Роль внеклеточной ДНК в функциональной активности генома человека

Костюк, Светлана Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль внеклеточной ДНК в функциональной активности генома человека
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль внеклеточной ДНК в функциональной активности генома человека"

На правах рукописи

Костюк Светлана Викторовна

РОЛЬ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

03.02.07 — генетика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

¿4 АПР 2014

Москва-2014

005547539

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

Доктор биологических наук, Наталья Николаевна Вейко

Официальные оппоненты:

Сулимова Галина Ефимовна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова» Российской академии наук, главпый научный сотрудник лаборатории сравнительной генетики животных.

Лившиц Виталий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, Лауреат премии Правительства Российской Федерации в области науки и техники, Закрытое акционерное общество «Научно-Исследовательский институт Аджиномото-Генетика», ведущий научный сотрудник ЗАО «НИИ Аджиномото-Генетика».

Ковалев Леонид Иванович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимии им. А.Н.Баха» Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биомедицинских исследований.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «¿¿» 2014 г. в « '» часов на заседании

Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1, www.med-gen.ru.

Автореферат разослан » 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор - Зинченко Репа Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Фрагменты ДНК, циркулирующие вне клеток в межклеточной среде организма или в среде культивирования клеток, называют внеклеточной ДНК (вкДНК) (Galeazzi М. et al., 2003). Существует несколько гипотез о происхождении внеклеточной ДНК, основными из которых являются - образование пула внеклеточных нуклеиновых кислот в результате гибели клеток ("гипотеза клеточной гибели") и активная секреция ДНК живыми клетками (гипотеза «метаболической ДНК») (Pisetsky D.S., 2012; Peters

D.L., Pretorius P.J., 2011; Gahan P.B. et al., 2008).

Повышенный интерес к внеклеточной ДНК связан с возможностью ее использования в качестве маркера для диагностики. В составе внеклеточной ДНК, выделенной из плазмы или сыворотки периферической крови, обнаруживается ДНК опухоли (при онкологической патологии), ДНК плода (при беременности), что позволяет анализировать соответственно геном опухоли или плода, не прибегая к биопсии. Определение концентрации внеклеточной ДНК позволяет в ряде случаев оценить уровень гибели клеток при патологии или при действии повреждающих факторов, в том числе, ионизирующей радиации и ультрафиолета (Schwarzenbach Н., 2013; El Messaoudi S. et al., 2013; Gonzdlez-Masiä J.A. et al., 2013). К моменту начала данного исследования гораздо меньшее число работ было посвящено биологическому действию внеклеточной ДНК на активность генома клеток организма человека (Gahan P.B. et al., 2008). Вместе с тем внеклеточная ДНК циркулирует в составе крови организма и потенциально может влиять на функциональную активность клеток разного типа. Известно, что многие клетки экспрессируют на поверхности и в цитоплазме ДНК-сенсоры, которые потенциально могут опознавать внеклеточную и цитоплазматическую ДНК с определенными свойствами. Поэтому исследование общих свойств вкДНК и биологического действия вкДНК на активность генома клеток человека является актуальной проблемой генетики.

Исследование свойств вкДНК необходимо как для создания новых подходов и методов диагностики состояний, сопровождающихся повышенным уровнем гибели клеток организма, так и для определения основных характеристик пула внеклеточной ДНК, благодаря которым вкДНК становится биологически активной молекулой. К таким свойствам вкДНК можно отнести содержание отдельных последовательностей генома человека, как повторяющихся, так и уникальных (Peters D.L., Pretorius P.J., 2011; Suzuki К. et al., 2008). В составе вкДНК обнаружено увеличение содержания митохондриальной ДНК, приводятся сведения об увеличении ГЦ-состава вкДНК по сравнению с ДНК, выделенной из ядер клеток. (Вейко H.H. и соавт., 2006; Rykova

E.Y. et al., 2012; Gonzalez-Masia J.A. et al., 2013). Однако в литературе нет данных, которые объясняли бы механизм значительного изменения количественного состава фрагментов вкДНК в норме и при патологии. Неизвестно также, каким образом

изменение состава вкДНК влияет на биологическую активность вкДНК в отношении разных типов клеток.

Для того, чтобы понять, какие функции выполняет вкДНК в организме в норме и при патологии, необходимо, во-первых, определить закономерности изменения ее свойств по сравнению с геномной ДНК нормально функционирующих клеток. Во-вторых, необходимо выяснить, приводит ли изменение характеристик вкДНК к изменению ее биологической активности в отношении различных типов клеток человека. И, наконец, важно определить основные звенья пока не известного клеточного механизма, посредством которого вкДНК изменяет функциональную активность различных клеток организма. Для решения перечисленных задач необходимо исследование свойств вкДНК в норме и при патологии, исследование процессов регуляции пула вкДНК в организме и биологического действия фрагментов вкДНК на клетки человека.

Результатом подобных исследований будут новые знания о молекулярных и клеточных механизмах действия вкДНК, которые необходимы как для создания новых методов молекулярной диагностики и лечения, так и для понимания фундаментальных основ взаимодействия внеклеточных нуклеиновых кислот с живыми клетками организма. Исследование роли молекулы внеклеточной ДНК -носителя генетической информации - в регуляции активности генома клеток разного типа представляется актуальной задачей генетики.

Цель исследования:

Установление взаимосвязи между структурными особенностями внеклеточной ДНК и ее способностью изменять уровень транскрипционной активности генов, имеющих ключевое значение для сохранения стабильности генома и регуляции адаптивных реакций клеток человека разного гистогенеза.

Задачи исследования:

1. Определить концентрацию, изменение содержания ГЦ- и AT- богатых последовательностей, размер фрагментов, уровень окислительной модификации оснований вкДНК в плазме крови здоровых доноров, беременных женщин, больных аутоиммунными и сердечно-сосудистыми заболеваниями и лиц, контактировавших с источниками ионизирующего излучения. Выявить структурные особенности вкДНК, которые определяют ее выраженную биологическую активность.

2. Исследовать локализацию ГЦ-обогащенных и окисленных фрагментов вкДНК в нормальных (на примере клеток эндотелия) и раковых клетках (на примере культуры клеток аденокарциномы молочной железы).

3. Проанализировать влияние фрагментов вкДНК на развитие окислительного стресса в клетках разного типа (HUVEC, МСК, фибробластах и MCF7) Определить

локализацию синтеза АФК в раковых клетках линии MCF7. Охарактеризовать время развития окислительного стресса в разных типах клеток.

4. Изучить повреждающее действие фрагментов вкДНК на клетки (HUVEC, МСК, MCF7 и фибробласты). Проанализировать уровень окисления и количество одно- и двунитевых разрывов ДНК в ядрах клеток, а также признаки нестабильности генома раковых и нормальных клеток.

5. Исследовать ответ клеток (HUVEC, МСК, MCF7 и фибробласты) на окислительный стресс, индуцируемый фрагментами вкДНК с разными свойствами, на уровне транскриптома. Изучить пролиферативную активность клеток, клеточный цикл, экспрессию гена репарации BRCA1, пространственную структуру хроматина, уровень апоптоза и транскрипции антиапоптотических генов под действием вкДНК.

6. Исследовать транскрипционную активность генов сигнальных путей NF-kB, NRF2, PPARG и STAT3 в клетках (HUVEC, МСК, MCF7 и фибробластах) в ответ на действие ГЦ - обогащенных и окисленных фрагментов вкДНК.

7. Проанализировать перемещение транскрипционных факторов NF-kB, NRF2 и STAT3 в ядро клеток (HUVEC, МСК, MCF7 и фибробластов); исследовать уровень экспрессии генов - мишеней NF-kB - сигнального пути (TNF, IL1B, IL8, 1L6, IL-10), и гена SOD1- мишени антиокислительного NRF2 - сигнального пути,

8. Исследовать влияние ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК на уровень экспрессии генов внутриклеточных ДНК-сенсоров TLR9, AIM2, RIG1, участвующих в распознавании чужеродных нуклеиновых кислот и генов - адаптеров внутриклеточных рецепторов - MyD88 и STING. Проанализировать влияние фрагментов вкДНК на изменение экспрессии белков TLR9 и AIM2.

9. Исследовать влияние окисленных фрагментов вкДНК на синтез низкомолекулярного сигнального медиатора внутриклеточных и внеклеточных процессов - оксида азота (II) в клетках эндотелия человека и на экспрессию генов четырех ключевых транскрипционных факторов миогенной дифференцировки (.MYOD1, MYOG, MYF5, MRF4) в МСК.

Научная новизна полученных результатов:

Впервые подробно охарактеризованы свойства внеклеточной ДНК (содержание ГЦ- и АТ-богатых последовательностей и уровня окисления) в норме (у здоровых доноров) и при патологии (на выборке больных аутоиммунными, сердечнососудистыми заболеваниями), при беременности и при контакте с ионизирующим излучением. Выявлены общие структурные характеристики внеклеточной ДНК -накопление в ее составе ГЦ-богатых фрагментов рибосомного гена, устойчивого к нуклеазному гидролизу, снижение АТ-богатой последовательности сателлита 3 и увеличение содержания окисленной формы дезоксирибогуанозина.

На основании полученных данных предложена оригинальная обобщенная гипотеза образования пула вкДНК в организме, который подвергается хроническому воздействию ионизирующего излучения.

Впервые выявлены две составляющие пула вкДНК, превращающие ее из относительно инертной молекулы, которой является геномная ДНК клеточных ядер, в биологически активную молекулу. Во-первых, это эпигенетическая модификация вкДНК - окисление фрагментов вкДНК, маркером которого является 8-окси-дезоксирибогуанозин. Во-вторых, накопление в составе вкДНК ГЦ-богатых фрагментов ДНК, маркером которых является транскрибируемая область рибосомного повтора.

Впервые выявлена роль ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК в функционировании клеток разного типа: дифференцированных (клеток эндотелия, фибробластов, лимфоцитов), недифференцированных мезенхимных стволовых клеток и раковых клеток.

Впервые обнаружен новый клеточный механизм, посредством которого реализуется биологическое действие вкДНК в отношении различных типов клеток. Центральным звеном этого механизма является индукция при действии ГЦ-богатых и окисленных фрагментов вкДНК синтеза активных форм кислорода, что приводит к повреждению ДНК ядер клеток: образованию одно- и двунитевых разрывов и геномной нестабильности. В ответ на повреждение ядерной ДНК активируются системы репарации ДНК: снижается пролиферация, возникает остановка клеточного цикла и повышается экспрессия генов, ответственных за репарацию. В результате снижается уровень гибели в клеточных популяциях за счет активации транскрипции антиапоптотических генов и ингибирования апоптоза.

