Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение организации фосфат-связывающей области бактериальных уридинфосфорилаз

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чеботаев, Дмитрий Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Тканевая локализация пиримидиннуклеозидфосфорилаз в организме человека. Роль их биологической активности в нормальных и патологических процессах, а также химиотерапии онкозаболеваний.

1.1. Введение.

1.2. Общая характеристика пиримидиннуклеозидфосфорилаз человека. Роль их структуры и ферментативных свойств в проявлении ими биологической активности in vitro и in vivo.

1.3. Тканевая локализация пиримидиннуклеозидфосфорилаз и их роль в нормальных и патологических процессах в организме человека.

1.4. Возможности использования индукции и ингибирования ферментативной активности пиримидиннуклеозидфосфорилаз in vivo при химиотерапии онкозаболеваний.

ВЫВОДЫ.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Ферменты.

2.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Методы.

2.2.1. Общие методы.

2.2.2. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов.

2.2.3. Амплификация фрагментов ДНК.

2.2.4. Сайт-направленная реконструкция ДНК.

2.2.5. Анализ структуры ДНК.

2.2.6. Выделение нативных бактериальных ИРаз и их мутантных и и гибридных форм.

2.2.7. Изучение ферментативных свойств нативных бактериальных ЦРаз и их мутантных и гибридных форм.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Общая характеристика ЦРазы из Е. coli.

3.2. Клонирование и экспрессия в клетках Е. coli гена ЦРазы (udp) из Klebsiella aerogenes.

3.3. Структура и свойства бактериальных ЦРаз.

3.4. Получение, клонирование и экспрессия в клетках Е. coli генов гибридных ЦРаз. Анализ свойств гибридных белков.

3.5. Сравнительный анализ топологий вторичных структур ЦРазы из

E.coli К-12 и ряда функционально родственных ей ферментов.

3.6. Исследование функциональной роли остатков дикарбоновых аминокислот и остатка Туг 169 ЦРазы из E.coli.

3.7. Локализация функционально важных аминокислотных остатков фрагмента Pro61 - Pro72 полипептидной цепи ЦРазы Е. coli, входящих в состав фосфат-связывающей области активного центра

3.8. Изучение роли остатков Arg91 и Serl99 в функционировании

UP азы из Е. coli.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение организации фосфат-связывающей области бактериальных уридинфосфорилаз"

Актуальность темы диссертации. Уридинфосфорилаза (11раза К.Ф.2.4.2.3.) -фермент катаболизма нуклеозидов, осуществляющий обратимый фосфоролиз уридина до урацила и рибозо-1-фосфата [1]. Интерес к исследованию молекулярных основ биологического действия данного фермента, кроме получения фундаментальных знаний о его структурно-функциональной организации, вызван отмеченным в литературе явлением резкого возрастания уровня накопления РуКРаз: уридинфосфорилазы (ЦРазы) и тимидинфосфорилазы (ТРазы, К.Ф.2.4.2.4.) в клетках злокачественных новообразований у человека [2]. Данные ферменты не только снижают терапевтический эффект применяемых в онкологии антипролиферативных препаратов нуклеозидной природы [3], но и, обладая ангиогенными свойствами (ТРаза или РО-ЕСОР), способствуют метастазированию опухоли [4]. Таким образом, изучение взаимосвязи структура-функция в ЦРазе может существенно упростить дизайн высокоэффективных ингибиторов данного фермента, позволяющих подавить развитие и метастазирование злокачественной опухоли. Фосфорилазы пиримидино-вых нуклеозидов (РуЫРазы) из разных организмов могут также быть подходящими внутриклеточными мишенями при терапии вирусных и бактериальных инфекций, а также гельминтологических и протозойных заболеваний [5-8].

Кроме того, эти исследования могут представлять интерес для разработки новых технологий ферментативного синтеза аналогов нуклеозидов антиметаболитов, обладающих антивирусной и противоопухолевой активностью. Особый интерес представляет разработка способов производства новых, замещающих антибиотики, препаратов нуклеозидной природы. Химический путь получения подобных соединений является трудоемким, многостадийным процессом, связанным с использованием токсичных соединений на разных стадиях производства [9]. Использование ферментов (в том числе с измененной субстратной специфичностью) позволяет существенно упростить, удешевить и обезопасить синтез. Так, ЦРаза из Klebsiella sp. в настоящее время уже нашла практическое применение в ферментативном синтезе антивирусного агента широкого спектра действия 1-Ь-с1-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида ("Virazole") [10].

