Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование модельных систем дляселекции генноинженерных штаммовBacillus subtilis - продуцентов рибофлавина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование модельных систем дляселекции генноинженерных штаммовBacillus subtilis - продуцентов рибофлавина"

Центр "Биоинженерия" PA^f^ • 0Д

г 5 £ЕН 7ПП1

На правах рукописи.

РАКИТИН АНДРЕЙ ЛЬВОВИЧ.

Конструирование модельных систем для селекции генноинженерных штаммов Bacillus subtilis - продуцентов рибофлавина.

03.00.23 - биотехнология.

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва - 2000 г.

Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов Центра Бионнженерия РАН.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор А.И.Степанов. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.Р.Азизбекян кандидат химических наук И.А.Шилов.

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Защита состоится «2.2» ноября 2000 г. в I) час. СО мин. на заседании Диссертационного совета Л*020.040.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (127550, Москва, ул. Тимирязева, д. 42).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИСБ РАСХН.

Автореферат разослан _27- октября 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

Кандидат биологических наук

С.А.Мелихова

и 17 7, -Г (А ) и п п<~ч /1 ? Й>*> .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Витамин В2 (рибофлавин) в виде ФМН и ФАД включается в окислительно-восстановительные ферменты - флавопротеиды, которые являются переносчиками водорода. Рибофлавин является незаменимым витамином, поскольку не синтезируется организмом человека и животных, которые получают витамин либо с пищей, либо в результате деятельности микроорганизмов желудочно -кишечного тракта. Недостаток витамина В2 у животных и человека проявляется в виде поражения кожи, глаз и снижения жизнеспособности. В связи с этим, витамин В2 нашел широкое применение в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и фармацевтической промышленности.

Вид Bacillus subtilis хорошо изучен и охарактеризован как биохимически, так и генетически. В настоящее время полностью расшифрована первичная нуклеотпдная последовательность хромосомы В.subtilis. Для В.subtilis разработаны и широко применяются методы современной генетической инженерии. Клетки B.subtilis способны к эффективной секреции различных биологически активных веществ (БАВ). Генноинженерные штаммы признаны безопасными в экологическом отношении. Клетки B.subtilis бысто растут, нетребовательны к составу питательной среды. Существуют хорошо развитые технологии ферментации различных видов бацилл и извлечения конечных продуктов. Поэтому многие штаммы B.subtilis успешно применяются в микробиологической промышленности в качестве продуцентов различных БАВ: ферментов, антибиотиков, аминокислот, нуриновых нуклеозидов, витаминов.

Традиционно первый этап создания промышленного штамма -продуцента заключается в прямом отборе более продуктивных вариантов после воздействия мутагенов различной природы. Такой способ получения продуцентов достаточно трудоемок. Кроме того, отбор новых штаммов происходит эмпирически, неизвестна причина повышения уровня синтеза БАВ.

Установление биохимических путей биосинтеза того или иного метаболита и генетической регуляции его синтеза позволило проводить направленный отбор штаммов с заданными свойствами. Для этого отбирают штаммы устойчивые к аналогам целевого и промежуточных продуктов, получают направленные мутации ауксотрофности и т.д.

Успешное развитие генетической инженерии позволило многократно увеличивать дозу необходимого генетического

материала в клетках штамма - продуцента, что достигается за счет амплификации искомой ДНК в автономном состоянии в составе плазмидпых векторов или интеграции генетического материала в хромосому реципиентпого штамма.

Для создания современных штаммов - продуцентов применяют комбинацию вышеизложенных способов. В настоящее время на основе клеток В.БиЫШз сконструирован ряд штаммов -продуцентов витамина В2- Эти штаммы созданы путем соединения традиционных методов селекции с методами современной генетической инженерии. Многие продуценты рибофлавина содержат низкопийную плазмиду рМХ45, представляющую собой вектор рМХЗО, несущий рибофлавиновый оперон.

Для клонирования ДНК в клетках В.виЬШ18 применяют как многокопийные, так и низкокопийные векторы. Преимуществом низкокопийных векторов является то обстоятельство, что они, как правило, обеспечивают стабильное наследование клонированного генетического материала. Доза генов, клонированных с помощью таких векторов, составляет 1-3 на геном клетки. Для достижения сверхэксцресспи целевого продукта, теоретически, более предпочтительно использовать многокопийные векторы, т.к. в этом случае доза клонированного генетического материала может превышать 10 копий на клетку. Но, как правило, в этом случае возникает ряд проблем связанных с различными видами нестабильности гибридных плазмид и отсутствием корреляции между дозой генов и уровнем их экспрессии. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является конструирование модельных систем, включающих в себя ряд многокопийных плазмид, содержащих оперон биосинтеза витамина В2 и изучение возможности использования информации полученной при исследовании модели для создания нового поколения штаммов -продуцентов рибофлавина на основе клеток В.зиЫШв. Исходя из поставленой цели, решали следующие задачи:

-минимизация фрагмента хромосомы В.зиМШз содержащего в своем составе оперон биосинтеза рибофлавина.

-создание нового поколения многокопийных векторов, ведущих свое происхождение от низкокопийного вектора рМХЗО.

-клонирование минимизированного фрагмента хромосомы В.аиЫШэ, содержащего рибофлавиновый оперон в составе полученых плазмидных векторов. И тем самым завершение создания искомой модели.

-изучение уровня биосинтеза рибофлавина и стабильности полученных рекомбинантных молекул в клетках модельного штамма В.эиЫШз.

Научная новизна и практическая пенность работы.

В результате работы по минимизации фрагмента хромосомы В.виЫШв, размером около Ют.п.о., несушего рпбофлавпновый оперон, получена многокотшная плазмпда рОП, несущая фрагмент хромосомы В.виЫШз минимизированный до размеров оперона биосинтеза рибофлавина (4.4т.п.о.).

На основе пизкокопийного вектора рМХЗО созданы многокопийные векторы рАИ13 и рАЛ21. Показан высокий уровень стабильности полученных векторов в клетках модельного штамма В.зиМШэ.

