вероятно, обусловлена взаимодействием фотовосстановленного вторичного хино-на в непротонированной форме (Qg**) с кислородом. Поскольку скорость фотооксвдазной реакции в хроматофорах R. rubrum снижается.при добавлении супероксиддисмутазы и каталазн, то продуктом реакции, вероятно, является анион супероксвдного радикала. В интактных клетках компонентом, взаимодействующим

с QgT может бить не Og, а цитохром с' или ее* ( они в значительной степени теряются при выделении хроиатофоров), которые в свою очередь окисляются кислородом с образованием H¿0. Таким образом, фотооксидазная активность пурпурных бактерий выполняет защитную функцию, а бактериальные хроматофоры подобно митохондриям, по-видимому, служат биологическими топками, сжигающими органическое вещество для снижения концентрации кислорода в клетке.

При обработке изолированных хроиатофоров R. rubrum детергентами с кислородом взаимодействуют фотовосстановленные компоненты электрон-транспортной цепи, предшествующие Qg"*. В опытах с модельными системами показано, что такими компонентами могут быть бактериохлорофилл и бактериофеофитин, которые, будучи встроенными в мицеллы детергентов, или в леци-тиновне липосомы, при освещении взаимодействуют о кислородом. Фотооксвдазной активностью обладают также липосомы, содержащие каротиновды пурпурных бактерий.

Показано, что светозависимая циклическая редокс-цепь пурпурных бактерий может функционировать в двух режимах: как цепь с полным набором редокс-компонентов и как сокращенная цепь, функционирующая без участия цитохрома ь. Она находится в тесном взаимодействии с системой дыхания, что проявляется э наличии не только общих компонентов, но и в образовании общего продукта этих двух систем - трансмембранной разности электрохимических потенциалов. Впервые проведена реконструкция электрогенной функции мембранной РРн-азн пурпурной бактерии

R. rubrum.

Окисление компонентов циклической редокс-цепи в результате фотооксвдазной реакции, как и чрезмерное их восстановление в анаэробных условиях вызывает ингибирование её электрогенной функции. Кислород оказывает регулирующее влияние на редокс-состояние компонентов циклической цепи фотоиндуциро-ванного переноса электронов.

В клетках пурпурной серобактерии Ectothiorhodoapira balopMla и зеленой серобактерии Chlorobium limicola цито-хромоксадазной активности не обнаружено, что свидетельствует

06 отсутствии системы дыхания и особой роли фотооксвдазной реакции, физиологический смысл которой в микроаэрофильннх условиях в сочетании с супероксвддисиутазой и каталазой может заключаться в детоксикации молекулярного кислорода, а в условиях аэрации среды она, вызывая окисление компонентов фотосинтетической редокс-цепи, приводит к энергетическому дефициту в клетке и её последующей гибели.

Высказана гипотеза о том, что молекулярный кислород мог быть движущим фактором эволюции фотосинтетического аппарата как преобразователя световой энергии, важным этапом эволюции представляется формирование механизмов фотооксвдазной реакции, что закладывает основу для нового подхода в изучении фотосинтеза.

Практическая значимость работы. Знание механизмов фотооксвдазной реакции проясняет природу анаэробного образа жизни фототрофных бактерий и может быть использовано для оптимизации их промышленного культивирования с целью получения полезных продуктов метаболизма, а в будущем для создания искусственных систем преобразования и аккумуляции световой энергии по принципу действия фотосинтетического аппарата клетки.

Место проведения работа. Исследования были начаты на кафедре микробиологии биологического факультета Московского госуниверситета и продолжены на кафедре физиологии растений и микробиологии биологического факультета Пермского госуниверситета. Автор выражает искреннюю благодарность В.Д. Саму-илову за внимание, поддержку и помощь в организации исследований и написании работы.

Структура работы. Диссертационная работа написана в монографическом плане на 325 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 70 рисунков, и состоит из введения,

7 глав, в которых изложены результаты исследований и проведено их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, включающего 493 названий.

Апробация работы. В 1596 году работа в полном её объеме апробировалась на кафедре физиологии растений и микробиологии биологического факультета Пермского госуниверситета, на

кафедре микробиологии биологического факультета Московского госуниверситета, на сессии по биоэнергетике в лаборатории академика В.П. Скулачева в МГУ и на международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза" в институте почвоведения и фотосинтеза РАН (г. Пущино).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ряде работ отечественных и зарубежных авторов показано, что фотооксидазной активностью обладают мембранные препараты разных видов пурпурных бактерий ( Vernon, Kamen, 1953; Борисов и др., 1970; Del Valle-Tascon, Ramirez, 1975; Hochman, Carmeli, 1977; Asami, Akazawa, 1977) и зеленых серобактерий (Шувалов и др., 1968; Shill, Wood, 1985; Frigard et al,l9S4), инкубируемые с различными донорами электронов. Проведенные нами исследования показали, что у одних ввдов бактерий процесс подавляется о-фенантролином, а у других устойчив к данному ингибитору (Ременников, Самуилов, 1981).

МЕХАНИЗМ ФОТООНСВДАЗЮй РЕАКЦИИ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ

Для изучения механизма и роли фотоокседазной реакции при проведении опытов использовали главным образом клетки и изолированные мембранн несерной пурпурной бактерии r. rubrum. Такой выбор объясняется тем, что относительная простота структурной организации, высокая лабильность метаболизма и устойчивость к неблагоприятным факторам среды, возможность получения высокостабильных субклеточных структур и обширная информация делают их удобными объектами исследований, а сходство биоэнергетических систем позволяет экстраполировать данные, полученные при изучении этой бактерии, на другие организмы.

Фотооксидаэная активность интактннх клеток,

хроматофоров и изолированных комплексов реакционных центров

Исследования, проведенные нами, показали, что фотоокси-дазной активностью обладают не только изолированные мембраны, но и интактные клетки пурпурных бактерий. Данный процесс про-

является после добавления в среду инкубации цианцца, ингиби-рующего цитохромоксидазу R. rubrum , как с искусственными, так и с природными субстратами (рис. 1 А,Б), стимулируется при последующем добавлении ингибитора циклического переноса электронов 2-н-гептил-4-гвдроксихинолин-н -оксида (или анти-мицина А) и протонофорного разобщителя м-хлоркарбонилцианед-фенилгидрааона и подавляется о-фенантролином.

Рис. 1. Фотоиндуцированное поглощение кислорода клетками несерной пурпурной бактерии ШюаозрЛгШит гиЪгит с искусственным (А) и естественным субстратом окисления (Б). Среда инкубации: А - 250 мй сахароза, 50 мМ трис-НС1-буфер (рН 7,6), 0,2 мМ ЭДТА; Б - то же плюс 10 мМ цианцц калия. Добавки: клетки с содержанием бактериохлорофилла 10 мкМ, 0,1 мМ ТНФД, 5 мМ трис-аскорбат, 10 мМ КСТ , 5 мМ о-фенантролин, 5 мМ трис-сукцинат, 3 мкМ 2-н-гептил-4-гвдроксихинолин-й -оксвд (ГХО), 3 мкМ м-хлоркарбонилциа-нидфенилгидразон (ХКФ), 5 мМ о-фенантролин (о-фен).

Фотооксвдазной активностью, чувствительной к о-фенан-тролину, обладают не только клетки и изолированные хромато-форы, но и комплексы фотосинтетических реакционных центров Р870. Освещение комплексов, инкубируемых с ТМФД и аскорбатом, вызывает поглощение кислорода, которое существенным образом

стимулируется витамином Kg и протекает со скоростью 30 мкмоль поглощенного Og на 1 мкмоль Р870 за 1 мин. Поскольку молярное соотношение, меяду реакционными центрами Р870 и общей массой светособирающего бактериохлорофилла в хроматофорах составляет 1:30, то скорости поглощения Ог, хроматофорами (1,7-2,0 мкмоль в расчете на 1 мкмоль бактериохлорофилла за 1 мин), клетками (1,3 мкмоль в расчете на 1 мкмоль бактериохлорофилла за 1 мин) и изолированными реакционными центрами в пересчете на 1 мкмоль Р870 существенно не отличаются.

Таким образом, фотооксвдазная активность клеток и изолированных хроматофоров обусловлена зависимым от реакционного центра нециклическим переносом электронов от добавленного донора на лабильно связанный хинон (Qg"*") и последующим его взаимодействием с кислородом. Такой вывод подтверждается данными, полученными при изучении влияния экстракции хинонов на фото-оксидазную активность хроматофоров R. rubrum (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние экстракции хинонов на фотоиндуцировэнное поглощение Og хроматофорл. rubrum'(в нмолях Оо за 1 мин на 1 мкмоль бактериохлорофилла).