Сравнение аминокислотных последовательностей всех известных ИРаз из про- и эукариотов обнаруживает существенную гомологию [11,12], что позволяет надеяться на близость архитектур их активных центров. Создание на первом этапе исследований высокоэффективного штамма-суперпродуцента ЦРазы из E.coli К-12 [13] позволило направить дальнейшую работу на изучение структурно - функциональной организации этого фермента.

К настоящему времени выполнен ряд экспериментов по его селективной химической модификации [14-17] и сайт-направленному мутагенезу [18 -20], а также проведен РСА высокого разрешения, что позволило идентифицировать вторичные структуры полипептидной цепи [21,22]. Серьезное внимание было уделено определению кинетической схемы действия и ферментативных характеристик бежа, включая субстратную специфичность [23 -26]. Вместе с тем, полученные с помощью нескольких химических реагентов выводы о вхождении ряда аминокислотных остатков в активный центр ЦРазы из E.coli К-12, за исключением остатка His8, не были подтверждены сайт-специфическим мутагенезом.

Проведение РСА также не дало возможности проверить данные химической модификации, так как основная часть исследования проводилась в отсутствие субстратов. В результате, были получены только предварительные сведения о комплексах фермента с уридином и его аналогами, что позволило авторам работы [27] приблизительно локализовать участки аминокислотной последовательности белка, предположительно формирующие подцентр связывания этого субстрата. С другой стороны, создание методом сайт - направленного мутагенеза ряда белков с заменами и последующее изучение их свойств позволили сделать некоторые предварительные заключения о структурно - функциональной организации фермента. В частности, было убедительно показано, что в гексамере ЦРазы из E.coli К-12 отсутствуют как внутри, так и межмолекулярные дисульфидные связи. Были локализованы аминокислотные остатки (Cysl36, Hisl22) которые участвуют в поддержании активной структуры фермента. Предполагалось, что фрагмент полипептидной цепи Рго61 - Рго72 белка отвечает за связывание фосфат - иона и, как и остаток His8, принимает участие в формировании активного центра [28].

Таким образом, к началу исследований, результаты которых представлены в данной работе, мало что было известно о структуре активного центра ЦРазы из E.coli К-12 и конкретных аминокислотных остатках, принимающих участие в связывании и превращении субстратов.

Вышеизложенное и определяет актуальность темы исследования.

Цель работы. Целью работы являлась локализация с помощью сайт -направленного мутагенеза функционально важных участков полипептидных цепей и аминокислотных остатков бактериальных UP аз на примере данного фермента из Е.coli К-12.

Научная новизна работы. В работе впервые клонирован ген ЦРазы (udp) из Klebsiella aerogenes и определена его нуклеотидная последовательность (EMBL Y13414). Сконструирована экспрессионная плазмида и получен рекомбинантный штамм-суперпродуцент данного белка. Проведено выделение ЦРаз из Klebsiella aerogenes и Salmonella typhimurium, и сравнительное с ЦРазой из E.coli К-12 изучение их ферментативных свойств. Показано, что ферменты из E.coli К-12 и S. typhimurium наиболее сильно различаются по своим кинетическим характеристикам в ряду исследуемых белков.

Методами сайт-направленной реконструкции ДНК получены гены гибридных ферментов, состоящих из фрагментов полипептидных цепей ИРаз из E.coli и S. typhimurium. Созданы рекомбинантные штаммы -суперпродуценты соответствующих белков, с повышенной, по сравнению с ЦРазой E.coli дикого типа, удельной ферментативной активностью.

Методом сайт-направленного мутагенеза в аминокислотную последовательность уридинфосфорилазы из Е. coli К-12 был внесен ряд точечных и двойных замен. Мутантные белки выделены и исследованы их ферментативные характеристики. На основании сравнения полученных величин констант Михаэлиса и активности ЦРазы из Е. coli К-12 дикого типа сделан вывод о прямом или опосредованном (через структурирование активного центра) участии остатков Asp27, Ser66, Ser73, Arg91 в связывании неорганического фосфат-иона.

Проведено сравнение известных на современном этапе результатов исследования структурно-функциональной организации ЦРазы из Е. coli К-12, полученных методами сайт-направленного мутагенеза, PC А и селективной химической модификации.

