Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа геномных перестроек, обусловливающих усиление экспрессии гена уридинфосфорилазы у ESCHERICHIA COLI

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Природа геномных перестроек, обусловливающих усиление экспрессии гена уридинфосфорилазы у ESCHERICHIA COLI"

ол

государствей^тйЖучно-иссхшедоватежсюй институт

генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

ЗАПОРОЖЕЦ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ПРИРОДА ГЕНОМНЫХ ПЕРЕСТРОЕК, ОБУСЛОВЛИВАЮЩИХ УСИЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА УРИДИНФОСФОРИЛАЗЫ У ESCHERICHIA COLI 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических паук

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в Государевенном научно-исследовательском ' ' институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель - доктор биологических наук АХ.Миронов. ~

Официальные оппоненты: доктор биологичесих наук Д.А.Перумов; кандидат биологических паук В.З.Ахвердян.

Ведущая организация - Московский Государственный Университет им. М.Ломоносова

Защита диссертации состоится 10 октября 1995 г. в 14 часов на заседании Диссертационного, совета Д.098.12.01 при ГосНИИ Генетика по адресу: Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИ Генетики.

Автореферат разослан [О сентября 1895 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических паук В.И.Щербакова

Актуальность темы '

Геномы всех организмов, в том числе и энтеробактерий, крайне консервативны с точки зрения локализации, состава и количества генов на хромосоме. Это является ^необходимым условием поддержания видов. Наглядным примером может служить штамм W311Q Escherichia coli, который содержит инверсию участка хромосомы длиной около 18 минут генетической карты. Эта перестройка произошла между двумя оперонами рибосомной РНК, rrnD и ттпЕ, и впервые была обнаружена более 30 лет назад. т -

С другой стороны известно, что непременным условием эволюции является изменчивость. В связи с этим, у бактерий хромосомные нутации происходят с довольно высокой частотой. Основную роль в их возникновении играет неравный кросспнговер между различными гомологичными последовательностями, которые присутствуют в бактериальном геноме. Примером таких протяженных повторов являются опероны рибосомной РНК, которые присутствуют в количестве 7 копий на геном Е. coli, rhs-лохусы. Важную роль в образовании хромосомных перестроек играют также мобильные генетические элементы: транспозоны и IS-элементы. Сайт-специфическая рекомбинация с их участием приводит к образованию различных • хромосомных перестроек: делений, инверсий, дупликаций, транслокаций.

Для изучения механизмов генетических процессов, приводящих к изменению макроструктуры генома, важное значение имеет разработка селективных систем отбора мутантов, содержащих хромосомные перестройки. Такой удобной системой оказался метод селекции, раработанный на модели гена udp, контролирующего синтез фермента уридинфосфорилазы (УФ-зы) E.coli (Mironov, Sukhodolets 1979, Миронов 1982). Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в изучении роли транспозона ТпЮ в обраэовашши различных хромосомных перестроек у мутантов штаммов E.coli DZ100 и DZ200 с конститутивной экспрессией гена udp. В задачи исследования входило: ,

с

1. Получить представительную коллекцию мутантов с повышенной . экспрессией гена udp, возникшей в результате различных хромосомных перестроек.

2. Осуществить физическое картирование генома у, полученных мутантов с помощью обычного электрофореза, а также электрофореза в пульсирующем электрическом поле (11ЭФ).

3. Установить точную локализацию хромосомных перестроек с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

4. Определить нухлеотидную последовательность в районе стыков перестроек для выяснения роли транспозона Тal0 в образовании перестроек.

Научная новизна н значимость работы

С помощью эффективного метода отбора получена коллекция мутантов с повышенной экспрессией гена udp, несущих уникальные хромосомные перестройки, индуцированные транспозоном Тп/0.

Осуществлено физическое картирование полученных хромосомных перестроек и предложены схемы вероятных рекомбинационных событий, лежащих в основе этих геномных. мутаций.

Выявлена ключевая роль транспозона Тп 10 в образовании инверсий, дупликаций и делещш у полученных мутантов.

Показано, что мутация в гене метилазы dam повышает частоту хромосомных перестроек.

Обнаружена мутация в гене, кодирующем транспозазу Тп/0, которая приводит к изменению специфичности фермента.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение и обсуждение результатов, выводов и списка

цитируемой литературы. Диссертация содержит _ страниц, _

рисунков и библиографический список из_названии.

Апробация работы —✓

Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в двух статьях, а также представлены на 17-м международном генетическом ■ конгрессе (Бирмингем, 1993г.), 3-й научной - конференции ГосНИИ Генетики (Москва, 1995). Материалы диссертации были доложены на семинаре отдела молекулярной генетики ГосНИИ Генетики 22 мая 1995г.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные • штаммы E.coli К-12. Полный' генотип родительских штаммов, полученных мутантов, а также их физиологическая характеристика представлены в Табл.1.

Трансдукдаю бактериофагом PI проводили по стандартной методике [Миллер 1976].

Обработка ДНК ферментами, выделение геномной п плазмидной ДНК, Саузерн-гибридизацня осуществлялись по стандартным методикам [Маниатис и др. 1984].

Манипуляции с ДНК. Геномную ДНК, для рестрикции эндонуклеазами / и последующим электрофоретическим фракционированием в обычном и пульсирующем поле, выделяли из клеток, иммобилизованных в легкоплавкой агарозе. Для этого, " выросшие клетки промывали в 'буфере ТЕ и' зайнвали "1,4% расплавленной легкоплавкой агарозой в 50мМ ЭДТА. Далее образцы в течение ночи инкубировали при 60°С в растворе, содержащем: 90% 0,5М ЭДТА, 10% ДСН и 0,4 мг/нл протеиназы К. Гидролиз хромосомы рестрнктазами проводили в условиях, предусмотренных для используемых ферментов. Для фракционирования фрагментированной ДНК использовали аппарат для иульсалсктрофореза CHEF-DR* III фирмы "Bio-Rad". Саузерн-гкбридизацию проводили в буфере : 0,5М NaII2P04, 7% ДСН, 1кМ ЭДТА. В качестве ДНК-зоидов использовались плазмиды:* рКК3535 (ггпВ)-для оперона рибосомной РНК, р1Ш7(ш/р)-для гена udp, а также ПЦР-амплифицированные фрагменты еггрутегурной области гена met.F. и тяг.ерципнного элемента IS10.

