Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физическое картирование генома CORYNEBACTERIUMGLUTAMICUN АТCC13032 и локализация генетических детерминант

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Физическое картирование генома CORYNEBACTERIUMGLUTAMICUN АТCC13032 и локализация генетических детерминант"

Научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

НИКОЛЬСКИЙ ЮРИЙ ВИКТОРОВИЧ

ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОМА СОКУЖЕВАСТЕШиМ ОШТАШСив* АТСС13032 И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ

03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

. Москва — 1992

■ ^ ч^о

' Работа выполнена в Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Н. К. Янковский.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Ю. Д. Цыганков; кандидат биологических наук Е. В. Еланская.

Ведущая организация — Институт общей генетики РАН.

Защита диссертации состоится 27 октября 1992 г. в 14 час. на заседании Специализированного Совета Д.098.12.01 при НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан____ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

В. И. ЩЕРБАКОВА

; ''УД"

Актуальизстт» топы.

С.в1и1аи1сия АТСС 13032 является представителем группы глютамат - продуцируютIX поринебактериП и имеет большое прикладное значение пак основа для селекционной работы по получешяо продуцентов аминокислот. Еиотехиологнчаская знащпгасть штампа вызывает рост числа раеот, посвященных разработке систем клонирования и генетическому гаучетш объекте. Сущэстветшм фактором, сдергипгкл!М прогресс в этоп оеласти, является отсутствие генетичесг.сп карты С. 81иЪат:1сип. Построение такоп карты позволит' изучить структурно-фуикинональнул организации генома этоп бактерии, что существенно облегчит процесс создания продуцентов. Для построения генетической карты С.с1чtc.niicv.rn нэ могут быть применены традиционные генетические подходи, поскольку для глютемат-продуциругсаих коринебактериП не разработаны системы переноса генетическог» информации.

3 дашгоп работе для решения задачи построения генетичоскоП карты использован совремзнныП метод, основшпшл на получении физическоя нагсрорестрикцненноП парты целого генома с послояукпеп л-кализациеЛ на ней генетических детерминант.

Большое еиотехнологическое гначапш глютамат-продуцирукпих коринрбактернл ставит задачу достоверно»! идентификации различных промышленных итдммов-лродуцептоа п природных изолятов этсП группы микроорганизмов, проводившейся ранее на основе морфологических, биохимических и физиологических свойств штаммов. Паспортизация штамма может быть дополнена его макрорестришаюииын портретом, полученным с помощью электрофореза в переменном поле (пульс-электрофореэа - ПЭФ), широко применявшегося в последние годы в систематике микроорганизмов.

Цельа работы являлось построение Но 6I-рёстрикционноП карты хромосомы С. е11^ат1сшп ЛТСС13032 и получение на ее осноре генетической карты этого штамма. Другая цель состояла в идентификации нескольких штаммов глютамат-продуцирующнх коринебактериП с покошыо пульсэлектрофореза геномни-^ ДНК. В рамк.эх работы была поставлена методическая зьдзча освоения и ';рарненнп существующих способов макрорестрикциошгаго квртироряния бактериальных геномов. •

Научная погасши гозрлътатси ц практическая значимость робот.

Получен макрорострнкцмоннып портрет и определен размер генома С. ßlutamicum, состашшциП 2676 тпн по результатам рссеоплсния интактной хромосомы рзстрикт^.зой Hotl, и 2645 тпн - рестриктазоя Sfil.

Применение различии?: подходов позволяло получать первую накрорестрикционкую карту хромосомы С.glutamicum, представленную в пило шести протяяегогых сегментов (контнгов) из упорядочено расположенных IIotI-фрагментов хромосомы. Общая длина карты составила 2335 Тпн, пли В"7% размера генома С.clutamicixa.

В контн.гах с точностью до размера Фрагмента локализовав гены, коднруюпдав некоторые ферменты биосинтеза аминокислот, кмевкио паг;ноо биотехнологичоскоо значение, и определено физическое расстояние незду ними, то есть получена генетическая карта, состоящая из 7 элементов.

В процессе работы была проведена идигткфикоцнл дэвяти штанноп глютамат-продуцирующих коркнзбакторип на основе сравнения макрорсстрш:цнсшшх портретов п гибридизации Sfil-фрагиентои хромосом штаммов с зо'шом на основе оперена рибосокных РНК. Полученные данные суиественны для проведения дальнс/^гей селекционной работы в этоЯ группа микроорганизмов.

Структура и ойьен дисеертшкш. Диссертация состоит из введения. оОзора литературы, посвященного рестрпкшюшгому картирова/спо бактериальных генонов, методической части, результатов и их обсуждения и высодогз. Ду:ссерташ;л содержит 14 рисунков и 5 таблиц.

Лиробшош. Патернали диссертации докладывались на ceinmape отдела молекулярной гс1!этп;:и ЕННИгокотика, на Есесс:эзных кон ;ерепщ:пх d г. Перославль-Залесский (1991) и г. Кипе:: (1992). Основные результаты работы опубликованы в 2 статьях.

КАТЕРКА."^ И МЕТОДА.

Пульс—зледт'ро^орез образцов ДИК проводили с помошьп аппарата с контурным расположением элзгтродов фирм I)ia М (Москва) и LKB (Швеция) в 0,25 - 0,5-кратном буфере TBE при темпоратуре 9"С в 1,1-1,2% агарозном геле.