Практическая ценность работы. Представляемая работа является частью проводимой в ГУЛ "ГосНИИгенетика" комплексной программы (№ темы 01/97-98. Регистрационный номер темы 01990002547) исследования структурно - функциональных отношений в ЦРазе из Е. coli К-12. Полученные в ней результаты, а именно: создание гибридных и мутантных форм бактериальных ИРаз с повышенной, по сравнению с ЦРазой из Е. coli К-12 дикого типа, удельной активностью;

• получение в процессе проведения исследований белков с измененным сродством к уридину и неорганическому фосфату и улучшенным распознаванием в качестве субстратов 2'-дезоксирибо-аналогов уридина; локализация с помощью сайт - направленного мутагенеза ряда аминокислотных остатков, предположительно входящих в состав фосфат -связывающей области активного центра; создают предпосылки для понимания закономерностей функционирования ЦРаз из разных организмов. Полученные экспериментальные данные позволят в дальнейшем проводить целенаправленные работы по конструированию на основе бактериальных ЦРаз белковых катализаторов с заданными свойствами, а также создавать и осуществлять синтез лекарственных препаратов для эффективной терапии ряда заболеваний.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста и содержит 25 рисунков и 5 таблиц. Библиография включает в себя 105 названий.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чеботаев, Дмитрий Владимирович

выводы.

1. Впервые клонирован ген уридинфосфорилазы (udp) из Klebsiella aerogenes, определена его нуклеотидная последовательность. Сконструированы экспрессионные плазмиды и исследована гетерологичная экспрессия в клетках E.coli гена udp из К. aerogenes. Создан высокоэффективный рекомбинантный штамм-продуцент соответствующего белка.

2. Проведено сравнительное изучение ферментативных свойств очищенных ЦРаз из К. aerogenes, S. typhimurium и E.coli К-12.

3. Сконструированы и клонированы гены гибридных ферментов (ЦРаз), состоящих из фрагментов полипептидных цепей ЦРаз из E.coli и S. typhimurium. Получены экспрессионные плазмиды и с их помощью созданы рекомбинантные штаммы - суперпродуценты соответствующих гибридных белков, обладающих повышенной удельной ферментативной активностью.

4. С использованием сайт-направленного мутагенеза показано, что, в отличие от данных РСА и селективной химической модификации, остатки Asp5 и Туг169 не принимают участие в формировании активной формы белка. Предложена схема участия функционально-важных остатков His8 и Asp27 в системе переноса протона в ходе каталитического превращения субстратов.

5. Методом сайт-направленного мутагенеза получен ряд мутантных форм ЦРазы из E.coli К-12. На основании изучения их ферментативных характеристик сделан вывод об участии остатков Asp27, Ser66, Ser73, Arg91 в связывании неорганического фосфат-иона.

6. Предложена модель структурно-функциональной организации фосфат-связывающей области активного центра ИРазы из E.coli.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чеботаев, Дмитрий Владимирович, Москва

1. Hammer Jespersen K. // Metabolism of Nucleotides, Nucleosides and Nucleobases in Microorganisms / Ed. Munch - Petersen A. London, New York, San Francisco: Acad. Press - 1983. - P. 203 - 258.

2. Luccioni C., Beaumatin J., Bardot V., Lefrancois D. Pyrimidine nucleotide metabolism in human colon carcinomas: comparison of normal tissues, primary tumors and xenografts. // Int. J. Cancer. 1994. - V. 58. - P. 517 - 522.

3. John J. Scocca. Purification and Substrate Specificity of Pyrimidine Nucleoside Phosphorylase from Haemophilus influenzae. II The Journal of Biological Chem. -1971.-V. 246.-P. 6606-6610.

4. Lee C. S., Jimenez B. M. and O'Sullivan W. Purification and haracterization of uridine (thymidine) phosphorylase from Giardia lamblia. 11 Molecular and Biochemical Parasitology. 1988. - V. 30. - P. 271 - 278.

5. Iltzsch M. H., Юепк Е. Е. Structure-activity relationship of nucleobase ligands of uridine Phosphorylase from Toxoplasma gondii. II Biochemical Pharmacology. -1993.-V. 46.-P. 1846- 1858.

6. Kouni M.H., Nagiub F.N.M., Niedzwicki J.G., Iltzsch M. H. and Cha S. Uridine Phosphorylase from Shistosoma mansoni II The Journal of Biological Chem. 1988. -V. 263.-P. 6081 -6086.