Хроматофоры Скорость поглощения кислорода

нмоль Og %

1. Н ативнне 1700 100

2. Лиофилизированнне 1700 100

3. Экстрагированные 50 3

4. 3 + витамин 1700 100

5. Реконструированные:

экстрактом 660 40

убихиноном-6 400 i 23

Из данных, представленных в таблице, видно, что лиофиль-ное высушивание не влияет на фотооксвдазную активность хроматофоров, которая сильно подавляется при удалении хинонов в результате их экстракции изооктаном и восстанавливается вновь

при добавлении в среду инкубации витамина К^ или в результате реконструкции хроматофоров иэооктановнм экстрактом, содержащим бактериальные хиноны или убихинон-6.

Данные по аутооксвдабельности хинонов (1,4-нафтохинон, убихинок-1, витамин йд) показывают, что скорость поглощения кислорода в водном растворе аскорбата и добавленного хинона возрастает с увеличением рН среды от 5 до 9. Сходную рН-ззависимость имеет чувствительное к о-фенантролину фотоиндуци-рованное поглощение кислорода хроматофорами, скорость которого также возрастает при увеличении рН среды инкубации. Это указывает на то, что в том и другом случае с кислородом взаимодействует непротонированная форма хинона (рис.11 ).

Таким образом, можно полагать, что в изолированных хро-матофорах фотооксвдазная активность представляет собой нециклический перенос электронов от добавленного донора, протекающий при участии компонентов реакционного центра, на лабильно связанный хинон, который, восстанавливаясь, в непро-тонированной форме взаимодействует с С^. наиболее вероятно в форме анион-радикаласемихинона ((?зт).

Подводя итоги и опираясь на данные о строении и составе фотрсинтетических реакционных центров, процесс чувствительного к о-фенантролину фотоиндуцированного поглощения кислорода можно выразить следующей схемой последовательно протекающих реакций:

Донор электронов (Бхл^ Бхл -*■ Бфео —-»-Чв*^

В данной схеме отсутствуют цитохромы. Это объясняется тем, что изолированные комплексы реакционных центров не содержат в своем составе цитохромов ( ОгасЬеу et а1,1976). Однако в интактных клетках мевду донором электронов и бакте-риохлорофилльным димером в качестве промежуточного переносчика электронов функционирует цитохром С2» который является общим компонентом системы дыхания и фотосинтетической цепи переноса электронов в клетках пурпурных несерных бактерий (В,ассаг1п1-Ме1ап<1г1 et а1., 1578). Последующий перенос электронов от цитохрома С£ на кислород может осуществляться двумя путями: в темноте при участии цитохромоксидазы или на

свету с помощью компонентов реакционного центра. Оба варианта являются электрогенными, что подтверждается стимулирующим действием протонофорного разобщителя на темновое и световое поглощение кислорода клетками R. rubrum , инкубируемыми с ТМФД и аскорбатом.

Внутренняя сторона

2i+ Сукцинат

Внешняя сторона

ТМФД Аскорбат

Рис. 2. Взаимодействие фотосинтетической и дыхательной систем переноса электронов в цитоплазматической мембране несерной пурпурной бактерии Rhodospirillum rubrum. (Бхл)g - бактериохлорофилльный бимер реакционного центра; ^А и ^В ~ пеРвичный и вторичный хинон реакционного центра; Q и QHg - окисленная и восстановленная форма хинона мембранного фонда; Ъ^ и Ъ^- высокопотенциальннй и низкопотенциальный гем цитохрома ь; Cg и с' - цитохромы Cg и с'; цит. о - цитохромоксидаза; PeS и с^ - FeS-белок Риске и цитохром с^, входящие в состав ьс^-комплекс а; СДГ - сукци-натдегвдрогеназа (сукцинат-Соф-редуктаза).

Кроме цитохрома Cg в клетках пурпурных бактерий имеются цитохромы с' и ее' функция которых невняснена. Эти цитохромы большей частью теряются в процессе выделения хрома-тофоров (Bartsch , 1991). Возможно, что именно цитохромы с' и ее, а не кислород, взаимодействуют в процесе фотоок-

- 10 -

сидазной реакции с Qg"* и далее окисляются Og с образованием Н-р в ннгактных клетках пурпурных бактерий.

Наксимальная скорость фотооксвдазной реакции клеток R. rubrum проявляется в условиях, когда: 1) заторможен фотоин-дуцированннй циклический перенос электронов, чувствительннй к ГХО и антимицину А, 2) подавлено чувствительное к разобщителю образование траисмембранной разности электрохимических потенциалов и 3} ингибирована цитохромоксвдаза системы дыхания, чувствительная к цианвду.

Выход цитохрома C2 из сферы влияния цитохромоксидазы в результате воздействия цианвдом вызывает переход этого цитохрома в преимущественно восстановленную форму, что обеспечивает проявление фотооксвдазной реакции в результате переноса электронов от цитохрома Cg при участии компонентов реакционного центра Р870 на цитохром с» или ее', который окисляется кислородом. Ингибитор ГХО, сникающий конкурирующее влияние циклической системы фотоиндуцированного переноса электронов (Del Valle-Tcgcon, Reunires, 1975), стимулирует данный процесс, скорость которого ещё сильнее возрастает при добавлении разобщителя, снимающего электрохимический протонный градиент.

При использовании в качестве субстрата окисления фото-оксвдазной реакции сукцината в переносе электронов на кислород как в темноте, так и на свету принимают участие сукцинат-CoQ-редуктаза и ьс^-комплекс (рис. 2). Согласно схеме, взаимодействие системы дыхания и фотосинтетической системы переноса электронов, проявляющееся в подавлении светом темнового поглощения кислорода, обусловлено наличием не только общих компонентов, но и образованием мембранного потенциала, их общего продукта (Remennikov, Samuilov , i960), обеспечивающего реализацию механизмов фотосинтетического и дыхательного контроля.

Кроме чувствительной к о-фенантродину в клетках пурпурных бактерий была обнаружена и устойчивая к данному ингибитору фотооксидазная реакция. Как показали опыты, наибольшей скоростью фотоиндуцированного поглощения кислорода обладают

клетки серной пурпурной 6aKTepmEctothiorhodospira halophila (Ю-12 мкмоль Og за 1 мин на 1 мкмоль бактериохлорофилла). В отличие от клеток R. rubrum , обладающих" чувствительной к о-фенантролину фотооксвдазной активностью и способных хорошо расти как в анаэробных или аэробных условиях на свету, так и аэробных условиях в темноте, клетки е. halophila, характеризующиеся слабым ростом в аэро&шх условиях в темноте, в присутствии ТМФД и аскорбата в темноте не поглощают кислород, т.е. не обладают цитохромоксвдазной активностью и не имеют системы дыхания (рис. 3). При освещении красным светом клетки Е. halophila осуществляют устойчивое к о-фенантролину фотоиндуцированное поглощение кислорода, которое прекращается в темноте и при освещении зеленым (вместо красного) светом. Данный процесс подавляется азвдом, ингибирую-щее действие которого снимается высокими концентрациями аскорбиновой кислоты. Следует отметить, что в отличие от r. rubrum для проявления фотооксвдазной реакции клеток е. halophila , не зависящей от pH среди инкубации и протекающей с одинаковой скоростью как в присутствии 20% Nací » так и в его отсутствие, не требуется ТМФД, а достаточно лишь аскорбата, непосредственно выполняющего роль донора электронов. Доступность редокс-компонентов, принимающих участие в фотооксвдазной реакции, для аскорбата указывает на то что компонент восстанавливаемый аскорбатом расположен открыто, на внешней стороне мембраны. Подобным типом фотооксвдазной реакции, обусловленной непосредственным окислением аскорбиновой кислоты, а не ТМФД, обладают и другие ввды пурпурных бактерий, лишенные эндогенных субстратов окисления в результате выдержки клеточных суспензий в аэробных условиях в темноте: Rhodospirillum rubrum G-9, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsula tus, Rhodopseudomonasi palustris, Thiocap-sa roseopersicina, Ectothlorhodoapira shaposhnikovii, Ecto-thiorhodospira halochloris.

