Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование пространственной структуры уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium и её комплексов с аналогами субстратов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Донцова, Мария Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Часть 1. Характеристика нуклеозидфосфорилаз из различных видов организмов.

1. Введение.

2.1. Нуклеозидфосфорилазы, мономер которых состоит из одного домена.

2.1.1. Общая характеристика. t 2.1.2. Аминокислотные последовательности.

2.1.3. Рентгеноструктурные исследования.

2.1.4. Активный центр.

2.2. Нуклеозидфосфорилазы, мономер которых состоит из двух доменов.

2.2.1. Общая характеристика.

2.2.2. Аминокислотные последовательности.

2.2.3. Рентгеноструктурные исследования.

2.2.4 Активный центр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование пространственной структуры уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium и её комплексов с аналогами субстратов"

2.1. Кристаллизация в объеме.46

2.2. Кристаллизация диализом.47

2.3. Кристаллизация методом диффузии паров растворителя.48

2.4. Кристаллизация на подложке.50

2.5. Кристаллизация в геле. 51

2.6. Кристаллизация в невесомости.53

2.7. Кристаллизация в центрифуге.56

3. Автоматизация экспериментов по кристаллизации.57

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.59

1. Материалы.59

1.1. Химические материалы.59

1.2. Биологические материалы.59

2. Методы.59

2.1. Выделение и очистка уридинфосфорилазы

Salmonella typhimurium.59

2.2. Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium.62

2.3. Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium в комплексе с аналогами субстратов.63

2.4. Получение наборов дифракционных данных.64

2.5. Определение структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium.66

2.6. Определение структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium в комплексе с аналогами субстратов.70

2.6.1. Комплекс уридинфосфорилазы S. typhimurium с урацилом и ионом сульфата.70

2.6.2. Комплекс уридинфосфорилазы S. typhimurium с уридин

5'-монофосфатом и ионом сульфата.71

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.72

1. Получение гомогенного препарата уридинфосфорилазы

S. typhimurium .73

2. Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium.76

3. Кристаллизация уридинфосфорилазы 5". typhimurium в комплексе с аналогами субстратов.77

4. Сбор дифракционных данных с кристаллов уридинфосфорилазы S. typhimurium и определение пространственной структуры фермента.79

5. Структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium.82

6. Активный центр фермента.87

6.1. Место связывания урацила.90

6.2. Место связывания иона фосфата.92

6.3. Место связывания рибозы.93

5. ВЫВОДЫ.95

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.96

БЛАГОДАРНОСТИ.110 4 А С

ВВЕДЕНИЕ

Способность клеток поддерживать постоянный запас пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов зависит от процесса синтеза нуклеотидов из имеющихся готовых продуктов или de novo. Относительная важность любого из этих двух синтезов в сохранении нуклеотидного запаса различна и зависит от клеток и типов тканей. Нуклеозидфосфорилазы обеспечивают клетку пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, которые могут использоваться альтернативно синтезу de novo.

Биомедицинский интерес к нуклеозидфосфорилазам возник из их ключевой роли в нуклеотидном метаболизме и их необходимости для нормальной клеточной функции. Нуклеозидфосфорилазы привязаны к клеточному уровню свободных оснований и нуклеозидов, катализируя их взаимопревращение. Они участвуют в метаболизме противораковых и противовирусных препаратов, являющихся аналогами нуклеозидов. Было предположено, что ингибиторы специфичные к нуклеозидфосфорилазам могут усиливать действие определенных нуклеозидных аналогов при химиотерапевтическом воздействии, предотвращая их разрезание и последующую инактивацию.

Нуклеозидфосфорилазы разделяют на два семейства: пуриновые нуклеозидфосфорилазы, расщепляющие как гуаниновый, так и адениновый нуклеозиды, и пиримидиновые нуклеозидфосфорилазы, которые делятся на два типа: уридинфосфорилазу и тимидинфосфорилазу. Расщепление цитидина не описано до сих пор. К настоящему моменту наиболее изученными являются пуриновые нуклеозидфосфорилазы и тимидинфосфорилазы. Последние данные об исследованиях нуклеозидфосфорилаз приведены в первой части литературного обзора данной диссертации.

Существование уридинфосфорилаз впервые было установлено в 1952 году (1), но до сих пор эти ферменты остаются наименее изученными. Одним из подходов к установлению механизма действия ферментов является сравнительное изучение особенностей структурно-функциональной организации этих белков, выделенных из различных организмов. До настоящего момента была известна только пространственная структура уридинфосфорилазы Escherichia coli. Это была первая пространственная структура для ферментов данного типа. Было показано, что фермент состоит из шести одинаковых мономеров молекулярной массой 27 кДа. Каждый мономер представляет собой однодоменный белок а/(3 типа. В настоящей диссертации изучалась структура уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium. При сходстве аминокислотных последовательностей уридинфосфорилаз S. typhimurium и Е. coli, тем не менее, наблюдается существенное отличие в их ферментативных свойствах. В частности, уридинфосфорилаза S. typhimurium обладает более широкой субстратной специфичностью в отношении природных нуклеотидов и их аналогов по сравнению с ферментом из Е. coli. Кроме того, уридинфосфорилаза S. typhimurium обладает более высоким, чем ее аналог из Е. coli, сродством ко всем исследованным субстратам. Например, уридинфосфорилаза S. typhimurium связывается с тимидином в 4 раза сильнее, чем уридинфосфорилаза Е. coli (2).

Целью настоящей работы являлось определение пространственной структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium и комплексов этого фермента с аналогами субстрата уридин-5 '-монофосфатом и урацилом. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- разработка методики выделения и очистки гомогенного препарата фермента уридинфосфорилазы S. typhimurium;

- поиск условий кристаллизации и выращивание пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов нативного фермента и его комплексов с аналогами субстратов;

- получение экспериментальных наборов рентгеновских интенсивностей с выращенных кристаллов с использованием синхротронного излучения;

- определение и уточнение пространственной структуры нативного фермента и его комплексов с аналогами субстратов;

- анализ пространственной структуры активного центра фермента.

Ранее в научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов была создана плазмида, несущая ген уридинфосфорилазы S. typhimurium, и получен штамм-суперпродуцент фермента. Используя этот продуцент, в данной работе была разработана методика получения высокоочищенных препаратов уридинфосфорилазы S. typhimurium в препаративных количествах. Полученный белок был охарактеризован по подвижности в гель-электрофорезе в присутствии SDS и в неденатурирующих условиях. Был проведен поиск условий кристаллизации и получены пригодные для рентгеноструктурного анализа две кристаллические формы фермента уридинфосфорилазы S. typhimurium. А также были получены кристаллы комплексов уридинфосфорилазы S. typhimurium с аналогами субстратов: ионом фосфата, урацилом и уридин-5'-монофосфатом. С полученных кристаллов были собраны наборы дифракционных данных: для нативного фермента - с разрешением 2.9 А и 1.7 А; для комплекса с ионом фосфат - с разрешением 2.5 А; для комплекса с урацилом и ионом сульфата - с разрешением 2.5 А; для комплекса с уридин-5'-фосфатом и ионом сульфата - с разрешением 2.3 А.

С использованием полученных наборов дифракционных данных были определены пространственные структуры нативного фермента и его комплексов с перечисленными выше соединениями. Полученные структуры позволили охарактеризовать активный центр фермента.

Литературный обзор данной работы состоит из двух частей. Первая часть посвящена общей характеристике нуклеозидфосфорилаз. Подробно описана история открытия этих ферментов, первые исследования механизма катализа, а также новые данные о пространственных структурах нуклеозидфосфорилаз из различных организмов. Вторая часть литературного обзора посвящена методам кристаллизации.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Донцова, Мария Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика выделения и очистки уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium, получен препарат белка с чистотой 95% и определены условия его кристаллизации.

2. Выращены пригодные для рентгеноструктурного анализа кристаллы, собраны дифракционные данные с разрешением 2.9 А, решена и уточнена пространственная структура уридинфосфорилазы S. typhimurium в нативном состоянии при разрешении 2.9 A (PDB ID: 1RYZ).

3. Выращены кристаллы комплекса уридинфосфорилазы S. typhimurium с ионом фосфата, получен экспериментальный набор интенсивностей на синхротронном излучении. Решена и уточнена пространственная структура комплекса с разрешением 2.5 А, локализован ион фосфата в активном центре (PDB ID: 1SJ9).

4. Оптимизированы условия кристаллизации для получения пространственной структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium высокого разрешения. Собран набор дифракционных данных с разрешением 1.77 А, решена и уточнена атомная структура фермента (PDB ID: 1Y1T).

5. Выращены кристаллы комплекса уридинфосфорилазы S. typhimurium с урацилом и ионом сульфата и собран набор рентгенодифракционных данных при разрешении 2.55 А. Определена и уточнена пространственная структура комплекса (PDB ID: 1Y1S).

