Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиология галофильных эубактерий - компонентов цианобактериального сообщества

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиология галофильных эубактерий - компонентов цианобактериального сообщества"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

УДК 576.8.095.1

Кевбрин Вадим Владимирович

Физиология галофильньк эубактерий - компонентов цианобактериального сообщества

Специальность 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель: чл.-корр. РАН, профессор Г.А.Заварэин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.М.Горленко

доктор биологических наук Б.Б.Намсараев

Ведущая организация: кафедра микробиологии МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита состоится "А9.." января 1994 г. в Ш.77 часов на заседании специализированного совета Д.002.64.01. в Институте микробиологии РАН по адресу: 117811, г.Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН,

Автореферат разослан ' ." декабря 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета, к.б.н.

Л. Е.Никитин

Актуальность теш Галофильные бактерии широко распространены на Земле и населяют различные экотопы, где имеется накопление солей. Специфическим биоценозом, образованным почти исключительно галофильными бактериями являются цианобактериальные маты гиперсоленых водоемов, интенсивное изучение которых началось с 70-х годов (КгитЬе1п е1 а1. , 1977).

Микробный мат представляет собой сложное природное бентосное сообщество микроорганизмов с четко выраженной слоистостью на макро-и микроуровнях. Современные маты часто приурочены к экстремальным местообитаниям с высокой температурой или соленостью. Возникший к ним интерес обусловлен тем, что современные маты рассматривают как аналоги древних микробных сообществ, сохранившихся в геологической летописи как строматолиты. Их изучение позволяет глубже понять эволюцию прокариотных организмов на ранних стадиях возникновения жизни (Ау/гапик, 1984). Посредством газообмена, древние микробные сообщества принимали активное, если не главное, участие в формировании атмосферы Земли (Заварзин, 1984). Кроме того, образование и, особенно, разложение микробных матов является удобным объектом моделирования процессов формирования нефтеносных сланцев ШгепэМаЬ е1 а1. , 1984).

Модельным объектом в лаборатории микробных сообществ Института микробиологии РАН были избраны цианобактериальные маты лагун Арабатской стрелки, расположенные на восточном побережье Сиваша и обнаруженные в 1983 году проф. Г. А.Заварэиным. В последующие годы эти маты интенсивно изучались, что позволило дать общее представление об их строении и функционировании продукционной и деструктивной части СГерасименко и др., 1992; Заварзин и др., 1993). Изучена экофизиология индивидуальных микроорганизмов СгЬШпа, 1986; Жилина и Заварзин, 1990; Жилина и др. , 1991а; Дубинин и др. , 19926), построена общая схема трофических взаимо-

действий С Жилина и Заварзин, 1991; Жилина, 1992). Представляемая диссертация является продолжением работ, проводимых в лаборатории и касается нефотосинтезирущей части микробного сообщества. Цель работы Целью работы было: I) установление особенностей эко-фиэиологии новых облигатно анаэробных галофильных микроорганизмов семейства На1оапаегоЫасеае, выделенных из цианобактериального мата гиперсоленых лагун Арабатской стрелки, участвующих в разложении осмопротекторных веществ:

а) сахаролитических бродильщиков родов На1оЬас1его1<1ез и На1о1псо1а

б) гомоацетатной бактерии Асе(оЬя1оЫш1 агаЬаНсш.

2) Определение основного осмолита у основного первичного продуцента матов - цианобактерии ШсгосоЬеиэ сЬ1Ытор1а51ез и пути его деградации.

3) Выявление и идентификация аэробных гетеротрофных бактериальных спутников цианобактерии ШсгосоЬеиэ сЫкотюр1а£1ез.

Конкретные задачи исследования по первому пункту включали:

а) Изучение общей физиологии анаэробов: .изучение динамики роста на отдельных субстратах, состава продуктов брожения, выведение балансовых уравнений разложения субстратов, измерение параметров роста.

б) Изучение физиологии представителей ИаЬоапаегоЬьасеае в отношении серных соединений: восстановление серных акцепторов, определение источников серы на синтетической среде, ингибирование роста серосодержащими веществами.

Научная новизна Проведено сравнительное изучение анаэробных сахаролитических бактерий как физиологической группы. Показана способность анаэробных галофильных сахаролитиков к росту на гликоэилглицерине - осмопротекторном веществе, накапливаемом циано-бактерией М1сгосо1еиз сЬ.Оюпор1аз1ез. Впервые у представителей НаЬоапаегоЫасеае обнаружена способность к сероредукции и поглощению метантиола, что позволит оценить вклад микроорганизмов

этой группы в общий круговорот серы в -цианобактериальном мате. Изучена физиология галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticwi. Получены балансовые уравнения разложения основных субстратов. Впервые у представителя гомоацетатных бактерий обнаружена способность к восстановлению диметилсульфоксида, причем образование водорода и диметилсульфида находятся в обратной зависимости. Из лабораторной культуры Microcoleus chthonoplastes выделен и идентифицирован новый штамм Pseudomonas nautica, слабогалофильной бактерии с неопределенным таксономическим положением. Новый штамм 2-492 растет в 100% кислороде и гетеротрофно окисляет тиосульфат. Изучение галофильных микроорганизмов в отношении источников углерода и серы позволило уточнить и дополнить схему деградации осмопротекторных. веществ в цианобактериальном мате.