7. Ling F., Inoue Y. & Kimura A. Induction, Purification and Utilization of Purine Nucleoside and Uridine Phosphorylase from Klebsiella sp. // Process Biochemistry.- 1994. -V. 29.-P. 355-361.

8. Watanabe S I., Uchida Т. Cloning and Expression of Human Uridine Phosphorylase // Bioch. and Bioph. Res. Communication. - 1996. - V. 216. - P. 265 -272.

9. Брикун И.А., Миронов A.C., Суходолец В.В., Хургес Е.М. Клонирование гена уридинфосфорилазы ( udp) Escherichia coli и его экспрессия в составе рекомбинантных плазмид. // Генетика. 1989. - Т. 25. - С. 438 - 446.

10. Drabikowska А.К., Wozniak G. Modification of uridine phosphorylase from Escherichia coli by diethyl pyrocarbonate. // J. Biochem. 1990. - V. 270 - P. 319 -323.

11. Komissarov A.A., Romanova D.V. and Debabov V.G. Complete inactivation of Escherichia coli uridine phosphorylase by modification of Asp-5 with Woodward's reagent K. // The Journal of Biological Chem. 1995. - V. 270. - P. 10050 - 10055.

12. Komissarov A.A. and Debabov V.G. Modification with Tetranitromethane of an Essential Tyrosine Residue in Uridine Phosphorylase from Escherichia coli. И Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 1252 - P. 243 - 246.

13. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Ратманова К.И., Гулько Л.Б., Миронов A.A., Андрюхина Р.В., Дебабов В.Г. Изучение структурно-функциональной организации уридинфосфорилазы из Escherichia coli. II Докл. РАН. 1994. -Т. 339. N.6. - С. 819 - 821.

14. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Ратманова К.И., Гулько Л.Б. Исследование роли гистидина в функционировании уридинфосфорилазы из Escherichia coli К-12 методами белковой инженерии. // Биоорган, химия. 1995. - Т.21., N 11. -С. 834- 837.

15. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Ратманова К.И., Гулько Л.Б., Миронов A.A. Белковая инженерия уридинфосфорилазы из Escherichia coli К-12. Роль остатков цистеина в функционировании фермента. // Молекуляр. биология. -1996. Т.ЗО., N 1. - С. 170 - 177.

16. Krenitsky T.A. Uridine phosphorylase from Escherichia coli. Kinetic properties and mechanism. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V. 429. - P. 352 -358.

17. Leer J.C., Hammer Jespersen K., Schwarts M. Uridine phosphorylase from Escherichia coli. Physical and chemical Characterization. // Eur. J. Biochem. -1977.-V. 75.-P. 217-224.

18. Vita A., Huang C.Y., Magni G. Uridine phosphorylase from Escherichia coli В. Kinetic Studies and Mechanism of catalysis. // Archiv, of Biochem. and Biophys. -1983,-V. 226.-P. 687-692.

19. Vita A., Amici A., Cacciamani T., Lanciotti M., Magni G. Uridine Phosphorylase from Escherichia coli В. Enzymatic and molecular properties. // J. Biochem. 1986. - V. 5. - P. 431 - 436.

20. Zhao B. // Ph. D. Dissertation, University of Alabama at Birmingham. 1991.

21. Сипрашвили 3.3. Сайт направленная реконструкция ДНК. Изучение структурно-функциональных отношений в уридинфосфорилазе из Escherichia coli К-12. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, ГНЦ "Генетика", Москва. - 1994.

22. Mclvor R.S., Wohlhueter R.M., Plagemann P.G. Uridine Phosphorylase from Acholeplasma laidlawii. Purification and Kinetic properties. // J. of Bacteriology. 1983. - V. 156. - P. 198 - 204.

23. Avraham Y., Grossowicz N., Yashphe J. Purification and characterization of uridine and thymidine Phosphorylase from Lactobacillus casei. II Biochim. Biophys. Acta. 1990. - V. 1040. - P. 287 - 293.

24. Kraut A., Yamada E. W. Cytoplasmic Uridine Phosphorylase from Rat Liver. Characterization and Kinetics. // The Journal of Biological Chem. 1971. - V. 246. -P. 2021 - 2030.