6. Выращены кристаллы комплекса уридинфосфосфорилазы с уридин-5'-монофосфатом и ионом сульфата. Получен экспериментальный набор рентгенодифракционных интенсивностей, решена и уточнена атомная структура комплекса уридинфосфорилазы S. typhimurium при разрешении 2.35 A (PDB ID: 1Y1Q).

7. Локализован активный центр фермента уридинфосфорилазы S. typhimurium, который образован остатками двух соседних мономеров. На димер приходится два активных центра, связанных осью симметрии второго порядка. Установлено изменение положения петли 224-234 в зависимости от занятости активного центра. Петля может находиться в открытой, промежуточной и закрытой конформациях.

96

3. Заключение

Нуклеозидфосфорилазы, мономеры которых состоят из одного или двух доменов, представляют собой два структурно индивидуальных семейства ферментов, что катализируют похожие фундаментальные биохимические реакции. Наиболее вероятно, что произошли они от разных предшественников и эволюционировали независимо. Несмотря на это, нуклеозидфосфорилазы имеют только два способа укладки белковой молекулы, вовлеченные в фосфоролиз большого количества пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов. Анализ последовательностей нуклеозидфосфорилаз в сочетании с известными пространственными структурами обеспечил информацией относительно структурно -функциональной взаимосвязи в обоих этих семействах и помог объяснить различия и схожесть, что существует среди принадлежащих им ферментов. В то время как укладка белковой молекулы в первом и втором типах не похожа, положение субстратов в активном центре и конформация связанных нуклеозидов, оказалась подобной. К тому же, хотя механизм катализа для тимидинфосфорилаз не изучен так, как для пуриновых нуклеозидфосфорилаз, он возможно очень похож на предполагаемый механизм катализа для ферментов первого типа.

Кроме этого, примеры нуклеозидфосфорилаз первого типа показали, что пространственные структуры часто более консервативны среди белков выполняющих одинаковые функции, чем их аминокислотные последовательности. Поэтому структурная информация может служить более точной оценкой в определении дальнего родства, чем идентичность последовательностей, а также может оказаться полезной для поиска клинически пригодных ингибиторов.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ЧАСТЬ 2. МЕТОДЫ КРИСТАЛЛИЗЦИИ БЕЛКОВ 1. Введение

Первые кристаллы белков, в частности гемоглобина, были получены более 150 лет назад (81). С тех пор кристалл стал признанным знаком качества высокой степени очистки белка. После возникновения в 50-е годы прошлого столетия такой области науки как рентгеновская кристаллография, кристаллизация приобрела большое значение для получения новых знаний об устройстве молекул различных веществ. Белковая кристаллография до сих пор является одним из главных источников точного знания о пространственной структуре молекулы белка. Кристаллизация белков отличается от кристаллизации обычных органических и неорганических веществ незначительно. Как частный случай кристаллизации веществ из раствора - это равновесный процесс. В его основе лежат физические явления, описываемые в терминах термодинамики, а сам процесс кристаллизации подчиняется принципам минимизации свободной энергии. Справедливы все основные термодинамические закономерности кристаллизации, установленные для низкомолекулярных соединений - зависимость от температуры, давления, концентрации (пересыщения). Кристаллизация начинается после достижения белковым раствором пересыщенного состояния. В условиях пересыщения система, содержащая растворенный белок, переводится в новое состояние равновесия и происходит распределение белка между твердой и жидкой фазой. Переход в кристаллическую фазу приводит к появлению большого числа межмолекулярных взаимодействий, понижающих уровень потенциальной энергии системы. В твердом теле минимум свободной энергии достигается, когда молекулы располагаются симметричным, периодически повторяющимся способом, т.е. в кристалле. В поддержании кристаллической решетки белка принимают участие водородные и электростатические связи, а также гидрофобные взаимодействия между молекулами. При образовании кристалла происходит также изменение состава окружающего раствора, вследствие перераспределения его компонентов между твердой и жидкой фазами. В результате вблизи растущего кристалла возникают конвекционные потоки, усиливающиеся при увеличении размеров кристалла (82). Специфика белковой кристаллизации обусловлена сложностью строения и многообразием биологических молекул, их конформационной подвижностью и особенными физико-химическими свойствами. Например, оптимальная стабильность белковых растворов ограничивается довольно узким интервалом рН и температуры. Кроме того, макромолекулы в значительно большей степени, чем малые молекулы, чувствительны к внешним условиям. Их конформация может изменяться при изменении физико-химических параметров (температуры, рН, ионной силы, природы растворителя), при связывании лигандов (субстратов, кофакторов, ионов металлов и других ионов). Воздействуя добавками малых молекул на поверхность белковой глобулы, активируя или инактивируя на ней те или иные группы, можно влиять на взаимодействие молекул белка между собой и с внутренней средой кристалла - растворителем (83).

Хотя до сих пор для каждого конкретного белка условия кристаллизации подбираются в большой степени эмпирически в соответствии с опытом исследователя, выработан и сформулирован ряд приемов и правил, достаточно широко применяемый на практике и помогающий сократить время поиска условий кристаллизации. Делаются попытки распространить опыт, накопленный при выращивании кристаллов малых молекул, на выращивание кристаллов белков.

Часть методов, используемых для выращивания белковых кристаллов, разработана уже давно. Использование других, началось сравнительно недавно, но в настоящее время находит все большее применение. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, и выбор того или иного метода кристаллизации зависит от конкретных условий и опыта исследователя.

2.1. Кристаллизация в объеме

Исторически именно этот метод стал впервые применяться для кристаллизации белков. Он основан на прямом добавлении осадителя к белковому раствору до появления опалесценции (состояния пересыщения). После быстрого удаления образовавшихся зародышей кристаллов центрифугированием, раствор оставляют для роста крупных кристаллов. Этот метод удобен для тех белков, у которых последней стадией очистки является кристаллизация. Недостатки метода состоят в необходимости использовать большие количества белка, а также в сложности изменения условий по ходу кристаллизации.

Модификация метода кристаллизации в объеме, позволяющая использовать всего 3 мкл исходного раствора белка на пробу, была разработана Доблером (84). Такой микрометод удобен для быстрого подбора оптимальных сочетаний нескольких параметров, например, концентрации белка и осадителя.

В последнее время была предложена новая версия микрометода кристаллизации в объеме - кристаллизация в капельках масла (85). При этом используют объемы растворов до 1-2 мкл. Масло предохраняет образцы от испарения, загрязнения и нежелательных колебаний физических параметров. Смешение растворов проводится с помощью автоматических систем, что существенно ускоряет время эксперимента и обеспечивает его точность (86). Одновременно можно ставить на кристаллизацию до 1000 образцов, т.е. просканировать огромное число условий (87). Авторы считают этот метод более эффективным, чем общепринятый метод диффузии паров растворителя, о котором будет рассказано ниже. Микрометод кристаллизации в объеме позволяет получить небольшое количество кристаллов в каждой капле кристаллизуемого раствора.

2.2. Кристаллизация диализом

Метод равновесного диализа применяется при работе как со сравнительно большими (до 1 г), так и с маленькими (порядка нескольких мг) количествами белка и используется как на начальных этапах изучения растворимости белка и поиска условий кристаллизации, так и для выращивания крупных кристаллов. Состояние пересыщения белкового раствора достигается посредством диализа через полунепроницаемую мембрану против возрастающих концентраций буфера или осадителя. Медленно изменяя концентрацию противораствора, удается создать ограниченное пересыщение белкового раствора. Преимуществом метода является его обратимость, что позволяет одну и ту же порцию раствора использовать с противорастворами различного состава, молярности и рН. Степень пересыщения легко контролировать и изменять, меняя состав внешнего раствора (88).

Для кристаллизации белка методом равновесного диализа используются диализные ячейки разнообразных типов, однако принцип их действия одинаков. Помещенный в ячейку с полупроницаемой мембраной, раствор белка отделен от большого объема растворителя или осадителя этой мембраной, проницаемой для малых молекул (ионов, добавок, буферов) и непроницаемой для белков. При диализе постепенно происходит выравнивание концентраций низкомолекулярных соединений в белковом и внешнем растворе. Концентрацию осадителя во внешнем растворе повышают до тех пор, пока не начинается осаждение белка.

Метод диализа для микро количеств белка был впервые применен Цеппезауэром и сотрудниками (89), сконструировавшими специальные микро ячейки. Техника метода постоянно совершенствуется. В качестве микродиализных ячеек используют также тонкостенные рентгеновские капилляры, закрытые полунепроницаемой пробкой из полиакриламидного геля, стеклянные трубочки, на одно из отверстий которых помещена диализная мембрана (90). Широкое распространение получили диализные "пуговицы", в которых можно диализовать 10 мкл белкового раствора. Чтобы уменьшить скорость достижения равновесия и обеспечить лучший контроль над ростом кристаллов, применяют метод двойного диализа, для которого сконструирована специальная ячейка (91). Белковый раствор, помещенный в диализную "пуговицу", уравновешивается против такой концентрации осадителя, при которой белок находится в состоянии ограниченного пересыщения. Резервуар, содержащий противораствор и находящуюся в нем "пуговицу" с белковым раствором, закрывают полупроницаемой мембраной и помещают в другой резервуар большего размера с более высокой концентрацией осадителя, при которой белок осаждается полностью. Состояние пересыщения белкового раствора достигается посредством диализа против осадителя, концентрация которого постепенно растет за счет диализа против того же осадителя более высокой концентрации. Скорость достижения равновесия зависит от объемов осадителя в обоих резервуарах. Авторы считают этот метод более контролируемым и в большей степени пригодным для получения больших белковых монокристаллов по сравнению с обычным диализом.