Получены плазмиды рА11131, рА11211, рА11212, р(Ж, рОШ5, рАЙЕ, рАТШ1, рАЕББ, рАИВШ, рАЛВБЕ, несущие оперон биосинтеза рибофлавина, клонированный по различным сайтам в различной ориентации. Тем самым создана модель для изучения влияния копийности плазмид; участка по которому клонированы целевые гены; ориентации рибофлавинового оперона, встроенного в тот пли иной участок вектора; дозы целевых генов, т.е. наличие в составе плазмиды двух копий оперона биосинтеза рибофлавина на стабильность штаммов В.виМШв п уровень биосинтеза целевого продукта.

Установлено, что при селекции геннопнженерных штаммов-продуцентов рибофлавина необходимо учитывать число копий гибридных плазмид, местоположение оперона и его ориентацию для достижения максимального уровня биосинтеза витамина В2-Для предложенной модели введение инвертированных повторов рибофлавинового оперона является неперспективным.

При изучении уровня биосинтеза рибофлавина в клетках модельного штамма В.зиЬйНзВ107 показано, что многокопийная плазмпда рАШЮ как в селективных, так и в неселективных условиях детерминирует биосинтез рибофлавина в 4-4.5 раза больший, чем низкокопийная плазмпда рМХ45, которая составляет основу современных продуцентов рибофлавина. Публикации. По материалам диссертации опубликовано две печатные работы. Результаты работы доложены на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пущено, 2000.

Структура и обьем работы. Диссертация содержит введение, обзор литературы, экпериментальную часть (описание объектов п методов, а также изложение результатов исследования),

обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы (129 литературных источника). Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит б таблиц и 21 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы. В работе использовали лабораторную коллекцию B.subtilis ribD107, ribA629, ribH16, ribG850, ribBllO, ribT16, a также их recE производные. E.coli DH5a, ribA4096.

Плазмиды. В работе использовали лабораторную коллекцию рМХЗО, рМХ45, рСВ20, pUC7Cm, pCRII.

Среды. Для культивирования B.subtillis использовали среды LB и СП1, состоящую из минимальной среды Спицайзена с добавлением 0.1% дрожжевого экстракта и 0.04% гидролизата казеина. При изучении уровня биосинтеза витамина В2 применяли среду СПЗ включающую в себя СП1 с добавлением 2% глюкозы. Для определения стабильности плазмид использовали среду СП4 содержащую минимальную среду Спицайзена с добавлением 0.04% гидролизата казеина. Для E.coli использовали среды LB и YT. Соответствующие твердые среды содержали 1.4% агара.

Антибиотики. Применяли в следущих концентрациях: Эритромицин (Em) - 10мкг/мл, хлорамфеникол (Cm) - 10мкг/мл, ампицилин (Атр) - 100мкг/мл, митомицин (Mit) - 0.05 и 0.005мкг/мл.

Определение уровня накопления рибофлавина. Штаммы выращивали на среде СП1 с добавлением эритромицина или хлорамфеникола при 37оС и активном перемешивании в течении 18-20 часов. Затем полученной культурой засевали колбы содержащие по 10мл. питательной среды СПЗ с добавлением соответствующего антибиотика и СПЗ без добавления антибиотика. Колбы помещали на качалку и культивировали при температуре 40оС в течении 48 часов, после чего измеряли концентрацию витамина В2 флюориметрическим методом.

Изучение уровня стабильности рекомбинантных плазмид. Плазмидосодержащие штаммы выращивали при 37оС и активном перемешивании в селективных условиях (среда СП4, содержащая 10мкг/мл эритромицина или хлорамфеникола) до достижения титра Бактериальные культуры разводили до конечного

титра около 100 кл/мл и выращивали при 40ОС и активном перемешивании в неселективных условиях (среда СП1) в течении, как минимум 20 генераций. Полученные культуры высевали на неселективные агаризованные среды с целью получения единичных колоний, которые, в количестве 200-250 штук, с помощью

стерильной зубочистки переносили на агаризованные питательные среды: СП1 с добавлением антибиотика и СП1 без антибиотика. После культивирования в течении 24 часов определяли соотношение клонов сохранивших и утерявших антибиотическую устойчивость.

Определение уровня копийности плазмид. Плазмидосодержащие штаммы выращивали в стандартном объеме среды СП1 с добавлением 10мкг/мл эритромицина или хлорамфеникола до середины экспоненциальной фазы роста. Далее проводили выделение и очистку плазмидной ДНК по методу Курье п Нестера. Полученные препараты разводили обьемом буфера ТЕ, прямо пропорциональным концентрации биомассы, которую определяли спектрофотометрически. Препараты плазмидной ДНК переводили в линейную форму с помощью расщепления по единичному участку EcoRI. Пробы ДНК наносили на 0.7% агарозный гель. После окончания электрофоретпческого разделения плазмидной ДНК определяли ее концентрацию по флуорисценции с бромистым этидием. В качестве маркеров применяли низкокопийную плазмиду рМХЗО (копийность 3 на клетку) и многокопийный вектор рСВ20 (около 30 копий на клетку), расщепленные EcoRI. На основании концентрации ДНК делали вывод о уровне копийности плазмид. Данный метод не может быть применен для определения истинной копийности плазмид, в частности из-за высокой загрязненности препаратов плазмидной ДНК хромосомной ДНК. Однако, используя этот метод, можно установить является-ли плазмида низко- или высококошшной.

Олигонуклеотиды. Все использованные в работе праймеры и адаптеры синтезированы в лаборатории нуклеотидного синтеза "Центра Биоинженирия" РАН под руководством Г.Е. Позмоговой.

ППР-амплификация. Схема ПЦР была следующей: "горячий" старт-95°С-1'-1 цикл, денатурацпя-95°С-30', отжиг-45°С-30', элонгация -72°С -250", количество циклов - 30. Реакцию проводили с помощью VentR ДНК - полимеразы.

