Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экофизиология цианобактерий MICROCOLEUS CHTHONOPLASTES в экстремальных условиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экофизиология цианобактерий MICROCOLEUS CHTHONOPLASTES в экстремальных условиях"

" 9 ю я?

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

I

ДУБИНИН Алексея Викторович УЖ 579.22.04..574.23.

ЭКОФИЗИОЛОГИЯ ЩАНОБАКТЕРИИ М1СН0С01Еи5 СНТНОНОРЬАБТЕЗ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

Специальность 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученоя степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук М,В.Гусев

Официальные о-ппоненты: доктор■ биологических наук В.М.Горленко

кандидат биологических наук Л.А.Минеева

Ведущая организация: Институт физиологии растений РАН.

Защита диссертации состоится " ¿ЗеЯР^Ь' 1 яя? г. в /А часов на заседании специализированного совета Д.002.64.01. в Институте микробиологии РАН по адресу:' 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, кор.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан ¿¿¡¿ы^-? 19Я? г.

Ученый секретарь специали-^^,^^^, зированного совета, к.б.н. Л.Е.Никитин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Цианобактерии являются важными объектами изучения фотосинтеза и его эволюции, азотфиксации, метаболизма углерода, серы, а также при решении других проблем общвбио-логического и прикладного характера.

Цианобактерия ШсгосоЛеиэ сМЬопор1аа1ез - космополит водных экосистем с умеренной и экстремальной соленостью. Ее массовое развитие отмечено в составе бентосных микробиальных сообоэств -цианобактериальных матов. Такие сообщества являются современными аналогами цианобактериальных сообществ протерозоя, давгах начало строматолитам. В некоторых стооматолитах обнаруживаются микрофоссилии осциллаториевых водорослей, к которым относится М1сгосо1еиз. Изучение реликтовых микробных сообозств, где отсутствуют эукариоты, дает возможность судить по аналогии о процессах геологического прошлого.

Исследование- альгобактериальных матов предполагает прежде всего детальную хактеристику их основных компонентов - первичных продуцентов, в роли которых чаще всего выступают различные виды нитчатых цианобактерия. Среди них М. с№Ьопор1а£Ьев занимает лидирующее место по широте распространения в соленых водоемах морского происхождения.

Это обусловливает важность экофизиологического изучения М. сЫЬопор1&згез, однако его экология и метаболизм были исследованы недостаточно.

Цель-И задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение экофизиологии М. сМ:йошр1а^ез в составе цианобактериальных матов гипергалинного водоема.

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

1. Изучение физико-химических параметров местообитания и структуры сообщества.

2. Определение продуктивности M. chthonoplastes в природе.

3. Выделение чистой культуры М. chthonoplastes.

4. Изучение механизма галоадаптации М. chthonoplastes.

5. Исследование ростовых и биосинтетических процессов, особенностей светового и темнового метаболизма, азотфиксации вс взаимодействии с биотическими и абиотическими факторами экосистемы.

Научная новизна и практическая значимость. В работе впервы« дана обобщенная картина зкофизиологии М. chthonoplastes в составе экстремально галофильного микробного сообщества с указание» ключевых моментов метаболизма. Впервые изучен механизм галоадаптации М. chthonoplastes. процесс фотопродукции перекис» водорода, обнаружена способность к осуществлению серногс дыхания.

Результаты изучения приспособительных физиологических механизмов U. ththonoplastes как обитателя гипергалинного биотопа с повышенной продукцией сероводорода представляют интерес для реше'ни* обшебиологическоя проблемы существования организмов в экстремальны* условиях*.

Данные о продуктивности М. chthonoplastes в естественны* условиях и об участии в циклах основных биогенных элементов, в частности, в цикле серы, важны с точки зрения экологии для оценки влияния на современное состояние водоемов, атмосферы и первичные этапы почвообразования в засоленных биотопах.

Апробация работы Материалы диссертации"доложены на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ и на совместном заседании лабораторий микробных сообществ, экологии и герхимической деятельности микроорганизмов и

регуляции микробного метаболизма Института микробиологии РАН, 1991 г.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, 2 статьи сданы в печать.