2.3. Кристаллизация методом диффузии паров растворителя

Среди микрометодов этот способ кристаллизации является наиболее распространенным. Состояние ограниченного пересыщения достигается за счет диффузии растворителя (а также осадителя, если он летучий) через газовую фазу. Впервые этот метод был предложен Хампелом с сотрудниками и использован для кристаллизации т-РНК в 1968 году (92). Метод удобен как на начальных этапах работы, когда необходимо сканировать большой диапазон условий, так и для выращивания крупных белковых кристаллов. Эксперимент проводят, помещая на силиконированные стекла капли раствора белка в буфере, содержащие необходимые добавки и осадитель. Этими стеклами герметично закрывают резервуар с осадителем или помещают их в герметично закрытые ячейки с осадителем (93). Концентрация осадителя в резервуарном растворе на 30-50% превышает концентрацию осадителя в капле с раствором белка. Из-за разницы концентраций осадителя в резервуарном и белковом растворе происходит возгонка воды или летучих компонентов из белкового раствор в резервуарный, пока давление паров над обоими растворами не сравняется. В результате объем капли уменьшается и возрастает концентрация белка и остальных компонентов. Скорость диффузии пропорциональна концентрационному градиенту. Если концентрация осадителя в резервуаре подобрана правильно, степень пересыщения достигается медленно, что важно для образования и роста ограниченного числа зародышей кристаллов. Метод используется в трех вариантах, различающихся способом размещения белковой капли: метод висячей капли, лежачей капли и метод капли типа "сендвича", представляющий собой сочетание двух предыдущих (90). Описанный метод прост и удобен. Для его использования требуются сравнительно небольшие количества белка. Он дает возможность опробовать сразу много разных условий в процессе кристаллизации изменять концентрацию осадителя в резервуаре. Имеется также возможность прямого наблюдения проб под микроскопом без нарушения равновесия в кристаллизационной ячейке.

2.4. Кристаллизация на подложке

Метод искусственной эпитаксии представляет собой новое направление в кристаллизации белков. В этом случае ориентированный рост кристаллов белков происходит на произвольных (обычно аморфных) подложках, имеющих кристаллографически симметричный рельеф. Ранее метод неоднократно использовался для получения ориентированных неорганических пленок (94). При эпитаксиальном росте регулярность поверхности используемых минеральных матриц облегчает образование кристаллических зародышей. Частным случаем эпитаксиальной нуклеации является зарождение кристаллов на волокнах целлюлозы, случайно попавших в раствор (90).

Кристаллизация белков на ориентированных подложках, являющаяся более сложным процессом в сравнении с ростом кристаллов малых молекул, обсуждается в работе Feigelson (95). McPherson с соавторами изучали ориентированный рост лизоцима на апофеллите (96). Фундаментальное исследование кристаллизации каталазы, канавалинна и лизоцима на ориентированных поверхностях проведено в работе Givargizov (97). Было изучено влияние симметрии и профиля микрорельефа и детергентов на ориентированный рост белковых кристаллов. Для кристаллизации использовали метод диффузии паров растворителя в варианте лежачей капли на матрицах кремния. Для каталазы Penicillum vitale рост кристаллов на подложках из монокристаллических пластин кремния, на которых методами фотолитографии создан полосчатый микрорельеф, приводил к ориентированному расположению выросших кристаллов. Авторы предложили возможные механизмы такого роста, а также показали, что микрорельеф можно считать своего рода катализатором процесса образования зародышей, сокращающим инкубационный период появления кристаллов и понижающим величину степени насыщения, необходимого для нуклеации.

Метод эпитаксиального выращивания кристаллов, обеспечивающий высокую их упорядоченность, пока ограниченно применяется в кристаллизации биологических макромолекул из-за трудности подбора подходящих минеральных матриц. Дело в том, что многие подложки способствуют адгезии белков. Иногда сила взаимодействия с подложкой оказывается больше силы, связывающей молекулы в кристаллическую решетку. Применение эпитаксиальных субстратов полезно в тех случаях, когда образуются несовершенные кристаллы, надо уменьшить количество зародышей или когда кристаллы вообще не растут.

2.5. Кристаллизация в геле

Этот метод вошел в практику кристаллизации белков сравнительно недавно. Гели, используемые в кристаллизации, являются гидрогелями и представляют собой двухкомпонентные системы, в которых кристаллизационный раствор (жидкая фаза) пропитывает микропористую гибкую полимерную сетку (твердая фаза). В процессе образования геля происходит его структурирование, приводящее к возникновению полимерного кластера во всем объеме раствора. Этот процесс может быть обратимым в случае физических гелей (желатин, агароза), которые состоят из свободных полимерных цепей и получаются понижением температуры полимерного раствора, или необратимым в случае химических гелей (силиконовых, полиакриламидных), получаемых образованием прочных связей между полимерными цепями (98).

Использование гелей способствует более равномерной встречной диффузии осадителя и белка и созданию плавного градиента концентраций. Кроме того, гель предотвращает появление конвекционных потоков в кристаллизационной среде (99).

Для кристаллизации в геле применимы все классические методы кристаллизации из растворов. Процесс роста кристаллов белка в геле определяется теми же факторами, что и рост из раствора. Чистота и гомогенность белкового препарата также необходимы.

Существует несколько способов кристаллизации с применением гелей. При кристаллизации лизоцима с использованием в качестве осадителя NaCl осадитель помещали в слои геля, а белковый раствор наносили на него (99). Условия для роста кристаллов возникали в результате встречной диффузии ионов осадителя и молекул белка, а кристаллы образовывались в слое раствора над гелем, на границе раздела гель - раствор, т.к. коэффициент диффузии белка существенно ниже, чем соли.

В другом способе, напротив, раствор белка наносится в слои геля, а раствор соли - сверху (90). В этом случае кристаллы вырастают в геле. Недостатком этого способа является необходимость извлечения хрупких кристаллов белка из геля.

Кристаллизация белка в геле может происходить, когда слой геля, содержащий только буферный раствор, помещен между растворами белка и осадителя. В этом случае диффузия через слой геля смягчает любые резкие изменения в окружающей среде, что способствует росту более совершенных кристаллов.

Наконец, можно проводить кристаллизацию диффузией жидкость - жидкость в каплях, содержащих одновременно белок, буфер, осадитель и агарозу. Оптимальная концентрация агарозы в каплях определяется в предварительных экспериментах. Так, Provost и Robert (98) показали, что более совершенные по форме кристаллы лизоцима вырастают только при концентрациях агарозы 0.1% и выше.

При кристаллизации в геле время роста белковых кристаллов увеличивается, поэтому иногда наблюдается нежелательное "старение" белка. Чтобы избежать его рекомендуется увеличить степень пересыщения, что при обычных условиях роста в свободных растворах является невозможным. Метод полезно применять, если в обычных условиях появляются мелкие кристаллы с дефектами, делающими их непригодными для рентгеноструктурного исследования.

Поскольку рост кристаллов в гелях имеет ряд общих черт с кристаллизацией в условиях микрогравитации и при макрогравитации, использование гелей помогает осуществить предварительный поиск условии, после чего целесообразно применять эти перспективные и развивающиеся методы кристаллизации.

2.6. Кристаллизация в невесомости

Новым направлением в кристаллизации белков стало изучение процесса роста кристаллов в космосе при отсутствии гравитации. В обычных условиях в гравитационном поле по мере роста кристалла около его поверхности уменьшается плотность маточного раствора; раствор с низкой плотностью начинает подниматься, создавая конвекционные потоки. Конвекционные потоки оказывают существенное влияние на рост кристалла, в разной степени изменяя концентрацию маточного раствора вблизи разных участков поверхности, и препятствуют однородному росту кристалла. Уменьшить вредное влияние конвекции можно, используя кристаллизацию в геле. Однако, желаемый эффект в этом случае не всегда достигается, поскольку хрупкие белковые кристаллы часто разрушаются при взаимодействии с гелем. В невесомости удается избежать конвекции в кристаллизационном растворе, а также достичь медленного и равномерного смешивания растворов белка и осадителя. При этом образующиеся кристаллы плавают в жидкой фазе, не осаждаются, что способствует образованию более изометричной формы.

Эксперименты по кристаллизации белков в космосе проводятся учеными ряда стран с 1984 года (100). К настоящему времени более 100 различных макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) "участвовали" в космических экспериментах. Только на американских спутниках эксперименты по росту кристаллов биологических макромолекул в условиях невесомости проводились во время 28-ми полетов.