Впервые исследован ответ транскриптома клеток на изменение свойств вкДНК - от рецепторов, адаптеров и эффекторов каскада сигнальных путей до медиаторов клеточного ответа (цитокинов, факторов роста и молекул адгезии). Показана активация экспрессии внутриклеточных рецепторов ТЬК9, А1М2, и, в меньшей степени, 11Ю1 на уровне генов и на уровне белков. Выявлены и исследованы сигнальные пути, которые активируются в ответ на воздействие ГЦ-богатых и/или окисленных фрагментов вкДНК. Впервые описана активация четырех транскрипционных факторов фрагментами вкДНК с измененными свойствами: ОТ-кВ, N№2, БТАТЗ и РРАЯ02.

Впервые была высказана и подтверждена экспериментально гипотеза о роли окисленной и ГЦ-богатой вкДНК как нового медиатора стресс-сигнализации в развитии адаптивного ответа клеток. Впервые предложена новая альтернативная стратегия повышения выживаемости МСК, применяемых в трансплантологии и для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей, включающая использование ГЦ- богатых фрагментов ДНК в низких концентрациях.

Таким образом, данная работа является оригинальным исследованием, охватывающим новую область знаний о роли внеклеточной ДНК в функциональной активности генома клеток эндотелия, фибробластов, лимфоцитов, недифференцированных мезенхимных стволовых клеток и раковых клеток линии аденокарциномы молочной железы.

Внедрение

С использованием результатов работы в ходе выполнения государственного контракта № 14.512.11.0090 (МОН РФ, 2013 г) разработана тест-система для оценки индивидуальной радиочувствительности человека.

Научно-практическая значимость работы:

1. Полученные в работе данные имеют фундаментальное значение и могут быть рекомендованы для использования на курсах лекций по разным разделам медицинской генетики, биологии развития, клеточной биологии, при подготовке специалистов в высших учебных заведениях медико - биологического профиля, а также включены в руководства и учебные пособия по данным специальностям.

2. Результаты проведенного анализа свойств вкДНК представляют собой базу для разработки диагностических систем эпигенетических маркеров. По результатам работы зарегистрирован патент регистрационный номер 2013147906/20 (074505). «Определение содержания ОС-богатой последовательности генома (ОС-ДНК) в составе циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы периферической крови как способ определения уровня гибели клеток при хронических заболеваниях, при физиологических состояниях (беременность) и при хроническом действии неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека».

3. Часть материалов работы получена и использована в рамках выполнения прикладных разработок по Государственному Контракту № 14.512.11.0090 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ по теме «Разработка высокоточной тест-системы для оценки и прогнозирования индивидуальной радиочувствительности человека».

4. В последнее время терапия стволовыми клетками приобретает все более актуальное значение для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей. Массовая гибель клеток, пересаженных в очаг поражения, остается серьезной проблемой в трансплантологии. Полученные результаты позволяют предложить альтернативный подход к повышению выживаемости МСК при трансплантации или замещающей терапии. Культивирование МСК в присутствии низких количеств ДНК гена ШРНК, накапливающейся в составе внеклеточной ДНК, способствует выживанию МСК при неблагоприятных и гибельных воздействиях среды микроокружения. Подана заявка на патент регистрационный номер 2013147907/20 (074506) «Применение фрагмента ДНК транскрибируемой области рибосомного

повтора для повышения устойчивости мезенхимных стволовых клеток к действию агрессивных факторов окружающей среды».

5. Проведенное в ходе работы исследование характеристик вкДНК, механизмов регуляции вкДНК в организме, биологического действия вкДНК на разные типы клеток способствует получению новой информации о биологической функции циркулирующей внеклеточной ДНК крови в норме и при патологии. Обнаруженный при выполнении диссертационной работы факт повышения выживаемости раковых клеток при контакте с фрагментами внеклеточной ДНК может привести к коррекции схем проведения радиотерапевтических процедур при лечении в онкологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Накопление в составе вкДНК ГЦ-богатых последовательностей и окислительная модификация оснований обуславливают ее выраженную биологическую активность.

2. Проникающая способность окисленных фрагментов внеклеточной ДНК в раковые и нормальные клетки выше, чем неокисленных. Неокисленные фрагменты вкДНК связываются с мембраной клетки, окисленные - проникают в цитоплазму и локализуются вблизи ядра.

3. Синтез активных форм кислорода в клетках вблизи ядерной мембраны -новый, ранее не описанный фактор стресс-сигнализации, посредством которого реализуется ответ клеток на фрагменты вкДНК.

4. Окисленные фрагменты вкДНК вызывают транзиторное образование быстрорепарируемых разрывов ДНК ядер клеток и нестабильность генома раковых клеток, сопровождающиеся кратковременным блокированием пролиферативной активности клеток, остановкой клеточного цикла и активацией процесса репарации.

5. Адаптивный ответ на окислительный стресс, вызываемый ГЦ-богатыми и окисленными фрагментами в составе внеклеточной ДНК, на уровне транскриптома является общей закономерностью ответа злокачественных и нормальных клеток человека с разным пролиферативным потенциалом. Характерными особенностями адаптивного ответа являются: усиление транскрипции антиапоптотических генов семейства BCL-2, гена репарации BRCA-1, генов адаптеров, костимуляторов и эффекторов сигнального пути NF-кВ, транскрипционных факторов PPAR-гамма и STAT3, гена-мастер-регулятора антиокислительного ответа клеток NRF2. Результатом таких изменений транскриптома является повышение выживаемости клеток.

6. Перемещение транскрипционных факторов NF-kB, NRF2 и STAT3 из цитоплазмы в ядро с последующим усилением транскрипционной активности генов антиокислительного фермента SODI, молекул адгезии, цитокинов (TNF, ILIB, IL8, 1L6, 1L-10) и усиление синтеза цитокинов происходят в процессе

реализации адаптивного ответа клеток человека на фрагменты вкДНК. Реакция транскриптома клеток на воздействие ГЦ-богатых и окисленных фрагментов различается по длительности и амплитуде профиля экспрессии генов NRF2 - и NF-kB - зависимых сигнальных путей.

7. Повышенная экспрессия внутриклеточных рецепторов TLR9, AIM2, RIG1, участвующих в распознавании чужеродных нуклеиновых кислот - особенность адаптивной реакции транскриптома разных типов клеток на ГЦ-обогащенные и окисленные фрагменты вкДНК.

8. Эпигенетическая модификация вкДНК, вызванная окислением, блокирует ее способность стимулировать синтез низкомолекулярного сигнального медиатора внутриклеточных и внеклеточных процессов - N0 - в клетках эндотелия человека. Повышение экспрессии генов четырех ключевых транскрипционных факторов миогенной дииференцировки (MY0D1, MYOG, MYF5, MRF4) в МСК - особенность ответа МСК на окисленные фрагменты.

9. Фрагменты вкДНК с умеренно повышенным содержанием ГЦ-пар или слабым окислением остатков гуанозина обладают способностью защищать клетки от гибели при воздействии химических и физических повреждающих факторов.

Апробация работы:

Материалы диссертации представлены на V-VIII международных конференциях «Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Sérum» (Москва, 2007; Гонконг, 2009, Мадрид, 2011, Балтимор, 2013), на II Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), на Российской научной конференции "Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии" (Санкт-Петербург, 2008), на 37 международной конференции "37th Annual Meeting of the European Radiation Research Society" (Прага, 2009); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), на XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2010), на VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010); на XIII международной конференции «The Leiden International Médical Student Conférence» (Лейден, 2011); на международной научной конференции "Современные проблемы радиобиологии" (Гомель, 2010); на международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2009); на 37 международном конгрессе «Fédération of European Biochemical Societies Congress» (Севилья, 2012); на V съезде Радиобиологического общества Украины (Ужгород, 2009); на научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва-Пущино, 2011); на IV съезде Российского Общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на

международной конференции «Новые направления в радиобиологии» (Москва, 2007); на 6 съезде аллергологов и иммунологов (Москва, 2006); на международной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» ( Санкт-Петербург, 2006); на международной конференции: «Медико-биологические проблемы действия радиации» (Москва, 2012).

Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ФГБУ «МГНЦ» РАМН 4 декабря 2013 года.

Личный вклад автора:

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора: на этапах постановки цели и задач, разработки методов и их выполнения, проведения исследований, обработки, анализа и обобщения полученных результатов, написания и оформления рукописи.

Публикации по теме работы:

По теме диссертации опубликовано 67 печатных работ, из них 29 научных статей - в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание учёной степени доктора наук.

Структура и объём работы:

Диссертация состоит из разделов: оглавление, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Диссертация изложена на 389 страницах машинописного текста (без учета списка литературы), содержит 223 рисунка и 8 таблиц. Список литературы состоит из 672 источников, из них 35 отечественных и 637 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Анализ свойств внеклеточной ДНК Сбор образцов плазмы крови пациентов с аутоиммунными, сердечнососудистыми, онкологическими заболеваниями; лиц, контактировавших с источниками ионизирующего излучения; здоровых доноров и беременных женщин осуществлялся сотрудниками ФБГУ "НИИР им. В. А. Насоновой" РАМН (г. Москва), ФГБУ "РОНЦ им. Блохина" РАМН (г. Москва), кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (г. Москва), ФГБУ НЦН РАМН (г. Москва), ФБГУ ЦКБ РАН (г. Москва), ФГУП ГНЦ РФ ФЭИ (г. Обнинск) и РФЯЦ-ВНИИЭФ (г. Саров) с соблюдением этических норм, от всех пациентов получено добровольное информированное согласие.

Выделение внеклеточной ДНК осуществляли с помощью метода экстракции органическими растворителями (Chomczynski P. and Sacchi N., 1987). Концентрацию вкДНК определяли флуориметрически, используя красители Hoechst 33528 или

Quant-iT RiboGreen («MoBiTec»), Количественное содержание повторяющихся последовательностей в составе внеклеточной ДНК определяли с помощью метода нерадиоактивной количественной гибридизации (Вейко H.H. с соавт., 2003). Содержание 8-окси-дезоксирибогуанозина (8-oxodG) в составе вкДНК проводили методом ESI-MS/MS на приборе SCIEX 3200 Qtrap.

