Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Направленная реконструкция ДНК. Исследование структурно-функциональной организации альфа2-интерферона человека и уридинфосфорилазы из Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Направленная реконструкция ДНК. Исследование структурно-функциональной организации альфа2-интерферона человека и уридинфосфорилазы из Escherichia coli"

РГ8 ид

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 575.22.224.112

ВЕЙКО ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ

НАПРАВЛЕННАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ ДНК. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СС2-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА И УРИДИНФОСФОРИЛАЗЫ ИЗ Escherichia coll.

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва 1995г.

Работа выполнена в Государственной научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор мирошников А.И.

доктор химических наук, профессор Степанов В.И. доктор биологических наук, профессор Рубцов П.М.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского, МГУ.

Защита состоится 26 декабря 1995 г. в 14 час. на заседании Специализированного совета Д 098.12.01 по биологическим наукам при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1 Дорожный проезд, д.1. С авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИгенетика.

Автореферат разослан "я?/ " ноября 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Щербакова В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Исследование структурно-функциональной организации белков предполагает выявление функционально-важных аминокислот, а также участков белковой молекулы, определяющих формирование вторичной, третичной и четвертичной структур этих молекул. Именно эти аминокислотные остатки (или участки полипептидной цепи) во многом определяют биологические функции белка. Выявление такого рода аминокислотных остатков ведет как к пониманию механизма действия белков, так и дает широкие возможности для анализа укладки (фолдинга) полипептидной цепи, что немаловажно при создании алгоритмов математических программ, предсказывающих направление этого процесса.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез является одним из наиболее эффективных методов введения запланированных замен в последовательность ДНК при реконструкции генетического материала, а также получения белков с направленными изменениями в аминокислотной последовательности. Разработка новых и оптимизация уже существующих методов мутагенеза позволяет более эффективно проводить реконструкцию ДНК и получать информацию о структурно-функциональной организации белков.

Отдельные моменты актуальности исследования конкретных белков (СХ2-интерферон человека и уридинфосфорилаза из E.coli) описаны непосредственно в разделах, посвященных этим белкам.

В данной работе, начатой примерно в 1985 году, широко использовались два наиболее эффективных метода сайт-направленной реконструкции ДНК - урацил-репарационная система (T.Kunkel, 1985), а также метод по-лимеразной цепной реакции, эффективность применения которого в сайт-направленном мутагенезе была продемонстрирована в последние 5-7 лет. Исследование и оптимизация этих способов введения направленных изменений в ДНК также являлись предметом данной работы.

Сказанное выше и определяет актуальность темы исследования.

Цель и задачи исследования.

Целью данного исследования являлось изучение структурно-функциональной организации двух белков - СС2-интерферона человека и уридинфос-форилазы из Escherichia coli. Были поставлены и решались следующие задачи :

1. Получение серии мутантных форм гена (Х2-интерферона человека, создание соответствующих бактериальных штаммов-продуцентов мутантных интерферонов, выделение и характеристика мутантных форм интерферона. Целью данной части исследования являлась локализация фрагмента полипептидной цепи интерферона, принимающего участие в формировании противовирусной активности белка.

2. Изучение особенностей проведения олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием урацил-репарационной системы.

3. Химический синтез гена ингибитора протеиназ из Hirudo medicina-

lis (эглин С), получение бактериального штамма-продуцента соответствующего белка, отработка методики его выделения и изучение ингибирующих свойств эглина С.

4. Конструирование на основе гена эглина С генов химерных белков, содержащих фрагменты СС2-интерферона человека и ß-эндорфин человека. Создание соответствующих бактериальных штамм0в-продуцентов.

5. Исследование структурно-функциональной организации уридинфосфо-рилазы - одного из ферментов катаболизма нуклеозидов E.coli.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Одним из объектов изучения в настоящей работе является интерферон (ИФН) - многофункциональный белок, имеющий широкое клиническое применение. Выяснение взаимосвязи "структура-функция" в ИФН направлено, в конечном итоге, на исследование молекулярных основ механизма действия белка. Эти данные, кроме фундаментальных знаний о принципах функционирования ИФН, позволяют прогнозировать изменение его свойств при введении мутаций и ведут к получению нового поколения лекарственных препаратов белковой природы.

Вторым объектом данного исследования являлась уридинфосфорилаза -фермент катаболизма нуклеозидов в E.coli. Данные о принципах функционирования уридинфосфорилазы создают предпосылки для целенаправленного создания соединений, ингибирующих активность этого белка. Последнее особенно актуально в связи с явлением резкого увеличения уровня биосинтеза уридинфосфорилазы в раковых клетках. Т.,о.-, понимание принципов молекулярной организации и функционирования уридинфосфорилазы ведет к созданию высокоэффективных химиотерапевтических агентов для лечения онкологических заболеваний.

Изменение структуры белков на уровне кодирующих их генов осуществляется с помощью сайт-направленного мутагенеза - метода, использующегося для реконструкции ДНК. Изучение особенностей сайт-направленного мутагенеза дает возможность правильно планировать проведение экспериментов и проводить процесс в оптимальных условиях.

С использованием подхода сканирующих мутантов сконструированы гены ИФН человека с изменениями в области кодонов 30-50 аминокислотных остатков (а.о.), получены штаммы-продуценты соответствующих белков и проведено структурно-функциональное исследование СС2-ИФН человека.

Определено, что участок 31-42 а.о. ответственен за противовирусную активность белка на линии клеток человека (А-549) и свиньи (СПЭВ), определяет видоспецифичность подвида ИФН. В процессе исследования выявлена функциональная роль отдельных аминокислотных остатков участка 30-50 интерферона. Предложена пространственная модель третичной структуры антивирусного сайта 02-ИФН человека, в рамках которой дано объяснение ряда литературных и экспериментальных результатов.

Отработаны варианты метода получения протяженных фрагментов ДНК из

1тетических олигодезоксирибонуклеотидов без применения Т4-полинукле-1дкиназы и Т4-ДНК-лигазы, определены оптимальные условия проведения зцесса. Проведен химический синтез гена эглина С (специфического ин-эитора протеиназ из Hirudo medicinalis) и гена (i-эндорфина человека.

Сконструированы векторы для экспрессии эглина С в E.coli и создан iMM-продуцент эглина С, продуцирующий не менее 400 мг белка на литр тьт^ральной жидкости. Отработана схема выделения гомогенного эглина 13 биомассы E.coli. Исследована ингибирукмцая активность полученного <омбинантного эглина С по отношению к СС-химотрипсину и эластазе. По-ченный штамм-продуцент может служить источником для наработки ле-эственного препарата белковой природы.

На основе гена эглина С и фрагментов гена СС2-ИФН человека сконс-/ированы гены химерных белков и соответствующие экспрессионные плазмы. Достигнут высокий уровень экспрессии генов химерных белков в Е. Li. Охарактеризован химерный белок, содержащий фрагмент 30-52 амино-глотной последовательности Й2-ИФН человека. Показано, что данный бе-< связывается с моноклональным антителом NK-2, нейтрализующим анти-эусное действие СС2-интерферона человека.

Разработана схема твердофазного синтеза аминоолигонуклеотидов. 1фатическая аминогруппа по разработанной схеме вводится по межнукле-1Дной фосфатной группе, оставляя немодифицированными 5'- и З'-конце-г гидроксильные группы и гетероциклические основания олигонуклеоти-з. На основе аминоолигонуклеотидов получены биотинилированные олиго-<леотидные зонды. Показано, что такие олигонуклеотиды могут быть ис-тьэованы практически во всех видах генно-инженерных работ.

Изучен процесс проведения сайт-направленного мутагенеза в ура-i-репарационной системе. Определено влияние отдельных факторов на <од мутагенеза и выявлены особенности мутагенеза в урацил-репараци-системе. Предложена модификация методики получения урацилсодер-цей ДНК-матрицы.

Разработан метод многоточечного мутагенеза с использованием адре-занного фрагментирования одноцепочечной ДНК, позволяющий конструиро-гь гибриды гомологичных белков с заданными границами. С помощью дан-го метода получен гибридный белок СС-ИФН человека и свиньи.

С использованием сайт-направленного мутагенеза в урацил-репараци-10й системе проведен комплекс работ по получению различных генно-ин-1ерных конструкций:

- осуществлена реконструкция области регуляции репликации плаэмиды ?322 для создания на ее основе мобильных генно-инженерных конструк-i;

- осуществлена реконструкция гена предшественника ИФН1, в резуль-■е которой получен ген зрелого белка. Экспрессия гена зрелого ИФН1 ¡.coli составила 2х107 МЕ/л;

- получен ген HVH-[5-Ser-17 и создан штамм-продуцент белка, облада-

ющего повышенной в 10 раз по сравнению с рекомбинантным ИФН-|5 удельнс противовирусной активностью.

Сконструированы экспрессионные плазмиды, обеспечивающие эффективную транскрипцию и трансляцию генов под контролем промотор-операторнс области гена уридинфосфорилазы. Получены штаммы-продуценты ферментов катаболизма нуклеозидов (уридинфосфорилазы - 0,4г/л, тимидинфосфорила эы - 0,6г/л, цитидиндезаминазы - 0,6г/л), которые могут быть использс ваны в биоконверсии нуклеозидов при синтезе антиметаболитов, имеющих практическое значение при химиотерапии злокачественных опухолей.

С помощью сайт-направленного мутагенеза изучена структурно-функци опальная организация уридинфосфорилазы из E.coli. В ходе исследования показано, что:

- в уридинфосфорилазе остатки цистеинов не участвуют в образовании как внутри-, так и межмолекулярных дисульфидных связей;

- остаток С136 имеет важное функциональное значение в поддержании как активного центра, так и всей молекулы фермента в целом;

- остаток Н122 участвует в поддержании активного центра уридинфосфорилазы, а остаток Н8 входит непосредственно в активный центр фермен та ;

- участок полипептидной цепи Р61-Р72 в уридинфосфорилазе играет важную роль в функционировании молекулы фермента, отвечая за связывание иона фосфата;

- N- и С-концевые участки полипептидной цепи уридинфосфорилазы формируют места межсубъединичных контактов, участвуя в образовании на-тивной четвертичной структуры белка.

С использованием полимеразной цепной реакции отработаны методы сайт-направленной реконструкции ДНК. Методы основаны на:

- сдвиге и возвращении рамки считывания в структурной области гена;

- использовании однонитеппго фрагмента ДНК для проведения сайт-направленного мутагенеза;

- введении "стоп-кодона" трансляции в 3'-концевой области гена и кодона инициации трансляции в 5'-концевой области гена для конструирования генов белков укороченного размера.

Вышесказанное определяет как научную новизну, так и практическое значение проделанного исследования.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на Международных, Всесоюзных и Российских конференциях, в том числе: на 20 Международном конгрессе ФЕБО (Будапешт, Венгрия, 1990), на 15 Международном конгрессе по биохимии (Иерусалим, Израиль, 1991), на 13 Американском симпозиуме по пептидам (Эдмонтон, Канада, 1993), на Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы практического применения" (Москва, Россия, 1991), на конференции "Новые направления в би-

зтехнологии" (Пущино, Россия, 1994), на отчетных конференциях Гос.НИИ--енетика (1993, 1994, 1995).

структура работы.

Диссертация изложена в виде научного доклада и автореферата. основная часть результатов получена в соавторстве с Шехтер И.И., Булен-(овьиу М.Т., Ратмановой К.И., Гулько Л.Б., Сипрашвили 3.3. Вклад других »второв отражен в публикациях по теме диссертации. Автор приносит бла--одарность коллегам за активное участие в совместных исследованиях.

ГЛАВА I. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СС2-ИНТЕР-

ФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА. ПОИСК ФРАГМЕНТА ПОЛИПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ, ПРИНИМАЮЩЕГО

УЧАСТИЕ В ФОРМИРОВАНИИ АНТИВИРУСНОГО САЙТА ИНТЕРФЕРОНА.

1.1. ИНТЕРФЕРОНЫ (Общая характеристика объекта исследования).

Интерфероны (ИФН) были открыты в 1957 г. (Isaacs A., Lindenmann 3), как агенты, предотвращающие репликацию вирусов. Они представляют зобой секретируемые белки и относятся к классу белков-цитокинов.

В настоящее время известны три класса интерферонов, хотя, вероят-ю, их многообразие на этом не исчерпывается (так, например, недавно эткрыт еще один тип интерферона - трофобластный, обозначенный как Т). 1звестные классы интерферонов отличаются друг от друга по своей пер-зичной структуре, антигенным свойствам, физико-химическим характеристикам. Первоначальное разделение на лейкоцитарный (СС), фибробластный (Р) и иммунный (Y) основывалось на типах клеток, которыми эти белки 1родуцировались. Позднее было показано, что такое деление не совсем 1равомерно, т.к. часто интерфероны-Ct и -|3 синтезируются в одном и том ке типе клеток. Поэтому интерфероны О. и Р отнесены к типу I, а интер-|>ерон-У к типу II (в зависимости от типа рецепторов клеток, с которыми ззаимодействуют интерфероны).

Гены лейкоцитарных интерферонов, представленные семейством близкородственных белков, не имеют интронов и локализованы, так же как и ген 1ФН-(5, на 9 хромосоме человека.

1.2. Биологические эффекты интерферона.

Интерфероны - белки широкого спектра действия. Помимо противовирусной активности эти белки характеризуются антипролиферативной и им-1уномодулирующей функциями.

Если противовирусное действие ИФН не является специфичным по отно-зению к определенному вирусу, то следует отметить, что ИФН обладает шраженной видоспецифичностью действия. Так, например, ИФН человека :орошо защищает от вирусной инфекции клетки человека и быка, несколько :уже свиньи и кошки, и существенно хуже мыши и крысы. Однако, видовая :пецифичность действия ИФН является скорее количественным, чем качест-

венным признаком: защитный эффект может быть достигнут in vitro и на гетерологичных линиях клеток при значительном увеличении дозы интерферона. Некоторые подвиды ИФН-Ct человека, напротив, проявляют большее противовирусное действие на клетках гетерологичных организмов.

1.3. Некоторые аспекты механизма действия интерферона, связывание белка со специфическими клеточными рецепторами.

Интерфероны - высокоактивные биологические соединения, проявляющие противовирусную активность уже при концентрациях около 10"14 М, что значительно ниже, чем нижняя граница концентраций для простагландинов (10~9 М), а также различных пептидных гормонов.

Механизм биологического действия ИФН до сих пор остается до конца невыясненным. Интерфероны рассматривают как гормоноподобные переносчики, которые осуществляют как стимулирующее, так и ингибирующее действие на клетку посредством связывания со специфическими клеточными рецепторами. Клонирование гена рецептора СС/|3, расположенного на 21 хромосоме человека, позволило определить, что он представляет собой белок молекулярной массой примерно 110 кДа (Grossberg S.E. et al., 1989). Обнаружен также растворимый рецептор <Х/(5, имеющий молекулярную массу 40 кДа (Novick D, 1994).

В литературе широко обсуждается вопрос о последовательности событий, происходящих после связывания ИФН с поверхностным клеточным рецептором и приводящих к индуцированию биологического ответа: проникает ли ИФН в клетку после связывания с рецепторов ил1£, подобно гормонам, продуцирует трансмембранные сигналы, приводящие к активации транскрипции ряда генов (Gilmour К.С. et al., 1995; Landolfo S et al., 1995).

Неудовлетворительные результаты по индуцированию противовирусного статуса клетки при микроинъекциях ИФН в цитоплазму или в ядро, а также устойчивость к действию ИФН клеток, лишенных рецепторов, свидетельствовали о необходимости взаимодействия ИФН с рецептором.

Описано получение анти-идиотипического антитела (т.е. антитела к анти-ИФН иммуноглобулину), которое не только связывалось с клеточными рецепторами, но и индуцировало биологический ответ, активируя рецепторы, что говорит в пользу триггерного механизма действия ИФН (Osheroff P.L., 1985, Pestka S., et al., 1992). Однако, вопрос об интернализации ИФН в клетку после взаимодействия с рецептором остается предметом для исследований.

В литературе рассматривались различные участки белковой структуры, предположительно ответственные за непосредственный контакт с рецептором. Было показано, что N-концевой участок интерферона-31 человека (10-44 а.о.) принимает участие во взаимодействиях с рецепторами клеток человека и быка. Однако, имеется множество работ, где показано участие во взаимодействии со специфическими клеточными рецепторами С-концевого (120- 140 а.о.) участка ИФН. Завьяловым В.П. с соавт. (Zav'yalov V.P.

it al., 1995) было показано, что фрагмент 131-138 а.о. СС2-ИФН человека •пособен связываться с рецепторами тимоцитов и эффективно активировать >ласт-трансформацию. Эти данные свидетельствуют о возможном участии ¡азличных фрагментов аминокислотной последовательности ИФН в проявле-ши антивирусной и антипролиферативной активностей.

Таким образом, связывание ИФН со специфическим клеточным рецепто-юм представляет один из определяющих моментов в механизме действия »той группы белков. Однако, до сих пор элементы белковой структуры интерферона, принимающие участие во взаимодействиях с клеточным рецепто-эом, точно не локализованы и представляют значительный интерес при 1эучении структурно-функциональных отношений этой группы белков.

1.4. Методы, применяемые при изучении структурно-функциональных

отношений в интерферонах, и некоторые результаты исследований.

Отсутствие информации о третичной структуре интерферонов человека, установленной на основании данных рентгеноструктурного анализа, пов-1екло использование различных методических подходов, направленных на юиск участков молекулы, определяющих ее биологические функции, краткое описание которых приведено ниже.

Как было отмечено выше, (Х-интерфероны, представляющие семейство Элизкородственных белков, имеют значительную гомологию аминокислотной последовательности. Наличие эволюционно-консервативных областей в интерферонах авторы многих работ связывали с их функциями.

Так, при исследовании консервативного кластера 47-50 а.о. интерфе-рона-С12 с помощью сайт-специфического мутагенеза были введены замены в 48, 49 и 62 а.о. Несмотря на то, что введенные а.о. отличались от исходных по заряду, а также по размеру боковых радикалов, они не оказывали влияния на противовирусную активность белка (Valenzuela D. et al., 1985) на линиях клеток быка (МДВК), человека (WISH) и мыши (L929) .

Сконструированный аналог ИФН-СС2 человека с заменами 30,32,33 а.о. на остатки аланина (Camble R, et al. , 1986) был полностью лишен противовирусной и антипролиферативной активностей. Дополнительные мутации показали, что природа бокового радикала Arg-ЗЗ является существенным фактором для проявления интерфероном противовирусной активности.

Говоря о консервативных аминокислотах, нельзя не отметить исследование роли остатков цистеина. Основные подтипы ИФН-(Х содержат четыре остатка цистеина, соединенных дисульфидными связями: 1-99 и 29-139/138. Работы по сайт-направленному мутагенезу цистеинов показали, что основную роль при проявлении биологической активности ИФН играет дисульфидная связь 29-138, тогда как 1-99 необходима, скорее всего, для поддержания общей конформации молекулы.

ИФН-Р имеет три остатка цистеина в положениях 17,31,141. Локазано, что функциональную нагрузку несет дисульфидная связь 39-141, а остаток

Cys-17 остается свободным и может принимать участие в межмолекулярных взаимодействиях при гетерологичной экспрессии гена.

Суммируя изложенное, следует сказать, что работы по исследованию в интерферонах роли отдельных консервативных аминокислотных остатков или их кластеров также не дали возможности получить однозначную информацию о структурно-функциональной организации этой молекулы.

Изучение биологической активности фрагментов интерферона, проведенное с помощью синтетических пептидов, показало, что ни один из синтетических фрагментов ИФН-Cll человека 1-81, 24-81, 71-166 и 111-166 не проявлял биологической активности на уровне нативного интерферона (Leist Т. et al., 1984). В случае использования термолизина при расщеплении ИФН было получено два фрагмента 1-110 и 111-153, один из которых (1-110) сохранял противовирусную активность на клетках МДВК и почти не терял способности связываться с их рецепторами (Ackerman S. et al., 1984). В последнее время появились данные, показывающие наличие антип-ролиферативной активности С-концевого фрагмента интерферона (Danilko-vich A.V. et al-, 1992, Zav'yalov V.P. et al., 1995). Эти данные могут свидельствовать о наличии в интерфероне линейного участка аминокислотной последовательности, ответственного за формирование антипролифера-тивного сайта.

Моноклональные антитела (МкАт), узнающие С-концевой эпитоп (16 С-концевых амиинокислот) ИФНОС-А и CC-D специфически связывались с комплексом ИФН-клеточный рецептор (Arnheiter Н. et al., 1983), что свидетельствовало о невовлеченности этого участка ИФН в образование контакта с рецептором.

Нейтрализующее противовирусную активность СС-ИФН МкАТ NK-2 не взаимодействовало с восстановленной формой Ct-ИФН, что указывает на то, что противовирусный сайт интерферона, по-видимому, представляет конформа-ционную структуру линейных фрагментов, расположенных в разных частях молекулы (Lydon N. et al., 1985).

Изучение структурно-функциональных отношений в ИФН с помощью МкАТ показало, что нарушение одной иэ активностей ИНФ может происходить без затрагивания остальных его функций. МкАТ к участку 133-147 нейтрализовали противовирусную активность ИФН без воэгействия на антипролифера-тивную функцию (Barasoain L. et al., 1989). МкАТ, полученные в работе (Cebrian М. et al., 1987), разрушали способность интерферона стимулировать активность естественных киллеров, оставляя противовирусную активность белка без изменения. Вышеизложенное позволяет предположить наличие разнесенных сайтов в молекуле интерферона, обуславливающих проявление различных биологических функций белка на разных линиях клеток (Bañarjee К. et al., 1989).

Выводи.

Подводя итог краткому рассмотрению различных методов изучения

зтруктурно-функциональной организации интерферонов можно отметить, 1то, несмотря на обилие литературных данных, во многом противоречивых, < настоящему времени не удалось составить однозначную картину взаимосвязи "структура-функция" в этом классе белков. Во многом это объясня-зтся отсутствием систематического подхода в изучении отдельных элементов структуры интерферонов и трудностями, связанными с получением рентгенографических данных для (Х-ИФН человека, которые могли бы слу-кить ориентиром при выборе участка в последовательности белка для детального изучения. Следует отметить также, что полифункциональность 1нтерферонов и их видоспецифичность не позволяет проводить прямое :равнение результатов, полученных с использованием различных подвидов чнтерферона. К началу настоящей диссертационной работы можно было с определенной долей достоверности утверждать, что, по-видимому, антивирусный сайт (или, по крайней мере, его фрагмент) ИФН-СС2 и, возможно, 4ФН-Р человека расположен в Ы-концевой части белка (участок с 10 по 50-й аминокислотный остаток) и представляет собой конформационную структуру. Локализация антивирусного сайта в СС-ИФН человека и явилась эдной из задач настоящей диссертационной работы.

II. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ИНТЕРФЕРОНОВ-а.

11.1. Поиск участка белковой молекулы, определяющего противовирусную активность интерферона.

Одним из направлений в изучении структурно-функциональных отношений в интерферонах-СС является поиск участков, ответственных за противовирусную функцию белка. Противовирусное действие интерферона-ОС человека по отношению к широкому спектру клеток-мишеней, включая клетки гетерологичных организмов, является основным, количественно тестируемым свойством этих белков.

Поскольку первичным актом действия интерферона на клетку является его связывание со специфическим клеточным рецептором (Pestka Б. et а1., 1992), поиск антивирусной детерминанты сопряжен с локализацией рецептор-свяэывающего сайта.

В основе связывания интерферона с рецептором лежит белок-белковое взаимодействие, которое должно определяться комплементарностью профи-пей контактных поверхностей, структурным соответствием доноров и акцепторов (БЬи1г в.Е. et а!., 1979; Загип й. е£ а1., 1990). Из этого -ледует, что антивирусная детерминанта, включающая сайт связывания с рецептором, вероятнее всего, должна находиться в экспонированных участках молекулы.

Значительная гомология в аминокислотных последовательностях, а также сходство функциональных свойств позволяют рассматривать интерфе-?оны-<Х как семейство белков с однотипной структурной организацией. В этсутствие рентгенографических данных в литературе описан ряд гипоте-

тических моделей третичной структуры интерферонов-СС (Sternberg M.J.E. et al., 1982, Raj N.B.K. et al., 1988, Ptitsyn O.B. et al. 1985, Zav'yalov V.P. et al.. 1989 и др.)- Эти модели интерферонов (рис.1) включают комплекс из 4-6 Ct-спиралей, соединенных петлевыми участками.

Рис.1. Модели третичной структуры СС-интерферонов: 1.Sternberg М.О.Е. et al., 1982, 2. Nicolas Э. et al.,1993, 3. Raj N.B.K, et al., 1988, 4. Zav'yalov V.P. et al.,1989, 5. Ptitsyn O.B. et al. 1985.

Именно петлевые участки могут определять специфические свойства интерферона, поэтому, на наш взгляд, они должны являться основными объектами поиска антивирусной детерминанты. Следует отметить, что в последнее время такой подход к трактовке структурно-функциональной организации гормоноподобных белков находит в литературе все более широкое развитие и подтверждение.

На основании моделей третичной структуры интерферонов-СС и с учетом того факта, что N-концевая область белка участвует в формировании антивирусного сайта интерферонов-tt на клетках человека, для исследования нами был выбран сегмент молекулы в области 30-50 а.о. полипептидной цепи. Этот участок, не входящий в состав описанных СС-спиралей, ß-сло-ев, ß-поворотов,может быть отнесен к Й-подобным структурам (Leszsynski J.F. et al, 1986), представляющим независимый элемент нерегулярной вторичной структуры, часто осуществляющий важную функцию в процессах узнавания и формирования функциональной активности белковых молекул. Данный участок интерферона является достаточно консервативным (рис.2).

30 40 Ь0

Ьи 1Гп а Ь К О я н 0 Г б г р 9 Е Е г . в N й Г с К

ши 1Гп а - - - - К - - И - - - - К V э А о N

ти ¿Гп 1 - К - - К V 0 А о - I К -

ти 1Гп 2 - 0 Ь - К V И N о - I -

ши 1Гп 4 - К I. - К V э N 0 - I -

га 1Тп 1 - - - - К У - - - - 1. - К V И - 0 - I -

Ьо 1Гп а ~ <2 - - N - - Е - 1 - - А 1 с - 5 - с -

Ьо 1Гп Ь - - N - Е - - - - А Ь Й - Б - с -

Ьо 1Гп с! - <1 - - N - - Е - - - - А ь с - в - с -

Ьо 1Гп с - 0 - - N - Е - - - - А 1 с - Э - с -

Ьо 1{п 1 - 0 - - N - Е - - - - А ь с - Э - с

ро п 1 - 0 н - Я - - - Б - Н - А - в - - - V - -

ея 1 - - - - N - - - - - С V - о - - - - я

ея 1 £п 2 - - - - N - - - - - - С V - р - - - - К ь

Ьи 2

Ьи 1Гп 2'

Ьи 1 £п 1 - м - - - - - - - - - - - - й - - - - - -

Ьи 1{п б - - - - - - - К - - - - - - о - - - - - -

Ьи 1{п д . - - - - - - - - - 0 - - - - -

Ьи ] Т п 5 - О

Ьи 1Гп с1 - - - - Р - - - ь - - - - - О - - - -

Ьи 1 Г п 11 - - - - - - - - ь - - - - - 0 - - - - -

Ьи 1 Гп 1' - - - - - - - - ь - - - - - 0 - - - - -

Ьи 1Гп 1 - - - - - Е - Я - - - - - - О - н - - -

Ьи 1 ГП 7 - - - - - Е - И - - - - - - э - н - - -

Ьи 1 Г п а - - - - - - - Е - - - - - - э Р К - - - -

Ьи 1Гп 2Ь - - - - - - - Е - - - - - - О - - - - -

Ьи 1Гл 10 - - - - - - - Я - - - - - - И - - - I -

Ьи ]{п Ь - Я I - - - - - О - - - - -

Ьи 11п п - - - - - - - Е - - - _ - - э - - - - -

Ьи 1Гп о - - - - - - - Е - - - - - - й - - - - - -

Ьи Ь - - - - - - - Е - - - - - - 0 Э К - - - -

Ьи 1(п с - Н I - - - - - 0 - - - - - -

Ьи <3 - м - - - - - - - - - - - - 0 - - - - - -

Ьи 1Гп 51749 - - - - - - - Е - - - - - - 0 й К - - - -

Ьи 1Гп 51Ы 0 - 0

Ьи 1Гп Ь - - - - - - - Е - - - - - - р - - - - - -

Ьи 1Гп 1 - - - - Р - - - 1 - - - - - 0 - - - - - -

Ьи 1{п j1 - - - - - Е - Я - - - - - - й - н - - -

Ьи 1Гп е - - - - - - - 0 - - Н <2 V - н - - н - - -

Ьи 1{п { - 0

Ьи 1Гг> к - - - - - - - К - - _ „ - - И - - - - -

Ьи 1Гп 4Ь - - - - - - - - - - Е - - - 0 - н - - -

Ь и 1 Г п 4 л - - - - - - - - - - Е - - - О - И - -

Ьи 1Г п j2 - - - - - Е - я - - - - 0 - н - - -

Ьи 2Гп wa(n) - - - - У - - - - - - V - - р - - - - -

Ьи 1Гп Ь2 - - - - - - с - - - - - О О К - - -

Ьи 1{п Ь - - - - - - И - - - [) - - - I

Ьи 1Гп дх-1

Ьи 1 £п /6 - - - - - - - - Е - - - - - И - -

Ьи 1Гп 11-1 - - - И - - К - - - М V К - 3 - 1

Ьи р9а2 - - - И - - я - - Г М V ь - Б - 1

Ьи 1Гп е76е9 - - - И - • я - - Г м V ь - Б - ь

Рис.2. Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемого участка (Х2-интерферона человека с другими подтипами й-интерферо-нов.