Модельные пигмент-содержащие системы

Установлено, что при обработке изолированных комплексов реакционных центров Р870 и комплексов бактериохлоро-

филльной светособирающей антенны r. rubrum детергентом тритоном Х-100 наблюдается устойчивое к о-фенантролину светоаависимое поглощение 0g, скорость которого не зависит от рй среды инкубации (Ременников, Самуилов, 1S80). Данный детергент, действуя/4а клетки и пигмент-белковые комплексы Anabaena variabilis , вызывает увеличение квантового выхода реакции и времени жизни флуоресценции хлорофилла до значений, близких vi таковым для хлорофилла в растворе. Скорость фотооксвдазкой реакции хлорофилла а в водном растворе тритона Х-100 не зависит от pH среды (Abdoureshitova et el., 1984).

Зависимой от аскорбата фотооксидазной активностью обладает не только изолированный хлорофилл а, но и бактерио-хлорофилл а и их беэмагниевые производные, встроенные в мицеллы разных детергентов или в лецитиновне липосомы. Независимо от природы пигмента и включения его в искусственные мембраны азид оказывает ингибирующее действие на фото-индуцированное поглощение кислорода этими модельными системами, а увеличение концентрации аскорбата с 10 до 100 мМ снимает существенным образом действие азцда во всех исследованных системах (рис. 4). Скорость фотооксвдазной реакции пигментов как и клеток е. halophila не зависит от pH среды инкубации, устойчива к о-фенантролину и прекращается при освещении зеленым светом. В том и другом случае процесс подавляется азвдом, ингибирующее действие которого снимается высокими концентрациями аскорбата.

Данные кинетического анализа показали, что ингибирова-ние азидом фотоокисления хлорофилла а является конкурентным по отношению к аскорбату и кислороду (Барский и др., 1S86). С одной стороны, азвд конкурентно подавляет взаимодействие аскорбата с окисленной молекулой хлорофилла, а с другой, являясь окислителем, азид может конкурировать с кислородом как акцептор электронов от фотовозбузденного хлорофилла. Увеличение концентрации аскорбата в среде снижает конкуренцию в пользу аскорбиновой кислоты, что сопрововдается частичным снятием ингибирующего действия азвда на фотоиндуци-

Рис. 3. фотоиндуцированное поглощение кислорода клетками серной пурпурной бактерии Ес1;о«и.огЬоао8р1га па1ор'л11а. Среда инкубации: 250 мМ сахароза, 50 мМ трис-НС1-буфер (рй 7,6), 0,2 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-аскорбат, клетки с содержанием бактерио-хлорофилла 10 мкМ. Добавки: 3 мкМ о-фенантролин (о-фен), 10 мМ м: , до) мм трис-аскосбат (Аск). КС и ЗС - включение красного и зеленого света.

Рис. 4. Фотоиндуцированное поглощение кислорода хлорофиллом а ■ в водном растворе тритона Х-100 и аскорбиновой кислоты. • Среда инкубации: 10 мМ трис-аскорбат, 0,3% тритон Х-100, 50 мМ трис-НС1-буфер (рй 7,6), 3 мМ о-фенантрйлин, 0,33 мкг/мл хлорофилл а. Добавки: 10 мМ Май3 , 100 мМ трис-аскорбат (Аск). Вре-•мя преинкубации хлорофилла в растворе детергента составляло 5 мин. КС и ЗС - включение красного и зеленого света.

- 14 -

рованное поглощение кислорода модельными пигмент-содержащи-ми системами и клетками Е. 1га1орМ1а. Неполное снятие инги-бирующего действия аавда высокими концентрациями аскорбиновой кислоты можно объяснить конкурентными по отношению к О2 свойствами Н3 как акцептора электронов от фотовозбувденного хлорофилла.

Таким образом, можно полагать, что фотооксвдаэная активность клеток Е. Ьа1орЬ11а , инкубируемых с аскорбатом обусловлена непосредственным взаимодействием фотовосстановлен-ного бактериохлорофилла с кислородом. Не исключено, что данный процесс может иметь не только физиологическое значение, смысл которого может заключаться в удалении из среди и обеспечивании анаэробных условий, необходимых для роста бактерий, но и большое экологическое значение. Усиливающееся загрязнение водоемов сточными водами, содержащими моющие средства, вызывает разрушение мембран фотосинтезирующих организмов и экстракцию из них пигментов, встраивание которых в мицеллы детергентов в конечном счете может привести в условиях освещения к быстрому потреблению из водной среды и созданию анаэробных условий, неблагоприятных для существования аэробных организмов.

Таким образом, у пурпурных бактерий нами выявлено два типа фотооксвдазной реакции. Чувствительная к о-фенантролину фотооксвдаэная реакция, протекающая при участии компонентов реакционного ценра, обусловлена взаимодействием непротонированной формы вторичного хинона с кислородом. Устойчивая к данному ингибитору, но чувствительная к азиду, фотооксвдаэная реакция интактных клеток пурпурных бактерий, а также изолированных хроматофоров и комплексов реакционных центров, обработанных детергентами, протекает в результате непосредственного взаимодействия фотовосстановленного бактериохлорофилла и бакте-риофеофитина с кислородом. Ингибирующее действие азвда на фо-тооксвдазную реакцию второго типа снимается высокими концентрациями аскорбиновой кислоты.

Поскольку в состав фотосинтетического аппарата фототрофных бактерий входят не только бактериохлорофиллы, но и каротино-иды, то были проведены исследования по выяснению возможного

участия этих пигментов в фотооксвдазной реакции. Для выделения каротиноидов использовали клетки пурпурных бактерий Е. halophila и R. rubrum , основным каротиноидом KOTcpi^c является спириллоксантин, и клетки Rhodobacter aphaeroidea , содержащие каротиноиды сфероиден и сферовденон.

Исследования показали, что в отличие от хлорофилла, бакте-риохлорофилла и их безмагниевых производных каротиноиды, встроенные в лецитиновые липосомы (но не в мицеллы детергентов) в присутствии аскорбата при освещении поглощают кислород, но только после добавления в среду инкубации витамина Kg. Поскольку аутоокисление хинонов возрастает в щелочных условиях и подавляется в кислых, то для предотвращения этого процесса перед добавлением витамина К^ pH среды инкубации снижали до 1-2 10%-ным раствором соляной кислоты (рис. 5.). Фотовосстановление Og не подавляется азидом, который ингибирует данный процесс, протекающий при участии порфиринов, прекращается в темноте или при освещении красным светом с длиной волны более 660 нм и стимулируется белым светом. Более низкая скорость поглощения кислорода при освещении зеленым светом обусловлена тем, что использованный светофильтр (ЗС-2) в четыре раза снижает интенсивность пропускаемого света. Аналогичные результаты были получены и при проведении опытов с каротиновда-ми пурпурных бактерий R- rubrum и Rb. aphaeroidea . Поскольку в отсутствие каротиновдов, но в присутствии других компонентов системы фотоиндуцированное поглощение кислорода не наблюдалось, это явилось основанием для вывода, что сенсибилизатором данной реакции являются каротиноиды ( Малахова, Ре-менников, 1993).

На участие каротиноидов в фотооксидазной реакции указывают и результаты опытов других исследователей. Известно, что экстракты клеток пурпурных бактерий R. rubrum и Rb. sphaeroidea проявляют значительную фотооксвдазную активность при освещении синим светом ( Feldman, Lindström, 1964). Облучение клеток Raeudomonaa fluoreacena i монохроматическим светом с длиной волны 334, 436 и 580 нм вызывает фотоиндуцированное поглощение кислорода ( Еремеева, Фрайкин, 1970). Подобный эффект коротковолновых лучей в области 380-580 нм был обнаружен _

зс нсГ

Рис 5. Фотоиндуцированное поглощение кислорода липосомами, содержащими каротиновдн Еао-йИогИойозР1га ЬвЮрЪПа. Среда инкубации: водный раствор липосом, содержащих кароти-ноида ( - 0,225), и 10 *М аскорбат. Добавки: 10%-ннй НсГо 1 ^витамин Ид, Ю мХ **3. ЗС, БС и КС - включение зеленого, белого и красного света. Внк - выключение света.