Научно-практическая значимость Полученные результаты расширяют наши представления о функционировании галофильного цианобактериального сообщества. Галофильная цианобактерия Microcoleus chthonoplastes может быть использована как перспективный продуцент гликозил-глицерина. Это вещество - осмопротектор может найти применение в качестве стабилизатора ферментов, в том числе и промышленного назначения.

Апробация работы Отдельные материалы диссертации были представлены на 4 Симпозиуме социалистических стран по биотехнологии (Болгария, 1986), и Всесоюзной конференции "Архебактерии" (Пущино, 1987). Публикации По теме диссертации опубликовано 5 статей, две статьи сданы в печать.

Объем и структура диссертации Диссертация написана на 119 страницах машинописного текста и состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть" (включающая главы "Обтекты и методы исследования", "Результаты и их обсуждение"), "Заключение",

"Выводы" и "Список литературы" С188 наименований). Диссертация содержит 12 рисунков и 16 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Микроорганизмы, среды и условия культивирования

Чистые культуры анаэробных галофильных бактерий Hzlabacteroides

halobius 2-7287, Z-7387, Halobacteroides lacunaris Z-7888T,

Haloincola saccharolytica Z-7487, Z-7587, Z-7687, Z-7787T,

T

Acetohalobim arabaticm Z-7288 получены от д.б.н. Т.Н.Жилиной из

коллекции лаборатории микробных сообществ СИНМИ РАН). В опытах

использовали в основном типовые штаммы Z-7888^, Z-7787^, Z-7288^, а

т

также Z-7287. Типовая культура Pseudomonas nautica LMG 2226 получена от Д-ра Д. йенсенса из коллекции лаборатории микробиологии Гентского университета (Бельгия). Альгологически чистая культура галофильной цианобактерии Microcoleus chthonoplastes получена от к.б.н. А.В.Дубинина из коллекции лаборатории микробных сообществ.

Состав основной среды для анаэробных бактерий был следующим Сг/л): NaCl - 150; MgS04 7Н20 - 4; КН2Р04 - 0.3; KCl - 2; NH4C1 -0.5; СаС12 2Н20 - 0.07; дрожжевой экстракт - 0.5; NaHC03 - 4; резазурин - 0.001; раствор витаминов CWolin et al., 1963) - 10 мл; раствор микроэлементов СКевбрин и Заварзин, 1992) - 1мл. Культуры Halobacteroides и Haloincola поддерживали на основной среде с добавлением 5 г/л D-глюкозы, а Acetohalobim. - с добавлением 5 г/л D,L - лактата магния. В качестве восстановителей, в зависимости от целей работы, использовали: 0.5 г/л Na2S 9Н20, I г/л L-аскорбата натрия и 0.2 мМ комплекса TiCIII) с нитрилотриуксусной кислотой (Moench and Zeikus. 1983). Среду готовили по анаэробной методике СКевбрин и Заварзин, 1992). Стерилизацию проводили в автоклаве 30 мин при 121°С.

Подготовленные пробирки засевали Г/, (об/об) инокулятом для

Halobacteroides и Haloincola и 10% для Acetohalobim, взятым из середины логарифмической фазы. Культуры выращивали при 37°С.

Оптимальная среда для опытов с Pseudomonas nautica имела следующий состав (в г/л): NaCl - 40, MgS04 7Н20 - 0.3, КН2Р04 -2.72, СаС12 2Н20 - 0.07, ШдС1 - 0.5, раствор микроэлементов (Кевбрин и Заварзин, 1992) - 1мл, гидролизная смесь аминокислот (САГ-П. Украина) - 5. В опытах по нитратредукции NHjCl заменяли на 2 г/л NaNOg, а САГ-П на лактат натрия. Засев производили из расчета l'A Соб/об), культурой, взятой из поздней экспоненциальной фазы. Во всех случаях, кроме снятия температурной кривой, культуру выращивали при 37°С. Определение роста

Рост бактерий определяли по оптической плотности при бООнм на спектрофотометре Spekol-IO СГермания) непосредственно в пробирках или в 1см кюветах, если культивирование проводили во флаконах или ферментере. Экономический коэффициент CY) рассчитывали по общему клеточному белку. Осадок клеток дважды промывали буфером С150г/л NaCl, IOmM КН2Р04> IOmM MgClg, рН 7.0) и заливали 0.5М NaOH. После 10 мин выдерживания на кипящей водяной бане, в гидролиэате определяли содержание белка по реакции с Кумасси (Bradford et al., 1986). Строили графики зависимости клеточного белка от текущей концентрации ацетата в среде и на линейном участке определяли Y как тангенс угла наклона. Удельную скорость роста (р) рассчитывали на компьютере по программе FERMENT.BAS (Veiga and Gutierrez, 1991). Аналитические определения

