Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности биологии серобактерий рода Thiodendron

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности биологии серобактерий рода Thiodendron"

' • На правах рукописи

ЛЕЩЕВА Наталья Владимировна

ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ СЕРОБАКТЕРИЙ РОДА ТНЮОЕ^Ш*

Специальность 03. 00. 07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1997

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор Г.А. Дубинина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущая организация: кафедра микробиологии

биологического факультета МГУ

Защита диссертации состоится " ¡Н " ил&Д, 1997 г. в п часов на заседании диссертационного совета Д. 00. 64. 01 в Институте микробиологии РАН по адресу: 117811, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп. 2.

Т.Н. Жилина

кандидат биологических наук К.С. Лауринавичус

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь ,

диссертационного совета, к.б.н. ¿.¿с-О-*- _Л.Е. Никитин

Актуальность проблемы. Одной из групп, участвующей в окислительных реакциях геохимического цикла серы, являются бесцветные серобактерии. Их характеризует массовое развитие в природе с образованием своеобразных обрастаний на поверхности донных отложений или плотных скоплений на границе окислительно-восстановительной зоны в водной толще.

Несмотря на то что серобактерии известны давно и в последнее время наметился определенный прогресс в их изучении, знания по физиологии и таксономии этой группы организмов остаются весьма ограниченными из-за трудностей культивирования и часто основываются на результатах наблюдений за природными популяциями.

К некультивируемым организмам относятся и бесцветные серобактерии рода Thiodendron. Этот организм был описан Б.В.Перфильевым в качестве нового рода как микроб со сложным циклом развития, включающий стадии тончайших длинных нитей и подвижных вибрио-идных клеток. Thiodendron относится к очень редким микроорганизмам, и его единичные находки были обнаружены автором в мелководных соленых водоемах и минеральных сероводородных источниках. При окислении сульфида бактерии накапливают элементную серу и в определенных условиях формируют на поверхности грунта обрастания в виде гигантских сферических колоний с накоплением серы, или бактериальные серные маты.

Кроме автора, Thiodendron никем не был исследован. Ввиду отсутствия чистых культур физиология, роль в серном цикле и филогенетическое положение рода остаются неясными. В "Руководстве по систематике бактерий Берги" род Thiodendron, представленный единственным видом - Т. latens, на основании гифомикробиального строения и сложного жизненного цикла помещен в раздел "Почкующиеся и/или стебельковые бактерии" (Hirsch, 1989).

Цель работы. Изучение бесцветных серобактерий рода Thiodendron.

Конкретные задачи работы состояли в следующем :

1. Изучение распространения, условий местообитания и метаболической активности Thiodendron в соленых водоемах различного типа.

2. Выделение чистых культур серобактерий рода Thiodendron.

3. Исследование физиологических особенностей и роли неорганических соединений серы в метаболизме выделенных штаммов.

4. Выделение анаэробных спирохет из морских донных осадков, где не отмечалось развитие матов Thiodendron. Сравнительная характеристика спирохет, выделенных из различных экосистем. Последняя задача была поставлена в связи с обнаружением симбиотической при-

роды Thiodendron и отнесением основного компонента ассоциации, формирующей гигантские колонии, к свободноживущим спирохетам.

Научная новизна и практическая значимость работы. Установлено широкое распространение бактериальных матов, сформированных нитчатыми серобактериями рода Thiodendron, в соленых водоемах различного типа. С применением радиоизотопных методов показано, что маты Thiodendron характеризуются высокой скоростью окисления сульфида, высоким гетеротрофным потенциалом (усвоением глюкозы) и гетеротрофной фиксацией углекислоты.

Показано, что описанные ранее бактерии рода Thiodendron со сложным циклом развития в действительности представляют тесную ассоциацию свободноживущих спирохет и сульфидогенов с вибриоид-ной формой клеток. Спирохеты являются основным структурным и функциональным компонентом серных матов "Thiodendron". Из материала матов "Thiodendron" различных соленоводных экосистем выделены чистые культуры свободноживущих спирохет. На основании изучения фено- и генотипических свойств выделенные штаммы отнесены к новому роду в пределах пор. Spirochaetales - Perfilievia gen. nov. - с видовым названием Р. russia gen. nov., sp. nov.

Из донных осадков Японского моря и бухты Кратерная выделены три штамма анаэробных спирохет, отличающихся по таксономическим и филогенетическим свойствам от Perfilievia russia. Они отнесены к новым видам рода Spirochaeta - S. orientalis sp. nov., S. crateria sp. nov. и S. gracilis sp. nov. Умеренно галофильный штамм SL из циано-бактериального мата Солар Лейк генетически и эволюционно удален от известных видов и может быть представлен в статусе нового рода в системе пор. Spirochaetales.

Показана способность чистой культуры Р. russia к окислению сульфида в микроаэробных условиях с накоплением элементной серы в периплазме клеток. Представители всех новых таксонов спирохегт способны осуществлять восстановление элементной серы до сероводорода. Процесс восстановления S0 является альтернативным механизмом стока восстановительных эквивалентов, образующихся в результате брожения.

В результате проведенных исследований впервые выявлено участие анаэробных свободноживущих спирохет в геохимических процессах цикла серы, сопряженных с деструкцией органического вещества. Полученные результаты значительно расширяют представления о разнообразии таксономического состава и метаболических возможностях группы свободноживущих спирохет и пор. Spirochaetales в целом.

Полученные в работе результаты могут быть использованы при составлении определителей бактерий, а также для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на семинарах финско-русской лаборатории биотехнологии Университета г.Турку (Финляндия, 1994, 1995 гг.), на совместном заседании лабораторий хемолитотрофных микроорганизмов, гипертермофильных микробных сообществ, экологии и геохимической деятельности микроорганизмов (ИНМИ РАН, 1996 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две работы и одна сдана в печать.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 153 страницах машинописного текста, включая 18 таблиц и 17 рисунков. Список литературы содержит 35 отечественных и 160 иностранных наименований работ.

Место проведения работ. Работа проведена в Институте микробиологии РАН в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов (заведующий лабораторией - доктор биологических наук, профессор В.М.Горленко). Исследование генотипических свойств проводили совместно с к.б.н. Н.А.Черных (ИНМИ РАН). Анализ 16S рРНК выполнен д-ром Ф. Рейни (DSM, Германия). Газообразные продукты брожения определяли совместно с к.б.н. A.JL Степановым (МГУ). Исследования по сероредукции и газохроматографические анализы (совместно с д-ром С. Павилайнен) выполнены в финско-русской лаборатории биотехнологии (JBL), руководимой профессором Т. Корпела (Университет г.Турку, Финляндия). Автор приносит искреннюю благодарность всем упомянутым участникам работы.