в опытах с хлорофилл-содержащими и с этиолированными проростками кукурузы. В отличие от красного света, который не влиял или подавлял дыхание, стимулирующее действие коротковолновых лучей нарастало постепенно по мере увеличения интенсивности света ( Воскресенская, 1865).- Фотооксвдазной активностью обладает и бактериородопсин, содержащий каротиновд ретиналь, который, будучи встроенный с датохромоксвдазой в протеолипосомы, в водном растворе аскорбиновой кислоты принимает участие в фотоиндуцированном поглощении кислорода ( ае11Шб1гег£ et а1., 1976). Всё это указывает на то, что в клетках, содержащих каротиновдн, имеет место фотооксвдазная реакция, протекающая при участии данных пигментов, которая, вероятно, играет роль клеточного механизма детоксикации молекулярного кислорода, что особенно вашо в условиях сильного освещения с преобладанием ультрафиолетовых лучей. Такое

предположение согласуется с данными по сверхсинтезу кароти-ноидов ( мутанты А2озр1гИ1ит ЬгазИепэе- сверхпродуцентн, содержащие в 100 раз больше каротиноидов, чем дик;:П штам), что обеспечивает устойчивость азотфиксации к 0£ в условиях кислородного стресса (Наг-Ьшапп, Нигек, 1988). Следовательно, для создания условий, необходимых для протекания азот-фиксации, избыток кислорода может удаляться из клеток в результате функционирования механизма детоксикации с участием каротиноидов. Для некоторых бактерий показана связь каротиноидов не только со светособирающими комплексами фотосинтетического аппарата, но и с компонентами клеточной стенки ( Уигкот et а1., 1993), что указывает на особую роль этих пигментов в жизнедеятельности клетки.

ЮТООНСИДАЗШ АКТИВНОСТЬ И ГЕНЕРАЦИЯ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА

В хроматофорах несерных пурпурных бактерий генерация мембранного потенциала циклической редокс-цепью обусловлена переносом электронов по двум ввеньям: в темноте с участием ьс^-цитохромного комплекса и на свету с участием комплекса фотосинтетического реакционного центра. С использованием протео-липосом, реконструированных из фосфолипидов и бактериохлоро-филльных реакционных центров, продемонстрировано образование мембранного потенциала при функционировании циклической ре-докс-цепи без участил цитохрома ь ( БгасЬеу ег а1 1975, 1576). Возможно, подобный сокращенный вариант циклической цепи фотоиндуцировэнного переноса электронов действует и в хроматофорах. Решение данного вопроса может пролить свет на эволюцию фотосинтетического аппарата как преобразователя световой энергии. Однако такой возможности противоречат данные с импульсным освещением, согласно которым показатель Н+/е", равный 2 в нативных хроматофорах, падает до 1 при обработке их антимицином А (рг^у а1 ., 1977). Причем устойчивая к данному антибиотику транслокация протонов через мембрану сохраняется лишь на первые три световых импульса, что исключает возможность функционирования циклической цепи по сокращенному варианту.

В связи с эти были проведены исследования, результаты которых даст основание полагать, что циклическая редокс-цепь пурпурных бактерий, локализованная в хроматофорах, может фу-, нкционировать по сокращенному варианту, исключающему участие цитохрома ь.

Из рис. 6 видно, что клетки r. rubrum , инкубируемые аэробно, поглощают анионы ТБ~. Этот процесс, протекающий в темноте, обусловлен поглощением данных анионов по градиенту концентрации и их высоким коэффициентом распределения мевду гидрофобной фазой клетки и водной средой. Последующее включение света вызывает дополнительное поглощение анионов клетками против градиента концентрации, что свидетельствует об их переносе из цитоплазмы во внутриклеточные хроматофоры. Снижение концентрации ТБ~ в цитоплазме, в свою очередь, вызывает перенос этих анионов по градиенту концентрации из среды в цитоплазму клетки.Выклвчение света приводит к восстановлению исходной концентрации ТБ~ в среде инкубации. Сукцинат стимулирует световой ответ ТБ~, который подавляется протонофор-ньм разобщителем (рис. 6 А). Подобно сукцинату, стимулирую-, щее действие на генерацию мембранного потенциала оказывают и анаэробные условия. Это связано с тем, что в аэробных условиях проявляется фотооксвдазная реакция, вызывающая окисление компонентов циклической редокс-цепи, действие которой устраняется при создании анаэробиоза и при добавлении сук-цината.

Антимицин А, ингибирующий перенос электронов на уровне цитохрома ь (мевду гемомъ^ и Q , см. рис. 2), подавляет фотоиндуцированное поглощение ТБ~ внутриклеточными хромато-форами r. rubrum в аэробных условиях (рис. 6 Б). Ингибирую-щее действие антимицина в значительной степени снимается сукцинатом и проявляется вновь при добавлении оксалацетата, конкурентного ингибитора сукцинатдегвдрогеназн. Антимицин А, добавленный на фоне сукцината, не оказывает существенного влияния на уровень светозависимого поглощения ТБ~ клетками R. rubrum . Аналогичные результаты были получены и в опытах с изолированными хроматофорами r. rubrum.

четки Сукцинат ХК$

Внк Океалацетат

Антимицин А [ТБ~]-107 М

4 мин I-И

Рис. б . Влияние различных агентов на фотоиндуцированное поглощение анионов тетрафенилбора клетками Л. гиЪгшп, инкубируемыми аэробно. Среда инкубации: 50 мМ трис-НС1-буфер (рН 7,6), 0,2 мМ ЭДТА, 0,5 мкМ тетрафенилбор натрия (ТБ~), клетки с содержанием бактериохлорофилла 35 мкМ в опыте А и 31 мкМ в опыте Б. Добавки: 5 мМ трис-сукцинат, 2 мкМ м-хлоркарбонилцианидфенилгидразон (ХКФ), 1 мкМ антимицин А, 5 мМ трис-сукцина, 3 мМ трис-оксалацетат.

В анаэробных условиях антимицин А оказывает двухфазное подавление генерации мембранного потенциала внутриклеточными хроматофорами r. rubrum, измеряемого по фотоиндуцирован-ному поглощению ТБ~. В интервале концентраций антибиотика от 0,1 до 1,0 мкМ ответы ТБ~ устанавливаются на относительно постоянном уровне (рис. 7) и подавляются при дальнейшем увеличении концентрации антимицина как в опытах с клетками, так и с изолированными хроматофорами R.rubrum и Rb.sphaeroides (рис. 6).

Поскольку, как показали опыты с изолированными хроматофорами ,r. rubrum, антимицин А в высоких концентрациях ( 2 и более мкМ) подавляет генерацию мембранного потенциала, индуцируемою неорганическим пирофосфатом и фотоиндуцированным нециклическим переносом электронов от диаминодурола, восстановленного аскорбагом, на кислород и метилвиологен, то вторая фаза подавления (рис. 8 А) обусловлена разобщающим действием антибиотика, который разобщает также фотофосфорилиро-вание в хлоропластах ( Drechler et al., 1S6S).

Наиболее вероятно, что первая фаза подавления генерации мембранного потенциала как изолированными, так и внутриклеточными хроматофорами обусловлена переключением электрогенного циклического переноса электронов с одного режима, характеризующегося показателем Н+/е~ = 2, на другой (Н+/е~=1). Такое переключение возмошо в результате изменения механизма окисления-восстановления убихинона. В результате функционирования циклической цепи переноса электронов при участии цитохрома ь происходит трансмембранный перенос двух протонов на один электрон, поступивший из реакционного центра. В присутствии антимицина А, блокирующего функцию цитохрома ь в переносе электронов, также происходит транслокация двух протонов, но в расчете на два электрона, поступивших от реакционного центра. При этом протон освобождается в результате окисления восстановленной формы убихинона компонентами цепи по схеме, представленной на рис. 2. Образующийся при этом семихинон может вступать в реакцию диспропорционирова-ния, что приводит к образованию окисленной (Q) и восстанов-

ioo - °-о-ч>

\

о.

\>

S 50

\

о-

3

.о

0

9 8 7 6 5 4

Рис. 7 . Действие антимицина А на фотоиндуцированное поглощение анионов тетрафенилборз (ТБ~) клетка?« r. rubrum , инкубируемыми анаэробно. Среда инкубации: 50 мН трис-НС1-буфер (рН 7,6), 0,2 мМ ЭДТА, 30 мМ глюкоза, 0,5 мкМ тетрафенилбор натрия, клетки с содержанием бактериохлорофил'ла 31 мкМ, каталаза и глюко-эооксвдаза по 0,17 мг/мл и вазелиновое масло для создания анаэробных условий. 100/5-ннй уровень поглощения ТБ~ соответствует разности электрических потенциалов на измеряющей фосфолипидной мембране 27 мВ.

■ ленной форма (QHg) убихинона. Последующее окисление QHg приводит к освобождению второго протона. Локальное накопление семихинона и последующая реакция диспропорционирова-ния, вероятно, возможны лишь в условиях стационарного освещения, что не происходит при импульсном освещении, которое использовалось в опытах с хроматофорами Rb. sphaeroides ( Petty et al., 1977 ).

