Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация параметров культивирования рекомбинантного rec+ штамма Bacillus subtilus и разработка промышленной технологии биосинтеза рибофлавина на основе этого штамма

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация параметров культивирования рекомбинантного rec+ штамма Bacillus subtilus и разработка промышленной технологии биосинтеза рибофлавина на основе этого штамма"

XV и VIII пассажай, клонировали и определяли характеристики кланов при культивировании в пробирках на жидкой питательной среда (ТаСл.1),

Таблица 1. Влияние планирования на характеристики штамма B.SUbtiliS 53D(pMX45)U2-66

I Исходная культура Культура посла IV пассажа Культура после! VIII пдссажа 1

OD ед Rib г/л OD ед Rib г/л OD ед Rib * г/л 1

Сроднее ¡ значение 29.1 2.9 29.2 1.4 29.3 0.6 I

1 ............................ 1 Диспэрсия 2.93 0.04 2.66 0.19 2.95 0.12 J

Результаты, полученные при культивировании клонов, покб-зыпают, что исходная культура достаточно гомогенна. Средняя ахтионость культур после IV пассажа снизились в 2 рягм, посла VIII пассвжа - а 5 раз, однако ростоеыо характеристики практически но изменились, что свидоталъствувт о значительной снижении удпяьной актианости клеток. Также сущэстввмно возросла гетерогенность популяций пассированных культур по показателю активности.

Поскольку итамн B.subtllis 53D(pMX45)62-66 - rec+ штамм, т.о. штамм, который подвержен рокомбинационным изменениям, снижение активности культуры, полученной посла VIII пассажа (0.6 г/л Rib), hhäc уровня активности реципиентного штамма Y 6 (1,5 г/л Rib) может Сыть связано с возможными рекомбинациями можду плзэмидной и хромосомалъной ДНК. Очевидно, что при создании промышленной технологии культивирования высокопродуктивного рвкомбинантного штамма B.subtilis 53D(pMX45)62-66 важно учитывать особенности гас+ штаммов. Это означает, что при приготовлении свежего посевного материала следует свести к минимуму количество пассажей, т.е. использовать только культуру, полученную непосредственно из рабочего музея.

Оптимизация условий приготовления инокулята. Приготовление

8

4 ..............._

льнов, так как во многом определяет весь ход дальнейшей дик. Учитывая генетические особенности культуры ^^НЯ Х1в 530(рНХ45)62-б6, представлялось необходимым определить

ле условий приготовления инокулята на стабильность и вность культуры. При исследовании влияния температуры выращивания инокулята .среда ЬВ-бульон с эритромицином) на биосинтетическую активность |■ клеток было выявлено, что максимальное накопление рибофлавина

Я инокулятом происходит при 41°С (Рис.1). При других температурных

Г / Рисунок 1. Влияние температуры (<:) на удельную активность (в) инокулята штамма В.виЬЪШв 53Р(рКХ45)б2-6б _________

0.08

0 06

0 04

0 0:

t - температура культивирования, °С

О - удельная активность культуры, Я - ШЬ/ос, г/л*ед ОР

режимах удельная активность (0) клеток снижалась - при боле« низких, по-видимому, за счет снижения эффективности работь Ферментов биосинтеза рибофлавина, а при температурах выше 41"С, в основном, в результате структурной дестабилизации плазмиды. Пр1 культивировании при 45°С на среде с эритромицином мы наблюдет сохранение культурой устойчивости к антибиотику, чт(

V % о 9 О «

о f- А Ъ V 2, t *

® Л о

® Ç» -р.