Автор благодарит д.б.н. В.М. Горленко (ИНМИ РАН) и д.б.н. Б.Б.Намсараева (Институт биологии СО РАН) за предоставление проб, а также д.б.н. В.Г. Тарасова (Институт биологии моря ДВНЦ РАН) - за предоставление проб и организацию полевых работ в 1991 и 1992 гг.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы полевых исследований. Объектами изучения служили бактериальные серные маты Thiodendron из соленых водоемов различного типа и морские донные осадки. Пробы монолитов матов и донных осадков отбирались с помощью стеклянных трубок, воды - над матами и под ними - с помощью стерильных шприцев объемом 100 мл для химических определений или 10 мл - для микроанализа содержания кислорода и сульфидов.

Сульфиды определяли колориметрическим методом с диметил-парафенилендиамином (Trüper, Schlegel, 1964; Mackereth et al., 1978), раздельное определение форм серы в воде (S2-, S2O32- и S03:) проводили методом иодометрического титрования (Резников и др., 1963). Концентрацию кислорода в воде определяли методом Винклера и микро-

методом Перфильева (Перфильев, Габе, 1964). Окислительно-восстановительный потенциал в колонках грунта в трубках определяли по-тенциомеггрически с гладким платиновым электродом, рН- с помощью стеклянного электрода на полевом потенциометре "Portable рН meter 30В"(Англия), общую минерализацию - по электропроводности воды, общее содержание углерода карбонатов - титрованием (Кузнецов, Дубинина. 1989).

Гетеротрофную активность бактерий определяли по методу Хобби и Райта, используя 1-6-ыС-глюкозу в качестве источника органического вещества (Wright, Hobbie, 1965). Контролями служили суспензия серного мата с добавлением 0,5 мл 40%-ного формалина и придонная вода. Радиоактивность фильтров измеряли методом жидкостной сцинтилляции на сцинтилляционном счетчике "Rackbeta 1219" фирмы LKB (Швеция). Для расчетов максимальной скорости усвоения глюкозы (Vmax) и природной концентрации глюкозы (So) использовали уравнение ферментативной кинетики Михаэлиса - Ментен (Фурсенко, 1972, 1975).

Определение темновой ассимиляции углекислоты проводили с использованием меченого бикарбоната в конечной концентрации 0,01мкКи на 1 мл пробы. Удельную скорость роста рассчитывали как соотношение углерода фиксированной за сутки углекислоты к углероду биомассы, выраженное в процентах.

Скорость окисления сульфида и тиосульфата в матах определяли с использованием меченых соединений серы - Na235S и Nai35S203, которые добавляли до конечной концентрации 1 мкКи на 100 мл.

Суспензию свежеотобранных матов для краткосрочных опытов с радиоизотопами углерода и серы готовили путем осторожного растирания слизистого материала мата с придонной водой в стеклянном гомогенизаторе.

Структуру матов изучали, исследуя стекла обрастания и материал свежеотобранных матов в световом микроскопе NU-2 фирмы "Zeiss", а также исследуя фиксированные образцы в электронном микроскопе.

Методы лабораторных исследований. Работа проводилась с семью штаммами спирохет, выделенных нами совместно с Г.А. Дубининой из бактериальных серных матов Thiodendron из различных местообитаний и из морских донных отложений.

Для получения накопительных культур использовали среду следующего состава (в г/л): NaCl - 20, NH4CI - 0,3, СаСЬ»2Н20 - 0,3, MgCh»6H20 - 3,0, крахмал растворимый - 5,0, рифампицин - 10 мг. В свежепрокипяченную и быстро охлажденную среду перед посевом вносили 10 мл 10%-ного фосфатного буфера (КН2РО4 и К2НРО4, рН 7,2), 1 мл микроэлементов (Pfennig, Lippert, 1966), 10%-ный раствор ЫагБ^НгО - 0,5 мл. Для культивирования выделенных чистых культур

в жидкую среду вводили дополнительно 1 г дрожжевого экстракта "Difco", 1 г пептона и витамин В12 - 5 мкг в расчете на 1 л.

Выделение чистых культур из накопительных проводили методом предельных разведений в пробирках на полужидкой среде с 5г агара "Дифко" в 1л с последующим отсевом отдельных выросших колоний в жидкую среду. Чистоту культур проверяли микроскопирова-нием. Культивирование бактерий проводили в анаэробных условиях во флаконах на 20 мл, доверху заполненных средой, при температуре 28°С.

Биохимические свойства бактерий изучали общепринятыми методами (Герхардт, 1984).

Морфологию бактерий исследовали в микроскопе NU-2 фирмы "Zeiss" с фазово-контрастным устройством. Изучение строения клеток проводили с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100. Препараты для микроскопии готовили общепринятыми методами. Для выявления особенностей строения тонких нитей из материала матов Thiodendron и выделенных чистых культур использовали метод Ховинд-Хоугена (Hovínd-Hougen, 1976).

Биомассу бактерий определяли в зависимости от целей работы одним из указанных методов: по белку методом Брэдфорда с кумасси синим G-250 "Serva" (Bradford, 1976) или в отдельных случаях - методом Лоури (Lowry et al., 1951) с предварительным гидролизом клеток в IN NaOH при 90°С; по оптической плотности культуральной жидкости при 600 нм; по сухому весу.

Суспензию клеток получали путем центрифугирования культуры при 5000g при 4°С в течение 30 мин. Клетки отмывали требуемым буфером и осадок ресуспендировали до необходимой концентрации белка. Бесклеточные экстракты получали разрушением клеточных суспензий ультразвуком в течение 3-5 мин дробно на дезинтеграторе "MSE-100" (Англия) при 22 кГц и 50 Вт в ледяной бане.

Цитохромы определяли в бесклеточном экстракте по дифференциальным спектрам поглощения, измеряемым на приборе "Pye-Unicam SP 1800" (Англия).

Содержание ГЦ в ДНК определяли совместно с Н.А.Черных по температуре плавления (Тт) стандартным методом (Marmur,1961), гомологию ДНК-ДНК изучали методом оптической реассоциации (De Lay, 1970). В качестве реперного штамма использовали Spirochaeta litoralis R1 (DSM 2029), выделенный ранее (Hespell, Canale-Parola, 1970b). Анализ 16S pPHK проводили совместно с доктором Ф.Рейни (DSM, Германия) по описанной ранее методике (Rainey et al., 1992).