Культуры клеток, используемые в экспериментах in vitro Эксперименты in vitro проводили на клетках эндотелия человека (HUVEC, N=9); мезенхимных стволовых клетках (МСК) жировой ткани, пуповины, дельтовидной мышцы (N=17); лимфоцитах периферической крови здоровых доноров (N=21) и больных системной красной волчанкой (СКВ, N=3); мононуклеарах костного мозга (N=2). Материал для выделения HUVEC предоставлен сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (г. Москва); для выделения МСК - сотрудниками ФГБУ "РОНЦ им. Блохина" РАМН (г. Москва); лимфоциты больных СКВ и мононуклеары костного мозга - ФБГУ "НИИР им. В. А. Насоновой" РАМН (г. Москва). МСК из дельтовидной мышцы получены из коллекции клеток Университета Ниццы — София Антиполис (Ницца, Франция). На использование материала получено добровольное информированное согласие доноров. При заборе материала соблюдались правила асептики и антисептики. Выделение и культивирование клеток осуществляли с помощью стандартных методик (Pittenger M.F. et al., 1999; Crampton S.P et al., 2007). В экспериментах in vitro использованы также культуры клеток аденокарциномы молочной железы (MCF7), эмбриональных фибробластов легких человека (HEF, N=3) и фибробластов кожи взрослых здоровых доноров (HDF, N=4) из коллекции клеточных культур ФГБУ «МГНЦ» РАМН.

Используемые в экспериментах образцы вкДНК Полученные образцы добавляли к среде культивирования клеток в концентрации 1 - 300 нг/мл, инкубировали различные промежутки времени.

Для изучения in vitro ответа клеток на присутствие вкДНК использовали: (1) Образцы циркулирующей вкДНК здоровых доноров и больных гипертонией, ишемическим инсультом, острым инфарктом миокарда, ишемической болезнью сердца, раком молочной железы, ревматоидным артритом, системной красной волчанкой. (2) Образцы вкДНК, выделенные из среды культивирования клеток HUVEC, МСК, первичных маммосфер из операционного материала (РМЖ). (3) Пробы неокисленной и окисленной геномной ДНК. Геномная ДНК выделена из нормальных клеток (HDF или HUVEC). Пробы окисленной ДНК были приготовлены обработкой геномной ДНК Н202 (гДНКокси1), или Н202 при УФ-облучении (гДНКокси2) (Kostyuk S.V. et al., 2013). (4) Модельная ГЦ-ДНК. Использовали ГЦ -богатый фрагмент транскрибируемой области рДНК (участок от 515 до 5321 в соответствии с HSU13369, GeneBank), встроенный в вектор pBR322 (п(рДНК)) (Костюк C.B. и соавт., 2010). В качестве AT - обогащенной ДНК человека

использовали фрагмент 1,77 сателлита III (п(СатШ)) (участок lql2, хромосомы 1) в векторе pBR322. Плазмиды подвергали дополнительной очистке от липополисахаридов (Вейко H.H. и соавт., 2006). Образцы вкДНК, используемые в опытах, были охарактеризованы по содержанию рДНК и 8-oxodG.

Флуоресцентно меченые ДНК-зонды получали методом ник-трансляции, используя метки Spectrum Green или Spectrum Red. Для получения меченой окисленной ДНК проводили ренатурацию денатурированных образцов меченной ДНК и окисленной in vitro ДНК (Kostyuk S.V. et al., 2013).

Полученные образцы добавляли к среде культивирования клеток в концентрации 1 - 300 нг/мл, инкубировали различные промежутки времени.

Методы, используемые для оценки ответа клеток на действие вкДНК

Уровень синтеза клетками активных форм кислорода исследовали с использованием DCFH-DA («Molecular Probes/Invitrogen», «CA», США) (LeBel et al., 1992). Количество окиси азота определяли с использованием реагента CuFL («Strem», США) (Lim М.Н., 2007). Флуоресценцию DCF или NO-FL регистрировали методом флуоресцентной микроскопии (Axio Vert, «Carl Zeiss Microscopy», Германия), проточной цитометрии (Partee CyFlow® ML, Германия) и с использованием планшетного ридера («EnSpire» , Финляндия).

Для окраски F-актина цитоскелета применили родамин-фаллоидин («Molecular Probes/Invitrogen», «CA», США) (Wieland T. et al.,1983). Для анализа структурных изменений в ядрах определяли методом FISH положение прицентромерных локусов 1-й хромосомы (район lql2) в фиксированных ядрах лимфоцитов (Карпухин A.B. и соавт., 1995).

Уровень одно- и двунитевых разрывов ДНК ядер клеток определяли методом комет (single cell gel electrophoresis) с использованием адаптированной стандартной методики (Seitz N. et al., 2007). Количество двунитевых разрывов ДНК ядер клеток оценивали, используя антитела к фосфорилированной форме гистона у-Н2АХ, конъюгированные с FITS (Lobrich D.T. et al., 2010). Разрывы ДНК ядер оценивали также с помощью метода TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling staining), используя CometAssay® Kit 50 Samples («Trevigen Cell Assays», Германия), согласно протоколу производителя (www.trevigen.com) (Loo D.T., 2011).

Жизнеспособность клеток определяли с помощью стандартного МТТ- теста.

Активность каспазы 3 определяли в белковых лизатах клеток с использованием флуоресцирующего субстрата Ac-DEVD-AFC ("Sigma"), *.возб=400 нм, ?.флу=490 нм.

Уровень экспрессии генов TLR9, AIM2, R1G1, STING1, TLR1, TLR2, TLR3. TLR4, TLR5, TLR6, TLR7. TLR8. TLR10, NOX4, SOD1, CCND1, CDKN2A, CDKNIA, ТВР, GAPDH, BRCA1, BCL2, BCL2Al(Bfl-l/Al), BCL2LI (BCL-X), BlRC2(c-lAPl), BIRC3 (c-IAP2), ICAM1, SELE, VCAM1, eNOS, ¡NOS, NFKB1, ACTB, MYD88, TIRAP, HSPD1, MAP2K3, TICAM, SARM1, TOLLIP, HRAS, HSPA1, MAPK8, EIF2AK2, PPARA ,TRAF6, UBE2, FADD, IRAKI, MAP3K7,

IRAKI, IRAKI, PELI1, RIPK2 MAP3KI, MAP4K4, REL, IKBKB, RELA (p65), NFRKB, NFKB2, TNF, IL1B, IL8, IL6, IL-10, IFNG, NRF2, KEAP1, STAT3, PPARG, MYODI, MYOG, MYF5, MRF4 (MYF6), RUNX2, SPPI, OCN, LPL и АР2 (FABP4) оценивали методом ПЦР в реальном времени (Barbour et al., 2012). Из клеток выделяли РНК с использованием наборов YellowSolve («Клоноген», Россия). Концентрацию РНК определяли с помощью красителя Quant-iT RiboGreen RNA reagent («MoBiTec», Германия), Хвозб=487 нм, Хфлу=524 им. Реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью реактивов фирмы «Силекс» (РФ). ПЦР проводили с использованием соответствующих праймеров ("Синтол") и интеркалирующего красителя SybrGreen на приборе StepOnePlus («Applied Byosystems», США). Праймеры отобраны из PrimerBank. Условия ПЦР подбирались индивидуально для каждой пары праймеров. Уровень экспрессии генов анализировали в нескольких независимых экспериментах на клетках от разных доноров, обработку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения прибора; ошибка составляла 2%.

Уровень экспрессии белков TLR9, AIM2, iNOS, eNOS, peNOS, N0X4, Ki-67, PCNA, p65(NF-kB), STAT3, NRF2, CD31, CD34, CD45, HLA-ABC, HLA-DR, CD44, CD29, CD49b, CD54, CD90, CD106, CD105, CD117 определяли методом проточной цитометрии. Локализацию белков в клетках исследовали с использованием иммуноцитохимического метода. Клетки фиксировали раствором формальдегида, инкубировали с антителами (первичными, и, при необходимости, вторичными), меченными FITC или РЕ («Sigma», США) (Larsson L.I., 1993).

Уровень синтеза цитокинов: ИЛ-6, ИЛ-10, фактора некроза опухоли альфа определяли с помощью иммуноферментных тест-систем для количественного определения соответствующих цитокинов (ООО «Цитокин», Россия) по прилагаемым производителем методикам (http://www.cytokine.ru).

Статистическую обработку проводили с использованием программы Excel Microsoft Office, Statistica 6.0, StatGraph. При анализе предполагаемых различий между выборками исходили из нуль-гипотезы об отсутствии различий, которую проверяли с помощью расчета U-критерия Манна-Уитни. Различия достоверны при р < 0,05. Распределения параметров сравнивали по методу Колмогорова-Смирнова.

результаты и обсуждение

1. Основные характеристики вкДНК плазмы крови человека

К числу наиболее общих характеристик вкДНК относятся концентрация вкДНК в плазме крови, содержание в составе вкДНК ГЦ - богатых последовательностей генома и уровень окислительной модификации оснований ДНК. Приводятся, подчас противоречивые, сведения о повышении концентрации вкДНК в плазме крови при патологии (Gonzalez-Masia J.A. et al., 2013; Hong H. and Zu Y., 2013; Schwarzenbach H. 2013; Swarup V. et al., 2007). Чтобы понять, в каких случаях концентрация вкДНК может служить маркером повышенной гибели клеток организма, концентрацию

вкДНК определили в плазме крови 1349 человек. На рисунке 1 приводятся значения концентраций вкДНК, определенные для некоторых выборок.

Рисунок 1. Кумулятивные распределения концентрации вкДНК в различных подгруппах, численность выборок указана на рисунке. Контроль - здоровые доноры (N=390).

А — сосудистая патология: атеросклероз мозговых артерий (АС), артериальная гипертензия (АГ) и острое нарушение мозгового кровообращения

(ОНМК). АГ и АС достоверно отличаются от контрольной и выборки ОНМК (критерий Комогорова - Смирнова, р«0,0001).

Б - аутоиммунная патология: ревматоидный артрит (РА) и системная красная волчанка (СКВ), р<0,0001.

В - хроническое облучение малыми дозами, источник указан на рисунке. Выборка лиц, работавших с гамма-

нейтронными источниками

достоверно отличается от контрольной выборки, р<0,0001.