Трансформация. Трансформацию B.subtilis проводили по модифицированному методу Анагностопулоса и Сппцайзена, трансформацию протопластов по методу Иманакп. E.coli- по модифицированному "кальциевому" методу Манделя и Хида.

Выделение плазмидной ДНК. Выделение и очистку ДНК проводили по модифицированному методу щелочного лизиса Бирмбойма и Доли. При определении уровня копийности плазмид применяли методику Курье и Нестера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Оптимизация оперона биосинтеза рибофлавина.

Оперон биосинтеза рибофлавина B.subtilis клонирован в гибридных плазмидах в составе EcoRI фрагмента размером около 10т.п.о. Вместе с тем, в соответствии с установленной первичной последователностью размер рибофлавинового оперона составляет 4.3т.п.о. Таким образом, клонированный EcoRI фрагмент включает около 6 т.п.о. "лишнего" для синтеза витамина В2 генетического материала (рис.1).

"Лишний" генетический материал не только увеличивает размер клонированного фрагмента, что часто снижает стабильность гибридных плазмид и затрудняет геннопнженерные манипуляции с ними, но и может влиять на эффективность экспрессии целевых генов и жизнеспособность геннонженерных штаммов-продуцентов.

В результате работы сконструирована многокопийная гибридная плазмида, содержащая фрагмент ДНК минимизированный до размеров оперона биосинтеза рибофлавина.

Для получения плазмиды pCRRIB проведена ПЦР-амплификация оперона биосинтеза рибофлавина (рис.1). В качестве матрицы использован EcoRI фрагмент плазмиды рМХ45 содержащий рибофлавиновый оперон. Для синтеза цепочки ДНК в прямом направлении применен праймер OF в обратном OR. Продукт ПЦР, содержащий рибофлавиновый оперон и фланкированный искуственными участками узнавания фермента EcoRI, лигировали с вектором pCRII и трансформировали штамм E.coli А4096 по устойчивости к ампициллину и прототрофности к рибофлавину. В результате трансформации получена плазмида pCRRIB, содержащая оперон биосинтеза витамина В2 размером 4.4т.п.о. (рис.1).

Затем рибофлавиновый оперон по EcoRI участку переклонирован на векторе рСВ20 в клетках B.subtilis. В результате получена плазмида pOR, содержащая в своем составе фрагмент ДНК размером 4.4т.п.о., включающий рибофлавиновый оперон (рис.1).

Плазмида pOR способна трансформировать гесЕб" рибофлавиновые ауксотрофы B.subtilis: G850, В110, А629, Н16, D107 к прототрофности по рибофлавину (табл-Nl). Кроме того, эти плазмидосодержащие штаммы при росте на среде Спицайзена обладают сверхсинтезом витамина В2, что указало на функционирование всех генов оперона биосинтеза рибофлавина, клонированного в составе плазмиды pOR.

EcoRI

ßgllli Bglll

1тпо

OF OR

EcoRI

Bglll,

-Bgl II

EcoRI l i EcoRI

EcoRI

ВашШ EU19035

EcoRI

рис N1 Схема конструирования плазмид pCRRIB и pOR.

Здесь и далее PO, G, В, А, Н, TD - последовательность генов оперона биосинтеза рибофлавина. Арг, Kmr, Emr, - устойчивость к ампициллину, канамицину и эритромицину, соответственно. EU19035 -экспрессионная едипица. oriE и oriB - точки начала репликации для E.coli и B.subtilis, соответственно. Стрелками обозначено направление транскрипции соответствующих генов, а также ориентация экспрессионной единицы.

Таблица N1 Способность плазмиды pOR восстанавливать прототрофность гесЕ6~ ауксотрофов B.subtilis.

штамм плазмида G850 гесЕб В110 гесЕб А629 гесЕб Н16 гесЕб Т1 DrecEö D107 гесЕб

pOR + + + + + +

Минимизация фрагмента хромосомы B.subtilis до размеров оперона биосинтеза рибофлавина облегчила дальнейшие работы по клонированию оперона в составе различных векторов и дала возможность подстраивать оперон под дополнительные промоторные области.

Получение нового поколения векторных молекул.

Векторы с механизмом репликации по типу катящегося кольца такие, как pUBllO, рЕ194, рС194 хоршо зарекомендовали себя при использовании в лабораторных целях в силу высокой степени их изученности и удобства при генноинженерных манипуляциях. Однако, они не могут быть применены для создания промышленных штаммов - продуцентов в силу невысокой стабильности поддержания клонированного генетического материала. Векторы с 8- механизмом репликации, напротив, стабильны и могут поддерживать вставки ДНК размером более Ют.п.о. Ряд таких плазмид применяется для создания промышленных штаммов - продуцентов. Например, плазмида рМХ45 успешно примененена для создания промышленного продуцента витамина В2- рМХ45 сконструирована на основе низкокопийного вектора рМХЗО, делеционного варианта стрептококовой плазмиды pSM19035, реплицирующейся по 0-механизму.

Целью данного этапа работы являлось конструирование многокопийных векторов на основе низкокопийной плазмиды рМХЗО и высококопийного вектора рСВ20, ведущих свое происхождение от плазмиды pSM19035.

Генетические локусы плазмиды рМХЗО (рис.2), отвечающие за репликацию плазмиды, уровень ее копийности и сегрегационной стабильности находятся в пределах фрагмента Hindni-G-F-B, размером около бт.п.о. Большая часть репликацпонного региона расположена в пределах F - фрагмента. Небольшая часть Rep -локуса также находится в пределах В - фрагмента, сор-локус картируется в пределах G, ген Res, отвечающий за антимультимеризацию расположен в пределах В - фрагмента.

рМХЗО содержит протяженные обратные повторы находящиеся в пределах C,H,D,H',C' HindIII-фрагментов плазмиды.

Первый этап данной работы заключалася в удалении повторяюшегося генетического материала, при этом планировали сохранить генетический материал, детерминирующий стабильность плазмиды рМХЗО, а также единичный участок EcoRI. Предполагали, что полученные векторные молекулы будут характеризоваться более высоким уровнем кошшности по сравнению с родительской плазмидой.