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на Мб страницах машинописного текста, включая в таблиц и 27 рисунков. Список литературы содержит 27 отечественных и 116 иностранных наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы полевых исследования Объектом изучения служили цианобактериальные маты гиперсоленых лагун оз.Сиваш. Освещенность определяли при помощи люксметра; температуру воды - ртутным термометром; кислотность среды - на полевом кондуктометре ОК-ЮЗ (Венгрия); общую минерализацию воды - по степени ее оптического преломления на полевом рефрактометре (ГДР). Концентрацию кислорода в воде определяли методом Винклера (Резников и др., 1970). Концентрацию сероводорода определяли колориметически (Тгирег, Shlegel, 1964). Сумму форм углекислоты определяли титрованием 0,01 N HCl (Резников и др., 1970).

Морфологию мата изучали на срезах при помощи светового

*

микроскопа, а также в фиксированных образцах в лаборатории с использованием трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии.

Продуктивность целого мата и отдельных его слоев определяли по 14

сти фиксации С02 и выделения 02 в модельных опытах. Методы лабораторных исследований. Альгологически чистую

культуру М. сhthonoplastes выращивали на среде следующего состава (г/л): NaCl-23.2, MgS04 7^0-3.04, MgClj 6^0-2.1, КС1-0.4,. СаС12-4.5, HaNOj-0.75, KBr-0.03, К2НР04"0.02, NaHC03-0.02, Na-цитрат-0.005, Fe-HH4 -цитрат-0.005, Ne^ ЭДТА-0.0005, комплекс витаминов Aj+Co (Rlppka et al., 1979). Процентное соотношение элементов в среде соответствует составу воды лагун о.Сиваш. Соленость среды в пределах 1-30* меняли, пропорционально увеличивая содержание всех макроэлементов. После стерилизации устанавливали pH 7.6. Культивирование осуществляли при t 27°С, освещенности 2000 лк (7500 эрг/cv^ceK) с перемешиванием на магнитной мешалке и продуванием воздушно-углекислотной смесью (2* С02) со скоростью 2 л/мин.•

Для выделения чистой культуры М. chthonoplastes использовали среду вышеприведенного состава с добавлением комплекса витаминов, 0.3* агара и одного из следующих соединений в концентрацияхс Na2S 9Н20-0.5 пМ, NajSgOj-l г/л, Na пируват - 0.5 г/л. Na сукцинат - 0*5 г/л, пептон - 5 г/л,а также среду без добавок. Под бинокулярной лупой изолировали отдельные нити' М. chthonoplastes, отмывали несколько раз в свежей среде и переносили в пробирки с полужидкой средой. Засеянные пробирки инкубировали при температуре • 25°С, освещенности 500 1х в течение 40 суток. Пробы из появившихся зон роста проверяли на чистоту- микроскопированием' и высевом на стандартные бактериологические среды (Stein, 1975).

МорфолоГию клеток бактерий и М. chthonopiastes изучали в световом микроскопе NU-2 (ГДР) с иммерсионной системой и фазовым контрастом. Подвижность нитей М. chthonopiastes оценивали при помощи окуляр-микрометра.

Хлорофилл экстрагировали из клеток метанолом при 4°С 10 мин. Концентрацию рассчитывали с использовании коэффициента экстинкЦи!/

для хлорофилла а при 665 ни 71.9 г-1см-1 л (de Wit, Van Gemerden, 1987).

Общее содержание углеводов в биомассе определяли фенольным методом, содержание белка - с помощью реактива 'Фолина после солюбилизации клеточной суспенции при 90°С в 1Н NaOH в течение 10 мин (Герхардт и др., 1984).

-2 о -2

Раздельное определение различных форм серы (S , S , S203 ,

-2

SOj ) в клеточной суспензии проводили с ' помощью подометрического титрования по стандартной методике (Резников и др., 1970).

Концентацию H2Û2 в среде определяли хемолюминесцентным методом (Cormier, Prlchard, 1966).

/

Каталаэную активность определяли несколькими методами: спектрофотометрически (Акулова, Смолов, 1974), полярографически по скорости образования кислорода при разложении - Н202> хемолюминесцентным методом по убыванию концентрации перекиси в растворе в присутствии целых клеток или клеточных экстрактов, а также качественно по образованию пузырьков кислорода при нанесении 3% на поверхность бактериальных колония или на пучки нитей

И. chthonoplastes.