С этой точки зрения представлял интерес детальный структурно-функ-(иональный анализ выбранного района интерферона-(Х2 человека, включаю-(ий определение роли отдельных а.о. в формировании предполагаемого антивирусного домена, что и явилось предметом данного раздела работы.

11.2. Выбор типа аминокислотных замен при исследовании функцио-

нальной роли участка 30-50 а.о. (Х2-интерферона человека.

Исследование такого рода может быть проведено с использованием му-тантных белков с измененной аминокислотной последовательностью в анализируемом участке. При выяснении роли участка молекулы, а также его отдельных аминокислотных остатков, мы считали, что следует рассматривать мутанты с постепенным замещением (сканированием) а.о. Этот подход обеспечивает более точную идентификацию функционально-значимых аминокислот и позволяет выявить вклад локальных, малопредсказуемых конфор-мационных изменений в исследуемом фрагменте, которые могут происходить при введении точечной мутации. Это обусловило получение сканирующих мутантов интерферона, а также дополнительных вариантов с единичными и множественными заменами.

Решающим при планировании изменений в составе белка для структурно-функционального исследования является определение типа вводимых замен. На наш взгляд, замены должны быть строго детерминированы, по крайней мере на первом этапе исследования, существующими в природе аналогами с отличающимися от изучаемого белка свойствами, которые и дают возможность определить влияние вносимого изменения на функциональные свойства белка, не нарушая в целом структуру всей молекулы. Именно поэтому в качестве замещающих нами были выбраны негомологичиые в исследуемой области аминокислоты свиного интерферона-ОС - белка, имеющего пониженную (на два порядка) противовирусную активность на тестируемой линии клеток человека и содержащего нехарактерные (рис.3) для интерферона-ОС человека а.о. в исследуемой области (Piasecki Е. et al., 1988, La Bonnardiere С. et al.1986).

30 40 50

LKDRHDFGFPQEEF-GNQFQKAETI ИФН-СС2 человека

30 *** **** * 50 * * *

LDHRRDFGSPHEAFGGNQVQKAQAM ИФН-СС свиньи

Рис.3. Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемого участка Ct-интерферонов человека и свиньи.

II.3. выбор системы для проведения сайт-направленного мутагенеза.

К моменту начала настоящего исследования существовал ряд эффективных методов сайт-направленного мутагенеза, анализ которых показал, что оптимальным является проведение процесса с использованием урацил-репа-рационной системы (Kunkel Т.А. et al., 1984). Система характеризуется простотой выполнения, универсальностью, не требует применения специально сконструированных векторов.

Однако, следует отметить, что урацил-репарационная система, широко используемая во многих работах по мутагенезу, характеризовалась большим разбросом в выходах мутантных форм ДНК и практически не была изу-

чена с точки зрения отдельных факторов, определяющих эффективность процесса.

Проведение ряда работ по получению генов мутантных форм ИФН-С12 человека, гибрида ИФН-Й2 человека и свиньи, зрелого ИФН-СС1 , а также эксперименты по реконструкции области репликации плаэмиды рВИ322 с применением метода сайт-направленного мутагенеза в урацил-репарационной системе представляли интерес не только с точки зрения получения целевых мутантов, но и давали возможность провести изучение особенностей проведения процесса в этой системе, имеющее отдельное практическое значение.

11.3.1. Общая характеристика урацил-репарационной системы отбора мутантных форм ДНК.

схема проведения сайт-направленного мутагенеза в урацил-репарационной системе представлена на рис.4.

Рис.4.Общая схема проведения мутагенеза с применением урацил-репарационной системы.

Урацил-репарационная система предполагает использование урацилсо-

|>агов в культурах штаммов E.coli с нарушенной репарацией урацилов [dut'ung") в присутствии небольшого количества уридина. Урацилсодержа-1ие ДНК функционируют как нормальные матрицы при проведении ферментативного синтеза мутантной цепи гетеродуплекса (III), т.к. урацил обляжет таким же кодирующим потенциалом, как и тимин.

После проведения синтеза ДНК in uitro "минус"-цепь гетеродуплекса жлючает мутацию и только характерные для ДНК гетероциклические осно-(ания, а исходная "плюс"-цепь - урацилы и исходный генотип. Наличие рацилов направляет действие фермента репарации бактериального штамма : нормально функционирующей репарацией dut ung (урацил-И-гликозилазы) а разрушение "плюс"-цепи гетеродуплекса, элиминирующее исходный гено-ип, что и приводит к преимущественному размножению "минус" цепи гете-одуплекса и, соответственно, высокому выходу мутантных форм (V) ДНК.

4

IV

V

держащих ДНК-матриц (I), введение которых осуществляют выращиванием

II.4. Конструирование мутантных генов (Х2-интерферона человека.

Изучение структурно-функциональной организации ИФН-С12 человека ставило задачу получения ряда его мутантов с изменениями в области 30-50 а.о. Изменение последовательности белков на уровне кодирующих их генов проводили с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием вышеописанной урацил-репарационной системы. При этом эксперимент планировали так, чтобы получить одиночные, множественные и сканирующие

Porcine-a IFN

30 • • >35 • .40 • .45 • 50 • . .

LDHRRDFGSPHEAFCGNQVQKAQAM З'ААССТССТСТСТССАСТСАААССТАСАССССТАСТССССАААССССССТГССТССАССТПТСССАСТТСССТАСб'

Human- <X?-/FH

30 35 <0 <5 50

L К О R Н О F G F Р О Г Е F С N О Г О К А С Т I ЗААСТТССТСТСТСТАСКАААССГАААССССТСС7ССГСААА---СССТГССГСААССПГТСССАСГТТССГАС5

R'S /rggrcCAGGrrnCCGA 5'

Rii CCrC444CCCCCCTTCGTCCAG 5' R<2 GTCCTCCCGkkKQCCQQCTlQ 5' R'O CCgCMCTCCGGAAACC 5'

fiJS ¿¿r.WAGGGGTACTCC 5'

TCtMCClbCAGCCGfC У L3S

тстасCACTCAAACCT 5' u<

ACCAACCTCGTGTCTG 5' L3I32

30 31 32 33 34 35 36 37 38 38 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 60 51 52 53 54

7. ._.. _

4. _i .■... _

3. --

2. -<=>--

Рис.5. Схема получения мутантных форм гена (Х2-интерферона человека и структуры использованных синтетических олигодезоксирибонуклеотидов.

мутации относительно инвариантного в СС-интерферонах остатка Р-39. Источником получения гена 0.2-интерферона человека и экспрессионным вектором для получения мутантных форм 02-интерферона являлась плаэмида р74, любезно предоставленная Народицкой В.А. (ГосНИИгенетика), а основные генно-инженерные манипуляции осуществляли по руководству Маниа-тиса с соавт. ( Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984).

Конструкции мутантов (рис.5) предусматривали постепенное (от мутанта к мутанту) замещение а.о. ИФН-(Х2 человека на соответствующие а.о. ИФН-СС свиньи, а также варианты с единичными и множественными заменами. Для интенсификации процесса получения мутантных форм была выработана схема (рис.6), сочетающая применение последовательных и параллельных мутагенеэов и обеспечившая получение 15 различных мутантных аллелей гена интерферона в кратчайшие сроки. Структуры использованных при проведении сайт-направленного мутагенеза олигодезоксирибонуклеоти-дов приведены на рис.5.

Рис.6. Общая схема проведения мутагенеза при получении мутантных форм гена (Х2-интерферона человека.

11.4.1. Разработка метода многоточечного мутагенеза с использованием адресованного фрагментирования одноцепочечной ДНК. Получение гибридного гена интерферонов-(Х человека и свиньи.

Одним из элементов изучения структурно-функциональных отношений в гомологичных белках, в частности, в интерферонах, является исследование свойств гибридных молекул, состоящих из отдельных частей интересующих белков. Стандартные генно-инженерные методы получения гибридов предполагают использование сайтов эндонуклеаэ рестрикции для конструи-

рования рекомбинантных молекул. В этом случае расположение сайтов заранее предопределяет структуру получаемого гибрида, не всегда совпадающую с поставленной исследователем задачей. В отсутствие удобных рест-рикционных сайтов гибридная рекомбинантная технология к моменту выполнения данного исследования представляла сложную генно-инженерную задачу.

Получение гибридного интерферона человека и свиньи, в котором изучаемая область 30-50 а.о. интерферона-СС2 человека была бы полностью заменена на гомологичную область интерферона-(Х свиньи (мутант 15, рис.5,6), поставило перед нами задачу разработки нового метода получения гибридов с заданными границами. Эта задача была решена методом многоточечного мутагенеза (рис.7) с использованием адресованного фраг-ментирования одноцепочечной ДНК (рис.8).

Рис.7. Схема проведения многоточечного мутагенеза. А и В - гены гомологичных белков, Е5 и Е2 - эндонуклеазы рестрикции.

3

3' 91Ьр 5' annealing

mutagenesis

ю у^го

Ncol-20 3 TGCTCTCCGTACCGAACTCG

Hmfl-20 3 TTCCTCTCTAACACGAGTAC

MI3tg!31-pinf

Ncol-20 3 TCCTCTCGCTACCCAACTCG

Fokl-34 5'AGCATCCCTC -s CACACCCAAACTCCTCGT/GCCAC J

M13tgl31-pmf

Рис.8.Схема адресованного фрагментирования одноцепочечной ДНК.

Возможности адресованного фрагментирования были продемонстрированы на примере рестриктаз N00!, н1пГ1, Гок1, выбор которых обусловлен тем.

что фермент Ncol имеет один сайт узнавания в исследуемой ДНК, в то время, как для Hinfl, их насчитывается более 30. Применеиие рестрикта-зы FokI ставило целью ввести разрыв в любую, заранее запланированную, последовательность однонитевой ДНК.

На рис.8 представлена схема фрагментирования. 20-звенные олигонук-леотидные праймеры (HinfI-20 и NcoI-20), содержащие сайты узнавания соответствующих рестриктаз,гибридиэовали с одноцепочечной ДНК фага М1э£д131, включающей ген интерферона-CL свиньи. Последующая обработка комплексов олигонуклеотидов с ДНК ферментами Hinfl и Ncol позволила выщепить полинуклеотидный фрагмент (91 п.н.), содержащий последовательность, кодирующую 24-54 а.о. интерферона-d свиньи. После выделения одноцепочечный фрагмент использовали в качестве праймера в многоточечном мутагенезе гена интерферона-(Х2 человека, клонированного в составе фага M13tgl30. Определение нуклеотидной последовательности фаговых ДНК, выделенных из отобранных клонов, подтвердило наличие области ко-донов 24-54 а.о. гена интерферона-СС свиньи в составе гена интерферо-на-(Х2 человека. Гибридный ген клонировали в составе экспрессионного вектора.

Подход адресованного фрагментирования получил дальнейшее развитие при использовании рестриктазы FokI и может представлять метод конструирования гибридных молекул в отсутствие сайтов рестрикции. FokI является эндонуклеазой IIS класса. Ферменты данного типа (BspMI, Mboll, FokI) характеризуются тем, что расщепляют ДНК на определенном расстоянии от сайта узнавания, оставляя сайт узнавания интактным. Применение специально сконструированного адаптора с дуплексным сайтом узнавания FokI и однонитевым адресом на интересующей ДНК дает возможность гидро-лизовать последовательность ДНК в строго определенном, с точностью до нуклеотида, месте (Szybalski W. et al. , 1985). Синтезированный 34-звенный олигонуклеотид, удовлетворяющий этим требованиям, использован нами для введения разрыва в область 7-го а.о. гена интерферона-tt свиньи (рис.8), не содержащую специфических последовательностей каких-либо рестриктаз. Совместное использование NcoI-20 и FokI-34 прай-меров позволило выщепить 142 нуклеотидный фрагмент гена интерферона-СХ свиньи.

Разработанный нами метод многоточечного мутагенеза с использованием адресованного фрагментирования одноцепочечной ДНК может успешно применяться при получении практически любых гибридов гомологичных белков. Процедура является более простой, быстро выполнимой и удобной по сравнению с последовательным многоступенчатым мутагенезом и не требует синтеза протяженных олигонуклеотидов.

Использование двух адапторов с сайтом узнавания рестриктазы FokI и различными адресами, соответствующими граничным точкам требуемых гибридов, значительно расширяет возможности конструирования гибридных молекул в отсутствие рестрикционных сайтов.

II.5. Исследование антивирусной активности мутантных форм (Х2-ин-

терферона человека.

Мутантные белки выделяли с помощью иммуноаффинной хроматографии (Sepharose-HllF6, лаборатория иммунологии ГосНИИгенетика и Sepharo-se-5A6, ВНИИОЧБ, С.Петербург) и подвергали тестированию на противовирусную активность, которую определяли по подавлению цитопатического действия индикаторного вируса везикулярного стоматита (штамм Индиана) на клетки карциномы легких человека (А-549), а также на линии эмбриональных почечных клеток свиньи (СПЭВ). Референс-препаратом служил лей коцитарный ИФН человека (НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН России). Активность проб приведена в международных единицах (ME). Определение активности мутантных форм интерферона проводили в лаборатории иммунологии ГосНИИ генетика (зав. лабораторией к.м.н. Юрин В.Л.). Результаты тестирована приведены в таблице 1.

Рассмотрение удельных противовирусных активностей сканирующих мутантов (1,5,6,8,9,10,11,12,15), представленных в табл.1а, позволило определить, что правая часть исследуемого района, включающая участок 42-50, по-видимому, не имеет функциональной значимости, т.к. замены в этой области ( мутанты 8,9), проведенные в нашей работе, а также заме ны F-48-S и Q-49-H (Stewart A.G. et al., 1987) не приводили к существенным изменениям в активности белка. При замещении 42 и 40 а.о. происходило незначительное понижение активности, которое сопровождается резким ее падением (более 500 раз) при замене остатка фенилаланина в положении 38. Аналогичное резкое падение активности при замещении 38 а.о. в мутантах с изменением левой части исследуемого района указывав' на определяющий характер замены F-38-S. Однако, неодинаковый уровень падения активности мутантов б (31,32,34,38) относительно 5 (31,31,34) и 12 (38,40,42,44,48) относительно 11 (40,42, 44,48) свидетельствуют об участии аминокислот, окружающих остаток F-3S, в формировании актив ной формы интерферона.

В этой связи интересно дополнительно рассмотреть мутанты с единичными и множественными заменами, данные биологического тестирования которых представлены в табл.16. Из таблицы видно, что замена F-38-S сам; по себе дает понижение активности в сто раз (данные по мутантам 3 и 1< с единичной и отнесенной заменой 38 а.о.). Т.к. мутанты 7 (34,38,40, 42) и 12 (38,40, 42,44,48), охватывающие изменения в центральной части, отличаются дополнительным понижением активности, это указывает, что наиболее существенную роль играет участок, включающий 34-42 а.о.

Замены в левой 31-34 части района характеризовались некоторым понижением активности белка при замещении 31 и 32 аминокислот, которая восстанавливалась при введении замены в 34 положении. Неаддитивность эффекта замен в случае мутантов 1, 5 и 2 свидетельствовала о небходи-мости привлечения альтернативных методов анализа изучаемого участка.

Таблица 1. Специфическая антивирусная активность СС2-интерферона человека и его мутантных форм.

I-1-1-1

I N0 ¡Аминокислотная (специфическая антивирус- | |мутан-| I ная активность, % \

I та I замена |-1-1

I | I А-549 | СПЭВ |

I_I_I_I_I

а). Сканирующие мутации

1 1 IhuifnccI 1 100 1 100 I

1 1 1 31,32 | 20 20 1

1 5 | 31,32,34 | 80 80 |

1 6 1 31,32,34,38 | 2 2 1

1 12 | 38,40,42,44,481 0,6 0,5 1

1 и 1 40,42,44,48 | 40 26 |

1 10 I 42,44,48 | 40 26 |

1 9 | 44,48 | 150 88 |

1 8 | 48 | 100 100 I

1 15 | I 1 23-54 | | 1 1 | I

б). Одиночные и множественные мутации

1 1 1 2 | 1 34 | 32 30 I

1 з I 38 | 1 1 1

1 4 1 34,38 1 1 0,5 |

1 7 | 34,38,40,42 | 0,1 0,2 |

1 13 | 38,40,44,48 | 4 4 1

1 14 | I 1 38,44,48 | 1 1 0,7 | I

За 100% принята удельная противовирусная активность рекомбинант-ного ИФН-С12 человека, составлявшая в экспериментах 3,8х107 МЕ/мг.

Предположение о том, что анализируемая область является неструктурированной и расположена на поверхности белковой глобулы, определило использование структурного анализа экспонированности аминокислот (Водег Э., 1988) - метода, позволяющего оценить локальные изменения в структуре исследуемого фрагмента при внесении мутаций, используя алгоритм расчета вероятности экспонированности а.о., были построены профили исследуемого участка с изменениями в аминокислотной последовательности. Расчетные профили экспонированности аминокислот в мутантах 1 (31, 32) и 2 (34) показывали существенное изменение (уменьшение и увеличение) в экспонированности кластера заряженных аминокислот 31-34 относительно других а.о. района; при последующем замещении 34 а.о. в профиле

мутанта 5 (31,32,34) происходило возвращение к исходному профилю экс-понированности, характерному для ИФН-С12, и этот белок приближался по своей специфической активности к ИФН-С12 (табл.1а). Аналогично, мутант] 8 и 9, при отсутствии существенных изменений по сравнению с ИФН-СС2 в профиле экспонированности а.о. в исследуемом районе,, имели противовирусную активность, сходную с ИФН-СС2 (табл.1а).

Рассмотрение профилей всех анализируемых мутантных интерферонов показало, что белки, имеющие профили, малоотличающиеся от ИФН-СС2 (5,8,9), характеризовались приближающимся к нему уровнем противовирусной активности. Мутанты, сохраняющие общую структуру профиля ИФН-Ot; (1,2,10,11), однако, имеющие в значительной степени измененное соотно шение экспонированности кластера заряженных аминокислот (31-34) относительно участка 34-42, отличались небольшим понижением противовирусной активности (30-40%). Мутанты с изменением профиля в области предполагаемого изгиба полипептидной цепи (3,4,6,7,12-15) отличались пони жением активности в сто и более раз.

Анализ профилей экспонированности а.о. в мутантных белках показывает, что при внесении изменения в исследуемую область происходящее изменение экспонированности двух соседних участков (31-34 и 34-42) приводит к изменению противовирусной активности, что определяет участие не только участка 34-42, но и 31-34 в формировании активного сайт. ИФН-И2, определяющего противовирусную активность на клетках человека. Наибольший вклад в изменение активности вносит замена F-38-S. Следует отметить, что подобные замены остатка фенилаланина, проведенные в а-интерферонах человека (F-48 и F-124, Nisbet О.Т. et al. , 1985; Beil harz M.W. et al., 1989), существенно не сказывались на противовирусно! активности интерферона по отношению к клеткам человека. Этот факт подтверждает, что в данном случае замена введена в функционально значимую область белковой структуру, определяющую ярстипсйнрусную активность ИФН-СС2 человека. Выявленная нами корреляция структурных изменений участка и противовирусной активности мутантных форм позволяет предположить, что антивирусный сайт является конформационным.

II.б. Локализация элемента антивирусного сайта интерферона-(Х2 человека с помощью моноклональных антител.

В вышепредставленном материале показано, что фрагмент 31-42 а.о. участвует в образовании антивирусного сайта белка. В связи с этим возникает вопрос, принимает ли он участие в непосредственных взаимодействиях с рецептором клетки. Как было указано выше, клеточные рецепторы интерферона представляют собой белковые молекулы, поэтому одной из предполагаемых моделей системы интерферон-рецептор нами была избрана система белкового взаимодействия моноклональное антитело - интерферон.

Для исследования были использованы моноклональные антитела (МкАТ), характеризующиеся нейтрализующим действием по отношению к противови-

русной активности интерферона (ЬВР5А6, ВНИИОЧБ г.С.Петербург и ЫК-2, СеИТесЬ, Великобритания), а также не обладающие такими свойствами (Н11Гб, ГосНИИгенетика, Москва и ЬВРАЗ, ВНИИОЧБ, г.С-Петербург).

Ингибирование противовирусной активности интерферона может быть обусловлено либо взаимодействием с рецептор-связывающим доменом белка, либо его экранированием. В случае идентичности рецептор-связывающего сайта и антигенного сайта для нейтрализующего моноклонального антитела вносимые изменения в предполагаемый сайт связывания с рецептором должны оказывать влияние на аффинность лиганда по отношению к данному антителу.

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили в следующей постановке: МкАТ-ИФН-ПА#ПХ(поликлональные антитела на ОС-интерферон, конъюгирован-ные с пероксидазой хрена).

Такая постановка эксперимента была обусловлена выбором наиболее щадящих условий для исследуемых мутантных форм интерферона, т.к. в литературе имеется множество данных, свидетельствующих о существенных стерических затруднениях, возникающих при прямой иммобилизации белков-антигенов на поверхности лунок пластиковых планшетов. Параметр аффинности вычисляли на основе кривой титрования иммобилизованных на планшете МкАТ повышающимся количеством интерферона.

Полученные в ходе исследования результаты приведены в таблице 2.

Анализ результатов связывания МкАТ с мутантными формами ОМФН позволяет разделить МкАТ на группы. МкАТ ЬВР5Аб и МК-2 характеризуются высокой аффинностью к ИФН. Для ЬВР5А6 и МК-2 данные достаточно хорошо коррелируют друг с другом, что позволяет предположить для них идентичность антигенных сайтов в молекуле ИФН. Введенные мутации в ряде случаев (мутанты 12 и 14) понижают связывание на 2 порядка по сравнению с рекомбинантным ИФН-СС2 человека, что может указывать на наличие одного из сайтов связывания МкАТ в изучаемой области. Сопоставление данных, полученных для каждой мутантной формы интерферона, дает возможность оценить роль конкретных а.о. в связывании с МкАТ. Для 5А6 и ГЖ-2 такими положениями, на наш взгляд, являются 11-34-11, Г-38-Б, (2-40-Н и Е-42-А, причем их вклад в это взаимодействие аддитивен (мутанты б, 7,12,14). Эти замены вносят принципиальные изменения в свойства фрагмента, так как приводят либо к уменьшению гидрофобности (остаток 38), либо к увеличению положительного заряда (остатки 34,42). Существенную роль играет замена 38 аминокислоты (Р->Б), т.к. нехарактерное для гидрофобных остатков расположение на поверхности белковой глобулы может предполагать их участие в формировании биологических функций молекулы. Эти результаты также подтверждают предположение об экспонированности данного фрагмента на поверхности глобулы белка.

Связывание всех мутантных форм и исходного ИФН-СС2 с Н11Г6 и ЬВРАЗ сохраняется примерно на одном уровне (табл.2), что свидетельствует о расположении антигенной детерминанты для этих МкАТ в иной структурной

Таблица 2. Влияние аминокислотных замен в области 30-50 аминокислотных остатков на связывание мутантных форм (Х2-ИФН человека с мо-ноклональными антителами.

1 | N0 I мутанта Аминокислотные замены Связывание с МкАТ, % к человека* 1 аг-иФн |

1 1.ВР5А6 | 1 ЫК-2 1 1 Н11Г6 1 1 ЬВРАЗ |

I а2-ИФН - 1 100 | 100 1 1 100 100 |

I 1 31,32 100 | 100 1 100 100 |

1 2 34 40 | 30 1 85 100 |

1 з 38 10 | 30 1 90 90 |

1 4 34,38 60 | 40 1 95 95 |

1 5 31,32,34 100 | 100 1 100 90 |

1 6 31,32,34,38 8 1 20 1 95 95 |

| 7 34,38,40,42 2 1 7 1 80 100 |

1 8 48 100 | 100 1 100 100 |

1 9 44,48 100 | 100 1 100 100 |

1 ю 42,44,48 30 | 40 1 100 100 |

1 11 40,42,44,48 90 | 100 1 100 90 |

1 12 38,40,42,44,48 0.2'| 2 1 90 100 |

1 13 38,44,48 15 | 30 1 - 100 100 |

1 14 38,40,44,48 0.5 | 4 1 100 95 |

1 15 | 30-50 10 | ........ 1 20 1 85 | 95 | 1

(*) - Абсолютные значения параметра аффинности для ИФН-СХ2 человека составляют 1.6х109, 1.5х109, 6.1x10е и 9.0x10® (1/М) для ЬВР5А6, ЫК-2, Н11Г6 и ЬВРАЗ, соответственно.

области и о сохранении нативной конформации молекулы при введении мутаций. Следовательно, замены находятся вне структурированных элементов, поддерживающих нативную конформацию молекулы, а в выпетленной и экспонированной области, так как в ином случае проведенные замены могли привести к нарушению третичной структуры. Это также подтверждают экспериментальные данные для мутантов, имеющих дополнительную аминокислоту в 44 положении (мутанты 9-15) и, тем не менее, имеющие уровень связывания, сопоставимый с исходным ИФН-0£2.

Таким образом, на основании полученных результатов и анализа литературных данных можно сделать следующие выводы: фрагмент 30-50 а.о. аИФН, действительно, не входит в состав спирализованных участков, а экспонирован на поверхности глобулы и принимает участие в белок-белковых взаимодействиях, что показано на примере взаимодействия белок-

МкАТ. Кроме того, эта область может иметь О-подобную структуру и играть важную роль в биологическом функционировании белка, безусловно, включая и участие в проявлении иммунного ответа.

11.7. Сравнение результатов тестирования антивирусной активности мутантных форм 0С2-интерферона человека и исследования с использованием моноклональных антител.

Как показано выше, введение мутаций в состав полипептидной цепи интерферона (30-50 а.о.) приводило как к изменению антивирусной активности белка, так и к изменению в связывании с нейтрализующими эту активность моноклональными антителами. Достаточно большой интерес представляло сравнение этих параметров, которые сведены в рис.9-10 (а,б).

\дАЧ

Рис.9. Специфическая антивирусная активность мутантных форм а2-ин-терферона человека. Номера мутантов указаны цифрами (см. рис.5). Стрелками обозначены направления сканирующих мутаций.

Анализ этих данных показывает полную корреляцию между изменениями в связывающей способности нейтрализующих антивирусную активность мо-ноклональных антител (рис.10) и антивирусной активностью мутантных форм интерферона (рис.9). Вместе с тем, моноклональные антитела, не обладающие нейтрализующим действием, практически не реагировали на вносимые мутации (рис.10). Для исключения возможности появления арте-фактных результатов, связанных со способом выделения (тип аффинного

1аК>М

Рис.10 (а,Ь). Взаимодействие мутантных форм С£2-интерферона человека с нейтрализующими (N(<-2, 1,ВР5Аб) и ненейтрализующими (Н11Г6, ЬВРАЗ) антивирусную активность белка моноклональными антителами. Номера мутантов указаны цифрами (см.рис.5). Стрелками обозначены направления сканирующих мутаций.

сорбента), были проведены дополнительные эксперименты, направленные на перекрестный анализ мутантных форм интерферонов, выделенных на БерЬа-гоэе-ННЕб и БерЬагоБе-5А6. Совпадение полученных данных позволило сделать вывод о том, что участок 30-50 а.о. интерферона действительно

является эпитопом для моноклоналыюго антитела NK-2 и не является таковым для H11F6. Более того, полученный набор мутантных форм интерферона может служить достаточно хорошей тест-системой при определении эпитопной характеристики интерферона.