Эксперименты по кристаллизации в космосе можно условно разделить на две группы. Задачей одних является получение кристаллов модельных белков, условия образования которых, определены и отработаны на Земле. Цель таких экспериментов - проверка используемого оборудования и сравнение характеристик кристаллов, полученных в земных условиях и в невесомости (101. - 104). Задачей других экспериментов является выращивание кристаллов белков, интересных в функциональном плане, которые не удается получить на Земле. Однако из-за технических сложностей не все эксперименты оказываются удачными.

Наиболее успешным можно считать эксперимент, проведенный американскими учеными в 1988 году (101). Кристаллизация продолжалась 72 часа. Качество кристаллов проверялось сравнительным анализом дифрактометрических данных. Из 11 белков для 3 удалось получить кристаллы более упорядоченные, чем на Земле.

В нашей стране также была создана аппаратура для кристаллизации белков в космических условиях на спутниках "Фотон" и на орбитальной станции «Мир». Проведенные на них эксперименты и результаты представлены в работе Траханова (105).

На новой международной космической станции в настоящее время также проводятся эксперименты по кристаллизации различных белков. Результаты этих экспериментов обсуждаются в работах Vergara (106) и Vahedi-Faridi

107). Эти авторы показали что кристаллы, полученные в невесомости, как правило, отличаются большими размерами, низкой мозаичностью и отражают рентгеновские лучи до высокого разрешения 1.2 —1.9 А. На Земле таких результатов для исследуемых белков получить не смогли. В течение последних нескольких лет специальное техническое оборудование, предназначенное для проведения космических кристаллизаций, стремительно развивается. Для кристаллизации в невесомости были сконструированы различные кристаллизационные ячейки, позволившие адаптировать основные применяемые на Земле методы кристаллизации белков: диффузии в парах в варианте висячей капли, диализа, кристаллизации в объеме. Выбор физико-химических параметров процесса (природы буфера, концентрации и рН растворов белка и осадителя, температуры и т.д.) происходит на Земле, где ставится контрольная кристаллизация исследуемого белка в тех же ячейках и с теми же реагентами.

Хотя на основании накопленного материала обобщать и делать однозначные выводы пока преждевременно, из полученных результатов следует, что кристаллизация в невесомости имеет ряд преимуществ: возможно, использовать сравнительно большие объемы кристаллизационного раствора, что уменьшает влияние граничных условий; возможно, получить более изометричные кристаллы благодаря тому, что кристаллические зародыши образуются в объеме капли; возможно, получить более упорядоченные кристаллы благодаря отсутствию конвекционных потоков. К недостаткам метода следует отнести значительные денежные затраты и трудоемкость эксперимента. Наличие интервала "ожидания" между загрузкой кристаллизационной ячейки и ее активацией, невозможность вмешиваться в процесс кристаллизации и контролировать его, непредсказуемость условий доставки кристаллов на Землю из космоса, плохая воспроизводимость эксперимента также являются существенными недостатками метода.

2.7. Кристаллизация в центрифуге

Метод получения кристаллов белков в ультроцентрифуге в условиях повышенной силы тяжести пока распространен недостаточно. Между тем, он весьма перспективен для кристаллизации белков с высоким молекулярным весом, имеющих сложное субъединичное строение, которые трудно закристаллизовать традиционными методами. При центрифугировании молекулы белка, имеющие высокий коэффициент седиментации, осаждаются на дно центрифужной пробирки, что обеспечивает активный транспорт белка в зону кристаллизации. Концентрация белка на дне пробирки увеличивается, создается пересыщение раствора и начинается рост белковых кристаллов. Так как коэффициент седиментации осаждаемых частиц увеличивается с увеличением молекулярного веса, этот метод наиболее перспективен для кристаллизации белков с молекулярной массой свыше 100 кДа осаждающихся при центрифугировании сравнительно быстро (108). Метод позволяет исключить стадию концентрирования белка перед кристаллизацией. Начальная концентрация белка в растворе может быть очень небольшой, порядка 0.05 - 0.2 мг/мл. Требование к гомогенности белкового препарата может быть менее строгим. Существенно (в 7 - 15 раз) сокращается время получения кристаллов. Для этого метода характерна высокая воспроизводимость.

Другие методы кристаллизации белков подробно описаны в ряде работ по получению белковых кристаллов. Это метод свободно диффундирующих слоев, предложенный Салеммом (109), и основанный на различиях в плотностях растворов белка и осадителя. Метод жидкого моста, идея которого состоит в ограничении площади свободной диффузии между каплями растворов белка и осадителя (110). Методы кристаллизации, основанные на повышении концентрации белка, когда пересыщение белкового раствора достигается упариванием, ультрафильтрацией или ультроцентрифугированием.

В ряде случаев для роста кристаллов используют зависимость растворимости белков от рН и температуры. Путем медленного изменения этих параметров можно инициировать рост кристаллов (111). рН-зависимую кристаллизацию осуществляют методом диализа или методом диффузии в парах растворителя. Метод температурного градиента требует наличия специальных боксов, позволяющих изменять и фиксировать температуру.

3. Автоматизация экспериментов по кристаллизации

Получение монокристаллов белков для рентгеноструктурного анализа является трудоемким и длительным процессом. Его можно ускорить за счет автоматизации приготовления растворов осадителей и внесения их в микропробы. При этом повышается точность и воспроизводимость результатов, а также появляется возможность быстро осуществить систематический поиск оптимальных условий кристаллизации, когда варьируются концентрации белка, осадителя, добавок, значения рН и т.д. Для автоматизации опытов по кристаллизации белков созданы специальные установки и роботы, управляемые компьютером и позволяющие контролировать и анализировать экспериментальные результаты. Они программируются на последовательное разбавление растворов, помещение растворов в кристаллизационные ячейки, перенос определенного объема резервуарного раствора на силиконированные стекла и добавление белка в каплю, где происходит кристаллизация. В настоящее время сконструировано несколько автоматических систем для проведения экспериментов по кристаллизации (86, 90, 112, 113, 114, 115). Высокая точность определения объемов и концентраций подтверждается высокой воспроизводимостью результатов. Одна из таких систем позволила одновременно проводить 14 независимых экспериментов, точно изменяя в растворах содержание шести компонентов по заранее заданной программе. В итоге из 14 белков 8 были закристаллизованы в течение полугода (116).

В последнее время получили развитие системы видеозаписи процесса образования и роста кристаллов (112). Доступность информации о механизме роста белковых кристаллов, образовании кристаллических агрегатов и полиморфных кристаллов, возможность простого измерения скоростей роста позволяют планировать новые эксперименты и управлять процессами роста. Огромные перспективы, связанные с использованием автоматизированных кристаллизационных систем, очевидны.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1 МАТЕРИАЛЫ

1.1. Химические материалы

В работе использовались химические реагенты: Р-меркаптоэтанол, хлористый натрий, хлористый магний (Merck, Германия), изопропил-1-тио-Р-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) (Pharmacia Biotech, Швеция), бромфеноловый синий ( Reanal Венгрия), акриламид, сульфат аммония, динатриевая соль этилендиамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА), N,N'-метиленбисакриламид, додецилсульфат натрия (SDS), бис-трис (бис-(2-гидроксиэтил)-имино-трис(гидроксиметил)-метан), персульфат аммония, ксиленцианол, полиэтиленимин (Serva, Германия), ацетат натрия, трис (гидроксиметил)-аминометан, дитиотреитол (DTT) (Sigma, США). Питательные среды (Difco, США); хроматографические носители Бутил-сефароза, Q-сефароза, хроматографические колонки (Pharmacia, Швеция).

1.2. Биологические материалы

Штамм Е. coli для экспрессии белка BL21(DE3) с фенотипом [F- ompT, hsdSB, gal, dcm (DE3)]: лизоген DE3, содержащий производное фага X, с геном РНК-полимеразы фага Т7 под контролем lacUV5 промотора (Studier et al., 1990). Плазмида pBluescript IISK( Stratagene)

2. МЕТОДЫ

2.1. Выделение и очистка уридинфосфорилазы Salmonella typhimurium

Ген уридинфосфорилазы S. typhimurium был субклонирован в плазмиду pBluescript IISK, как описано в статье Молчана (2). Для выделения фермента использовался штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3). Клетки Е. coli трансформировали рекомбинантной плазмидой и высевали на твёрдую среду