100

I

из е-

а> к

X ш а о ч и о ез

100

I *

вд е-

Ф £

а о к

о с:

9 8

-lg Г Антимицин А], М

9 8 7 6 5 -1в[Антимицин АЗ, М

Рис. . Действие антимицина А на поглощение анионов ТБ энергизозаншми хроматофорами, выделенными из клеток (А) И. гиЪгит (Б)ЯЬ. зрЬаего1с1еа (Летешйкот, БаптИстт , 1979)

Среда инкубации: А - 250 мМ сахароза, 50 мМ трис-НС1-буфер (рН 7,6), 1 мкИ тетрашенилбор натрия и хроматофорн Е.гиЪгиш с содержанием бактериохлорофилла 14 нкг/мл; •—е, аэробные условия, 5 иН тркс-аскорбат, 0,1 мМ диаминодурол, 2 1-й ме-тилвиологен, свет, 100%-ный уровень поглощения ТБ- соответствует 120-мЗ на измеряющей фосфолганздной мембране; о—о, аэробные условия, темнота, 3 мМ МвС12 » последовательные добавки 50 мкМ неорганического пирофосфата, ЮО^-ный уровень соответствует 70 мВ; п—п, анаэробные условия, свет, 10 мМ трис-сукцинат, 100%-ннй уровень соответствует 65 мВ; ж—*, анаэробные условия, свет, 100^-ный уровень - 62 мВ. Б - 50 мМ трис-КС1-буфер (рН 7,6), 220 мМ сахароза, 1 мкМ тетрафенилборат натрия и хроматофорн йъ. зр1шего±(1езс содержанием бактериохлорофилла 14 мкМ; о—о, анаэробные условия, свет насыщающей интенсивности, 100%-ный уровень поглощения ТБ~ соответствует НО мВ; •--•, анаэробные условия, интенсивность света снижена, 100/£-шй уровень поглощения ТБ~ соответствует 56 мВ. Для создания анаэробных условий в среду инкубации добавляли 30 мМ глюкозу, по 0,17 мг/мл каталазы и глюкозооксидазы и вазелиновое масло.

Таким образом, исследование функционирования циклической редокс-цепи, показало, что в анаэробных условиях антимицин вызывает двухфазное подавление генерации мембранного потенциала в изолированных и внутриклеточных хроматофорах пурпурных бактерий. Двухфазное действие он окезывает и на фо-тофосфорилирование в хроматофорах R.rubrum (Jonea, Vernon, 1969). Исходя из этого, можно полагать, что циклическая ре-докс-цепь хроматофоров пурпурных бактерий в условиях стационарного освещения может функционировать в двух режимах: как цепь, включающая все редокс-компонентн, и как сокращенная цепь, функционирующая без участия цитохрома ь. Возможная физиологическая роль функционирования циклической редокс-цепи по сокращенному варианту заключается в энергообеспечении клетки в условиях подавления синтеза гемопротевдов или когда в среде культивирования содержатся вещества аналогичные антимицину, которые широко распространены в природе и представлены разнообразными химическими соединениями (Tap-pel, I960 ; Dickie et al., 1963 ). He исключено, что на ранних этапах формирования фотосинтетического аппарата как преобразователя световой энергии циклическая редокс-цепь функционировала по сокращенному варианту, не требующему участия цитохрома ь.

Поскольку изолированные и внутриклеточные хроматофоры по генерации мембранного потенциала и влиянию на этот процесс антимицина А ведут себя одинаково, то для изучения роли фотооксидазной реакции в генерации мембранного потенциала в дальнейшем были использованы изолированные хроматофоры, что внесло существенные удобства и значительно сократило время проведения опытов.

Из рис. 9 вццно, что изолированные хроматофоры, инкубируемые аэробно в отсутствие донора электронов, при освещении генерируют мембранный потенциал, измеряемый по поглощению анионов фенилдикарбаундекаборана (ФЮГ), величина которого существенно снижается во времени. Такой спад обусловлен проявлением фотооксидазной активности, вызывающей окисление компонентов циклической цепи. Повторное включение

5.9 . фотоиндуцированн'ое' поглощение анионов ФЙГхроматофорами гиЪ'ггш в аэробных (А) и анаэробных (Б) условиях. Среда инкуба-л: А- 220 мМ сахароза, 50 мМ трис-НС 1-буфер (рН 7,6) и хромато-рн с содержанием бактериохлоробилла 17 мкМ; Б-то же+ 30 мМ окоза, каталаза и глвкозооксидаэа по 0,17 мг/мл,. вазелиновое зло, 0,1 мМ ТМФД, 5 иМ трис-аскорбат. Добавки: А- 5мМ трис-сук-*ат; Б--5 мЧ трис-йумарат, 1 нМ трис-оксалацетат, 0,1. м« 1,4-Ьтохинон

света вызывает дальнейший спад величины мембранного потенциала. Сукцинат, добавленный в среду инкубации, восстанавливает исходный уровень поглощения ФКБ~ хроматофорами и предотвращает спад величины мембранного потенциала. Аналогичный эффект оказывают анаэробные условия. Однако в анаэробных условиях в присутствии ТМФД и аскорбата набл сдается шгибирование генерации мембранного потенциала ( рис. 9 Б), что связано с чрезмерным восстановлением компонентов циклической редокс-цепи и подавлением её электрогенной функции. Этот ингибирующий эффект устраняется при добавлении в среду инкубации Фумарата, 1,4-нафтохинона, витамина Кд, выполняющих роль акцептора электронов, или при аэрации среды.

Таким образом, полученные данные иллюстрируют регулятор-ную роль фотооксидазной реакции в генерации мембранного потенциала, обусловленной работой циклической редокс-цепи .В аэробных условиях в результате оттока электронов на кислород и в анаэробных условиях в присутствии доноров электронов наблюдается ингибирование генерации мембранного потенциала, которое устраняется в первом случае при добавлении субстратов окисления фотооксидазной реакции (сукцината или ТМФД и аскорбата), а во втором - акцепторов электронов, устраняющих чрезмерное восстановление компонентов циклической редокс-цепи. Кроме регуляторной, как показали опыты, фотооксвдазная реакция может выполнять и электрогенную функцию ( йетегт±коу, БатиНоу, 1979). Наряду с этим внутриклеточную мембранную систему пурпурных бактерий можно рассматривать как механизм детоксикации молекулярного кислорода, создающий анаэробные условия в клетке за счет функционирования фотооксидазной реакции. Причем если субстратом окисления фотооксвдазной реакции является сукцинат, то энергетическая эффективность работы фотоиндуцированного нециклического переноса электронов, согласно схеме на рис. 2, в расчете на один электрон, поступивший от реакционного центра на кислород, будет выражаться показателем Н+/е~ = 2. Такой показатель энергетической эффективности имеет и циклическая цепь фотоиндуцированного переноса электронов, функционирующая в анаэробных условиях.

ФОТООКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КАК КЛЕТОЧНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕТОКСИКАДИИ МОЛЕКУЛЯРНОГО КИСЛОРОДА

Продуктом фотооксвдазной реакции в хроматофорах пурпурных бактерий, как чувствительной, так и устойчивой к о-фе-нантролину, вероятно, является анион супероксидного радикала Образование Ос? обнаружено при функционировании системы дыхания в митохондриях и бактериальных клетках, в освещенных хроматофорах и комплексах реакционных центров пурпурных бактерий, в водном растворе хлорофилла и феофи-тина, дакубируемых с тритоном Х-100. Показано, что свето-зависимое поглощение кислорода хроматофорами chronatium vinosica подавляется при добавлении супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, что вызвано регенерацией Og из 0£(ЛБв.-ш±, Akazawa , 1S77). Опыты, проведенные нами ( Remennikov, SamuiloT , 1S79), также показали, что данные ферменты снижают скорость фотооксидазноЯ реакции хроматофоров r. rubrum, что указывает на их участие в детоксикации активных форм кислорода.