Как отмечалось выше, мы предполагали, что участок 30-50 а. о. интерферона не вовлечен в образование tt-спирализованных участков. Это предположение полностью подтверждается полученными данными. Действительно, если бы вносимые на достаточно протяженном участке полипептидной цепи изменения вызывали существенные возмущения в третичной структуре белка, это привело бы к деградации полипептидной цепи протеазами E.coli в условиях гетерологичной экспрессии.

Полученные экспериментальные данные позволили утверждать, что исследуемый участок, действительно, представляет собой неструктурированный петлевой фрагмент, а также предложить модель третичной структуры этого фрагмента полипептидной цепи.

XI.8. Описание предполагаемой нодели структуры исследуемого участка (Х2-интерферона человека.

Совокупность экспериментальных и расчетных данных дает основание предложить модель структуры изучаемого фрагмента. Выявленный функционально-значимый участок 34-42 окружен кластерами противоположно заряженных аминокислот. Такой участок может образовывать белковую петлю Q-подобной конформации, в которой аминокислотные остатки 35-40 расположены на поверхности глобулы, а формирование и стабилизация всей структуры в основании обеспечивается электростатическим взаимодействием двух кластеров противоположно заряженных аминокислот: 33-34 ( R,H) и 41-42 (Е,Е), взаимное расположение которых дополнительно закрепляется наличием строго инвариантного в ОС-интерферонах Р-39, определяющего изгиб петли.

На основании предполагаемой структуры участка ИФН-Й2 человека построена его трехмерная модель (рис.11).

Рассмотрение хода полипептидной цепи показывает, что пептид действительно может формировать Q-подобную петлю, о основании которой находятся заряженные а.о., обеспечивающие прочное электростатическое закрепление структуры. Вся структура с N-конца дополнительно закреплена дисульфидной связью (29-138). Расположение двух остатков фенилала-нина (F-36, F-38) на поверхности петли, вероятно, несет функциональную нагрузку, т.к. эти а.о. могут осуществлять гидрофобное взаимодействие с белком-рецептором. Такое взаимодействие может давать выигрыш в свободной энергии до 2,5 ккал/моль на остаток фенилаланина и во многом определять константу связывания интерферона с белком-рецептором, составляющую 10"9 - 10" мМ. В целом, обращает на себя внимание компланарность модельной структуры, что предполагает возможность внедрения данного фрагмента в гидрофобный карман белка-рецептора. Надо отметить.

Рис.11. Модель третичной структуры участка 30-50 Й2-интерферона

(1), пальмитиновой кислоты (2).

что по литературным данным (Danin 0. et ah, 1990) такое явление распространено в комплексах антиген-антитело. При этом в осуществлении контактов часто принимают участие а.о., несущие ароматические боковые радикалы (Oanin 3. et al., 1990; Padlan E.A. et al., 1990; Mian S. et al., 1991). Между остатками фенилаланина у ИФН расположен глицин, облегчающий конформационную подстройку фенилаланинов при осуществлении белок-белковых взаимодействий.

В рамках предложенной модели стало возможным объяснение экспериментальных данных, полученных как в настоящей работе, так и рядом других исследователей. Становится понятным повышение биологической активности при введении глицина в 44 положение (табл.1, мутант 9). Как известно, малнчи2 глицина, лишенного боковых радикалов, может увеличивать подвижность полипептидной цепи. В данном случае возникает дополнительная возможность конформационных переходов участка в целом, что приводит к меньшим энергетическим затратам при осуществлении взаимной подстройки интерферона и рецептора. В рамках предложенной модели становится понятной и функциональная значимость дисульфидной связи 29 -138, стабилизирующей структуру петли. Известно, что разрушение именно 29-138, но не 1-98 дисульфидной связи, приводит к потере противовирусной активности белка.

Наблюдаемое в настоящей работе незначительное уменьшение противовирусной активности при введении замен в консервативный кластер заряженных аминокислот может быть объяснено тем, что предусмотренные замены 31-32 а.о. приводили к изменению стабильности между взаимодействующими заряженными аминокислотами в основании петли, что дестабилизировало общую конформацию участка. Введение последующей компенсирующей замены в 34 положении (мутанты 1, 5) восстанавливало как структуру

участка, так и функцию белка. Следует отметить, что элиминирование заряда на данном участке полипептидной цепи (А-30,32,33), по литературным данным, приводило к полной потере активности белка, что подтверждает функционально-важную роль этого консервативного кластера.

Консервативная, с точки зрения заряда, замена Я-ЗЗ-К, описанная в литературе, указывает на необходимость точного соответствия размеров боковых радикалов аминокислот для стабильности структуры. Анализируя кластер отрицательно заряженных а.о. (41-42) с точки зрения участия в стабилизации петли, можно отметить, что замена Е-42-А, устраняющая отрицательный заряд, приводила к понижению активности в мутанте 10, в то время как последующая замена 0-40-Н ( мутант 11), не затрагивающая остатки отрицательно заряженных аминокислот, не сказывалась на противовирусной активности белка. Интересным фактом является некоторое увеличение активности 13 (38,40,42,44,48) мутанта по сравнением с 12 (38,40,44 48), которое может быть объяснено присутствием аспарагиново-го а.о. в 42 позиции. Противоположная замена А-42-Е, описанная в литературе, также приводила к увеличению противовирусной и рецептор-связы-вающей активности белка на клетках человека, что подчеркивало необходимость заряда в основании петли.

В рамках предложенной модели становится понятным не столь значительное изменение активности при заменах в области кластера заряженных а.о. 31-34 и 41-42, выявленное нами, а также показанное в ряде работ по изучению структуры и функции в интерферонах. Как видно из модели, эти а.о. играют стабилизирующую, но не определяющую роль в формировании антивирусного сайта белка. Закономерным представляется наиболее существенное понижение противовирусной активности белка при замене Г-Зв-Э (табл.1, мутанты 3,4,6,7,12, 13,14,15), т.к. эта позиция, как видно из рис.11, может определять эффективность взаимодействия интерферона и клеточного рецептора.

11.9. Анализ видоспецифичности (Х2-интерферона человека.

Как было отмечено выше, из всех проведенных в области антивирусного сайта замен наиболее критичной была замена Г-38-Б. Следует отметить, что Г-36 и Г-38 являются высоко консервативными позициями почти у всех интерферонов-(Х человека (рис.2). Для Г-38 имеется несколько синонимических замен (Г-38-Ь,I). Серин в 38 положении встречается только в одном случае из всех известных в настоящее время интерферонов-а -ингерфероне-а свиньи.

На основании данных о роли участка 34-42 в формировании антивирусного сайта интерферона и с учетом определяющей роли замены Г-38-3 в подавлении функциональной активности белка, можно предположить, что низкая активность свиного интерферона может быть обусловлена наличием остатка серина в положении 38 и, соответственно, менее аффинным, по сравнению с интерфероном-(Х2, взаимодействием с рецептором клеток

А-549. Экспериментальные данные, демонстрирующие снижение в 100 и более раз противовирусной активности мутантных интерферонов, включающих Б-38, согласуются с литературными данными по активности свиного интерферона на линии клеток А-549, составляющей IX от соответствующей активности ИФН-02 человека (Р1аэеск1 Е. et а!., 1988). .

Представленные данные подтверждают, что фрагмент 31-42а.о. ИФН-(Х2 человека участвует в образовании сайта, необходимого для проявления антивирусных свойств ИФН на линии клеток человека А-549, и определяет видоспецифичность данного подвида интерферона. Идентичность в изменении противовирусной активности мутантных форм интерферона на свиной (СПЭВ) и человеческой (А-54 9) линиях клеток (табл.1) свидетельствует об однотипном характере взаимодействия фрагмента 31-42 а.о. ИФН-СС2 человека с клетками А-549 и СПЭВ.

11.10. Проверка предполагаемых структурных особенностей исследуемого участка.

С целью проверки высказанных выше предположений о важности как отдельных, "ключевых" а.о., так и третичной структуры исследуемого участка, были поставлены дополнительные эксперименты. Действительно, если указанные а.о. несут структурирующую или функциональную нагрузку, то внесение несинонимических мутаций по данным аминокислотам должны были существенно сказаться на антивирусной активности белка в целом. Мутагенез проводили с использованием урацил-репарационной системы, а выделенные белки тестировали как на антивирусную активность, так и на связывание с моноклональными антителами. Результаты исследования приведены в таблице 3.

Таблица 3. Специфическая антивирусная активность мутантных форм интерферона-(Х2, несущих мутации по "ключевым" аминокислотным ос-

1 1 1 N0 | 1 Аминокислотная | Специфическая 1 активность(%) . |

1 мутанта | 1 Антивирусная Аффинность |

1 1

1 1 А-549 | 1 ЫК-2 Н11Е6 |

|Ни1ЕН-С12| 1 1 100 1 1 100 100 |

1 16 | Р- 39-1 1 15 1 20 100 |

1 19 | Е- 36-Б 1 0 05 | 5 100 |

1 IV | Е- 36-Б , Н-34-0 | 0 02 | >1 95 |

1 21 | Е- 36-Б , Е-38-3 | 0 02 | >1 95 |

1 20 | Е- Зв-Б , Ы-46-К | 4 1 2 100 |

1 18 | 1 1 Е- 36-Б Е-Зв-Б, Ы-46-К| 1 | 0 04 | 1 | >1 100 | |

За 100% принята удельная противовирусная активность рекомбинант-ного ИФН-С12 человека, составлявшая в экспериментах 3,8xlo' МЕ/мг. Абсолютные значения параметра аффинности ИФН-СС2 человека составляли 1.5 х109, 6.lxlO8 (1/М) для NK-2, H11F6, соответственно.

Из таблицы следует, что, действительно, замена P-39-I приводит к существенному падению антивирусной активности интерферона. Однако, решающими и практически уничтожающими антивирусный сайт интерферона являются замены F36 И F38, хотя следует отметить, что эти замены неравноценны. Исследования взаимодействия моноклональных антител с мутапт-ными формами интерферона еще раз подчеркивают, что данный эпитоп является конформационным и нарушение общей третичной структуры данного фрагмента полипептидной цепи приводит к практически полной отмене связывания МкАТ с мутантным ИФН.

Выводы.

Т.о., проведенное в работе структурно-функциональное исследование области 30-50 а.о. ИФН-СС2 человека с использованием подхода сканирующих мутантов позволило локализовать участок аминокислотной последовательности 31-42, ответственный за противовирусную функцию белка на клетках человека (А-549) и свиньи (СПЭВ). Данный фрагмент интерферона, по всей вероятности, участвует в непосредственных взаимодействиях с рецепторами клеток А-549 и СПЭВ, а также определяет видоспецифичность данного подтипа интерферона. Предложенная пространственная модель структуры исследуемого участка позволяет объяснить ряд экспериментальных и литературных данных по изучению структурно-функциональных отношений в интерферонах. Появившиеся позже в литературе данные во многом подтверждают сделанные нами выводы. Действительно, в работе (Senda Т.et al., 1990) получены рентгеноструктурные данные для рекомбинантно-го ß-интерферона мыши, где, в частности, фрагмент 30-40 а.о. отнесен к потенциально важным для связывания с рецепторами клеток человека и проявлении интерфероном биологической активности. Кроме того, в этом районе обнаружена структура, аналогичная предложенной нами Q-подобной петле. В работах, направленных на изучение интерферонов с использованием сайт-направленного мутагенеза ( Waine G.3. et al., 1992), также подтверждена определяющая роль F36, L30 и R33 при связывании интерферона с клеточными рецепторами. Аналогичное утверждение приводится в работе (Fish E.N. et al., 1995, Uze G. et al.,1994), где отмечается важность участка 29-35 в проявлении биологической активности Я2-интер-фероном человека. Достаточно убедительные подтверждения полученным нами результатам изложены также в ряде обзорных работ, посвященным структурно-функциональным отношениям в интерферонах ( Mitsui Y. et al., 1995; Kontsek Р. et al., 1994 ).

III. ИССЛЕДОВАНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ СТАДИЙ ПРОВЕДЕНИЯ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО

МУТАГЕНЕЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УРАЦИЛ-РЕПАРАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ.

Как отмечалось во введении в автореферат, для проведения сайт-направленной реконструкции ДНК нами был избран достаточно эффективный и простой в исполнении метод, предложенный Т.Кункелем (Kunkel Т.А. et al., 1984). Характеристика этого метода приведена выше (II. 3.1). Разнообразие проведенных реконструкций ДНК с применением этого метода дало возможность сделать ряд практически важных выводов, позволяющих оптимизировать как весь процесс внесения целевых изменений в состав ДНК, так и его отдельные стадии. Основные положения такого анализа приведены в публикациях автора. Поэтому в данном разделе будут кратко приведены только результаты исследований и внесенные модификации в метод Т.Кункеля.

III.1.Изучение особенностей и оптимизация процесса сайт-направленного мутагенеза с использованием урацил-репарационной системы.

Исследовали следующие стадии сайт-направленного мутагенеза с использованием урацил-репарационной системы:

- эффективность получения урацилсодержащей ДНК-матрицы, однородность фаговой популяции;

- выход мутантных форм ДНК в зависимости от термостабильности комплекса матрица-праймер;

- зависимость закрепления совокупности мутаций от структуры прай-мера;

- влияние качества препарата ДНК-матрицы на выход мутантных форм (явление эндогенной достройки).

Подробное исследование этих параметров при проведении 15 типов му-тагенезов в урацил-репарационной системе (табл.4) позволило сделать выводы о том, что:

- выход процесса коррелирует со стабильностью комплекса "матрица-праймер" . При использовании олигонуклеотидных праймеров со сгруппированными заменами выход мутагенеза находится в линейной зависимости от температуры плавления 5'-концевого фрагмента комплекса, 3'-концевая часть комплекса играет менее существенную роль. При использовании праймеров с многоточечными заменами следует учитывать дополнительный вклад центральной части комплекса в стабильность 5'-концевой части конструкции. В процессе проведенных исследований определено, что не только стабильность 5'-конца праймера, но и его фиксированное закрепление является определяющим фактором прецезионного введения целевых мутаций;

- при ферментативной достройке в условиях in vitro, наряду с целевыми, протекают процессы элонгации эндогенных праймеров, существенно понижающие эффективность введения мутации и определяющие стратегию поиска мутантов;

- характер зависимости выхода процесса от параметров синтеза ДНК в условиях in vitro указывает на то, что именно ферментативная стадия является определяющей при проведении мутагенеза в урацил-репарационной системе. Это может иметь место в том случае, когда последующая стадия в условиях in vivo протекает с постоянным выходом. Выявленная в работе однородность популяции в составе фаговой бляшки свидетельствует о полном ^разрушении "плюс" цепи гетеродуплекса. Следовательно, можно утверждать, что селекционный аппарат системы осуществляет полное элиминирование исходного генотипа в общем пуле продуктов реакции ферментативной достройки in vitro, что приводит к близкому к количественному выходу мутантных форм ДНК на стадии мутагенеза в условиях in vivo. Таблица 4. Условия проведения мутагенеэов в урацил-репарационной системе при получении мутантных форм гена ИФН.

Номер Структура олиго- Условия отжига Расчетна Т пл/ Я С Выход TOB, мутан-

мутагенеза мутанта плексе "матрица -праймер" 3 '->5 ' секве- ниро- влние

ПК 5 1 К ЦК З'К гибридизация

1 1 -^___^- А 38 20 _ 18 7 _

6 4 6

2 2 -.—.- Б 46 28 - 18 - 36

6 1 10

3 3 Б 48 24 - 24 - 17

9 17

4 15 А - - - - - 3

5 8 -- Б 50 32 - 18 - 50

6 1 11

6 4 -^- Б 48 24 - 24 - 18

9 1 7

' 7 5 А 38 20 - 18 - -

6 4 6

8 9 ---- Б 60 40 - 20 - 86

7 3 12

9 6 ------ А 38 20 - 18 - -

6 4 6

10 7 -ч^-•--- Б 46 14 14 18 - -

5 14 2 5

11 10 -- А 62 38 - 24 - 70

7 2 12

12 11 -—-- А 46 14 14 18 3 -

5 14 2 5

13 13 --—--^- А 52 14 24 14 20 -

5 16 14

13 14 ---.---- А 52 14 24 14 - 7

5 16 14

14 12 -v- А 48 14 - 34 - -

10 2 5 1 1

Примечание: ПК - полный комплекс олигонуклеотида с матрицей, 5'К и З'К - концевые фрагменты, ЦК - центральная часть комплекса. Режимы отжига: А - понижение Т° от 70°С до 30°С, время -1,5часа, Б - Т°С-55°С, время -1час. Прочерк - выход мутантных форм не определяли.

Изучение особенностей сайт-направленного мутагенеза в урацилрепа-рационной системе, выявляющее влияние отдельных факторов на выход процесса, дает возможность правильно планировать процедуру мутагенеза, прогнозировать выход мутаций и, по возможности, проводить ее в оптимальном режиме.

Основные рекомендации по успешному проведению мутагенеза с применением урацил-репарационной селекции состоят в следующем:

- использование предложенной модификации методики получения ура-цилсодержащей ДНК-матрицы позволяет избежать многократных циклов выращивания фагов;

- выбор конструкции праймера предполагает использование олигонук-леотидов с температурами плавления их 5'-и 3'-концевых комплексов с ДНК-матрицей, составляющих не ниже 38-40°С и 18-22°С, соответственно. При рассмотрении структуры олигонуклеотида особое внимание должно быть обращено на фиксированное закрепление его 5'-конца;

- требования к препарату используемой ДНК-матрицы заключается в том, что количество и состав примесей не должны превышать определенного уровня, приводящего к более чем 15-20& степени эндогенной достройки. Проведение контрольного эксперимента по определению степени эндогенной достройки позволяет выбрать стратегию поиска мутантных клонов;

- эффективно протекающая стадия мутагенеза in uitro ( при использовании олигонуклеотидов, образующих стабильные и строго фиксированные комплексы с ДНК), а также низкий уровень эндогенной достройки дают возможность исключить стадию гибридизационного скрининга мутантов, а также опустить стадию расчистки фаговых бляшек.

Выполнение перечисленных рекомендаций позволяет значительно упростить и ускорить проведение процедуры мутагенеза.

ИХ.2. ДыЛициинни-инимрцмиНный иутигоноа протяженных областей ДНК

с использованием урацил-репарационной системы.

К началу выполнения данной диссертационной работы проведение достаточно протяженных делеционно-инсерционных мутагенезов представляло определенную проблему, оптимизация решения которой являлась актуальной задачей.

III.2.1. Получение гена CCI-интерферона человека, кодирующего зрелый белок.

Экспрессия эукариотических генов в клетках прокариот предполагает реконструкцию ДНК, освобождающую ген от тех элементов, которые не требуются для экспрессии в клетках прокариот.

Реконструкция ДНК гена предшественника ИФН-СС1 человека (рис.12), заключающаяся в удалении последовательности лидерного пептида для получения гена зрелого белка, проводилась совместно с сотрудниками ИМБ АН Болгарии. Наличие дополнительной последовательности в составе ин-

терферона, синтезируемого в E.coli, где отсутствует система правильного процессинга белка, могло сказаться не только на биологической активности белка, но и его антигенности (Дебабов В.Г., 1986).

-10 +1 MLSCKSSCSLGCDLPETH AGCTTATGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTCTGGGCTGTGATCTCCCTGAGACCCAC f

Рис.12. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность N-конце-вой части пре-ИФН-CCl человека.

Многие гены интерферонов имеют сайт узнавания рестриктазы Sau3a, находящийся непосредственно за кодоном цистеина (первая аминокислота зрелого белка). Рестриктаэу Sau3a использовали для удаления лидерной последовательности интерферона-СС2 человека (Goeddel D.V., et al., 1980), однако, попытки болгарских коллег пойти подобным путем не увенчались успехом, т.к. данный сайт гена ИФН-0С1 этой рестриктазой не атаковался .

В связи с этим прецезионную стыковку промотора, последовательности SD, ATG-кодона и кодирующей последовательности белка проводили с помощью олигонуклеотид-направленного делеционного мутагенеза. Мутагенез проводили по схеме, представленной на рис.13.

EcoR BamHI /О Л Е coli

EcoRl/ \ BomHI

M13tgl30-iín1 EcoRI / \BamHl

M13tg130-¡fn1(U

М13(д'30-ИШ(11

Рис.13. Схема проведения делеционного мутагенеза при удалении ко-донов лидерной последовательности пре-ИФН-Я1 человека. I, - лидер-ная последовательность.

Делеционный мутагенез предъявляет более строгие требования к структуре олигонуклеотида, по сравнению с точечным мутагенезом. Как было указано ранее, эффективность стадии in vitro зависит от стабильности комплекса на 5'-конце праймера. При введении делеции олигонукле-отид используется для выпетливания удаляемой последовательности при

соединении участков, подлежащих стыковке. Поэтому в данном случае необходимы более протяженные его 5'- и 3'-части. Кроме того, на стабильность комплекса матрицы с праймером должна существенно влиять структура петли ДНК, образующаяся при отжиге. Устойчивый стебель в основании шпилечной структуры может обеспечить более эффективное, введение деле-ции.

Образование устойчивой шпилечной структуры (рис.13) при делетиро-вании 30 нуклеотидов гена преИФН-0С1 (расчет структуры проводился по программе "DNA-sun") позволило получить 20%-ный выход мутации (без использования селекционного отбора мутантов).

Фрагмент ДНК, содержащий ген зрелого интерферона, был переклонирован в составе ДНК исходной плазмиды (pIMB-5IFN) для последующей экспрессии в E.coli. Уровень экспрессии гена ИФН-СС1 в штамме-продуценте составил 2х107 МЕ/л.

III.2.2, Делеционно-ннсерциониый мутагенез в области регуляции

репликации плазмиды pBR322.

Работа по реконструкции области регуляции репликации плазмиды PBR322 проводилась совместно с сотрудниками лаборатории оптимизации экспрессии генов (зав.лабораторией д.б.н. Машко C.B.) и состояла в удалении фрагмента длиной 116 п.н. области промотора препраймерной РНК (PHKII) ColEl репликона при одновременном введении сайта узнавания рестриктазы BglII для создания на его основе мобильных генно-инженерных конструкций.

Оптимальным решением данной задачи являлось использование олиго-нуклеотид-направленного делеционно-инсерционного мутагенеза. Несмотря на то, что в предыдущем разделе было описано успешное проведение пре-цезионной делеции ДНК гена интерферона-CCI, получение интересующей де-лсции могло оказаться затрудненным из за налои эффективности делецион-ного процесса при удалении протяженной последовательности ДНК (Smith M., 1985). Кроме того, по данным предварительного анализа, выпетлива-ние одноцепочечного делетируемого фрагмента в комплексе "матрица-прай-мер" не формировало устойчивого стебля в основании шпилечной структуры. Это определило структурные особенности олигонуклеотида (протяженность фланкирующих областей), условия его отжига (постепенное понижение температуры от 70° до 30°С в течение 1,5 часов), а также использование эффективной системы проведения процесса (рис.14).

Чтобы оценить эффективность применения урацил-репарационной системы, мутагенез проводили в двух вариантах: с использованием урацил-репарационной селекции и без ее применения. Электрофоретический анализ продуктов на стадии ферментативной достройки показал, что при использовании урацилсодержащей ДНК и стандартной матрицы эффективность элонгации мутагенного праймера in vitro практически одинакова.

MiJiqlJi-CoiEi uOiqUI-Cdti uOlqÜi-CdClM

Рис.14. Схема проведения делеционно-инсерционного мутагенеза ColEl

»

репликона с применением урацил-репарационной системы.

Полученными на ферментативной стадии гетеродуплехсами трансформировали клетки штамма E.coli TG-1 (dut* ung* ). Выходы мутагенеэов, оцененные по данным гибридизационного скрининга, составили 5% и 0,15*, соответственно. Одинаковая эффективность протекания стадии ферментативной достройки при использовании урацилсодержащей и стандартной ДНКматрицы дает основание полагать, что именно применение урацил-репарационной селекции позволило с более чем в 30 раз повышенной эффективностью провести делеционно-инсерционную процедуру.

Следует отметить, что ферментативная стадия мутагенеза была проведена нами с помощью фрагмента Кленова, использование которого, по литературным данным (Su Ti-Zi et al.. 1988; Veukitaraman A.R., 1989), не представлялось возможным для удаления и введения протяженных фрагментов ДНК.

В данной работе мы показали, что фрагмент Кленова, несмотря на его меньшую, по сравнению с модифицированной ДНК-полимеразой Т7, 5' -3 1 по-лимеразную активность, может быть с успехом использован при проведении сложной реконструкции ДНК. Отрицательные результаты, приведенные в цитируемых работах, могут быть объяснены применением неоптимальных условий при проведении ферментативного синтеза ДНК. Правильный выбор температурного режима работы фермента, а также оптимизация конструкции олигонуклеотидного праймера дают возможность проводить процесс в эффективном режиме.

Выводы.

Делеционно-инсерционные мутагенеэы, описанные в разделах III.2.1. и III.2.2., дали возможность не только провести запланированные реконструкции ДНК, но и позволили продемонстрировать роль вторичной структуры петли ДНК в комплексе матрица-праймер. При проведении мутагенеза pBR322 впервые была проведена количественная оценка влияния урацил-репарационной селекции мутантных форм ДНК на выход в мутагенезе. Полученные данные являются дополнительным свидетельством целесообразности использования селектируемых систем при проведении сайт-направленной реконструкции ДНК.

II1.3. Получение белка с улучшенными фиэико-хикнчаскими и биологи-

ческями свойствами {$-8erl7-IFN).

Особый интерес в ряду интерферонов представляет фибробластный интерферон человека, свойства которого во многом аналогичны интерферо-нам-СС. Фибробластный интерферон может использоваться в качестве противовирусного препарата, для этого белка показано и противоопухолевое действие (Quesada J.R. et al., 1982). При лечении простудных заболеваний фибробластный интерферон дает более слабую кожную воспалительную реакцию по сравнению с интерфероном-Ct (Carter W.A. et al., 1979). Все это привлекает внимание к получению интерферона-)} как высокоэффективного терапевтического средства.

Получение индивидуальных интерферонов микробиологическим синтезом позволило получать рекомбинантные белки в препаративных количествах. Так, в частности, ИФН-(51, экспрессированный в E.coli в составе плазми-ды pPR-IFN|$ 1-13 (Машко С.В. с соавт., 1987), сконструированной в лаборатории оптимизации экспрессии генов (ГосНИИгенетика), проявлял противовирусную активность 2Х109 МЕ/л.

Из литературы известно, что рекомбинантные белки, полученные микробиологическим синтезом в бактериях, иногда имеют отличия от природных (Davis О.М. et al., 1987; Pestka S. et al., 1983). Эукариотические белки, полученные в E.coli, как правило, не гликозилированы, что может приводить к неправильному формированию третичной структуры при замыкании внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей. Несовершенная сборка белковой глобулы, обуславливающая появление малоактивного продукта, может происходить также вследствие использования денатурирующих агентов на стадии выделения белков из бактериальных клеточных экстрактов (Kimura S. et ai., 1988). Процесс образования неправильно замкнутых структур возможен при хранении готового препарата в отсутствие бел-ка-носителя. Поэтому одной из проблем получения рекомбинантных белков при микробиологическом синтезе является обеспечение формирования стабильной биологически активной третичной структуры.

Особую роль в формировании третичной структуры играет правильное замыкание дисульфидных связей. В молекуле интерферона-^ имеются три остатка цистеина - 17,31,141, которые могут участвовать во внутри- и межмолекулярных взаимодействиях. Аналогично дисульфидной связи 29-139/138 в интерферонах-а, дисульфидная связь 31-141 является важной и необходима для нормального функционирования белка (Shepard Н.М. et al., 1981).

Как было показано с помощью физико-химических методов, SH-rpynna остатка цистеина-17 остается свободной и может принимать участие в межмолекулярных взаимодействиях, приводящих к образованию олигомеров. Подтверждение негативной роли остатка цистеин-17 в стабильности реком-бинантного ИФН-Р получено при изучении изменения биологической активности мутантного (серин-17) фибробластного интерферона (Mark D.F. et al.. 1984). Было показано, что мутантный ИФН человека стабилен при

хранении без белка-носителя по крайней мере в течение одного года при +4°С, в то время как немутантный белок, хранившийся при -70°С, теряет свою активность в значительной степени уже через 75 дней.