LB-arap, содержащую 100 fir мл-1 ампицилина. Затем подращивали при 37°С в термостате в течение ночи. Далее клетки пересевали в жидкую среду LB (0.5-2 л) с антибиотиком и растили на качалке при 37°С с интенсивным перемешиванием (200-250 об/мин) до оптической плотности OD595 = 0.5. Синтез белка индуцировали добавлением в среду ИПТГ до 0.5 мМ, и через 3 часа роста клетки осаждали центрифугированием. Уровень продукции фермента оценивали электрофорезом в ПААГ/SDS. Биомассу, содержащую уридинфосфорилазу S. typhimurium, суспендировали в буферном растворе, содержащем 100 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 1.5 М NaCl, 4 мМ ЭДТА, 1 мМ р-меркаптоэтанол, и разрушали ультразвуком, используя звуковой дезинтегратор-550 (Fisher Scientific). Клеточные мембраны удаляли центрифугированием (13000 g, 10 мин). В надосадочную жидкость при помешивании добавляли раствор содержащий 20 мМ NaH2P04, рН 7.0, 10% полиэтиленимин, 2 М NaCl, 0.5 мМ Р-меркаптоэтанол, до конечной концентрации полиэтиленимина 1%. После инкубации такой смеси на +4°С в течение 2 часов, раствор был центрифугирован (13000 g, 20 мин). Из надосадочной жидкости белки высаливали сульфатом аммония. Высоленные белки растворяли в буфере: 2 М сульфат аммония, 50 мМ КН2РО4, рН 7.2, 0.5 мМ Р-меркаптоэтанол, для дальнейшей хроматографической очистки на Бутил-сефарозе. Связавшийся с колонкой фермент элюировали градиентом концентрации сульфата аммония до 0 М. Фракции, содержащие уридинфосфорилазу, собирали вместе и диализовали в буфер 50 мМ Трис-HCl, рН7.5, 20 мМ NaCl, для дальнейшего очищения на колонке с Q-сефарозой. С колонки с Q- сефарозой уридинфосфорилазу смывали градиентом NaCl до 1 М. После этих этапов выделенная уридинфосфорилаза была достаточной чистоты. Чистоту белка анализировали в денатурирующих условиях в ПААГ SDS электрофорезом. Удельная активность фермента оценивалась нашими коллегами из Института генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Гомогенность фермента оценивали по гель электрофорезу в неденатурирующих условиях, в качестве маркера использовали близкий по подвижности белок - уридинфосфорилаза Е coli. Полученный препарат уридинфосфорилазы S. typhimurium использовали для экспериментов по кристаллизации. Условия гелъ-электрофорезов.

Электрофорезы проводили в пластинах геля размером 7x8 см толщиной 0.75 мм в аппарате "Mini Protein И" фирмы Bio-Rad. После электрофореза гель окрашивали в растворе, содержащем 4 % НСЮ4, 0.05 % кумасси G-250, при 100°С в течение 1 мин. Фоновую окраску отмывали.

Электрофорез в ПААГ/SDS. Электрофорез проводили по методу Леммли (117). Разделяющий гель содержал 12-17 % акриламида или градиент концентрации акриламида от 10 % до 25 % (сшивка 19:1), 0.375 М трис-НС1 рН 8.8, 0.1% SDS; для полимеризации на 10 мл раствора добавляли 10 мкл ТЕМЕД и 100 мкл персульфата аммония. Концентрирующий гель содержал: 5 % акриламид (сшивка 9:1), 0.125 мМ Трис-HCl рН 6.8, 0.1% SDS; для полимеризации на 3 мл раствора добавляли 3 мкл ТЕМЕД и 30 мкл персульфата аммония. Для электрофореза использовали электродный буфер, содержащий 0.025 М Трис-HCl рН 8.3, 0.192 М глицин, 0,1% SDS. Буфер для приготовления образцов содержал в 10 мл: Змл 1М Трис-HCl, рН 6.8, 1 г SDS, 2.5 мл 2-меркаптоэтанола, 3 мл глицерина, 0.05 г бромфенолового синего. К образцу добавляли данный буфер (1/5 часть от объема образца) и прогревали при 100°С в течение 5 мин. Режим электрофореза: 100 В до вхождения образцов в разделяющий гель, затем 250-280 В до выхода красителя из геля.

Электрофорез в неденатурирующих условиях. Электрофорез проводили в буфере : трис-борат 90 мМ, рН 8.3; ЭДТА 0.2 мМ, ЮмМ MgCl2, 7.5% ПААГ геле. К образцу белка добавляли в соотношении 5:1 буфер для образцов: 1% глицерин, 0.01% бромфеноловый синий. Режим электрофореза: 250-280 В до выхода красителя из геля.

2.2. Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium

Поиск условий кристаллизации проводили методом диффузии паров в висящей капле с использование набора условий для кристаллизации Crystal Screen Hampton Research (85). Раствор белка, содержащий 10 мМ Трис-НС1 рН 7.3, 0.4% NaN3, с концентрацией белка 20 мг мл*1 , смешивался с раствором из набора условий для кристаллизации в соотношении 1:1 и помещался на силиконированное стекло, в противорастворе находился 1 мл соответствующего раствора осадителя. Кристаллизационная плашка инкубировалась при температуре 21°С. Первые кристаллы уридинфосфорилазы S. typhimurium были получены в растворе, содержащем 0.1М Na-ацетат, рН 4.6 и 8% полиэтиленгликоля 4000, в качестве осадителя. Кристаллы отражали рентгеновские лучи с разрешением 5А. Оптимизация условий кристаллизации позволила получить кристаллы пригодные для рентгеноструктурного анализа, отражающие рентгеновские лучи с разрешением 2.9А. Кристаллы были получены в условиях: ЮОмМ Na-ацетат, рН 5.0, 7% полиэтил енгликоль 8000 в противорастворе. Объем кристаллизационной капли составлял 5 мкл, соотношение белка и противораствора в капле 1:1. Был подобран раствор для замораживания этих кристаллов в жидком азоте, для сбора дифракционных данных в криоусловиях 100°К. Наиболее оптимальным оказался раствор, содержащий 0.1М Na-ацетат, рН 5.0, 10% полиэтиленгликоль 400, 20% глицерин. С этих кристаллов на рентгеновском дифрактометре Института белка РАН при температуре 100° К был получен первый набор дифракционных данных с разрешением 2.9А, с пространственной группой P6i и параметрами элементарной ячейки: а=92.3 А, Ь=92.3 А, с=267.5. Этот набор дифракционных данных позволил впервые определить структуру уридинфосфорилазы S. typhimurium. При съемке кристаллов, выращенных в тех же условиях, на синхротроне в Гамбурге удалось получить набор дифракционных данных с более высоким разрешением 2.5 А, позволивший уточнить структуру уридинфосфорилазы S. typhimurium до разрешения 2.5 А. Повышение разрешения позволило локализовать ион фосфата в одном из активных центров уридинфосфорилазы S. typhimurium.

2.3. Кристаллизация уридинфосфорилазы S. typhimurium в комплексе с аналогами субстратов

Получение комплексов фермента с аналогами субстрата: урацилом и уридин-5'-монофосфатом, с сульфат и фосфат ионами, также производилось методом диффузии паров в висящей капле. Для получения кристаллов комплексов были оптимизированы условия кристаллизации нативного белка, а также несколько изменена методика кристаллизации. В итоге кристаллы комплексов получались при использовании противораствора, содержащего бОмМ Na-ацетат, рН 5.2, 20% полиэтиленгликоль 4000. Состав кристаллизационных капель для комплексов уридинфосфорилазы S. typhimurium с аналогами субстратов был следующий: с урацилом и сульфат ионом: 3 мкл раствора белка (20 мг^мл"1), 3 мкл противораствора, 0.5 мкл урацила (50 мМ) и 0.5 мкл сульфата аммония (10 мМ); с уридин-5'-монофосфатом и сульфат ионом: 3 мкл раствора белка (20 мг+мл"1), 3 мкл противораствора, 0.5 мкл уридин-5'-монофосфата (10 мМ) и 0.5 мкл сульфата аммония (10 мМ);

Для получения крупных кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа, использовалась следующая методика. Раствор белка смешивался с противораствором, как описано выше, при смешивании в капле образовывался кристаллический осадок и пленка. Капля уравновешивалась в течение 12 часов против противораствора, затем стеклышко с каплей переносилось на резервуар с 400 мкл Н20. Через 1-3 суток в капле образовывались крупные кристаллы размером 100x50x40 мкм. Все кристаллы комплексов были схожей формы. Для сбора дифракционных данных в криоусловиях был подобран раствор для замораживания этих кристаллов в жидком азоте. Криораствор содержал бОмМ Na-ацетат, рН 5.2, 10% полиэтиленгликоль 4000, 30% полиэтиленгликоль 400.

При кристаллизации нативного белка с использованием этой методики кристаллизации удалось получить другую форму кристаллов. При этом были несколько изменены условия кристаллизации. Противораствор содержал бОмМ Na-ацетат, рН5.2, 20% полиэтиленгликоль 6000, объем кристаллизационных капель составлял 7 мкл, соотношение белка и протораствора в капле было 1:1. Раствор для замораживания этих кристаллов в жидком азоте содержал 60 мМ Na-ацетат, рН 5.2, 10% полиэтиленгликоль 6000, 30% полиэтиленгликоль 400. Полученные кристаллы уридинфосфорилазы S. typhimurium отражали рентгеновские лучи с разрешением 1.77 А.