Супероксиддисмутаэную (СОД) активность определяли в экстрактах ■слеток фотохимическим методом по реакции восстановления гетранитросинего тетразолия (Beyer, Frldovlch, 1987).

Нитрогенаэную активность определяли ацетиленовым методом Stewart et al., 1967).

Летучие продукты метаболизма, ацетилен, водород, а также iaKTdT после дериватизации пробы йодной кислотой (Teunlssen et al., 989) определяли методом газо-жидкостной хроматографии на ;роматографе Chrom-5 (ЧССР).

Качественное определение органических осмолитов проводили на

- б -

хромато-масс-спектрометре НР-59В5В с квадрупольным анализаторе» (Хыолетт-Паккард, США).

Количественное определение содержания гликоэилглицерина I экстрактах определяли по Эрдману (ЕШтапп, 1983).

Скорость выделения и поглощения кислорода клетками М

сМЬопор^геэ определяли полярографически.

14

Скорость фиксации СО^ определяли общепринятым методом Радиоактивность углерода определяли на сцинциЛляционном счетчию "НаскЬега-12197п 1ЛКБ, Швеция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Природное сообщество М. сШюпор1&51еБ из гипергалинного водоема

Экологические условия местообитания. Лагуны Арабатскоя Стрелк представляют собой неглубокие (до 30 см) водоемы, которые тянутс вдоль восточного берега Сиваша и отгорожены от него невысоко пересыпью, сложенной ракушняком.

Основными характерными особенностми данного местообитани являются высокая {10-21Ж) и меняющаяся в широких пределах (1-30) солености* воды, а также резкие суточные колебания концентрац» кислорода и сероводорода, в воде лагун, которые определяютс физиологической активностью микробного сообщества. Днем сероводорс в воде как правило отсутствует. Концентрация кислорода составляв 3-5 мг/л, однако, при активном фотосинтезе может наступа* пересыщение по кислороду. В вечернее и утренние часы концентрат сероводорода и кислорода составляют Соответственно - 15-30 мг/л 0-0,5 мг/л. Ночью за счет высокого содержания сероводорода лагунах создаются строго анаэробные условия.

Таким образом, высокая и меняющаяся в широких предел

соленость, крайне нестабильный окислительно-восстановительный режим обусловливают экстремальный характер условий данного местообитания, что сильно ограничивает видовой состав . микрофлоры. В лагунах развивается высоко специализированное микробное сообщество цианобактериальный мат.

Структура сообщества. Галофильный цианобактериальный мат представляет собой плотное структурное образование толщиной до 1 см_ с ясно различимыми по цвету слоями, окраска которых определяется либо цветом пигментов микроорганизмов, либо образуемыми минералами. В целом для различных образцов мата характерно наличие нескольких основных зон, имеющих определенный набор микроорганизмов с присушим им метаболизмом. Первая зона, имеющая зеленую окраску, - зона оксигенного фотосинтеза с цианобактериями; вторая - желтая -слизистый слой с флексибактериями; третья - розовая - зона аноксигенного фотосинтеза с пурпурными бактериями; четвертая -черная - зона анаэробной деструкции с сульфидогёнами и метаногенами.

Изучение морфологической структуры бентосного микробного сообщества лагун показывает, что М. с11Нюпор1аз1ез является доминирующим по - биомассе и основным формообразующим его компонентом, ответственным эа структуру мата.

Продукция органического вещества в сообществе. Цианобактериальный мат характеризуется высоким содержанием хлорофилла а на единицу поверхности. По нашим данным его концентрация в среднем для различных • участков мата составляет 600-900 мг/м2, но может достигать 1500 мг/к? , что сравнимо с плотностью хлорофилла в листовой пластине.

На свету мат активно выделяет, а в темноте поглотает кислород.

- в -

Расчет продуктивности мата по скорости выделения С^ дает значение 287 мг С/»? час, или 0,47 иг С/нг хл а час. Полученная величина продуктивности мата сравнима с таковой для фитопланктона гиперевтрофных водоемов юга (Wetzel, 1975).