Показано, что аэрация среды вызывает увеличение содержания каталазы в клетках разных видов пурпурных бактерий, культивируемых на свету, в 2-4 раза (Успенская и др.,1971). При аэрации среды содержание каталазы в клетках Rb.capsulata увеличивается в 10 раз, содержание СОД - в 2 раза (Кулакова, Гоготов, 1S82). Увеличение концентрации каталазы в клетках пурпурных бактерий R.palustris и Е. shaposhuiko-vii коррелирует с их ростом в аэробных условиях. Накопление биомазсы, как и содержание каталазы в 4 раза выше на свету чем в темноте при аэрации среды воздухом (Гусев и др., 1970). Из этого следует, что пурпурные бактерии при аэрации среды растут лучше за счет фотосинтеза, чем в темноте за счет дыхания и, следовательно, надежно защищены от активных форм кислорода, образующихся в результате фотооксвдазной реакции. Увеличение концентрации СОД и каталазы в клетках пурпурных бактерий, инкубируемых аэробно на свету, указывает на защитную функцию этих ферментов, при фотосинтезе.

Этот вывод цдтверлщается исследованиями, проведенными нами: рост R. rubrum возможен в среде с 1 мМ H^Og, добавленной пред посевом культуры. Если учесть, что в клетках R. rubrum на 1 молекулу каталазн приходится до 500 молекул бактериохлорофил-ла, а в изолированных хроматофорах - 50 молекул (Успенская и др., 1S71), то соотношение реакционный центр/каталаза в хроматофорах R. rubrum будет близко к 1:1. У пурпурных бактерий на один реакционный центр приходится 30-50 молекул бактериохлоро-филла (Бойченко, Махнева, 1994). Из этого следует, что хрома-тофорам, обладающим фотооксвдазной активностью, принадлежит ведущая роль в защите клетки от кислорода и его активных форм. Причем действие фотооксвдазной реакции в цитоплаэматической мембране и хроматофорах направлено на фотовосстановление кислорода, находящегося внутри клетки. Супероксвдннй анион-радикал, образующийся в результате функционирования фотооксвдазной реакции, при участии СОД и каталазн преобразуется в воду.

Кроме каталазного механизма детоксикации H¿0g, как показано для пурпурной бактерии Rb. capsulatus, имеется другой механизм - пероксвдазный, с участием цитохром Cg: H^Og-оксидоредук-тазы ( Hanion et al., 1992; Richardson,.Ferguson, 1995): 2 ферроцитохром Cg + H^Dg + 2 феррицитохром Cg + 2 H^D.

В аэробных условиях у исследованных бактерий H^Og конкурирует с ио3~ в качестве терминального акцептора в дыхательной цепи (Richardson, Ferguson , 1995).

Выше отмечалось также возможное участие цитохромов с" и сс' в осуществлении фотооксвдазной реакции. 3 этом случае восстановление 0g, по-ввдимому, ведет сразу к образованию Н^0, минуя стадию H^)g.

Таким образом, фотооксвдазная активность пурпурных бактерий в сочетании 1) с СОД и каталазой, 2) с СОД и пероксвдазой или 3) с цитохромами с' и сс' позволяет снижать концентрацию кислорода в клетках, т.е. выполняет роль внутриклеточного механизма детоксикации молекулярного кислорода и его активных форм. Хроматофоры пурпурных бактерий, как и митохондрии (Ску-лачев, 1994), следует рассматривать в качестве своеобразных биологических топок,сжигающих органическое вещество для снижения концентрации 0? в клетке.

ЗОТООКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ЗЕЛЕНЫХ СЕРОБАКТЕРИЙ

Клетки зеленой серобактерии сЫогоЫит Ит1со1а , инкубируемые с ТМФД и аскорбатом, не поглощают кислород в темноте, что указывает на отсутствие у них д'нхания. Однако при освещении они поглощают 0^. Процесс прекращается в темноте, устойчив к о-фенантролину (рис. 10) и азиду. Аналогичным образом ведут и изолированные мембраны бактерий. Для проявления фото-оксидазной активности мембран аскорбат пригоден как донор

Рис. 10. Фотооксидазная активность клеток с. limicola Среда инкубации: 250 мМ сахароза, 50 мй трис-НС1-буфер (pH 7,6), клетки с содержанием бактериохлорофилла 10 мкМ. Добавки: 5 мМ трис-аскорбат, 0,1 мМ ТМФД, 5 мМ о-фенач-тролин ( о-фен).

В отличие от фотооксцдазной активности е. halophila, которая не зависит от pH среды, скорость фотооксидазной реакции в мембранах с. limicola , как и у R. rubrum , возрастает при изменении pH от 5 до 9. Сходную зависимость имеет индуцируемое убихиноном и аскорбатом темновое поглощение кислорода (рис. И). Это может указывать на то, что фотошдуцированное поглощение 0«, С.limicola , как и r. rubrum , вызвано окислением непротонированыой формы хинона. Устойчивость фотоокси-

5 5 7 8 9

рН

Рис. 11. Зависимость фотооксидазной активности мембран с. 11ш1со1а, и. гиЪгцт и темнового поглощения кислорода, вызванного убихшоном-1 и аскорбатом, от рй среды инкубации-. о-о, фотооксвдазная активность хроматофоров й. гиЪгшп ; #-•, фотооксвдазная активность-мембран с. li.mi.coia ; х-х , поглощение кислорода вызванное убихиноном. Данные для мембран выражены в мкмоль 02, поглощенного за 1 мин на 1 мкмоль бактериохлорофилла. Данные для убихинона выражены в нмолях кислорода, поглощенного 1 мл реакционной смеси за 1 мин с вычетом 02, поглощенного в результате самоокисления аскорбата.

дазной реакции С. иш±со1а к о-фенайтролину, вероятно, обусловлена различиями в строении и составе комплексов фотосинтетических реакционных центров у этой бактерии.

По природе первичного стабильного акцептора электронов реакционные центры фототрофных бактерий мошо разделить на две группы: реакционные центры пурпурных и зеленых несерных бактерий и реакционные центры зеленых серобактерий и гелио-

бактерия ( Ашева , 1968). У зеленых несерннх бактерий, как и у пурпурных бактерий, электроны от бактериохлорофилла а реакционного центра передастся набактериофеофитин и затем на хинон, а у зеленых серобактерий - сначала на бактериохлорофилл с, а затем на железосерный белок ( Атеаг, 1987). Далее электроны у зеленых серобактерий поступает на ферредоксин и от него к НАД, восстановление которого в отличие от такового у пурпурных бактерий вдет путем прямого переноса электронов и не подавляется протокофорным разобщителем ( Ивановский,1975). Анализ фотоактивного комплекса Р840 зеленой серобактерии С. Иш1со1а показал, что в его состав входят три полипептвда. Один из них связан с бактериохлорофкллом и сходен с белком реакционного центра Р700 цианобактерий и хлоропластов. Второй полипептвд идентифицирован как восстанавливаемый аскор-батом цитохром с-550,5, донор электронов для бактериохлоро-

Цитоплазма

НАД Ор 2Г

"I

Цитоплазматическая мембрана

PeS-

i

Бхл с

J

Бхл а-

Фд-

550,5'

->Q.

•QHc

i

~ТГ 2Н

Периплазма

Рис. 12. Схема функционирования фотосинтетической электрон-транспортной системы зеленой серобактерии C.limicola. Бхл а и Бхл с - бактериохлорофилла реакционного центра ; °550 5 " ЦИТ0ХР0М с J ь - два гема цитохрома ь ; Q и QHg -окисленная и восстановленная форма хинона ; Фд - ферредок-сж ; FeS - негемовый Fes-протеин; Jfíg - донор электронов.

филла реакционного центра. Третий полипептвд - Pes-белок. Кроме этого из мембран С. limicola ввделены фракции, включающие цитохром ь-562 (Hurt, Hauska , 1S84) и два вида хи-нонов: менахинон (витамин Kg) и хлоробиум хинон (Prudman , Rappoport , 1S63). Исходя из этих данных, можно предложить

ь

схему (рис. 12), согласно которой роль фотоокседазы С. limicola выполняет хинон. Согласно схеме фотооксвдазная реакция С. limicola представляет собой фотоиндуцированный нециклический перенос электронов от Д^ С аскорбата или сероводорода) , протекающий при участии компонентов реакционного центра, на ферредоксин и хинон и последующим взаимодействием хинона с кислородом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследований, проведенных на интактных клетках несерных пурпурных, пурпурных серных и зеленых серных бактерий, на изолированных хроматофорах, субхроматофорных пигмент-белковых комплексах и модельных пигмент-содержащих системах, выявлено несколько типов фотооксвдазной реакции, изучен их механизм и функции.