' %■ * о

Л \\%Л%

\ Ъ "Ь

•4 * в -

Также мы определили оптимальное время выращивания инокулята. :азалось, что для засева ферментера следует использовать 'льтуру, находящуюся в конце логарифмической фазы роста (8 -10 ic роста), что обеспечивает практически максимальный уровень >копления биомассы. Дальнейшее культивирование может привести снижение активности клеток. Возраст инокулята по крайней мере > 10 час выращивания не оказывает существенного влияния на фактеристики культур при ферментации (Рис.2). При примерно (инаковом уровне накопления биомассы (00) разница показателей ;тивности культур (Rib) находится в пределах 10% после 66 час гльтивировакия и составляет 5.5 + 0.5 г/л Rib.

оптимизация условий культивирования штамма B.subtllls ID(РМХ45)62-66. На первой стадии работы по оптимизации фаметров культивирования, проведенной в колбовых условиях, было феделено, что максимальный уровень накопления рибофлавина 1блюдается при использовании глюкозы, сахарозы или осахаренного >ахмала как углеводного субстрата и кукурузного и дрожжевого сстрактов в качестве источников амииного азота и ростовых »Кторов.

Выбор основных условий ферментации (температуры, аэрации, юлотности среды) проводили в лабораторных ферментерах при гльтивировании в режиме дробной подачи основных субстратов, как !Тода ферментации, обеспечившего высокую продуктивность гльтуры. В экспериментах использовали в качестве исходной среду, >держащую 10 г/л глюкозы, 1.5 г/л дрожжевого экстракта, шеральные соли, микроэлементы и эритромицин. С подпиткой давали глюкозу и кукурузный экстракт с оптимизированной ;оростью 3 г/л*час в расчете на глюкозу до достижения конечных >нцентраций этих субстратов (200 г/л и 75 мл/л соответственно), i определили, что при данной скорости подачи подпитки культура юсобна продуцировать до 7.1 г/л Rib. При этом на некоторых тапах Ферментации скорость биосинтеза рибофлавина достигала 0.19 'л*час.

Мы изучили влияние кислотности среды на рост культуры и юсинтез рибофлавина (Рис.3).

Мы определили, что хотя оптимальные значения кислотности цпя

пути биосинтезе рибофлавина из ключевого ¿енника ГТФ лежат а основном в щелочной аоне (Foor at аз laut et al, 1976? Burrows et al, 1978), штамм B.subtili rfX45)62-66 обладает высокой продуктивностью в интервал <ений рн, близким к нейтральным. Это согласуется с

рисунок 3. Влияние кислотности среды на рост культуры B.subtilis 530(рИХ45)62-66 (OD) и биосинтез рибофлавина (Rib)

OD - уровень накопления биомассы, ед 00

Rib - активность культуры, концентрация рибофлавина, г/л

литературными данными об оптимальных значениях кислотности срез для роста культур В.БиЫ;1.115 - продуцентов рибофлавина (Олешк< 1981; Соколов и др., 1989). Продукция рибофлавина коррелирова1 с ростом культуры, т.е. кислотность среды определяла накоплен! биомассы и не влияла существенно на удельную активность культур!

В дальнейшей работе Ферментации проводили при значениях | 6.в - 7.2, обеспечиваемых автоматической подачей в культуральн; жидкость щелочи (12.5* ПН40Н) и кислоты (10%об Н2504). -. '

Парциальное давление кислорода в культуральноИ жидкое вшЛют на биосинтетическую активность продуцентов риСофлавн

(Шавловский, 1970; Уатапе въ а1, 1993). При культивировании в ферментере концентрацию растворенного кислорода регулировали варьированием скорости премешивания. Мы опроОнровяли режимы с автоматическим контролем скорости перемешивания (уровень стабилизации р02 - 20* от насыщения), и режимы с различной постоянной скорость» перемешивания. Для характеристики условий массообмена при различных режимах аэрации н перемешивания нами были определены сульфитные числа (Табл.3).