Концентрацию глюкозы в культуре определяли спектрофотомет-рически по реакции с динитросалициловой кислотой после удаления клеток центирифугированием (Sumner, Somers, 1949). Летучие жирные кислоты и спирты определяли методом газожидкостной хроматогра-

фии на хроматографе "Varion Model 3700" (Palo Alto,USA) после экстракции проб диэтиловым эфиром. Нелетучие кислоты определяли после дериватизации проб метанолом и последующей экстракции метиловых эфиров хлороформом. Органические кислоты разделяли методом HPLC на колонке Animex Х-87Н (Bio-RadLabs.,USA) (Paavilainen, Korpela, 1993). Содержание CO: анализировали на хроматографе "Chrom-3700"; определение водорода вели на газоанализаторе "Газохром-3101" (Степанов, Онипченко, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Экология серобактерий рода ТЬЫепйгоп.

1.1. Распространение и физико-химические условия развития серных матов Пюс!епс1гоп в соленых водоемах различного типа.

Сведения о распространении матов и о физико-химических параметрах среды обитания суммированы в таблице 1. Как видно из представленных данных, серные маты ТЫобепёгоп оказались широко распространенными в морских и океанических экосистемах. Помимо мелководных водоемов и минеральных источников, описанных Б.В.Перфильевым, ТЫос1еп(1гоп обнаружен на литорали, сублиторали и в заливах Белого моря. Обильное развитие ТЫодепёгоп обнаружено в районах подводного вулканизма на выходах подводных гидротерм и в зоне их влияния в бухте Кратерная, средние Курилы, а также в заливе Матупи Харбор, Папуа-Новая Гвинея, в Тихом океане.

Развитие бактериальных серных матов ТЫоёепскоп происходит на разных глубинах при умеренных температурах и солености. Основной характерной особенностью местообитания является низкая концентрация кислорода в зоне роста мата, составляющая, как правило, доли мг/л, а в некоторых случаях его не удавалось определить аналитически. Концентрация сульфида в воде над матом может варьировать от 0,1 мг/л до 48 мг/л. Таким образом, серные маты ТЫос1еп(1гоп развиваются на границе окислительно-восстановительных условий в градиенте ШБ-Ог. Следует отметить, что источники поступления сероводорода в наддонную воду различаются в зависимости от района их развития. Так, в Старорусских источниках и на литорали Белого моря сероводород поступает из илов и донных отложений за счет сульфатре-дукции. В бухте Кратерная сероводород поступает в морскую воду из сероводородсодержагцих газогидротерм.

На основании полученных результатов можно предполагать широкое распространение серных матов Т1пос1епс1гоп и в других районах подводного вулканизма и гидротермальной активности в океане.

I аилици 1. 1 аифи^1|1апБП11с и ^плт^г-лм.чпи.4.1411 V- д^виопл ^а^опш

в солёных водоёмах различного типа

Глу- Соле- • Темпе- Содержа- Содержание

Район исследований бина, ность, ратура, ние кисло- сероводоро- Характер роста матов

м % град. * рода, мг/л* да, мгЭ/л *

Мелководные солёные водоёмы

Курорт Старая Русса

Минеральный источник N 8 0,3 2,0 8 0-0,2 0,8-1,5 Нежная голубовато-белая паутинка в устье источника

Минеральный источник 0,2- 2,0 8-12" 0-1,8 2.0-48.0 Слой колоний размером 5-30мм, пло-

Серебряный 0,5 4,8-48,0 ские и шаровидные над илом или в виде обрастаний на поверхности фунта

Нижнее озеро. 0,5-1 1,8 16 1.5-2.7 0,5-1,8 Белая пленка на поверхности ила тол-

прибрежная зона 0-0,8 щиной 1-2мм на площади в несколько кв.метров Маты толщиной 1-2мм, отдельные

Грязевые ванны 0,20,5 2,5 25 0.1 -0.8 0-0,1 1,5-3,8 сферические колонии на поверхности лечебной грязи в местах разложения органических загрязнений

Морские водоемы

Белов море

Пролив у о-ва Великий, 0,3- 1.7- 16-20,5 5.2 - 7.3 0.1-1.1 Эфемерные голубовато-белые пау-

литораль и сублитораль 1,5 2,1 0 - 2,04 4,6-14,4 тинки и белые пленки толщиной 1-2 мм на значительной площади дна

Ермолинская губа 0,5- 2,05 15 2.0 - 7.4 0-0.3 Белые пленки толщиной 1-2 мм на зна-

2,0 0-0,3 Тихий океан 2,07-2,7 чительной площади дна

Бухта Кратерная 10- 4-6 0.3-0.43 Голубовато-белый мат толщиной до

(о-в Янкича, Курильские о-ва), 25 3,5 12-34 2,8 - 3,5 5-30 20мм на площади в десятки кв.метров в

р-ны гидротермальной активости районах выходов газогидротерм

Залив Матупи Харбор, Папуа- Голубовато-белый мат

Новая Гвинея, зона вулканизма 1,5 3,5 - - - толщиной до 20мм

вблизи подводного источника***

Примечание: - Сведения не приводятся. * - В числителе - показатели в воде над матом, в знаменателе - под слоем мата в воде. ** - В весенний и летний периоды. *** - Данные Б.Б.Намсараева.

1.2. Метаболическая активность серных матов.

Скорость окисления соединений серы. Результаты краткосрочных опытов с радиоактивными соединениями серы, проведенные с использованием материала матов из бухты Кратерная, представлены в таблице 2. На различных глубинах распространения матов скорость окисления сульфида варьировала от 0,8 до 3,4 мкг/мг белка в сутки, что соответствовало 21,6-202,5 мг сульфидной серы в сутки на площадь в 1 м2. Скорость окисления тиосульфата, содержание которого в воде над матом составляло до 12 мг/л, была значительно выше - 1,3-17,1 мкг Б/мг белка в сутки, или 6,5-346 мг Б/м2. Однако ввиду того, что в опытные склянки с суспензией материала матов вносили дополнительно тиосульфат до конечной концентрации 200 мг/л, полученные величины скорости его окисления следует оценивать как потенциально возможные.

Таблица 2. Скорость окисления соединений серы в бактериальных матах ТЫо(1еп(1гоп из бухты Кратерная (Курильские о-ва)

¡Глубина Скорость окисления, п=3

отбора проб, и сульфида тиосульфата

мет Б/ {мгбелка* сут) мг8/ (м1* сут) мкгБ/ (мгбелка» сут) мг5/ (м5,сут)

15 0,80 21,6 1,28 6,5

23 3,40 202,5 17,12 , 346,5

Примечание: п - число опытов. Содержание белка в суспензии мата -0,56-0,6мг/мл. Время экспозиции проб - 3-6 ч в разных сериях опытов.