1 4

Непосредственно в мате была изучена динамика фиксации СО, в

длительном эксперименте. Продуктивность, рассчитанная по скорости

накопления метки в биомассе, составляет 242 мг С/м2час (0,39 мг С/

мг хл а час), то есть сопоставима с величиной, определенной по

скорости выделения кислорода.

Б табл.1 приведены результаты сравнительного изучения 14

величины фиксации С02 целым матом и цианобактериальным слоем на свету и в темноте.

1 4

Таблица 1. Фиксация С в мате на свету и в темноте.

условия фиксация ИС, dpm

цианобактерии, свет 10223 1 452

мат, свет 11615 - 380

цианстбактерии, темнота 2105 ¿ 230

мат, темнота ЗОЮ 1 287

контроль (мат+формалин) 1725 i 112

Видно, что фиксация СО, целым матом и отделенным цианобактериальным слоем дает практически одинаковые результаты в пределах сшибки измерения. Темновая фиксация углекислоты в мате за счет, хемосинтеза и гетеротрофной ас.симилляции практически не превышает контроля. Полученные результаты указывают' на то, что основным продукционным процессом в сообществе является цианобактериальныя

фотосинтез.

Таким образом, сообщество является высокопродуктивной системой. Это коррелирует с высоким содержанием в нем хлорофилла а. Основным продуцентом является М1сгосо1еиг chttюnoplastes.

2. Рост М.сМЪопор1а51е5 в лабораторной культуре

I

Выделение чистой культуры И. сЫ:?юпор1е^еб. Путем варьирования условий и подбора сред нами из отдельных нитей было получено 5 штаммов М. сГгёйопорДг^ез. Однако, полученные культуры оказались Нестабильны. На определенном этапе нити Ы. сМЬопор1аз1ез теряли подвизвдость, рост прекращался, уменьшалось содержание хлорофилла. Это сопровождалось морфологическим изменением нитей в виде вздутий отдельных клеток, затем деформацией клеток по всей длине нити и распадом ее на отдельные нежизнеспособные фрагменты. В то же время, культуры, имевшие бактериальных спутников, в тех же условиях были стабильны, сохраняли характерную корфологию и устойчивый рост.

Было сделано предположение о том, что причина наблюдаемого явления заключается в автоингибировании чистых культур продуктами неполного восстановления кислорода, которые в смешанных культурах удаляются из- среды с помощью каталаэ бактериальных спутников. Предпосылками для этого служит целый ряд фактов, в том числе отсутствие у М. сЫ1юпор1&з1ез каталазной активности, высокая чувствительность этой цианобактерии к повышенной концентрации кислорода в среде, а также наличие высокой каталазной активности у сопутствующих бактерий. *

Для проверки высказанной гипотезы нами была изучена способность М. cflthonop^astes к продукции перекиси водорода.

Фотопродукция перекиси водорода. На рис.1 приведены результаты измерения концентрации Н202 в культуре И. сй^опор1аз1еэ.

Н202, мкмоль мг-1хл.а

время, сек

Как видно из рисунка, образование перекиси начинается при включении света, идет со скоростью 13 мкмоль В,й,/мг хл а-час и• прекращается в темноте.

В табл.2 суммированы результаты опытов по влиянию различных условия на продукцию перекиси водорода клетками. \

Таблица 2. Влияние различных условий на продукцию Н202 в суспензии М. с1)1йопор1аз1ез.

условия продукция Н202, (-Х)

свет 100

темнота 0

свет, БСМи 5 мкМ 27

свет, ИСМи 20 мкМ 6

свет, аргон. 5 мин 9

свет, аргон 10 мин 4

свет, метилвиологен 50 мкМ 802

свет, С02, 5* 21

Анализ полученных результатов позволяет предположить, чтс

образование перекиси осуществляется согласно следующей схеме:

, Фд-НЛД* • +

РцП * 0а|0ь- Пх "> Пц * РШ * РеЗ - «д - редуктаза* НАД»

' ▼ 4 А

Н2° °2 I КВ 02

осии I

СОД

°2 |Н2^2

В этом случае электроны с ферредоксина поступают непосредственно на кислород с образованием супероксидного радикала. Конечным стабильным продуктом такой реакции является Н2<32. образующаяся в результате ферментативной дисмутации супероксидного радикала.