И)1 1<>: 10' 104 К)5 Концентрация вкДНК, нг/мл (логарифмическая шкала)

Контроль

СКВ N = 41

РА

N = 65

— ИИ трития

N = 88

ОНМК

N = 35

В плазме крови здоровых лиц концентрация вкДНК варьировала от 0,2 до ~ 2000 нг/мл, медиана 130 нг/мл, распределение отличается от нормального. Концентрация вкДНК плазмы крови повышается у части больных ревматоидным артритом (РА) и системной красной волчанкой (СКВ), у больных с сосудистой патологией. При остром инфаркте миокарда (ОИМ) и остром нарушении мозгового кровообращения (ОНМК) концентрация вкДНК увеличивается в несколько раз. Однако увеличение концентрации вкДНК, которое часто используют как маркер

патологического процесса, не достаточно точно отражает наличие хронической патологии. В плазме крови небольшой части больных и в плазме облученных людей обнаружили значительное снижение концентрации вкДНК (р<0,0001; рисунок 1). Снижение концентрации вкДНК на фоне повышенного уровня повреждения ДНК лимфоцитов крови могло быть обусловлено активацией эндонуклеазной активности плазмы крови. Для доказательства сравнили активность ДНКазы 1 в плазме крови облученных и не облученных лиц. В контрольной группе активность ДНКазы 1 варьирует от 0,2 до 12 нг/мл (медиана 2,2 нг/мл, N= 200), в группе облученных лиц активность ДНКазы 1 изменяется в интервале от 0,4 до 25,5 нг/мл (медиана 4,5 нг/мл, N=176), (D=0,59, р «10-5, метод Колмогорова-Смирнова). Таким образом, резкое увеличение концентрации вкДНК происходит в случае острой фазы заболевания, такого, как ОИМ или инсульт (ОНМК). При хроническом неостром процессе, вызванном заболеванием или внешним воздействием, когда увеличивается эндонуклеазная активность плазмы крови, концентрация вкДНК не отражает реальный уровень повреждений ДНК и гибели поврежденных клеток.

Повышение эндонуклеазной активности плазмы крови направлено на снижение молекулярного веса фрагментов вкДНК путем образования двунитевых разрывов за счет накопления однонитевых разрывов ДНК. Низкомолекулярные фрагменты выводятся почками. Если последовательность ДНК устойчива к образованию двунитевых разрывов, то, не смотря на наличие однонитевых разрывов, такая ДНК циркулирует в виде высокомолекулярных фрагментов и накапливается в составе вкДНК. Одной из таких последовательностей является транскрибируемая область рибосомного повтора человека (рДНК) (Вейко H.H., Спитковский Д.М., 2001). Рибосомный повтор (42999 п.н) локализован в геноме на 5 парах акроцентрических хромосом в виде тандемных повторов (300 - 700 копий на диплоидный геном) (Hamperl S. et al., 2013); рДНК (13 314 п.н.) содержит 60 - 85% ГЦ - пар, что обеспечивает высокую температуру плавления участкам рДНК, содержащим однонитевые разрывы. Для оценки количественного содержания рДНК в геноме разработан метод нерадиоактивной количественной гибридизации на мембранах (Вейко H.H. с соавт., 2003); рДНК выбрана в качестве маркера, отражающего накопление в составе вкДНК ГЦ-богатых фрагментов.

Для доказательства обогащения вкДНК по сравнению с клеточной ДНК ГЦ-богатыми последовательностями проанализировали содержание рДНК в 736 образцах вкДНК, выделенных из плазмы крови человека, и 716 образцах геномной ДНК, выделенной из клеток крови (таблица 1). Выборка включала образцы вкДНК плазмы крови: практически здоровых лиц; больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и ревматоидным артритом (РА) с хроническим, неострым течением заболеваний; пациентов с атеросклерозом сосудов головы и артериальной гипертензией (АГ); беременных женщин (1 триместр беременности); больных ОИМ и ОНМК в неострой фазе течения заболевания; лиц, которые работают с источниками ионизирующего

излучения. Большинство случаев характеризуется сравнительно небольшим, но хроническим повышением уровня гибели клеток в организме, который не сопровождается увеличением общей концентрации вкДНК плазмы крови. Как следует из таблицы 1, фрагменты рДНК накапливаются в составе вкДНК по сравнению с геномной ДНК в норме, при патологии, при внешнем воздействии и при беременности. При хронических процессах содержание рДНК в составе вкДНК возрастает в несколько раз по сравнению с содержанием рДНК во вкДНК здоровых людей (статистика Колмогорова-Смирнова, а « Ю"10).

Содержание ТОрДНК, пг/нг, медиана (интервал варьирования) Содержание ТОрДНК, относительно генома N

1 Практически здоровые доноры 2,9 (0,7 -14,1) 1,7 187

2 Ишемическая болезнь сердца 18,0 (5-41,2) 10 18

3 Ревматоидный артрит 6,6(0,1-21,3) 4 14

4 Беременность 7,0 (0,5 - 52,9) 4 68

5 Атеросклероз мозговых артерий 16,6 (0,4 - 124) 9 30

6 Артериальная гипертензия 10,2 (0,5-15) 6 64

7 Инсульт 2,2(0,1-7,2) 1,2 19

8 Острый инфаркт миокарда 9,6 (0,1-40,2) 5 7

9 Ионизирующая радиация 4,8(0,3-151) 3 329

10 Геном человека 1,7 (0,89 - 2,99) 1 716

Таблица. 1. Определение содержания рДНК в образцах вкДНК (строки 1-9) и клеточной ДНК (строка 10) человека. Распределения содержания рДНК в составе вкДНК отличаются от распределения содержания рДНК в составе клеточной ДНК (статистика Колмогорова-Смирнова, а« Ю"10).

Дополнительным подтверждением увеличения содержания ГЦ-последовательностей генома в составе вкДНК является снижение содержания во вкДНК AT- богатого фрагмента генома - субфракции сателлита III, который локализован в прицентромерном районе lql2 первой хромосомы человека (СатШ) и представлен в геноме несколькими тысячами копий (Richard М.М. et al., 2008). Содержание СатШ в геномной ДНК 126 здоровых доноров и 329 облученных лиц варьировало от 10 до 40 пг/нг (среднее 24 ± 6 пг/нг), распределения содержания СатШ не отличались от нормального и с высокой вероятностью не отличались между собой (р > 0,5, критерий Стьюдента). Распределения содержания СатШ в циркулирующей вкДНК в группе облученных лиц и в контрольной группе отличались от нормальных распределений, значительно отличались от соответствующих распределений содержания СатШ в геномной ДНК и различались между собой (статистика Колмогорова-Смирнова, а « 10~7, рисунок 2).

Рисунок 2. Сравнение содержания СатШ в составе вкДНК плазмы крови в контрольной выборке (N=126) и в выборке облученных лиц (N=329). Распределения различаются между собой (статистика Колмогорова-Смирнова, а « 10-7).

В контрольной группе содержание СатШ в составе вкДНК варьировало от 1,2 до 84 пг/нг (медиана 19 пг/нг), в группе облученных лиц содержание СатШ варьировало от 0,01 до 124 пг/нг (медиана 6 пг/нг).

Увеличение содержания ГЦ - богатой рДНК в составе циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы периферической крови является маркером хронических неострых процессов в организме, которые сопровождаются увеличением уровня гибели клеток организма, но не приводят к существенному увеличению общей концентрации циркулирующей ДНК (Костюк C.B. и соавт., 2008; Вейко Н.Н. и соавт., 2007).

В составе вкДНК обнаружено повышение содержания маркера окисления ДНК - 8-oxodG. ВкДНК больных ОИМ содержала 400 - 2100 (8-oxodG)/106 нуклеозидов; вкДНК больных РМЖ содержала ~ S100 (8-oxodG)/106 нуклеозидов (Loseva P.A. et

al., 2012). В составе геномной или вкДНК здоровых лиц содержание 8-oxodG не превышало I (8-oxodG)/106 нуклеозидов. Основная причина обогащения вкДНК 8-oxodG - это преимущественная гибель клеток с высоким уровнем окисления клеточной ДНК и увеличение содержания ГЦ-богатых последовательностей в составе вкДНК по сравнению с ядерной ДНК (Ermakov A.V. et al., 2013).

2. Изменение свойств вкДНК изменяет функциональную активность генома культивируемых клеток человека

Таким образом, установлено, что при патологии или внешнем воздействии на

организм человека изменяются концентрация вкДНК, ее ГЦ-состав и уровень окислительной модификации. Чтобы определить, влияет ли обнаруженное изменение свойств вкДНК на функционирование клеток организма, воспользовались распространенной моделью — культивируемые клетки различного типа. Для

исследования выбраны дифференцированные клетки: эндотелия (HUVEC, N=9), лимфоциты периферической крови (N=24), фибробласты кожи (HDF, N=4) и эмбриональные фибробласты легкого человека (HEF, N=3). Недифференцированные

клетки; мезенхимные стволовые клетки жировой ткани, дельтовидной мышцы,

пуповины (МСК, N=17) и стволовые клетки костного мозга (N=2). Раковые клетки -культивируемая линия аденокарциномы молочной железы (МСР7). В среду культивирования клеток человека добавляли образцы ДНК с различными свойствами, моделируя увеличение концентрации вкДНК, увеличение содержания рДНК и увеличение содержания окисленных фрагментов в составе вкДНК.

2.1. Локализация фрагментов вкДНК с различными свойствами в клетках

человека

Флуоресцентно меченую ДНК добавляли к среде культивирования ниУЕС и МСР7 (50 нг/мл, 30 мин). Флуоресценцию анализировали в фиксированных формальдегидом клетках (приводятся данные для НЦУЕС и МСР7). Неокисленные фрагменты вкДНК, независимо от ГЦ-состава, связываются с поверхностью клеток (рисунок ЗА). Окисленная вкДНК транспортируется в цитоплазму клеток и локализуется вблизи поверхности ядра (рисунок ЗБ).

А „ „ „ш,. П1Ш^Л111,______ Б

НКокси

Видимый свеч гДНКгс(1 ОАР1+1 ДНКт! Видимый свет гДНКокси-т!

Рисунок 3. Взаимодействие с клетками ниУЕС и МСР7 неокисленной вкДНК (А) и окисленной вкДНК (Б) (увеличение Х40).

Через 30 мин после добавления вкДНКокси к клеткам более, чем в 2 раза возрастает количество клеток с увеличенной экспрессией белка ЕЕА1, который является маркером ранних эндосом, поэтому можно предположить, что окисленная ДНК проникает в цитоплазму клеток путем эндоцитоза.

2.2. Изменение свойств вкДНК индуцирует в клетках синтез АФК

Количество АФК в HUVEC, МСК, MCF7, HEF и HDF определено с использованием H2DCFH-DA. Разгорание флуоресценции DCF при связывании с АФК определяли методом флуоресценции (планшетный ридер), флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Изменение свойств вкДНК в среде культивирования индуцировало в клетках разного типа кратковременный окислительный стресс (рисунок 4А). Время развития окислительного стресса зависит от типа клеток и варьирует от 15-30 минут для МСК и MCF7 до 3 часов в случае HUVEC (рисунок 4А). Окисленные фрагменты вкДНК в гораздо большей степени

стимулируют синтез АФК в клетках, чем ГЦ-богатые фрагменты ДНК и неокисленная ДНК. Одним из основных источников АФК в цитоплазме клеток при действии на клетки окисленной ДНК являются митохондрии. Большинство сигналов красителя митохондрий (МЦо-1гаскег) и ОСР, выявляющих АФК, локализованы вблизи друг друга и частично перекрываются (рисунок 4Б).