Ч

Таблица 1

ХАРАКТЕРИСТИКА РОДИТЕЛЬСКИХ ШТАММОВ И МУТАНТОВ, НЕСУЩИХ ХРОМОСОМНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ

Штамм Генотип Время генера- Активность

цкн(ют)\ УФ(ед/иг)

СМ922 Ш ЛуАйеоС йеаА тпе(Е::Та10 35 270

гшоо как СМ922, но ¿ат::Тп9 32 200

СМ973 как СМ922, во [т&Е',ггпО'\ 8 . 630

огт как ОгЮО, во ЮТб (тегЯ'.тШ'] 35 1280

ьгт как тт, во ШУ7 [теШ?,ггпО'] 36 3100

огио как ШЮО, яо ОЕ1/ОЫ>Щш1р,ггпА] 62 700

огш как тЮО, но ОЕНЦте^Е} .30 550

огпъ как ОгЮО, но ОиР15[ги1р,гт} 38 500

тт как ОгЮО, во 01}Р17[ие1р,ггп] 48 870

тая как ШЮО, н» 40 2500

АМ2050 ¿кг/А ¿еоС йеоА1 тейЕ-.ЯпЮ 24 350

Бггоо как №3110, но ¿атг:Тп9 25 320

АМ2151 как ТО110, ио ЮТ30[»^Е',гт.Е/1>'] 50 1000

Ш20& как ЭгЗОО, во Ш\г8[теШ,гтО/.Е1 50 2300

0\ЗРЪ{и<1р/ггпГ>/Е\

ОХШ как 02200, но ЮТ11{т&Е,ггпО/Е) 90 1500

ъгт как ОггОО, яо гШУ12[ае/р/ггпО/Е, 40 700

т^Е/ггпО(Е\ ПиР12(исГр/гтО/Б1

ог213 как 02200, ттТтЩийр/тгпО/Е, 42 500

таЕ/ггпО/Е\ ОШЩи^р/гтО/Е]

вгги как 02200, но хШЧЩийр/ггпО / Е> 70 480

таЕ/ггпО/Е] 01]РЩис1р/ггпО/Е]

02215 как 0X200, нотУ151те£Е,тгО/Е1 75 3500

02216 как 07200, во 76 4600

Амплификацию. ДНК проводили на термоцнклере ТС480 (фирма Perkin-Elmer Cetus). Метод ПЦР-амплнфнкашш также использовали для прямого секвенировашш ДНК. Электрофорез проводили - в 6% полиакриламидном денатурирующем геле. В работе были использованы оперонов рибосомной РНК: rrnl 5'-atgatttggttgaatgttgcgc -82- 60 ггпЗ 5'-aggaagggagtaaagttaatac 741- 762 ггп5 5'-cgcttaccactttgtgattcat 1753-1771 rrn7 5'-ggcttagaagcagccatcattt 3338-3354 rrn9 5'-ctcaatgttcagtgtcaagctat 4378-4356 rrnl0 54ggttcattagtaccggttagc 5166-5145

б) для инсерционного элемента ISfO:

ISp 5'-gcagaattggtaaagagagtcgtg 152-129 ISd 5'-gtactctcaacagttcgcttaggca 1179-1203 IS1 5'-cacgactctctttaccaattctgc 129-152 ISr 5'-tgcctaagcgaactgttgagagtac 1203-1179 ISa 5'-gttgagaagctgggttggtactgg 621- 644 ISb 5'-ccgctcctaggtctgcatattgta 690- 667

в) для гена melE:

metEa 5'-aatcggtcctggcgtctatgac 2057-2078 _ metEs 5;-ggcggtagggcgtgaattgc- 121- 141 _

1 metEd 5'-cccgacgcaagttctgcgccgc 2259-2238

Определите активности УФ-зы. Методика измерения активности УФ-зы описана в работе [Mironou A.S., Sukhodolets V.V., J.Bacteriol. 1979. V.137. Р.802-810]. Белок определяли по Лоури [Lowry О. Н. и др. J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение коллекции штаммов, несущих хромосомные перестройки

Возможность систематического изучения хромосомных перестроек определяется в первую очередь наличием удобной селективной системы, позволяющей получать нужные мутации. Ранее нами был описан метод отбора мутантов с высоким уровнем

б

экспрессии гена udp [Kulakauskas S.T. и др. Genetika 1985. V.21 P.375-378]. УФ-за катализирует обратимую реакцию фосфоролиза уридина, а также имеет невысокую (2%) специфичнось к тамилу [Leer J.C. и др. Eur. J. Biochem. 1977. V.75. Р.217-224]. В условиях конститутивного синтеза УФ-зы способна комплементировать аухсотрофность по тимидину, вызванную мутацией в гене лшвдзшфосфорклазы (deoA), при отсутствш1 сшггеза тимцдиловой кислоты de novo (thyA) [Суходолец В.В. и др. Генетика. 1973. Т.9. N2. С.167]. Селекция, направленная на эффективную утилизацию экзогенного тимина на фоне мутаций thyA и deoA, позволяет отбирать промоторные мутанты с повышенной экспрессией гена udp [Mironov A.S., Sukhodolets V.V. J.BacterioI. 1979. V. 137. P. 802-810].