Для получения векторных молекул с вышеперечисленными свойствами была разработана следующая схема. Проводили неполное расщепление плазмиды рМХЗО рестриктазой Mbol с таким расчетом, чтобы средний размер фрагментов ДНК составлял около Ют.п.о. Полученную смесь фрагментов ДНК лигировалп с геном, кодирующим устойчивость к хлорамфениколу размером 1.1т.п.о., полученным в результате обработки плазмиды pUC7Cm ферментом BamHI и трансформировали штамм B.subtilisA629, содержащий плазмиду рМХЗО, по методу "спасения маркера". Отбор трансформантов проводили на среде СП1 с добавлением хлорамфеникола.

Отобранные клоны проверены на чуствительность к эритромицину. Из 264 колоний трансформантов 74 обладали искомым фенотипом Стг, Ems, остальные Стг, Em г .

Для определения размера полученных плазмид была выделена плазмидная ДНК из 30 клонов обладающих фенотипом CmT, Ems. Оказалось, что плазмиды с таким фенотипом имеют размер от 10 до 16т.л.о.

Рестрикционяый анализ Cmr, Ems плазмид показал что все они содержат участок EcoRI. Варианты 8, 21, 29 приобрели образовавшийся при ллгпрованип участок BamHI. При обработке Pstl из всех плазмид выщепляется последовательность нуклеотидов, размером около I.It.h.o. которая являетя геном, кодирующим устойчивость к хлорамфениколу. Для дальнейших исследований выбраны плазмиды pAR13 и pAR21, с наименьшим размером ДНК (рис.2).

С помощью рестрикционного анализа установлено, что векторы pAR13 и pAR21 (рис.2) содержат нативные HindIII-E-G-F-В-С фрагменты и часть Н фрагмента - (АН). рСМ21 несет часть А фрагмента - (АА). Полученные векторы не содержат прямых повторов и несут уникальный участок EcoRI. pAR13 и pAR21 включают в себя все известные в настоящее время генетические локусы, отвечающие за репликацию плазмиды рМХЗО, уровень ее

Hindill EcoRI

Hindill

Hindiii

Hindlll

Hindill

Hindill

Psti

Hindiii ДР

Hindlll

Hindlll

Hindlll

Hindlll

Hindiii' abvJL/d BamHI' 'Hindlll

Hindlll

Hindlll

Hindlll

Hindlll-L_J [Rep pAR13

10kb

.Res

H'ndl" Hindlll

Psti

Psti

Hindlll

EcoRI

Psti

Hindlll

Hindlll

Hindlll

рис. N 2 Рестрикционпая и генетическая карта векторов рМХЗО, pAR13, pAR21,pCB20, pARl.

А, Е, G, F, В, С, Н, D, Н', С', X - HindEH фрагменты плазмиды рМХЗО.

АА, AH, AF, AB- деледионные варианты фрагментов А, Н, F, В, соответственно. Rep- генетический локус кодирующий репликационный белок, сор - регеон ответственный за уровень копийности векторов. Res - ген ответственный за антимультемеризацию плазмид. kb - тысяч пар оснований. ■ - фрагменты векторов не являющиеся частью плазмиды

рМХЗО.

коппйности и сегрегационной стабильности. Повидимому, именно этим, объясняется высокий уровень стабильности этих плазмид в клетках штамма B.subtilisD107 (табл.N2).

По предварительным данным (определение концентрации ДНК по флуоресценции с бромистым этидием в агарозном геле) копийность векторов pAR13 и pAR21 выше таковой у плазмиды рМХЗО. Такой результат может представлятся достаточно неожиданным, поскольку все полученные ранее многокопийные плазмиды - варианты рМХЗО имели различные делеции в сор -локусе. Однако существуют данные о том, что незначительное увеличение копийности плазмид может наблюдаться также и при удалении фрагментов ДНК не включающих в себя сор-локусы.

На втором этапе данного исследования на основе вектора рСВ20 сконструирован вектор pARl.

Высококопийный вектор рСВ20 способен размножаться, как в клетках B.subtilis, так и в клетках E.coli. Эта плазмида создана путем слияния минимального решшкона вектора рМХЗО и плазмиды pUC18. Размер фрагмента плазмиды рСВ20, отвечающего за репликацию и устойчивось к эритромицину в клетках B.subtilis составляет 4.5т.п.о. Вектор рСВ20 содержит фрагмент размером около Зт.п.о., который отвечает за репликацию и устойчивость к ампициллину в клетках E.coli (рис.2).

На стабильность многокопийных векторов в клетках B.subtilis в значительной степени влияет наличие гетерогенного генетического материала. В связи с этим нами была удалена часть плазмиды, которая детерминирует устойчивость к ампициллину и способность размножаться в клетках Е. coli.

Сначала участок Pstl заменен на сайт EcoRI. Для этого ДНК рСВ20, расщепленную Pstl, лпгировалп с адаптером AI. Лигированую смесь обрабатывали Pstl и трансформировали штамм B.subtilisD107, с отбором трансформантов по устойчивости к эритромицину. В результате получена плазмида pAR20, размером 7.6т.п.о., содержащая в своем составе участок EcoRI вместо Pstl.

Далее pAR20 обрабатывали EcoRI, после чего выделяли из агарозного геля фрагмент ДНК размером 4.5т.п.о., содержащий в своем составе маркер усойчивости к эритромицину и репликон (Rep). После очистки фрагмент обрабатывали ДНК-лпгазой и трансформировали штамм B.subtilisDl07 с отбором трансформантов по устойчивости к эритромицину. В результате получена плазмида pARl, размером около 4.5т.п.о. (рис.2).

Установлено, что уровень стабильности векторов рАИ1 и рСВ20 примерно одинаков и составляет 49 и 45% соответственно. Таким образом, гетерогенный генетический материал в виде части вектора р11С18 не дестабилизирует вектор рСВ20 в клетках штамма В.зиМШзВ107 (табл.N2).