MCF7

А контроль г ДНК гДНКокси Б гДНКокси

Рисунок 4. А - Влияние окисленных и неокисленных образцов геномной ДНК (50 нг/мл) на уровень АФК в клетках MCF7 и HUVEC. Время действия - 30 минут (MCF7), 1 час и 24 часа (HUVEC). Б - Митохондрии - основной источник АФК при действии на клетки окисленной ДНК. MCF7 обрабатывали гДНКокси (30 мин, 50 нг/мл), красителем митохондрий - Mito-tracker Red 580 (15 мин) и H2DCFH-DA (15 мин), (х200).

Одним из основных источников АФК в клетке при физиологических условиях являются NADPH - оксидазы (NOX). Фермент NOX4 расположен на мембране HUVEC, МСК и MCF7, и в митохондриях раковых клеток MCF7, его экспрессия регулируется на уровне транскрипции гена (Weyemi U. et al., 2012). В разных типах клеток окисленные вкДНК вызывают кратковременное повышение уровня экспрессии гена NOX4: в HIJVEC - в течение часа (в 3-6 раз), в МСК и MCF7 - в течение 20-30 минут (в 2-3 раза). Неокисленные ГЦ-богатые фрагменты в меньшей степени воздействовали на уровень экспрессии гена NOX4 в HUVEC и MCF7 (уровень экспрессии гена NOX4 повышается только в 1,5 раза в течение 3-х часов). В МСК воздействие неокисленных и ГЦ-богатых фрагментов приводит к повышению уровня экспрессии гена NOX4 через 1 час после добавления (в 2,5 раза). Повышение экспрессии гена NOX4 при действии окисленной и неокисленной ДНК происходит и на уровне белкового продукта - белка NOX4 (показано для HUVEC).

2.3. Изменение свойств вкДНК стимулирует окислительную модификацию и образование разрывов в ДНК клеток

Увеличение количества активных форм кислорода (АФК) в околоядерном пространстве клеток различного типа при изменении ГЦ-состава или при окислении вкДНК приводит к окислению ДНК ядер (показано для MCF7), что, в свою очередь, ведет к образованию одно - и двунитевых разрывов в цепи ДНК ядер. Уровень повреждения ДНК в ядрах клеток HUVEC, МСК, MCF7, HEF и HDF оценивали методом комет (щелочной вариант), методом анализа фосфорилированной формы гистона Н2АХ и TUNEL-методом. Одно- и двунитевые разрывы ДНК образуются в ядрах клеток через 30 минут после изменения свойств вкДНК во всех исследованных типах клеток (рисунок 5). Через 3 часа их количество снижается.

Рисунок 5. А, Б - Примеры ядер клеток HUVEC (А) и MCF7 (Б) через 30 минут после воздействия окисленной и неокисленой ГЦ-богатой вкДНК (50 нг/мл), метод комет. В - примеры ядер клеток HUVEC, МСК и MCF7 с двунитевыми разрывами через 30 минут после воздействия окисленной вкДНК (50 нг/мл), анализ фосфорилированной формы гистона Н2АХ.

окисленная ДНК

Наиболее сильные повреждения хроматина с образованием одно- и двунитевых разрывов при введении в среду культивирования окисленных фрагментов ДНК наблюдаются в культурах НиУЕС и МСР7.

Одно- и двунитевые разрывы ДНК, возникающие в клетках в течение 30 минут после резкого изменения свойств вкДНК, способствуют появлению клеток с признаками нестабильности генома. В МСБ7 наблюдается образование микроядер, выпячивание ядерной мембраны, образование мостиков хроматина между ядрами (рисунок 6).

(1) (2)__(3)__(4)

1 ■r^J^A. [ЛыЛ ' 1 ^ Ш1......■■

f^^^hpPn^^E ЛШ

да^П

■¿А Ш Шшл и 1

Рисунок 6. Примеры образования микроядер (2), мостиков хроматина (3), деконденсации хроматина в М-фазе цикла (4) после действия гДНКокси (50 нг/мл, 24 часа) на активно делящиеся клетки МСР7; (1) - контроль. Увеличение *100.

Анализ динамики изменения содержания в клетках разных типов фракции subGl, включающей микроядра различного размера и клетки со сниженным содержанием ДНК, показал транзиторное увеличение фракции subGl при действии на клетки окисленной фракции вкДНК.

2.4. Изменение свойств вкДНК влияет на клеточный цикл

Окислительный стресс, вызывающий повреждения ДНК ядер, приводит к остановке клеточного деления на всех стадиях клеточного цикла и блокированию пролиферации (Shackelford R.E. et al., 2000). Влияние ГЦ-богатых и окисленных образцов вкДНК на количество пролиферирующих клеток в культурах HUVEC, MCF7, МСК, HDF и HEF анализировали, используя антитела к маркерам пролиферации Ki-67 и PCNA (Gerdes A.M. et al., 1984, Bologna-Molina R. et al., 2013) и метод проточной цитометрии. Для определения количества ДНК клетки окрашивали пропидий йодидом. Воздействие образцов окисленной и ГЦ-богатой ДНК в клетках эндотелия, фибробластах и MCF7 (а в случае МСК только окисленной ДНК) вызывает кратковременное блокирование пролиферативной активности. В клетках MCF7 снижается уровень экспрессии маркеров пролиферации Ki-67 и PCNA при действии образцов окисленной и ГЦ-богатой вкДНК. В клетках HUVEC, МСК, HEF и HDF уровень экспрессии маркера пролиферации Ki-67 снижается на фоне повышения количества PCNA. Это связано с активацией процессов репарации, поскольку PCNA является фактором транскрипции полимеразы дельта, которая принимает участие и в репарации ДНК (Moore J.О. et al., 2004).

Снижение пролиферативной активности обусловлено блокированием клеточного цикла на всех стадиях (Wells А. et al., 2013). Исследовали, в какой фазе клеточного цикла происходит его остановка при действии окисленных фрагментов ДНК на клетки с разным пролиферативным потенциалом: HUVEC, МСК, MCF7. Для этого сравнивали содержание ДНК в ядрах клеток и уровень белка Ki-67 при действии фрагментов вкДНК. В значительной части клеток MCF7 воздействие окисленной вкДНК и, в меньшей степени, неокисленной вкДНК, блокирует клеточный цикл в G0/G1- фазе. При инкубации MCF7 с фрагментами окисленной ДНКокси (50 нг/мл, 48 часов) общее количество клеток в G0/G1 фазе клеточного цикла возрастает, а количество клеток в S- и G2/M- фазах клеточного цикла снижается. В меньшей степени этот эффект выражен при культивировании MCF7 48 часов в присутствии неокисленной гДНК. В HUVEC фрагменты ГЦ-богатой и окисленной ДНК (50 нг/мл, 48 - 72 часа) вызывают остановку в Gl -, S- и G2/M- фазах клеточного цикла.

Полученные результаты мы подтвердили данными об изменении экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла. Регулирующие элементы могут остановить деление в любой контрольной точке: Gl, G2/M и М (Grady W.M. et al., 2008). Циклин Dl запускает фазу Gl клеточного цикла, играет ключевую роль в

регуляции перехода клеток из фазы клеточного цикла 01 в фазу Б, уровень экспрессии белка циклина 01 регулируется на стадии транскрипции (ЗЫвИосНа Б. 2013). В НиУЕС и окисленные, и ГЦ-обогащенные фрагменты вкДНК (50 нг/мл, 0,53 часа) снижают уровень экспрессии гена ССАЮ7 на 40 - 60 % (рисунок 7).

А Б В

HUVEC CCND1 MCF7 ССУД/ МСК CCND1

п(рДНК) i ДНК гДПКокси п(рДПК) i ДНК гДПКокси и(рЛНК) гДНК гДПКоксп

Рисунок 7. Динамика изменения уровня экспрессии гена циклина DI - CCND1 в клетках HUVEC, MCF-7 и МСК. Приведены средние значения 3-х независимых экспериментов на культурах, полученных от разных доноров, и SD. В качестве гена внутреннего стандарта использовали ген ТВР (TATA box binding protein ). Горизонтальная зеленая линия - средний уровень экспрессии генов интактных клеток эндотелия (1 ± 0,2 отн. ед.) (*) - значения достоверно отличающиеся от контроля (р<0.005, критерий Манна-Уитни).

В MCF7 уровень экспрессии гена CCND1 снижается на 40% в течение 0,5 - 2 часов при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК (рисунок 7). Таким образом, в клетках эндотелия и в раковых клетках происходит ингибирование экспрессии гена CCND1 в первые часы после воздействия как окисленных, так и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК, что подтверждает остановку клеточного цикла в фазе G1. В культуре МСК мы не зарегистрировали снижения уровня экспрессии гена CCND1 при действии фрагментов вкДНК (рисунок 7).

Ген CDKN2 кодирует белок р16, регулятор клеточного цикла, который, связываясь с CDK4 и CDK.6, нарушает связывание циклина D1 с циклин-зависимыми киназами (Pei Х.Н. et al., 2005). Ген CDKN1A кодирует белок р21, ингибитор киназ, оказывающий негативное воздействие в фазе G1 клеточного цикла (Velasco-Velázquez M. et al., 2011). Повышение уровня экспрессии генов CDKN2 и CDKN1A может приводить к G1-аресту (Jiang N. et al., 2013). В клетках HUVEC и MCF7 в присутствии всех образцов ДНК, независимо от ГЦ - состава и уровня окисления, экспрессия генов CDKN2 и CDKN1A возрастает в 2 - 3,5 раза в течение 3-48 часов. Это указывает на блокирование перехода G1/S, что согласуется с данными по экспрессии гена CCND1, а также данными, полученными другими методами. К 72 часам экспрессия генов CDKN2 и CDKN1A в клетках HUVEC и MCF7 снижается до уровня контроля. В МСК экспрессия генов CDKN2 и CDKN1A возрастает в 1,6 - 1,9 раза в течение первого часа только в присутствии образцов окисленной вкДНК, неокисленные образцы не влияют на экспрессию генов CDKN2 и CDKN1A. Увеличение количества РНК генов CDKN2 и CDKN1A в клетках эндотелия и клетках

MCF7 подтверждает блокирование деления в фазе Gl при увеличении в несколько раз концентрации внеклеточной ДНК в среде культивирования клеток.