Относительно высокая СОД-активность М. сМЬопор!аз(ез, составляющая 12-21 ед/мг белка, служит еще одним косвенным свидетельством в пользу предложенного механизма образования в результате дисмутации 02 с участием СОД.

Из соотношения скоростей фотосинтетического образования кислорода и продукции перекиси следует, что на ее образование может идти до 40* от общего потока электронов.

Таким образом, высокая скорость продукции перекиси М. сМ/юпор1а51ез вследствие отсутствия у данного организма каталазы аолжна вызывать автоингибирование культуры. Однако, важно отметить, что в. естественной среде обитания накопление значительных <оличеств Н^О^ в микроокружении клеток И. сМ/х>пор1аз1е5 1евозможно по крайней мере по двум причинам: во-первых, в природе шнная цианобактерия существует в тесном сообшгстве с другими [икроорганиэмами, обладающими высокой каталазной активностью, и роблема детоксикации перекиси в этом случае решаются не на уровне

клетки, а на уровне сообщества. Во-вторых, постоянное поступление Н23 из нижних слоев мата способствует созданию в среде анаэробных условия, в которых практически полностью ингибируется образование перекиси.

Ввиду отсутствия стабильного роста чистой культуры М. сйЬЬопор1азЬев дальнейшие исследования проводили с использованием альгологичес.ки чистой культуры М. cht.^юnop2astes с предварительным удалением бактериальных спутников путем тщательной отмывки клеточной суспензии на мембранных фильтрах. Полноту удаления бактерий контролировали с использованием световой и электронной сканирующей микроскопии.

3. Влияние Физико-химических параметров среды на физиологию М.сЪг1юпор1азгез

Влияние_температуры. Температурный оптимум М. сЬЫопор1азЬез

ярко выражен и составляет 30°С.

6.2,_Влияние_рН. Максимальная фотосинтетическая активность

М. сМ1юпор1аз1ез зафиксирована при рН 7.5, однако в довольно

широком интервале значений рН - 7.0-8.5 она поддерживается

практически на оптимальном уровне. Это позволяет данному организму

осуществлять активный фотосинтез практически на протяжении всего

светового дня, несмотря на то, что рН среды при этом меняется

довольно существенно - от 6.9 до 9.0.

Влияние освещенности Фотосинтез М. сЬПюпорХазЬез практически

достигает насыщения при сравнительно низкой освещенности - около 2

15000 эрг/см сек. Это хорошо согласуется с литературными данными о том, что оптимальная освещенность для большинства иианобактерий

л

находится в пределах 2000-20.000 эрг/см'сек (Б1а1 et а1., 1985), что составляет 1-10* от интенсивности дневного света.

Влияние солености Фотохимическая активность М1сгосо1еия в

сильной степени зависит от в'еличины солености среды (рис.2).

-1 -1 С , мг мг хл.а час

соленость, %

1 4

Максимальное значение СС^-фиксации отмечено при 15% солености. При дальнейшем увеличении солености интенсивность фотосинтеза резко падает, хотя включение метки в биомассу прослеживается и при 26% солености.

Била изучена зависимость относительных скоростей прироста основных химических компонентов клеток М. chthonoplastes от •солености среды. Максимальный уровень прироста биомассы, белка и хлорофилла находится в области 5% солености, а'углеводы наиболее активно синтезируются при 9%. Выше 15% относительные прирост всех определяемых компонентов практически прекращается. Эти данные хорошо согласуются с наблюдаемым в природных условиях активным ростом М. сМЬопор1авгеБ при рассолении лагун весной или в период дождей летом. При увеличении осмотической силы среды переключение

- и -

метаболизма преимущественно ■ на синтез углеводов объясняется необходимостью накопления осмопротектора углеводной природы. Таким образом, соленость среды является фактором, регулирующим не только общий уровень метаболической активности, но и характер биосинтетических процессов данного организма.

Механизм галоадаптаиии Поиски органических осмолитов совместно с В.В.Кевбриным и Г.А.Осиповны в экстракте из клеток М. сМПопор^азЬез методом масс-спектрометрии показали, что эта цианобактерия в осмотически значимых количествах накапливает исключительно 2-0-а-Р-глюкопиранозилглицерин (гликоэилглицерин). Другие гликозиды или сахара, а также глицинбетаин, известные для других цианобактерия как осмолиты, не обнаружены. Нарастание содержания гетероэида с увеличением солености имеет отчетливый линейный характер что служит доказательством его роли как осмопротектора.