Таблица 3. Влияние перемешивания на рост биомассы и биосинтез рибофлавина культурой В.виЬЗДИа 330(рМХ45)62-6б

Скорость вращения Сульфитное

мешалки, число, OD Rib

об/мин г02/л*час ед г/л

800 1.8 100 ' 6.1

1000 2.4 100 7.0

1150 2.8 120 7.9

переменная,

(р02 - 20%) — 120 8.0

Результаты экспериментов показали, что пггамм B.subtilis 53D(рМХ45)62-66 чувствителен к концентрации растворенного кислорода в среде. Скорость вращений мешалки 1150 об/мин, как и ведение процесса с автоматическим регулированием для поддержания концентрации растворенного кислорода на уровне 20% от насыщения, позволили обеспечить накопление целевого продукта в концентрации около 8.0 г/л Rlb. Учитывая результаты экспериментов в последующей работе мы использовали следующий ступенчатый режим перемешивания; в течение первых 18 - 20 час культивирования скорость вращения мешалки устанавливали на уровне 800 об/мин {1.8 г02/л*час), далее - 1150 об/мин (2.8 г02/л*час). При этом концентрация растворенного кислорода после падения со 100% поддерживалась, на уровне 10 - 20* от насыщения. В условиях же лимитирования по кислороду при утилизации глюкозы происходит переключение с ЦТК и пентозо-фосфатного пути на гликолиз и анаэробное окисление субстрата (Doelle et al, 1989; Готтшалк, 1982), в результате чего снижается выход рибофлавина.

Увеличение аэрации воздухом (более 0.6 - 0.7 л/л*мин) при

культивировании штамма в выбранных нами условиях перемешивания не оказало существенного влияния на величину парциального давления кислорода в культуральной жидкости и показатели ферментации.

Данные исследований влияния температурных режимов на характеристики инокулята (Рис.1) показали увеличение удельной активности культуры при выращивании при температуре 41"С. В процессе исследования регулирующего действия температуры на биосинтетическую активность штамма В.виЬЗДИв 530(рМХ45)62-6б при культивировании в ферментере мы подтвердили, что максимальное накопление рибофлавина происходит в интервале температур (О 40 42°С (Табл.4).

Таблица 4. влияние температуры культивирования на показатели Ферментации культуры В.виьеШв 530(рИХ45)б2-бб

Показатели ферментации 8

00 МЬ Т1 Р Ртах 1

•с ед г/л час г/л*час г/л*час|

34 95 3.8 66 0.06 0.08 I

37 120 7.8 66 0.12 0.18 8

40 120 8.5 54 0.16 0.20 8

42 125 8.7 4« 0.18 0.24 I

45 105 2.1 54 0.04 0.10 1

Результаты, приведенные в Таблице 5, показывают, что при культивировании . штамма при 40 - 42°С время достижения максимальной концентрации рибофлавина в культуральной жидкости (Т1) значительно сокращается, что улучшает технологические показатели процесса ферментации. При этом культура продуцирует до 48 - 34 часа роста с примерно постоянной высокой скоростью (Р) 0,16 - 0.18 г/л*час.

После определения основных условий ферментации, мы провели серию экспериментов для выбора оптимального углеводного сырья для промышленного культивирования штамма В.виЬЪШв 530(рМХ45)б2-бб. Мы сравнивали эффективность сред, содержащих техническую глюкозу, технический сахар, осахаренный крахмал и свекловичную мелассу в качестве источника углерода (Табл.5).

Промышленная реализация процесса Ферментации. Для зпролелвния возможности промышленного применения зптимизированнсго процесса биосинтеза рибофлавина мы поставили ■юделъные эксперименты в лабораторных аппаратах. Были проведены ферментации, включающие этапы стандартной промышленной технологи* 1икробного синтеза: создание базового музея лиофилиэированных слеток - приготовление рабочего музея - получение свежей культуры - выращивание прединокулята в колбах - выращивание инокулята в >ерментерах - проведение основной ферментации. Полученные зеэультаты показали, что увеличение количества стадий подготовки сультуры к ферментации не привели к снижению ее продуктивности. Сультура продуцировала около 11.0 г/л в среднем за 48 час »ориентации.