При использовании этого метода селекции для штаммов, содержащих в составе хромосомы инсерцию транспозона Тп 10 в соседнем с udp гене metE был получен особый класс конститутивных. мутантов: 2-3% клонов, отобранных на минимальной среде с тимином, теряли детерминант устойчивости к тетрациклину [Kulakauskas S.T. и др. Genetika 1985. V.21 Р.375-378]. Генетический и физический анализ мутантов этого класса показал, что все они> содержат протяженные хромосомные перестройки типа инверсий или транслокаций, в которые вовлечены опероны тгп, контролирующие синтез рибосомной РНК [.Fonstein М. и др. J. Bacteriol. 1994. V.176. N8. Р.2265-2271]. В результате этих рекомблнационных событий ген udp оказывается под контролем промоторов рибосомных оперонов, с которых осуществляется сквозная транскрипция гена udp (Рис.1).

Для оценки роли Тп/0-транспозазы в образовании хромосомных перестроек мы сравнили частоту выщепления тетрациклинчувствительных клонов у мутантов с конститутивной экспрессией гена udp, отобранных в штаммах, дефектных по специфической ДНК-ыетилазе (dam) [Roberts D. Е. и др. Cell. 1985. V.43. Р.117-130] и штаммов дикого типа Ыат~*~). С этой целью были сконструированы изогсгашс пары штаммов: СМ922 и DZ100; AM2Q50 и DZ200, отличающиеся относительной ориентацией гена udp, а также алледьным состоянием гена dam (см. "Материалы и методы" и Табл.1).

Рис. 1. Схема образования инверсии а) Генетическая кар-

та хромосомы исходного штамма АМ174; б) Генетическая карта хромосомы мутанта СМ973 с инверсией 1*т. Цифры указывают минуты генетической карты.

ч

\

Суспензии бактерий рассевали на минимальную агаризованную среду, содержащую, 5-10 мкг/'мл тимнна и инкубировали в течение 2-3-х суток при 37°С. Выросшие колонии тестировали на выщепление детерминанта устойчивости к тетрациклину, что могло свидетельствовать оприсугавни в геноме данного мутанта хромосомной перестройки. ^Первичный. анализ показал, что частота возюшювсгаш клонов, способных к росту на среде с тимином«для всех штаммов была примерно одинакова (Ю-?), однако доля Тс^ вариантов среда мутантов, отобранных в штаммах DZ100 и DZ200 (dam") составляла 23-25%, тогда как в штаммах СМ922 и АМ2050 (dam+) она не превышала 2%.

Фснотшшчсские свойства и генетическая характеристика отобранных мутантов суммированы в Таблице 1. Практически все клоны отличаются от родительских штаммов повышенным от 2-х до 20-ти рая уровнем экспрессии гена udp. Кроме того, многие мутанты характеризуются из меиением скорости роста: у некоторых мутантов

время генерации увеличивается почти в три раза. В соответствии о имеющимися литературными данными [Hill С. W., , Gray J.A. Gcnctics. 1988. Л'.119. Р .771-778], изменение этого параметра может свидетельствовать о наличии в геноме бактерий крупных хромосомных перестроек.

Физическое картирование хромосомных перестроехс с помощью ПЭФ и Саузерп-гибридизации

Дли обнаружении и выяснения природы хромосомных перестроек мы использовали два метода физического картирования. Первый - это электрофорез в пульсирующем электрическом поле (ПЭФ), который применяется для разделения крупных фрагментов геномной ДНК Escherichia coli, обработанной эндонуклеазой Notl. Notl расщепляет хромосому на конечное число фрагментов с различной молекулярной массой, которые достаточно легко идентифицируются в геле \Smith C.L. л др. Science. 1987. V.236. Р.1448-1453]. Как выяснилось в процессе дайной работы [Fonstein М. и др. J. Bacterioi. 1994. V.176- N8. Р.2265-2271], благодаря локализации гена udp на сдипствснпом ^Voil-фрагментс, размером

ТАБЛИЦА 2

СУММАРНЫЙ ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛНЗ РОДИТЕЛЬСКИХ ШТАММОВ.

Размер фрагментов 1(тпн)

АГоЯ Ватт ВатТП/РзП

Ген ГШ ПО пшо 02100 пггоо гшоо 1УТ2йй

ггпО . 1000,0 810.02 8,1 17,12 8,1 11,42

ггпН 270,0 270,0 11,8 11,8 9,5 9,5

ггпС 250,0 - 250,0 15,4 15,4 15,4 15,4

ггпЕ 240,0 440,03 16,8 7,83 11,1 7,83

ггпВ 240.0 810.0 14,4 14,4 7,3 7,3

ггпС 200,0 200,0 33,2 33,2 16,7 16,7

ггпА 36,0 36,0 6,7 6,7 6,7 £7

■те(Е - зяо 35,02 - 5д5 25.5- - 11,0 11,0

ийр 35.0 35.0 25.5 25.5 8,5 8,5

Подчеркнутые числа означают локализацию генов иа одном и том яге фрагменте ДНК. 1- Размер и локализация фрагментов были определены гибридизацией со следующими зондами: рКК3535 (ггпВ)-для оперола рнбосомной РНК; р!Л)7-для гена ыг/р; ПЦР-амплифицирояашшй фрагмент для гена т&Е. 2- Фрагмент ДНК, связанный с гибридным олероном рнбосомной РНК ггпЁ/1). 3- Фрагмент ДНК, связанный с гибридным опероном рнбосомной РНК ггпП/Б

\

/ 35 т.п.н., любые хромосомные перестройки, затрагивающие этот фрагмент, приводят к появлению новых, визуально фиксируемых Nvll -фрагм ентов. Последующая Саузерн-габридизация этих фрагментов с зондами, специфичными к рибосомным оперонам, генам udp и metE, позволяет более точно выявил, изменения в структуре хромосомы.