На рис.3 представлены результаты вычисления молярной концентрации гликозилглицерина в биомассе М. сЬНюпор1аз1ез в зависимости от солености среды.

гликоэилглицерин, М

0 5 10 15 20 25 соленость, *

Накопление гетерозида происходит прямо пропорционально увеличении солености среды до 14Х, а в области более высоких значений практически не меняется.

Таким образом, М. сМ1юпор1азЬе8 имеет развитый механизм гало-адаптации, что позволяет этому виду занимать доминирующее положение в экосистемах с экстремально высокой и переменной соленостью.

4. Анаэробный метаболизм М. сМ:Ьопор1ая1е5

Аноксигенный Фотосинтез На рис.4 представлена временная зависимость изменения концентрации сульфида-в клеточной суспензии М. cht^юnopiastes в темноте и на свету в присутствии и в отсутствие в среде БСМи - ингибитора ФС-11.

Ъ'2, шМ

20 30 40 время, час

Рис.4 Изменение концентрации 'сульфида в суспензии М. сМ)юпор1аз-{ев при инкубации в темноте (1), на свету (2) и на свету в присутствии 5 мкМ БСМи в среде.

-2

Как видно из рисунка, М. c^1tí]oдаpIastes способен потреблять Э на свету в присутствии диурона. При этом скорость процесса вдвое ниже, чем без БСМи. Объяснением наблюдаемому различию в скоростях может служить тот факт, что у М. сЬИюпор1а£1е5 активность ФС-11

-О

подавляется в присутствии Б лишь частично, то есть в клетках помимо потребления сульфида с участием только первой фотосистемы.

как в присутствии ВСМи, функционирует фотосинтез с образованием кислорода, который химически окисляет сульфид в среде.

Лаг-период в процессе потребления сульфида в присутствии диурона составляет в разных опытах 4-5 час. В случае предварительной инкубации клеток на свету с сульфидом лаг-период отсутствует. Таким образом, способность организма к окислению сульфида без участия ФС-11 не является конститутивной, а индуцируется сульфидом-с 5-часовым периодом индукции.

Единственным продуктом окисления сульфида М. cl^t^юíюplaзtes в

\

процессе аноксигенного фотосинтеза является тиоеультфат.

Светозависимое окисление сульфида М. сЬЫюпор1аз1ез сопровождается фиксацией С02. Максимальная скорость 14СС^ -фиксации

(0,195 мг СфИК(./мг хл а-час) зарегистрирована в присутствии 1,2 мМ

-2

5 в среде. При этом скорость превышает таковую для оксигенного фотосинтеза при данной солености среды в 1,3 раза. При концентрации сероводорода более 1мМ скорость фиксации резко падает, по-ви-димиму, вследствие токсического действия сульфидного иона на фотосинтез.

При' длительной инкубации М. сЫЬопор1в£1ез на среде с сульфидоц в присутствии диурона было установлено, что в процессе аноксигенного фотосинтеза происходит, увеличение общего содержания углеводов.клеток, однако, синтез белка и хлорофилла не происходит.

Вклад различных типов фотосинтеза (окси- и аноксигенного) в общую продуктивность М. с№}юпор2а^е£ сильно различается в зависимости от условий (рис.5):

Предварительная обработка части материала диуроном позволяет выделить из общей фотосинтетической активности лишь аноксигенную •составлявшую. Из приведенных на диаграмме Данных видно, что в утренние часы (700 час), когда концентрация сульфида в воде над

14С, <1рт 103

50 40 1 30 20 10

Т°°, 5~2 25 мг/л

14,

1200, 02 9 мг/л

Рис.5 Накопление СС^ в биомассе м. сЫЬопорХаяЬез в цианобактериальном мате в природе присутствии и в условиях насыщения по кислороду. А - без добавок; В - 15 мкМ ОСМи; С -убитый контроль.