Приготовление препаратов хромосомной ДИК иорииеЕоктериЯ в агарозкых блоках осуществляли по модифицированной методике Спит (Smith et al., 1988)

ГасБтоплеиио ДГК п агарозгалс Слешах зндои;-плеозапи рестрикции и проведение пульс-электрофореза просолили,- как описано ранее (Smith et al., 1987) с небольшими модификациями.

Поикатемерм /UîK фагаХс1057о7 (стандарт молекуллрного веса для макрорестрикшюнного кагтнровшшл), готовили но типовой мотодике запекания част1<ч фага в присутствии протеттнаги (iJatliaw et al, 1988)

V *

Злектропорацию E.coll плазиндной /НК просолили с использованием приСора П21-1М (Санкт-Петербург) по стандарт!foil метггеике (Dower et al., 1983). *

Обработка ДИК ферментеют, выделение 'ррагаезггов ДНК из гелл, Свузерн-гибридизаиия, ваделе1с;э пяазмшвюп и кэсмидной ДНК осуществлялись по (Маниатнс, 198-1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕШ'З.

1. Рол^гение рветгикииошюго портрета п rt3M«sreinro размера renoua C.glutamicum.

Для макрорестрнкшюнного анализа геномов бактерий используются крупнощепшяие рестриктази, подбираемые э.;!ЛирпчеС1:и с учетом размера сайта узнавания рест1иктази, близости его по GC-составу к GC-составу хромосомной ДНК и окидаеНоиу размеру генома. В работе попользовались две рестрнктазы с октш1уклвотидным сайтом узнавания - Ilotl (GCGGCCGC) и Sfil (GGCCtJHHJHlGGCC). Ны показали, что каядый из этих ферментов расщепляет хромосому C.glutamicum менее, чем на 50 фрагментов. Тестировались также рестрнктазы о

гексануклеотидными сайтами узнавания, являющиеся редкощепягоши для многих бактериальных геномов: Smerl - 100% GC; Dral, Vspl, SapI -0% GC, а также рестриктази HluI, SalGI, Avril и Xbal. При растеплении хромосомы C.glutamicum любым из этих ферментов образуется черезнерно много фрагментов, что неудобно для дальнейшего анализа. На основа!not этих экспериментов рестриктази Notl и Sfil били выбраны для картирования генома C.glutamicum.

Били оптимизированы параметры пульс-элект!гоф0рвза (ПЭ$) для Фракционирования макрорестрикционных Фрагментов геномной ДНК C.glutamicum. Подобрана протяженность импульса (время пульса).

оптимальная для разделения фрагментов в различных диапазонах размеров. Наилучшее разрешение, позволявшее визуализировать одновременно кождып из фрагментов, давало последовательное изменение времени пульса: 3,5 сокуцей - 4 часа; 4,2 секунда - 20 часов; 5 секунд - 6 часов (рнс.1).

А В с

л а з 2 3

Рис. 1.Фракц:юнировакие мацрорестршщионныл фрагионтои генокноп ЯНК С.slutaciicuta ЛТСС13032 с помощью ПЭ4>.

Л) разделение всех сраг»:еитос п услосилх: г, ре мл пульса 3,5 с - G ч; 4.2с - 20 ч: 5с -г 4 ч. 1. - коикатекеры ДНК фага ; 2 -рестрикция Notî: 3 - S£1I. В) разделенно l'otl-фрагментов. Прскл' пульса 0 с, 4-ореза 24 ч. С) схема распределения фрагментов

пропорционально размерам; спрапа отнечечы парке pu размере::. в ттс:.

Остальные паракетры электрофореза: т^:тература, концентршия агарозч и Gyoepa, напрженпостъ поля также подбирали 1".цаг!л1дуалы!0 спя даиного набора фрагментов.

Было показано, что Hotl т>аспепляет геном С.glutamic-jin на 40 Фрагментов размером от 5 дс 106 тпн; Sfil- на 43 фрагмента от 6 до 205 тпн Стаб-1).

ОбщиЯ размер кольцевой хромосомы по сумме всех отдельных Фрагментов составил 267G тпн для Notî и 2645 для Sfil. Таким образом, размер генома С.glutamicum достигает, приблизительно, 2660 тпн, что примерно в два раза меньше генома E.coli.

Таблица 1. 3£11 и Но1Л- рестрикшюнные фрагменты геномной ДНК С. аЦЛагЛсига. Размер фрагментов дан в тпн. Индексами отмечены Фрагменты с локалчзоватгыки генами: 1 - ^гЛзАЬгВ; 2 - 1уеЛ; 3 11уЛ; 4 - рЬеА; 5 - 1уоС/авс1; б - агоЛЛЗ; 7 - рРИК-оперон

номер Фрагмента 3£11 иогл номер Фрагпентт ££11 Мог!

1 205»■^ 1Й53.7 23 "1 527

О С» 135 2*1 ССР 24 471

3 1-1.74.7 13о 25 47 42

•1 1203 130 26 44 38

5 115 27 40 36

а 112 109 23 38 34

7 100 106 29 36 27

о 10?, 101 30 32 24

9 97' 53® ' 31 272 22

10 03«.Т. СО'' 32 2;>7 1В

11 90 С.03 33 2.01 15

12 65 ' 85. 34 10^ 12

13 03 032 35 143.7 Э.5

14 60 00 33 11 9

13 77« 70 37 10 8

10 72 76 30 9 7

17 67 70 ЗЭ .0.5 5

10 66 60 40 ' 8

19 Мв 62 41 7

20 621.= 592 42 .6,5

21 59= 55=. в 43 6

22 53 53

2. Сравнение пулъс-о.юктроторв грамм рпзлнчних т-лутамат-Гфодуцируюздпс копшебактериЛ.