2.4. Получение наборов дифракционных данных

Первый сбор дифракционных данных для нативного белка проводился при температуре 100° К на рентгеновском дифрактометре Института белка РАН. Основными компонентами системы являются: генератор (GX-6, Эллиот, Англия) с вращающимся медным анодом и фокусом 0,2 х 0,2 мм, работающий в режиме 35кВ х 35 мА; рентгенофокусирующее устройство на основе поликапилярной линзы Кумахова (Институт рентгеновской оптики РАН), позволяющее увеличить на порядок интенсивность пучка, падающего на кристалл; детектор рентгеновского излучения MAR-345(MAR Research, Германия) и криоустановка, создающая струю газообразного азота с температурой около 100° К (CryoJet, Oxford Instruments, Великобритания).

Дифракционный набор был получен методом вращения с одного кристалла. Расстояние от кристалла до детектора было 280 мм. Общий угол поворота во время сбора дифракционных данных составил 43°, угол осцилляции - 0.5°, время съемки одной рентгенограммы - 20 минут. Полное время съемки составило 29 часов. Величина мозаичности кристалла не превышала 0.6°. Обработка набора проведена программой "XDS" (118) до разрешения 2.9 А (таб.3). Полнота набора составила 93.0%, фактор слияния рефлексов Rmerge =15.4%. Коэффициент Метьюза (119) VM=2.0A3 Da*1 соответствует шести молекулам в асимметричной части ячейки, содержание растворителя 38.9%. Этот набор был использован для получения первой структуры уридинфосфорилазы S. typhimurium с разрешением 2.9 А. Следующий набор дифракционных данных, позволивший уточнить структуру уридинфосфорилазы S. typhimurium до разрешения 2.5 А, был получен А.Г. Габдулхаковым на синхротроне в Гамбурге на линии XI3, при температуре 100° К (таб.3). Величина мозаичности кристалла не превышала 0.6°. Обработка набора проводилась программой "XDS" до разрешения 2.5 А, полнота набора составила 99.2%, фактор слияния рефлексов Rmerge=6.2%. Коэффициент Метьюза VM=2.0lA3 Da"1 соответствует шести молекулам в асимметричной части ячейки, содержание растворителя 38.18%. Сбор дифракционных данных для кристаллов комплексов фермента с урацилом и уридин-5'-монофосфатом, а также другой формы кристаллов нативного белка был проведён совместно с Г.С. Качаловой на синхротроне DESY в Гамбурге на разных линиях синхротрона (таб.3). Кристаллы комплексов уридинфосфорилазы S. typhimurium с аналогами субстратов имели схожие параметры элементарной ячейки и принадлежали к пространственной группе симметрии P2i2j2i, в асимметричной части ячейки находился один гексамер. Кристалла нативного белка принадлежали к группе симметрии НЗ (R3) с параметрами элементарной ячейки а = b = 150.82 А, с =

47.84 А, в асимметричной части ячейки находился димер.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Донцова, Мария Владимировна, Пущино

1. Paege L.M., Schlenk F. Bacterial uracil riboside phosphorylase. J. Arch.

2. Biochem. Biophys. 1952, V.40, pp. 42 49.

3. Молчан O.K., Дмитриева H.A., Романова Д.В., JI. Эррайс Лопес, В.Г.

4. Дебабов, А.С. Миронов. Выделение и первичная характеристика уридинфосфорилазы из Salmonella typhimurium. Биохимия. 1998, Т.63, вып. №2, с. 235 239.

5. Levene Р.А. and Medigreceanu F. On nucleases. J. Biol. Chem. 1911, V.9,pp. 65 83.

6. Levene P A., Yamagawa M. and Weber I. On nucleosidases. I. General * properties. J. Biol. Chem. 1924, V.60, pp. 693 706.

7. Levene P.A. and Weber I. On nucleosidases. II. Purification of the enzyme.

8. J. Biol. Chem. 1924, V.60, pp. 707 715.

9. Kalckar H.M. Enzymatic synthesis of a nucleoside. J. Biol. Chem. 1945,1. V.158, pp. 723-724.

10. Kalckar H.M. The enzymatic synthesis of purine ribosides. J. Biol. Chem.1947, V.167, pp. 477 486.

11. Friedkin M. and Roberts D. The enzymatic synthesis of nucleosides. I.

12. Thymidine phosphorylase in mammalian tissue. J. Biol. Chem. 1954, V.207, pp. 245 256.

13. Friedkin M. and Roberts D. The enzymatic synthesis of nucleosides. II. щ, Thymidine and related pyrimidine nuclosides. J. Biol. Chem. 1954, V.207,pp. 257 266.

14. Kalckar H.M. Enzymatic microanalysis of purine compounds. J. Biol. Chem.1945, V.158, pp. 313 -314.

15. Kalckar H.M. Differential spectrophotometry of purine compounds bymeans of specific enzymes. III. Studies of the enzymes of purine metabolism. J. Biol. Chem. 1947, V.167, pp. 461 475.

16. Kalckar H.M. Differential spectrophotometry of purine compounds bymeans of specific enzymes. II. Determination of adenine compounds. J. Biol. Chem. 1947, V.167, pp. 445 459.

17. Kalckar H.M. Differential spectrophotometry of purine compounds bymeans of specific enzymes. I. Determination of hydroxypurine compounds. J. Biol. Chem. 1947, V.167, pp. 429 443.

18. Lewis A.S., Glantz M.D. Bovine brain purine-nucleoside phosphorylasepurification, characterization, and catalytic mechanism. J. Biochemistry. 1976, V. 15, pp.4451 -4457.

19. Porter D.J. Purine nucleoside phosphorylase. Kinetic mechanism of theenzyme from calf spleen. J. Biol. Chem. 1992, V.267, pp. 7342 7351.

20. Lewis A.S., Glantz M.D. Monomeric purine nucleoside phosphorylase fromrabbit liver. Purification and characterization. J. Biol. Chem. 1976, V.251, pp. 407-413.

21. Milman G., Anton D.L., Weber J.L. Chinese hamster purine-nucleosidephosphorylase: purification, structural, and catalytic properties. J. Biochemistry. 1976, V.15, pp. 4967 4973.

22. Jensen K.F., Nygaard P. Purine nucleoside phosphorylase from Escherichiacoli and Salmonella typhimurium. Purification and some properties. Eur. J. Biochem. 1975, V.51, pp. 253 265.

23. Cacciapuoti G., Porcelli M., Bertoldo C., De Rosa M., Zappia V.

24. Purification and characterization of extremely thermophilic and thermostable 5-methylthioadenosine phosphorylase from the archaeon Sulfolobus solfataricus. J. Biol. Chem. 1994, V.269, pp. 24762-24769.

25. Shirea H, Yokozeki K. Purifications and properties of orotidinephosphorolyzing enzyme and purine nucleoside phosphorylase from Erwinia carotovora AJ 2992. J. Agric. Biol. Chem. 1991, V.55, pp. 1849 -1857.

26. Gilpin R.W. and. Sadoff H.L. Physical and catalytic properties of the purinenucleoside phosphorylases from cells and spores of Bacillus cereus T. J. Biol. Chem., Mar 1971; 246: 1475 1480.

27. Моргунова Е.Ю., Михайлов A.M., Комиссаров A.A., Мао Ч., Линькова

28. Krenitsky Т.A., Mellors J.W. and Barclay М. Pyrimidine nucleosidases. J.

29. Biol. Chem. 1965, V.240, pp. 1281- 1286.

30. Delia Ragione F, Oliva A, Gragnaniello V, Russo G.L., Palumbo R, Zappia

31. V. Physicochemical and immunological studies on mammalian 5'-deoxy-5'-methylthioadenosine phosphorylase. J. Biol. Chem. 1990, V.265, pp. 6241 6246.

32. Ferro A.J., Wrobel N.C. and Nicolette J.A. 5-Methylthioribose 1-phosphate:

33. A product of partially purified, rat liver 5 -methylthioadenosine phosphorylase activity. J. Biochimica et Biophysica Acta — Enzymology. 1979, V.570,pp.65-73.

34. Kim B.K., Cha S., Parks R.J. Purine nucleoside phosphorylase from humanerythroyctes. II. Kinetic analysis and substrate-binding studies. J. Biol. Chem. 1968, V.243, pp. 1771 1776.

35. Kim B.K., Cha S, Parks R.J. Purine nucleoside phosphorylase from humanerythrocytes. I. Purification and properties. J. Biol. Chem. 1968, V.243, pp. 1763-1770.

36. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс.

37. Фаир-Пресс. Москва. 1998, 715 с.

38. Carlson J.D., Fischer A.G. Characterization of the active site ofhomogeneous thyroid purine nucleoside phosphorylase. J. Biochim. Biophys. Acta. 1979, V.571, pp. 21 -34.

39. Erion M.D., Takabayashi K., Smith H.B., Kessi J., Wagner S., Honger S.,

40. Shames S.L., Ealick S.E. Purine nucleoside phosphorylase. 1. Structure-function studies. J. Biochemistry. 1997, V.36, pp. 11725 11734.

41. Erion M.D., Stoeckler J.D., Guida W.C., Walter R.L., Ealick S.E. Purinenucleoside phosphorylase. 2. Catalytic mechanism. J. Biochemistry. 1997, V.36, pp. 11735- 11748.