Второй метод картирования основан на том, что ни один из рмбосомных оперонов [Boros /. и др. Nucleic Acids Res. 1979. V.6 ?. 1817-1830J, а также, как следует из наших даннмх, гены udp и metE не содержат сайга узнавания для эвдонуклеаз. ВатШ и Pstl. Гидролиз геномной ДНК этими ферментами, а затем последующее разделение фрагментов я обычном электрофорезе и Саузерн-гибридизация с зондами позволяют идентифицировать в геномах родительских штаммов DZ100 и DZ200 7 дискретных ВатШ и ВатШ-Pstl фрагментов, каждый из которых соответствует конкретному рибосомному оперону (тгпА-G), в то время как зонды p'JD? и MetE обеспечивают распознавание двух уникальных фрагментов ВатШ-Pstl, на которых локализованы гены udp и wgLE, соответственно. В Таблицах 2 и 3 суммированы результаты .-ибридизашюнного анализа родительских и мутантных штаммов, которые получены на основании данных двух независимых методов физического картирования.

Сопоставление данных картирования, приведенных в Табл. 2 и 3 показывает, что все исследуемые мутанты отличаются от родительских штаммов исчезновением исходных и появлением одного или нескольких новых Notl, ВатШ или ВатШ-Pstl фрагментов, с которыми гибридизуется зонды, содержащие гены udp ¡; rrn. Таким образом, появление в составе генома мутантов нового фрагмента, содержащего ген udp во всех случаях обусловлено такими перестройками генетического материала, в которые оказываются вовлеченными ген metE, а также те или иные опероны, кодирующие синтез рибосомальных РНК.

Сравнительный анализ размеров этах новых фрагментов в некоторых случаях позволяет достаточно однозначно определить характер и природу хромосомной перестройки, исходя из модели внутримолекулярной транспозиции тралспозона Та/0 [Bender J

и

ТАБЛИЦА 3

СУММАРНЫЙ ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ХРОМОСОМНЫХ

МУТАНТОВ

Размер фрагментов (тли)

Дслсггнрошишые фр-ты* Новые фрагменты^

Мутакт //о« ЯшяШ В/Я3 ЯоП ВатШ В/Р Комментарии (Рис. 1. 2, 3)

СМ373 1000,0« 25,5® 8,1» 700,0» 25,0» 5,7» нгоереяя тс1Е-гти

35,05 8,1» 340,0»<® 15,0®

огшб 1000,0» 25,5® 8,1» 700,0» 19,0» Г* кивере** те^£-гтя1>

35,0б 8,1« 340,0»»® 15,0®

огт 250,0» 15,4» 15, 4» 40,0»'® 13,К6 21.2» инверсия те(Е-ггпС

35,0®'* 25,5® 240,0»

огт 35,0« 25,5е 6,7» 43,0я 23,0м 5,5» инверсия тЫ /й^

35,06 20,0»1® 14,4®

02Н5 + + + 25,0».6 18,0® - дупликация ие!ря гт

огш + + + 25,0»-6 1В,0® - дупликация иёр ч ТТЛ

огне 1000,0« 25,5® 8,1» 700.0» 19,0» 5,7» ипиерси* теЛЕ-ттп1>

35,0® 8,1» 340,0»'6 15,06

02208 «0,0« 25,5® + 380,01'6 13,0» 4,3» кпв-еяя те(£-гтяО/£ после

35,0б 110,0»'® 20» Д4».® дун-шш между ¿р/гппО/Е

20,0»>® в ггаЛ

огги «0,0« 25,5® + 380,0».6 15,5»'® 5,0» клверсти теХЕ-гтпО / Е

игзи 35,Об 110,0»-" 5,9»

огг<б

02212 + + + 20,0»-6 15,5»'® 5,9» ннв-см тсЬЕ-ттпО/Е после

02213 + + + 20,0»-6 15,5».6 4,8» дуллюэдми между

02211 + + т- 20,0»'6 15,5»'6 4,8» ъЛр/гтО/Е * тгЛ,

м рогакрш т<АЕ-ггп1>/Е

1. Рваиер исчезнувших исходных фрагментов, которые гибридизукггся со следующими аовдами: "а"- рКК3535 (ггпВ); "б"-рШ7 (аёр)- "в"- ПЦР-аютлифящироганный т^Е-фрпгм гагг; "+"-псясааываег фрагмент, размер которого не напенился по сравнению с соответствующими фрагментами родительских штаммов (Таблица 2).

2. Размер покых фрагментов, хогорые гибридизуются с тени же зондами,

обозначает отсутствие новых фрагментов.

Kleckner N. Ceil. 1986. V.45. Р.801-815]. Так, большинство проанализированных мутантов содержит перестройки типа инверсий, в которые вовлечены такие рибосомные опероны, которые имеют ротивоположное по сравнению с геном udp направлениегранскрипции: rrnD у муташов СМ973, DZ106, DZ118, гтпС : (DZ107) и rrnD/E (АМ2151, DZ2li\ DZ215, DZ216). Исключение в этом отношении составляет мутант DZ110, который, судя по данным гибридологического анализа (Табл.3), содержит рекомбинантный оперон rmA/udp. Механизм образования такого рекомбинантного оперона остается неясным, т.к. гены udp н ггпА имеют одно и то. же направление транскрипции и простая инверсия не может обеспечить подсоединение гена udp под контроль промотора оперона тгпЛ. Очевидно, что эта перестройка явилась результатом двух, а, возможно, и большего числа последовательных событий. На Рис.2 приведены возможные схемы хромосомных перестроек в геноме штамма DZ100.