Темновая ассимиляция углекислоты. Определение скорости тем-новой фиксации СОг показало, что в матах из Старорусских минеральных источников активность темновой ассимиляции углекислоты составляла 6-12 мкг углерода на 1 мг белка клеток (табл. 3). Это соответствует удельной скорости роста 0,6-1,2%. Скорость темновой фиксации углекислоты в матах ТЫос1еп(1гоп из бухты Кратерная при инкубации проб с меченым бикарбонатом не превышала 0,6-0,65 мкг С на мг белка в сутки. Удельная скорость роста в этом случае составляла 0,06-0,065% в расчете на углерод клеточного белка, или 0,12-0,13% от белка клеток. Относительно более высокие величины гетеротрофной фиксации СОз в матах из минеральных источников Старой Руссы, вероятно, могут быть обусловлены тем, что для проведения опытов были отобраны свежеобразованные колонии ТЫоёепётоп суточного возраста в стадии активного формирования мата. Таким образом, в обоих

случаях темновая ассимиляция углекислоты в матах не превышала величин, известных для процессов гетеротрофной фиксации СО: микроорганизмами. Следовательно, окисление сульфида в матах не связано с продукцией органического вещества за счет процессов хемосинтеза.

Таблица з. Скорость темновон ассимиляции углекислоты в бактериальных матах ТЫобепбгоп

Место отбора мата Глубина, м Средняя скорость темновой фиксации ^С02 : , мкг С/(мг белка *сут) п = з •': Удельная скорость роста, О;' % '

9,5 0,95

Курорт Старая 0,4 7,4 0,74

Русса,

грязевые ванны 6,3 0,63

12,0 1,20

Бухта Кратерная, о-в Янкича, Курильские о-ва 15 23 0,34 0,60 0,65 0,034 0,06 0,065

Примечание: п - количество повторностей. Приведены средние значения из трех опытов. Температура инкубации проб 21°С. Длительность опытов 3-6 часов в различных сериях.

Гетеротрофная активность бактерий в матах. С помощью радиоизотопного метода была изучена активность усвоения глюкозы в матах из грязевых ванн курорта Старая Русса. Максимальная скорость усвоения глюкозы оказалась высокой и равнялась 15,8мкг/мг белка в час, рассчитанная величина природной концентрации глюкозы в воде составила 485 мг/л, время оборота - 30,5ч. Полученные величины близки известным для зоны хемоклина высокопродуктивных озер и загрязненных пресноводных водоемов, где процессы деструкции органического вещества протекают весьма интенсивно (Драбкова и др., 1990).

1.3. Структура матов.

Маты ТЫо<1епскоп из различных мест обитания характеризуются сходным строением. Они могут достигать до 20-30 мм в толщину и состоят из сферических колоний голубовато-белого цвета гелеобразной консистенции. Колонии сформированы из длинных тонких нитей, погруженных в слизистый матрикс полисахаридной природы. Нитевидные клетки, в которых происходит накопление серы, доминируют по биомассе и численности и являются основным структурным компо-

нентом матов. Второй постоянный компонент в колониях - крупные подвижные вибрионы, структурно не связанные с нитями.

При микроскопическом анализе обрастаний ТЫо<1епёгоп на стеклах обнаружена вертикальная дифференциация форм роста. В верхней части зоны роста преобладают длинные слабо изогнутые нити с обильным отложением серы вдоль всей нити. В нижележащей зоне в нитях встречаются лишь отдельные включения серы, либо она отсутствует в клетках. В самых нижних горизонтах роста преобладают спирально изогнутые нити, имеющие характерную для спирохет морфологию. Вибриоидные клетки расположены диффузно по всей вертикальной зоне обрастаний, но их количество возрастает в нижних горизонтах на границе с грунтом в строго анаэробных условиях.

Таким образом, в действительности, колонии ТЫос1еп(1гоп представляют не единый организм, как это следует из первоначального описания Б.В.Перфильева, а тесную ассоциацию двух организмов. При специальной обработке материала матов при электронномикроскопи-ческом исследовании обнаружено, что тонкие нити ТЫоёепскоп обладают характерными для спирохет особенностями строения: прото-плазматическим цилиндром, аксиальными нитями, наружной мембраной.

Таким образом, исследование строения и морфологии нитевидного компонента серных матов ТЫос1еп(1гоп показало, что основным структурным элементом исследованных бактериальных серных матов являются спирохеты.

Анализ строения и функциональной активности показал, что серные маты ТЫос1еп(коп существенно отличаются от известных типов серно-бактериальных матов. Во-первых, структурно: они представляют тесную ассоциацию двух бактериальных форм - организма нитчатой формы (спирохет) и бактерий с вибриоидной формой клеток; и, во-вторых, функционально - если известные маты образуют органическое вещество, то ТЫос1епс1гоп существует за счет использования готового органического вещества. Отсюда его четкая приуроченность к высокопродуктивным галофильным экосистемам.

2. Выделение и характеристика спирохет из различных местообитаний.

2.1. Выделение, характеристика и таксономическое положение спирохет из матов "ТЪШеп&оп".

Выделение чистых культур. Для выделения чистых культур ТЫоёепскоп использовали материал бактериальных серных матов из различных местообитаний. При подборе состава питательных сред и условий культивирования были использованы результаты экологических наблюдений за развитием ТЬюс!еп<коп в мелководных источниках курорта Старая Русса, согласно которым крупные колонии с отложе-

нием серы развивались на поверхности ила в местах локального загрязнения органическими остатками или при внесении в верхний слой иловых отложений органических веществ полисахаридной природы (крахмала, картофеля). В зонах активного нарастания матов кислород в воде над матом аналитически не улавливался или его содержание не превышало долей мг/л, а содержание сероводорода варьировало от десятых долей миллиграмма до 40 мг/л и выше. Исходя из этих наблюдений, для выделения ТЫос1епс1гоп использовали среду, содержащую крахмал в качестве источника углерода и энергии, и создавали анаэробные условия путем добавления 50 мг/л ЫагЭ^НзО.

Штамм Р выделен из материала мата минерального источника Серебряного курорта Старая Русса, штамм М-6 - из матов газогидротермальной зоны залива Матупи Харбор и штамм БМ - из матов литорали Белого моря.