42. Fedorov A., Shi W., Kicska G., Fedorov E., Tyler P.C., Furneaux R.H.,

43. Hanson J.C., Gainsford G.J., Larese J.Z., Schramm V.L., Almo S.C. Transition state structure of purine nucleoside phosphorylase and principles of atomic motion in enzymatic catalysis. J. Biochemistry. 2001, V.40, pp. 853 860.

44. Tebbe J., Bzowska A., Wielgus-Kutrowska В., Schroder W., Kazimierczuk

45. Z., Shugar D., Saenger W., Koellner G. Crystal structure of the purine nucleoside phosphorylase (PNP) from Cellulomonas sp. and its implication for the mechanism of trimeric PNPs. J.'Mol. Biol. 1999, V.294, pp. 1239 -1255.

46. Krenitsky ТА. Uridine phosphorylase from Escherichia coli : Kineticproperties and mechanism. J. Biochimica et Biophysica Acta -Enzymology. 1976, V.29, pp. 352 358.

47. Kraut A., Yamada E.W. Cytoplsmic uridine phosphorylase of rat liver.

48. Characterization and kinetics. J. Biol. Chem. 1971, V.246, pp. 2021-2030.

49. Zappia V., Delia Ragione F., Pontoni G., Gragnaniello V., Carteni-Farina M.

50. Human 5'-deoxy-5'-methylthioadenosine phosphorylase: kinetic studies and catalytic mechanism. J. Adv. Exp Med. Biol. 1988, V.250, pp. 165-177.

51. Garbers D.L. Demonstration of 5-methylthioadenosine phosphoiylaseactivity in varius rat tissues. Some properties of the enzyme from rat lung. J. Biochimica et Biophysica Acta Enzymology. 1978, V.523, pp. 82-93.

52. Shugart L., Mahoney L., Chastain B. Kinetic studies of Drosophilamelanogaster methylthioadenosine nucleoside phosphoiylase. Int. J. Biochem. 1981, V.13, pp. 559-564.

53. Ealick S.E., Rule S.A., Carter D.C., Greenhough T.J., Babu Y.S., Cook W.J.,

54. Habash J., Helliwell J.R., Stoeckler J.D., Parks R.E. Three-dimensional structure of human erythrocytic purine nucleoside phosphorylase at 3.2 A resolution. J. Biol. Chem. 1990, V.265, pp. 1812- 1820.

55. Narayana S.V. Refined structure of purine nucleoside phosphorylase at 2.75

56. A resolution. J. Acta Crystallogr. 1997, D53, pp. 131 142.

57. Bzowska A., Luic M., Schroder W., Shugar D., Saenger W., Koellner G.

58. Calf spleen purine nucleoside phosphorylase: purification, sequence and crystal structure of its complex with an N(7)-acycloguanosine inhibitor. J. FEBS Lett. 1995, V.367, pp. 214 218.

59. Koellner G., Luic M., Shugar D., Saenger W., Bzowska A. Crystal structureof calf spleen purine nucleoside phosphorylase in a complex with hypoxanthine at 2.15 A resolution. J. Mol. Biol. 1997, V.265, pp. 202 -216.

60. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Federov A.A., Almo S.C., Ealick S.E. Calfspleen purine nucleoside phosphorylase complexed with substrates and substrate analogues. J. Chen. Biochemistry. 1998, V.37, pp. 7135 7146.

61. Shi W., Basso L.A., Santos D.S., Tyler P.C., Furneaux R.H., Blanchard J.S.,

62. Almo S.C., Schramm V.L. Structures of purine nucleoside phosphorylase from Mycobacterium tuberculosis in complexes with immucillin-H and its pieces. J. Biochemistry. 2001, V.40, pp. 8204 8215.

63. Appleby T.C., Erion M.D., Ealick S.E.The structure of human 5'-deoxy-5'methylthioadenosine phosphorylase at 1.7 A resolution provides insightsinto substrate binding and catalysis. J. Structure Fold Des. 1999, V.7, pp. 629-641.

64. Mao C., Cook W.J., Zhou M., Koszalka G.W., Krenitsky T.A., Ealick S.E.

65. The crystal structure of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase: a comparison with the human enzyme reveals a conserved topology. J. Structure. 1997, V.5, pp. 1373 1383.

66. Bennett E.M., Li C., Allan P.W., Parker W.B., Ealick S.E. Structural basisfor substrate specificity of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase. J. Biol. Chem. 2003, V.278, pp. 47110 47118.

67. Tahirov Т.Н., Inagaki E., Ohshima N., Kitao Т., Kuroishi C., Ukita Y.,

68. Takio K., Kobayashi M., Kuramitsu S., Yokoyama S., Miyano M. Crystal structure of purine nucleoside phosphorylase from Thermus thermophilus. J. Mol. Biol. 2004, V.337, pp. 1149 1160.

69. Burling F.T., Kniewel R., Buglino J.A., Chadha Т., Beckwith A., Lima C.D.

70. Structure of Escherichia coli uridine phosphorylase at 2.0 A. J. Acta Cryst. 2003, D59, pp. 73-76.

71. Appleby T.C., Mathews I.I., Porcelli M., Cacciapuoti G., Ealick S.E. Threedimensional structure of a hyperthermophilic 5'-deoxy-5-methylthioadenosine phosphorylase from Sulfolobus solfataricus. J. Biol. Chem. 2001, V.276, pp. 39232 39242.

72. Pugmire M.J., Ealick S.E. Structural analyses reveal two distinct families ofnucleoside phosphorylases. J. Biochem. 2002, V.361, pp. 1-25.

73. Zappia V., Oliva A., Cacciapuoti G., Galletti P., Mignucci G., Carteni-Farina

74. M. Substrate specificity of 5-methylthioadenosine phosphorylase from human prostate. J. Biochem. 1978, V.175, pp. 1043-1050.

75. Laster L., Blair A. An intestinal phosphorylase for uric acid ribonucleoside.

76. J. Biol. Chem. 1963, V.238, pp. 3348 3357.

77. Zimmerman M. and Seidenberg J. Deoxyribosyl Transfer. I. Thymidinephosphorylase and nucleoside deoxyribosyltransferase in normal and malignant tissues. J. Biol. Chem. 1964, V.239, pp. 2618 2621.

78. Zimmerman M. Deoxyribosyl transfer. II. Nucleoside :pyrimidinedeoxyribosyltransferase activity of three partially purified thymidine phosphorylases. J. Biol. Chem. 1964, V.239, pp. 2622 2627.

79. Schwartz M. Thymidine phosphorylase from Escherichia coli. Properties * and kinetics. Eur. J. Biochem. 1971, V.21, pp. 191-198.

80. Avraham Y., Grossowicz N., Yashphe J. Purification and characterization ofuridine and thymidine phosphorylase from Lactobacillus casei. J. Biochim. Biophys. Acta. 1990, V.1040, pp. 287-293.

81. Desgranges C., Razaka G., Rabaud M., Bricaud H. Catabolism of thymidinein human blood platelets: purification and properties of thymidine phosphorylase. J. Biochim. Biophys. Acta. 1981, V.654, pp. 211-218.103

82. Yamada E.W. Pyrimidine nucleoside phosphorylases of rat liver. Separationby ion exchange chromatography and studies of the effect of cytidine or uridine administration. J. Biol. Chem. 1968, V.243, pp. 1649 1655.

83. Krenitsky T.A., Barclay M. and Jacquez J.A. Specificity of mouse uridinephosphorylase. J. Biol. Chem. 1964, V.239, pp. 805 812.

84. Razzell W.E., Khorana H.G. Purification and properties of a pyrimidinedeoxyriboside phosphorylase from Escherichia coli. J. Biochim. Biophys. Acta. 1958, V.28, pp. 562 566.

85. Hamamoto Т., Noguchi Т., Midorikawa Y. Purification and characterizationof purine nucleoside phosphorylase and pyrimidine nucleoside , phosphorylase from Bacillus stearothermophilus TH 6-2. J. Biosc.

86. Biotechnol. Biochem. 1996, V.60, pp. 1179-1180.

87. Scocca J.J. Purification and substrate specificity of pyrimidine nucleosidephosphorylase from Haemophilus influenzae. J. Biol. Chem. 1971,V.246, pp. 6606-6610.

88. Pugmire M.J. and Ealick S.E. The crystal structure of pyrimidine nucleosidephosphorylase in closed conformation. J. Structure. 1998, V.6, pp. 1467 -1479.

89. Waltera M.R., Cook W.J., Brent Cole L., Short S.A., Koszalka G.W.,

90. Krenitsky T.A. Pentosyl transfer mechanisms of the mammalian nucleoside phosphorylases. J. Biol. Chem. 1968, V.243, pp. 2871 2875.

91. Iltzsch М.Н., el Kouni M.H., Cha S. Kinetic studies of thymidinephosphorylase from mouse liver. J. Biochemistry. 1985, V.24, pp. 6799 -6807.

92. Hammer-Jespersen K., Munch-Petersen A., Schwartz M., Nygaard P.1.duction of enzymes involed in the catabolism of deoxyribonucleosides and ribonucleosides in Escherichia coli К 12. Eur. J. Biochem. 1971, V.19, pp. 533 -538.