Т.о., получение мутантного (серин-17) интерферона-ß человека представляло интерес в плане создания стабильного лекарственного препарата белковой природы, обладающего повышенной, по сравнению с реком-бинантным ИНФ-ß, удельной биологической активностью и всеми терапевтическими свойствами природного фибробластного интерферона человека.

Мутагенез проводили с использованием урацил-репарационной селекции. Мутантный ген ИФН-ß переклонировали в составе исходной плазмиды. Плазмида, несущая мутантный ген интерферона-ß, получила название pPR-INF-ß-Serl7. Штамм-продуцент мутантного фибробластного интерферона (ВКПМ В-3546) получали трансформацией штамма E.coli VL-902 (любезно предоставлен к.б.н. Лившицем В.А.) плазмидой pPR-IFN-ß-Serl7.

По данным биологического тестирования на линии клеток А-549 человека противовирусная активность мутантного (серин-17) интерферона-ß достигала при культивировании в колбах 4x10*0 МЕ/л, в то время как у исходного рекомбинантного белка она составляла 2х109 МЕ/л. Результаты электрофоретического разделения белков штаммов-продуцентов показаны на рис.15. Из представленных данных следует, что гены мутантного и исход-

1 23456789 10 _ р т а _ .. —

Iii

• -fcX—-т _ •

ÜE ~ —

Рис.15.Электрофорез в 12,5% SDS-ПААГ образцов ИФН-Р и ИФН-(5-Бег-17. 1,5,8 - смесь белков-маркеров (20,30,43,67 и 94кДа). 2,3,4- общие лизаты биомассы: 2 - до термоиндукции, 3,4 - ИФН-0, ИФН-Р-Зег-17. 6,7 - супернатанты суспензии клеточных лизатов ИФН-Р и ИФН-(5-Зег-17. 9,10 -мембранная фракция суспензии клеточных лизатов ИФН-Р и ИФН-Р-Бег-17. время культивирования штаммов после термоиндукции - 2ч.

ного фибробластных интерферонов экспрессируются в E.coli с одинаковой

эффективностью, однако, противовирусная активность мутантного ИФН-Р на

порядок выше по сравнению с активностью исходного немутантного белка. Такое повышение активности мутантного белка, вероятно, происходит вследствие реализации единственной возможности замыкания дисульфидной связи, приводящей к образованию биологически активной третичной структуры (Mark D.F. et al., 1984; Hawkins М.У. et al. , 19.85; Higgins P.G. et al., 1986). Подтверждение проведенной мутации было получено после определения аминокислотной последовательности N-концевой части выделенного мутантного белка.

Таким образом, культивирование созданного на основе мутантного гена ИФН-(5 штамма-продуцента интерферона-Р-Бег-17 позволяет получать белок с улучшенными биологическими и физико-химическими свойствами. Сконструированный штамм-продуцент был передан в НПО "Ферментас" (Вильнюс, Литва) для проведения доклинического и клинического испытания ре-комбинантного fJ-Ser-17 интерферона.

IV. КОНСТРУИРОВАНИЕ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРНО-ФУНК-

ЦНОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ИНТЕРФЕРОНА. СИНТЕЗ ГЕНА ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНА 3 ЭГЛИН С И КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ЭТОГО БЕЛКА.

В последнее десятилетие возникло новое направление в изучении белковых молекул, связанное с созданием несуществующих в природе белков (полипептиды и белки de novo) или гибридных (химерных) белков, состоящих из частей неродственных белков. Возможности создания такого рода структур во многом предопределились развитием техники пептидного и олигонуклеотидного синтеза, созданием эффективных методов экспрессии чужеродных генов, включая и систему трансляции in vitro. При этом, в основном, авторы идут по пути создания заранее запланированного, с предполагаемой вторичной структурой, белка и затек изучают его физико-химические свойства, подтверждая или опровергая собственные предположения. Это направление, которое может быть названо "структурным", является крайне важным в понимании истинного механизма фолдинга белковой молекулы. Второе направление связано прежде всего с получением белков, несущих определенные функции (от осуществления белок-белкового узнавания до проявления какой-либо биологической активности). Это направление может быть названо "функциональным". Примером такого конструирования может служить белок "альбебетин" (Долгих Д.А. с соавт., 1993; Chemeris V.V. et al., 1994), структура которого была заранее предсказана, а затем на его основе получен химерный белок, проявляющий биологическую активность (активация бласт-трансформации тимоцитов мыши). Безусловно, эти два направления тесно связаны между собой и дополняют друг друга. Обзоры, посвященные проблеме создания искусственных белков (Betz S.F. et al., 1993; Sander С., 1991, 1994), в достаточной степени освещают рассматриваемый вопрос.

В нашем исследовании мы не ставили целью создание искусственного белка, а стремились найти такую белковую структуру, введение в состав

которой фрагментов 02-интерферона не нарушало бы в целом конформацию белка и, более того, обеспечивало экспонированность введенного фрагмента, как необходимое условие для обеспечения взаимодействия не только с клеточными рецепторами, но и с моноклональными антителами (см. главу II). Кроме того, было предпочтительно найти такой белок, который сам по себе проявлял бы биологическую активность, т.е. был практически важен. Необходимым условием для планирования такого исследования явля-

9

.ется также наличие достоверной информации о третичной структуре белка (рентгеноструктурные и/или ЯМР-спектроскопические данные). В качестве объекта исследования нами был выбран эглин С - белок из Hirudo medicinal is, краткая характеристика которого приведена ниже.

IV.1. Биологические и физико-химические свойства эглина С.

Эглины (В и С) - ингибиторы белковой природы, выделенные из пиявок Hirudo medicinalis (Seemuller U. et al., 1977). Изучение биологических и физико-химических свойств этих белков показало их высокие ингибирую-щие свойства по отношению к сериновым протеиназам.

Эглин С представляет собой белок с молекулярным весом 8,1 кДа, содержит 70 аминокислотных остатков (рис.18). Эглин В отличается от эглина С одной аминокислотной заменой (Tyr35His), которая не связана с активным центром ингибитора.

1 10 20 30 40 50 60

TEFGSELKSFPEVVGKTVDQAREYFTLHYPQYHVYFLPEGSPVTLDLRYNRVRVFYNPGT 70

NVVNHVPHVG

Рис.16. Аминокислотная последовательность эглина С.

Структура эглина не стабилизирована дисульфидными связями, однако, белок является высокоустойчивым к кислотной и термической денатурации. Эглины не подвергаются протеолизу трипсином без предварительной интенсивной обработки кислотами (нагрев до 70°С в 20 X трифторуксусной кислоте в течение 1 часа). Даже после обработки кислотой (рН 2, 80°С, 10 мин.) не наблюдается снижения ингибирующей активности эглина С (Chang Д-Y. et al., 1985). На основании анализа аминокислотной последовательности, эглин С отнесен к семейству ингибитора 1 из картофеля (PI-1) по классификации ингибиторов сериновых протеиназ.

IV.2. Спектр ингибирующего действия эглина С.

Эглин С является сильным ингибитором лейкоцитарной эластазы человека, химотрипсина из поджелудочной железы быка, катепсина G из грану-лоцитов человека и субтилизинов из бактериальных источников с величиной равновесной константы диссоциации (Kt) порядка 10"10 М (Seemuller

U. et al., 1977). Эглин С взаимодействует со специфичной для него про-теиназой с образованием комплекса в соотношении 1 : 1 (Braun N.J. et al., 1987). Показано, что эглин С взаимодействует с лейкоцитарной эла-стазой со сравнимыми с эндогенными ингибиторами эластазы скоростями (значение Касс для ингибитора СС-1 протеиназы (CC1PI) и ,СС-2-макроглобу-лина равно соответственно 1,4 х 107 М"1 s"1 и 2,4 х 107 М"1 s"1). Следует отметить, что лейкоцитарная эластаза ингибируется эглином С одинаково сильно как в свободном, так и в адсорбированном на эластине состояниях.

Эглин С ингибирует также лейкоцитарные эластазы из других источников: крысы, лошади, овцы, а также химазу из легочной ткани свиньи (Fink Е. et al., 1986) и три нейтральные протеиназы (1, 2А, 2В) из лейкоцитов лошади (Protempa 3. et al., 1985).

Результаты исследований показывают, что эглин С может быть эффективен in vivo против панкреатической и лейкоцитарной эластазы человека. По своим кинетическим характеристикам, а также вследствие селективности ингибирования и химической устойчивости, эглин С является перспективным препаратом для терапевтического применения при эмфиземе легких (Braun N.O. et aJ., 1986), предотвращении септического шока (Jochum М. et al., 1986), травматического шока (Schnebli Н.Р. et al., 1986) и т.д. Вследствие пептидной природы и размеров молекулы, применение препаратов эглина С для животных и человека возможно внутривенно, интратрахеально или местно.

IV.3. Третичная структура эглина С.

Использование методов рентгеноструктурного анализа позволило определить третичную структуру свободного эглина С (Hipler К. et al., 1992) и структуру эглина С в комплексах с протеиназами, объяснить механизм ингибирующвго действия эглина С. Исследования по ЯМР-спектрос-копии эглина С позволили установить третичную структуру эглина С в растворе, показать наиболее подвижные, способные к конформационным переходам, участки полипептидной цепи эглина С (рис.17).

Методом ЯМР-спектроскопии выявлено, что структура эглина С состоит из двух основных элементов: ОС-спиралей и состоящего из четырех тяжей нерегулярного ß-складчатого слоя. Две спирали локализованы на участке, близком к N-концу молекулы эглина С.

В эглине С гидрофобная сердцевина обладает большой стабильностью, а N-концевой гептапептид имеет неупорядоченную структуру. В связывающей, определяющей ингибирующее действие петле эглина С (G40-R48, Bode W. et al., 1986) отклонения боковых цепей составляют более 3,0 ангстрем, т.е., в растворе полипептидная цепь связывающей петли эглина С способна претерпевать конформационные изменения шарнирного типа (Ну-berts S.G. et al., 1992) .

Выводы.

Т.о., из анализа литературных данных следует, что эглин С является высокоактивным и специфичным ингибитором протеиназ человека, вовлеченных в развитие ряда заболеваний (эмфизема легких, ревматоидный артрит, панкреатит, хронический бронхит, цистическая фиброма, аллергические воспалительные процессы и др.). Кроме того, показано, что эглин С оказывает положительный терапевтический эффект при общем сепсисе и травматическом шоке у экспериментальных животных. Не выявлена токсичность, аллергенность или иммуногенность (на примере приматов) этого белка. Эти свойства белка вызывают повышенный интерес к эглину С, как к потенциальному лекарственному средству для лечения заболеваний человека, которые вызываются или сопровождаются повышенным биосинтезом протеиназ .

Достаточно подробно изучена третичная структура белка, показаны основные элементы третичной структуры эглина С и механизм его ингиби-рующего действия по отношению к протеиназам.

Высокая устойчивость к кислотной и термической денатурации позволяет использовать эглин С в качестве белка-носителя при проведении работ в белковой инженерии.

Кроме того, высокая ингибирующая активность эглина С по отношению к сериновым протеиназам может позволить использовать эглин С как селективный ингибитор в биотехнологических процессах. Все это предопределило задачу проведения химического синтеза гена эглина С и осуществления его экспрессии в Е. coli.

IV.4. синтез гена эглина С и получение белка методом гетерологич-

ной экспрессии.

История создания синтетических генов насчитывает уже 25 лет. Среди многочисленных работ по получению синтетических фрагментов ДНК можно выделить два основных методических подхода: традиционный подход, связанный с полным химическим синтезом двух цепей ДНК (Khorana H.G., 1979; Itakura К. et aJ., 1977), и подход, основанный, на ферментативной достройке частично комплементарных синтетических олигонуклеотидов до двуцепочечных фрагментов ДНК (Rossi Э.О. et al., 1983; Scarpulla et al., 1982).

Одним из способов получения протяженных синтетических фрагментов ДНК является синтез полинуклеотидов (150-200 нуклеотидов), из которых затем и собирается целевой двуцепочечный фрагмент (Graham R.W. et al., 1993). Однако, в этом случае вероятность возникновения мутаций в целевом фрагменте за счет химической модификации олигонуклеотидов во время наращивания олигонуклеотидной цепи резко возрастает. Поэтому оптимальными, с этой точки зрения, являются олигодезоксирибонуклеотиды длиной 50-70 нуклеотидов.

l Таким образом, следует отметить, что даже с развитием методов химического синтеза олигонуклеотидов и появлением современных автоматических синтезаторов, получение протяженных синтетических генов с использованием "классических" подходов является достаточно трудоемкой и многостадийной задачей.

Развитие техники PCR позволило существенно упростить процедуру сборки протяженных синтетических фрагментов ДНК. Так в работах (Dillon P.O. et al., 1990; Prodromou С. et al., 1992; Majumder К., 1992) описано получение синтетических генов с помощью PCR непосредственно из относительно коротких (54-86 н.) олигонуклеотидов без предварительного кинирования и лигирования. Сборка генов по данному методу осущест- . вляется в один этап: олигонуклеотиды - PCR - синтетический ген.

Однако, разбивка планируемой последовательности на частично перекрывающиеся олигонуклеотиды не является единственным вариантом проведения сборки синтетических генов в PCR. Независимо от вышеуказанных работ, нами были предприняты самостоятельные исследования эффективности сборки протяженных фрагментов ДНК с использованием прямой амплификации смеси синтетических олигонуклеотидов. В результате исследования для получения синтетических генов эглина С и ß-эндорфина нами были предложены отличающиеся от имеющихся в литературе схемы проведения сборки генов непосредственно из отдельных олигонуклеотидов.

IV.4.1. Проведение модельных сборок фрагментов ДНК прямой

амплификацией смеси синтетических олигонуклеотидов.

С целью оптимизации условий сборки целевого гена эглина С в PCR без предварительного кинирования и лигирования олигонуклеотидов, мы исследовали принципиальную возможность такого подхода и эффективность проведения амплификационной сборки протяженных фрагментов ДНК в зави-

симости от концентрации олигонуклеотидов на примере упрощенной модельной схемы.

Для этого были синтезированы олигонуклеотиды А*В* и В"А*, у которых участки А* ,А" и В*,В" взаимно комплементарны. Структуры олигонуклеотидов представлены в табл.5.

Таблица 5. Структуры модельных синтетических олигонуклеотидов.

I-1-1

I Наименование I Нуклеотидная последовательность | | | 5*->3' |

I А*В* I TACTTCACTCTGCACTACCATGTACCGCACGTTGGT |

I В"А" I GTAGTGCAGAGTGAAGTAACCAACGTGCGGTACATG |

I-1-:---I

Схема взаимных достроек олигонуклеотидов показана на рис.18. Повторение циклов: денатурация-отжиг-достройка приводит к увеличение длины продукта амплификации. Теоретически процесс увеличения длины цепей может продолжаться вплоть до исчерпания запасов дезоксинуклеозидтри-фосфатов и, следовательно, чем меньшее количество затравки вводится в PCR, тем более протяженные полинуклеотИдные цепи образуются в результате полимеразных достроек. По данной схеме взаимных достроек в результате PCR можно ожидать образования набора дуплексов ДНК различной длины с повторяющимся мотивом в 36 п.н.

а' в' PCR , а* в' а'

5 -=_5' 5 == 51

в" а" а в а

В*_А* PCR

--:-. 5'

а в а

г, а* В* А* В* А* PCR PCR

^ J . , . , 5' • •

а' в а в а

Рис.18. Схема взаимных достроек при проведении PCR в модельной системе.

На основании проведенных модельных экспериментов выявлена следующая закономерность: чем меньше концентрация олигонуклеотидов, вводимых в PCR, тем более высокомолекулярные продукты образуются в результате полимеразной реакции. Определено, что концентрация олигонуклеотидов, приводящая к эффективной достройке с образованием протяженных полинук-леотидных цепей, должна быть не выше 1х10"7-5х10"7М. Многократные цик-

лы PCR ведут к соединению отдельных полинуклеотидных фрагментов в протяженный участок ДНК. Данный принцип и был использован при сборке гена эглина С прямой амплификацией из отдельных олигонуклеотидов без использования Т4-полинуклеотидкиназы и Т4-ДНК-лигазы.

IV.4.2. Синтез гена эглина С.

Перекодировка последовательности белка в полинуклеотидную выполнена на основе аминокислотной последовательности эглина С (Seemuller U. et al., 1980; Knecht R. et al., 1983) с учетом наиболее часто встречающихся кодонов аминокислот в геноме E.coll (Магуаиа Т. et al., 1986).

Варианты последовательностей гена эглина С были проанализированы с помощью пакета математических программ "DNA-sun" (к.ф.-м.н. Миронов A.A.). Планирование синтеза олигонуклеотидов проведено с учетом минимальной вероятности образования нежелательных самокомплементарных структур. На рис.19 представлена оптимизированная полинуклеотидная последовательность, кодирующая эглин С.

1 11 21 31 41 51

ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrValAspGln actgagttcggttctgagctgaaatctttcccggaagttgttggtaaaactgttgaccag tgactcaagccaagactcgactttagaaagggccttcaacaaccattttgacaactggtc

61 71 81 91 101 111 121

AlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGly gctcgtgaatacttcactctgcactacccgcagtacgacgtttacttcctgccggagggt cgagcacttatgaagtgagacgtgatgggcgtcatgctgcaaatgaaggacggcctccca

121 131 141 151 161 171 181

SerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThr tccccggttactctggacctgcgttacaaccgtgttcgtgttttctacaacccaggtact aggggccaatgagacctggacgcaatgttggcacaagcacaaaagatgttgggtccatga

181 191 201 211

AsnValValAsnHisValProHisValGly aacgtagttaaccatgtaccgcacgttggt ttgcatcaattggtacatggcgtgcaacca

Рис.19. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая структурную часть гена эглина С.

Для получения гена эглина С были синтезированы олигонуклеотиды, последовательность которых включает в себя кодирующую цепь гена эглина С и олигонуклеотиды, комплементарные участкам стыковки олигонуклеоти-

дов кодирующей цепи (табл.6).

Таблица 6. Структуры синтезированных олигонуклеотидов, использованных при сборке гена эглина С.

No I п/п| 5'

Нуклеотидная последовательность

>3 1

I 1.1 TATGAATTCGAACAGCAGACTTTCTGATGACTGAATTTGGTTCTGAGCTCAAATC- |

I I TTTCCCCGAAG |

I 2.1 TTGTTGGTAAAACTGTTGACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCACTACCCGCA- |

I I GTACGACGTTTAC I

I 3.1 TTCCTGCCGGAGGGTTCCCCGGTTACTCTGCACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTG- |

I I ТТТТСТАСААС |

I 4.1 CCAGGTACTAACGTAGTTAACCATGTACCGCACGTTGGTTAG |

I 5.1 AACAGTTTTACCAACAACTTCCGGGAAAGATTTCA |

I 6.1 CCCTCCGGCAGGAAGTAAACGTCGTACTGC |

I 7.1 CTACGTTAGTACCTGGGTTGTAGAAAACACG I

I 8.1 TTTTGGATCCCTAACCAACGTGCGGTAC I

I 9.| TTTTGGATCCATGACTGAATTTGGTTCTGAGCTGAAATCTTTCCCGGAAG |

I 10.1 TTTTTTCGAACTAACCAACGTGCGG |

I 111 TTTTGAGCTCCTGCAGAATGAAG |

I 12.1 TTTTGGATCCCTCCTCTGTGAATC |

I-1--1

Сайты рестрикции и другие вспомогательные элементы были заложены в структуры праймеров и присоединялись к гену эглина С в результате проведения PCR (табл.6., рис.20).

г

з

< 9 г з <

EcoPl

А

5 6

EgllnC

10

Hindlll

А

Рис.20. Схема получения гена эглина С с использованием PCR и конструирования экспрессионных плаэмид. 1

При сборке гена эглина С не происходит, как в случае лигирования, предварительного соединения ковалентной связью олигонуклеотидов кодирующей цепи гена. Олигонуклеотиды объединяются в полинуклеотидную цепь в результате последовательных достроек с участием Taq-полимеразы. Формально этот процесс аналогичен соединению отдельных олигонуклеотидов в протяженную цепь с помощью лигазы, однако, по своей сущности, это объединение протекает по совершенно другому механизму.

Результаты фракционирования продуктов амплификации олигонуклеотидов представлены на рис.21. Увеличение концентрации олигонуклеотидов, как и в случае модельного эксперимента, от 10~8М до 10~7М не вызывает качественных отличий в продуктах PCR, доминирует зона полинуклеотидно-го материала, соответствующая гену эглина С. Увеличение количества исходных олигонуклеотидов до 10~7М приводит к наработке только следовых количеств фрагмента, соответствующего гену эглина С. Дальнейшее повышение концентрации олигонуклеотидов в амплификационной смеси окончательно подавляет образование целевого двуцепочечного фрагмента.

I 2 3 4 5 6 7

I

Рис.21. Электрофоретический анализ продуктов амплификации олигонуклеотидов при сборке гена эглина С. Молярная концентрация каждого из олигонуклеотидов в реакционной смеси: 1- X/Pstl, 2.- 10~8, 3.- 3 10"8, 4.- 510"8, 5.- 10~7, 6.- 2.5'10"7, 7.- 5'10~7 .

IV.4.3. Сборка гена Р-эндорфина без приненення Т4-полинуклеотид-киназы и Т4-ДНК-лигазы.

С использованием аналогичного подхода, без применения Т4-полинук-леотидкиназы и Т4-ДНК-лигазы, была получена полинуклеотидная последовательность, кодирующая Р-эндорфин человека (Goldstein А., 1976).

Эндорфины - общее название ряда опиоидных пептидов (Ц-, Р-, дорфины, Met-энкефалин, Ьеи-энкефалин и др.). Среди них Р-эндорфин обладает наиболее выраженной анальгетической активностью, что обусловлено его высокой способностью связываться с опиатными рецепторами. Опиаты ингибируют высвобождение вещества Р-нейропептида, который, как по-

лагают, выполняет роль нейромедиатора нервного болевого пути. ß-Эндор-фин обладает более высокой активностью (при расчете на молекулу - в 25-30 раз), чем морфин и в 100 раз большей опиоидной активностью, чем энкефалины.

Особый интерес к эндорфинам связан, помимо фундаментальных исследований по изучению центральной нервной системы, с надеждой найти сильнодействующие анальгетики, к которым не возникает привыкание.

Для перекодировки аминокислотной последовательности ß-эндорфина в полинуклеотидную, как и в случае гена эглина С, использовали наиболее часто встречающиеся кодоны аминокислот в геноме E.coli (рис.22).

1 11 21 31 41 51 61

TyrGlyGlyPheMetThrSerGluLysSerGlnThrProLeuValThr acttggatccatgtacggtggcttcatgacttccgaaaaatctcagaccccgctggttac tgaa'cctaggtacatgccaccgaagtactgaaggctttttagagtctggggcgaccaatg "BamHl

61 71 81 91 101 111 121

LeuPheLysAsnAlalleileLysAsnAlaTyrLysLysGlyGlu : tctgtttaaaaacgctatcattaaaaacgcatacaaaaagggtgaatgataggtcgacaata agacaaatttttgcgatagtaatttttgcgtatgtttttcccacttactatccagctgttat

"SalGl .

Рис.22. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая структурную часть гена ß-эндорфина человека.

Первичная структура синтетических олигонуклеотидов и их ориентация представлены в табл.7 и рис.23. Только олигонуклеотиды 3 и 4 имеют комплементарные участки, а олигонуклеотиды 1 и 2, 2 и 3 имеют гомологичные участки.

Таблица 7. Структуры синтезированных олигонуклеотидов, использованных при сборке гена ß-эндорфина.

I-Г

No п/п

Нуклеотидная последовательность 5'->3'

1 . 2 . 3 . 4.

ACTTGGATCCATGTACGGTGGCTTCATGACTT

TACGGTGGCTTCATGACTTCCGAAAAATCTCAGACCCCGCTGGTTACTCTGTTTAAA

CGCTGGTTACTCTGTTTAAAAACGCTATCATTAAAAACGCATACAAAAAGGGTGAA

TATTGTCGACCTATCATTCACCCTTTTTGTATGCGT

На рис.23 представлена схена взаимных достроек олигонуклеотидов,

1 5'-3'

2 5'-У PCR 3 PCR_ PCR

3 5'-3' 3--1— 5" - +

4 5'-3-

2

PCR ß -Endorphine

+

BamH1 Sold

1

Рис.23. Схема взаимных достроек олигонуклеотидов при сборке

гена Р-эндорфина человека (см.табл.7).

приводящая к образованно фрагмента ДНК, кодирующего 0-эндорфин человека. При проведении данного синтеза была применена схема амплификацион-ной сборки, принципиально отличающаяся от схемы сборки полинуклеотид-ной последовательности эглина С. Сборка гена начинается с отжига олигонуклеотидов 3 и 4. В результате последующей полимеразной достройки олигонуклеотид 4 достраивается до двуцепочечного фрагмента, который отжигается с олигонуклеотидом 2. Таким образом, в данной схеме в каждый последующий цикл амплификации вступают новые олигонуклеотиды и последовательность удлиняется от 3'- к 5'-концу фрагмента. В конечном итоге получается целевой фрагмент ДНК, кодирующий Р-эндорфин человека. Предложенный подход позволяет заранее рассчитать и реализовать схему получения отдельных фрагментов гена при исследовании структурно-функциональных отношений в белках.

В отработанных оптимальных условиях синтетический ген р-эндорфина эффективно собирается в предложенном варианте получения двуцепочечного фрагмента ДНК.

Полученный прямой амплификацией синтетических олигонуклеотидов фрагмент ДНК был расщеплен эндонуклеазами рестрикции (ВалН1 и Ба1С1) и клонирован в составе ДНК фага М131д131. Первичная последовательность клонированного фрагмента полностью соответствовала запланированной.

Таким образом, на основании проведенных экспериментов по сборке генов эглина С и Р-эндорфина, можно утверждать, что отработанная высокоэффективная схена получения протяженных фрагментов ДНК прямой амплификацией синтетических олигодеэоксирибонуклеотидов позволяет существенно упростить и ускорить проведение генно-инженерных работ, связанных с реконструкцией ДНК. Определены оптимальные условия при проведении такой сборки.

IV.4.5. Конструирование экопрессионных плазмид и получение штан-мов-продуцентов эглина С.

Полученный в результате амплификации фрагмент ДНК I (олигонуклео-тиды 1-8) расщепляли соответствующими рестриктаэами (рис.20) и клонировали в составе мультикопийного экспрессионного вектора pPR-TGATG-l (Mashko S.V. et al., 1990). Наличие в последовательности данной плаз-миды гена температурочувствительного репрессора X clts857 позволяет эффективно контролировать экспрессию чужеродного гена. Этот факт был особенно важен, т.к. не была до конца выяснена токсичность эглина С по отношению к клеткам E.coli.

При клонировании чужеродного гена в составе вышеописанного вектора необходимо было проводить ряд технически сложных экспериментов, обеспечивающих точную состыковку TGATG-последовательности с клонируемой последовательностью. В работах (Mashko S. V. et al., 1990; Lapidus А.L. et al., 1990) это достигалось расщеплением плазмиды эндо-нуклеазой рестрикции SacI с последующим затуплением "липких" концов ДНК. Последующее клонирование фрагмента ДНК осуществляли по "тупым" концам. Известно, что такого рода клонирование может приводить к неоднозначным результатам и осложняет последующий скрининг трансформантов.

Для того, чтобы избежать этих операций при планировании синтеза гена эглина С в его первичную последовательность исходно были заложены регуляторные элементы (SDtrpD, 'trpE) и необходимые сайты эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI (рис.20, табл.6). Внесенные изменения существенно упростили конструирование рекомбинантной плазмиды pTEGl.

Для клонирования фрагмента II в качестве иультикопийных векторов использовали плазмиды pUC18 и pUC19, в составе которых нами был дополнительно клонирован промотор гена уридинфосфорилазы (PUdP, 169 п.о.) из E.coli, полученный амплификацией с плазмиды pUD7 (Брикун И.А. с со-авт., 1989) с использованием олигонуклеотидов 11,12, табл.6). При амплификации регуляторный элемент искусственно фланкирован сайтами рест-риктаз SacI и BamHI. Производные плаэмид pUC18 и pUC19 получили название pUU18 и pUU19 (рис.20). Данные векторы были в дальнейшем использованы при клонировании различных генов (см. главу VI).