Чувствительная к о-фенантролину фотооксвдазная реакция в клетках несерной пурпурной бактерии r. rubrum , протекающая при участии компонентов реакционного центра, может выполнять не только электрогенную и регуляторную, но и защитную от Og функцию. Регуляторная роль фотооксидазной реакции проявляется в обеспечении оптимальных условий функционирования циклической редокс-цепи, которая может функционировать в двух режимах. Не исключено, что на ранних этапах формирования фотосинтетического аппарата циклическая цепь фотоиндуцированного переноса электронов функционировала по сокращенному варианту, не требующего участия цитохрома ь. В цитоплаэматической мембране она находится в тесном взаимодействии с системой дыхания. Эта связь, проявляющаяся в.подавлении светом темнового поглощения кислорода клетками, обусловлена наличием общих редокс-компонентов и образованием разности Н+.

Поскольку скорость фотоиндуцированного поглощения кислорода изолированными хроматофорами снижается при добавлении в среду инкубации супероксвддисмутазы и каталазы, то продуктом фотооксвдазной реакции, вероятно, является анион супероксидного радикала и перекись водорода. Многие ввды пурпурных бактерий, обладающие системой дыхания, при одинаковых концентра-

циях кислорода лучше растут на свету, чем в темноте (1^сев и др., 1570). Следователшо, клетки этих бактерий надежно защищены от токсического действия и Н^О£, образующихся в результате фотооксвдазной реакции. Преобразование этих активных форм кислорода в НцО может осуществляться суперок-сидцисмутазой и каталааой, содержание которых в клетках пурпурных бактерий, инкубируемых на свету, многократно возрастает при аэрации среды (Успенская и др., 1971). Наряду с каталазой, в разложении Н^О^ с образованием Н^О у пурпурных бактерий принимает участие цитохром с,,: Нг/^-пероксидаза (Нап1оп et а1., 1992; Но.сЬагс1зоп, Реггизеп, 1995). Поскольку в качестве терминального компонента, взаимодействующего с 0£, может выступать цитохром с' или ее» ( Самуилов, 1983), то участие этих цитохромов, теряющихся при выделении хрома-тофоров, в фотооксвдазной реакции интактннх клеток может приводить к прямому образованию Н2О, минуя стадию 0£Ти Н^. Мембранную систему пурпурных бактерий,, обладающих фотоокси-дазной активностью, можно рассматривать как единый механизм детоксикации молекулярного кислорода, как биологические топки, сжигающие органическое вещество с целью снижения концентрации 0£ в клетке. Эта вдея была высказана академиком В.П. Скулачевым (1994) применительно к митохондриям.

В клетках пурпурных бактерий," кроме чувствительной к о-фенантролину, обнаружена и устойчивая к данному ингибитору фотоокевдазная реакция. Она проявляется в присутствии аскор-бата и обусловлена непосредственным взаимодействием бактерио-хлорофилла с кислородом. Доступность пигментных молекул для аскорбиновой кислоты позволяет судить, что они расположены на внешней стороне цитоплаэматической мембраны и непосредственно восстанавливают кислород периплазмы.

Устойчивой к о-фенантролину фотооксвдазной активностью обладают и клетки зеленой серобактерии С. 11ш.со1а , инкубируемые с ТМФД и аскорбатом. Реакция протекает при участии компонентов реакционного центра, её устойчивость к о-фенантролину обусловлена различием в структуре фотосинтетических реакционных центров, в состав которых, в отличие от таковых

R. rubrum , входят железо-серные белки. Поскольку окисление мембранного фонда хинонов в результате фотооксидазной реакции подавляет работу циклической редокс-цепи и вызывает снижение эффективности энергообеспечения клетки, которое усугубляется отсутствием системы дыхания и сукцинатдегвдро-геназн, способной восстанавливать мембранный фонд хинонов пурпурных бактерий, то этими причинами, вероятно, определяется облигатно анаэробный образ жизни зеленых серобактерий.

Знание механизмов фотооксвдазной реакции позволяет понять причины анаэробного образа жизни фототрофных бактерий и может быть использовано во многих лабораториях, занимающихся их культивированием.

Молекулярный кислород мог быть движущим фактором эволюции фотосинтетического аппарата как преобразователя световой энергии, а одним из этапов эволюции могло быть формирование механизмов фотооксидазной реакции. Это закладывает основу для нового подхода в изучении фотосинтеза.

ВЫВОДЫ

1. Клетки и изолированные мембраны пурпурных и зеленых фототрофных бактерий, инкубируемые с донорами электронов, роль которых могут выполнять искусственные и естественные субстраты, при освещении поглощают кислород, т.е. обладают фотооксидазной активностью. У разных бактерий компоненты, реагирующие с Og, как показали данные ингибиторного анализа и pH-зависимости реакции, имеют различную природу.

2. Фотооксидазная реакция несерной пурпурной бактерии R. rubrum подавляется при блокировании переноса электронов мевду первичным и вторичным хинонными акцепторами электронов, при экстракции хинонов иа хроматофоров и восстанавливается вновь при последующей реконструкции экстрагированных хроматофоров хинонами. Фотооксвдазной активность обладают и комплексы фотосинтетических реакционных центров Р870, выделенные из хроматофоров. Все это указывает на то, что компонентом, реагирующим с Og в хроматофорах, является лабильно связанный убихинон, наиболее вероятно, вторичный в форме семихинона QgT.

3. Поскольку скорость фотооксадазной реакции в хрома-тофорах R. rubrum снижается при добавлен супероксиддис-мутазы и каталазы, то продуктом этой реакции может быть супероксидный анион-радикал, возникающий в результате взаимодействия QßTc 0? и преобразующийся при участии этих ферментов в воду. Однако в р^нтактных клетках бактерий компонентом, взаимодействующим с Qg"1 может быть не Og, а цитох-ром с' или се', которые теряются при выделении хроматофо-ров. Эти цитохромы могут быть окислены кислородом с образованием Н^О. Из этого следует, что фотооксидазная реакция выполняет защитную функцию, а мембраны пурпурных бактерий являются биологическими топками, сжигающими органическое вещество для снижения концентрации кислорода в клетке.

4. При обработке хроматофоров R. rubrum детергентами, как показывают данные pH-зависимости, с кислородом реагируют фотовосстановленные компоненты электрон-транспортной цепи, предшествующие Qg"7. С использованием модельных систем установлено, что с Og взаимодействуют: хлорофилл а, бакте-риохлорофилл а и их безмагниевые производные, встроенные в мицеллы детергентов или лецитиновые липосомы. Фотооксидаз-ной активностью обладают также липосомы,- содержащие кароти-ноиды пурпурных бактерий.

5. Окисление компонентов фотосинтетической электрон-транспортной цепи кислородом приводит к подавлению её электрогенной функции, которое снимается при добавлении субстратов окисления. Чрезмерное восстановление компонентов электрон-транспортной цепи толе вызывает ингибирование её электрогенной функции, которое снимается кислородом и другими акцепторами электронов. Следовательно 0^ и фотоокси-дазная реакция оказывает регулирующее влияние на редокс-состояние компонентов циклической цепи фотоиндуцированного переноса электронов.

6. В опытах с клетками и изолированными хроматофорами пурпурных бактерий с применением ингибиторного анализа показано, что электрогенная светоэависимая циклическая редокс-цепь этих бактерий функционирует в двух режимах: как цепь с полным набором редокс-компонентов и как сокращенная цепь,

функционирующая без участия цитохрома ь. Она находится в тесном взаимодействии с системой дыхания, что проявляется в наличии не только общих редокс-компонентов (мембранный

фОНД ХИНОНОВ, ЬСj-ЦИТОХрОМННЙ КОМПЛеКС, ЦИТОХрОМ Cg), но и

в образовании трансмембранной разности электрохимических потенциалов Н+ - общего продукта функционирования этих двух систем.

7. В клетках пурпурной серобактерии E.halophila и зеленой серобактерии С. limicola , инкубируемых с тетраме-тил-п-фенилендиамином и аскорбатом в качестве субстратов окисления, цитохромоксцдазная активность не обнаруживается, что свидетельствует об отсутствии системы дыхания у этих облигатно анаэробных бактерий и особой роли у них фотоокси-дазной реакции.

8. Таким образом, клетки фототрофных бактерий обладают фотоокскдазной активностью, выполняющей роль клеточного механизма детоксикации молекулярного кислорода, который мог быть движущим фактором эволюции фотосинтетического аппарата как преобразователя световой энергии. Важным этапом эволюции представляется формирование механизмов фотооксидазной реакции.