матом достигает 0,5 мМ, вклад аноксигенного фотосинтеза в общую продуктивность достигает не менее 95*. В дневное время (1 £Р° час) .сульфид в воде над матом не обнаруживается. Доля аноксигенного фотосинтеза в общей продуктивности в это время снижается до нескольких процентов. При этом величины общей продуктивности утром и днем, несмотря на различия условий среды, отличаются незначительно . '

Таким образом, способность к гибкому использованию различных типов светового метаболизма (оксигенного и аноксигенного фотосинтеза) дает возможность М. сМ/топор1а51ез эффективно использовать весь световой день для фотосинтетического преобразования солнечной энергии.

Темновой анаэробный метаболизм При наступлении темноты в результате активной сульфатредукции в нижележащих горизонтах мата в слое цианобактерий создастся анаэробные условия. Это предполагает наличие у Ы. сМЬопор1а£1ез развитых механизмов получения энергии в анаэробных условиях в отсутствие света.

Б процессе темновой анаэробной ' инкубации культуры М. сМ1юпор1аз1ез происходило уменьшение общего содержания углеводов в клетках в среднем со скоростью 230 мкг/мг хл а «час, которое сопровождалось накоплением в среде в различных вариантах опыта продуктов темнового метаболизма клеток - ацетата или сульфида. Рост клеток при этом отсутствовал - содержание в суспензии хлорофилла а и белка оставалось практически неизменным.

Было изучено влияние различных физико-химических условий, в частности, присутствия в среде различных форм серы, на образование продуктов темнового анаэробного метаболизма М. cÍ!tílonop^asíes. Результаты этих опытов представлены в Табл.3. Величины скоростей продукции ацетата и сульфида представляют собой усредненные значения за весь период темновой инкубации.

Таблица 3. Влияние различных условий на образование продуктов темнового метаболизма М. сhthoшplastes.

Условия инкубации, добавки Скорость продукции, мкг/мг хл.-час

ацетат' водород сульфид

воздух аргон аргон, -2 аргон, 3203 аргон, Э0 0 0 0 55,3 2,1 0 51,9 2,0 0 / 49,6 2,3 0 следы 0 117,9-

Видно, что образование сероводорода происходит только в случае

/

внесения в среду элементной серы. Вслучае внесения в среду других серных соединений, а также в вариантах опыта без добавок происходит накопление в среде ацетата. Другие ЛЯС, спирты а также лактат среди продуктов темнового метаболизма обнаружены не были.

Изучение темновой продукции водорода М. сМЬопор1аз1еБ показало, что к ней способны лишь клетки, выращенные на среде без' связанного азота. Интенсивность ^-продукции сравнительно невелика. Внесение в суспензию элементной серы полностью прекращает продукцию водорода.

Таким образом,( полученные результаты показывают, что М. сЫЬопор1аз1ез, помимо широко распространенного среди цианобактерий аэробного темнового дыхания, обладает еще двумя механизмами получения энергии в отсутствие света и кислорода - ацетогенным брожением и серным дыханием. Функционирования данных физиологических механизмов недостаточно, однако, для обеспечения роста, они служат лишь для поддержания клеток в жизнеспособном состоянии в анаэробных условиях в темноте.

Таким образом, наличие у М. сЬЬЬопор1азЬез многообразных анаэробных физиологических механизмов и способность к их гибкому использованию позволяет ему существовать в природе на фоне высоких концентраций сероводорода.

5. АзотФиксация М. с!и1топор1е^ез

На среде без связанного азота наблюдали устойчивый рост суспензионной культуры М. сМ1юпор1а£1ез, который, однако, сопровождался длительным лаг-периодом. Появление нитрогеназной активности клеток зафиксировано через 30 час после их перенесения на безазотистую среду. Удельная скорость роста на среде без

связанного азота была втрое ниже (0,009 час *), чем на среде

Ч'

нитатом.

Световая азотфиксация в культуре М. сЬаюпор1г^геБ сопровождается двукратным понижением активности оксигенного фотосинтеза.

Оптимум солености для нитрогеназной активности составляет 5Х и совпадает с таковым для синтеза белка.

В Табл.4 представлены данные о влиянии света, анаэробиоза и присутствия в среде сульфида на азотфиксацию.