По описанной методике были проведены ферментации в эаводскнх слоаиях на пилотной установке биофармацевтического комбината в :итайской Народной Республике. Установка вкллчала посевной орментер объамом 30 л и рабочий Ферментер объемом 300 л для оследующего перехода на промышленный аппарат объемом 45 куб.м.

результате проведенных испытаний в серии форментаций был остигнут средний уровень накопления конечного продукта 10.3 г/л 1Ь за 5 5 час культивирования. Из наработанных культуральнызе идкостей были получены препараты рибофлавина1 кормового и едицинского назначения; качество медицинского рибофлавина оответствовало требованиям Британской Фармакопеи' (ВР 1988).

Расчет экономического эАфвкзгге применения разработанной ехнологии биосинтеза рибофлавина на основе рекомбннантного гвс+ тамма В,$иЫ1И8 530(рНХ45)62-66 при годовой эксплуатации ромышленного ферментера объемом 45 куб.м показал, что

-г годовой выпуск препарата рибофлавина медицинского азначения составит 23.5 т;

стоимость получаемого продукта, соответствующего еждународным стандартам, составляет на 1995 40 $ за кг. Таким бразом, годовой выпуск в денежном исчислении составляет 940 ис.$, что увеличивает эффективность производства не менее, чем , а 254 по сравнению с используемой технологией биосинтеза , ибофлавина на основе культуры Егето1:Ьес1.ит аэЪЬуН.

ВЫВОДЫ

X. Впервые были исследованы вопросы стабильности физиологические характеристики гес+ штаммов В.виь^111в и показан возможность их использования для промышленного получени рибофлавина кормового и медицинского назначения.

2. Исследовано влияние основных режимов культивирования н рост и продуктивность штамма В.виьсШв 5Э0(рМХ45)62-бб осуществлена оптимизация основных стадий технологии биосинтез рибофлавина:

- разработаны условия хранения штамма, приготовления рабоче культуры и посевного материала}

- установлено, что максимальная продуктивность культур достигается в диапазоне значений кислотности среды 6.8 - 7.6 Показано, что парциальное давление кислорода в среде необходим поддерживать на уровне не ниже 10% от насыщения. Культивирована при температуре 41 "С обеспечивает высокую удельную активно« культуры и эффективность процесса биосинтеза рибофлавина. Дх увеличения выхода на стадии ферментации процесс следует вести режиме дробной подачи субстратов со скоростью, поддерживаете остаточную концентрацию углеводов в культуральной жидкости око; 5 г/л;

- оптимизирован состав промышленной питательной среда содержащей в качестве основных компонентов мелассу (200 г/л расчете на сахарозу) и кукурузный экстракт (75 мл/л обеспечиваюошй высокие показатели накопления рибофлавина и выхо, конечного продукта на стадиях выделения и очистки.

3. Проведено исследование некоторых оссобенностей технолог; культивирования штамма В.БиЬЪШв 530(рМХ45)б2-бб!

- определено, что в отличив от других известных продуцент! рибофлавина (дрожжей и дрожжеподобных грибов) биосинтез продук1 ассоциирован с ростом биомассы;

- показано, что для штамма-продуцента характерно образован ацетоина в значительных количествах, однако при культивирован в условиях лимита по углеводному субстрату в процессе ферментац ацетоин утилизируется;

- определено, что на продуктивность штамма влияет накоплен в культуральной жидкости продуктов метаболизма, ингибирующих ро

культуры;

- впервые показана способность родительского штамма и продуцента к сверхсинтезу леваноа (до 40 г/л) и, таким образом, возможность создания продуцентов леванов на базе культур В.виЫ;111з.