Ацетат, пируват, лактат. этанол, метантиол, диметилсульфид определяли методом газоадсорбционной хроматографии на хроматографе Chrom-5 (Чехия) с пламенно-ионизационным детектором. Разделение проводили на колонке 0.9м х Змм, заполненной Chromosorb 101. Ацетат и пируват определяли после предварительного подкисления образца до

pH 2. Для определения лактата пробу обрабатывали йодной кислотой по (Teunissen et al. , 1989). Метантиол и диметилсульфид отбирали из газовой фазы Собьем вводимой пробы 100 мкл), остальные вещества из жидкой (2 мкл). Так как метантиол и диметилсульфид заметно растворимы в воде, предварительно был построен калибровочный график ^газ^^обш?' по которому и определяли содержание летучих серо-органических соединений на литр среды.

Кислород и водород определяли на хроматографе ЛХМ-80 с катарометром. Газ-носитель - аргон, ток накала нити 80мА, Разделение проводили на колонке 0.75м х Змм, заполненной молекулярным ситом 5А.

Глюкозу и гликозилглицерин определяли с фенолом СХансон и Филлипс, 1984). Сульфид - по реакции образования метиленовой сини CTruper and Schlegel, 1964). Бетаин - осаждением с рейнекатом аммония (соль Рейнеке) (Focht et al. , 1956) Формиат - по Лангу (Lang and Lang, 1972). Нитрит - по реакции с сс-на'фтиламином и сульфгниловой кислотой (Лурье, 1984). Тиосульфат - титрованием с иодом. Индикатор - крахмал.

Аминокислоты определяли на аминокислотном анализаторе Т339 (Чехия) в аналитической лаборатории ИНМИ РАН. Пробу культуральной жидкости, очищенную от клеток, разбавляли водой в мерной колбе до приблизительной концентрации 0.25мМ по любой аминокислоте. Из колбы отбирали аликвоту 1.5мл и выпаривали досуха на кипящей водяной бане. Сухой остаток заливали 1.5мл загрузочного буфера и вводили в анализатор.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЯ Pseudomonas nautica 2-492

Хемоорганотрофный аэробный спутник Microcolevs был выделен высевом биомассы цианобактерии, находящейся в поздней стационарной

фазе, на среды с пептоном в качестве источника углерода и NH^Cl в качестве источника азота. Чистая культура пептолитической галофильной бактерии была получена методом последовательных разведений в жидкой среде и отсевом отдельной колонии с агаризованной среды. После 2-х суточного инкубирования на агаризованной среде были получены мелкие (2-3им). круглые, выпуклые колонии с ровным краем. Поверхность колоний - гладкая, блестящая. Цвет - кремовый, полупрозрачный.

Морфологически культура представляет собой мелкие, прямые, подвижные палочки, размножающиеся бинарным делением. Бактерия имеет типичное грамотрицательное строение клеточной стенки и монополярный жгутик. Морфология культуры сильно зависит от источника азота. При замене NH^Cl на NaNOg, наблюдается множественное образование инволюционных форм, тем не менее, сохраняющих способность к размножению. При последующем высеве на среду с аммонием, микроскопическая картина становится однородной. Микроскопирование культуры на среде с нитратом может привести к ложному выводу о "недоочистке" организма. Морфологическое разнообразие палочковидной микрофлоры всегда наблюдалось при микроскопировании культуры Microcoleus в стадии разложения.

Для идентификации выделенного организма были выполнены стандартные микробиологические тесты по (Смайберт и Криг, 1984) и определено содержание Г+Ц (59.2 мол%). На основании фенотипических свойств и содержания Г+Ц, организм отнесен нами к Pseudomonas nautica и получил обозначение штамм 2-492. Штамм 2-492 растет на белках, растительных маслах, C2~Cg карбоновых кислотах. Из аминокислот использует только глутамат, глутамин и пролин. Не растет на моно- и дисахарах. По набору используемых субстратов, 2492 близок к штаммам 179 и 617. ДНК-ДНК гибридизация Z-492 с типовым штаммом Р. nautica LMG 2226 показала' 73% гомологии, что

хотя и находится на грани вида, все-же подтверждает принадлежность

выделенного нами изолята к Р. nautica.

Штамм Z-492 является слабым галофилом, с интервалом роста 0.I-2M

NaCl и с оптимумом 0.2-1. ОМ NaCl, нейтрофилом с интервалом рН от

5.5 до 9 с оптимумом 7, мезофилом с интервалом роста Ю-47°С и с

оптимумом 41°С. Культура выдерживает до О.ЗМ Мд^* без изменения

скорости роста, хотя потребность в магнии не обнаружена. В качестве

источников азота на среде с лактатом, культура использует NH^Cl,

NaNOg, CHgNHg и не использует молекулярный азот, ди-, три- и

тетраметиламин. Максимальная скорость роста ^=0.88ч"* получена на

среде со смесью аминокислот (САГ-ID и NH^Cl как источнике азота.