Таблица 4. Нитрогеназная активность М. сМЬопор!аз1ез а эа-

-2

висимости от света, анаэробиоза и концентрации Б т

условия сульфид, мМ* мкмоль С2Н2/МГ хл.-час

свет, аэробные 0 0,70

темнота 0 2,0

свет, анаэробные 0 2,27

свет, анаэробные 0,07 2,59

свет, анаэробные 0,11 2,62

свет, анаэробные 0,57 3,70

свет, анаэробные 0,92 2,23

'средние значения между концентрацией сульфида в начале.и в конце инкубации

Видно, что оптимальными для проявления нитрогеназной активности М. chthonop.las.tes являются световые анаэробные условия в присутствии в среде до 0,6 мМ сульфида.

Таким образом, изучение экологических условий местообитания, структуры и продуктивности природного сообщества, а также физиологии М. chthonoplastes в лабораторной культуре позволяет

сделать вывод о высокой приспособленности этой цианобактерии к существованию в экстремальных условиях, что обусловливает ее доминирующее положение в микробиальном сообществе гиперсоленых лагун Сиваша.

ВЫВОДЫ

1. Microcoleus chthonoplastes является доминирующим продуцентом цианобактериальных матов в гипергалинных лагунах с широко варьирующей соленостью. Продуктивность М. chthonoplastes, измеренная In situ, составляет 0,39-0,47 мг С/мг хл.а час.

2. Оксигенныя фотосинтез М. chthonoplastes имеет оптимум по

выделению 02 при 3(Яс, в пределах рН 7,0-8,5 и солености 10-15*.

2 3

Световое насыщение наступает при освещенности 10 эрг/см сек 10 .

3. Оксигенный фотосинтез сопровождается образованием перекиси водорода со скоростью 13 мкмоль/мг хл а час, которая служит причиной автоингибирования клеток. Организм не имеет каталазы. Активность СОД соствляет 12-21 ед/мг белка. Ингибирование Н2°2 снижается в присутствии спутников с активной каталаэои, HgS, избытка С02, что отражает приспособленность организма к развитию в составе многокомпонентного сообщества. При окси'генном фотосинтезе до 40* от общего потока электронов идет на образование Н2О2. В связи с этим выделенные чистые культуры М. chthonoplastes нестабильны.

4. В присутствии R,S М. chthonoplastes способен к

-2

аноксигенному фотосинтезу с образованием и' ассимиля1*ией

1 4

С02. При этом образуются углеводы, но синтез белка не происходит.

1 4

Аноксигенная ассимиляция С02 в природе по мощности сопоставима с оксигенной.

5. В анаэробных условиях в темноте запасные углеводы в ходе

брожения используются с образованием 2,5 моля ацетата на моль метаболизированноя глюкозы. В присутствии элементной серы, но не других серных соединений, осуществляется серное дыхание с образованием H2S.

6. Адаптация к. высокой солености M. chthonoplastes

обеспечивается за счет накопления в клетках в качестве «

осмопротектора гликозилглицерина. Соленость среды регулирует не только общий уровень метаболической активности M. chthonoplastes, но и характер биосинтетических процессов: синтез белка и хлорофилла имеет оптимум при 3-5* солености, углеводов - при 10*. При солености выше 15* метаболическая активность резко снижается и наступает стадия переживания.

7. Нитрогеназная активность М. chthonoplastes составляет 1-3,7 мкмоль Cg^/ur хл а • час. Установлена корреляция процессов аноксигенного фотосинтеза и азотфиксации.

6. Экофизиология М. chthonoplastes характеризуется высокой приспособляемостью организма к развитию в составе сообщества с резко выраженной суточной периодичностью и варьирующими физическими и химическими условиями.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Дубинин A.B., Застрижная О.М., Гусев М.В. Продукция перекиси водорода галофильной цианобактерея Mlcrocoleus chthonoplastes. Микробиология. 1992. Т.61. Вып.З. С.

2. Дубинин A.B., Герасименко Л.М., Еенецкая С.{., Гусев М.В. Отсутствие роста цианобактерии Mlcrocoleus chthonoplastes в чистой культуре. Микробиология. 1992. Т.61. Вып.1. С.

3. Дубинин A.B., Герасименко Л.М., Гусев М.В. Физиологические