Объединение глютамат-продуцирувдаих корииебактерий в одну группу основывается на их морфологическом сходстве п природной способности х суперпроаукции глготамата, а также на основании особенностей строения клеточной стенки, деления клеток и некоторых биохимических и физиологических параметрах. При этом большинство штаммов этой группы, в настоящее время определяемой как род СогупеЪасЪег1иш, генетически мало изучены, и таксономические отношения между ними не ясны. Дия идентификации геномов некоторых доступных природных изолятов коринебактерий мы использовали метод ПЭР.

Образцы геномной ДНК девяти штаммов коринебактерип С. glutaralcUIn АТСС 13032, Вгеу1ЬасЪег1ит 1асЪоГегиепЬшп АТСС 21086, Вг. ¿1уег1саЪит СИа 400, Вг. ер 11НПМ В-81, Вг. 14067,

Вг. егтег^ит АТСС 13869', Вг. £1алпцп АТСС21127, С.СиШпар и

Вг. атоп!авепев АТСС6872 расщепляли рестриктазаии КоЫ и 5511 и

в

Фракционировали ПЭФ. ЛНК ютаииов Вг. £1вуиш, Вг. <11лгег1саЪит, Вг. ер. оказались устойчивы к действия 50-кратного избытка НоЪ1, что может указывать на наличие в этих штаммах особой системы модификации ЛНК, изменявшей сайт узнавания ЫоЪ1.

Образец пульсэлектрофореграммы с Б£11 и ЫоЫ-рестриктами пяти штаммов представлен но рис.2(А). Хромосомы исследуемых штаммов расщепляются на 32-40 видимых £ЗД1-Фрагментов. Разкэры геномов исследуемых образцов коринебактерий находятся в пределах 2,1-2.7 н.п.к. &£11-о6разцы штаммов Вг. вр ЦМПН В-61 и Вг. 51аущ> 14067 имеют большое сходство по fi.fi.I- фрагментам; остальные штаммы имеет по 13-20 сходных по размеру фрагментов.

Для Солее корректной идентификации штаммов и выяснения их таксономической близости использовали Саузерн-гибридизашао образцов хромосом, расщепленных рестриктаэаки ВашН1 и 8£11, с высококонсервативным бактериальным повтором - рРНК-опероном.' Количество и распределение на хромосоме рРНК-оперонов - важный систематический признав штамма (Кгаы1ес, ИНеу, 1990).

На рис.2(В) представлен результат Саузерн-гибрмамзаиии геномных ДНХ 6 втаммов коринебактерий, расщепленных ВааОД, 'с рРНК-опероном С.(1иЪаа1сиа, клонированным на фазиианок ввит ор» р2Ь5 в составе ЕсоШ-фрагмвнта размером 12 тин Глюбезно поелоставлен М.Ю.Фонштейном). Зона Выявляет на автографе 4 или 5 дискретных полос яля каждого отакма. Результаты гибридизаций демонстрируют высокую степень родства втаммов Вг. вр.ЦМПМ В-81, Вг. Паушп (дорожки 3, 4, 5), Вг. ДасЬо£епввпЪиш (дорожки в, 8) и С.в1иЬао1сио (дорожка 7), у которых 4 гибривиэуяоихся фрагмента из 5 имеют одинаковый размер. Три из этих фрагментов совпадают с фрагментами Вг.. ¿Цуег1саЬиш ИЮ 400 (дорожка 1).

Штамм Вг. Натоа АТСС21127 отличается от Вг. £1а\ллп АТСС14067 наличием на автографе дополнительной полосы размером 1,2 тпн, которая также присутствует у образцов штаммов Вг. <Цувг1саЬит вка 400 и Вг.1асЪо£егп1епЪип. Можно высказать предположение, что в втом случае произошла транслокация, либо дупликация участка рРНК-оперона.

9.4

6.7

4.3

2.3 2.0

Рис. 2. Л) Г'естршшионные портреты штаммов глютамат-продуцируюиих коринебактерий. 1,7 - конкатемеры ЛНК фага ; I. Рестрнктаза Sfll: II. рестрнктаза Notl. 2,0 - С. glutamicum ЛТСС 13032; 3.9 - Вг. lactofermentum АТСС 210G6: 4 - Вг. divericatum GRG 400; 5 - Вг. ер 1ШПМ В-81; 6 - Вг. flavum 14067. В) Сауэерн-гибрияизация рРНК-оперона с БатН1-рестрик.тами образцов геномной ДНК штаммов: 1 - Вг. divericatum GEG 400; 2 - Вг. amoniagenea АТСС6872: 3 - Вг. вр ЦМПМ В-81; 4 - Вг. flavum 14067; 5 - Вг. flavum АТСС21127; 6 - Вг.lactofermentum АТСС 13869; 7 - С. glutamicum АТСС 13032; 8 - Orevibacterium lactofermentum АТСС 21086

3. Локализация генов аминокислотного метаболизма и рРКК на tlotl и Sfil-фрагментах хромосомы С.ßlutamicum.