Штамм Z-492 обладает высокой окситолерантностью, вплоть до 100%

кислорода (Рис.I). Кривая на рисунке хорошо аппроксимируется

о

уравнением Моно с коэффициентом детерминации г = 0.97:

О -Т

М = где ц - удельная скорость роста, ч ,

С - концентрация кислорода в газовой фазе, 'Л Скорость поглощения кислорода, измеренная в полярографической ячейке, была одинаковой в интервале 10-100% (об/об) кислорода и составила 0.3 мкМ раств^/мин.мг. белка. Культура имеет каталазную активность, обнаруженную по выделению кислорода при внесении перекиси водорода. Сульфид оказывает на Z-492 только бактерио-статическое действие. После 2-х суточного выдерживания выросшей культуры под азотом в присутствии 20мМ NagS, организм высевается на аэробную среду без удлинения лаг-фазы. Аналогичное действие оказывает 20мМ сульфита и дитионита. Штамм Z-492 гетеротрофно окисляет тиосульфат, что является новым признаком для Р. nautica, поскольку для других штаммов это свойство не списано.

В анаэробных условиях на среде с САГ или с лактатом штамм Z-492 оказался способен к восстановлению нитрата. В тех же условиях культура не восстанавливала: нитрит, серу, фумарат, ацетон.

/V

j-i

I- I

9.12 H

D.M»- !

Л Й

Ьп 02

Рис.1 Рост Z-492 в зависимости от кислорода.

•2 +

диметилсульфоксид, Н-окись триметиламина, С0£, Fe .

Восстановление нитрата идет только до нитрита С Рис. 2). При инкубировании в атмосфере аргона, в газовой фазе не обнаружено летучих продуктов денитрификации - 1^0, . N0. В среде, также, не обнаружено накопления аммония. Кривая роста на Рис. 2А имеет отчетливый двухфазный характер. Замедление скорости роста обусловлено накоплением токсичного уровня Сок. 8мЮ нитрита. Способность нашего штамма к нитратному дыхании отличает его от других штаммов P.nautica, т.к. для вида в целом характерна денитрификация. Рост на нитрате не требует строго анаэробных условий и культура может расти с нитратом и на воздухе СРис 2БЭ. Однако, в этом случае, нитрит начинает появляется только после снижения концентрации кислорода до 7%. Способность Pseudomonas nautica к использованию нитрата расширяет адаптивные возможности

о

о

о

г

0П 600

часы

Рис.2 Рост г-492 с 2г/л ЫаЫОЗ: А - в аргоне. Б - в воздухе 1 - 0П, 2 - нитрит, 3 - кислород

организма, хотя нитрагредукция в цианобактериальных матах неизвестна.

Штамм Z-492 не лизирует живую культуру Microcaleus. Это было доказано по отсутствию зон просветления при точечном засеве газона Microcoleus культурой 2-492. Было приготовлено два газона с разными формами азота: с NH^Cl и с NaNOg, которые, затем выставляли на свет. Ни в одном случае литической активности не обнаружено. Штамм 2-492 не растет на биомассе Microcoleus, стерилизованной нагреванием при 121°С. Возможно, что денатурированные нагреванием белки биомассы не поддаются расщеплению протеазами 2-492. Косвенным подтверждением этого предположения является отсутствие роста 2-492 на альбумине, стерилизованного в автоклаве, тогда как среда с альбумином, стерилизованная фильтрованием, обеспечивала рост 2-492. Таким образом, источником углерода для P. nautica в бинарной культуре Microcoleus - Pseudoacnas могут быть: I) низкомолекулярные вещества, например, ацетат, выделяемый Microcoleus при темновом метаболизме (Дубинин и Герасименко. 1993), 2) некромасса Microcoleus.

Особенности физиологии штамма Z-492 указывыают на причины, по которым Pseudomonas nautica оказалась спутником цианобактерии. Микроокружение цианобактерии в естественных условиях циано-бактериального мата пересыщено кислородом. Для штамма Microcoleus используемого в данной работе, ранее была показана о,блигатная зависимость от бактериальных спутников, из-за чего оказалось невозможным поддержание Microcoleus в аксеничной культуре (Дубинин и др., 1992а). Такую зависимость предложено объяснить ауто-ингибированием перекисью водорода, образующейся при фотосинтезе, поскольку у Microcoleus отсутствует каталаза (Дубинин, 1992). Обнаруженная каталазная активность, а также высокая устойчивость штамма Z-492 к кислороду показывают, что в бинарной культуре Micro-

со1еиэ-Рзеи£к>топав гетеротрофный спутник получает от цианобактерии кислород, а взамен удаляет перекись водорода.