Таким образом, были получены три варианта экспрессионных векторов (pTEGl, pUEG18 и pUEG19), структуры которых приведены на рис.20. Отбор рекомбинантных клонов после проведения трансформации Е. coli проводили в случае pTEG гибридизационным скринингом in situ с использованием би-отинилированного (Вейко В.П. с соавт., 1990, 1991; см. главу V.2) оли-гонуклеотида (7, табл.6), а при поиске целевых клонов, содержащих плазмиды pUEGlS и pUEG19 - прямой амплификацией ДНК клонов с использованием "универсального" (GTAAAACGACGGCCAGT) и "реверсивного" (CAGGAAA-CAGCTATGAC) синтетических прайнеров. Соответствие полученных конструкций запланированным вариантам подтверждали определением первичной последовательности фрагментов плаэмид, выделенных из целевых клонов.

Среди штаммов-продуцентов, полученных трансформацией штаммов E.coli: TGI (SupE, hsdAs, thi.A(lac-proAB),F'[traD36,proA+В*,laclq,

1асгДМ15]); С600 ( F",thi-1,thr-1, leuB6,lacYl,tonA21,supE44Д" ) и XL1 Blue (RecAl, endAl,gyrA96,thi,hsdR17(rk mk ),supE44,relAl,X[ F' proAl,lacIq laczAM15,TnlO(tetr)], сконструированными экспрессион-ными плаэмидами, наибольший уровень накопления эглина С наблюдался в штаммах С600 и XL1 Blue (табл.8).

Таблица 8. Биосинтез эглина С в E.coli.

1 I Штамм -продуцент Накопление сырой 1 эглина С, мг/г | биомассы I

I С600 (pTEGl) 14 I

I С600 (pUEGl8) 10 I

I С600 (pUEG19) 11 1

I TG1 (pTEGl) 9 1

I TC1 (pUEG18) 9 1

1 TG1 (pUEG19) ю |

1 XL1 (pTEGl) 14 |

I XL1 (pUEG18) 12 |

I XL1 i (pUEG19) 14 | i

Достаточно высокий уровень накопления эглина С в клетках E.coli позволил сделать вывод о нетоксичности белка к данному виду микроорганизма.

После проведения оптимизации культивирования штамма-продуцента С600 (pUEG18) уровень накопления эглина С удалось повысить до 0,4 г/литр культуральной жидкости (исследование проводили совместно с лабораторией оптимизации процессов ферментации, зав. лаб. к.ф.-м.н. Соколов А.К.). Выбор именно этого штамма в качестве штамма-продуцента определялся отсутствием стадии термоиндукции, необходимой при использовании штаммов, содержащих плазмиду pTEGl.

IV.4.6. Выделение реконбинантного эглнна С и исследование его нн-

гибярующей актявностн.

Учитывая устойчивость эглина С к денатурации и протеолитической деградации, нами была применена следующая схема выделения рекомбинант-ного белка. После разрушения клеток на ультразвуковом дезинтеграторе, клеточный дебрис осаждали центрифугированием (8000 об/мин, при этом эглин С оставался в надосадочной жидкости). Осадок отбрасывали, а в супернатант добавляли при перемешивании этиловый спирт. Конечное соотношение спирт - супернатант 8:1. Применение этилового спирта вызывало осаждение балластных белков, а эглин С оставался в растворе. Водно-спиртовый раствор упаривали, остаток растворяли в 0,1М водном растворе уксусной кислоты и наносили на хроматографическую колонку с Сефадексом

С-50. В качестве элюента использовали 0,1М водный раствор уксусной кислоты. Контроль за ходом гель-фильтрации осуществляли измерением оптической плотности элюата при 280 нм.

Присутствие эглина С в элюате подтверждали по ингибированию гидролиза хромогенного субстрата СС-химотрипсином. Фракции, содержащие эглин С, объединяли и лиофилизировали. Выход целевого белка составляет 80-85%. Гомогенность полученного препарата анализировали денатурирующим гель-электрофорезом (рис.24).

12 3 4

Рис.24. Электрофоретический анализ белков общего лизата клеток E.coli: 1. - выделенный препарат рекомбинантного эглина С, 2.-белки-маркеры, 3.- штамм-продуцент, 4.-штамм-реципиент.

Ранее было показано, что природный и рекомбинантный эглины С имеют идентичную биологическую активность in vitro и in vivo (Jochum М. et al., 1987). Активность полученного нами эглина С тестировали по ингибированию бычьего СС-химотрипсина и свиной панкреатической эластазы (рис.25).

Т.о., в результате проведенной работы синтезирован ген эглина С (зарегистрирован в EMBL под номером Х89517), получены экспрессионные плазмиды, создан штамм-продуцент высокоэффективного ингибитора протеи-наэ (эглин С), который может быть использован для наработки препарата, имеющего терапевтический эффект как при локальном, так и при общем воспалительном процессе (например, пневмония, эмфизема или общий сепсис). Отработана методика выделения эглина С в гомогенном состоянии. Тем самым созданы все предпосылки для разработки технологического способа получения нового терапевтического препарата белковой природы.

А 405 nm i -

elastase

О -1-1-1-1-1-

о 0.2 O.í 0.6 о.» i

„ Egi¡r»C mt*g

-•-rEglinC — < Egli'nC ^Slgmo

CHYMOTRYPSIN

0 0.01 0j02 0.03 0.04 0.05 0.06

— rEglinC ——rEglinC Sigmo" Egi.nC mkq

Рис. 25. Ингибировакие зластазу (Л) и хнмогрипснна (В) рекомби-нантным эглином С, полученным в настоящей работе.

IV.5. Конструарованве гибридных генов (эглин С - (5-эндорфин, эглин С - ОСг-интерферон человека) и создание штаммов-продуцентов соответствующих химерных■белков.

VI.5.1. Выбор участков Ü2-интерферона человека для введения в состав эглина С.

Исходя из данных по третичной структуре интерферона, полученных на основе многочисленных моделей математических расчетов, в качестве исследуемых фрагментов интерферона были выбраны N- и С- концевые участки полипептидной цепи (рис.1, и табл.10), потенциально важные в функционировании молекулы интерферона (антипролиферативная и антивирусная активности). Выбор основан на высказанных в литературе предположениях (см. главу I) о разнесенности антивирусной и антипролиферативной функций белка и предварительных экспериментальных данных о важности участия именно этих фрагментов в связывании с рецепторами клеток и прояв-

лении белком антивирусной и антипролиферативной функций.

Кроме того, указанные участки Ы- и С-концевой области были дополнительно подраэбиты на отдельные фрагменты полипептидной цепи (2-16, 30-52, 111-139, 125-139, 125-145, 132-139, 102-141 аминокислотные остатки интерферона), что позволяет провести более детальный анализ рол1 этих фрагментов как в проявлении интерфероном биологической активности, так и в определении эпитопной характеристики этого белка.

VI.5.2. Выбор области введения фрагмента СС2-интерферона человека 1

состав полнпептядной цепи эгдхна С.

Задача выбора области введения фрагмента интерферона в состав полипептидной цепи эглина С во многом определялась наличием информации < третичной структуре последнего, полученной на основе рентгеноструктур ного анализа (см. IV.3., рис.17). Как указано выше, молекула эглина С обладает уникальной устойчивостью к термо- и кислотной денатурации, что во многом определяется наличием в составе молекулы центрального участка, состоящего из нескольких |$-тяжей. При этом функциональную роль в белке играет участок 40-48 а.о., взаимодействующий с широким спектром сериновых протеиназ и участок 56-63 а.о., по литературным данным, предположительно, участвующий во взаимодействии с лейкоцитарной эластазой. М-концевые аминокислоты (1-10 а.о.) не принимают участия в стабилизации молекулы в целом, являясь свободным архитектурным элементом, определяющим начало фолдинга белка. Именно поэтому в данной работе не рассматривалось введение чужеродного полипептидного фрагмента в Ы-концевую часть эглина С.

Т.о., в качестве участков, потенциально пригодных для введения чу жеродного полипептидного фрагмента, являются места между 48-49 а.о. и 59-60 а.о. эглина С (рис.17). Преимуществом такого конструирования является возможность закрепления и пространственного сближения Ы- и С-концевых областей вводимого полипептидного фрагмента, что, в свою очередь, позволяло надеяться на формирование третичной структуры вводимого фрагмента, подобной структуре в исходном интерфероне.

Предполагаемая структура гибридных белков приведена на рис.26.

IV.5.3. общий принцип получения гибридных генов белков.

Создание гибридных молекул, состоящих из отдельных частей интересующих белков, является одним из способов выяснения структурно-функциональных отношений в этих соединениях. Ранее мы предложили вариант конструирования гибридных молекул с заданными границами методом многоточечного мутагенеза с использованием адресованного фрагментирования одноцепочечной ДНК (см. главу I). Однако, этот метод также имеет ограничение, связанное с необходимостью соблюдения условий гомологичное™ генов двух исследуемых белков, что сужает спектр его применения. Развитие техники полимеразной цепной реакции и олигонуклеотидного синтезе

позволило решать эту задачу более эффективно (Hall L.et al. , 1991)

PRO

Рис.26. Предполагаемая структура гибридных белков.

5' 29 lFN у PCR' 5'.

IFN

• У

У-ГГ.

■ У "

•5'

3'-

Eglin

Eglin

49 Eglin 71 „ PCR2 IFN Eglin 5- з--5' => - »

З'тг

Л

• 5'

1 Eglin 48 5' PCRj ,, Eglin 48|FN

í --- И1

PC R,

Eglin 4g IFN 49 Eglin

II +111

•У

У-

I

Clontng

Рис.27. Общая схема получения гибридных белков с использованием полимеразной цепной реакции.

Метод создания такого рода конструкций с применением PCR состоит в проведении последовательных реакций и в общем виде представлен на рис.27. На первом этапе олигонуклеотиды используются для получения целевого двуцепочечного фрагмента ДНК, который необходимо перенести в состав другого гена (рис.27, I). Затем полученный фрагмент без предварительного разделения цепей используется в качестве праймера в последующей амплификации в паре с "реверсивным" или "универсальным" прайме-рами (их роль могут выполнять любые праймеры, располагающиеся в проксимальной и дистальной областях мутагенизируемого гена). Вновь синтезированные фрагменты (рис.27, II-III) в перекрестной амплификации дают целевую структуру (рис.27, IV). Адрес вносимой замены в генетической структуре-мишени, а также адрес встраиваемого участка заложены в нук-леотидной последовательности синтетических олигонуклеотидов. Использование данного подхода позволяет производить не только инсерции фрагментов чужеродной ДНК в состав гена-мишени, но и одновременно делегировать практически любой фрагмент.

IV.5.4. Конструирование гибридных генов на основе гена эглина с и гена ß-эндорфина, а также эглина С и фрагментов гена СХ2-интерферо-на человека. Получение штаммов-продуцентов соответствующих химерных белков.

Для реализации вышеизложенной схемы конструирования гибридных генов были синтезированы олигонуклеотиды, структуры которых приведены в таблице 9, а основные характеристики получаемых с помощью такой техники белков приведены в табл.10.

Одним из целевых химерных белков, ген которого был получен при проведении данного исследования, является гибридный белок, состоящий из эглина С и ß-эндорфина (9, табл.10). Данная конструкция была создана не только с целью проверки устойчивости такого рода белка при гете-рологичной экспрессии гена в E.coli, но и для исследования биологической активности химерного белка. Кроме того, в случае успешного проведения экспрессии этого гена в клетках E.coli, можно было надеяться на создание штаммов-продуцентов коротких пептидов, потребность в которых в настоящее время достаточно высока.

После проведения амплификационной реконструкции ДНК по вышеприведенной схеме фрагменты ДНК, соответствующие целевым гибридным структурным генам, были клонированы в составе плазмиды pUU18 в штамме E.coli С600.

На рисунке 28 приведены результаты электрофоретического анализа общеклеточных белков штаммов-продуцентов химерных белков. Как видно из рисунка, уровень накопления целевых белков достаточно высок.

Следует отметить, что на данном этапе работы мы не стремились к достижению максимального уровня биосинтеза соответствующих химерных белков, а преследовали чисто научный интерес наработки и выделения

- 56 -

1 23456789 1011 12

:цнуу

••ЭНННПг

ИГ?

ННСН

М f. С

Рис.28. Биосинтез гибридных белков (см. табл.10) в E.coli: 1,- эг-лин С, 2.- штамм-реципиент, 3.- белки-маркеры, 4-12 - гибридные белки.

Табл.9 Структуры синтетических олигонуклеотидов,использованных при конструировании гибридных генов.

т i : : i

Зис * " - j •■»4M

\ К*

No Нукпеотидная последовательность

п/п 5'- -»■ 3'

Gl yCly

1 tactctggacctgcgtg gtCgatacggtggcttcatgac

eqltn endorphine

2 acacgaacacggttgtatccaccttcaccctttttgtatgc

eglin endorphme

3. tactctggacctgcgtgatctgcctcagaccca

eglin interferon

i cacgaacacccttgtacatcaaggtcctcctgct

eglin interferon

ь iacictggacctgcgiatgaaggaggactccatt

eglin interferon

6 cacgaacacggttgtaggcacaaccgctgtat

eglin interferon

7 tactctggacctgcgtagaatcactctctatctg

eglin interferon

в cacgaacacggttctatcctctgacaacctccca

eglin interferon

9 actctggacctgcgtttgaaggacagacatg

eghn interferon

Ю cacgaacacggttgtaggtttcagccttttcg

eglin interferon

Cys

II :gtgttttctacaacccagcttgcgggctgggg

egitn interferon

12 atggtttacaacgttagtctcccagccacaaggg

eglm interferon

белков в количествах, достаточных для проведения биологического тестирования на антивирусную, антипролиферативную и анальгеэирующую активности (в случае белка эглин С - [5-эндорфин), а также изучения связывания полученных белков с клеточными рецепторами (несколько миллиграммов белка) .

Особый случай представлял химерный белок 7 (табл. 10), в котором протяженный участок полипептидной цепи интерферона был клонирован в области 59-60 а.о. эглина С. Такого рода конструирование имело своей целью получить химерный белок с нативной структурой ингибирующей петли эглина С (см. главу IV.3.). Однако, химерный белок не накапливался в клетках E.coli в условиях гетерологичной экспрессии. Проведенный анализ аминокислотной последовательности этого белка показал, что вводимый в состав эглина с фрагмент интерферона величиной 40 аминокислотных остатков находится вблизи С-концевой части эглина С и белок не может быть застабилизирован в своей исходной структуре.

Таблица 10. Основные характеристики гибридных генов и белков, получаемых на их основе.

1 " | N0 гибридного I гена п/п ■ 1 1 2 i 3 1 1 4 1 1 5 1 1 6 1 | , 7 1 1 8 1 1 1 9 |

1 Фрагмент | СС2-ИФН, | а . о. 2-16 111139 125139 | 125-| 145 1 132-| 139 1 301 52 | 102-| 141 1 Cys 1 1021 141 1 " I

| (3-эндорфин, I а . о. - - - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 11-32 I

I Адрес встра-I ивания в эг-1 лин С, а.о. 48-49 48-49 48-49 | 48-| -49 1 481 -49 1 48-| -49 I 591 -60 | 591 -60 148- | 1 -49 |

| Длина поли-| пептида, а.о. 85 99 85 1 91 1 78 1 93 1 110 1 111 1 102 1

| Расчетная I мол. масса I белка, кДа | | 9,5 11,1 9,5 [ 10,2 1 1 8,7 i |Ю,4 i 112,3 i ¡12,4 i Ul.4 1 i i

Этот факт, очевидно, и приводил к нарушению центрального ^-тяжевого участка эглина С, что, в свою очередь, приводило к разворачиванию (де-

натурации) белковой глобулы и быстрому прогеолизу химерного белка.

С целью получения химерного белка была предпринята попытка экспрессии его гена в системе мини-клеток штамма E.coli X925• В связи с отсутствием в мини-клетке геномной ДНК, создаются благоприятные условия для биосинтеза белков, подверженных деградации в условиях макси-клеток. Однако, попытки проведения биосинтеза данного химерного белка в мини-клетках также были безрезультатны. Полученные данные ставили задачу стабилизации этой белковой структуры.

Из литературных данных известно, что одной из функций дисульфидных связей в молекуле белка является формирование и поддержание конформа-ции белковой глобулы в целом (см. главу I). Учитывая, что в составе химерного белка уже присутствовал остаток Cys, мы провели конструирование гена нового химерного белка, введя дополнительный остаток Cys, пытаясь обеспечить стабилизацию вводимого петлевого участка интерферона за счет образования S-S-связи. Тем самым мы предполагали сблизить N- и С-концевые области вводимого участка интерферона и позволить белку сформировать стабилизирующий молекулу в целом центральный ß-тяжевый участок. Предполагаемая структура вновь синтезированного белка представлена на рис.26.

Конструирование такого химерного белка проведено по аналогичной вышеописанной схеме. Анализ экспрессии полученного гибридного гена, кодирующего химерный белок, показал, что уровень биосинтеза нового, стабилизированного дополнительной S-S-связью белка находится на уровне полученных ранее белковых конструкций (рис.28).

Полученные гибридные белки подвергались очистке и в настоящее время проходят тестирование как на биологическою активность, так и на связывание с моноклональными антителами. Результаты этого исследования являются частью завершаемой в лаборатории диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук и поэтому в данной работе не обсуждаются. Хотелось бы отметить только результат тестирования взаимодействия гибридного белка, содержащего фрагмент интерферона (30-52 аминокислотный остаток, 9, табл.10), с моноклональным антителом NK-2. Показано, что Каf[ этого белка составляет 75% от связывания с рекомбинантным СС2-интерфероном человека. Этот факт позволяет утверждать, что конформация введенного фрагмента интерферона не претерпевает существенных изменений в составе гибридного белка. Кроме того показано, что ингибирующая способность такого белка на три порядка ниже по сравнению с нативным эглином С. Высокий уровень экспрессии данного гена еще раз указывает на решающую роль центрального гидрофобного ß-слоя в стабилизации третичной структуры эглина С.

Выводы.

Синтезированы, клонированы в составе мультикопийного вектора гибридные гены химерных белков. Исследование биосинтеза химерных белков в

E. coli показало, что эглин С может успешно выполнять функцию белка-носителя. Проведена дополнительная реконструкция химерного гена и показано, что введение стабилизирующей S-S-связи позволяет вводить фрагмент чужеродного белка в С-концевую область эглина С.

V. РАЗРАБОТКА МЕТОДА СИНТЕЗА НЕРАДИОАКТИВНОМЕЧЕНЫХ (БИОТННИЛН-

РОВАННЫХ) ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗОНДОВ, 'традиционно олигодезоксирибонуклеотиды или фрагменты ДНК для проведения генно-инженерных работ метятся и затем детектируются с использованием радиоактивных изотопов (например, 32Р). Безусловно, этот тип метки обеспечивает высокую чувствительность при выявлении ДНК, однако, получаемые таким образом зонды небезопасны в работе, удельная активность радиоактивного зонда быстро уменьшается.

В ряду таких зондов синтетические олигодезоксирибонуклеотиды занимают особое место как в медицинской диагностике, так и при проведении научных исследований в молекулярной биологии (Бадашкеева А.Г. с со-авт., 1991; Matthews 3. A. et al., 1988). Основное преимущество таких зондов по сравнению с ДНК-зондами заключается в возможности обнаружения точечных мутаций, что особенно существенно при выявлении ряда генетических заболеваний. Кроме того, в настоящее время синтетические нерадиоактивномеченые олигонуклеотиды нашли широкое применение в качестве праймеров при проведении автоматического секвенирования ДНК, обнаружении фрагментов PCR и т.д. Это обусловлено достаточно высокой чувствительностью, стабильностью и безопасностью при работе с такими зондами (Pieles U. et al., 1990).

В качестве репортерных в нерадиоактивномеченых олигонуклеотидных зондах могут выступать флуоресцентные соединения, красители, группы, выявляемые под действием ферментативных систем (биотин), ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза).

Наиболее часто в качестве репортерной группы используют биотин, что связано, прежде всего с уникальной способностью биотина образовывать высокоустойчивые комплексы (Кдис 10",4М) с авидином или стрепта-видином (Goodchild Э.,1990) .

Применение биотинилированных олигонуклеотидов и иммобилизированно-го на магнитных шариках авидина или стрептавидина позволяет проводить большое число генно-инженерных операций (лигирование, отжиг, полиме-разные достройки) в твердофазном варианте, что существенно облегчает работу с ДНК и, в ряде случаев, открывает новые возможности в реконструкции генетического материала (Dombrowski К.Е. et al., 1992; Khudya-kov Y.E. et al., 1994; Espelund M. et al., 1990). Так, в частности, применение биотинилированных праймеров при проведении сайт-направленного мутагенеза с помощью PCR облегчает выделение одноцепочечных фрагментов ДНК, несущих необходимую мутацию (Weiner М.Р. et al., 1993). Как правило, введение репортерных групп осуществляли модификацией

гетероциклических оснований либо модификацией 3'- или 5'- конца олиго-нуклеотида (Коршун В.А. с соавт., 1993; Горожанкин A.B. с соавт., 1993; Lo Y-M.D. et al., 1988). Эти методы довольно трудоемки, дорогостоящи, многостадийны и зачастую не позволяют использовать модифицированный олигонуклеотид для дальнейших ферментативных реакций in vitro, что существенно сужает круг задач, решаемых с помощью олигонуклеотид-ного зонда (введение репортерных групп по 5'- концевой гидроксильной группе олигонуклеотида приводит к невозможности ферментативного фосфо-рилирования, а репортерные группы на 3'-конце олигонуклеотида блокируют элонгацию полимеразами).

Все это предопределило актуальность разработки метода получения нерадиоактивно меченых олигонуклеотидных зондов, лишенных вышеуказанных недостатков.

Современные методы твердофазного синтеза олигодезоксирибонуклеоти-дов основаны либо на использовании высокореакционных соединений трехвалентного фосфора (фосфоамидитный метод синтеза), либо применяются соединения пятивалентного фосфора (Н-фосфонатный метод). Однако, не все репортерные группы могут быть подвергнуты обработке реагентами, используемыми на стадиях конденсации и при деблокировании олигонуклео-тидной цепи.

Поэтому при разработке схемы твердофазного получения нерадиоактивно меченых олигонуклеотидов мы получали аминоолигонуклеотиды, как промежуточные соединения. Принципиальным'моментом в выборе схемы являлось местоположение введенной модификации. Несмотря на то, что олигодезок-сирибонуклеотид является соединением с достаточно большим количеством реакционных центров, наиболее подходящей для проведения подобной модификации является межнуклеотидная фосфатная группа, т.к. при этом остаются открытыми важные для ферментативных реакций 5'- и 3'-концевые гидроксильные группы, а также не модифицируются важные для образования комплекса днк-олигонуклеотид гетероциклические основания.

В качестве модифицирующего реагента нами был выбран алифатический диамин, позволяющий получить устойчивую ковалентную связь по межнукле-отидному фосфатному узлу и одновременно ввести алифатическую аминогруппу, химические свойства которой отличаются от потенциально активных центров в составе олигодезоксирибонуклеотида. Это давало возможность в последующем провести избирательную модификацию выделенного олигонуклеотида (введение остатка биотина, флюоресцентной группы и пр.). Кроме того, эта методология не ограничивала местоположение модифицируемой фосфатной группы в олигонуклеотидной цепи, а также количество вводимых групп, что необходимо при получении различного рода адресованных реагентов на основе олигонуклеотидов.

Мы предложили вариант синтеза модифицированных олигонуклеотидов, содержащих алифатическую аминогруппу, введенную по межнуклеотидной фосфатной группе в процессе твердофазного наращивания олигонуклеотид-

ной цепи (рис.29). После наращивания олигонуклеотидной цепи по фосфи-тамидной схеме до места введения модификации проводили конденсацию очередного нуклеотидного эвена по Н-фосфонатной схеме. Введение аминогруппы осуществляли обработкой полимерного носителя 0,1 м раствором 1,7-гептаметилендиамина в присутствии иода либо с использованием реакции Атертона-Тодда (АЫдегЪоп Г.!?. еЬ а!., 1945).

Для предотвращения побочных процессов, которые могли бы протекать по аминогруппе при дальнейшем наращивании олигонуклеотидной цепи, введенные аминогруппы блокировали трифторацетильными остатками (хепирова-ли). Выбор трифторацетильной защитной группы был обусловлен ее лабильностью в процессе стандартной обработки олигонуклеотидной цепи концентрированным водным раствором аммиака. Далее синтез продолжали по фосфитамидной или Н-фосфонатной схеме до получения целевого олигонук-леотида.

В качестве модельного олигонуклеотида был выбран "универсальный праймер" (3 (СТААААССАСССССАСГ), используемый при определении первичной последовательности ДНК. Введение аминогруппы осуществляли как по центральному, так и по 5'-концевому фосфодиэфирным узлам олигонуклеотидной цепи (рис.29) .

Выделение синтезированных олигодезоксирибонуклеотидов (I) и (II). несущих модификацию по межнуклеотидной фосфатной группе, проводили препаративным электрофорезом в ПААГ. Электрофоретическая подвижность модифицированных олигонуклеотидов (I) и (II) одинахова, но существенно меньше по сравнению с соответствующим немодифицированным олигомером, что упрощает процедуру их идентификации и выделения.

С целью проверки эффективности предлагаемой методологии Н5 основе синтезированных модифицированных олигонуклеотидов были получены биоти-нилированные зонды. Введение биотинового остатка осуществляли обработкой выделенных аминоолигонуклеотидов раствором И-оксисукцинимидного эфира биотина. Анализ гомогенности биотинилированных олигонуклеотидов (III) и (IV) проводили с помощью обращенно-фаэовой ВЭЖХ.

При введении [32Р)-фосфатной группы по 5'-концу полученных биотинилированных олигодезоксирибонуклеотидов с помощью полинуклеотидкинаэы фага Т4 нами было обнаружено, что, в отличие от модифицированного по центральному фосфатному остатку олигонуклеотида, его изомер, несущий модификацию по 5'-концевому фосфодиэфирному узлу, не вступал в реакцию ферментативного фосфорилирования. Из приведенных данных следует, что модификация краевого (5'-) межнуклеотидного фосфатного узла не позволяет Т4-полинуклеотидкиназе узнавать синтетический олигонуклеотид. Поэтому, во избежание неоднозначных результатов при использовании киназы или полимераэы (Кленовский фрагмент, Бечиепазе", Тач-полимераэа и т.д.), вводимая модифицирующая группа не должна находиться вблизи 5'-или 3'-концов праймеров.

Синтезированные биотинилированные олигонуклеотиды применяли в ка-

Prot - наоашивамие опигонукпеотипмои иепи по фосфитамицпой схеме

1 NH2-ich2)7-NH2

- РгоТ -р-G-p-А-р-С-р-С-р-С-р-С-р-С -ОМГгА-р-О -

СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ н

ООООООО ° P'vil -p-G-p-A-p-C-p-C-p-G-p-O-p-C -p-AOMTr

СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ Н 2 (СГ3С012

ооооооо ° РГЧ.Т -p-G-p-A-p-C-p-C-p-G-p-G-p-C -p-ADMTl о >

СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ СЕ NH-ICH,>7-HN-C-CF3

- продолжение марашивамин опигонукпеотидной цепи по фосфитамип«ой или и-фосфонатной схеме -

I (id

о

о*-

Ъ diGpTpApApApApCpGpApCpGpGpCpCpApGpT)

I

NH-ICH >7-NH ^

5 dlGp'pApApApApCpGpApCpGpCpCpCpApGpT)

I

nh-ich j -nh Z / i

_5 d(GpTpApApApApCpCpApCpGpGpCpCpApGpT)

0-B'ol — NH-ICH 2)7"NH-Biol

— 5 dlCpTpApApApApCpGpApCpGpGpCpCpApGpT)

HU

nh-ICH,)7-hh -Bid

Рис.29. Схема твердофазного синтеза аминоолигонуклеотидов и получения биотинилированных праймеров на их основе.

честве зондов при проведении дот-гибридизации с одноцепочечной ДНК фага Ml3 (mpl8), закрепленной на нитроцеллюлоэных фильтрах. Чувствительность определения ДНК составила Юпг при отсутствии фоновой сорбции на 1мкг контрольной ДНК (ДНК тимуса теленка). Эти данные отвечают лучшему уровню чувствительности, достигнутому к настоящему времени при других способах нерадиоактивного мечения олигонуклеотидов (Urdea M.S. et al., 1988).