Для С.glutamicum как штамма-основы для создания продуцентов аминокислот наибольший интерес представляет изучение путей биосинтеза аминокислот и клонирование генов, кодирующих ключевые Ферменты их биосинтеза. В данной работе шесть таких генов выли локализованы на макрорестрикционных фрагментах хромосомы С.glutamicum (таб.1).

Ранее по комплементации соответствующих ауксотрофных мутаций E.coli в лаборатории Молекулярной генетики ВНИИгенетика на Фазмидном векторе pSL5 были клонировали гены С.glutamicum. Функционально соответствующие генам thrA2, thrB, 1увА, и ilvA E.coli (Бескровная, 1989). Эти гены были субклонироианы на плазмийах pUC19 и pUC18 в составе фрагментов ДНК размером 1,5 -3,0 тпн. В работе также использовались гены С.glutamicum pheA (Ростова, 1990), lynC/acd (Передельчук, 1992) и ген Bacillus

еиЬЪШв агоА/в (Ростова, 1990). Все перечисленные зонды метили альфа заР с применением метода рассеянной затравки и использовали в качестве зондов лля Саузарн блот-гибридизации с Ыо<;1 и II -рестриктами хромосомы С.ц1иЬат1сшп, разделенными ПЭФ (таб.2).

Таблица 2. Гены-зонды, использованные при Саузерн-гибридизации с НоЪ! и 3/11-фрагментами хромосомы С.е1иЬат1сшл

гон вектор длина вставки (тпн) источник

thrA2/thr£! PUC19 4.1 (Бескровная, 1989)

1увА pSLS 14 (Бескровная, 1968)

ilvA pUC19 3,6 (Бескровная, 19S9)

pheA piiY416 5 (Ростова, 1989)

lyaC/aed pUC19 2,5 (Передельчук. 1992)

aroA/G pEOl 1.7 (Ростова, 1990)

рРНК-оперон pSL5 12 (пред. 11. Ю. Фо! штейном

КакдыЯ из зондов, соответствухицих генан thrA2-thrB, ilvA, pheA говридизовался лиаь с одним из N о LI ц Sf II-фрагментов.

Гены thrA2 и thrB кодируют кличесае ферменты в биосинтезе я?рвонина и входят в состав одного оперона. Зонд, содержащий гены thrA2 и thrB. гибридизовался с фрагментами N24 (47 тпн) и S21 (59 тли). Этот результат показывает отсутсвие сайтов Notl и Sfii в последовательности клонированной области и подтверждает кластерное расположение этих генов в хромосоме.

Зонд, содержат^ ген pheA (Ростова, 1990), кодирующий префенатдегидрогеназу, гибридизовался с Uotl-фрагментом f 15 (119 тпн). и Sf 11-фрагм0нтом S16(72 тпн).

Ген ilvA (треоннндезаминаза) выявлял при Саузорн-гкбрюстзации Фрагменты IUI (89 тпн) и S5 (115 тпн). ,

При использовании о Саузерн-гибридизации зонда, с од: с-ри а.:; э го в одном клонированном Фрагменте гены 1уеС и ned (Передельчук, 10^2), кодирующие, соответственно, аспартпткипазу н беэта-аспартатполуальдегидлагидрогенаэу, выяеили один Notl -фрагмент N9 (92 тпн) и два Sfil-фрагмента: S20 (62 тпн) и S35 (14 тпн). Эти донные согласуются с анализом нуклеотидной последовательности клонированной области, показавшим наличие одного сайта Sfii в

области между этими генами при отсутствии внутренних Hotl-сайтов (Передольчук 1992).

При гибридизации Notl и Sfil-Фрагкектов хромосомы C.glutamlcua с зондом, представляющим собой фазмiiay pSL5 с клонировшшым геиом lysA, кодирующим диамтопимилат-декарбоясилазу, выявлено 3 llotl-ФРагмента: 1113 (S3 тли), IÍ20 (59 тли), 1121 (55тпн) и 3 Sfil-Фрагмента: 520 (62 тпн), S21 (59 тпн). S3! (27 гпи), причем рестрикционный анализ клонированной области не еыявил Hotl и Sfil-сайтов. Известно, что генсм С. glutfiniicun содержит только один Функциональный ген 1узА. Возможно, хромосома C.elutamlcuin содеряит несколько копий "молчащих" генов lysA, по каким-либо причинам на зкспрессиругсихся, и, вследствие этого, не обнаруженных по комплементации ауксотрофных мутаций. Есзио;шо также, что повтором является не структурная,, а регуляториал часть гена lysA, входящая в состав зоила ; это попет указывать на существование в этих Фрагментах координировано регулируемых генов. Не исклзочено такио, что использованный для гибридизации зонд размером 14 тпн содержит на флангах участки. Функционально не связанные с геном 1упЛ, которые локализованы в трех выявляемых хромосомных локусах.

На примере результатов гибридизации с зондом pOBIi7, содержащим ген 1увА, можно заключить, что данные чисто структурного анализа генома могут помочь в изучении регуляции генов, а также указать на причины суперэкспрессии, гена у штаима-продуцехгга по сравнению с диким типом (например, "молчащая" у штамма дикого типа копия гена может экспрессироваться у продуцента).