Материалы диссертации изложены в следующих работах

1. Ременников В.Г., Самуилов В.Д. 1S77. Фотоиндуциро-ванное поглощение кислорода хроматофорами и субхроматофор-ннми пигмент-белковыми комплексами Rho do spirillum rubrum. Биохимия. 42, 1997-2004.

2. Ременников В.Г., Самуилов В.Д. 1979. Нециклический перенос электронов и генерация мембранного потенциала в xpoMa^opaxRhodospirillum rubrum. Биол. науки 5, 45-52.

3. Ременников В.Г., Самуилов В.Д. 1979. Генерация мембранного потенциала при функционировании полной и сокращенной систем циклического переноса электронов в хрома-^opaxRhodospiiillum rubrum. Биол. науки Ю, 24-29.

4. Самуилов В.Д., Ременников В.Г. 1979. Циклический перенос электронов и генерация мембранного потенциала в

бактериальных хроматофорах. Всесоюзный семинар "Использование солнечной энергии и возможности фотосинтеза" тезисы доклада, 16. Пущино.

5. Кондрашин A.A., Реиенников В.Г., Самуилов В.Д., Скулачев В.П. 1979. Реконструкция электрогенной функции изолированной мембранной пирофосфатаэыйюаозр1г111ит rubrum. Биохимия 44, 2114-2117.

6. Ременников В.Г., Самуилов В.Д. 1980. Циклический перенос электронов и образование мембранного потенциала в хроматофорах несерной пурпурной бактерии Rhodospirillum ¿rubrum. Биохимия 45, 1298-1304.

7. Ременников В.Г., Самуилов В.Д. 1980. Взаимодействие компонентов фотосинтетической цепи переноса электронов Hfaodospirillum rubrum с кислородом. ДАН СССР 252, 491-4S4.

8. Ременников В.Г., Самуилов В.Д. 1981. Фотоиндуциро-ванное поглощение кислорода изолированными хроматофорами и интактными клетками фототрофных бактерий. Вестник МГУ, сер. 16 биология, 1, 36-42.

9. Ременников В.Г. 1983. Исследование фотооксвдазяой активности с применением детергентов. 3 межвузовская конференция молодых ученых, тезисы доклада, 107. Пермь.

10. Ременников З.Г. 1985. Исследование электронтранс-портной системы несерной пурпурной бактерии Rhodospirillum rubrum ; цитохром с^-оксидазное звено дыхательной цепи переноса электронов. В сб. "Биологические основы регуляции роста и'развития растений", 86-Я), Пермь.

11. Ременников В.Г. 1985. Исследование фотооксадазной активности изолированных пигментов в водном растворе детергента тритона Х-100.IV. Всесоюзная конференция по биологии клетки, тезисы доклада, 626-627, Тбилиси.

12. Барский Е.Л., Камилова Ф.Д., Ременников В.Г., Самуилов В.Д. 1986. Ингибирующее действие азвда на фотовосстановление кислорода хлорофиллом а в мицеллах тритона Х-100. Биофизика 31, 789-792.

13. Малолеткова H.A., Пугач Т.М., Ременников В.Г. 1987. Влияние азвда на поглощение кислорода модельными системами и клетками пурпурных бактерий. Деп. в ВИНИТИ 7881-В87.

14. Ременников В.Г. 1989. Определение концентрации пигментов по скорости фотоиндуцированного поглощения кислорода. Физиология и биохимия фотосинтеза: лабораторные работы и методические указания к ним, 10-16, Пермь.

15. Ременников В.Г. 1989. Влияние w.N'-дициклогексил-карбодиимада на поглощение кислорода клетками пурпурных бактерия. Деп. в ВИНИТИ 7227-В89.

16. Ременников В.Г. 1S89. Влияние азида и и.Ы'-дицикло-гексилкарбодиимида на поглощение кислорода клетками пурпурных бактерий. Всесоюзная конференция "Регуляция микробного метаболизма" тезисы доклада, 137-138, Пущдао.

17. Ерицян Г.Р., Ременников В.Г. 1990. Изучение механизмов осморегуляции галофильной пурпурной бактерии Ectothiorhodospira halophila. Деп. в ВИШИ 736-В90.

18. Ерицян Г .Р., Ременников В. Г. 1991. Влияние состава среды на рост фототрофной бактерии Ectothiorhodospira halophila . В сб. "Некоторые вопросы адаптации растений к экстремальным факторам", 11-17, Пермь.

19. Ерицян Г .Р., Ременников В.Г. 1991. Влияние-пролин а и глутамата на рост галофильной фототрофной бактерии Ecto-thiorhodospira halophila.Микробиология 60, 757-758.

30. Малахова E.H., Ременников З.Г. 1SS2. Участие бактериальных каротиноидов в фотовосстановлении кислорода. Деп. в ВШИТИ 2105-В92.

21. Малахова E.H., Ременников В.Г. 1993. Фотоиндуциро-ванное поглощение кислорода липосомами, содержащими кароти-ноиды пурпурной бактерии Ectothiorhodospira halophila. Биохимия 58, 7, 1024-1026.

22. Баринова Г.А., Ременников В.Г.. Сазонова Н.Г. 1993.. Влияние аминокислот на рост галофильной пурпурной бактерии Ectothiorhodospira halophila.В сб. "Вопросы адаптации растений к неблагоприятным факторам среды", 6-12, Пермь.

23. Ременников В.Г., Слищенко Л.С. 1995. Ингибиторный анализ фотооксидазной реакции серной пурпурной бактерии Ectothiorhodospira halophila.Вестник ПГУ, сер. биология 1, 70-81.

24. Ременников В.Г. 1995. Фотооксвдазная активность и её роль в бактериальном фотосинтезе. Меядународняя конференция "Экология и охрана окружающей среды", тезисы доклада, 107108, Пермь.

25. Ременников В.Г., Старкова Е.А., Ткаченко А.Г., Чудинов А.А., Чурилова Н.С. 1S95. Влияние условий культивирования на рост, содержание полиаминов и ультраструктуру Ectothiorhodospira holophila. Микробиология,64, 5, 587-591.

35. Ременников В.Г., Самуилов В.Д. 1996. Светозависимое поглощение кислорода фототрофными бактериями и его роль в детоксикации кислорода. Международная конференция "Биоэнергетика фотосинтеза", тезисы доклада, 17, Пущино.

27. Ременников В.Г. 1997. Роль кислорода и фотооксидаз-ной реакции в эволюции фотосдатетического аппарата. Вестник ПГУ, сер. биология 2.

28. Samuilov V.D., Remennikov V.G. 1977. Photooxidase acti-" vity of Rhodospirillum rubrum. chromatophores. 4th Internat. Congr. on Photosynthesis. Abstracts, p.324. Reading U.K.

29 . Remennikov V.G., Samuilov V.D. 1979. Photooxidase activity of isolated chromatophores and intact cells of phototro-phic bacteria. Arch. Microbiol. 123, 65-71.

3or. Remennikov V.G., Samuilov V.D. 1979. Photooxidase activity of Rhodospirillum rubrum chromatophores and reaction: center complexes. The role of non-cyclic electron: transfer in generation of the membrane potential. Biochim. Biophys. Acta 546, 220-235.

31. Remennikov V.G., Samuilov V.D. 1979. Two regiment of electrogenic cyclic redox chain, operation in chromatophores of noa-sulfur purple bacteria. A study using antimycin A. Biochim."Biophys. Acta 548, 216-223.

32. Remennikov V.G., Samuilov V.D. 1980. Electrogenic cyclic redox chain in bacterial photosynthesis: to regimes of operation in intact cells of Rhodospirillum rubrum. Arch. Microbiol 125, 271-275i

33. Kondrashin A.A., Remennikov V.G., Samuflov V.D., Skula-chev V.P. 1980. Reconsti tution of biological molecular'generators of electric current. Inorganic pyrophosphatase. Eur. J. Blochen. 113, 219-222.

3*. Pototsky H.Ya., Remennikov V.G., Kotova B.A Sflm,-n J.B I». The inhibition of photo syndetic ele!^ I* Rhodospirillum rubrum by ff.N'-dicyclohcxylcarbodiimide J ochim Biophys. Acta 634, 2.66-270.

-ft. Remennikov V.G. 1995. Photooxidase activity of purple bacteria. Internat. Conf. oa envlromental Pollution and Neuroimmuno interaction; and Enviroment. Abstracts,?. 50. St. Peterburg.

Сдано в печать 22.01.97г.Формат 60x84/16. Объем 2,5п.л.Тираж ЮОэкэ.Зака» 1092. Рогапркмт ПГТУ.