2.5. Изменение свойств вкДНК сопровождается активацией репарации

ДНК

Повреждение ДНК ядер клеток в результате окислительного стресса активирует в клетках сигнальные каскады, которые контролируют остановку клеточного цикла и репарацию ДНК (Goodarzi A.A. and Jeggo P.A., 2013). Двунитевые разрывы ДНК (ДР) составляют одну из самых опасных форм повреждения ДНК (Mermershtain I. and Glover J.N., 2013). BRCA1, ядерный белок, продукт гена BRCA1, принимает участие в регуляции клеточного цикла и репарации двунитевых разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации (Mermershtain I and Glover J.N., 2013).

Одновременно с изменением экспрессии генов, контролирующих клеточный цикл, при увеличении концентрации вкДНК в среде культивирования клеток

Рисунок 8. Динамика изменения уровня экспрессии гена BRCA1 в клетках HUVEC (A), MCF7 (Б) и МСК (В). Результат представлен как изменение экспрессии гена в стимулированных клетках по отношению к не

стимулированным. Экспрессия генов проверена в независимых экспериментах на разных культурах клеток. Данные представлены как среднее значение трех экспериментов и стандартного отклонения. Г -уровень экспрессии BRCA1 в культуре МСК с гетерозиготной мутацией в гене BRCA 1 -5382insC (3 часа, 50 нг/мл).

Этот факт подтверждает наблюдение, сделанное при анализе белка PCNA, о переключении при изменении концентрации вкДНК процессов клеточного деления на процессы, связанные с репаративным синтезом. При действии образцов вкДНК, независимо от ГЦ-состава и уровня окисления, на культуру HUVEC экспрессия гена

BRCA1 повышается в ~2 раза через 3 часа инкубации и сохраняется более 48 часов

(рисунок 8А). Окисленные фрагменты вызывают повышение экспрессии гена BRCA1

возрастает экспрессия гена BRCA J (рисунок 8).

3 S ,

HUVEC вксл1

3 24 48 72 3 24 4Я 72 3 24 48 72 1

п(рДИК) гДНК гДИКоксп

о ^ d

85?

MCF7 вксл1

fl-tt-W

24 48 24 48 24 48 'I

п(рДНК) гДНК гДИКоксп

мск hrca i

МСК икса i mm

x т i

5 =5

;м

0,5 I 3 24 0,5 1 3 24 п(рДНК) гДНК

0.5 1 3 24 ч гДИКоксп

с. о

>' - 1

и(рДНК) гДНК гДНКокси

в MCF7 в ~ 6 раз через 2 часа после начала воздействия, к 48 часам экспрессия

BRCA1 падает. Неокисленные ГЦ-богатые фрагменты стимулируют повышение экспрессии гена BRCA1 в MCF7 позже - через 48 часов экспрессия BRCA1 повышена

в - 3 раза при действии ГЦ-богатой п(рДНК) (рисунок 8Б). Геномная ДНК не влияет

на экспрессию гена BRCA1 в MCF7. В МСК ГЦ-богатые фрагменты п(рДНК) вызывают наибольшее повышение экспрессии гена BRCA1 - в 6,7 раза через 3 часа (рисунок 8В). Окисленные фрагменты гДНКокси, индуцируют повышение экспрессии гена BRCA1 в МСК в 3 - 4,5 раза. Неокисленные фрагменты вкДНК также повышают экспрессию BRCA1 в МСК, но в меньшей степени, чем окисленные (рисунок 8В). В культуре МСК с мутацией в одном из аллелей гена (МСК BRCAlmut - 5382insC) уровень экспрессии гена BRCAI повышается сильнее, чем в культуре без мутации. Вероятно, наличие только 1 немутантного аллеля приводит к тому, что усиливается функционал гена при поврежденной матрице (рисунок 8Г).

Таким образом, как окисленные, так и неокисленные фрагменты вкДНК активируют в клетках репарационные системы, что в конечном итоге приводит к уменьшению через 3 часа разрывов ДНК ядер клеток, которые были вызваны повышением уровня АФК.

Активация репарационных процессов подтверждается и наблюдаемыми в клетках перемещениями локусов хроматина ядер. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают сближение локусов lql2 1-й хромосомы в ядре клеток HUVEC, МСК и лимфоцитах, и их перемещение к центру ядра. Ранее показано, что наблюдаемые перемещения хроматина - составляющая часть репарационного ответа на повреждения ДНК (Спитковский Д.М., 2005).

2.6. Изменение свойств вкДНК снижает интенсивность гибели клеток

Поскольку изменение свойств вкДНК приводит к аресту клеточного цикла и снижению пролиферативной активности клеток, логично было бы предположить уменьшение со временем клеточной популяции при действии ГЦ-ДНК и ДНКокси. Однако все исследуемые культуры клеток (HUVEC, МСК, MCF7, HEF и HDF) сохраняли и даже увеличивали на 10-20% общее количество клеток по сравнению с контролем на фоне снижения пролиферативной активности в присутствии вкДНК. Этот факт указывает на снижение уровня гибели клеток.

Действительно при оценке интенсивности апоптоза во всех исследуемых культурах клеток с использованием раннего маркера апоптоза белка анексина 5 (Wlodkowic D. et al., 2013) или при анализе морфологии ядер обнаружено значительное и достоверное снижение количества клеток с признаками апоптоза. Подтверждением снижения количества погибающих клеток в культурах, обработанных ГЦ-богатыми и окисленными ДНК, является уменьшение в несколько раз концентрации собственной внеклеточной ДНК в среде культивирования клеток.

Фрагменты ГЦ-богатой и окисленной вкДНК снижают также активность фермента апоптоза каспазы 3 в HUVEC, МСК и лимфоцитах (р<0.05). Воздействие вкДНК на активность каспазы 3 зависит от концентрации и степени окисления фрагментов вкДНК, низкие концентрации окисленной вкДНК в большей степени ингибировали апоптоз, чем сильноокисленные. Фрагменты ГЦ-богатой вкДНК ингибировали апоптоз в интервале концентраций 5-100 нг/мл.

Ключевую роль в регуляции выживания клетки и апоптоза играют белки семейства Вс12 (Cory S. et al. 2003). Белок Bcl-2 и четыре родственных ему белка (BCL -XL, Bel -W, Al, и Mcl- 1) способствуют выживанию клетки (Cory S. et al. 2003).

Ингибиторы белков апоптоза (IAP - inhibitors of apoptosis proteins,) подавляют активность каспаз -3,-7,-9 (Silke J. and Meier Р., 2013). В условиях стресса, когда активируются процессы, направленные на выживаемость популяции клеток, происходит активация экспрессии антиапоптотических генов (Muñoz-Pinedo С., 2012).

Мы исследовали активацию экспрессии генов антиапоптотических белков семейства BCL-2 (BCL2, BCL2A1, BCL2LI), BIRC2(c-IAPl) и BIRC3 (с-1АР2) при действии на разные типы клеток вкДНК.

Анализ количества мРНК BCL2, BCL2Al(Bfl-l/Al), BCL2L1 (BCL-X), BIRC2(c-IAP1) и BIRC3 (с-1АР2) в HUVEC показал, что в ответ на изменение концентрации вкДНК в клетках значительно активируются процессы, направленные на предотвращение апоптоза, что согласуется с данными об отсутствии значимых изменений в общем количестве клеток, не смотря на блокирование пролиферации. Экспрессия генов семейства BCL2, BIRC2 и BIRC3 возрастает через 3 часа и остается повышенной в 1,5 - 3 раза на протяжении 72 часов (рисунок 9А). Активация экспрессии антиапоптотических генов наблюдается и при действии вкДНК на культуру MCF7.

При действии окисленных фрагментов (гДНКокси и п(рДНК)окси) и ГЦ-богатых фрагментов п(рДНК) на MCF7 уже через 0,5 часа количество мРНК BCL2, BCL2AI(Bfl-I/Al), BCL2L1 (BCL-X) возрастает в 1,5-2 раза, повышаясь к 48 часам в 2 - 4 раза (рисунок 9Б). Неокисленная гДНК значимо (в 1,9 - 3,5 раза) стимулирует повышение экспрессии генов семейства BCL2 в MCF7 только через 48 часов (рисунок 9Б). ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК в 2 - 3 раза повышают экспрессию генов BIRC2 (с-1АР1) и BIRC3 (с-1АР2) (рисунок 10 Б). При действии вкДНК на MCF7 не возрастает, или незначительно снижается уровень экспрессия проапоптотического гена В АХ. Активация антиапоптотических генов и супрессия гена ВАХ согласуется с полученными данными о возрастании количества клеток популяции MCF7 при действии фрагментов вкДНК. В клетках MCF7, так же, как и в HUVEC, вкДНК блокирует процесс апоптоза.

Ни\'ЕС

ВСЬ2 HCL2.il

ВСГ.21.1 СВСГ.-Х)

МСР 7

24 48 72 г ДНК

НШ'ЕС

3 24 48 72 л гДНКокси

■ В1КС2 (С-1ЛР2)

• вига (с-1лрц

3 24 48 72 гДНКоксп

■ ВС1.2

■ ВСТ.2Л1 ВСЬ2Ы (ВСЬ-Х)

ш и! Ы

о Ч

о О

§■5

а о

0,5 2 48 п(рДНК)

тНЙг

0,5 2 48 гДНК

МСР 7

0,5 2 48 ч гДНКоксп

■ В1ПС2 (С-1ЛР2) • втез (с-1АР1)

0,5 2 48 п(рДНК)

0,5 2 48 гДНК

0,5 2 48 гДНКокси

МСЕ 7 вах

г 0,4 = 0.2

5 1- 0,5248 0.5248 0,5248т

1|(рДНК)гДНК гДНКокси

Рисунок 9. Уровень экспрессии генов семейства ВСЬ2: ВСЬ2, ВСЬ2А1, ВСЬ2И; ВЩС2 (с-1АР1) и ВЦ{СЗ (С-1АР2) при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК на НиУЕС (А) и МСР7 (Б) (50 нг/мл, время действия указано на рисунке). Приведены средние значения 3-х независимых экспериментов на культурах НиУЕС, полученных от 3-х разных доноров, и БО. В качестве гена внутреннего стандарта использовали ген ТВР. Горизонтальная зеленая линия - средний уровень экспрессии генов интактных клеток эндотелия (1 ± 0,2 отн. ед.) (*) - значения достоверно отличающиеся от контроля (р<0.05, критерий Манна-Уитни).