В качестве зонда мы использовали также ген В.oubtilio aroA/G (Ростова, 1992), кодирующий две ферментативные активности -дезоксиарабинггептулозонатфосфатсинтетазу и хоризматмутазу. Известно, что некоторые гены бактерий рода Bacilluo экспрессируются в коринебактериях (Smith, 1906). При гибридизации в мягких условиям слабый положительный сигиал дели 3 Uotl и 5 Sfil Фрагментов. Известно, что ген nroA/G существует в одной копии п геноме B.subtilis и. возможно, гибридизация происходит между частично гомологичными последовательностями в регуляторной области гена и п хромосоме С.glutamicum.

Одним из кл»"овых з.'эментов в cti '-туре бактериального генома являются опероны, кс>диру:-щие рибос..--ные FHK (рГНК-опероны). Их количество и расположение п геноио постомнно для И'ида и н:жет

служить таксономическим признаком. В работе установлено количество локусов, содержащих рРНК-опероны, у штамма глютамат-продуцирующих коринебактерий Corynebactorium elutamicum АТСС13032. При гибридизации с зондом, содержащим клонированный ранее рРНК оперон С.elutamicum, на NotI и Sfil-рестрикты выявлено по 5 индивидуальных сигтгзлов для каждой рестриктазы. Полученный результат означает, что последовательность 12 тпн зонда не содержит сайтов NotI и Sfil, и что рРНК-опероны присутствуют в 5 различных локусах хромосомы С.glutomicum, и их копийность в геноме не менее 5.

Таким образом, путем Саузерн-гибридизации генов-зондов с макрорестрикциомными фрагментами хромосомы С.elutamicum были локализованы нами с точностью до отдельного Фрагмента рестрикции 7 генетических маркеров, то есть участков ДНК, определяющих известную функций-

Опыты по Саузерн-гибридизации отдельных генов-зондов с Фрагментами, фракционированными ПЭФ, позволяют: 1) судить о количестве локусов, содержащих данный маркер и 2) установить сцепление между отдельными генами-зондами с точностью до размера общего гибридизуюшегося фрагмента. По нашим данным, 5 Sfil-Фрагментов и 3 Hotl-фрагмента гибридизуются каждый с более, чем Тэдлии геном-зондом (таб.1). Например, фрагмент S20 размером 62 тпн Тибридизуется с генами lysA и thrAs/thrB; фрагмент N5 (119 тпн) -с генами pheA, aroA/G. и рРНК-опероном. Эти фрагменты можно рассматривать как группы сцеплешш локализованных на них генов, где физическое расстояние между генами не превышает размеров Фрагмента.

•1. Конструирование стыкующей библиотеки Coryiiebacfcoriua Glutamicuaj АТСС13032.

Стыкующие Hotl-клоны представляют собой фрагменты ZHIK, клонированные из данного генома и содержащие единичные спЛты узнавания рестриктазы NotI. Использование их в качество зоил9в при блот-гибридизации с MotI-фрагментами хромосомы позволяет визуализировать сосодние в геноме фрагменты. Совокупность таких гибридизаций дает возможность получить непрерывную карту хромосомы, представленную как последовательность определенным

образом расположенных стыкующих клонов, и NotI-Фрагментов хромосомы, идентифицируемых электрофоретически.

Стратегия конструирования стыкующих клонов, примененная в' данной работе, состоит в растеплении кольцевых молекул ДНК геномной библиотеки, полученной по одной рестрнктаэе, другой, крупнощеплдей (по ней ведется картирование) н лигированием расщепленных молекул с селективным маркером - геном амбер-супрессора eupF (рис.3). Рекокбинантныв стыкующие клони отбираются после трансформации лнгпрованно.ч снеси в соответствующий щтамн-хозяин. "

Библиотека была сконструирована на плазмидном векторе pGEM3Z. Наличие в векторе гена альфа-пептида lacZ позволяет выявлять на индикаторной средэ гибридные молекулы - основу для получения стыкующих клонов. Наличие сильных промоторов РНК-полнмеразы фагов Т7 и SP6 создает возможность получения меченых мРНК-транскриптов отдельно для обоих флангов стыкуюшего Фрагмента.

Для получения стыкующих клонов хромосомную Ц}'1' С glutamicun частично распепляли рсстриктазой Sau3AI и лигировали с гекторси pGEM3Z, расаепленным рестриктазой EarrJil н дефосчс^::л?1рованшл1. Лигированные молекулы ДНК транс^ормнроаали в пггакм К.coli TGI.

Тоталыг/ю ДНК плазмидно»! бг.Злиотек;: ;:олис.г:т-о расггчплялн рестриктазоп NotI и лигировали с 10-кратным кслярним избкткоп Фрагмента, содержащего амбер-супрессор Sup F,-Фланкированного липкими NotI- концами. Фрагмент с геном супрессора элсировалн J агарозного геля послэ расшзпления п/тазкняы pBXHsupF рестриктазоЛ Hotl. Лигнросанную скесь трансформировал!: в птамм E.coli MC 1063, несусгий амбер-мутац!;п в гено, определяющем устойчивость к тетрациклину. На сслектисноП срэле отобрали сигло 250 7п1 -колония.

ДНК С glutaaicuB, 'раемпл;мная Hîtl

пульс.-эяшрсфсргз, блэт-гибридизация

- Piu. 3. Схема конструирования и использования в иакрорестршишонном картировании стыкующих клонов на основе w «тога |<!КМ32.

5. Лиалиэ впваттт стижуишпх клопов и 1« гютюлъзоиагага для Физического карпгрования хромосомы С.(11иЬаш1сиш.