Таблица N2 Стабильность различных векторов в штамме В.виЬШ1и0107.

плазмиды Распределение клонов в зависимости от фенотипа Стабильность в процентах

общее число клонов Ап^

рМХЗО 402 402 0 100

рАШЗ 401 401 0 100

рАИ21 410 410 0 100

рСВ20 414 161 253 45

рАШ 832 405 427 49

Ап^* . При культивировании штаммов, содержащих плазмиды рАШЗ и рАЛ21 в питательную среду добавляли хлорамфеникол. Культивирование остальных плазмидосодержащих штаммов проводили в присутствии эритромицина.

В результате работы сконструирован ряд плазмидных векторов, созданных на основе низкокопийного вектора рМХЗО. Многокопийные векторы рАШЗ и рАЕ.21 имеют высокий уровень стабильности, характерный для родительской плазмиды.

На следующем этапе минимизированный фрагмент хромосомы В.виЫдИз, содержащий рибофлавиновый оперон клонирован в составе полученных плазмидных векторов.

Клонирование оптимизированного рибофлавипового оперопа в составе полученных плазмидных векторов.

Ранее не удалось создать стабильные многокопийные плазмиды, содержащие рибофлавиновый оперон. Мы надеялись, что клонировав "оптимизированный" оперон биосинтеза витамина В2 в составе полученных нами многокопийных плазмидных векторов мы приблизимся к полученю стабильных многокопийных плазмид, которые могли бы быть применены для создания промышленных штаммов - продуцентов рибофлавина.

Оперон биосинтеза рибофлавина клонирован по ЕсоШ сайту в составе векторов рАК13 и рАК.21. В результате получены плазмиды рАШ.31, рАН211, рАЕ.212, содержащие в своем составе оперон биосинтеза рибофлавина размером 4.4т.п.о. У плазмид рАН211 п рАШ31 направление транскрипции р.ф. оперона и релпикацип плазмиды совпадают ("прямая" ориентация), а у плазмиды рАЛ212 репликация плазмиды и транскрипция оперона контрнаправлены ("обратная" ориентация) (рис.3).

ЕсоМ

ЕсоК!

1грям ал орнбхтахсвя

прямая ориентация

ЕсоК!

ЕсоМ

рис. N3 Рестрикционная н генетическая карта плазмид рАК131, рА11211 и рА11212.

"обратная ориентация

Клонирование рибофлавпнового оперона в составе векторов рАШ и рСВ20 предпологалось вести как по сайту ЕсоШ, так и по сайту ВамШ.

Плазмиды рАИЕ и рОЫ получены путем клонирования рибофлавинового оперона на векторах рАШ н рСВ20 по ЕсоШ сайту. При этом у обеих плазмид оперон встроен в "прямой" ориентации (рис.4).

Плазмиды рАВШ) и рАЫВ1 содержат рибофлавиновый оперон, клонированный по ВатН1 сайту. У плазмид рАИВБ и

ЕсоИ

ВатШ ЕШ9035

14

ЕсоЫ

оп В

Е1ЛЭ035

Ет

рАК1

4-&П10

ВатШ

прямая ориентация

ЕсоШ

ВатШ

прямая ориентация

ЕсоИ

ЕсоШ

ВатШ

ЕсеЮ

ЕсоЫ

ВатШ

"обратная ориентация

ВатШ

ЕсоШ

ВатШ

обратная" ориентация

ЕсоШ

прямая ориентация

ВатШ

ВатШ

ВатШ

рис. N4 Генетическая карта штзлгад рСВ20, р011, р01115, рАК1, рАК-Е, рАЕ,ВБ, рАИВ!.

рОН15 оперон встроен в "прямой" а у плазмиды рАГШЕ в "обратной" ориентаии (рис.4).

На основе плазмид рАИВБ и рАИВ1 получены рекомбпнантные плазмиды рАИВБЕ и рАЛВГЕ, содержащие в своем составе в виде инвертированого повтора два оперона биосинтеза рибофлавина, причем инвертированный повтор составляет 66% от контурной длинны плазмидной молекулы (рис.5).

рис. N5 Генетическая карта плазмид pARE.DE и рАЛВ1Е, содержащих обратные повторы рибофлавиновых оперонов.

В ходе первых трех этапов работы создана модель для изучения влияния нескольких характеристик гибридных плазмид на их стабильность и уровень экспрессии целевого продукта. Такими характеристиками являются:

-Копийность вектора.

-Участок, по которому клонированы целевые гены (локализация оперона в составе вектора).

-Ориентация целевых генов, встроенных в тот или иной сайт.

-Доза целевых генов т.е. наличие в составе плазмиды двух копий целевых генов.

Исследование свойств полученных плазмид в клетках штамма

В.8иЫШ80107.

Полученные плазмиды протестированы на уровень стабильности и витаминообразования в клетках модельного штамма В.БиЫШзВ107.

Рассмотрим влияние различных характеристик гибридных плазмид на стабильность гибридных плазмид и уровень биосинтеза рибофлавина.

—Тип. маркера антибиотической устойчивости.

Плазмиды pAR131, pAR211, pAR.212, созданные на основе векторов pARl3 и pAR21, несут маркер устойчивости к хлорамфениколу. Плазмиды pARBD, pARBDE, pARBI и т.д., сконструированные на основе векторов pARl и рСВ20 определяют устойчивость клеток B.subtilis к эритромицину.

Показано, что для плазмид, кодирующих устойчивость к хлорамфениколу, не наблюдается корреляции между уровнем биосинтеза рибофлавина в селективных и неселективных условиях, в зависимости от уровня стабильности. Штамм B.subtilisD107 pAR212 как в селективных, так и в неселективных условиях синтезирует около 180 мг/л витамина (рис.6). Уровень стабильности этого штамма составляет около 78%, следовательно штамм нестабилен даже при культивировании в присутствии хлорамфеникола. Анологнчные данные получены и при изучении уровня биосинтеза витамина штаммами B.subtilisD107 pAR211 и B.subtilisD107 pAR131 (рис.6).