В МСК тоже возрастает экспрессия антиапототических генов при действии вкДНК. Экспрессия гена ВСЬ2 возрастает через 1 час в среднем в 1,5 - 2 раза после добавления окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК, к 3-м часам экспрессия гена Ва2 повышается в 3,5 - 5 раз и сохраняется на том же уровне через 24 часа (рис. 10А). Уровень экспрессии генов ВСЬ2, ВСЬ2А1, ВЫ2Ы, ВШС2(с-1АР1) и ВШСЗ (с-1АР2) в МСК повышается в 3 - 6 раз через 3 часа после начала воздействия гДНКокси и ГЦ-богатой п(рДНК) на МСК, гДНК повышает экспрессию перечисленных генов, в среднем, только в 2 раза. В культурах МСК с мутациями в генах ВЯСА1 (5382тэС) и р53 (миссенс-мутация Ь145р в 5-ом экзоне) наблюдается более активная экспрессия антиапоптотических генов ВСЬ2, ВСЬ2А1, ВСЬ2И -экспрессия этих генов возрастает примерно в 2 раза сильнее, чем в культурах МСК без мутации в генах ВЯСА1 и р53. Вероятно, столь сильный антиапоптотический

ответ в культурах МСК с мутациями в генах ВЯСА1 и р53 и активация гена репарации ВЯСА1 направлены на выживание клеток с дефектом в генах репарации и регуляции апоптоза.

Б МСК

МСК BCL2

g о ,

Ü9"

1Ы

Itt

1 -вал

2 - BCL2L1 (BCL-X)

3 -BCL2A1

4 - BIRC2 (с-Ш'2)

5 - ВГИСЗ (С-1ЛРЦ

МСК МСК

HRCAImut pSJimit

0J I ЛИ IIJ I 3 IJ ОД 1 ЛИ ч

п(рДНК) |Д11К гЛНКикси

iгз 12 3

ШрДНК) и(рДНК)

Рисунок 10. Уровень экспрессии гена ВС12 (А), генов ВСЛ2, ВСЬ2А1, ВСЬ2Ы, В1ЯС2 (с-1АР1) и В1ЯСЗ (с-1АР2) (Б) при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК на МСК (50 нг/мл, время действия указано на рисунке). Приведены средние значения 3-х независимых экспериментов на культурах МСК, полученных от 3-х разных доноров. В качестве внутреннего стандарта использовали ген ТВР. В - экспрессия генов ВС1.2, ВСЬ2А1, ВСЬ2И в культурах МСК с гетерозиготными мутациями в генах ВЯСА1 (5382ш8С) и р53 (Ы45р). *) - значения достоверно отличающиеся от контроля (р<0.005, критерий Манна-Уитни).

2.7. Изменение свойств вкДНК значительно повышает общий уровень транскрипционной активности генома

Изменение свойств вкДНК индуцирует в клетках разного типа одинаковый ответ: синтез АФК —» окисление ДНК ядер —>■ разрывы ДНК ядер—> остановка клеточного цикла, снижение уровня апоптоза —> активация репарации ДНК.

Активация сигнальных путей, направленных на выживание клеток, должна сопровождаться повышенной транскрипционной активностью генома клеток. Уровень транскрипции генома отражает общее количество РНК, образующейся в клетках. Количество РНК в клетке после воздействия фрагментов вкДНК определяли с использованием специфичного для РНК красителя Quant-iT™ RiboGreen RNA. Окисленные и ГЦ-богатые вкДНК стимулируют синтез общей РНК в клетке в 1,4 -1,7 раза (р<0,05), это характерно для клеток разного типа (лимфоцитов здоровых доноров, HUVEC, МСК и MCF7). Стимуляция синтеза РНК в клетках сопровождается изменениями структуры ядрышка, отражающими значительную активацию транскрипции рибосомных генов: увеличением числа центров, окрашенных нитратом серебра, и увеличением их суммарной площади. Методом ПЦР в реальном времени показано, что количество рРНК в клетках возрастает на 50%. Повышение транскрипционной активности генома является следствием активации сигнальных путей в клетках. Индукция экспрессии генов сигнальных путей происходит в результате связывания фрагментов вкДНК с клеточными ДНК-сенсорами.

2.8. ДНК-связывающие рецепторы, узнают вкДНК с измененными свойствами

Кандидатами для связывания вкДНК являются известные рецепторы, расположенные на мембране эндосом (TLR9), цитозольные рецепторы AIM2, RIG1 и неидентифицированный рецептор, адаптером которого служит белок STING.

TLR9. Последовательность рДНК и других ГЦ - богатых участков в составе вкДНК содержит большое количество неметилированных мотивов связывания с TLR9, что делает ее потенциальным лигандом TLR9 (Костюк C.B. и соавт., 2010). TLR9 являются трансмембранными внутриклеточными рецепторами, расположенными на мембране эндосом, связывание с TLR9 сопровождается активацией протеинкиназ семейства МАРК, фактора транскрипции NF-kB, увеличением индукции ряда цитокинов и выработкой активных форм кислорода (Yamamoto M. and Takeda К. 2010). Уровень экспрессии гена TLR9 повышается в 1,5 -4 раза при действии ГЦ-богатых ДНК (рДНК, вкДНК больных РА и СКВ) на разные типы клеток: лимфоциты здоровых доноров, CD34+ клетки и мононуклеары костного мозга, МСК, HUVECm MCF7 (рисунок 11).

А Б В Г

лимфоциты ЗД

CD 34+ костного мозга

мононуклеары костного мозга

лимфоциты больных СВК

МСК

HUVEC

MCF7

1 - Контроль

2 -п(рДНК)

3 - ДНКокси

4 - вкДНК РА

5 - вкДНК СКВ

4,5

I ö 4

ï ï J.5

я о

a Of 2.5

* , л 2

Sa" s. S 1

>■ 0.5

2 3,5

|1И

g-S 3!

к Of 2.5

ill11 ы

Рисунок 11. Уровень экспрессии гена TLR9 в лимфоцитах здоровых доноров (А), CD34+ клетках (Б), мононуклеарах костного мозга (В), лимфоцитах больного СКВ (Г), МСК (Д), HUVEC (Е), MCF7 (Ж) без воздействия и через 3 часа после добавления ГЦ-богатых или окисленных фрагментов ДНК в концентрации 50 нг/мл. Количество мРНК7£/?9 нормализовано по гену GAPDH (А - Г) и ТВР (Д - Ж). Данные приведены относительно контроля - интактных клеток того же донора (в случае В - здорового донора). Приведены средние значения для 3-6 экспериментов. (*) р <0,05.

Уровень экспрессии TLR9 в лимфоцитах периферической крови больных СКВ повышен в 3,2 раза по сравнению с уровнем экспрессии в лимфоцитах ЗД (рисунок 11, Г). Лимфоциты больных СКВ на однократное добавление ГЦ-богатой последовательности отвечали незначительным снижением уровня экспрессии гена TLR9 по сравнению с контролем. Вероятно, это проявление приспособительной реакции клеток на повышенную концентрацию вкДНК в организме больного СКВ и указывает на возможную функцию рДНК, как регулятора уровня экспрессии TLR9.

Экспрессия TLR9 возрастает при действии ГЦ-богатых фрагментов вкДНК в лимфоцитах ЗД, МСК и HUVEC не только на уровне экспрессии гена, но и на уровне экспрессии белка, что показано методом проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Вслед за повышением уровня экспрессии гена TLR9 при действии ГЦ-богатых фрагментов вкДНК в 1,5-4 раза увеличивается уровень экспрессии гена адаптера TLR9- сигнального пути - MyD88 во всех типах клеток, перечисленных выше. Увеличение экспрессии MyD88 свидетельствует о проведении сигнала через рецептор TLR9 и активации сигнального пути, ассоциированного с транскрипционным фактором NF-kB. При добавлении ГЦ-богатых фрагментов вкДНК на фоне ингибирования TLR9 олигонуклеотидом - ингибитором или хлорокином, количество РНКMyD88 не изменялось по сравнению с контролем.

AIM2. Попадая в клетку, вкДНК может взаимодействовать с цитозольным рецептором AIM2, что приводит к активации NF-kB, образованию инфламмосомы, активации каспазы 1 и индукции пироптоза (Hornung V. et al., 2009). Лигандом рецептора AIM2 служит двунитевая ДНК, независимо от ее размера и источника (Hornung V. et al., 2009). Как показал эксперимент по определению количества PHKL4/M2, изменение в среде культивирования концентрации любой вкДНК сопровождается увеличением экспрессии гена AIM2 в МСК, HUVEC, MCF7 и фибробластах (культивируемых в отсутствие сыворотки). Окисленная вкДНК в большей степени стимулирует экспрессию гена А1М2 (в 2 - 4 раза, р<0,005), чем неокисленные вкДНК (в 1,5 - 2, 5 раза, р<0,05). По-видимому, более сильное влияние вкДНКокси на экспрессию AIM2 связано с быстрым проникновением окисленных фрагментов внутрь клетки, в результате чего они становятся более доступными для цитозольного рецептора AIM2.

При действии окисленной вкДНК на МСК, HUVEC, MCF7 наряду с увеличением количества РНК AIM2 происходит повышение экспрессии самого белка AIM2. С помощью флуоресцентномеченной вкДНК исследовали, связывает ли рецептор AIM2 молекулы вкДНК, или экспрессия А1М2 в клетках повышается опосредованно. Для неокисленой ^HKRed связывание с рецептором А1М2 в HUVEC и MCF7 не выявлено (рисунок 12). Окисленная ДНК (^HKoKCuRed) способна проникать в клетку и частично колокализуется с рецептором AIM2: детектируется смешанное (желтое) окрашивание - показано для HUVEC (рисунок 12) и MCF7. Таким образом, окисленные фрагменты вкДЕ1К являются потенциальными

стимуляторами рецепторов А1М2. Неокисленная ДНК, окисляясь с поверхности клеток, может затем проникать в клетки и также выступать в качестве потенциального лиганда рецептора А1М2.

гДНКт! + AIM2 + DAP1 гДНКокси-red + AIM2 + DAPI AIM2 + DAPI

Рисунок 12. Колокализация внутриклеточных рецепторов AIM2 и меченых окисленных и неокисленных ДНК - зондов в HUVEC. Клетки эндотелия инкубировали в присутствии окисленных и неокисленнх образцов гДНКгес! (50 нг/мл, 3 часа), фиксировали формальдегидом и обрабатывали тритоном Х-100 (0,1 %) и антителами к рецепторам AIM2, конъюгированными с флуоресцеином, ядра окрашены DAPI.

Существует разница в активации экспрессии генов разных рецепторов фрагментами окисленной и ГЦ-богатой вкДНК. Уровень экспрессии цитозольного рецептора А1М2 повышается и на уровне РНК, и на уровне белка в ответ на присутствие окисленных фрагментов вкДНК, и, в гораздо меньшей степени - на ГЦ-рДНК. И окисленные, и неокисленные фрагменты двуцепочечной вкДНК активируют также экспрессию гена R1G1. Уровень экспрессия гена адапторной молекулы STING возрастает в присутствии неокисленной вкДНК.