Поскольку рестриктаза расщепляет хромосому С. в1иЪат1сил> на

•40 Фрагментов размером от 5. до 196 тгцг, для »»'явления всех пар соседних по По^-сайту фрагментов, и, соответственно, построения Физической карты по этой рестриктазе, необходимо 40 неповторяющихся стыкующих клонов. Исходная выборка должна быть в. пять раз больше, чтобы в ней с вероятностью 993. присутствовал каждый из хромосомных 11оЪ1-сайтов. ЧтсСы сделать вывод о достаточности инеюзэгося количества кленов -для получгютя кольцегей карты С.е1иЪаи1сшя была определена доля клоноп иорректной структуры. Лля анализа и проверю! структуры случайным образом отобрали 90 клоков. Выделяли плазмидную ДНК и выщоплялп вставку рестриктазами ЕсоН1 и Н1пс1111, сайты узнавания которых флвтигруют в полилинкере рЯП132 сайт ВатН!. Около 70% плазмид содержали сставки со средним размером 1,2 тпн.

Более детально псслодовали структуру 16 клонов, различающееся по длине вставок. 14 клонов-зендов, как и ожидалось, давали при Саузерп-габридизации сигнал с какими-либо двумя иоЪХ-фрагментами; 12 из этих зондов били неидентичны друг другу, топ как выявляли различные пары 1<оЪ1-Фрагментов на автографе (та0.3).

ТабЛ1ша 3. Результаты Сауззрл-гибршшзации стыкуюоих клонов-зондов с НоЫ-Фрагме!Ггами хромосомы С. {¡1иЬе211си1а

Зокл

плаамют« рЬ35 рЬ59 рЫЭ рЬ21 рЫ р174 рЬ6 рЬЯО

рьза

рЬ75 ГЫ4 рМ2

Гийрндизуюсшэся МойГ-фрагнанти

размеры фр-топ (тпн).

119.70 101. 79 79, 55 160. 13' 47. 29 106. 85 52. 42 130. 42 68. 59 195. 8 90. 38 168. 53

70. 32 32. 101

1Н9 H15. 1121 79. 55

2F8 N15, N21 79. 55

2G10 • N19, N11 62. 89

ЗА2 НИ. N2 69. 168

2F7 N2. N6 168 109

2Е11 N0. N31 109 22

4Н2 N31. 1124 22. 47.

2D4 N24. N1 47. 195

2С6 Ml. H18 1 S5 68

ЗВ7 1118. N20 63. 59

2D2 N20, N26. N9 59. 44.

2Е1 1126. i.'P 44. 92

ЗЕЗ N12 U14 85. 80

1Н10 »14 [.•23 80. 52

1С2 N22 1(33 53. 15

ЗЕ4 1Î22 N33 N35 53. 15,

2G7 N29 N32 27, 18

4В1 ' N2. 1139. N3 168 . 5.

На рис. 4 показан пример выявление соседних на xpomocosj ¡¡otl-ФРагментов с .помощью стыкующих клонов. Для дг>/;: зондов, рИ9 и i ¿59 один из вылfлэнных фрагментов оказался oSî^hm для двух пар. Зонд pL59 выявляет фрагменты !«8 ( 100 тпн) и N15 (00 тпн), а зонд pL19- -трагненты N15 и U21 (59 тпн). Следовательно, фрагмент N15 • раополо.кен на хромосоме меаду Фрагментами N8 и 1121.

Hot I

Hotl

N8

tas

Н21

pL59

PU9

Рис. 4. Использование стыкующих клонов для выявления соседних в хромосоме С.в1иЪаш1сиш ЫоЬ!-фрагментов.

Таким образом, на основании анализа выборки, мы ожидаем, что из 350 полученных клонов 70% содержат вставки, и 75% из них (180 клонов) имеют ожидаемую структуру. Доступность 180 клонов корректной структур« означает, что каждый из 40 Notl-сайтов генома С.glutemlcam представлен в'этой выборке с вероятностью 99%. Таким образов, сконструированная на этом этапа стыкующая библиотека, в принципе, достаточна для получения полной кольцеЕоп карты

в. Картирование No ti-фрагментов о использованием рекогДОтантншс космид s качестве зондов дют Сауэерн-гмбридизштп.

Основная часть результатов, необходимых для построения Hotl-рестрюшионной карты C.glutamicum. была получена при гибридизации Фрагментов Hotl-рестрмкционного портрета с зондами из ' сконструированной ранее библиотеки генов C.glutamicum на'косюшком векторе Loriot в (Буканов, 1991). В качестве исходного материала использовали минимальный набор космид (любезно предоставлен U.O. Букановым)> представляющих каждый участок гвксяа и органягопысгее в контиги (непрерывные цепочки коскид) различной протяженности. На предварительном•этапе был проведен рестрикциониый анализ библиотеки, выявивший большинство клонов, содержащих сайты Notl во вставке. Такие клоны использовались как стыкувайе зонды при Сауэерн-гибридизации с Notl-фрагментами хромосомы C.glutamicutn. Затем использовали клоны, находящиеся на концах космидкых контигов, сформированных к данному моменту. Наконец, в наиболее протяженных контигах случайным образом отбирали клоны из минимального набора для подтверждения их принадлежности к одному коскидному контигу и для уточнения' взаиморасположения посиид в контиге.