4. На основе проведенных исследований разработан лабораторный регламент процесса биосинтеза рибофлавина рекомбинантным гес+ штаммом В.виЬЪШа 530(рМХ'53)б2-5б. Выли проведены испытания в производственных условиях на пилотной установке в ферментере 300 л. Уровень синтеза рибофлавина составил 10.3 г/л за 55 час культивирования с конверсией сахарозы около 7%. Из культуральных жидкостей были наработаны препараты рибофлавина кормового и медицинского назначения. Качество медицинского рибофлавина соответствовало требованиям Британской Фармакопеи (ВР1988).

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ t - температура культивирования, "С OD - уровень накопления биомассы, единицы оптической плотности культуральных жидкостей, даны с учетом оптической плотности исходных сред, ед OD m - удельная скорость роста культуры, 1/час Rib - активность культуры, концентрация рибофлавина, г/л Q - удельная активность культуры, Q - Rib/OD, г/л*ед OD Rlb+/Rlb- - соотношение высокопродуктивных и низкопродуктивных клонов (Rib+ клоны, т.е. клоны, способные к сверхсинтезу рибофлавина, определялись по признаку образования желтых люминисцируххцих в УФ свете зон вокруг колоний на агариэоаанной среде, содержащей эритромицин. Rib- клоны зон практически не образовывали .) Т - время культивирования, час Т1 - время достижения максимальной концентрации

рибофлавина, час Р - средняя продуктивность культуры, скорость биосинтеза

рибофлавина за время ферментации, г/л*час Ршах - максимальный уровень продуктивности культуры на

одном из этапов ферментации, г/л«час Pt - продуктивность культуры, скорость биосинтеза

'рибофлавина в промежутке времени между измерениями, г/л*час

Sa - суммарная концентрация углевода, внесенного в среду, г/л

Sr - остаточная концентрация углевода в культуральной

жидкости, г/л Ya - выход конечного продукта в расчете на внесенный'

углевод, % Ас - концентрация ацетоина, г/л DA - концентрация диацетила, г/л ВО - концентрация 2,3-бутандиола, г/л

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Козлов С.И., Йомантас Е.В., Плотникова Т.Г., Фрейдкин И.п., Дедова О.А., Стеркин В.Э., Дебабов В.Г. - Бактериальный штамм B.subtilis - продуцент рибофлавина. - Заявка на патент Российской Федерации N 94021756, 1994.

2. Полануер Б.М., Дедова о.А., Гаспаров B.C. - Сравнение различных методов количественного определения рибофлавина в культуральных жидкостях штаммоп-продуцантов. - "Биотехнология", 5-6, 1995.

3. Дедова О.А., Полануер Б.М., Акишина Р.И., Матросов Н.Г., Грамматикова Н.В., Шинкевич Л.Э. - Утилизация сахарозы и синтез леванов (Фруктанов) бациллярными штаммами-продуцентами рибофлавина. - Тезисы конференции "Биосинтез и деградация микробных полимеров", Пуиино, 1995.

4. Polanuer В.М., Dedova о.А. - Application of "Negative Ion-Pair" Chromatography for the Analitical Method Development

- Тезисы конференции "13th International Symposium on Biomedical Applications of Chromatography and Electrophoresis", Праге, Чехия, 1995

5. Dedova О.A,, Polanuer B.M., Akishina R.I., Matrosov H.G.

- Chromatographic Study of Sucrose Utilization and Polyfructan (Levari) Production by Bacillar Strains - Тезисы конференции "13th International Symposium on Biomedical Applications of Chromatography and Electrophoresis", Прага, Чехия, 1995

6. Козлов с.И., Йомантас D. В. , Плотникова Т.Г., Дедова О; А. , Стеркин В.Э., Шолин А.Ф,, Позднякова Т.М. - Лабораторный регламент процесса получения рибофлавина (витамина В2) - 1994.

Отпечатано в типографии МГАПП. Формат 60x84/16. Объем *,?5п.л. тир. 100. Заказ № ^ 125080, г. Москва Волоколамское ш.11

>