ФИЗИОЛОГИЯ САХАРОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИИ Субстраты и основные характеристики роста

Как было показано ранее, преимущественными субстратами сахаролитических бактерий родов Halobac teroides и Haloincola являются углеводы, включая моно и дисахара (Жилина и др., 1991а; Zhilina et al. , 19923. В предварительных опытах на пробирках было установлено, что штаммы Halobactero ides в качестве продуктов брожения глюкозы накапливают ацетат, этанол, Н2 и С02. Штаммы Halo-íncola образуют ацетат, Н2 и С02. Других летучих жирных кислот, лактата, а также спиртов не обнаружено. Для точного определения балансового уравнения разложения глюкозы было проведено культивирование.Hb. halobivs Z-7287 и Hi. saccharolytica Z-7787 в ферментере с поддержанием рН 6,5. Как пример, на Рис.ЗА показана динамика роста штамма Z-7787. Основные параметры роста, а также стехиометрические коэффициенты представлены в Таблице I. Полученные стехиометрические соотношения продукт/субстрат позволили вывести следующие уравнения разложения глюкозы:

1) для Halobacteroides spp.:

глюкоза +■ 3H20 = ацетат" + этанол + 2НСО3 + ЗН* + 2Н2 AG0 =-51.6

2) для Haloincola spp.:

глюкоза V 4Н20 = 2ацетат" + 2НСО3 + 4Н+ + 4Н2 AG0 =-24. 6

Энергии Гиббса рассчитаны при рН 7 по (Thauer et al. , 1977) и выражены в ккал/М образованного ацетата.

Важными субстратами для сахаролитических бактерий в естественных условиях цианобактериального сообщества могут быть сахароза, трегалоза, а также гликозилглицерин. Эти три вещества углеводной природы выполняют осмозащитную функцию у многих слабо и умеренно

гпМ тМ Н

30

60 90 120 150 180

часы

Рис.3 Рост Н1.БассЬаго1уМса 2-7787 на глюкозе: А - среда без серы, Б - среда с серой 1 — ОП, 2 - ацетат, 3 - водород, 4 — глюкоза, 5 — сульфид

Таблица I. Параметры роста типовых культур НаЬоЬасЬегоьбеэ и

На1а1псо1а на среде с глюкозой. _______________________

НЬ.ЬаЬоЫиз

2-7287 0.17 9.3 0.9 1.8 1.0

т.эассЬптоЬу Пса

2-7787 0.15 4.2 2.1 4.2 О

Примечания: С^, Сад, Сэт, Сглю~ мольные концентрации водорода, ацетата, этанола и глшоэы соответственно.

Таблица 2. Скорость роста сахаролитиков и баланс продуктов при брожении гликоэилглицерина.

НЬ.ШоЫиБ 2-7287 0.03 0.2 0.6 1.8 9.5

НЬ. 1асипаП5 г-7888 0.03 0.1 0.8 1.8 12.8

Нг. зассЪаго 1уПса

2-7787 0.02 1.6 2.8 О О

Примечания: соотношения продукт/субстрат определяли после 47 часов (для 2-7287) и 75 часов (для 2-7888 и 2-7787) роста. Сгг - мольная концентрация гликоэилглицерина.

Таблица 3. Поглощение метантиола сахаролитическими бактериями в среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом.

добавлено, ИЬЛасьпаг1з НЬ.Ьа1оЫи£ Ш.зассЬаго1уПса

мл СН,БН/Юмл 2-7888 г-7287 2-7787

СмЮа СН38Н? шМ 0П600 СН3БН,тМ 0П600 СН35Н,тМ 0П600

0 - 0.23 - 0.09 - 0.17

0.24 (1.0) 0 0.40 0 0.32 0 0.21

0.48 (2.0) 0 0.41 0 0.32 0.3 0.23

0.96 (4.0) 0.6 0.43' 0.8 0.31 1.6 0.19

1.44 С6.0) 0.6 0.42 0.7 0.32 1.9 0.18

2.40 (10.0) 1.7 0.41 1.7 0.33 4.9 0.19

Примечания: все данные есть среднее из двух повторностей. а - цифры в скобках показывают общее количество метантиола на литр среды, б - остаточная концентрация после 48 часов роста.

галофильных эубактерий, вклочая цианобактерии (Reed et al., 1986а; Imhoff, 1986). При увеличении солености среды, основной первичный продуцент матов Арабатской стрелки цианобактерия Microcoleus chtho-noplastes накапливает гликозилглицерин до 40V, по весу СКевбрин и др., I99D. При распреснеиии лагуны или отмирании клеток гетерозид может поступать в окружающую среду. .Поскольку в чистом виде это вещество коммерчески недоступно, для опытов мы получили гликозилглицерин из биомассы Microcoleus, выращенной в специальном режиме.

Штаммы Halobacteroides и Haloincola используют гликозилглицерин в качестве единственного источника углерода и энергии С Табл.2). Из соотношения этанол/ацетат видно, что штаммы Halobacteroides разлагают гетерозид с преимущественным образованием этанола и водорода. Ацетат образуется лишь в следовых количествах, что возможно обусловлено примесью моносахаров в приготовленном препарате гликозилглицерина. Разложение Сахаров у видов Halobacteroides протекает по пути Эмбдена - Мейергофа, так как были найдены соответствующие ключевые ферменты (Rengpipat et al., 1988). Однако, гликозилглицерин является новым, для этого пути, субстратом и биохимия превращения гетерозида остается неизвестной. На основании полученных результатов предлагается следующее эмпирическое уравнение брожения гликозилглицерина штаммами Halobacteroides:

CSHI8°8 + Н2° = 3этанол + ЗС02 + н2

Использование серных соединений

При отсутствии в среде каких-либо иных источников серы, кроме имеющихся в дрожжевом экстракте серосодержащих аминокислот, для ' всех изученных штаммов наблюдали устойчивый рост в многократных пересевах. Таким образом, культуры не нуждаются в сульфиде, как источнике серы. В поиске конкретных соединений - источников серы, была сделана попытка перейти на полностью синтетическую среду, заменив дрожжевой экстракт смесью 20-ти кодируемых аминокислот по

20 мг/л каждой. Такая замена оказалась полноценной только для видов На1оЬас1его1сЬз. Для Иа1о1ПСо1а дрожжевой экстракт является незаменимым компонентом. Вычленяя аминокислоты по одной, оказалось, что рост поддерживает только пара лейцин + метионин. В качестве альтернативных источников серы на среде лейцин + глюкоза были испытаны 18 серосодержащих веществ. Оказалось, что только метантиол поддерживал рост в дальнейших пересевах. Таким образом, метантиол оказался единственным источником серы для штаммов На1оЬас1его1(1е5 на синтетической среде с глюкозой и лейцином.

Действие различных концентраций метантиола показано в Табл.3. Штаммы На1оЪас1его1(1ез поглощали метантиол более сильно, чем штаммы На1о1псо1а. В изученном интервале концентраций С до 10 мШ, ингиби-рующего действия не выявлено. В отдельном опыте было проверено сбраживание метионина с образованием метантиола. Этот процесс осуществляют только виды На1о1псо1а. При внесении 6.7 мМ метионина, штамм 2-7787 накапливает до 1,6 мМ метантиола. Ранее сообщалось о выделении метантиола из метионина для НаХоашютоЫгш ргаеьа1епз СгеИсиэ е1 а!., 19833. Таким образом, На1о1псо1а является вторым родом в семействе Иа1оапаетоЫасеов способным к этому процессу.

Обнаружено, что при внесении серы, в среде с глюкозой происходит образование сероводорода. Восстановление серы происходит только в сложной среде, с добавлением, помимо глюкозы, дрожжевого экстракта. Уровень образованного Ь^Б варьировал у разных штаммов от 3 до 8 мМ. Вместе с Н^ накапливался и водород, однако это происходило только в условиях неподвижно стоящей пробирки или флакона. В условиях перемешивания, при тесном контакте клеток с серой, водород выделялся лишь в следовых количествах. При выращивании штамма 2-7787 с серой в ферментере при непрерывном перемешивании 400 об/мин, концентрация водорода составила лишь 0.13 мМ, тогда как максимальная концентрация сульфида достигла 13 мМ (Рис.ЗБ). Рост в

присутствии серы был сильно замедлен и глюкоза использовалась не до конца. Сравнение выходов биомассы по белку на моль субстрата в отсутствие и присутствии серы показано в Таблице 4,

Таблица 4. Выход биомассы (У) в г. общего белка

на IM использованной глюкозы.

добавка серы Z-7287 Z-7888 Z-7787

- S 3.3 2.8 3.9

+ S 3.7 3.1 4.0

Видно, что восстановление серы не дает выигрыша в энергии для основного метаболизма и является скорее побочным для самой клетки, хотя концентрация образованного сульфида достигает больших значений С Рис. ЗБ). В стратифицированном микробном сообществе мата образование сульфида в присутствии серы и водорода в ее отсутствие, может иметь адаптивное значение для выживания анаэробов в условиях дневного пересыщения по кислороду.

ФИЗИОЛОГИЯ Aceiohalobiwn arabaticm. Субстраты и основные характеристики роста

Как сообщалось в первой публикации с описанием Acetohalobium., организм использует следующие субстраты: Н2+С02. СО. бетаин, триметиламин, формиат, лактат, пируват, гистидин, казаминовые кислоты СЖилина и Заварзин, 19903. Помимо вышеперечисленных веществ были испытаны и другие, не вошедшие в первую публикацию. Как оказалось, культура растет также на аспартате, аспарагине, глутамате. Глутамин не использует. Поэтому, рост на казаминовых кислотах обусловлен, вероятно, утилизацией этих трех аминокислот.

Рост культуры на всех субстратах заметно стимулируется дрожжевым экстрактом. Для инициации роста требуется стартовое количество С02. При замене бикарбонатного буфера на MOPS буфер рост не начинается.