Морфология. Для всех штаммов спирохет, выделенных из серных матов "ТЫос1еп(1гоп", характерна вариабельность морфологии в зависимости от условий культивирования. При небольшом содержании сульфида в среде (25-50 мкМ) рост бактерий происходит в виде слизистых войлочных обрастаний на дне флаконов. Основным структурным элементом в обрастаниях являются тонкие длинные неподвижные нити неравномерной толщины. Параллельно расположенные волокна, погруженные в слизистый матрикс, формируют длинные тяжи. Помимо этого, можно наблюдать прямые или слабо изогнутые нити, один конец которых спирально закручен. Картины роста аналогичны наблюдаемым в природных средах.

При снижении окислительно-восстановительного потенциала путем увеличения концентрации сульфида в среде (>0,1 мМ) характер роста бактерий значительно меняется. Основная масса клеток представлена подвижными клетками спирально извитой формы, характерной для спирохет. По форме и размерам клетки разных штаммов различаются незначительно (табл. 4).

Электронномикроскопическое исследование подтвердило их принадлежность к спирохетам: изоляты имеют все структурные особенности строения клеток, свойственные бактериям этой группы - спирально извитой протоплазматический цилиндр, окруженный наружной мембраной, аксиальные нити, или осевые фибриллы, которые выявляются лишь после обработки клеток протеазой.

Физиолого-биохимические свойства. Выделенные бактерии не используют аминокислоты, спирты, органические кислоты. Источниками углерода и энергии служат углеводы различного строения. Штаммы обладают гидролитической активностью, разлагают крахмал, гликоген, ламинарии, но не целлюлозу. Продуктами брожения глюкозы являются водород, СО2, ацетат, этанол, пируват и формиат.

штаммы из серных матов штаммы из морских Бр^о-

Характеристика "ТЫпНм1г1гпп" ппннмх пгятпгпп сИае(а

Р М-6 БМ в К-1 К-2 БЬ ШогаНв*1

Диаметр клеток, мкм*2 0,3-0,4 0,25-0,35 0,3-0,4 0,3-0,35 0,3 0,2-0,3 0,35-0,4 0.4-.05

Длина клеток, мкм*2 5-20 6-18 5-20 10-20 10-20 6-15 6-10 5-7

Оптимум темпера- 28-30 28-30 28-30 28-30 28-30 28-30 28-30 30

туры, град.

Оптимум рН 7,0-7,5 7,0-7,5 7,0-7,5 7,0-7,5 7,0-7,5 7,0-7,5 7,0-7,5 7.5

Соленость: КаС1, %

пределы / оптимум 0,5-5/2 1-7/3-3,5 1-5/3-3,5 1-7/3-3,3 1-7/3-3,5 1-7/3-3,3 2-12/7 2

Продукты брожения:

ацетат + + + + + + + +

этанол + + + + + + + +

лактат - - - + + + + -

пируват + + + - - - - -

формиат + + + - — — — -

ГЦ в ДНК, МОЛ.% 29,6 30,4 30,6 44,6 42,8 42,3 44,7 42,2«

(50,5:44,2)

Отношение к О2 Аэротолерантные анаэробы Строгие анаэробы

Примечание: *' -данные НеэреИ, Сапа1е-Раго1а, 1970Ь; *2 - в экспоненциальной фазе роста; *3 - см. примечание к табл.5.

Все штаммы каталазо- и оксидазоотрицательные. Цитохромы у выделенных бактерий не обнаружены. Аэротолерантные анаэробы, устойчивы к микроаэробным условиям. Мезофилы с оптимальной температурой роста 28-30°С и интервалом температуры от 10 до 32°С. Оптимальное значение pH для всех штаммов 7,0-7,5 с пределами 6,88,5. Выделенные штаммы являются облигатными умеренными галофи-лами и не растут в отсутствие NaCl или при его концентрации ниже 0,5-1%.

Изучение культуральных и физиологических свойств показало, что различия между штаммами, выделенными из разных географических зон, несущественны и касаются лишь оптимумов солености и набора используемых источников углерода.

На основании особенностей строения и метаболизма выделенные бактерии были предварительно отнесены к свободноживущим спирохетам рода Spirochaeta.

Генотипические свойства и таксономическое положение. С целью уточнения систематического положения штаммов было проведено изучение генетического родства с известными представителями рода Spirochaeta методом ДНК-ДНК гибридизации в сочетании с анализом нуклеотидного состава 16S рРНК. Реперным организмом служил наиболее близкий по свойствам штамм S. litoralis R1 (DSM 2029). Результаты определения ГЦ в ДНК и ДНК-ДНК гомологии представлены в таблице 5.

Было установлено, что исследуемые организмы характеризуются очень низким содержанием ГЦ в ДНК - 29-30 мол.%, что на 15-35% ниже, чем у известных видов рода Spirochaeta (45-65 мол.%) и что сближает их с группой трепонем (25-54 мол.%). Гомология новых штаммов и реперного штамма не превышает 2%.

Таксономическая обособленность этих организмов подтверждена результатами анализа 16S рРНК. Согласно полученным данным, новые штаммы принадлежат к пор. Spirochaetales и отличаются от рода Spirochaeta. Филогенетическое расстояние этой группы организмов от других представителей показывает, что она является достаточно удаленной от известных видов и эволюционно обособленной (рис.1).

Таким образом, на основании значительных отличий в содержании ГЦ в ДНК, практически полного отсутствия молекулярной ДНК-ДНК гомологии между изолятами и S. litoralis и на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК. штаммы спирохет, выделенных из сообщества "Thiodendron", отнесены нами к новому роду в пределах сем. Spirochaetaceae. Этот род получил название Perfilievia в честь русского микробиолога Б.В.Перфильева, впервые описавшего Thiodendron.

Таблица 5. Нуклеотидный состав и гомология ДНК анаэробных спирохет из сообщества "ТЬЫепйгоп" 0) и из морских донных осадков (П)

1.

Штамм ГЦ в ДНК, мол % Гпмоппгия ЛНК %

Р М-6 БМ

Р 29,6 100

М-6 30,4 61 100

БМ 30,6 52 77 100

S.litoralis Rl (DSM 2029) 42,2*' 50,5*2; 44,2« 0 2

П.

Штамм ГЦ в ДНК, мол % "омология ДНК, %

В К-1 К-2 SL

В 44,6 100

К-1 42,8 но 100

К-2 42,3 0 70 100

SL 44,7 0 5 0 100

S.litoralis R1 (DSM 2029) 42,2*1 50,5«; 44,2*з 0 36 0 1 8

Примечание: но - не определяли, *' - наши данные, *2 - по данным Hespell, Canale-Parola, 1970b; *3- Harwood,.Canale-Parola, 1983.

Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов, выделенных из разных географических регионов, указывает на их значительное фенотипическое сходство. Все штаммы характеризуются близким сходством по нуклеотидному составу ДНК (29-30 мол.%). Общность фенотипических свойств и высокий уровень гомологии ДНК (56-77%) позволяют отнести выделенные штаммы к одному виду нового рода, названнму Perfiüevia russia gen. novM sp. nov. Приведены диагнозы нового рода и вида.

ХйгасНк К-1

Рис.1. Филогенетическое дерево, основанное на сравнительном анализе 168 рРНК новых штаммов спирохет с известными представителями пор. 8р1госЬае1а1е8.

2.2. Выделение, характеристика и таксономическое положение спирохет из морских донных осадков.

Выделение чистых культур. Для сравнительных целей были выделены чистые культуры спирохет из донных осадков, где не отмечалось развитие матов "ТЫос1еш1гоп". Для выделения использовали селективную среду с крахмалом и рифампицином. Всего было выделено четыре штамма анаэробных спирохет: штамм В - из материала серного мата, сформированного Ве§д1а1оа, в Амурском заливе, штаммы К-1 и К-2 - из морских донных осадков бухты Кратерная, спирохеты штамм БЬ - из образцов цианобактериального мата из гиперсоленого водоема Солар Лейк. Морфолого-физиологические свойства чистых культур представлены в таблице 4.

Морфология. Штаммы спирохет из донных осадков представлены подвижными спиральными клетками. От бактерий, выделенных из серных матов, изоляты отличаются тем, что клетки имеют туго закрученную спираль правильной формы с меньшей амплитудой и длиной волны и большим количеством витков.

Физиолого-биохимические свойства. Подобно видам рода 8р!госЬае1а и Р. п^а, штаммы спирохет из донных осадков исполь-

зуют для роста только углеводы. Для штаммов В, К-1 и К-2 оптимум роста отмечен при температуре 28-30°С, pH 7-7,5 и солености 3-3,5% NaCl, границы солености - 1-7% NaCl. Штамм SL имеет более высокую верхнюю границу солености - 12% с оптимумом около 7% NaCl. От P. russia штаммы отличаются строгим анаэробиозом и составом продуктов брожения: дополнительно образуют лактат, но не накапливают пируват и формиат.

Генотипические свойства и таксономическое положение. Результаты определения генотипических свойств - ГЦ в ДНК и ДНК-ДНК гомологии - представлены в таблице 5. По составу нуклеотидных оснований штаммы В, К-1 и К-2 с содержанием ГЦ в ДНК 42-44 мол.% близки к S. litoralis, но по результатам ДНК-ДНК гибридизации и анализа I6S рРНК (рис.1) представляют три самостоятельные вида, образующие с этим видом кластер достаточно близкородственных организмов. Они получили название S. orientalis sp. nov., S. crateria sp. nov. и S. gracilis sp. nov. Приведены диагнозы новых видов.

Штамм SL из галофильного цианобактериального мата (ГЦ в ДНК - 44 мол.%) вместе с некультивируемым типовым видом S.plicatilis и штаммом DSM 6211 с неопределенным таксономическим положением представляет самостоятельную ветвь в эволюционном древе спирохет и дистанционно достаточно от них удален, чтобы быть признанным в статусе самостоятельного нового таксона на уровне рода. Однако, в настоящий момент мы пока не предлагаем родового названия и не описываем новый таксон до завершения дополнительных исследований с целью окончательного установления эволюционно-таксономического положения изолята.

t

3. Роль неорганических соединений серы в метаболизме выделенных штаммов.

3.1. Окисление сульфида спирохетами из ассоциации "Thiodendron".

Thiodendron был описан Б.В.Перфильевым как серо-железный микроорганизм, окисляющий сульфид с отложением серы на поверхности нитей. Хотя решение вопроса окисления серных соединений является принципиально важным, нами была показана лишь возможность накопления серы в клетках в микроаэробных условиях в чистой культуре спирохет Perfilievia russia штамм Р, а также в бинарной культуре при продукции сероводорода вторым компонентом ассоциации-сульфидогеном с вибриоидной формой клеток.

Механизм окисления сульфида с накоплением серы в клетках и трофические взаимодействия спирохеты - сульфидогены в настоящее время изучаются в нашей лаборатории и являются предметом отдельного исследования.

3.2. Восстановление элементной серы спирохетами.

При микроскопических наблюдениях за состоянием нитей из мата "ТЙюбепскоп" обнаружено, что в анаэробных условиях происходит удаление включений серы из клеток и в ряде случаев почернение осадка вследствие отложения сульфида железа - РеБ. При изучении физиологии чистых культур установлено, что все выделенные организмы (7 штаммов), в том числе и коллекционный штамм Б. ШогаНв Ш, накапливали сульфид при культивировании с серой в анаэробных условиях. В связи с этим была исследована роль элементной серы в метаболизме спирохет. Одно из предположений состояло в возможном наличии серного дыхания. Среди свободноживущих спирохет рода 8р1госЬаега известны два вида, способные, наряду с брожением, к дыханию (Вгегпак,Сапа1е-Раго1а,1972Ь; СгеепЬе^, Сапа1е-Раго1а, 1976).

Была исследована способность к использованию элементной серы как акцептора электронов при анаэробном дыхании на водороде или органических донорах электронов. Однако, было установлено, что организмы не способны к литоавтотрофному и литогетеротрофному росту с серой в качестве акцептора электронов. Оказалось, что данные организмы не используют при сероредукции, как и при органогетеро-трофном росте, иные источники углерода, кроме углеводов. Все испытанные штаммы спирохет росли только на среде с глюкозой и элементной серой. При этом рост сопровождался накоплением сульфида в среде. Бактерии из ассоциации "ТЫос1еп(1гоп" накапливали 3-5 мМ сульфида, бактерии, выделенные из донных осадков - от 7 до 10 мМ сульфида. Методами дифференциальной спектроскопии показано отсутствие цитохромов в клетках спирохет. Исходя из приведенных данных можно заключить, что восстановление серы у новых штаммов не связано с процессом переноса электронов по электронтранспортной цепи при серном дыхании.

Таким образом, основным способом получения энергии у спирохет в анаэробных условиях является брожение. Важно было выяснить влияние элементной серы на рост и на состав продуктов брожения глюкозы. С этой целью были проведены опыты по культивированию двух штаммов спирохет из разных местообитаний в присутствии и в отсутствие элементной серы. Результаты опытов представлены на рисунках 2 и 3.