93. Schwartz E.L., Hoffman M., O'Connor C.J., Wadler S. Stimulation of 5fluorouracil metabolic activation by interferon-alpha in human colon carcinoma cells. J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992, V.182, pp. 1232- 1239.

94. Takebayashi Y., Yamada K., Ohmoto Y., Sameshima Т., Miyadera K.,

95. Yamada Y., Akiyama Sh. and Aikou T. The correlation of thymidine phosphorylase activity with the expression of interleukin 1, interferon and interferon in human colorectal carcinoma. J. Cancer Lett. 1995, V.95, pp. 57-62.

96. Miyadera K., Dohmae N., Takio K., Sumizawa Т., Haraguchi M., Furukawa

97. Т., Yamada Y., Akiyama S. Structural characterization of thymidine phosphorylase purified from human placenta. J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, V.212, pp. 1040-1045.

98. Asai K., Nakanishi K., Isobe I., Eksioglu Y.Z., Hirano A., Hama K.,

99. Miyamoto Т., Kato T. Neurotrophic action of gliostatin on cortical neurons. Identity of gliostatin and platelet-derived endothelial cell growth factor. J. Biol. Chem. 1992, V.267, pp. 20311-20316.

100. Takebayashi Y., Yamada K., Maruyama I., Fujii R., Akiyama Sh. and Aikou

101. T. The expression of thymidine phosphorylase and thrombomodulin in human colorectal carcinomas. J. Cancer Lett. 1995, V.92, pp. 1 7.

102. Yoshimura A., Kuwazuru Y., Furukawa Т., Yoshida H., Yamada K. and

103. Akiyama S. Purification and tissue distribution of human thymidine1. А 105phosphorylase; high expression in lymphocytes, reticulocytes and tumors. J. Biochimica et Biophysica Acta. 1990, V.1034, pp. 107-113.

104. Norman R., Barry S., Bate M., Breed J., Colls J., Ernill R., Luke R.,

105. Minshull C., McAlister M., McCall E. Crystal Structure of Human thymidine phosphorylase in complex with a small molecule inhibitor. J. Structure. 2004, V. 12, pp. 75 84.

106. McPherson A. Introduction to protein crystallization. Methods. 2004, V.34,pp. 254 265.

107. Dobler M., Dover S.D., Laves K., Binder A., Zuber H. Crystallization andpreliminary crystal data of C-phycocyanin. J. Mol. Biol. 1972, V.71, pp. 785-787.

108. Jancarik J., Kim S.H. Sparse Matrix Sampling, a screening method forcrystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 1991, V.24, pp. 409 411.

109. Chayen, Shaw Steward P.D., Maeder D.L., Blow D.M. An automatedsystem for microbatch protein crystallization and screening. J. Appl. Cryst., 1990, V.23, pp. 297-302.

110. Baldock P., Mills V., Shaw Steward P. Increasing the number ofcrystallization conditions by using microbatch screening. The Sixth Internetional Conference on Crystallization of Biological Macromolecules, Collected Abstracts, 1995, 114 p.

111. Гарбер М.Б. Подготовка белков к рентгеноструктурному анализу.

112. Успехи современной биологии, 1978, Т.86, вып. №3, с. 432 446.

113. Zeppenzauer M., Ekiund H., Zeppenzauer E. Microdiffusion cells for thegrowth of single protein crystals by means of equilibrium dialysis. J. Arch. Biochem. Biophvs. 1968, V.126, pp. 564 568.

114. Ducruix A., Giege R. (ed.) Crystallization of Nucleic Acids and Proteins. A

115. Practical Approach, Oxford Univ, Press, N.Y., 1992.

116. Thomas D.H., Rob A., Rice D.W. A novel dialysis procedure for thecrystallization of proteins. J. Prot. Engineering. 1989, V.2, pp. 489 491.

117. Hampel A., Labananskas M., Conners P.G., Kirkegard L., RajBhandary

118. U.L., Sigler P.B., Bock R.M. Single crystals of transfer RNA from formylmethionine and phenylalanine transfer RNAs. J. Science. 1968, V.162, pp. 1384-1387.

119. Davies D., Segal D. Protein crystallization: microtechniques involving vapordiffusion. J. Methods Enzymol. 1971, V.22, pp. 266-269.

120. Givargizov E.I. Oriented crystallization on amorphous substrates plenum. N1. Y., 1990.

121. Feigelson R.S. The relevance of small molecule crystal growth theories andtechniques to the growth of biological macromolecules. J. Crystal Growth. 1988, V.90, pp. 1-13.

122. McPherson A. The use of heterogeneous and epitaxial nucleants to promotethe growth of protein crystals. J. Crystal Growth. 1988, V.90, pp. 47-50.

123. Givargizov E.I., Kliya M.O., Melik-Adamvan V.R., Grebenko A.I. Artificialepitaxy (graphoepitaxy) of proteins. J. Crystal Growth. 1991, V.112, pp. 758 772.

124. Provost K., Robert M.C. Application of gel growth to hanging droptechnique. J. Crystal Growth. 1991, V.l 10, pp.258-264.

125. Robert M.C., Lefaucheux F. Crystal growth in gels: principle andapplication. J. Crystal Growth. 1988, V.90, pp. 358 367.

126. Litke W., John C. Protein crystal growth under microgravity. J. Science.1984, V.225, pp. 203-208.

127. DeLucas L.J., Smith H.W., Vijay-Kumar S., Senadhi S.E., Ealick S.E.,

128. Carter D.C. et al. Protein ciystal growth in microgravity. J. Science. 1989, V.246, pp. 651 -654.

129. Long M.M., Bishop J.B., Nagabhushan T.L., Reichert P., Smith G.D.,

130. Траханов С.Д., Гребенко А.И., Широков B.A., Гудков А.В., Егоров

131. А.В., Бармнн И.В., Ваинштейн Б.К., Спирин А.С. Кристаллизация белков и рибосомных частиц в условиях микрогравитации. Доклады АН СССР, 1989, Т. 305, вып. №5, с. 1128 1132.

132. Vahedi-Faridi A., Porta J., Borgstahl G.E. Improved three-dimensionalgrowth of manganese superoxide dismutase crystals on the International Space Station. J. Acta Crystallogr. 2003, D59, pp. 385 388.

133. Mikhailov A.M., Smirnova E.A., Tsuprun V.L., Tagunova I.V., Vainshtein

134. B.K., Linkova E.V., Komissarov A.A., Siprashvili Z.Z., Mironov A.S. Isolation, crystallization in the macrogravitation field, preliminary X-ray investigation of uridine phosphorylase from Escherichia coli K-12. J. Biochem. Int. 1992, V.26, pp. 607- 615.

135. Salemme F.R. A free interface diffusion technique for crystallization ofprotein for X-ray crystallography. J. Arch. Biochem. Biophys. 1972, V.151, pp. 533 539.

136. Бландел Т., Джонсон JI. Кристаллография белка. "Мир", М. 1979, 576 с.

137. McPherson A. Crystallization of protein by variation of pH or temperature.1.: Methods in Enzymology, ed. Wyskoff H.W, Acad. Press, N.Y., 1985, V.114, pp. 125-127.

138. Zuk W.M., Ward K.B. Methods of analysis of protein crystal images. J.

139. Crystal Growth. 1991, V.110, pp. 148-155.

140. Rubin В., Talafous J., Larson D. Minimal intervention robotic proteincrystallization. J. Crystal Growth. 1991, V.l 10, pp. 156-163.

141. Wilson L., Bray Т., Suddath F. Crystallization of proteins by dinamiccontrol of evaporation. J. Crystal Growth. 1991, V.l 10, pp. 142-147.

142. Smith H.W., DeLucas L.J. A method for programmable control of reservoirconcentrations for protein crystal growth. J. Crystal Growth. 1991, V.l 10, pp. 137- 141.

143. Kelders H., Kalk K., Gros P., Hoi W. Automated protein crystallization anda new-crystal form of a subtilisin: eglin complex. J. Protein Eng. 1987, V.l, pp. 301 -303.

144. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. J. Nature. 1970, V.227, pp. 680 685.

145. Kabsch, W. Integration, scaling, space-group assignment and postrefinement. XDS. In International Tables for Crystallography, eds.109

146. Rossmann M.G. & Arnold E.F. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers; 2001.

147. Matthews B.W. Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol. 1968, V.33,1. P. 491 -497.

148. Vaguine AA, Richelle J, Wodak SJ. SFCHECK: a unified set of proceduresfor evaluating the quality of macromolecular structure-factor data and their agreement with the atomic model. J. Acta Cryst. 1999, D55, p. 191.

149. Автор приносит глубокую благодарность:

150. М.Б. Гарбер за руководство работой, бесценную помощь и поддержку; A.M. Михайлову за идею данной работы и помощь в анализе полученных результатов;

151. Российскому Фонду Фундаментальных Исследований и Фонду Биомедицинских Исследований Ховарда Хьюза за финансовую поддержку данной работы.