Для плазмид, кодирующих устойчивость к эритромицину, напротив наблюдается корреляция между уровнем биосинтеза рибофлавина в селективных и в неселективных условиях, в зависимости от уровня стабильности (рис.6).

Проявление нестабильности плазмид, созданных на основе векторов pAR13 и pAR21 при культивировании в селективных условиях можно объяснить следующим образом. Плазмидная устойчивость к хлорамфениколу определяется экзоферментом-хлорамфениколацилтрансферазой, которая инактивирует антибиотик. После инактивации хлорамфеникола в культуре появляется возможность для накопления бесплазмидных клеток.

Экспрессия гена устойчивости к эритромицину не приводит к инактивации антибиотика в среде. Поэтому при культивировании штаммов в присутствии эритормицина популяция клеток однородна, следовательно сегрегационная нестабильность штаммов не проявляется.

Таким образом, стабильность штаммов, а следовательно и уровень биосинтеза рибофлавина, при культивировании в селективных условиях, зависят от вида антибиотического маркера.

—Копийность вектора.

Влияние копийности вектора на стабильность плазмид и уровень биосинтеза витамина В2 можно проследить на примере

плазмид рМХ45 и pAR212. Обе плазмиды рМХ45 и pAR212 содержат рибофлавиновый оперон, клонированный по EcoRI участку в "обратной" ориентации на векторах рМХЗО и pAR21, соответственно. Как уже было указано выше, вектор pAR21 является многокопийным по сравнению с рМХЗО. В результате определения уровня витаминообразованпя штамма B.subtilisD107 pAR212 показано, что он, как в селективных, так и неселективных условиях синтезирует приблизительно в 2 раза больше витамина В2, чем штамм B.subtilisD107 рМХ45 (рис.6).

Таким образом, как и следовало ожидать, повышение копийностп вектора, при прочих равных условиях (уровень стабильности вектора, локализация и ориентация рибофлавинового оперона), приводит к более высокому уровню экспресси генов рибофлавинового оперона.

Вектор pAR212 характеризуется 100% уровнем стабильности в штамме B.subtilisD107 (рис.6). pAR212, являясь делеционным вариантом рМХЗО, содержит все известные в настоящее время генетические локусы родительской плазмиды, отвечающие за ее стабильное наследование (рис.2). Плазмида рМХ45 проявляет 100% уровень стабильности в штамме B.subtilisD107. Можно было бы предположить, что и плазмида pAR212 будет иметь такой-же уровень стабильности в модельном штамме. Однако, уровень стабильности pAR2l2 достигает лишь 78% (рис.6). Возможно, у вектора рМХЗО имеются неизвестные до сего времени генетические локусы, отвечающие за ее стабильное наследование. Эти локусы могли быть удалены в процессе получения вектора pAR212. Но скорее всего, снижение уровня стабильности плазмиды pAR212 по-сравненпю с рМХ45 обусловлено эффектом "метаболической нагрузки", возникающим в результате более высокого уровня экспрессии рибофлавинового оперона, клонированного в составе многокопийного вектора pAR21.

-Участок, по которому клонирован рибофлавиновый оперон (локализация оперона в составе вектора).

Влияние участка вектора, по которому клонирован рибофлавиновый оперон, на стабильность плазмид и уровень биосинтеза витамина В2 можно наиболее ярко проиллюстрировать на примере плазмид pOR и pOR15, а также pARE и pARBD. Плазмиды pOR и pOR15 сконструированы на основе вектора рСВ20, a pARE и pARBD на основе pARl. Оба вектора рСВ20 и pARE (рис.2) сконструированы на основе минимального решшкона плазмиды рМХЗО. Плазмиды pOR и pARE несут рибофлавиновый оперон, клонированный по EcoRI участку в "прямой" ориентации.

Плазмиды рОН15 и рАШШ содержат оперон, встроенный в ВатШ участок в "прямой" ориентации.

При культивировании штаммов В.виЫ.ШвВ107 содержащих плазмиды рОЫ и рАИЕ (оперон клонирован по ЕсоШ участку) установлено, что в селективных условиях уровень биосинтеза рибофлавина для обоих штаммов достигает примерно 220 мг/л (рис.6). Штаммы В..чиМШзВ107 рОК15 и В.БиЫШзВ107 рАНВБ в селективных условиях синтезируют около 450мг/л витамина В2-Следовательно, наблюдается двукратное различие уровня биосинтеза рибофлавина в зависимости от локализации оперона.

В данном случае, двукратное увеличение биосинтеза рибофлавина детерминируемое плазмидами рАНВБ и рОН15 по сравнению с рСЖ и рАНЕ повидимому связано с наличием трех дополнительных промоторов перед ВатШ участками векторов рАШ и рСВ20 (рис.4), в которые рибофлавиновый оперон встроен в ориентации, возможной для его дополнительной транскрипции с этих промоторов.

В неселективных условиях штаммы В.зиЫШ.зВ107 рСЖ и В.зиЫШзВ107 рАЛЕ синтезируют около 110 мг/л рибофлавина, то-есть в 3-4 раза меньше, чем модельные штаммы, содержащие плазмиды рАЛВБ и рОШб (рис.6).

В данном случае, различный уровень биосинтеза связан не только с дополнительной транскрипцией рибофлавинового оперона, но и с различным уровнем стабильности плазмид в зависимости от локализации оперона. Уровень стабильности плазмид рСЖ и рАЛЕ не превышает 10% (рис.6), в то время как уровень стабильности плазмиды рОШ5 составляет 76%, а плазмиды рАЛВО достигает стопроцентного уровня.

Вектор рСВ20 отличается от рАН1 наличием гетерогенного генетического материрала, размером около Зт.п.о. Эти векторы имеют приблизительно одинаковый уровень стабильности 45 и 49%, соответственно (рис.6). Стабильность плазмид рОК15 и рАКВБ, у которых рибофлавиновый оперон встроен по ВатШ участку в "прямой" ориентации, на векторах рСВ20 и рАИ1, составляет 76 и 100%, соответственно. Возможно, менее высокий уровень стабильности плазмиды рОШ5 относительно рАЕ1ВБ определяется наличием вектора р11С18 в составе плазмиды р(Ш15.