25. Hamamoto T., Noguchi T. and Midoricawa Y. Purification and characterization of Purine Nucleoside Phosphorylase and Pyrimidine Nucleoside Phosphorylase from Bacillus stearothermophilus TH-6. // Biosci. Biotech. Bichem. 1996. - V. 60. - P. 1179 - 1180.

26. Fleischmann R.D., Adams M.D., White O., Clayton R.A., Kirkness E.F., Kerlavage A.R., Bult C.J., Tomb J-F, Dougherty B.A. et. al. Whole-Genom Random Sequencing and Assembly of Haemophilus influenzae Rd. II Science.-1995.-V. 269.-P. 449-604.

27. Okuyama K., Hamamoto T., Noguchi T. and Midoricawa Y. Molecular cloning and Expression of Pyrimidine Nucleoside Phosphorilase Gene from Bacillus stearothermophilus TH-6. II Biosci. Biotech. Bichem. 1996. - V. 60. - P. 1655- 1659.

28. Valentin Hansen P. Gene Manipulation and Expression. // Ed. Glass R.E., Spizek J. - 1985. - P. 273 - 286.

29. Walton L., Richards C.A., Elwell L.P. Nucleotide sequence of the Escherichia coli uridine phosphorylase (udp) gene. // Nucl. Acids Res. 1989. - V.16.- P. 6741 -6744.

30. Takehara M., Ling F., Izawa S., Inoue Y., Kimura A. Molecular cloning and Nucleotide sequence of Purine Nucleoside Phosphorylase and uridine phosphorylase genes from Klebsiella sp. 11 Biosci. Biotechnol. Bichem. 1995. - V. 59., N.10. - P.1987 - 1990.

31. Watanabe S., Hino A., Wada K., Eliason J.F. and Uchida T. Purification, Cloning, and Expression of Murine Uridine Phosphorylase. // The Journal of Biological Chem.- 1995. V. 270.-P. 12191 -12196.

32. Moghaddam A. and Bicknell R. Expression of Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor in Escherichia coli and Confirmation of Its Thymidine Phosphorylase Activity. II Biochemistry. 1992. - V. 31. - P. 12141 -12146.

33. Krenitsky T.A., Mellors J. W., Barclay R. K. Pyrimidine Nucleosidases. Their classification and relationship to uric acid ribonucleoside phosphorylase. // The Journal of Biological Chem. 1965. - V. 240. - P. 1281 - 1286.

34. Cappiello M., Mascia L., Scolozzi C., Giorgelli F., Ipata P. L. In vitro assessment of salvage pathways for pyrimidine bases in rat liver and brain. // Biochim. Biophys. Acta. 1998.- V. 1425. - P. 273 - 281.

35. Bose R., Yamada E. W. Uridine phosphorylase, Molecular Properties and Mechanism of Catalysis. // Biochemistry. 1974. - V. 13.,N. 10. - P. 2051 - 2056.

36. Krenitsky T.A. Pentosyl transfer mechanisms of the mammalian nucleoside phosphorylases. // J. Biol. Chem. 1968. - V. 243. - P. 2871 - 2872.

37. Perignon J.L., Bories D.M., Houllier A.M., Thuillier L. and Cartier P.H. Metabolism of pyrimidine bases and nucleosides by pyrimidine-nucleoside phosphorylases in cultured human lymphoid cells. // Biochim. Biophys. Acta. -1987,-V. 928.-P. 130- 136.

38. Miyazono K., Okabe T., Urabe A., Takaku F. and Heldin C-H. Purification and Properties of an Endothelial Cell Growth Factor from Human Platelets. // Journal of Biological Chem. 1987. - V. 262. - P. 4098 - 4103.

39. Usuki K., Saras J., Waltenberger J., Miyazono K., Pierce G., Thomason A. and Heldin C-H. Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor Has Thymidine Phosphrylase Activity // Bioch. and Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 184. - P. 1311 - 1316.

40. Sumizawa T., Furukawa T., Haraguchi M., Yoshimura A., Takeyasu A., Ishizawa M., Yamada Y. and Akiyama S-I. Thymidine Phosphrylase Activity Associated with Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor. // J. Biochem. -1993. V. 114.-P. 9-14.

41. Furukawa T., Yoshimura A., Sumizawa T., Haraguchi M., Akiyama S-I. Angiogenic factor. //Nature. 1992. - V. 356. - P. 668.