В вариантах с серой одновременно с потреблением глюкозы и увеличением числа клеток происходило накопление сульфида в ростовой среде. За 6 сут культивирования в культуральной жидкости штамма Р было накоплено 3,5 ммоль сульфидаУл. В культуре штамма В за 7сут образовалось 7,5-8 ммоль сульфида/л. К концу культивирования бактерии штамма Р использовали около 50% внесенной глюкозы. Бактерии штамма В использовали субстрат практически полностью.

0,2

о о ю

с: О

|0,1

10

г £

я п О

1 2 3 4 5 6 Время, сутки

-Сульфид

-Рост

-рН

-Глюкоза

0

0

О

Рис.2. Рост, потребление глюкозы и образование сульфида в культуре спирохет Р-гизда штамм Р в присутствии (10 г/л, н-Б0) и в отсутствие (-Б0) элементной серы. Культивирование во флаконах с соотношением жидкой и газовой фаз 2:1 на среде с глюкозой (10 мМ) и дрожжевым экстрактом (0,5 г/л).

Как видно из представленных данных, скорость роста бактерий штамма Р на среде с глюкойой и серой не превышала скорости роста на среде с одной глюкозой. Сера не оказывала стимулирующего действия ни на скорость потребления глюкозы, ни на урожай клеток данных бактерий (рис. 2).

В присутствии элементной серы в среде культивирования спирохеты штамма В росли несколько быстрее и достигали чуть большей конечной плотности клеток, чем в отсутствие серы (рис. 3). Однако,

Время, сутки

Рис. 3. Рост, потребление глюкозы и образование сульфида в культуре спирохет Б.опеШаНв штамм В в присутствии (+5°) и в отсутствие (-Б0) элементной серы. (Обозначения те же, что на рис. 2).

расчеты показали, что удельный урожай клеток обоих штаммов на единицу использованного субстрата не менялся в зависимости от наличия серы в среде (табл. 6).

Исследовано влияние элементной серы на образование продуктов метаболизма глюкозы для штаммов Р и В. Результаты анализа представлены на рисунке 4.

Продуктами брожения штамма Р при росте на глюкозе являются Нг, СОг, ацетат, этанол, пируват, формиат. Как видно из приведенных данных, у спирохет штамма Р в присутствии серы помимо перечисленных продуктов происходит накопление сульфида в среде, а содержание молекулярного водорода уменьшается в 3-5 раз. За исключением Н2

Таблица 6. Сравнение урожая клеток бактерий, восстанавливающих элементную серу в результате брожения

Нали- Выход биомассы. Удельный выход биомассы,

Организм чие Б0 мг сухой клеточной г сухой клеточной массы/

массы/л М глюкозы

РегйПеу1а п^а ч-Б0 80 17,2

штамм Р -Б0 99 17,7

8р1госЬае1а +8° 144 32,7

опетаНв штаммВ -Б0 131 31,2

ТЪегто^а Бр. 96 10,9

штамм ^ЗЗ-В11 -Б0 141 11,3

ТЬегшо1ода ч-Б0 84 43-48

тагшта2 -Б0 84 42

Примечание: 1 - по данным Janssen, Morgan, 1992; 2 - по данным Schroeder et al., 1994.

или НгБ, соотношение остальных продуктов брожения остается приблизительно одинаковым независимо от наличия элементной серы.

Бактерии штамма В образуют при брожении лактат, ацетат, этанол, СО: и Нг. В присутствии серы помимо накопления сульфида увеличивается образование окисленного продукта брожения - ацетата и уменьшается содержание восстановленных продуктов - водорода и лактата. Количество углекислоты и этанола остается приблизительно одинаковым.

Таким образом, полученные результаты показали, что независимо от наличия Б0 изученные спирохеты осуществляют один и тот же катаболический процесс (брожение) с образованием одних и тех же продуктов. Элементная сера не влияет на тип катаболизма, а используется лишь для сброса освобождающихся при брожении электронов. Физиологическая роль сероредукции в метаболизме этих бактерий состоит, по-видимому, в удалении молекулярного водорода, накопление которого, как известно, может оказывать ингибирующее действие.

В природных местообитаниях процесс редукции внутриклеточной серы может иметь важное экологическое значение. На нижней границе распростанения серных матов "Thiodendron" в анаэробных условиях он может функционировать в качестве механизма редукционного удаления обильных отложений внутриклеточной серы у спирохет по мере нарастания свежих слоев мата и изоляции старых от зоны соприкосновения с растворенным кислородом. Микроскопический анализ показал, что в клетках спирохет из нижней придонной зоны действительно отсутствует сера.

Рис. 4. Влияние элементной серы на состав продуктов метаболизма спирохет Р.гиБя'т штамм Р (I) и Б. опегиаНз штамм В (II). Культивирование в сосудах с соотношением объемов жидкой и газовой фаз 2:1 на среде с глюкозой (10 мМ) и дрожжевым экстрактом (0,5 г/л). Культура из стационарной фазы роста. Потребленная глюкоза - 3,5 мМ (I) и 10 мМ (II). Приведены средние результаты трех независимых опытов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До настоящего времени нитчатые серобактерии рода ТЫос1еп(1гоп не были получены в виде чистых культур, и знания об этом необычном и редко встречающемся микроорганизме остаются на уровне первоначального морфологического описания (Перфильев, 1969).

Мы считали основной задачей нашей работы выделение чистых культур ТЬю<1еп<1гоп и их изучение с использованием современных таксономических методов. С этой целью было предпринято исследование соленых водоемов, где активно протекают процессы круговорота серы.

В результате экологических исследований нами показано широ-

кое распространение ТЬюс1епс1гоп не только в минеральных источниках и озерах, но и в морских экосистемах - в районах подводной гидротермальной и вулканической активности. Оказалось, что так называемые маты ТЫос1епс1гоп могут занимать огромные площади морского дна и литорали побережий, что указывает на их важную роль в данных экосистемах. Об этом также свидетельствуют достаточно высокие скорости окисления сульфида и усвоения глюкозы в матах, которые были определены радиоизотопными методами.

Проведенное электронномикроскопическое исследование материала серных матов позволило установить, что колонии ТЫос1епс1гоп представляют собой ассоциацию двух микроорганизмов - бактерий нитчатой формы, в клетках которых происходит накопление элементной серы, и бактерий с вибриоидной формой клеток, соответствующих подвижной стадии развития этого организма в природных условиях.