Из вышеизложенного следует, что клонирование рибофлавинового оперона в ВатШ участок векторов рСВ20 и рАШ в "прямой" ориентации стабилизирует эти исходно нестабильные векторы (рис.6). Мы затрудняемся объяснить данный феномен. Можно лишь отметить, что ранее подобный факт был

зафиксирован при исследовании стабильности вектора рСВ20, в составе которого по ВатН1 сайту в "прямой" ориентации клонирован ген пируватдекарбоксилазы.

Таким образом, в силу разных причин, стабильность наследования рибофлавинового оперона и уровень биосинтеза рибофлавина в клетках штамма В.зиЫШзОЮ7 в значительной степени зависит от локализации оперона биосинтеза рибофлавина.

—Ориентация рибофлавинового оперона, встроенного в тот или иной участок.

Влияние ориентации оперона биосинтеза рибофлавина, встроенного в различные участки векторов, на стабильность плазмпд и уровень биосинтеза витамина В2 можно показать на примере плазмид рАН211 и рА11212, у которых рибофлавиновый оперон встроен по ЕсоШ участку в "прямой" и "обратной" ориентацпях, соответственно, а также на примере плазмид рАИВБ и рА11В1, у которых оперон клонирован по ВатН1 участку вектора рАНЕ, в различной ориентации.

Штамм В.зиЫШзОЮ7 рАД212 как в селективных, так и в неселективных условиях синтезирует в 3-4 раза больше рибофлавина, чем штамм В.зиМШзОЮ7 рАЛ211 (рис.6). Скорее всего, такая значительная разница в уровне биосинтеза обусловлена невысоким, около 6%, уровнем стабильности плазмпды рАИ211 по сравнению с рА11212, уровень стабильности которой составляет 78% (рис.6).

Аналогичную картину можно наблюдать при сравнении уровня биосинтеза рибофлавина штаммами В.БиЫ;Ш8Б107 рАГШБ и В.БиЫШзБ107 рАЛВ1. В селективных условиях штамм В.8иЫШ&ОЮ7 рАНВБ синтезирует около 460мг/л рибофлавина, а штамм В.зиЬШ1зВ107 рАЕШ1 способен синтезировать лишь около 100мг/л рибофлавина (рис.6).

В данном случае, столь значительная разница в уровне биосинтеза рибофлавина может быть объяснена рядом причин. Как уже было указано выше рибофлавиновый оперон, который несет плазмида рАЕШБ встроен в ориентации возможной для его транскрипции с дополнительных промоторов, в то время, как дополнительная транскрипция оперона плазмиды рАЛВ1 невозможна. Поскольку у плазмиды рАЕВ1 оперон клонирован в ориентации предполагающей его транскрипцию в реплнкацпонную область, а оперон биосинтеза рибофлавина не имеет надежных терминаторов, вполне возможна ситуация, при которой неконтролируемая транскрипция оперона будет приводить к проскоку в область репликации плазмиды. Что может приводить к

уменьшению конийности плазмиды рАИВ1 относительно рАШШ и, следовательно, более низкому уровню биосинтеза рибофлавина.

В неселективных условиях уровень биосинтеза рибофлавина в штамме В.зиМШзВ107, детерминируемый плазмидами рА1ШО и рАНВ1 различается приблизительно в 200 раз (рис.6). Причиной этого, по всей видимости, являются вышеописанные явления, действия которых усугубляет отсутствие селективного фактора при очень высоком уровне нестабильности плазмиды рАЛВ1.

Исходя из вышеизложенного, следует, что стабильность плазмид и уровень биосинтеза рибофлавина в модельном штамме В.виЫШэ зависят от ориентации рибофлавинового оперона, встроенного в тот или иной сайт вектора.

—Доза целевых генов, т.е. наличие в составе плазмиды двух копий целевых генов.

Для изучения влияния дупликации рибофлавинового оперона на стабильность гибридных плазмид и уровень биосинтеза рибофлавина сконструированы плазмиды рАИВБЕ и рАНВЕЕ, в составе которых в виде инвертированных повторов клонированы две копии рибофлавинового оперона.

При определении уровня биосинтеза рибофлавина штаммом В.БиЬШЫНО? рАЕВВЕ установлено, что в селективных условиях он синтезирует в полтора раза меньше витамина В2, чем штамм В.виЪШшОЮ? рА11ВВ (рис.6). Возможно, клонирование дополнительной копии рибофлавинового оперона в составе плазмиды рАВВВ, тем или иным образом снижает копийность рА1ШВ, что приводит к снижению уровня биосинтеза рибофлавина.

Установлено, что в неселективных условиях уровень биосинтеза рибофлавина, детерминируемый плазмидой рАДВВЕ в клетках модельного штамма в два раза ниже, чем уровень синтеза витамина штаммом В.8иЬШ1БВ107 рАДВВ (рис.6). Понижение уровня биосинтеза можно связать с более низким уровнем стабильности плазмиды рАЛВВЕ, относительно рАЫВВ. И возможным понижением конийности рАИВВЕ по сравнению с рАЙВВ.

Таким образом, в данном случае, дупликация рибофлавинового оперона влияет на уровень стабильности плазмид и уровень биосинтеза рибофлавина в клетках штамма В.8иМШ8Б107.

Уровень биосинтеза рибофлавина штаммом В.5иМШзВ107, содержащим плазмиду рАКВ1Е как в селективных, так и в неселективных условиях, также как и уровень стабильности,

практически не отличается от таковых у штамма В.зиЬШ1зБ107 рАЛВ1 (рис.6). Следовательно, в данном случае дупликация рпбофлавинового онерона не влияет на уровень стабильности и биосинтеза рибофлавина в клетках штамма В.5иЬШ1зБ107.