42. Usuki K., Miyazono K. and Heldin C-H. Covalent Linkage between Nucleotides and Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor. // The Journal of Biological Chem. 1991. - V. 266. - P. 20525 - 20531.

43. Ealick S.E., Rule S.A. et al. Three-dimentional Structure of Human Erythrocytic Purine Nucleozide Phosphorylase at 3.2 A Resolution. // The Journal of Biological Chem. 1990. - V. 265. - P. 1812 - 1820.

44. Spraggon G., Stuart D., Ponting C., Finnis C., Sleep D., Jones Y. Crystallization and X ray Diffraction Study of Recombinant Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor. // J. Mol.Biol. - 1993. - V. 234. - P. 879 - 880.

45. Moghaddam A., Zhang H-T., Fan T-P. D., Hu D-E., Less V.C., Turley H., Fox S.B., Gatter K.C., Harris A.L., Bicknell R. Thymidine phosphorylase is angiogenicand promotes tumor growth. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1995. - V. 92. - P. 998 -1002.

46. Haraguchi M., Miyadera K., Uemura K., Sumizawa T., Furukawa T., Yamada K., Akiyama S-I. Angiogenic activity of enzymes. // Nature 1994. - V. 368.-P. 198.

47. Weinstock I.M., Bondar M. and Arslan-Contin P. Pyrimidine nucleoside Phosphorylase during development of the normal and distrophic chicken. // Bioch. Biophys. Acta. 1973. - V. 249. - P. 15 - 23.

48. Zimmerman M. and Seidenberg J. Deoxyribosyl Transfer. I.Thymidine Phosphorylase and nucleoside deoxyribosyltransferase in normal and malignant tissues. // The Journal of Biological Chem. 1964. - V. 230. - P. 2618 - 2621.

49. Schwartz E.L., Baptiste N., Wadler S., Makower D. Thymidine Phosphorylase Mediates the Sensitivity of Human Colon Carcinoma Cell to 5-Fluorouracil. // The Journal of Biological Chem. 1995. - V. 270. - P. 19073 -19077.

50. Toi M., Hoshina S., Taniguchi T., Yamamoto Y., Ishitsuka H. and Tominaga T. Expression of platelet endothelial cell growth factor/thymidine Phosphorylase in human breast cancer. // Int. J. Cancer. (Pred. Oncol.), 1995. - V. 64. - P. 79 - 82.

51. Takebayashi Y., Miyadera K., Akiyama S-I., Hokita S., Yamada K., Akiba S., Yamada Y., Sumizawa T. and Aikou T. Expression of Thymidine

52. Phosphorylase in Human Gastric Carcinoma. // Jpn. J. Cancer Res. 1996. - V.87.-P. 288 - 295.

53. O'Brien T., Cranston D., Fuggle S., Bicknell R. and Harris A. Different Angiogenic Pathways Characterize Superficial and Invasive Bladder Cancer. // Cancer Research. 1995. - V. 55. - P. 510 - 513.

54. Schwarte E.L., Hoffinan M., O'Connor C.J. andWadler S.Stimulation of 5-Fluorouracile metabolic activation by interferon-a in human carcinoma cells. // Biochem. And Biophys. Research Communication. 1992. - V. 182. - P. 1232 -1239.

55. Chae W-G., Cauchon N.S., Kozlowski J.F. and Chang C. Facile Synthesis of 2',5'-Dideoxy-5-fluorouridine by Thymidine Phosphorylase. // J. Org. Chem. -1992.-V. 57.-P. 1002- 1005.

56. Elias L. and Sandoval J.M. Interferon effects upon fluorouracile metabolism by HL-60 cells. // Biochem. And Biophys. Research Communication. 1989. -V. 163.-P. 867- 874.

57. Birnboim Н.С., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. II Nucl. Acids Res. 1979. - V. 7. - P. 1513 - 1532.

58. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. II Молекулярное клонирование: Пер. с англ. Москва. Мир. 1984.

59. Gussow D., Clackson Т. Direct clone characterization from plaques and colonies by polimerase chain reaction. //Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17., N10. - P. 4000.

60. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase // J. Mol. Biol. 1975. - V. 94. - P. 441 -446.

61. Laemmli U. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. -V.227. - P.680 - 685.

62. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities protein utilizing the principle of protein dye binding. // Anal. Biochem. 1976. - V. 2. - P. 248 - 254.