В отличие от рассмотренных выше случаев относительно простых вариантов перестроек типа инверсий в геноме штамма DZ100, ряд мутантов штамма DZ200, вероятно, содержит более сложные перестройки, являющиеся результатом нескольких последовательных событий (Рис.3). Так, анализ мутантов DZ208, DZ212, DZ213 DZ214 позволяет заключить, что на первом этапе в их геноме произошла инверсия между metE и rrnD/E с образованием рекомбинантного оперона rrnD/E/metE/udp. На втором этапе у этих мутантов, вероятно, произошла дупликация фрагмента, содержащего • рекомбинантный оперон

rrnD/E/metE/udp, о чем свидетельствует появление 3-х новых фрагментов Notl и ВатШ, гибридизующетося с зондами рКК3535 и pUD7 (Табл.3). Наконец, у трех последних штаммов (DZ212, DZ213 и DZ214), судя по появлению фрагментов Notl, BamHl и Pstl, соответствующих по размеру 'фрагментам родительского штамма DZ200 (Табл. 3), очевидно, произошла неполная реинверсия к дикому типу за счет неравного кроссинговера между дуплицированными копиями rrnD/E/metE/udp (Рис. 3).

У мутантов DZ115 и DZ117 анализ гибридизации. свидетельствуют о сохранении в их геноме всех исходных

»I D2100

DZ10B DZ118

rmG

QSEIBO E 250

rmG

E2S0 ilrOQ

rrnD oriC metE-Tn 10 rmA miB rmE

_I ... 1 Jj^j___LL

мймиавввзмшЭ QBBB шВЯВж шЯШВ. BBSBSEm

AI ООО L 200 S3S ТЭБ H24D

rmO/mctE 0,]C rrnOfadp .rmA rtnB rmE

^ i i esLSI

L200 S 340 Т36 Н 240

rmG)mct£ ot;c rmD

S) DZ107 E=fcj I • 1 '^'ч I ^

E"24B L20B А1000

rmGjudp ntiA rmB rmE

rU^LOJ,

S'45 ТЗБ H 240

rmG rrnD oriC metErmA rmA/udp rmB rmE

r) D2110 r=J=3 I ■ cL, (-Lj гвУд

E2S0 А ШОП L2B0Cs'48 T'20 H240

. DZ115 0Z117

rmG rmD oriC metE udp rrn/udp rrnA rmB rmE

t»111 ksttt '.. ■«.1! ! 1i > i i r4r*4i

£250 А1000 L 200 S35 25 ГЗБ H248

Рис. 2. Физическая карта фрагмента rmG-rrnE хромосомы Escherichia coli, вовлеченного в перестройки: а) физическая карта родительского штамма DZ100; б) мутанты с инверсией metE-rrnD; в) мутанты с инверсией met Е-rmG; г) мутант с дупликацией оггерона rrnA я образованней гибридного оперона rrnA/udp; д) мутанты с дупликацией неизвестного оперона ггп и гена ш//> и образованием гибридного оперопа rrn/udp. Незакрашенные полосы показывают участок хромосомы, вовлеченный в перестройку. Строчные латинские буквы обозначают фрагменты хромосомы, расщепленной рестрнкгазой Noil, цифры рядом - размер фрагментов (тли)

ггоЕЛ) «nA oäp meiErTnlO oriC rwD/E

DZZQO ПШОИММН —Ц nnllM дщд^

А81° ТЗБ S35 L20D H44D

.0211 D2215 DZ21B

«mEfD шЛ «KjpfrmDjE arte metE/rrnD/E

гг-Ц cLb

AB,° T3S S3E0 t ZOO H'llO

"1®° =5 «riC met££rnD/£

ö) IIZ208 II Ii Ja Сb j-■ i-1—1 C=U

A810 T36 £20 S3EC L 200 НПО

rmEfl) rmA

, D2212 *T~ ~T 1 ~T

/-) OZ213 miiiinfr'HMri bLÜ hAb i ,—<—,,-L.

OZZM АНЮ - ТЗБ S"2B S3S" L200 HMD

udp/me£

oriC rniD/E

Рис. 3. Физическая карта фрагмента rrriD/E-rrnE хромосомы Escherichia coli, вовлеченного в перестройки: а) родительского штамма DZ200; б) мутанты с инверсией metE-rrnD/Е; в) мутант с инверсией metE-rrnD в последующей дупликацией фрагмента между udp/rmD/E в ггпЛ; г) мутанты с инверсией metE-rrnD/Е, последующей дупликацией фрагмента между udp/rrnD/E и ггпЛ и реинверсией участка metE-rrnD/Е. Незакрашенные полосы показывают участок хромосомы, вовлеченный в перестройку. Строчные латинские буквы обозначают фрагменты хромосомы, расщепленной рестриктазон Noil, цифры рядом - размер фрагментов (тин)

фрагментов ЛГо£[, ВатШ и Р$Л, характерных для родительского штамма (Табл.3). Вместе с тем, появление новых фрагментов ЫоИ и ВатШ, гибрнднзуюшихся с зондами рКК3535 и р1Ш7 указывает на присутствие в их геноме дупликации, в которую вовлечены один из оперонов ггп я ген ш1р. Механизм образования новых рекомбпнантных оперонов гтп/ийр у мутантов 15 и 02117 остается неясным, так как данные гибридизации не позволяют сделать вывода о том, какой из 7-ми оперонов ггп оказывается вовлеченным в дупликацию (Рнс. 2д).

Картирование границ хромосомпых перестроек с помощью ПЦР

Для подтверждения данных физического картирования мутантов и установления точной локализации границ перестроек был применен метод ПЦР. На Рис.4 показана стратегия картирования границ перестроек с использованием ПЦР-амшшфикашш. В ее основе лежит возможность получения строго специфических фрагментов, амшшфицнрованных с помощью набора праймеров, гибридизующихся с различными участками оперонов ггп и генов ийр, тпе1Е, а также элемента 1Б10.