Всего при гибридизации виЯЬ йвйЬМ&зовано 37 клонов, 20 из которых являлись стыкующими.

Из каждого клона выделяли космйдну» ДНК, линеаризовали путем расщепления рестриктаэрй BcoRI, метили 32Р с помощью метода рассеянной затравки и гибркдиэовали с Notl-рестриктами геномной ДНК C.glutamlcura. Поскольку векторная ДНК (Loriot в) не имеет гомологии с хромосомной ДНК C.alutamicum, ДНК ^комбимаятннх космид метили, не отделяя вставку от вектора. Используемые зонды соответствовали размеру вставки 32-4S тпн

• 18 из 20 стыхуюаи* коснидных клонов, солержааих по одному Notl-сайгу, выявили ft роашечнах пар Notl-фрагментов (таблица 3). 2 космиды. 2D2 и г*йв^яй»йговалмсь на 3 фрагмонта каждая. Последующий более точййй' этмктрофоретический анализ Hotl-рестриктов этих клоноп показал наличие в них двух Notl-caftroD.

9 стыкующих косина (2GÍ0, ЗД2, 2F7, 2Е11, -4112, ,204. 2Св, 337, 2D2) позволили соединить Í0 КоСГ-ф^агнвнтов в непрерывную цепочку с известным положением фрагкейтов размером 960 тпн, являющуюся

с а> го сто лтйлыгьп I злопентсм карты. Расположи.« фрагментов в этом сегменте H19-1I11-112-П0-Н31-Н24-Н1-Н1В-Н20-iÜ6-НО.

В трех случаях д^о пары космилных зондов'еыЯзляот по две пары Фрагментов, один из которых является сбкнм длл обоих зондов, что позволяет соединить по Z соседних Hotl-фрсгиента. Зонды <Ш1 и 1Н7 соотьетств:'от расположению фрагметов U17-!i20-110; ЗЕЗ и 1П10 - Н12-!ИЛ-1!23; 1С2 и ЗЕ4 - 1122-1133-11.35.

Косима 207 выявила 2 фрагмента. М29 !lCü. Sir.-,; стой пары ФРагмаигоп не Сило найдено соседних при использовании данной выборки зондов.

Oißop коснид из минимальной библиотешг предполагает использование космид, неперекрывающихся друг с другом, что подтверждается результатами гибридизаций. Только в одном случае дел кос и г-ты, 11109 и 2F00 расположенные в одном контиге , дали ciini.vi с oiitiofl и той же парой llotl-фрагмеитов Н15-1121. ■

Космквный клон 4В1 заявляет при Саугерн-гибридизатш 3 llotl-Фрагмок.'а: 112, 1139 и MÖ, по другим даглсгм на являющихся соседними. Кроне того, этот зонд гибридизуется с тг-мя SfiI-фрагментами. Вероятно, в этой космидс в состав ьатявяя входит различите Фрагменты хромосомы C.glutamicujn.

У. Посхроаггио Notl-pecrrpiiKwioirirart карты генома С.flutamicu.-n. , lloti -Рестрикционная карта генома C.glutamicum представляет собой последовательность MotI-фрагменТов ДНК, расположенных в известном порядке вдоль хромосомы. При построении такой карты мы опирались на данные Саузерн-гибридизаций Hotl-фрагмвнтов на косиидные и плазмидные стыкующие зонды. Только комбинирование этих двух групп результатов позволило состыковать основную часть Notl-Фрагментов в непрерывный цепочки-контиги. Одновременно получена карте (последовательность вдоль хромосомы) использованных при пгЗридизлции стыкуюси-v: росмидных и плазнкдных клонов-зондоя. В итоговую карту вошли данные по гибридизации 20 космилных и 12 , плазмидных стыкующих клонов.

По рченная карт г-' представлена на рис. 5. На карте отмечены номера В(_ех космилных и пле..мидных зс^ аоз, а также пг-ледолателъностг и размер NotI- фрагментов, гибридизовавшихся с этими зондами.

Пзрт£ прj^J■:;..т.зт собой шесть контигов. тислючаюких 33 i.-э <i0 ИоМ-фрагиентов обшей длиной 2335 тпн. Ta:aiM образом, прсиаршгрогано 07% размера генома. В коптигм не вошли 7 M.itl-Фрагментов, для которых пут си Саузерн-глЗрмяизашн но било найдено сосоднш: lipanieHTOB.

Наибольший кснтиг Л содзршгт 17 llotl-фрагнентов (1400 тпн); гонтнг В - S фрагментов (495 тпн): контиг С - 4 фрагмента (2-10 тпн).

Остальное контнги представляют собой пары HotI-r¡>pan;~?iíTCi3 определенны.': по результатам единичтап: гибридмзанпй со cvuityinm-rtGi сосшшая! 2G7 (H29-1I32), 431 (112-1Ш-НЗ) п плазшщаин рЦ4 (¡1101527), pL75 (IÍ1-ÍÍ37).

В трех точках карты стыкующие пласгаишуэ клони Е^яилггют ту ко пару фратсктсв. что и коешцшыо клони, что попч-ает дэстоеестюсть результатов. Плазишт pL75 н коемнда 1Н9 гибрндизуотся с фрагментами ¡J15 и 1121; pL21 и 2F7 - 112 и lio; р14 п 1И2 - 1!31 и N24.