Для получения балансовых уравнений разложения субстратов, было проведено культивирование Acelohalobivjn в ферментере с постоянным поддержанием pH 7.0. Выращивание проводили в богатой среде с 2 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л исследуемого субстрата. Как пример, на Рис.4 показан рост на лактате и пирувате. На всех органических субстратах, кроме аспаргата и бетаина отмечено следовое выделение водорода в лаг-фазе. С началом роста, его концентрация в газовой фазе не меняется. На основании результатов культивирования, были рассчитаны основные характеристики роста - |j и Y, а также отношение ацетат/субстрат, которые представлены в Табл.5. Исходя из результатов культивирования были выведены следующие уравнения

образования ацетата:

AG0

4глутамат~ + 8Н20 = Эацетат" + 2НСО3 + ЗН+ + 4NH£ -6.4

2лактат~ = Зацетат- + Н+ -9.1

2аспартат~ + 4Н20 = Зацетат" + 2НСО3 + Н+ + 2Ш\ -10.6

4пируват~ + 4Н20 = 5ацетат"+ 2НСО3 + ЗН+ -14.0

4формиат~ + Н20 = ацетат" + 2НСО3 + ОН" -14.1

4Н2 + 2НСО3 + Н+ = ацетат" + 4Н20 -25.0

2гистидин + 12Н20 = 5ацетат" + 2НСО3 + Н+ + 6ЛНд ?

2бетаин + 2НР0 = 1,5ацетат" + 2ТМА+ + HGO; + 0.5Н1" ?

Для гистидина и бетаина не удалось найти справочных данных по Использование серных соединений

Исходная культура Асе1оЬа1оЫгт. была выделена на средах, восстановленных сульфидом натрия (Жилина и Заварзин, 1990). Замена сульфида на аскорбат привела к заметному улучшению роста. Проверка действия 18-ти различных неорганических и органических соединений серы в концентрации 1мМ на рост АсеЮЬлХоЪпт показала, что по характеру воздействия на организм, все вещества разделились на три группы. В первую входит большинство соединений, не оказывающих

ОП 600 тМ

О 20 40 60 80

часы

Рис.4 Рост А.агаЬаНсит 2-7288 на: А - лактате, Б - пирувате

1 — ОП, 2 — ацетат. 3 - /тактат, 4 — пируват

Таблица 5. Характеристики роста Acetohalobium. на разных

субстратах.

Субстрат М.ч"^ Y ? белка • М ацетата , мМ С ац/Ссуб.

глутамат 0. 04 0.8 0.14 2.9

Н2+С02а 0. 04 0.9 - -

лактат 0.09 1.0 0.13 1.4

пируват 0. 07 1.2 0.17 I.I

аспартат 0. 09 1.3 0.006 2.0

бетаин 0. 06 1.9 0.006 1.9

гистидин 0. 09 2.5 0.17 2.7

формиат 0.04 3.1 см. рис. ЮБ 0.3

Примечания: а - смесь Н2+СО2 в соотношении 4:1 непрерывно продували через ферментер с расходом 150 мл/мин. Сщ- средняя стационарная концентрация водорода.

Таблица 6. Восстановление ДМСО и S° AcetohaLobivm arabaticxmL

ДМС образ., ммоль ДМС H?S образ.. ацетат

Субстрат 0П600 мкМ на IM ацетата мМ образ.,мМ

лактат 0.23 49 1.0 0.35 0

пируват 0.24 54 1.3 0.19 4.6

глутамат 0.19 116 2.0 0.33 0

гистидин 0.1 31 3.6 0 0

контроль 0.02 II 5.2 0.37 0

бетаин 0.19 103 5.9 0.40 0

аспартат 0.2 186 6.7 0.33 0

формиат 0.09 70 9.4 0.39 0

контроль

стерильн. 0.02 0 - 0 0

Примечания: а - для среды с ДМСО. Измерения проводили через 48 часов роста. Начальная концентрация БМьО была 5 мМ, а серы - 0.3 г/10мл. Контроль содержал небольшое количество лактата, попавшее вместе с инокулятом. Цифры представляют среднее из трех повторностей.

заметного действия на рост, во вторую - умеренные ингибиторы -сульфид, цистеин, цистин, сера, и в третью - сильные ингибиторы -сульфит и дитионит. Таким образом, сульфит и дитионит оказались эффективными ингибиторами для всей изученной группы бактерий относящихся к На1оапаетоЫасеав. Действие умеренных ингибиторов -цистеина и сульфида - на рост Асе1оИа1оЫш показано на Рис.5. Цистеин обнаруживает более сильное ингибиторное действие, чем сульфид. Сходно ведет себя и цистин.

Дрожжевой экстракт в основной среде выступает как источник серы и является незаменимым компонентом. Не удалось перейти на полностью синтетическую среду и, тем самым, выявить истинный источник серы. При замене дрожжевого экстракта смесью 20-ти кодируемых аминокислот по 20 мг/л каждой, культура не растет. В этом отношении Асе1оИа1о-Ыш напоминает На1о1псо1а.

Асе1оЪа1оЫш оказался способен к восстановлению серных акцепторов - диметилсульфоксида (ДМСО) и элементной серы до диметилсульфида и соответственно. Других акцепторов - И-окись ТМА, ацетон, нитрат, сульфат и тиосульфат АсеЮЬа1оЫш не восстанавливает. Уровни накопленных продуктов восстановления и выход ДМС на I моль образованного ацетата представлены в Табл.6.