Результаты ПЦР-анализа (Табл.4) свидетельствуют о том, что у всех мутантов происходит амплификация фрашента хромосомы, фланкированного с одной стороны одним из праймеров, специфичным к рнбосомному оперону, а с другой - праймером ГБ^, специфичным к внутреннему участку элемента IБ10. В некоторых случаях проводили амплификацию с использованием дополнительных праймеров, специфичных к генам тпаЬН и иЛр. Данные ПЦР-анализа подтверждают сделанный ранее вывод о том, что у большинства мутантов в результате акта внутримолекулярной транспозиции происходит инверсия участка хромосомы, которая сопровождается разрывом ггя-оперона, гена теЬЕ и потерей маркера устойчивости к антибиотику. Ссквсиировапис амплнфицированных фрагментов, выделенных из нескольких мутантов показало, что акт транспозиции осуществляется таким образом, что Т5> /ОТ.-элемент взаимодействует с проксимальной областью рибосомного оперона, а 1Б/№ с его дкетальной частью (Рис.4). Для вариантов 02118, Т>121\ и 02215 была тфоведена

теШ^ТпТО ИМЯ К101.

6)

Ь)

9 йй гоеШэ

13р

иарг

Рве. 4. Схема картирования концов инверсий с помощью ПЦР-амшгафикацин: а) изучаемый район хромосомы исходного штамма 02100, внизу показаны распределение и ориентация прайме-ров на опероне рибосоиной РНК и генах те£Е и ийр, стрелки в рамках показывают ориентацию Б>70-алеиеэтоа; б) участок хромосомы после инверсии; в) амплификация ДНК штамма ОгИ8 с разными парами праймеров, цифры над стрелками показывают размеры амплификатов (пн)

ТАБЛИЦА 4

АНАЛИЗ АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ

Штамм Праймеры Размер амплнфкц-го локалнзацнз .

фрагмеята(пн) конца гат-снн

СМ973 ггп7-15й 512 235гДЛГЛ(3698нп)

гшЗ-Ка 830

огюб гтпЗ-К^ 693 165гКЫА(1283пп)

15р-ше1Е5 2135.*

Кр-шеЬЕ^ 317.*

15р-ис[р2 1400.*

тт гтЗ 693 ШгГША (1283ип)

ши о 806 235гК,\Л (240Этш)

В2115 гга7-15,1 1855 гЗБгЙКА (50431Ш)

Б2И7 ггп7-Г5({ 1191 235г1ША (4379нп)

эгиз лгп7-Г5а 1129 235г1ША (4317шт)

гтЗ-Ка 210

■■ ггя7-ше1Ес1 2479 -

АМ2151 ггп7-15(1 377 23SгRNA (3565нн)

ггп7-те1Е(1 1727

Бг208 ггпЗ-Кй 1538 235г1ША (3141тш)

т2и ггп7-К(1 957 235г1ША»(4155нп)

ггпЗ-Кд 376

Бг212 ггп7-Г5^ 266 235г1ША <3454гат)

ггп7-те1Е<} 1616

игггз гшТ-Ка 266 235г1ША (3454яп)

ггп7-те1Е^ 1616

П2214 ттл?-^ 266 гЧЬ'гШЧЛ (3454тш)

гто7-18с1 1129 23SrRNA (4317мп)

ггпЭ-ТБй 210

02216 гтЗ-Кд' 1151 165гК.\А (1742нп)

• - Эти фрагменты акплнфицнрухггся у всех мутантов.

контрольная" амплификация фрагментов, один из концов которых локализуется в дистальной области рибосомного оперона (праймеры ггп8 и 9), а второй в пределах 151011 элемента.

Опыты по ПЦР-амплификации с участием пары праймеров ггя7-те1Е<3 (штаммы 02118, .ЛМ2151 н В2213) позволили полупить прямые доказательства, что на стыке инверсий расположен элемент 15/0. Об этом свидетельствует выявление ПЦР-'фрагмен-тов, которые имеют структуру гтПр-15101--те№(1, где ггяр-проксимальная часть рибосомного оперона и тгЛЕ^- ликтальная часть гена теЬЕ (Рис.4). Таким образом, данные ПЦР-анализа, наряду с результатами физического картирования, показывают, что у мутантов происходят крупные хромосомные перестройки в ходе которых ген ийр подставляется в разрыв рибосомного оперона: под контроль его промоторов. ПЦР-анализ позволяет также приблизительно определить в каком участке ггя-оперона расположен конец той или иной инверсии (Табл.4).

Анализ первичной структуры границ хромосомных перестроек

Приведенные выше данные позволяют сделать вывод о том, что именно присутствие в геноме исходных пгтаммов транспозона Тп 10 обусловливает .формирование выявленных ■ геномных перестроек. Так, у всех проанализированных мутантов зафиксировано изменение локализации 15/0-элементов, что вероятней всего является проявлением активности кодируемой элементом В10 транспозазы (Рис.4б).

Для проверки этого предположения у всех мутантов была определена нуклеотидная последовательность участка хромосомы в месте разрыва оперона рибосомной РНК. Анализ нуклеотндов на стыке проксимальной, а такясе дистальной части оперона и 15/0-злемектов выявил присутствие дуплицированных 9-члекных олигонуклеотадов, которые характерны для сайтов-мишеней транспозазы элемента К/О.