Коне''::с:< целью работы Cl-to использование фнэичесхоя рзст^.ыинонной карты для получения генетической карты хромосомы С. ¡;lutü¿ilourj. Сля этого определено располскэниэ клонированных ■ гонов относительно оленентов карты, а такл.з физическое расстояние между ras ni. h'apF:e?u, локализованные на нескольких фрагментах ' l'/cA, nroA/G, х^РКП-слороны), услог"о обозначены номерлмп.

Лля зааергеиич построзпия полной кольцевой llotI-pecTpnj:uf'Ot;irart ¡:арты ::pci:c"-0>ui С. rjlutsunicum в гольиейяси кожло будет использовать лсиолттольно другие г.зтеди рсстрикш'онного кортпро г-ииы геномов, тгкио кш: ПЗ? в двух напргглешгях н перекрестную Саузорн-гнЗридизацига llotl п SflI- фрагментов с отдел!« ¿ии нентаии,

с,ломрс:заккики чз геля.

Макрорестрнкционная карта генома С.glutamicum даот новое предстац/тспие о пространственной орга;гизаши1 хроиссо-чы и может найти применение ц генетическом изучении этого штатм и в селекционной работе по получению новых продуцентов аминокислот. Гибридизация новых гонов-зондов на фрагменты рестрикшюшюго портрета хромосомы штамма позволит определите их располонегою и Физическое расстояние относительно генетически промаркировагаак Фрагментов.

____&1Д ,

ЧП O

■ti •a

, 4

g £

W - . . ü o.

a 5 « ça

„ д в -s a o

'■ ~ o. A. n¿.

«t, , « . ^ M O, í?

ваволы.

1. Получен NotI л Sf il-рестрикшюнный портрет генома C.glutamlcuni АТСС13032. Подобраны оптимальные параметры пульсэлэктрофореза для разделения каждого из 40'!fotl и 43 Sf 11-фрагме!ггов. Определен размер генома С. glutamicum АТСС1302. составившие 2G76 тпн u 2S45 ттш, по сумме tlotl и Sfil фрагментов соответственно..

2. Проведено исследование с помоиыо ПЭФ 9 штапмои глателчт-продуцируют« коринебактерий. Определена группа нзиСолее

по этому критерии штаммов. * '■

3. Установлено, что в геноме С.ßlutaraicuci содертэтся пять локусов оперонов pFHK.

4. Получена üotl-стакугззая библиотека С. glutamlcum АТСС13032, состоящей из 180 клопов, что d 5 раз превншает количество tlotl-епптоп в геноме и статистически обеспечивает созиозность построения полной кольис-пой карта хромосомы этого штамма.

в. Использование стш:укпяц: ;:оск:;л tux и плазмидпыя клоьов позволило получить ¡!оЫ-рестрикцио1пгу7) карту хромосомы C.gHi'jamicun, представляют^™ coSofi шесть cemeirrou с изпости-ги расположением Фрагментов длиной 1409, 495, 24G. 2С0, 123. ¡33 run, что составляет в челом 2182 тпн, или 82% размера генома. IIa карта локализованы 7 генетических маркеров.

7. На основании llotl-рестрикционной карты получена генетическая карта генома С.glutnnicum,включаюаая семь элементов, расположенных я последовательности: phoA. aroA/aroG-l, pPHK-l - 1увЛ-1.. aroA/nroG-2 - ilvA - .pPHK-2 - thrAaB - oroA/arcG-3, pPIlK-3 -'lysA-

3 - IveC/aßd

I

Основное содержание дкссер» aurrti mp-nra n пэчатн'с;

работах:

1. Никольский Ю.В. , Куканов И.О., Федорова Н.Д., Янковский Н.К., Фонгатейн ¡¡.Ю. Определение размера генома Coryncbacfcerium glut ami cum и его макрорестриктиос.' каргнропанно с помспыо гибридизации коекпд и "стыг.удатг:" к.понои-зоняов на Notl-фрагмеиты

ДНК, фрашшокпрозаювдо Пулг.е-Елактрофореэом. Сб. трудов 2-й всос. конф. "Геном челопакгь''. Пэраславль-Залесский, окт. 1891. стр.49. 2; Передольчук М.20., Буканов Н.О., Никольский Ю.В., Федорова Н.Д., Пепгзтов И.!!., ПдеюзсккЛ II.К. Использование физической карты геноиа Со г у п о Ъ й с t о г 1 ия clutcr,iicuji, лродстввлшшоЛ в силе энциклопедии генов, длл созд.".н;;л генетической карты. Св. трудои 2-й всес. конф. "Геном чолосоиа". Пареславль-Залесский. окт. 1991. стр.62.

3. Янколсилй Н.Я., Паредельчук Н.Ю., Буканов И.О., Никольский Ю.В., Федорова И.Д., Савостьянов С.Ю. Савнешетюя генетическая и Физическая карта генома бактерии Corynebaoterlun clutamicum. Сб. трудов конф. "Геном человека". Минск (в печати).

4. Никольский В.В., Фонштейн М.Ю., Геринг B.X¿, Янковский Н.К. • Картирование генотичесшр: маркеров Corynebacterium glutamicum

'АТСС13032 относительно элементов физической карты генома. "Генетика", 1992, т 28, N 12 (в печати)

5. .Никольский Ю.В. , Фонштейн 11.Ю., Янковский Н.К. Конструирование

и анализ стыкующей библиотеки Corynebacterium glutamicum i ' ЛТСС13032. "Генетика", 1902, (в печати).