Важной характеристикой биотинилированных праймеров является температура плавления комплекса этих праймеров с ДНК, т.к. вносимые модификации могут существенно изменять этот параметр. На рис.30 приведены кривые плавления биотинилированного (рис.29, III) и немодифицированно-го "универсального" праймеров. Из приведенных кривых плавления следует, что температуры плавления комплексов олигонуклеотид-ДНК существенно не отличаются и модифицированный по предложенной схеме биотинилиро-

ванный праймер можно использовать в стандартных для олигонуклеотидов условиях отжига.

cpm X 1000

срт

120

100

67 ГС

Native ol'flon —1- BlO''n*'8'ed ol'oon

-*- Oligonucleotide (without DNA)

Рис.30. Кривые плавления комплексов олигонуклеотид-магрица.

Модифицированные олигодезоксирибонуклеотиды (рис.29, III и IV) были использованы также при определении первичной последовательности ДНК. В качестве контроля в этом случае применяли немодифицированный "универсальный праймер". При этом оба биотинилированных олигонуклеоти-да (III) и (IV) обеспечивали лраймирование и позволяли однозначно определить первичную структуру исследуемого участка ДНК.

Дополнительно проведенные эксперименты показали, что биотинилиро-ванные по разработанной схеме олигонуклеотиды эффективно элонгируются при проведении полимеразной цепной реакции.

С использованием разработанного метода был синтезирован биотиннли-рованный праймер, аналогичный праймеру 7 (табл.6). Именно этот био-тинсодержащий зонд использовали для проведения скрининга in situ при поиске клонов Е. coli, содержащих плазмиду pTEGl (табл.6). Для сравнения чувствительности радиоактивного и нерадиоактийного методов выявления комплексов ДНК-олигонуклеотид, биотинилированный праймер был фос-форилирован с введением [32Р]-фосфатной группы. Выявление комплексов олигонуклеотид-ДНК проводили вначале радиоавтографией, а затем тот же фильтр обрабатывали раствором конъюгата стрептавидин-щелочная фосфата-эа. Результаты гибридизации показали, что все основные положительные

сигналы в двух выявлениях совпадают.

Таким образом, предложена новая схема твердофазного синтеза амино-олигонуклеотидов и нерадиоактивномеченых зондов на их основе. Получаемые олигонуклеотидные зонды могут быть использованы практически во всех ферментативных реакциях, применяемых в генной инженерии (киниро-вание, элонгация полимераэами, включая амплификацию), и, следовательно, лишены большинства ограничений, присущих меченым по 5'-, 3'- концевым гидроксильным группам или гетероциклическим основаниям зондам. Следует отметить, что полученные по предложенной схеме биотинилирован-ные олигонуклеотиды использованы как в npai тической работе лаборатории, так и при проведении исследований в других институтах. Так, например, при изучении повторяющихся последовательностей ДНК, представленных в прителомерных участках хромосом человека, был успешно использован синтезированный нами биотинилированный олигонуклеотид d(TTAGGG)5-biot (Карпухин А.В. с соапт. 1993). В заключение главы необходимо указать, что данное исследование проводилось в рамках ГНТП России "Геном человека".

VI. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОТНОШЕНИЙ В УРИДИНФОСФОРИ-

ЛАЗЕ ИЗ ESCHERICHIA COLI.

VI.1. Ферментативная система катаболизма нуклеозидов в E.coli.

Наличие в клетках E.coli ферментативной системы катаболизма нуклеозидов, а также белков, осуществляющих транспорт нуклеозидов из окружающей среды, позволяет бактериям использовать нуклеозиды в качестве единственного источника углерода и азота.

Катаболизм нуклеозидов в E.coli происходит на основе четырех типов различных реакций (рис.31). Центральной реакцией является расщепление (i-N-гликозидной связи нуклеоэида с участием соответствующей нуклеозид-фосфорилаэы и освобождение пуриновиго или нирипидиноцого основания и

dC

I cdd dG

dA

deoC

cdd

ocetaldehyde

rC

rU

glyceraldehyde-3-phosphate

Рис.31. Схема катаболизма нуклеозидов в E.coli.

сахаро-фосфатного остатка. Образованный в результате фосфоролитичес-кого расщепления нуклеозида рибозо-1-фосфат и дезоксирибоэо-1-фосфат превращается в соответствующий пентозо-5-фосфат на основе реакции, катализируемой фосфопентомутазой (DeoB). Рибозо-5-фосфат поступает непосредственно в пентозный цикл бактерий, а деэоксирибозо-5-фосфат под воздействием деэоксирибоальдолаэы (DeoC) расщепляется до ацетальдегида и глицеральдегид-3-фосфата, являющихся источником углерода для клеток E.coli (Neuhard 3. et al., 1983). Следует отметить тот факт, что в катаболизме дезоксирибонуклеозидов принимают участие только ферменты DeoA и DeoC, тогда как ферменты пуриннуклеозидфосфорилаза (DeoD) и DeoB проявляют неспецифичность по отношению к углеводному остатку молекулы нуклеозида, обеспечивая одновременно превращение как дезокси-, так и рибонуклеоэидов. Для UDP показано, что данный фермент участвует в катаболизме уридина, одновременно проявляя низкое сродство к дез-оксиуридину и его производным (Krenitsky Т.А., 1976). Все гены, ответственные за биосинтез ферментов катаболизма нуклеоэндов, идентифицированы, охарактеризованы и картированы.

Гены, кодирующие ферменты катаболизма и транспорта нуклеоэидов, регулируются с участием белков репрессоров CytR и DeoR, а также активирующего комплекса cAMP-CRP. В зависимости от того, какой из репрессоров контролирует биосинтез ферментов катаболизма нуклеоэидов, вышеперечисленные гены входят в состав СуtR-регулона, или DeoR-рвгулона. Г) то время как CytR-регулон объединяет все гены катаболизма и транспорта нуклеоэидов, к DeoR-рвгулону относятся deo-onepoH и гены nupG, tsx (Burton К., 1983; Mygind В. et al., 1975). Характерная особенность CytR-регулируемых промоторов состоит в том, что для их эффективной транскрипции необходим комплекс cAMP-CRP, тогда как DeoR-регулируемые промоторы являются CRP-независимыми (Valentin-Hansen Р., 1985).

Участие активирующего комплекса cAMP-CRP в экспрессии генов катаболизма нуклеоэидов определяет подверженность промотор-операторных участков данных генов катаболитной репрессии.

Таким образом, благодаря наличию в клетках E.coli ферментативной системы катаболизма нуклеоэидов, бактериальные клетки приобретают способность расти на минимальной среде с нуклеозидами в качестве единственного источника углерода. Множественная регуляция генов катаболизма нуклеоэидов с участием белков-репрессоров (CytR, DeoR) и активирующего комплекса cAMP-CRP, а также катаболитчувствительность промоторного участка этих генов, позволяет осуществлять эффективный биосинтез ферментов катаболизма нуклеоэидов в условиях углеродного "голодания" бактериальных клеток E.coli.

VI.2. Уридинфосфорилаза и тимидинфосфорилаза в опухолевых клетках.

В литературе отмечено резкое возрастание уридинфосфорилазной активности в клетках злокачественных опухолей (ligo М. et ai., 1990),

что вызывает деградацию таких агентов, как 5-фторуридин и 5-фтор-2'-дезоксиуридин (Martin D.S. et ai., 1989) и ведет к снижению терапевтического действия данных соединений. Высказано также предположение (Yoshimura A. et ai., 1990), что тимидинфосфорилаза играет существенную роль в пролиферации и (или) дифференциации лейкоцитов, а также в пролиферации опухолевых клеток.

Сравнительно недавно открыт также еще один фактор (фактор роста эндотелиальных клеток, PD-ECGF), который стимулирует ангиогенез in vi vo. Наиболее удивительным оказался тот факт, что данный белок обладав ярко выраженной тимидинфосфорилаэной активностью и его аминокислотная последовательность имеет высокую гомологию с тимидинфосфорилазой из Е coli (Usuki К. et ai., 1992; Miyazono К. et al., 1991).

В настоящее время данный фактор активно изучается с целью поиска его эффективного ингибитора. Т.о., наличие в опухолевых клетках увели ченного количества уридинфосфорилаэы и тимидинфосфорилазы, возможно, определяется не только потребностью этих клеток в интенсивном питании при активной пролиферации, но и выполнением других, пока невыясненных функций в развитии как злокачественной клетки, так и опухоли в целом.

В связи с этим большой интерес представляет создание синтетически ингибиторов этих ферментов. Знание структурно-функциональной организа ции и механизма действия ферментов фосфоролиза пиримидинов позволит существенно облегчить решение подобной задачи. Именно это и определяв актуальность изучения структурно-функциональных отношений в уридинфос форилазе из E.coli, как аналога уридинфосфорилаэы из опухолевых клеток .

VI.3. Конструирование экспрессионных векторов и создание штаммов-продуцентов ферментов катаболизна нуклеоэидов.

Сравнительно нсдиинс определена полная нуклеотидная последовательность регуляторной и структурной области гена udp и получена аминокислотная последовательность уридинфосфорилаэы из Е. coli, состоящей из 253 аминокислотных остатков (Walton L. et ai., 1989).

Ген udp был клонирован в составе гибридной плазмиды pUD7 (Брикун И.А. с соавт., 1989) и обнаружен высокий уровень накопления уридинфосфорилаэы в клетках E.coli. Плазмида pUD7 содержала фрагмент ДНК размером 3200 п.н., состоящий из гена udp (921 п.н.) и участка хромосомы E.coli (2279 п.н.), локализованного в дисталыюй области данного гена.

Мы провели субклонирование строго гена udp с гибридной плазмиды pUD7 на мультикопийный вектор pUC18. Схема клонирования гена udp представлена на рис.32.

Плазмидой pUUDP трансформировали штамм E.coli С600* F'(thi thr leu Дрго-lac Amet-udp recA ), любезно предоставленный д.б.н. А.С.Мироновым (Гос.НИИгенетика). Уровень биосинтеза уридинфосфорилаэы анализировали денатурирующим ПААГ-электрофорезом (рис.33,В,трек 3). Анализ белкового

ВопН 1

Soc

Ар

t) SttlG 1

UDP

Soc 1

BonHl

PCR

BonHl

SaiGl

ф Pudp ф

Рестрикция

•A^udp f SülGl

R

ОП

ОГ1

Рис.32. Схема конструирования рекомбинаитных экспрессионных векторов pUU18 и pUUDP.

профиля штамма С600*, содержащего мультикопийную плаэмиду pUUDP, выявил высокий уровень биосинтеза UDP. На основе измерения активности уридинфосфорилаэы в бесклеточном экстракте данного штамма было определено, что количество уридинфосфорилаэы в клетке составляет 48% от суммарных общеклеточных белков и соответствует 0,4 г фермента на 1 л культуралыюй жидкости.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов получена ре-комбинантная плазмида, обеспечивающая высокий уровень биосинтеза уридинфосфорилаэы в клетках E.coli. Высокий уровень биосинтеза данного белка может быть вызван особенностью катаболитчунствительного промотор-операторного участка регуляторной области гена udp, клонированного в составе мультикопийной плазмиды.

Для проверки этого предположения проведен ряд экспериментов по конструированию экспрессионных векторов на основе мультикопийной плазмиды - pUU18, позволяющих исследовать эффективность биосинтеза других белков под контролем регуляторной области гена udp.

Первоначально в качестве такого объекта был избран ген тимидинфос-форилазы (deoA) из E.coli (рис.31). Создание гибридного гена (структурная область гена deoA под контролем регуляторной области гена udp) позволяло исследовать роль PU(jp в эффективной транскрипции и трансляции тимидинфосфорилазы. Помимо этого, способность данного фермента участвовать в обратимом фосфоролизе тимидина и других пиримидин 2'-де-зоксинуклеозидов давала возможность использовать штамм-продуцент тими-

динфосфорилазы в инженерной энзимологии для получения аналогов дезок-сипиримидинов, необходимых в химиотерапии онкологических заболеваний.

Таблица 11. Синтетические олигодезоксирибонуклеотиды, использованные в работе.

N п/п Структура опигонуклеотидое г- . Т fj n/n | Струитура опигомуклеогидов r j 3

О '

1 Sacl TTTrCACCTCCTGCAGAATCAAG 15 Val CAGCGCAGTCACACAT ГССАААТ

2 BamHI ТТТТССАТСССТССТСГСТСААТС 16 Vol AACCAGCCCAACCCTACAITCG

3 BamHI TTTTCCATCCATCTCCAACTCTC 17 CAArTCGCGCTfACATCCCACC

1 Sold & TTTTGICGACTTACACCACACG 19 Asp CATTAATATTCGGCTCAATACCG

5 BamHI M«t TTTTGGATCCATGTTGTTTCTCGC 19 Asp GG1GCGAAGTTCAGGCTCGC

6 SolCI & TTTTCTCCACTTATTCCCTCAT 20 Asp ACGCCAACGT TAGTTGTCCCG

7 atcgtaaaccttatcgtctoctc 21 Asp TTTTCACCGCATTGCTtlCCGTT

9 cctacacggcaaccgccgatacc 22 Asp CCTTTAAACTTACGAACTAC

9 S«r gataccggtagaggagaccataac 23 Asp TTTTGGATCCATGTCCAAGTCTGATGTTTTTAATCTCG

Ю. S«r ССАССССАСТССГАСАГТССААА ГС 24 SalGI & ТТГГСТССАСГГАГГССАТГТСАГ

11 Ser GGCCCTGACnCCACACATGGTC 25 BamHI AGGGGGATCCATGGCCATCGTCCCTG

12 Asp CACCGCAGTCCTATCTTCGAAA! 26 Sod ATAA TGACCTCGCTGATCGCACCG

13 ciy CCTACATTCCCCATCAGCCACA 27 SolGl CGGCAGTCGACTTAACCGAGAAGCAC

и Vol CCTACATTCGACATCACCGACA 28 BamHI AIGCATGGAICCCCCTCATAATCATC

Структурную часть гена тимидинфосфорилазы получали амплификацией фрагмента ДНК непосредственно с хромосомы штамма С600 (w.t.) (олиго-нуклеотиды 5 и 6, табл.11). Полученный фрагмент ДНК, содержащий структурную область гена deoA и фланкированный сайтами рестрикции BamHI и SalGI, клонировали в составе рекомбинантной плазмиды pUU18. Сконструированная плазмида получила название pUTPP (рис.33,А). Плазмидой pUTPP • трансформировали штамм E.coli АМ273 F'(thi thy Amet-udp AdeoA), любезно предоставленный д.б.н. А.С.Мироновым (Гос.НИИгенетика). Из отобранных клонов выделяли рекомбинантную плазмиду и наличие искусственно созданного гибридного гена Pudp"SjeoA подтверждали определением нукле-отидной последовательности клонированного фрагмента.

Исходя из литературных данных об удельной активности фермента

(Schwartz M., 1971) и измерения активности тимидинфосфорилазы в бесклеточном экстракте, было установлено, что тимидинфосфорилаза составила 49% от суммарных общеклеточных белков. Это коррелирует с данными денситометрии электрофоретического разделения суммарных клеточных белков штамма-продуцента (рис.33,В,4) и соответствует 0,6 г фермента на 1 л культуралыюй жидкости.

Однако, теперь вставал вопрос о том, является ли данное свойство присущим только промотор-операторной области гена udp. Для проверки этого предположения было предпринято конструирование мультикопийного вектора, содержащего ген еще одного фермента катаболизма нуклеози-дов - цитидиндеэаминазы.

Ген цитидиндеэаминазы принадлежит, также как и ген уридинфосфо-рилазы, к CytR-регулону. Регуляторные области генов, принадлежащих CytR-регулону E.coli не обладают значительными структурными гомологи-ями. Можно только отметить фрагменты нуклеотидных последовательностей, отвечающих эа связывание активирующего комплекса cAMP-CRP, причем, расположение этих сайтов относительно точки инициации транскрипции неодинаково практически во всех промоторах генов, принадлежащих к CytR-регулону (Holst В. et al., 1992). Поэтому исследование уровня экспрессии гена цитидиндеэаминазы, клонированного в составе мультикопийного вектора, представляло самостоятельный теоретический интерес.

Как и в случае тимидинфосфорилазы, конструирование экспрессионного вектора, содержащего ген цитидиндеэаминазы, проводили на основе амплификации (олигонуклеотиды 26, 27, табл.11) с хромосомы штамма С600 (w.t.) фрагмента ДНК, содержащего полнораэмерный ген цитидиндеэаминазы, и клонирования его в составе мультикопийного вектора pUCia.

В результате амплификации был получен фрагмент ДНК, содержащий промотор-операторную и структурную область гена cdd и фланкированный сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции SacI и SalGI, который клонировали в составе мультикопийного вектора pUC18,

Сконструированная плаэмида получила название pUCDD (рис.33,А). Для изучения экспрессии гена цитидиндеэаминазы, плаэмидой pUCDD трансформировали штамм Е. coli С600* . Уровень накопления цитидиндезаминаэи (рис.33,В,5) составил 48% от суммарных общеклеточных белков, что соответствует 0,6 г фермента на 1 л культуральной жидкости.

Аналогично описанным схемам, в составе мультикопийного вектора pUC18 клонирована кодирующая область гена уридинфосфорилазы под контролем промоторной области гена цитидиндезаминаэи (олигонуклеотиды 2б, 28 для накопления фрагмента ДНК промотор-операторного участка гена cdd и олигонуклеотиды 4,5,табл.11, для получения фрагмента ДНК, содержащего структурную область гена udp). Гибридная плаэмида pUCDP в штамме E.coli С600* вызывала аналогичный уровень накопления уридинфосфорилазы, что и плаэмида pUUDP с полноразмерным геном уридинфосфорилазы (рис.33,В,16).

ВатН1

5ас1 / рииОР \solGl I ЗбКЬр 1

Ар

Рсаа.

Рийр

ВотН1

ВотН1

Бас! / риСОО \solG1 5ос' ( РиТРР 15аЮ15ос|/ риСОР \ 5оЮ, 3775Ьр I Л А,8;ьР / \ Э602Ьр

оп Кл

Ар

Л4

8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 1516

— — — ««« тл 4

- • . _ ---

Рис.33. Конструкции экспрессионных плазмид (А) и электрофоретичес кое разделение белков общего лизата клеток Е-со11 (В): 1-- белки-маркеры (20.1, 30.0, 43.0, 67.0 кда). 2.-С600*. 3.-С600*(рШГОР). 4.-АМ2 7 3(риТРР). 5.-С600*(риСОЭ). 6.-С600*(р1Ш0РС65Б). 7.-С600* (рииОРС136Б). 8 .-С600* (рШЮР С206Б). 9.-С600*(ри1ЮРС65БС2063). Ю.-Сб00«(рииОРБ136О). 11.-С600*(рииОРР61-Р72). 12.-С600*(риГОР•, 1-198а.О.). 13.-СбОО*(рииОР',21-253а.О.).14.-С600*(рииОРС65Б,С703; 15.-С600*(рииОРСб5Б,С70С) . 1 б.-С600»(рЦСОР) .

Выводы.

Полученные в этом разделе работы результаты свидетельствуют о той, что, по-видимому, большинство промотор-операторных областей генов катаболизма нуклеозидов, подверженных позитивной регуляции комплексом сАМР-СИР, в составе мультикопийного вектора обеспечивают эффективную транскрипцию генов. Эти данные позволяют надеяться на создание новых эффективных штаммов-продуцентов различных белков, имеющих практическое значение. Таким образом, в результате проведенной работы сконструиро-

ван ряд экспрессионых векторов, обеспечивающих высокий уровень биосинтеза ферментов катаболизма нуклеоэидов (UDP, ТРР, CDD), а также гена эукариот (эглин С, см. главу IV). Получены штаммы-продуценты соответствующих белков, что позволяет целенаправленно проводить ферментативную конверсию нуклеоэидов, получая исходные соединения для синтеза антиметаболитов, имеющих практически важное значение при лечении онкологических заболеваний. Молекулярно-биологические основы механизма регуляции генов катаболизма нуклеоэидов в настоящее время изучаются в лаборатории .

VI.4. Исследование структурно-функциональных отношений в уридин-

фосфорилазе из E.coli методой олигонуклеотнд-направленного мутагенеза ДНК с применением PCR.

VI.4.1. общая характеристика уридинфосфорнлазы.

Конструирование высокоэффективного штамма-продуцента уридинфосфорилаэы позволило проводить исследование структурно-функциональной организации данного фермента.

Уридинфосфорилаза из E.coli, аминокислотная последовательность которой представлена ниже, - шестисубъединичный белок с молекулярной массой одной субъединицы 27,5 кДа (Cook W.3. et al., 1987).

10 20 30 40 50 60

MSKSDVFHLGLTKNDLQGATLAIVPGDPDRVEKIAALMDKPVKLASHREFTTWRAELDGK

70 80 9 0 100 110 120

PVIVCSTGIGGPSTSIAVEELAQLGIRTFLRIGTTGAIQPHINVGDVLVTTASVRLDGAS

130 140 150 160 170 180

LHFAPLEFPAVADFECTTALVEAAKSIGATTHVGVTASSDTFYPGQERYDTYSGRVVRHF

190 200 210 220 230 240

KGSMEEWQAMGVMNYEMESATLLTMCASQGLRAGMVAGVIVNRTQQEIPNAETMKQTESH

250

AVKIVVEAARRLL

Рис.34. Аминокислотная последовательность уридинфосфорилаэы из

E.coli.

Реакция, катализируемая данным ферментом - обратимое фосфоролити-<еское расщепление уридина до урацила и рибозо-1-фосфата - представле-ia на рис.31. Аминокислотная последовательность не содержит ярко выра-кенных кластеров заряженных и гидрофобных аминокислот. Обращает на се-5я внимание высокое содержание остатков аланина, глицина и валина (до 10% на субъединицу), что может обуславливать конформационную "подвиж-юсть" полипептидной цепи UDP. В молекуле уридинфосфорилаэы локализо-тны три цистеиновых остатка: С65, Cl36 и С206.

В связи с отсутствием на период выполнения исследования данных о

третичной структуре уридинфосфорилазы, роль отдельных а.о. и участкос полипептидной цепи в функционировании фермента выясняли на основе конструирования и изучения ферментативной активности мутантных форм UDP.

VI.4.2. Введение спонтанных мутаций в ген udp с использованием хи

ннческого мутагенеза.

Начальный этап работы заключался в получении статистического набс ра мутантов UDP, анализ которых позволял в дальнейшем проводить целенаправленные аминокислотные замены в ферменте.

В литературе описаны различные способы получения спонтанных мутан тов, связанные с использованием жесткого УФ-облучения клеток E.coli, культивирования бактериальных клеток на питательных средах в присутствии мутагенов: нитроэогуанидина, гидроксиламина, этилметансульфоната и др. (Freese Е.В., 1961; Tessman I. et al., 1967;). Помимо этого, описаны способы отбора мутантов E.coli со сниженной активностью ферментов катаболизма нуклеозидов, в том числе дефектных по уридинфосфо-рилазе, на селективной среде, содержащей 5-фтор-2'-дезоксиуридин (FUDR) (Karlstrom О., 1967) или 5-фторурацил в присутствии дезоксири-бозо-1-фосфата.

Однако, применение этих методов для получения клонов, мутантных п уридинфосфорилаэе, не исключает возможности возникновения спонтанных мутаций в промотор-операторной области гена udp, что, в свою очередь, создает дополнительные трудности в отборе целевых мутантных форм уридинфосфорилазы с видоизмененной последовательностью структурной облас ти гена. В связи с этим, в работе мы использовали селективный мутаген - бисульфит натрия (Stewart A.G. et al., 1987; Петренко В.А. с соавт. 1987), применение которого in vitro на фрагменте ДНК, содержащем толь

в регуляторную область данного гена.

Действие бисульфита натрия основано на дезаминировании цитидина д урацила, следствием чего является специфическая транзиция в молекуле ДНК G:C пары на А:Т пару. Наиболее эффективная химическая модификация гена in vitro, при применении бисульфита натрия, происходит в случае использования однонитевой ДНК. С этой целью, при помощи асимметричной амплификации (олигонуклеотиды 3 и 4, табл.11) с плазмиды pUUDP нараба тывали одноцепочечный фагмент ДНК, содержащий структурную область ген. udp. Однонитевую ДНК обрабатывали бисульфитом натрия, повторно ампли-фицировали до двунитевого фрагмента и клонировали в составе плазмиды pUUl8 под контролем регуляторной области гена udp. Повторная амплификация фрагмента ДНК, обработанного бисульфитом натрия, позволяла избе жать мутаций как в последовательности ДНК, несущей сайты узнавания эн-донуклеаз рестрикции, так и в первых N-концевых кодонах уридинфосфорилазы, которые могли бы нарушить как транскрипцию, так и трансляцию

гена. Кроме того, примененный подход практически исключал возможность введения спонтанных мутаций в промотор-операторной области гена udp.

Полученной лигаэной смесью трансформировали штамм E.coli АМ273 и бактериальные клетки рассевали на селективной среде, содержащей 5-фтор-2'-деэоксиуридин. Реципиентныи штамм АМ273 несет на хромосоме протяженные делеции, захватывающие гены udp и deoA, что позволяет клеткам в присутствии тимидина расти на среде, содержащей FUDR. В слу-чае'наличия интактного гена udp на плазмиде, обеспечивающей биосинтез нативной уридинфосфорилазы, происходит расщепление 5-фтор-2'-дезоксиу-ридина до 5-фторурацила и дезоксирибозо-1-фосфата, что приводит к включению 5-фторурацила в структуру рибонуклеиновых кислот, необратимому нарушению их функций и, соответственно, гибели бактериальных клеток. Очевидно, что экспрессия мутантной UDP со сниженной активностью или потерявшей способность к деградации FUDR, будет в первом случае замедлять, а во втором случае не повлияет на рост клеток. В соответствии с этим на селективной среде отбирали клоны с нормальной и умеренной скоростью роста. Из отобранных мутантных клонов выделяли плаэмиды и на основе определения полной нуклеотидной последовательности гена udp были локализованы следующие аминокислотные замены: точечные мутации A19R, Н179Т, I228S И двойные замены T138V Е142К, C65S G70S (табл.12).

Таким образом, использование химической модификации ДНК in uitro с дальнейшим отбором бактериальных клеток in vivo дало возможность провести эффективный мутагенез и получить ряд мутантных форм одного из ферментов катаболизма нуклеозидов - уридинфосфорилазы E.coli. Изучение ферментативной активности полученных спонтанных мутантов UDP позволило в дальнейшем проводить целенаправленное исследование роли отдельных аминокислот и участков полипептидной цепи в функционировании уридинфосфорилазы .

VI.4.3. Поиск фосфат-связывающей области в уридинфосфорилазе (петля Россмана).

Т.к. фермент осуществляет обратимый фосфоролиз нуклеоэида, первоначальный интерес представляла локализация центра связывания иона фосфата в молекуле уридинфосфорилазы. Из литературных данных известно, что во многих фосфорилсвязывающих белках присоединение иона фосфата осуществляется в характерном центре, обозначенном как петля Россмана. Классическая структура петли Россмана представляет собой последовательность аминокислот, образующую ßüßttß-звено. Участие петли Россмана в связывании иона фосфата может быть объяснено тем фактом, что петля имеет конформационное жесткое основание и сана по себе может проявлять подвижность, не нарушая структуру белка в целом. В связывании иона фосфата участвуют различные участки структуры петли Россмана (Webb L.E. et al., 1973; Rossmann M.G. et ai., 1971). В случае глутатионре-

дуктазы и триоэофосфатизомеразы фосфат-ион расположен у остова описан ной петли. Участие карбоксильного конца (5-листа и следующей за ним

Таблица 12. Ферментативная активность уридинфосфорилазы из E.coli и ее мутантных форм.

N мутанта Аминокислотные замены Активность UDP *

UDP _ 100

1. C136D -

2. Р61-Р72 -

3. C65S

G70S -

4 . C65S

G70C -

5. C65S 100

6. C136S *

7. C206S -

8. C65S

C206S -

9. 1-198 а.о. -

10. F134V 50

11. F134G -

12. T137V 100

13. T138V 70

14. T138V

Е142К -

15. A19R -

16. Н179Т 100

17. I228S -

18. H47N 100

19. H101N 100

20. H122N 40

21. H152N 100

22. H8N -

23 . H179N 100

24. H240N 100

25. 21-253 а.о. *

Примечание. За 1ед. активности фермента принято такое его количество, которое расщепляет 1мкм уридина за 1мин при 37°С. За 100% принята удельная ферментативная активность 1ШР дикого типа, составлявшая в экспериментах 130ед/мг. Прочерки в таблице обозначают отсутствие ферментативной активности 1ШР, а * - отсутствие биосинтеза белка.