Консенсус мишени для транспозазы Тп/0 представляет собой два тандемно расположенных палшщромных триплета нуклеотндов, окруженных незначащими основаниями и имеет структуру 5'-Ы(КГША(КЛ^-3'. Усредненная последовательность встречающихся

Таблица 5

СТРУКТУРА САЙТОВ-МИИГЕНЕЙ ТРАНСПОЗАЗЫ У МУТАНТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ХРОМОСОМНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ

структура локализация кол-во мутанты

мишени мишени на мугто»

ггл-опероне

1) Ь ОСА О ТОТ а 4317 13 Ог118(ггп1>),

ЪтЦггпЛ/Е)

2) Ь АСС А АвТ с 230 И 02201, т202

3) 1 АСТ Т ЮС а 1857 5 02128, 02226

4) а АСТ А ТвТ g 3454 5 01212, ШШ(гт£>/Е)

5) 1 АСС Т СОТ с 1283 4 Б2107(т2С), В2106(ггл£>)

6) а ССС А АСС 1 4155 2 Б2207 , Б2211(гглО/£)

7) 1вСТг ТСС а 2059 2 02124, Б2132(1]ША-Л/я)

8) § тес а АСС § 843 2 О2241, В2243

Э) а ОСТ г ААС с 1742 1 02216(гт0/£)

10) а ССС с ААТ а 3373 1 Бг221

Н) 1 ССв а АСв 3638 1 СМ373(ттпО)

12) Ь САА а АСС с 3565 1 АМ2151(ггпВ/Е)

13) й СТА « АСС а 3141 1 т2ЩггпО/Е)

14) с АСС 1 ССТ а 2666 1 Б2235

15) а АСС с АСТ д 2409 1 ШПЦггпА)

16) t АСА с ССТ % 2301 1 игт

17) ЬACTtGGTg 3685 1 Бггзб

18) а АСС ^ ЛОТ с 2915 1 022 т

13) с АСС а ААС г 5043 1 В211ЦггпВ/Е)

20) сАТГйАОСс 4379 1 Ш117

21) 8 &ТО Ь АСС « 983 1 02121

отклонений от канонической последовательности имеет довольно высокую гомологию с консенсусной (Табл.6).

Исходно, у родительских штаммов СМ922, DZ100, АМ2150 и DZ200 транспозон TniO локализуется в дистальной части гена metE в районе., 2095 нп. Дуплицировашшй олигонуклеотнд имеет структуру 5'-taccgagcg-3', который отличается от консенсуса первым полусайтом -асс-. Это может указывать на то, что ген транспозазы в составе транспозона Tnfö, локализованного в гене metE исход- даго штамма, возможно, несет кахие-либо мутации.

В таблице 5 показаны идентифицированные сайты-мишени транспозазы у всех полученных в процессе работы мутантов. Из таблицы видно, что сайты-мишени имеют разнообразную структуру, которая в отдельных случаях не имеет ничего общего с консенсусом. Это может указывать на изменение специфичности транспозазы Та 10. В литературе имеются данные о некоторых мутантных формах этого фермента [Kleckner 1992], которые приводят к аналогичному эффекту. В составе дативного белка транспозазы идентифицированы два участка, расположенные между 102 и 167, 243 и 264 аминокислотными остатками, которые определяют сайт-специфичность. При этом показано, что замена цистеина на тирозин в положениях 134 и 249 приводит , к изменению специфичности транспозиции в отношении узнавания сайтов-мишеней.

Определение нуклеотндной последовательности транспозазы у исходных штаммов СМ922 и АМ2150 выявило присутствие толковой мутации ( нуклеотвд "С" под номером 1139 поменялся на "G" ), которая приводит к замене цнстецна на триптофан в 344 положении. Хотя идентифицированная нами мутация расположена вне пределов указанных выше двух доменов, вероятно, она также играет важную роль в специфичности фермента.

В таблице б суммированы данные по анализу сайтов-мишеней для транспозазы дикого типа, мутантов с хромосомными . перестройками и описанных в литературе мутантов с аминокислотными заменами CY134, CY249 [Kleckner 1992].

Поскольку сайт-консенсус является палиндромом, то анализ проводился по- сумме двух полу сайтов. Втречаемость каждого из четырех нуклеотидов выражена в процентах.

Таблица б

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ САЙТОВ-МИШЕНЕЙ ДЛЯ ТРАНСПОЗАЗЫ ДИКОГО ТИПА, МУТАНТОВ С ХРОМОСОМНЫМИ ПЕРЕСТРОЙКАМИ И ДРУГИМИ МУТАНТАМИ.

частота встречаемости в % Иерархический

N С А Т С ряд оснований

дикий тип 1 86 4 0 0 С > А > С, Т

2 0 0 2 98 С > Т > А, С

3 10 19 68 3 Т> А> ОС

Мутанты серии 1 35 62 2 1 А > О Т> С

1)2100 н 02200 2 2 1 5 92 С > Т > С > А

3 6 35 35 24 Т,А> С > С

СУШ 1 75 24 0 1 С > А > С > Т

2 0 3 13 84 С>Т>А>С

3 . .1.9 23 . 46 12 Т> А>О С

СУ249 1 55 38 3 4 С > А > С > Т

2 3 14 27 56 С > Т > А > С

3 11 18 59 12 Т > А > С > С

Горячие 1 32 66 2 0 А > С > Т

точки 2 2 0 0 98 С>С

3 2 43 31 24 А>Т> О С

в этой колонке покалано расположение пуклеотндов п волусайте-мишегаг, т.е. 12 3 54} С Т-3'

Из даиных таблицы 6 видно, что у дикого типа и мутантов СУ 134 и СУ249 (из литературных данных) преобладают полусайты с нуклеотидным составом ОСТ,соответствующие консенсусной последовательности. У вариантов с мутантной транспозазой изменяется только соотношение между лидирующим и последующими нуклеотиаами в ряду. Так у дшсого тала отношение О:А (первое основание триплета) равняется 94:4, у СУ134 - 75:24, у СУ249 - 55:38. У полученных нами мутантов с хромосомными перестройками картина совсем иная. Лидирухцее положение вместо "<3" занимает "А" в соотношении 62:35. На третьем месте в триплете с одинаковой частотой всречаются "А" и "Т", что также сильно отличается и от дикого тала и от других мутантов" у которых "Т" заметно преобладает в различных соотношениях (см .табл. 6). 'Дикому типу с близким соотношением (98%) соответствует только "С" во второй позиции в полусайте.