Восстановление ДМСО является, по-видимому, побочной метаболической реакцией, подобно восстановлению серы у сахаролитических галоанаэробов, и не может служить дополнительным источником энергии. На это указывают низкие уровни образования ДМС и малая величина выхода ДМС на моль ацетата. Из Таблиц 5 и 6 видно, что есть обратная зависимость между выделением водорода и выходом ДМС. Рост на аспартате и бетаине характеризуется следовым выделением водорода и высоким выходом ДМС, и наоборот, глутамат, лактат, пируват и гистидин дают больше водорода и меньше ДМС. Такой феномен можно объяснить перераспределением электронов между ДМСО-

мМ

Рис.5 Конечная плотность А.агаЬаНсит после 48ч роста с Ыа25 или цистеином: 1— Ыс^, 2-цистеин

редуктаэой и гидрогеназой. Исключением здесь является формиат, разложение которого идет через формиат дегидрогеназу (ФДГ). Выделение и последующая утилизация водорода при росте на формиате является общим свойством ФЛГ-содержащих организмов. Более мощный, по сравнению с другими субстратами поток восстановительных эквивалентов объясняет и максимальный выход ДМС при росте на формиате.

Из Таблицы 6 видно, что внесение серы приводило к полному угнетению роста, что было подтверждено как микроскопическими наблюдениями, так и отсутствием образования ацетата. Слабый рост отмечен лишь на пирувате. Однако, несмотря на отсутствие роста, слабое восстановление серы все-же происходило, что свидетельствует о разобщенности роста и сульфидогенеза. Малые уровни образования сульфида (до 0,4мМ) показывают, что сульфидогенез для Асе1оЬа1оЫгт. более токсичен, чем для сахаролитических галоанаэробов.

ВЫВОДЫ

1. Из морской цианобактерии Microcoleus chthonoplasles выделен и охарактеризован аэробный гетеротрофный спутник. По фенотипическим и генотипическим признакам он отнесен к слабогалофильной эубактерии Pseudomoruis nautica. Выделенный новый штамм Z-492 растет в 100% кислороде, окисляет тиосульфат и восстанавливает нитрат до нитрита.

2. Анаэробные сахаролитические бактерии семейства Haloanaerobiaceae используют гликозилглицерин в качестве единственного источника углерода и энергии, причем штаммы Halobacteroides сбраживают его с преимущественным образованием этанола и водорода.

3. Анаэробные сахаролитические бактерии способны к гетеротрофному восстановлению серы до сероводорода, однако сульфид не может служить источником серы для анаболических нужд.

4. Все изученные анаэробные галофильные бактерии поглощают метантиол, причем у представителей рода Halobacteroides это вещество являлось единственным источником серы на синтетической среде. Виды Halobacteroides могут осуществлять биологический сток метантиола в галофильном сообществе.

5. Получены уравнения ацетогенного брожения у гомоацетатной бактерии Acetohalobim arabaticm при росте на глутамате, лактате, аспартате, пирувате, формиате, гистидине, бетаине. Ацетат является единственным продуктом брожения для всех субстратов, кроме бетаина.

6. Acetohalobim arabaticm образует нестехиометрические количества водорода на всех субстратах, кроме аспартата и бетаина, причем его выделение происходит преимущественно в лаг-фазе.

7. Acetohalobium arabaticm восстанавливает диметилсульфоксид до диметилсульфида. За исключением роста на формиате, выделение диметилсульфида и водорода при росте на других субстратах, находятся в обратной зависимости.

8. Присутствие серы приводит к полному ингибированию роста Aceto-

halobivm. arabaticvm.

9. Дитионит и сульфит являются специфическими ингибиторами роста для всех изученных представителей Haloanaerobiaceae.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жилина Т.Н.. Кевбрин В.В., Лысенко A.M., Заварзин Г.А. Сахаролитические анаэробы в галофильном цианобактериальном мате. Микробиология 1991, т.60. вып.1, с.139-147.

2. Кевбрин В.В., Дубинин А.В., Осипов Г.А. Осморегуляция у морской цианобактерии Hicrocolevs chlhonaplasles. Микробиология 1991, т.60. вып. 4. с. 596-600.

3. Кевбрин В.В., Заварзин Г.А. Влияние соединений серы на рост галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticvm.. Микробиология 1992, т.61, вып.5. с.812-817.

4. Кевбрин В.В., Кострикина Н.А., Лысенко A.M., Заварзин Г.А. Выделение и идентификация Pseudomonas nautica как устойчивого спутника цианобактерии Hicrocolevs chlhonoplastes. Микробиология 1994, (в печати).

5. Кевбрин В.В., Заварзин Г.А. Физиология галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium. arabaticvm. Микробиология 1994, Св печати).

6. Kevbrin V.V., Zavarzin G.A. Methanethiol utilization and sulfur reduction by anaerobic halophilic saccharolytic bacteria. Curr. Microbiol. 1992, v.24, №5, p. 247-250.

7. Zhilina T.N., Zavarzin G.A., Bulygina E.S. , Kevbrin V. V., Osipov G. A., Chumakov К. M. Ecology, physiology and taxonomy studies on a new taxon of Haloanaerobiaceae, Haloincola saccharolytica gen. nov. , sp. nov. System. Appl. Microbiol. 1992, v.15, p.275-284.

8.S2.9Z