Исходя из полученных данных, можно считать, что для разработанной модели нет особых преимуществ обратных повторов ДНК в гибридной плазмиде для достижения сверхсинтеза целевого продукта.

Вамг/л

плазми-да PAJR131 pAR211 PAR212 pOR POR15 рАВЕ pARBI pAKiJIE pAKBD pAHBDE pMX45

стабиль ность 7 6 78 3 76 6.5 0 0 100 46 100

вектор PAR13 рАК21 рСВ20 pÂRl рМХЗО

стабильность 100 100 45 49 100

рис.N6 Уровень биосинтеза витамина В2 (мг/л) и стабильность плазмид (%) в штамме В.зиМШз Б107.

*—Хлорамфеникол при культивировании штаммов, содержащих плазмиды рАШ31, рА11211 и рАН212. Эритромицин при культивировании остальных плазмидосодержащих штаммов.

Суммируем вышеизложенное. При исследовании разработанной модели установлено, что уровень биосинтеза целевого продукта и стабильность наследования рибофлавинового оперона в клетках модельного штамма B.subtilis могут зависить от типа маркера антибиотической устойчивости, копийности плазмид, местоположения оперона в составе гибридных плазмид, его ориентации и дупликации.

Таким образом при селекции генноинженерных штаммов -продуцентов рибофлавина необходимо учитывать важность числа копий гибридных плазмид, местоположения оперона и его ориентации для достижения максимального уровня биосинтеза витамина В2. Для предложенной модели, введение инвертированных повторов рибофлавинового оперона является неперспективным.

Приемуществом нашей модели является тот факт, что экспрессия рибофлавинового оперона в клетках B.subtilis четко выражается фенотипически. То-есть, при росте плазмидосодержахцих штаммов на твердых питательных средах можно наблюдать появление ярко желтого ореола вокруг отдельных бактериальных колоний. Следовательно можно легко исследовать не только сегрегационную, но и структурную стабильность плазмид, несущих рибофлавиновый оперон.

Исследование стабильности плазмид по рибофлавиновому маркеру осуществляли путем выявления колоний, у которых при сохранении устойчивости к эритромицину или хлорамфениколу отсутствует желтая окраска, что свидетельствует о неспособности к сверхсинтезу витамина В2- Такой фенотип обнаружен только для штамма B.subtilisD107 pARBD. Около 5% популяции этого штамма при сохранении устойчивости к эритромицину неспособны к сверхсинтезу рибофлавина, на это указало отсутствие желтой окраски у колоний этой части популяции. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, выделенной из всех имеющихся сегрегантов показал, что причиной этого является делеция размером около 500п.о. в области гена ribB оперона. Полученный делеционный вариант плазмиды pARBD обозначен как pAR81. С помощью трансформации различных рибофлавиновых ауксотрофов B.subtilis плазмидой pAR81 подтверждено, что произошла делеция в области гена ribB (табл.ЫЗ). Таким образом, при значительном увеличении уровня синтеза рибофлавина в данном случае и 100% сегрегационной стабильности при клонировании оперона биосинтеза рибофлавина по сайту BamHI на векторе pARl в

"прямой" ориентации, возникает структурная нестабильность в области рибофлавинового оперона.

Таблица N3 Способность плазмиды рАИ81 воостанавливать прототрофность гесЕб- ауксотрофов В.БиЫШз.

штамм плазмида в850 гесЕб В110 гесЕб А629 гесЕб Н16 гесЕб Т1 гесЕб Б107 гесЕб

рАЛ81 + — + + + +

Из результатов работы следует, что штамм В.зиЫ11Ь50107 рАИВБ способен к четырехкратному увеличению уровня биосинтеза рибофлавина, как в селективных, так и в неселективных условиях, по сравнению с В.8иЫШ&В107 рМХ45. Плазмида рАИВО имеет 95-процентный уровень общей стабильности в клетках модельного штамма и может быть протестирована в промышленном штамме - продуценте В.БиМШв.

ВЫВОДЫ.

1.Фрагмент ДНК хромосомы В.зиЫШз размером около Ют.п.о., содержащий оперон бисинтеза рибофлавина размером 4.4т.п.о., с помощью ПЦР, минимизирован до размеров оперона биосинтеза рибофлавина.

2.На основе стабильной низкокошшной плазмиды рМХЗО сконструирована серия новых многокопппных векторов для клонирования ДНК в клетках В.зиМШв. Векторы рАШЗ и рАН21 имеют высокий уровень стабильности, характерный для родительской плазмиды.

3.Создана модель для изучения влияния различных характеристик гибридных плазмид, а именно: типа маркера антибиотической устойчивости, копийности плазмид, участка по которому клонирован рибофлавиновый оперон, ориентации оперона встроенного в тот или иной участок вектора, наличия в составе плазмид обратных повторов оперона на стабильность штаммов В.виЫШз и уровень биосинтеза рибофлавина.

4.Установлено, что при селекции генноинженерных штаммов - продуцентов рибофлавина необходимо учитывать число копий гибридных плазмид, местоположение оперона п его ориентацию для достижения максимального уровня биосинтеза витамина В2-Для предложенной модели, введение инвертированных повторов рибофлавинового оперона является неперспективным.

5.Из результатов анализа стабильности плазмид и детерминируемого ими уровня синтеза рибофлавина в штамме B.subtilisD107 следует, что наиболее перспективными для создания промышленных штаммов - продуцентов витамина В2 являются плазмиды pORl 5 и pARBDE, несущие "оптимизированный" оперон биосинтеза рибофлавина, встроенный по сайту ВатШ в "прямой" ориентации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Ракитин А. Л., Голышин П.Н., Добржанская Е.О. // "Клонирование оперона биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis в составе различных по размеру фрагментов ДНК на многокопийном векторе". Биотехнология, 1988, N4, С.37-43.

2.РакитинА.Л. // "Локализация и ориентация клонированного генетического материала определяют стабильность гибридных плазмид и уровень биосинтеза целевого продукта". Горизонты физико-химической биологии. Тезисы стендовых сообщений, Пущино, 2000.