Из матов ТЫоёепскоп, отобранных в мелководных соленых и морских водоемах, нами выделено три штамма спирохет. Сравнительное изучение строения и морфологии выделенных чистых культур и нитевидного компонента матов подтвердило их сходство и наличие у последнего особенностей клеточного строения, свойственных спирохетам. Таким образом, основным структурным элементом матов ТЫо-(Зепскоп являются спирохеты.

После того, как была выяснена природа "ТЫойепскоп" и установлена принадлежность основного компонента ассоциации к свободно-живущим спирохетам, представляло интерес сравнительное исследование изолятов с другими представителями этой малочисленной и сла-боизученной группы бактерий (Сапа1е-Раго1а, 1984; 1992).

Для этого из экологических ниш, где не отмечено формирования типичных для "Т1но(1епс1гоп" матов, было выделено четыре штамма анаэробных спирохет. По основным свойствам - морфологии и саха-ролитическому типу обмена - все штаммы, в том числе и изоляты из серных матов, оказались близки к представителям рода Бр^осЬа&а. Как показали проведенные исследования, основным физиологическим отличием спирохет из матов "ТЫос1епс1гоп" является отношение к кислороду. Эти организмы устойчивы к микроаэробным условиям и высоким значениям окислительно-восстановительного потенциала; они способны расти при подтоке кислорода и достаточно высокой концентрации сульфида. Этим объясняется приуроченность их развития к водоемам, для которых характерна узкая переходная зона между аэробной и анаэробной зонами. Все другие выделенные штаммы спирохет являются строгими анаэробами, и их местообитание приурочено к анаэробной зоне иловых отложений.

В результате детальных исследований фено- и генотипических свойств и на основании анализа 16Б рРНК штаммы спирохет из сообщества "ТЫос!епс1гоп" описаны в качестве нового рода - РефИепа

russia gen. nov., sp. nov. Спирохеты из морских донных осадков имеют статус трех новых видов рода Spirochaeta - S. oríenialis sp. nov., S.craíeria sp. nov. и S. gracilis sp. nov. Галофильный штамм SL филогенетически удален от известных видов р. Spirochaeta и, по-видимому, также будет обособлен в новый род.

Таким образом, результаты наших исследований позволили дополнить таксономический состав порядка Spirochaetales и значительно расширить существующие представления об эволюционно-генетиче-ском разнообразии и систематике бактерий этой группы.

При изучении физиологии новых видов большое внимание было уделено роли серных соединений в метаболизме. Впервые выявлена способность спирохет восстанавливать элементную серу в процессе ор-ганотрофного роста. Наряду с новыми видами это свойство обнаружено нами и у известного вида Spirochaeta litoralis. До сих пор среди ме-зофильных эубактерий эта реакция отмечена лишь у немногих организмов (Жилина и др., 1991; Sorokin et al., 1996). Однако, влияние серы на рост организмов и роль сероредукции в метаболизме авторы специально не исследовали.

Полученные нами результаты показали, что элементная сера не влияла на удельный выход биомассы, но влияла на соотношение продуктов брожения: в присутствии серы значительно уменьшалось образование водорода. Восстанавливаясь в сероводород, элементная сера служит стоком для освобождающихся в процессе брожения электронов и тем самым обеспечивает поддержание низкой концентрации молекулярного водорода. Таким образом, у изученных бактерий сероредук-ция является механизмом снятия ингибирующего действия водорода. Этот процесс, получивший название "облегченное брожение" (Janssen, Morgan, 1992), ранее показан для некоторых архебактерий (Fiala et al., 1986), экстремально термофильных эубактерий р. Thermotoga (Huber et al., 1986; Schroder et al., 1994) и умеренно термофильных органотроф-ных эубактерий (Бонч-Осмоловская, 1994).

В заключение хотелось бы подчеркнуть, что массовое развитие представителей анаэробных свободноживущих спирохет в качестве основных компонентов серных бактериальных матов в морских и океанических экосистемах никогда не было описано. В результате проведенных исследований впервые выявлено участие этой группы бактерий в геохимических процессах цикла серы, сопряженных с анаэробной деструкцией органического вещества.

ВЫВОДЫ

1. Установлено широкое распространение серно-бактериальных матов, сформированных сообществом "Thiodendron", в соленых водоемах различного типа.

Показано, что сообщество "Thiodendron" характеризуется высокой скоростью окисления сульфида, высоким гетеротрофным потенциалом (усвоением глюкозы) и низкой скоростью темновой ассимиляции углекислоты.

2. Показано, что описанные ранее бактерии рода Thiodendron со сложным циклом развития в действительности представляют тесную ассоциацию свободноживущих спирохет и сульфидогенов с вибриоид-ной формой клеток. Спирохеты являются основным структурным и функциональным компонентом серных матов Thiodendron, в клетках которых происходит отложение элементной серы.

3. Из материала матов "Thiodendron" различных солоноводных экосистем выделены чистые культуры свободноживущих спирохет. На основании изучения фено- и генотипических свойств выделенные штаммы отнесены к новому роду в пределах пор. Spirochaetales -Perfilievia gen. nov. - с видовым названием Р. russia gen. nov., sp. nov.

4. Из морских донных осадков выделены четыре штамма анаэробных спирохет, отличающихся по таксономическим и филогенетическим свойствам от Perfilievia russia. Три из них отнесены к новым видам рода Spirochaeta - S. orientalis sp. nov., S. crateria sp. nov. и S.gracilis sp. nov. Умеренно галофильный штамм SL генетически и эво-люционно удален от известных видов и может быть представлен в статусе нового рода в системе пор. Spirochaetales.

5. Показана способность чистой культуры Р. russia к окислению сульфида в микроаэробных условиях с накоплением элементной серы в периплазме клеток. Представители всех новых таксонов спирохет способны осуществлять восстановление элементной серы до сероводорода. Процесс восстановления S0 не влияет на удельный урожай клеток и является альтернативным механизмом стока восстановительных эквивалентов, образующихся при брожении.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Дубинина Г.А., Лещева Н.В., Грабович М.Ю. Выделение и таксономическое изучение бесцветных серобактерий рода "Thiodendron". Микробиология. 1993. Т.62. Вып. 4. С. 717-732.

2. Дубинина Г.А., Грабович М.Ю., Лещева Н.В. Распространение, структура и метаболическая активность бактериальных серных матов "Thiodendron" в соленых водоемах различного типа. Микробиология. 1993. Т.62. Вып.4. С.740-750.

3. Дубинина Г.А., Лещева Н.В., Черных H.A. Perfilievia russia gen. nov., sp. nov. - представитель нового рода анаэробных спирохет, основного компонента серных матов "Thiodendron". Микробиология.

1997.В печати.