63. McBride L.J., Caruthers M.H. An investigation of several deoxynucleoside phosphoamidites useful for synthesizing deoxyoligonucleotides. // Tetrahedron Letters. 1983. - V. 24., N.3 - P. 245 - 248.

64. Jones R.A. // Oligonucleotide synthesis: a practical approach / Ed. by M.J. Gait. Oxford. Washington DC: IRL Press. -1984. P. 23 -24.

65. Maxam A., Gilbert W. Sequencing end-lebel DNA with base specific chemical cleavage. // Meth. Enzymol. 1980. - V. 65. - P. 499 - 560.

66. Casse F., Pascal M., Chippaux M. Comparison between the chromosomal maps of Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Length of the inverted segment in the trp region. // Mol. Gen. Genet. 1973. - V. 124. - P. 253 - 257.

67. Молчан О.В. Изучение свойств бактериальных уридинфосфорилаз. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, ГНЦ "Генетика", Москва. 1998.

68. Шехтер И.И., Ратманова К.И., Вейко В.П., Дебабов В.Г. Сайт-направленный мутагенез с использованием адресованного фрагментирования однонитевой ДНК для получения гибридов гомологичных белков //Биоорган, химия. -1991. Т. 17., N.3. - С. 379 - 386.

69. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Ратманова К.И., Гулько Л.Б., Андрюхина Р. В., Дебабов В. Г. Клонирование и экспрессия в Escherichia coli тимидинфосфорилазы под контролем промотора уридинфосфорилазы. // Биотехнология. 1994. - Т.4. - С. 2 - 4.

70. Degano М., Gopaul D. N., Scapin J., Schramm V.L., and Sacchettini J. Three-Dimensional Structure of Inosine-Uridine Nucleozide N-Ribohydrolase from Crithidia fasciculata. II Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 5971 - 5981.

71. Scapin J., Grubmeyer C. and Sacchettini J. Crystal Structure of Orotate Phosphoribosyltrnsferase. // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 1287 - 1294.

72. Eads J.C., Scapin J., Xu Y., Grubmeyer C. and Sacchettini J. The Crystal Structure of Human Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase with Bound GMP. // Cell. 1994 - V. 78. - P. 325 - 334.

73. Walter M.R., Cook W.J., Cole B.L., Short S.A., Koszalka G.W., Krenitsky T.A. and Ealick S.E. Three-dimentional Structure of Thymidine Phosphorylase from Escherichia coli at 2.8 A Resolution. // J. Biol. Chem. 1990. - V.265. -P.14016- 14022.

74. Pugmire M.J., Cook W.J., Jasanoff A., Walter M.R. and Ealick S.E. Structural and Theoretical Studies Suggest Domain Movement Produces an Active Conformation of Thymidine Phosphorylase. II J. Mol. Biol. 1998.-V. 281.-P. 285 -299.

75. Hamamoto Т., Noguchi Т., Midoricawa Y. Cloning and Expression of Purine Nucleoside Phosphorylase I Gene from Bacillus stearothermophilus TH 6-2. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997. - V. 61(2). - P. 276 - 280.

76. B.A., Bott K.F., Hu P.-C., Lucier T.S., Peterson S.N., Smith H.O., Hutchison

77. C.A. Ill, Venter J.C. The minimal gene complement of Micoplasma genitaliumll Science. 1995. - V.270. - P. 397-403.

78. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов.// Пер. с англ. Москва. Мир. 1980.

79. Erion M.D., Takabayashi К., Smith Н.В., Kessi J., Wagner S., Honger S., Shames S.L. and Ealick E. Purine Nucleoside Phosphorylase. 1. Structure -Function Studies. // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 11725 - 11743.

80. Erion M.D., Stoeckler J.D., Guida W.C., Walter R.L. and Ealick E. Purine Nucleoside Phosphorylase. 2. Catalytic Mechanism. // Biochemistry. 1997. - V. 36.-P. 11735 - 11748.

81. Jordun F., Wu A. Stereoelectronic Factors in the Binding of Substrste Analogues and Inhibitors to Purine Nucleoside Phosphorylase Isolated from Human Erythrocytes. // J. of Med. Chem. 1978. - V. 21. - P. 877 - 882.

82. Krenitsky T.A. and Tuttle J.V. Correlation of substrate-stabilization patterns with proposed mechanisms for three nucleoside phosphorylases. // Biochim. et Biophys. Acta. 1982. - V. 703. - P. 247 - 249.