И-спирали в удержании фосфат-иона может быть объяснено выгодным электростатическим взаимодействием между отрицательным зарядом фосфатной группы и диполем <Х-спирали (Но1 М.С.Э. еЬ а1., 1978), который возникает при наложении диполей водородных связей.

Однако, на основе данных по связыванию иона фосфата участком полипептидной цепи, формирующей петлю Россмана, было показано, что обычно

в фосфат-связывающих белках отсутствует классическая структура петли. В подобных белках чаще встречается вырожденная структура петли Россмана, характеризующаяся наличием остатков пролина, определяющих поворот полипептидной цепи и участвующих в формировании петли. Помимо этого, вырожденная петля Россмана содержит последовательность аминокислот, богатую остатками глицина, которые обеспечивают конформационную подвижность цепи. В частности, в аденилаткиназе свиньи фосфат-связывающая пе'тля имеет в своем составе последовательность G-P-G-S-G-K-G (Heil А.F. et al., 1974). На основе рентгеноструктурного анализа данного белка показано, что наличие глицинов позволяет претерпевать значительное смещение петли при переходе аденилаткиназы из одного конформацион-ного состояния в другое. В глицеральдегид-3-фосфатдегидрогенаэе и ал-когольдегидрогеназе участок вырожденной петли Россмана представляет последовательность аминокислот, состоящую из G-R-I-G-R-L-V (Dayhoff М.О., 1976) и G-L-G-C-V-G (Edwards M.S. et al., 1987; Ефимов A.B., 1986), соответственно. Несмотря на то, что обозначенная аминокислотная последовательность данных белков не обнаруживает строгой гомологии, данные структуры формируют ßdß-звено, характерное для петли Россмана, и участвуют в связывании иона фосфата.

В литературе приведены данные по третичной структуре некоторых из ферментов катаболизма нуклеозидов: тимидинфосфорилаэы E.coli (Walter M.R. et al., 1990) и пуриннуклеозидфосфорилаэы из эритроцитов человека (Ealick S.E. et al., 1990). На основе рентгеноструктурного анализа тимидинфосфорилаэы показано, что ион фосфата локализуется вблизи петли, образованной между двумя последовательными ß-структурами, захватывающими (1-спирализованный участок полипептидной цепи. Структура петли представлена следующей аминокислотной последовательностью: S-T-G-G-V-G. Ион фосфата располагается асимметрично по отношению к центру данной петли, и в его связывании задействованы аминокислоты из центральной ОС-спирали и приближенного ß-листа. В целом, структура петли сохраняет мотив описанного звена петли Россмана, однако, также не является его классическим представителем.

Аналогично тимидинфосфорилазе, в молекуле пуриннуклеозидфосфорилаэы также выявлена вырожденная структура петли Россмана. Показано, что фосфат-ион локализуется между двумя антипараллельными ß-структурами около короткого СС-спирализованного участка полипептидной цепи, однако, аминокислоты, участвующие в связывании фосфата рассредоточены на близлежащих CC/ß-структурированных участках полипептида.

Анализ аминокислотной последовательности уридинфосфорилазы, а также литературные данные по фосфат-свяэывающим белкам позволили выявить участок полипептидной цепи UDP между остатками Р61-Р72, предположительно ответственный за формирование структуры петли Россмана. Аналогично описанным последовательностям, данный участок также фланкирован остатками пролина, определяющими поворот полипептидной цепи, и обога-

щен остатками глицина, обеспечивающими конформационную подвижность петли.

Исследование роли участка Р61-Р72 в функционировании уридинфосфо-рилазы проводили при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Вариант проведения сканирующего мутагенеза аминокислот (см. главу I), участвующих в формировании петли, связан с большой трудоемкостью процесса и, одновременно с этим, не позволял исследовать участие полноразмерного фрагмента полипептидной цепи (Р61-Р72) в связывании иона фосфата.

В связи с этим, мы разработали новый подход в реконструкции ДНК и проведении олигонуклеотид-направленного мутагенеза на основе полиме-разной цепной реакции. Подход основывался на следующем: как известно, инсерция одной или двух пар нуклеотидов в любом участке структурной области гена приводит к нарушению рамки считывания. В случае, если через определенное количество нуклеотидов ввести делецию такого же количества нуклеотидных пар, происходит восстановление рамки считывания и, соответственно, видоизменение структуры триплетных кодонов, что приводит к полной замене аминокислотной последовательности данного участка полипептидной цепи. Очевидно, что выбор места введения инсерции/деле-ции в нуклеотидной последовательности гена (кодирующей или комплементарной цепи ДНК), а также количество введенных нуклеотидов (один или два нуклеотида) определяют последующий аминокислотный состав видоизмененного полипептидного участка белка. Предварительный расчет структуры реконструированного фрагмента ДНК позволяет предопределить аминокислотную последовательность мутантного полипептида.

Для реализации предложенного подхода при проведении олигонуклеотид-направленного мутагенеза области полипептидной цепи Р61-Р72 ури-динфосфорилазы использовали олигонуклеотиды 7 и 8 (табл.11). Олигонук-леотид 7 вносил делецию двух нуклеотидов (СТ) псяссредстЕекко за трип-летным кодоном Р61, а олигонуклеотид 8 - инсерцию такого же количества нуклеотидных пар (АА), не затрагивающих кодон Р72. Анализ данного участка ДНК при помощи пакета программ "ОМА-Бип", показал, что именно делеция двух нуклеотидов в кодирующей цепи и инсерция АА-пары в комплементарной цепи ДНК позволяет произвести запланированную замену аминокислотной последовательности участка Р61-Р72, а также предотвращает возникновение кодона терминации трансляции. Важно отметить, что при проведении такой реконструкции мы не затрагивали кодоны Р61 и Р72, определяющих поворот полипептидной цепи. Разработанный подход реконструкции ДНК на основе олигонуклеотид-направленного мутагенеза позволил получить мутантную уридинфосфорилазу с заранее рассчитанной аминокислотной заменой протяженного участка полипептидной цепи Р61-Р72. Мутагенез данного района был направлен на существенное изменение состава петли - замену гидрофобных аминокислот, которыми обогащен участок, на гидрофильные:

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 KPVIVCSTGIGGPS 5'...AAACCTGTTATCGTCTGCTCTACCGGTATCGGCGGCCCGTCT...3'

Дикий ТИП UDP

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 KPYRLLYRYRRFPS

Мутантный

5'...AAACCTTATCGTCTGCTCTACCGGTATCGGCGGTTCCCGTCT...3' тип UDP

»

На первой стадии PCR ген udp, клонированный в составе плазниды pUUDP, амплифицировали при помощи олигонуклеотидов 7 и 8. Амплифициро-ванный фрагмент ДНК, содержащий реконструированную область Р61-Р72, использовали в качестве полинуклеотидного праймера на последующей стадии PCR, при амплификации проксимального (совместно с "реверсивным" праймером) и дистального (совместно с "универсальным" праймером) участка гена udp. Полученные на второй стадии участки ДНК содержали гомологичную нуклеотидную последовательность, что позволяло проводить их совместную амплификацию до полноразмерного гена udp.

Сконструированный по этой схеме ген уридинфосфорилазы с видоизмененной последовательностью участка Р61-Р72 клонировали в составе плаз-миды pUCl8. После отбора рекомбинантных клонов и анализа нуклеотидной последовательности гена udp в составе гибридной плазмиды, экспрессию мутантной формы уридинфосфорилазы изучали в штамме E.coli С600". Уровень биосинтеза мутантной формы UDP практически полностью совпадал с уровнем экспрессии дикой аллели гена udp (рис.33), однако активностью фермент не обладал (табл.12).

Отсутствие активности мутанта 2 (табл.12) с локальной заменой гидрофобных аминокислот на гидрофильные в области Р61-Р72, вероятно, свидетельствует об изменении структуры петли Россмана, следствием чего и является потеря ферментативной активности уридинфосфорилазы. Подтверждением значимости исследуемой области также является изменение ферментативных свойств UDP при введении дополнительных одиночных мутаций в данной области. Так, мутантная форма уридинфосфорилазы с заменой аминокислот C65S G70S (табл.12), полученная химической модификацией структурной области гена udp in nitro, также не обладала активностью.

Таким образом, анализ мутантов уридинфосфорилазы с точечными заменами аминокислот внутри предполагаемой петли Россмана (мутант 3) и локальной мутацией области Р61-Р72 (мутант 2) указывает на то, что фрагмент полипептидной цепи Р61-Р72 выполняет важную роль в функционировании молекулы, вероятно, отвечая за связывание иона фосфата.

VI.4.4. Изучение роли цистеинов в функционировании уридинфосфорилазы.

Особый интерес вызывало выяснение роли остатков цистеина в уридин-фосфорилаэе.

Как известно из литературы, цистеиновые остатки в белках могут выполнять различные функции, находясь в свободном (SH-группы) или в ко-валентносвязанном. состоянии (S-S связь). В олигомерных белках дисуль-фидные связи могут образоваться как внутри полипептидной цепи, так и между отдельными субъединицами, придавая стабильность структуре белка в целом. Примером внутримолекулярной дисульфидной связи может служить лейкоцитарный и фибробластный интерфероны человека (см. главу I).

В треониндезаминазе E.coli, димерном ферменте, SH-группы цистеинов участвуют в формировании межмолекулярных дисульфидных связей, тем самим стабилизируя активную конформацию ассоциированных белковых субъединиц (Hatfield G.W. et ai., 1970).

Существуют белки, в которых цистеин не образует ни внутри-, ни межмолекулярных дисульфидных связей, однако, находясь в активном центре фермента, непосредственно участвует в катализе. Типичными представителями подобных белков являются папаин и глицеральдегид-3-фосфатде-гидрогеназа (Wolfenden R. et ai., 1972; Mougin A. et ai., 1988). Из этого следует, что выяснение роли остатков цистеина является важной задачей при исследовании структурно-функциональной организации любого белка.

Как уже было сказано выше, в уридинфосфорилазе находятся три цис-теиновых остатка - С65, С136 и С206. Изучение роли цистеиновых остатков в молекуле UDP проводили на основе получения мутантных форм по данным остаткам. Мутагенез был направлен на замену остатков цистеина на серин. Такая замена обусловлена тем, что мутация цистеина на серин является наиболее вероятной заменой в эволюционном процессе развития белков (Dayhoff М.О., 1972). Мутагенез данных остатков цистеина проводили при помощи PCR. Нами была использована эффективная схема проведения мутагенеза, позволяющая конструировать мутантные белки с направленными точечными заменами аминокислот б любой области пслягссптиднс™ цепи. Схема проведения сайт-направленного мутагенеза при помощи PCR, на примере уридинфосфорилазы представлена на рис.35.

На первой стадии PCR проводили асимметричный синтез фрагмента гена udp для получения одноцепочечной ДНК, содержащей необходимую замену. Для этого, в реакционную смесь вводили олигонуклеотид, несущий запланированную замену (праймеры 9, 10, или 11, табл.11) и олигонуклеотид, комплементарный регуляторной области гена udp (праймер 1), в соотношении 1/100. Полученную однонитевую ДНК использовали на второй стадии PCR в виде полинуклеотида, совместно с дистальным праймером, комплементарным 3'-концевой области гена udp, для амплификации полноразмерного гена, содержащего требуемую мутацию. Использование в качестве ДНК-матрицы структурной области гена udp в составе фага M13tgl30 позволяло исключить возможность образования фрагментов ДНК, содержащих интактный ген уридинфосфорилазы, наличие которого существенно осложнило бы отбор целевых мутантных клонов. Это вызвано тем, что на второй

РгЭПО.П)

PL ÜDP з'-a_5't

э ———-J ss tg130-udp

5 Prl PCR1 ^

5'-л— 3'ss Prl-Pr9(10.11)

_5?ss tg130-Sudp

PCR3| Pr4

3- 1 -s- ds udP

4

Restriction, Cloning

Рис.35. Общая схема введения точечных мутаций в ДНК с использованием полимераэной цепной реакции.

стадии PCR, при наработке полнораэмерного мутантного гена, олигонукле-отид 1 не имеет комплементарной мишени на ДНК-матрице (т.к. отсутствует регуляторная область гена udp), что позволяет амплифицировать исключительно целевую мутантную ДНК. Амплифицированный полноразмерный ген udp с введенной заменой и фланкированный сайтами эндонуклеаз рестрикции SacI и SalGI, подвергали гидролизу соответствующими рестрикгазами и клонировали в составе плазмиды pUC18. После трансформации штамма С600* (несущего делецию гена udp на хромосоме) наличие запланированной замены в гене уридинфосфорилазы в отобранных рекомбинантных клонах подтверждали определением нуклеотидной последовательности.

Применение эффективного подхода проведения сайт-направленного мутагенеза позволило сконструировать ряд рекомбинантных плаэмид, содержащих мутантные гены udp с заменами C65S, C136S и C206S. Анализ профиля суммарных общеклеточных белков данного штамма (рис.33) показал, что введенные замены C65S и C206S в уридинфосфорилазе не сказываются на уровне экспрессии данного гена: мутантные формы уридинфосфорилазы экс-прессировались на уровне дикой аллели гена udp. При этом мутация C65S (мутант 5) не влияет на активность UDP, в то время как замена C206S (мутант 7) приводит к полному отсутствию ферментативной активности уридинфосфорилазы (табл.12).

Особый интерес представляла мутация C136S. Оказалось, что введение данной замены приводит к полной потере биосинтеза уридинфосфорилазы, что может быть обусловлено деградацией белка с существенно нарушенной третичной структурой под действием протеиназ E.coli.

Отсутствие биосинтеза уридинфосфорилазы при введении замены C136S

предопределило конструирование мутантной UDP, несущей двойную мутацию C65S C206S (мутант 8) на фоне дикой аллели С136. Уровень биосинтеза у полученного мутанта уридинфосфорилазы был практически идентичен уровню биосинтеза интактного белка, но, как и следовало ожидать (по аналогии с мутантом C206S), белок ферментативной активностью не обладал (табл.12). Наличие биосинтеза уридинфосфорилазы у мутантов 5, 7 и 8 свидетельствовало об отсутствии структурирующих дисульфидных связей между остатками цистеинов С65, Cl36 и С206 внутри субъединицы фермента. Однако, оставался открытым вопрос о наличии межмолекулярной ди-сульфидной связи, в образовании которой может принимать участие С136.

Для проверки этой гипотезы, на основе вышеописанной схемы мутагенеза, мы провели замену в мутанте 6 (C136S) остатка серина 136 на ас-парагиновую кислоту. Данная аминокислота выбрана, как аминокислота, содержащая боковой радикал, по размеру наиболее схожий с боковым радикалом остатка цистеина, и несущий отрицательный заряд, как и тиоль-ная группа цистеина.

В результате проведенного мутагенеза биосинтез уридинфосфорилазы, нарушенный заменой C136S, был полностью восстановлен (рис.33). Несмотря на то, что сконструированная мутантная форма UDP, несущая замену C136D, не подвергалась, в отличие от мутанта C136S, протеолизу, ферментативной активностью белок не обладал (мутант 1, табл.12), что могло указывать на важную структурно-функциональную роль как Cl36, так и всего участка, окружающего эту аминокислоту.

Восстановление биосинтеза уридинфосфорилазы заменой C136D, свидетельствовало об отсутствии межсубъединичной дисульфидной связи в молекуле фермента, в формировании которого потенциально мог участвовать цистеин 136. Помимо этого, способность аспарагиновой кислоты, благодаря наличию отрицательно заряженного бокового радикала, образовывать ионную связь, позволяла предположить, что Cl 36 участвует в формировании внутримолекулярного солевого мостика с остатком аминокислоты, несущей положительный заряд. Аминокислотами, способными участвовать во взаимодействиях подобного рода могут быть аргинин, лизин или гистидин.

VI.4.5. Изучение роли аминокислот, окружающих С136, в проявлении

ферментативной активности уридинфосфорилазы.

Ключевая роль С136, возможно, не ограничивается только структурной функцией данной аминокислоты в формировании солевого мостика в пределах субъединицы уридинфосфорилазы. Вероятно, Cl36 несет определенную функциональную роль, образуя связь, формирующую участок полипептидной цепи, принимающий участие в связывании субстрата или в осуществлении межсубъединичного контакта. В частности, на основе рентгеноструктурно-го анализа одного из ферментов катаболизма нуклеозидов - пуриннуклео-эидфосфорилаэы исследована роль отдельных аминокислот в функционировании белка (Ealick S.E. et ai., 1990). Оказалось, что из четырех цисте-

инов, только С31 находится в непосредственной близости от активного центра фермента. При этом, несмотря на то, что данный цистеин локализуется за пределами активного центра пуриннуклеозидфосфорилазы, он участвует в стабилизации конформации центра связывания нуклеозида.

В случае, если С136 в уридинфосфорилаэе выполняет аналогичную роль в формировании активного центра фермента, то локальное изменение конформации участка полипептидной цепи должно оказать влияние на ферментативную активность белка. Такого рода изменения в конформации могут быть внесены заменами близлежащих к С136 аминокислот, боковые радикалы которых схожи или существенно отличаются от исходных. Решение подобной задачи во многом зависит от правильности Выбора заменяющего а.о.

Участок полипептидной цепи, окружающий С136, представлен следующими аминокислотными остатками:

130 132 134 136 138 140 142 ...АУАОГЕСТТАЬУЕА ...

Обращает на себя внимание наличие гидрофобного ароматического остатка П34 и последующих за С136 двух остатков треонина, замены которых могут привести к достаточно выраженным изменениям в пространственном расположении остатка цистеина. В случае замены Г134 нами были выбраны остатки глицина и валина. Остаток глицина не содержит бокового радикала и, несмотря на вносимую им дополнительную конформационную свободу исследуемого участка, не может имитировать фенилаланин. В отличие от глицина, остаток валина обладает достаточно гидрофобным боковым радикалом, затормаживающим конформационные переходы участка полипептидной цепи, но в большей степени, чем глицин, имитирующим боковой радикал фенилаланина. В качестве аминокислот, заменяющих остатки Т137 и Т138, мы выбрали остаток валина. Такая замена была обусловлена близостью строения боковых радикалов этих аминокислот. Существенным различием в строении треонина и валина является отсутствие у последнего гидроксильной группы в составе бокового радикала, которая, в случае треонина, способна образовывать водородные связи, стабилизирующие структуру данного участка полипептидной цепи. Разрушение такого рода водородных связей может приводить к локальному нарушению конформации фрагмента белковой молекулы, что также должно неизбежно сказаться на пространственном расположении остатка цистеина 136.

Действительно, проведенные замены привели, в случае мутации П34С (мутант 11), к полной потере ферментативной активности уридинфосфори-лазы, в отличие от замены П34\/ (мутант 10), приводящей только к снижению активности белка.

Особый интерес представляли мутанты Т137У и Т138\/, у которых ферментативная активность составляла 100% (мутант 12) и 70% (мутант 13). Неравноценность изменения ферментативной активности при введении выше-

описанных мутаций подчеркивает важность конформации исследуемого участка в формировании активной белковой молекулы. Эти данные подтверждаются мутациями T138V Е142К (мутант 14), полученными в ходе про веденной нами химической модификации структурной части гена udp.

Таким образом, анализ сканирующих мутаций вокруг С136 указывает важную структурно-функциональную роль этого аминокислотного остатка формировании и поддержании активной формы уридинфосфорилазы из E.col

VI.4.6. Изучение роли гистидинов в функционировании уридинфосфор

лазы.

Изучение структурно-функциональной роли участка полипептидной це уридинфосфорилазы, содержащей С136, позволило продолжить исследовани отдельных аминокислот, способных катализировать ферментативную реакц превращения уридина. Особый интерес в этом аспекте представляло иссл дование роли гистидинов в функционировании уридинфосфорилазы.

Как известно, гистидин содержит имидазольный боковой радикал (рКа=б,0). При нейтральных значениях рН остаток данной аминокислоты сравнительно легко присоединяет ион водорода из раствора, или участв ет в передаче протона боковому радикалу близлежащей аминокислоты. В связи с этим, гистидин часто находится в активном центре фермента и выполняет важную роль при каталитическом превращении субстрата.

Помимо непосредственного участия гистидина в катализе, данная аи нокислота может играть важную роль в поддержании активного центра не которых белков, связывающих лиганды. В частности показано, что в ци-тохроме b5, Н39 и Н63 координируют симметричное расположение атома ж леза, а в пероксидазе хрена Н42 оказывает стабилизирующее действие н гем-содержащий белок (Urrutigoity М. et ai., 1991).

Следует отметить тот факт, что уридинфосфорилаза также являлась объектом, представляющим интерес в плане исследования функциональной значимости гистидинов в данном ферменте. Первоначальные попытки изуч ния роли гистидинов в UDP проводились при помощи химической модифика ции фермента. В работе (Drabikowska А.К. et ai., 1990) уридинфосфори лазу из E.coli подвергали селективной химической модификации с испол эованием диэтилпирокарбоната. Авторы показали, что модификации подве гаются три гистидиновых остатка на одну субъединицу уридинфосфорилаз При этом из трех модифицируемых остатков, только один защищается ури дином. На основе изучения активности модифицированных белков было та же показано, что только один из трех модифицируемых гистидинов важен для ферментативной активности UDP. Однако, авторам не удалось локали зовать ни один из этих аминокислотных остатков, включая функционально-значимый остаток гистидина. Следует отметить, что в аминокислотно последовательности UDP находится семь гистидинов. Отсутствие химичес кой модификации оставшихся четырех остатков гистидина из семи авторы обсуждению не подвергали.

Таким образом, способность остатка гистидина участвовать в переносе протона, находясь в составе активного центра различных ферментов, а также отсутствие данных по локализации функционально-значимых остатков гистидина в молекуле уридинфосфорилазы предопределило исследование роли остатка данной аминокислоты в функционировании 1ШР.

Исследование роли гистидинов в уридинфосфорилазе проводили при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза. В работе использовали олЛ-онуклеотиды 17-24 (табл.11), позволяющие вводить мутации Н8М, Н47Ы, Н101Н, Н122Ы, Н152Ы, Н179Ы и Н240Ы. Такая мутация является наиболее вероятной заменой в эволюционном процессе развития белков (Эау-1юГГ М.О., 1972). В связи с этим, введение аспарагина вместо гистидина в последовательность полипептидной цепи 1ЮР не должно было существенно нарушить структуру белка и, следовательно, на основе изучения ферментативной активности мутантных форм 1ЮР, позволяло локализовать функционально важный остаток гистидина.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез проводили по вышеописанной схеме введения точечных замен в последовательность гена (см. главу У1.4.4.). После отбора клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды с соответствующими заменами в гене исЗр, уровень биосинтеза мутантных форм уридинфосфорилазы анализировали в штамме С600* (рис.36). Анализ

12 3 4 5 6 7 8 У

— - «ОТ «ег1

Рис.36. Электрофоретический анализ экспрессии мутантных аллелей гена исЗр: 1. - белки-маркеры, 2. - штамм-реципиент, 3. - Н8М, 5. - Н101Ы, 6. - Н122М, 7. - Н152Ы, 8. - Н179Н, 9. - Н240Ы.

экспрессии мутантных генов исЗр, содержащих точечные замены Нвы, Н47Ы, Н1О1Л, Н122И, Н152И, Н179Ы, Н240Ы и Н179Т (табл. 12), обнаружил, ЧТО биосинтез мутантных форм уридинфосфорилазы осуществляется на уровне биосинтеза 1ШР дикого типа. Исследование ферментативной активности сконструированных мутантов показало, что замены Н47Н, Н101М, Н152Ы, 1179М, Н240Ы, а также Н179Т (получен мутагенезом бисульфитом натрия),

не сказались на активности уридинфосфорилазы. Что же касается замены H122N, то фермент обладал остаточной 40% активностью по сравнению с уридинфосфорилазой дикого типа. В то же время замена H8N полностью инактивировала фермент.

Как и следовало ожидать, введение аспарагина вместо гистидина не повлияло на структурную организацию уридинфосфорилазы, о чем свидетельствует наличие высокого уровня биосинтеза мутантных форм белка. Помимо этого, наличие 100% активности у мутантов, содержащих замены H47N, H101N, H152N, H179N, H240N и Н179Т указывает на то, что данные остатки гистидина, по видимому, не оказывают влияния на функционирова ние уридинфосфорилазы. В этом аспекте особый интерес представляет мутант H122N, обладавший сниженной активностью. Полученные нами данные давали возможность предположить, что 11122, так же, как и а.о., окружа ющие С136, выполняют важную функциональную роль в поддержании активно! формы уридинфосфорилазы. Анализ наших результатов указывает на их соответствие данным (Drabikowska А.К. et al., 1990) и, более того, позволяют локализовать функционально-значимые остатки гистидина Н8 и Н122, как аминокислот, участвующих в формировании активной молекулы уридинфосфорилазы.

Таким образом, исследование роли остатков гистидина в уридинфосфо рилазе позволило локализовать функционально-значимый остаток Н122 и трактовать Н8 как аминокислотный остаток, принимающий непосредственно! участие в формировании активного центра фермента. Выявление роли гис-тидинов в функционировании уридинфосфорилазы позволило продолжить исс ледование структурно-функциональных отношений в данном ферменте, кото рое в дальнейшем было направлено на изучение участия N- и С-концевых областей UDP в формировании активной мультимерной формы белка.

VI,4Л, Изучение роли К- и с—концевых областей уридинфосфорилазы i

функционировании белка.

Первоначальное исследование свойств уридинфосфорилазы, описанное i литературе (Mclvor R.S. et al., 1983; Saunders P.P. et al., 1969; Kou-ni M.H. et al., 1988), указывает на то, что фермент, выделенный из разных источников, имеет различные характеристики. В частности, существуют некоторые различия в описании молекулярного веса и четвертичного строения UDP. Предполагалось, что уридинфосфорилаза из штамма E.coli В состоит из четырех идентичных субъединиц с молекулярным весос 29кДа (Vita A. et al.,1986), также как и уридинфосфорилаза, выделенна? из печени крысы, хотя молекулярный вес субъединицы последней, составляет 26 кДа. Также известно, что уридинфосфорилаза из Lactobacillus casei является четырехсубъединичным белком с молекулярным весом субъединицы 20 кДа (Avraham Y. et al., 1990). Исключение в этом ряду составляет уридинфосфорилаза из Giardia lambíia, в котором данный фермент существует в виде мономера (40 кДа), несущего как тнмидинфосфорилаз-

ную, так и уридинфосфорилаэную активность (Choy Soong Lee et al., 1988). Что касается уридинфосфорилазы из других источников, то молекулярный вес фермента находится в пределах 56-78 кДа .

Для уридинфосфорилазы из штамма E.coli К-12, первоначально было показано, что данный фермент содержит восемь идентичных субъединиц с молекулярным весом мономера 22 кДа (Leer J.С. et al., 1977). В дальнейшее Cook W.J.(1987) с соавторами опровергли эти результаты и показали, что уридинфосфорилаза как из штамма E.coli В, так и из E.coli К12 является шестисубъединичным белком с молекулярным весом одной субъединицы 27,5 кДа.

Эти данные подтвердились изучением четвертичной структуры уридинфосфорилазы из E.coli Kl2 при помощи электронной микроскопии. Оказалось, что шесть субъединиц фермента располагаются тримерами в двух слоях с осью симметрии третьего порядка (Mikhailov A.M. et al., 1992). Можно предположить, что подобная четвертичная структура олигомерного белка формируется с участием N- и С-концевых доменов при осуществлении межсубъединичного контакта. Представляло интерес исследование роли данных участков полипептидной цепи в структурировании нативной молекулы уридинфосфорилазы. На начальном этапе внимание было уделено структурно-функциональной роли С-концевой области уридинфосфорилазы в формировании мультимерной формы белка.

Мы разработали эффективный подход, который давал возможность в течение однократной реакции PCR и последующего субклонирования конструировать экспрессионные плаэмиды, содержащие делеции в заранее определенной С-концевой области гена. Практически одновременно с нами, такой подход введения С-концевых делеций был использован на примере гена, кодирующего эндонуклеаэу рестрикции FokI, для получения делеционних вариантов данного фермента (Li L. et al., 1993). Аналогично этой работе, разработанный нами метод заключался в использовании олигонуклеоти-да, комплементарного необходимому участку 3'-концевой области гена и несущего в своем составе триплетный кодон терминации трансляции, а также уникальный сайт рестрикции (например, сайт, с помощью которого осуществляли клонирование гена). При помощи такого олигонуклеотида, а также олигонуклеотида, комплементарного проксимальной части гена, возможна амплификация гена укороченного размера и дальнейшее его клонирование в составе экспрессионного вектора. Очевидно, что введенный "стоп"-кодон позволит завершить процесс трансляции мутантного белка в запланированном месте полипептидной цепи.