Таким образом, структура проанализированных сайтов-мишеней у- мутантов позволяет сделать вывод, что идентифицированная нами аминокислотная замена в белке транспозазы в 344 положении приводит к изменению специфичности фермента.' В пользу этого довода свидетельствует также сл едущее обстоятельство. Нуклеохкдныс последовательности 165, 23Б, 5Б субъеяйшц рибосомной ТНК, в том числе и спейсерные области не содержат олигонуклеотвд структуры 5'-ЫОСТМАОСЫ-3'. Исключение составляет только фрагмент ДНК, кодирующий аланиновую тРНК. Этот ген встречается у трех оперонов ггпО, ттпА и ттпН и как раз несет сайт-консенсус. В таблице 5 в 7 строке приводится сайт с последовательностью 5Ч£сШ£са-3', который обнаружен у двух мутантов DZí2i и 02132 в гене ШИА-А1а и отстоит от вышеупомянутого консенсуса всего на 11 нуклеотидов. Таким образом, потенциальная мишень узнавания, характерная для транспозазы дикого типа у этих мутантов остается незадействованной. Очевидно, что причиной этого, скорее всего, является измененная специфичность действия идентифицированной нами мутантной транспозазы.

На ' рисунке 5 схематично показан усредненный оперон рибосомной РНК с распределением- выявленных нами сайтов-

Л

Щ п ппп ппп п

1В5гЯМА

гз5гяги

ж

Т V т 5 1 БкЬ вБгША

Т\

ШКА

1

Рнс. 5. Распределение сайтов мишеней-транспозицин у изученных мутантов. Условно показан усредненный оперон рнбосом-ных РНК. Цифры внизу указывают размер оперона в тли. Вертикальные столбики указывают локализацию .сайтов, число, клеток соответсвует количеству мутантов попадающих на данный сайт.

мишеней транспозиции, соответствующим местам разрыва внутри оперона в результате хромосомных перестроек. Из рисунка видно, что сайты распределяются практически равномерно по всему оперону. Сайты-мйшени, на которые приходится больше одной транспозиции принято считать горячими точками. Их распределение внутри оперонов рРНК, также молено считать равномерным. Следует заметить, что втречаются одинаковые сайты-мишени на разных оперонах рибосомной РНК (см. табл.3 и 5), то есть акт транспозиции, инициируемый при использовании данной системы селекции, изначально имеет сайт-специфическую направленность и, вероятно, уже на следующем этапе происходит фиксируемая нами хромосомная перестройка, вовлекающая тот или иной оперон, в состав которого входит данный сайт-мишень.

В заключение следует отметить, что результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что используемый нами метод селекции, направленный на усиление экспрессии гена «dp,'приводит , к отбору специфических хромосомных перестроек, затрагивающих опероны рибосомной РНК. Это подтверждает предположение о том, что высокий уровень экспрессии гена udp в штаммах, содержащих такие хромосомные перестройки обеспечивается за счет его" сквозной транскрипции с сильных промоторов- оперонов ,тгп. Отмеченное нами повышение частоты образования перестроек на фоне мутации dam позволяет заключить, "что_ ключевуто роль в образовании этих перестроек играет транспозаза, кодируемая элементом IS10 - составным компонентом транспозонаТп/0. "

ВЫВОДЫ

1. С использованием разработанного ранее метода селекции -получена коллекция мутантов, содержащих протяженные перестройки генома E.coli, которые обусловливают усиление экспрессии гена vdp.

2. Показано, что в геноме бактерий dam' частота хромосомных .перестроек повышается в 8-10 раз, что укалывает на участие транспозазы Тп/0 в образовании перестроек.

3. Осуществлено физическое картирование мутантов с использованием пульсэлектрофореза и Саузерн-гибридизации. Показано, что у всех исследованных мутантов один конец перестройки , затрагивает ген metE, а другой расположен внутри одного из семи оперонов, коднрующга; синтез рнбосомной РНК.

4. С помощью ПЦР-анализа определена локализация границ перестроек внутри рибосомных оперонов.

5. Осуществлено секвенирование границ перестроек у 55 независимых мутантов. На стыках перестроек выявлены -дупликации 9. пар нуклеотидов, характерные для сайтов-мишеней транспозазы транспозона ТаЮ.

6. Анализ дуплицированных олигонузслеогидов позволяет вывести усредненный сайт, который по структуре отличается от сайта-консенсуса, узнаваемого транспозазой дикого типа.

7. Осуществлено секвенирование гена транспозазы TníO, содержащегося в геноме исходных штаммов в составе транспозона Тп 10, интегрированного в гене metE. Идентифицирована аминокислотная замена шстеин-триптофан в 344 положении.

8. Сопоставление выведенного нами усредненного сайта-мишени у изученных мутантов и идентифицированной нами мутации^ в гене, транспозазы .Тй/0 .позволяет заключить,, что аминокислотная замена в 344 положении имеет определенное значение для сайт-специфичности транспозазы.

Основные материалы диссертации отражены в следующих печатных работах:

1) M.Fonstein, T.Nikolskaya, D.Zaporojets, Y,Nikolsky, S.Kulakauskas, A.Mironov. TníO-Mediated Inversions Fuse Uridine Phosphorylase (udp) and rRNA Genes of Escherichia coli', Journal of Bacteriology, Apr.1994, p.2265-227i.

2) Д.Запорожец, А. Миронов "Физическое картирование геномных перестроек Escherichia coli с помощью пульсэлектрофореза к ПЦР-метода. Генетика 1996, N1.

3) D.Zaporojets, A.Mironov "Large Scale Rearrangements of E.coli Chromosome", 17 Internat. Congress of Genetics, Birmingham 1993, p. 183

Подписано к печати" -3 "_@ &_; 1995 года.

Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4 Производственном комбинате Объем Д 5 пл. Литературного фонда .'. " Зак. ^^^Тир. ЮР • ■

ул. Усиевича, д. 8-а Тел. 152-17-71