Схема проведения такого мутагенеза на примере уридинфосфорилазы представлена на рис.37. Отсутствие активности при введении замены C206S, на фоне высокого уровня биосинтеза мутанта 7, а также приведенные данные по четвертичной структуре уридинфосфорилазы, позволяли проводить направленный мутагенез для введения стоп-кодона трансляции по 198 аминокислоте, тем самим осуществляя делецию 55 С-концевых амино-

л TT SalG1

UDP ATT- PCR UDP' TAA

pUUDP /- -/ i--

Socl / Sac) SalG1

Рис.37. Схема получения мутантной аллели гена udp (делеция З'-кон

цевой области) и конструирование экспрессионной плазмиды pUUDP'.

кислотных остатков в молекуле фермента.

При помощи олигонуклеотида 24 (табл.11), содержащего в своем составе "стоп"-кодон трансляции и сайт эндонуклеаэы рестрикции SalGI, а также олигонуклеотида 1, комплементарного проксимальной области гена udp и содержащего сайт SacI, проводили амплификацию для получения ген. udp укороченного размера. Полученный фрагмент ДНК подвергали гидроли зу соответствующими эндонуклеазами рестрикции и клонировали в составе плазмиды pUC18.

Анализ уровня биосинтеза делеционной формы уридинфосфорилазы пока зал, что сконструированная рекомбинантная плазмида обеспечивает высокий уровень экспрессии гена udp укороченного размера, однако, получен ный мутантный белок ферментативной активностью не обладал (мутант 9).

Делеция 55 аминокислотных остатков в С-концевой области уридинфос форилазы не вызывает снижения уровня биосинтеза мутантного белка по сравнению с уридинфосфорилаэой дикого типа, что свидетельствует о сох ранении правильного пути фолдинга оставшейся N-концевой области белка При нарушении пути фолдинга мутантный белок был бы неизбежно разрушен под действием протеинаэ E.coli (например, мутант 6, табл.11). По-видимому, внесенная делеция приводит к ухудшению контакта между субъединицами белка, что вызывает образование фермента с нарушенной четвертичной структурой.

С целью выяснения роли N-концевого фрагмента полипептидной цепи была предпринята реконструкция гена уридинфосфорилазы, приводящая к делеции первых 20 аминокислотных остатков белка, с одновременным введением N-концевого метионина (олигонуклеотид 25, табл.11). Полученная мутантная аллель гена уридинфосфорилазы не приводила к накоплению белка в клетках E.coli. Эти данные еще раз подтверждали (наряду с замена-

ми A19R и H8N) важность N-концевого фрагмента белка в формировании активной четвертичной структуры фермента.

Такие нарушения в структуре должны были приводить не только к отсутствию ферментативной активности уридинфосфорилазы, но и к изменению общих свойств белка. В частности, исследование локализации мутантных форм UDP показало, что, в отличие от уридинфосфорилазы дикого типа, локализованной в цитоплазме, мутанты 7, 9 и 15 (табл.12) находились в клеточном дебрисе, что, вероятно, связано с нарушением топологии контакта отдельных субъединиц UDP, следствием чего может являться неправильная (либо полностью нарушенная) агрегация мономеров при формировании гексамерной структуры фермента.

Эти данные подтверждают высказанное предположение об участии N-, и С-концевого доменов в осуществлении межсубъединичного контакта при формировании нативной активной четвертичной структуры уридинфосфорилазы.

Таким образом, проведенный анализ сконструированных мутантных форм уридинфосфорилазы позволяет создать предположительную модель структурно-функциональной организации данного фермента. В уридинфосфорилазе, шестисубъединичном белке, несмотря на наличие трех цистеиновых остатков, отсутствуют как внутри-, так и межмолекулярные дисульфидные связи. Особая роль принадлежит С136, который, вероятно, участвует в формировании как активного центра фермента, так и определяет стабильность четвертичной структуры молекулы в целом. В поддержании активного центра уридинфосфорилазы, наряду с аминокислотами, окружающими С136, также участвует Н122. Н8 входит в состав активного центра уридинфосфорилазы. Участок полипептидной цепи Р61-Р72 образует вырожденную структуру петли Россмана и отвечает за связывание фосфат-иона. N и С-концевые участки полипептидной цепи выполняют характерную для олигомерных белков функцию образования межсубъединичных контактов и формирования нативной четвертичной структуры уридинфосфорилазы, определяющей ферментативную активность этого белка.

VI.4.8. Сравнение данных по сайт-направленнону мутагенезу и результатов рентгеноструктурного исследования фернента.

Полученные недавно данные рентгеноструктурного анализа уридинфосфорилазы из E.coli (Е.Yu.Morgunova, Mikhailov A.M., et al., 1995) позволили провести прямое сравнение полученных нами результатов с описанием кристалла фермента (рис.38), полученного в отсутствие субстратов. По данным рентгеноструктурного анализа уридинфосфорилаэа, действительно, представляет собой шестисубъединичный мультимер, в котором в осуществлении контактов между субъединицами участвуют фрагменты 48-49, 68-69, 118-123, 160-163 и СС-спирализованный участок (72-83). Показано также, что подвижная петля (163-180) погружена в соседнюю субъединицу. Активный центр уридинфосфорилазы формируется при контактах между субъ-

\

N

Рис.38. Третичная структура мономера уридинфосфорилазы из E.coli (E.Yu.Morgunova, Mikhailov A.M. et al., 1995).

единицами (аминокислотные остатки 26-30-, 68-70, 91-96, 118-123, 162-163, 166-168, 195-198, 220-223 одной субъединицы и 5-8 остаток другой субъединицы).

Эти данные, в основном, совпадают с высказанными нами ранее предположениями. Действительно, предложенный в качестве фосфат-связывающей петли участок (петля Россмана, 61-72 а.о.) задействован в формировании активного центра. Более того, в полном соответствии с нашими предположениями, этот участок не структурирован и действительно представлен в белке в виде петли (рис.38). Одиночные и двойные замены, проведенные в настоящей работе (мутанты 3, 4, 5, табл.12), также указывают на важность именно участка 66-70 в функционировании молекулы. Н8 и А19 (мутанты 15, 22, табл.12) локализуются в N-концевой области, также вовлеченной как в межсубъединичный контакт, так и в формирование активного центра. Делеция этого участка (мутант 25, табл.12) приводит к невозможности формирования мультикомплекса.

Делеция 199-253 аминокислотных остатков приводит к уничтожению С-концевого участка белковой молекулы, также значимого для осуществления межсубъединичного контакта (мутант 9, табл.12). Такого рода мутация одновременно приводит к делеции участков 220-223 и 195-198 (см. рис.42) и нарушению подвижной петли (163-180 а.о.), важных, по ренте-геноструктурным данным, как для сборки мультимера, так и для формирования активного центра.

Любопытно было рассмотреть также одиночные мутации, приводящие к изменению активности фермента. Действительно, только два из семи остатков гистидина (Н8 и Н122) оказались важными в функционировании фермента. Роль остатка His8 уже обсуждалась выше. Что же касается остатка Hisl22, то по данным рентгеноструктурного анализа он входит в участок, вовлеченный в межсубъединичный контакт (118-123). Очевидно, что синонимическая замена (H122N) хотя и не привела к полной потере активности белка, но нарушила топологию контакта, что и выразилось в уменьшении ферментативной активности (мутант 20, табл.12) белка. Остальные пять остатков His не входят в состав контактирующих участков фермента.

Рассмотрение мутаций остатков cys (мутанты 1, 3, 4, б, 7, 8 табл.12) указывает на то, что, действительно, остаток Cys65 не находится в непосредственном месте контакта субъединиц и, хотя он локализован вблизи петли Россмана, не вносит существенного вклада в стабилизацию молекулы в целом. Остатки Cysl36 и Cys206 расположены в одном из двух доменов белка и могут принимать участие в стабилизации пространственного положения ОС-спирали (70-83) и участка 120-137. Результаты исследования мутантных по остаткам Cys форм уридинфосфорилазы показывают, что для сохранения белка в растворимой форме необходимо наличие отрицательно заряженной аминокислоты в положении 136 и 206 полипептидной цепи. Наличие такого заряда может приводить к образованию солевого мостика и, соответственно, закреплению нужной конформации фрагментов белка. Анализ рентгеноструктурных данных показывает, что пространственно вблизи остаков цистеина расположены остатки Arg212 и Arg88, которые и могут выполнять роль партнеров данных остатков Cys в образовании солевых мостиков. Более того, становится понятным отсутствие накопления белка в случае мутации Cysl36Ser: нарушение этого солевого мостика может приводить к существенному изменению (увеличению) подвижности всего участка 110-140 полипептидной цепи и большей доступности этого участка протеаэам E.coli, что и выражается в отсутствии накопления целевого белка в биомассе. Роль Cys206 в этом аспекте менее су-цественна и, хотя замена C206S приводит к нарушению топологии контакта нежду субъединицами и образованию нерастворимого белка, однако не вызывает его деградации.

Т.о., полученные в настоящей работе результаты по изучению структурно-функциональной организации уридинфосфорилазы нашли полное подт-зерждение в рамках рентгеноструктурного исследования. Дальнейшие исс-1едования могут быть направлены на детализацию структуры активного дентра уридинфосфорилазы.

VI.4.9. Изучение роли остатка Asp5 в функционировании уридинфосфорилазы из Е. coli.

По данным цитируемой выше работы (Е.Yu.Morgunova, Mikhailov A.M., it al., 1995) методом химической модификации показано, что в формиро-

вании активного центра уридинфосфорилазы принимает участие остаток Asp5. Ранее полученные нами замены A19R, H8N указывали на действитель ную важность N-концевого фрагмента уридинфосфорилазы в формировании активного мультимера фермента. Однако, роль остатка Asp5 в предполага емой в статье стабилизации переходного состояния при. фосфоролизе ури-дина оставалась для нас до конца непроясненной. Кроме того, замена этого аминокислотного остатка давала возможность дополнительно исследовать влияние вносимых замен в N-концевой области на функционировани фермента. Как и в предыдущих экспериментах, мутагенез проводили посте пенным замещением данного аминокислотного остатка от синонимического до несинонимического. Полученные результаты (табл.13) указывают на то что введение замены D5E (синонимическая замена) не приводит к изменению активности, т.е. при такой замене не выполняется правило взаимодействия фермент-субстрат ("ключ-замок"). Однако, и дальнейшие несино нимические замены (D5N и D5A) не приводили к изменению активности, ли бо уровня накопления белка в E.coli.

Таблица 13. Структуры синтетических олигонуклеотидов, использован ных при изучении роли Аэр5 в функционировании уридинфосфорилазы и ферментативная активность мутантных форм белка.

Г 1 1 No 1 1 П/П 1 Нуклеотидная последовательность 5' >3' 1 1 Вносимая 1 замена 1 1 Активность, 1 %

1 ~ 1 UDP 1 w.t. 1 100

1 1 • 1 TTTTGGATCCATGTCCAAGTCTGAAGTTT 1 D5E 1 100

1 2. ! TTTTGGATCCATGTCCAAGTCTAATGTTT 1 D5N 1 100

1 з. 1 ¡.....Í TTTTGGATCCATGTCCAAGTCTGCTGTTT 1 D5A 1 100

Полученные результаты указывают на то, что аминокислотный остаток Asp5, в отличие от His8, не играет существенной роли в формировании активного мультимерного комплекса и, тем более, не входит в состав ак тивного центра уридинфосфорилазы из Е. coli.

ВЫВОДЫ.

I. С использованием предложенного метода сканирующих мутантов про ведено структурно-функциональное исследование области 30-50 аминокислотных остатков ИФН-СС2 человека:

- сконструирована серия (21 ген) мутантных аллелей гена СС2-интер-ферона человека, получены штаммы-продуценты соответствующих белков. Мутантные формы СС2-ИФН выделены и изучены их свойства;

- выявлена функциональная роль отдельных аминокислотных остатков

участка 30-50;

- разработана схема многоточечного мутагенеза с применением адресованного расщепления одноцепочечной ДНК, позволяющая конструировать гибриды гомологичных белков с заданными границами. С помощью данного метода получен гибридный ген (12-интерферона человека и свиньи.

- показано, что фрагмент 31-42 аминокислотной последовательности СС2-интерферона человека ответственен за противовирусную активность белка на линии клеток человека (А-549) и свиньи (СПЭВ) и определяет видоспецифичность подвида (ХИФН;

- предложена пространственная модель третичной структуры антивирусного сайта ИФН-СС2 человека, в рамках которой объяснены литературные и полученные экспериментальные данные.

II. Исследованы особенности проведения сайт-направленной реконструкции ДНК с применением урацил-репарационной системы. Предложена модификация методики получения урацилсодержащей ДНКматрицы, позволяющая существенно сократить время на этой стадии процесса. Показано, что:

- решающими факторами эффективного введения мутаций являются стабильность 5'-концевой части комплекса "матрица-праймер" и его фиксированное закрепление на ДНК. При использовании олигонуклеотидных прайме-ров со сгруппированными заменами выход мутагенеза находится в линейной зависимости от температуры плавления 5'-концевого фрагмента комплекса;

- при ферментативной достройке в условиях in vitro, наряду с целевыми, протекают процессы элонгации эндогенных праймеров, существенно понижающие эффективность введения мутации и определяющие стратегию поиска мутантов;

- именно ферментативная стадия in vitro является определяющей при проведении мутагенеза в урацил-репарационной системе;

- применение урацил-репарационной системы в оптимизированном варианте повышает выход мутагенеза более, чем в 30 раз.

III. С использованием сайт-направленного мутагенеза в оптимизированном варианте проведен ряд реконструкций ДНК:

- осуществлена реконструкция области регуляции репликации плазмиды PBR322 для создания на ее основе мобильных генно-инженерных конструкций ;

- получен ген di-интерферона человека, кодирующий зрелый белок. На основе полученного гена создан штамм-продуцент (XI-интерферона человека. Показано, что уровень накопления белка в E.coli составляет

2x107 МЕ/л;

- получен ген интерферона-|5-Зег-17. Создан штамм-продуцент мутант-ного интерферона-Р-Бег-17 (4х1010 МЕ/л), позволяющий получать белок с улучшенными физико-химическими и биологическими свойствами по сравне-

нию с рекомбинантным Р-интерфероном человека.

IV. С применением полимеразной цепной реакции прямой амплификацис синтетических олигодезоксирибонуклеотидов получены гены ингибитора протеинаэ (эглин С) из Hirudo medicinalis и Р-эндорфина человека. В ходе исследования сборки фрагментов ДНК без применения Т4-полинуклео-тидкиназы и Т4-ДНК-лигазы показано, что концентрация олигонуклеотидо! приводящая к эффективной достройке с образованием протяженных пoлинy^ леотидных цепей, должна быть не выше 10"7- 5x10" 7 М.

Сконструированы экспрессионные векторы и получен высокоэффективный штамм-продуцент ингибитора протеинаэ белковой природы (эглин С), позволяющий получать не менее 400мг белка на литр культуральной жидкости. Отработана методика выделения эглина С из биомассы E.coli.

V. С применением полимеразной цепной реакции осуществлена реконструкция ДНК, направленная на получение генов гибридных белков:

- на основе гена эглина С и фрагментов гена СС2-интерферона челов« ка сконструированы гены химерных белков. Получены экспрессионные векторы и штаммы-продуценты соответствующих белков;

- сконструирован гибридный ген эглин С - Р-эндорфин и получен экс прессионный вектор, содержащий данный ген;

- показан высокий уровень накопления химерных белков в E.coli.

VI. Разработана схема твердофазного сицтеза!аминоолигонуклеотидо] и нерадиоактивномеченых зондов на их основе. Исследованы свойства полученных биотинилированных праймеров и показано, что получаемые по предложенной схеме олигонуклеотидные зонды могут быть эффективно использованы практически во всех ферментативных реакциях, применяемых i генной инженерии (ферментативное фосфорилирование, элонгация полимер: зами, включая амплификацию), и, следовательно, лишены большинства ограничений, присущих меченым по 5'-, 3'- концевым гидроксильным группе или гетероциклическим основаниям олигонуклеотидам.

VII. Сконструированы мультикопийные экспрессионные плаэмиды, содержащие ген уридинфосфорилаэы, структурный ген тимидинфосфорилаэы пс контролем промотор-операторной области udp и ген цитидиндезаминазы E.coli К-12. Полученные плаэмиды обеспечивают высокий уровень накопл« ния соответствующих белков в E.coli (0,4; 0,6; и 0,6 г/л культуральной жидкости). Эти результаты свидетельствуют о том, что, по-видимому большинство промотор-операторных областей генов катаболизма нуклеози-дов, подверженных позитивной регуляции комплексом cAMP-CRP, в составе мультикопийного вектора обеспечивают эффективную транскрипцию генов. Созданные штаммы-продуценты могут быть использованы для наработки фер ментов и разработки процесса ферментативной конверсии нуклеозидов.

VIII. С использованием полимераэной цепной реакции отработаны методы сайт-направленной реконструкции ДНК для исследования структурно-функциональных отношений в белках. Методы основаны на:

- сдвиге и возвращении рамки считывания в структурной области гена при помощи олигонуклеотид-специфического мутагенеза;

- использовании однонитевого фрагмента ДНК для проведения сайт-на-

*

правленного мутагенеза;

- введении кодона терминации трансляции в 3'-концевой области гена для конструирования белков укороченного размера (С-концевые делеции белка) ;

- введении кодона инициации трансляции в 5'-концевой области гена для конструирования белков укороченного размера (N-концевые делеции белка) .

IX. С помощью сайт-направленного мутагенеза с применением полимераэной цепной реакции получены мутантные формы гена уридинфосфорилазы из E.coli (28 аллелей), сконструированы штаммы-продуценты соответствующих белков и изучена структурно-функциональная организация этого белка. В ходе исследования показано, что:

- в уридинфосфорилазе остатки цистеинов не участвуют в образовании как внутри-, так и межмолекулярных дисульфидных связей;

- остатки С136 и С206 имеют важное функциональное значение в формировании активного мультимерного фермента. При этом остаток С136 и окружающие его аминокислотные остатки имеют определяющее значение в стабильности молекулы белка в целом;

- остаток Н122 участвует в поддержании активной формы уридинфосфорилазы, а остаток Н8 входит в активный центр фермента;

- участок полипептидной цепи Р61-Р72 в уридинфосфорилазе играет важную роль в функционировании молекулы фермента, отвечая за связывание иона фосфата;

- N- и С-концевые участки полипептидной цепи уридинфосфорилазы формируют места межсубъединичных контактов, участвуя в образовании на-гивной четвертичной структуры белка.

Полученные в настоящей работе результаты по изучению структурно-функциональной организации уридинфосфорилазы нашли полное подтверж-1ение при проведении рентгеноструктурного исследования этого белка.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих [убликациях;

1. Сарафова A.A., Шехтер И.И., Вейко В.П., Иванов И.Г. "Получение ена ai-интерферона, освобожденного от кодонов сигнальной последова-ельности", III научная конференция по генетике, Разград, НРБ, 1988,

С. 12

2. Сарафова A.A., Вейко В.П., Шехтер И.И., Иванов И.Г., Максимова В. "Метод конструирования гена (XI-интерферона че/фвека, освобожденного от кодонов сигнальной последовательности." Заявка'1 на авторское свидетельство НРБ No 87611, положительное решение от 2%.Об.89г.

3. Veiko V.P., Shehter I.I., Ratmanova К.I., Bulenkov M.T. "The construction of mutant human IFN-CX's", 20-th Meeting of the FEBS, 1990, P.181.

4.Шехтер И.И., Буленков М.Т., Вейко В.П., Ратманова К.И., Евдонина Л.В., Кулакова О.Г., Юрин В.Л., Дебабов В.Г. "Структурно-функциональные отношения в (Х-интерферонах. Изучение противовирусной активности мутантных форм 0С2-интерферона человека". Докл. АН СССР, 1990, Т.314, No4, С.998-1001.

5.Шехтер И.И., Буленков М.Т., Вейко В.П., Ратманова К.И., Евдонинг Л.В., Кулакова О.Г., Юрин В.Л., Дебабов В.Г. "Использование мутантных интерферонов для изучения структурно-функциональных отношений в ОС2-ин-терфероне человека". Депонированная рукопись в ВИНИТИ, No 4158-В от 24.07.1990г.

6. Шехтер И.И., Вейко В.П., Буленков М.Т., Ратманова К.И., Дебабо!

B.Г. "Сайт-направленный мутагенез в урацил-репарационной системе. Получение мутантных форм интерферона-СС2 человека". Молекулярная биология, 1991, Т.25, Вып.1, С.153-161.

7. Шехтер И.И., Ратманова К.И., Вейко В.П., Дебабов В.Г. "Сайт-направленный мутагенез с использованием'адресованного фрагмен-тирования однонитевой ДНК для получения гибридов гомологичных белков", Биоорганическая химия, 1991, Т.17, No3, С.379-386.

8. Шехтер И.И., Мочульский A.B., Вейко В.П., Дебабов В.Г. "Применение урацил-репарационной селекции при делегировании протяженной последовательности ДНК", Биоорганическая химия, 1931, Т.17, No4,

C.456-460.

9. Шехтер И.И., Вейко В.П., Буленков М.Т., Ходова О.М., Колеватых М.И., Изотова Л.С., Козлов Ю.И., Ребентиш Б.А., Дебабов В.Г. "Получение рекомбинантного (серин-17) ß-интерферона человека методом олиго-нуклеотид-направленного мутагенеза и его экспрессия в E.coli", Антибиотики и химиотерапия, 1991,Т.36, No8, С.25-28.

10. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Ратманова К.И., Гулько Л.Б., Анд-рюхина Р.В., Дебабов В.Г. "Клонирование и экспрессия в Escherichia coli тимидинфосфорилазы под контролем промотора уридинфосфорилазы", Биотехнология, 1994, N4, С.2-4.

11. Вейко в.П., Сипрашвили 3.3., Гулько Л.Б., Ратманова К.И., Анд-рюхина Р.В., Миронов A.A., Осипов A.C., Соколов А.К., Дебабов В.Г. "Сайт-направленная реконструкция ДНК. Изучение структурно-функциональных отношений в уридинфосфорилазе из Escherichia coli", Депонирование: научная работа в ВИНИТИ N1311-B94 от 27.05.1994.

12. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3. , Ратманова К.И., Гулько Л.Б., Анд-рюхина Р.В. "Исследование структурно-функциональных отношений в ури-цинфосфорилазе из E.coli", VI конференция Российской Федерации. Новые направления биотехнологии. г.Пущино 24-26 мая, 1994г. С.70.

13. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Синтии А.А, Гулько Л.Б., Ратманова К.И., Алексеева М.Г., Деревщикова Е.Б., Андрюхина Р.В., Осипов А.С. "Клонирование гена цитидиндезаминазы и его экспрессия в Escherichia coli", Биотехнология, Nol-2, С.19-21,1995.

14. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Гулько Л.Б., Ратманова К.И. "Сравнительный анализ результатов исследования структурно-функциональной эрганизации уридинфосфорилазы из E.coli методами сайт-направленного кутагенеэа и рентгеноструктурных данных". Тезисы III научной конференции ГосНИИГенетика, 1995, С.24.

15. Вейко В.П., Осипов А.С., Шехтер И.И., Буленков М.Т., Ратманова <.И., Гулько Л.Б., Чибискова Н.А., Эррайс Л.Л., Деревщикова Е.Б., Де-Забов В.Г. "Химический синтез гена ингибитора протеиназ (эглин С) без использования Т4-ДНК-лигаэы и его экспрессия в Е. coli". Биоорганическая ХИМИЯ, 1995, Т.21, No 5, С.354-358 .

16. Veiko V.P., Osipov A.S., Schechter I.I., Bulenkov M.T., Ratma-iova K.I., Errais L.L. "Synthesis and expression of the protease inhi-Ditor eglin С gene. Using eglin С for structure-functional investigation of proteins." Thirteenth American Peptide Symposium, Abstacts, idmonton (Alberta), Canada, 1993, P.2-207.

17. Вейко В.П., Ратманова К.И., Осипов А.С. "Твердофазный синтез Зиотинилированных олигодезоксирибонуклеотидов", Перспективные направ-1ения и новые методы в молекулярной биологии, г.Рига, 1990, с.57.

18. Вейко В.П., Ратманова К.И., Осипов А.С., Вейко Н.Н., Карпухин Дебабов В.Г. "Твердофазный синтез биотинилированных олигодезок-

:ирибонуклеотидов", Докл. АН СССР, 1990, Т.313, Nol, С.214-216.

19. Вейко В.П..Ратманова К.И., Осипов А.С.,Буленков М.Т., Пугачев ¡.В. "Направленное введение аминогрупп по межнуклеотидной фосфатной •руппе при твердофазном синтезе олигодезоксирибонуклеотидов. Получение шотинилированных олигонуклеотидных зондов". Биоорганическая химия, 991, Т.17, No5, С.625-629.

20. Veiko V.P., Ratmanova К.I., Osipov A.S. "Simple solid phase lynthesis of biotinylated oligonucleotides". Synthetic oligonucleoti-!es: problems and frontiers of practical application, Moscow, 1991, .119.

21. Veiko V.P., Ratmanova K.I., Osipov A.S. "Simple solid phase ynthesis of amino-oligonucleotides for obtaining non-radioactive pro-es". Nucleic Acids Research, Symposium series, 1991, No24, P.237.

22. Осипов А.е., Гулько Л.Б., Окорокова Н.А., Вейко В.П. "Химичес-ий синтез гена эглина С и его экспрессия в E.coli", Новые направления

биотехнологии, г. Пущино, 1994, С.110.

23. Mashko S.V., Mochulsky A.v., Kotenko S.V., Lebedeva M.I., Lapi dus A.L., Mochulskaya N.A., Izotova L.S., Veiko V.P., Vinetsky Y.P., Ketlynsky S.A., Debabov V.G. "Use of dual-origin temperature-controlled amplifiable replicón for optimization of human interleukin-lß synthesis in Escherichia coli". Gene, 1991, V.97, P.259-266.

24. Mashko S.V., Veiko V.P., Lapidus A.L., Lebedeva M.I., Mochulsk A.V., Shechter I.X., Trikhan M.E., Ratmanova K.I., Rebentish B.A., Ka luzhsky V.E., Debabov V.G. "TGATG vector: a new expression system for cloned forein genes in Escherichia coli cells". Gene, 1990, V.88,

P.121-126.

25. Lapidus A.L., Mochulski A.V., Podkovyrov S.M., Lebedeva M.I., Antipin A.A., Izotova L.S., Zagnitko O.P., Komolova G.S., Klesov A.A. Veiko V.P., Mashko S.V."Expression of the hAng gene in Escherichia со Ii; isolation and charaterization of human recombinant Ser-(-l) angio genin". Biomedical Science, 1990, V.l, No6, P.585-604.

26. Mashko S.V., Veiko V.P., Lebedeva MI.I., Lapidus A.L..Mochulsk A.V. "TGATG vector: a new expression system for cloned forein genes i Escherichia coli cells", 6-th International Symp. Genetics of Industrial Microorganisms, GIM-90, Strasbourg, 1990, D-128.

27. Котенко C.B., Буленков M.T., Вейко В.П., Епишин С.М., Ломакин И.Б., Емельянов A.B., Козлов A.n., Конусова В.Г., Котов А.Ю., Курбатова Т.В., Решетников В.Л., Симбирцев A.C., Кетлинский С.А., Винец-кий Ю.П. "Клонирование кДНК, кодирующих, проинтерлейкин 1СС- и проинтер лейКИН-lß", Доклады АН СССР, 1989, Т.309, N.0^4, Q.1005-1008.

28. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3. , Ратманова К.П., Гулько Л.Б., Миро нов A.A., Андрюхина Р.В., Дебабов В.Г. "Изучение структурно-функциональной организации уридинфосфорилазы из Escherichia coli", ДАН России, 1994, Т.339, No 6, С.819-821.

29- Вейко В.П-, Сипрашвили 3.3. , Ратманова К.И., Гулько Л.Е., Мире нов A.A. "Белковая инженерия уридинфосфорилазы из Escherichia coli К-12. Исследование роли остатков цистеинов в функционировании фермента", Молекулярная биология, 1995, Т.29, No б, С.1193-1202.

30. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Ратманова К.И., Гулько Л.Б. "Исследование роли остатков гистидина в функционировании уридинфосфорилаз: из Escherichia coli К-12 методами белковой инженерии", Биоорганическа. ХИМИЯ, 1995, Т.21 , No 11, С.835-838.