2.9. Активация клеточных сигнальных путей в ответ на изменение свойств

вкДНК

NF-kB. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК вызывают активацию взаиморегулирующихся сигнальных путей, направленных на выживание клеток. К одним из основных относится сигнальный каскад, ассоциированный с транскрипционным фактором NF-kB (Nuclear factor kappa В). Для доказательства активации этого пути исследовали стимуляцию рецепторов TLR9 ГЦ-богатой вкДНК (см.выше), активацию транскриптома адаптеров и эффекторов TLR9 - и NF-kB -сигнальных путей (NFKB1, MYD88, TIRAP, HSPD1, МАР2КЗ, TICAM, SARM1, TOLLIP, HRAS, HSPAI, МАРК8, EIF2AK2, PPARA, TRAF6, UBE2, F ADD, IRAKI, МАРЗК7, IRAK2, IRAKI, PELII, RIPK2 MAP3K1, MAP4K4, MAP4K3, REL, IKBKB, RELA (p65), NFRKB, NFKB2). Активация NF-kB фрагментами вкДНК сопровождается его транслокацией в ядро с последующей активацией экспрессии генов - мишеней. На рисунке 13 приводятся данные для МСК.

Контроль 11(рДНК),30 мин п(рДНК),2 часа н(рДНК),24 часа

Рисунок 13. А - Внутриклеточная локализация компонента р65 NF-kB при инкубации клеток в присутствии гДНКокси и гДНК (50 нг/мл, 2 часа), увеличение Х40. Б - Доля клеток, содержащих NF-kB в ядре. Эксперимент выполнен на двух культурах МСК. В -Динамика ядерной транслокации NF-kB при действии гДНКокси, увеличение Х40, время воздействия обозначено на рисунке. (*) р <0,05.

На различных типах клеток исследовали повышение уровня экспрессии генов -мишеней NF-kB - про- и противовоспалительных цитокинов: TNFa, интерлейкинов: IL1B, IL8, IL6 и IL-10, молекул адгезии (ICAM1, SELE и VCAM1) и проследили динамику изменения синтеза некоторых цитокинов (TNF-альфа, IL6 и 1L10) в присутствии фрагментов вкДНК в лимфоцитах здоровых доноров, МСК, HUVEC и MCF7. Полученные данные полностью подтвердили определяющую роль транскрипционного фактора NF-kB в клеточном ответе на изменение свойств вкДНК.

NRF2. Транскрипционный фактор NRF2, ответственен за индуцибельную и конститутивную экспрессию ARE (antioxidant response element) - регулируемых генов (Pedruzzi L.M. et al., 2012). NRF2 регулирует антиокислительные и противовоспалительные ответы клеток (Lau A., et al., 2008). Изменение свойств вкДНК сопровождается существенным увеличением уровня экспрессии NRF2 в фибробластах, МСК и HUVEC на уровне транскрипции и трансляции. Максимальный эффект наблюдается в случае действия окисленной ДНК на МСК - уровень РНК NRF2 возрастает в 12 раз, уровень белка - в 2 раза. В фибробластах в отсутствие сыворотки при действии окисленной ДНК уровень РНКNRF2 и белка NRF2 возрастают в 5 раз. В раковых клетках NRF2 играет незначительную роль в ответе на изменение свойств вкДНК. Увеличение экспрессии NRF2 в фибробластах, МСК и HUVEC сопровождается его транслокацией в ядро, что является доказательством его активации, как фактора транскрипции. Активация NRF2 вызывает увеличение

экспрессии гена - мишени SODI, который конвертирует супероксиданион в менее активную молекулу HjCb.

STAT3 - один из семи белков семейства STAT, охарактеризованных в настоящее время у млекопитающих. Гиперэкспрессия STAT3 обнаруживается в большинстве клеточных линий рака человека (Kamran M.Z. et al., 2013). Увеличение экспрессии STAT3 при изменении свойств вкДНК анализировали в MCK, HUVEC и MCF7. Максимальное увеличение экспрессии STAT3 на уровне транскрипции и трансляции наблюдали в MCF7 в присутствии окисленной ДНК (в 3 раза). Неокисленная ДНК, независимо от ГЦ-состава, в меньшей степени стимулирует STAT3. Пусковым механизмом активации STAT3 служат АФК, которые появляются в клетке в ответ на изменение свойств вкДНК и являются причиной транслокации STAT3 в ядро. Блокирование АФК снижает активность фактора.

PPARG2. В регуляции ответа клеток на окислительный стресс принимает участие транскрипционный фактор PPARG2 (Gummersbach С. et al., 2009). PPARG2 регулирует липогенез, метаболизм глюкозы и воспалительные реакции. Активация PPARG2 снижает экспрессию генов провоспалительных медиаторов, супрессируя NF-кВ-сигнальный путь (Park S.H. et al., 2010) и ингибируя экспрессию провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли а, интерлейкин (ИЛ)-lß и IL-6 (Schmidt M.V. et al., 2010). Увеличение экспрессии PPARG2 при изменении свойств вкДНК анализировали в MCK, HUVEC и MCF7. Максимальное увеличение экспрессии PPARG2 на уровне транскрипции наблюдали в МСК в присутствии вкДНК больных раком молочной железы (РМЖ), раковых клеток и образца гДНКокси (в 6 - 8 раз).

2.10. Динамика изменения экспрессии генов транскрипционных факторов NF-kB и NRF2 в ответ на изменение свойств вкДНК

В большинстве работ описывают работу NF-kB и NRF2 - сигнальных путей в противофазе, однако мультифакториальные агенты и стимулы, такие как АФК, ЛПС, окисленные ЛПНП вызывают одновременную активацию и NRF2, и NF-kB. Проанализирована динамика изменения активности NF-kB и NRF2 на уровне экспрессии их генов. Анализ показал, что уровни экспрессии генов адаптеров и эффекторов NF-kB - и NRF2 - сигнальных путей, несмотря на разную амплитуду изменения экспрессии генов, в динамике изменяются аналогично уровням экспрессии соответствующих транскрипционных факторов в разных типах клеток, т.е. синхронно.

В МСК при действии окисленных вкДНК активация транскрипции генов NFKB1 и NRF2 происходит быстро. Однако уровень экспрессии гена NFKBI повышается незначительно через 30 минут после начала воздействия и через 1 час -ингибируется на фоне увеличения транскрипции NRF2 (рисунок 14). При действии ГЦ-богатых фрагментов на МСК активация транскрипции NFKB1 и NRF2 смещена в

сторону более позднего времени. Уровень экспрессии гена ЫРКВ1 возрастает через 3 - 24 часа, Транскрипция гена ИЯР2 только начинает возрастать к 24 часам. И в этом случае мы наблюдаем частичное перекрывание профилей экспрессии генов ЫРКВ1 и N№2.

мск

ГЦ-обогащенные фрагменты пкДНК

Окисленные фрагменты вкДНК

NFKB1

10 20 30 40 50 60 71) 80 Время инкубации,ч

II) 20 30 40 S0 60 70 80 Время инкубации, ч

Рисунок 14. Динамика изменения уровня экспрессии генов транскрипционных факторов - ЫРКВ1 и №НР2 при действии ГЦ-богатых (А) и окисленных фрагментов (Б) в МСК.

При действии ГЦ-богатых и окисленных ДНК на HUVEC уровень экспрессии гена NRF2 возрастает через 2-3 часа. Транскрипция гена NFKB1 при действии ГЦ-богатых фрагментов активируется к 3 часам, но уровень экспрессии гена NFKB1 выше примерно в 2 раза, чем гена NRF2 - в этом случае профили экспрессии двух исследуемых факторов транскрипции частично перекрываются (рисунок 15А). При действии окисленных ДНК уровень экспрессии гена NFKB1 возрастает позднее -через 24 часа на фоне снижения экспрессии гена NRF2 (рисунок 15Б).

HUVEC - клетки эндотелия

Рисунок 15. Динамика изменения уровня экспрессии генов транскрипционных факторов - ЫРКВ1 и NRF2 при действии ГЦ-богатых (А) и окисленных фрагментов (Б) в НЦУЕС.

При действии ГЦ-богатых и окисленных ДНК на МСР7 наблюдается кратковременный подъем уровня экспрессии гена NRF2 - максимум экспрессии гена ЫЯР2 приходится на 2 часа, затем происходит снижение количества РНК N№2 (рисунок 16).

МСЕ 7 - клетки адепокарпииомы молочпой железы

ГЦ-обогашепные фрш мсшы вк-ДНК nfkb1

Окисленные фрагменты вкДНК

Время инкубации, ч

40 50 60 70

Время инкубации, ч

Рисунок 16. Динамика изменения уровня экспрессии генов транскрипционных факторов - NFKB1 и NRF2 при действии ГЦ-богатых (А) и окисленных фрагментов (Б) в клетках аденокарциномы молочной железы (MCF7).

При действии ГЦ-богатых ДНК подъем уровня экспрессии гена NFKB1 происходит поздно, достигая максимума к 24 часам, и сохраняется долго. При действии окисленных фрагментов максимум приходится на 3 часа и наблюдается частичное перекрывание профилей экспрессии генов ЫРКВ1 и NRF2 (рисунок 16).

В фибробластах, культивируемых в условиях длительного окислительного стресса (в бессывороточной среде), при действии окисленных ДНК ингибируется транскрипционная активность гена Ь1РКВ1 и активируется - NRF2 (рисунок 17).

Фибробласты

NRF2

при действии окисленное] ДНК

Время инкубации

Рисунок 17. Динамика изменения уровня экспрессии генов транскрипционных факторов - NFKB1 и АГ?/7? при действии окисленных фрагментов в эмбриональных фибробластах легкого и фибробластах кожи взрослого человека.

2.11. Влияние вкДНК на выживаемость клеток в экстремальных условиях

ВкДНК с умеренно повышенным ГЦ - содержанием и слабоокисленная ДНК, способствуют повышению выживаемости клеток. Наиболее выражен этот эффект в условиях сильного окислительного стресса (ионизирующее излучение в дозе 1,2-2 Гр или 5% этанол). ВкДНК с умеренно повышенным ГЦ-содержанием и слабоокисленная ДНК вызывали адаптивный ответ в клетках, «защищая» культуру клеток от гибели - в присутствии этанола в среде выживало более 50% всех клеток, в то время, как подобное воздействие приводило к гибели контрольных клеток.

Обнаруженный эффект действия малых концентраций вкДНК на МСК позволяет предложить альтернативную стратегию повышения жизнеспособности МСК, применяемых в трансплантологии и для лечения заболеваний, сопровождающихся дегенерацией тканей - краткосрочную (3 - 24 часа) предобработку (прекондиционирование) культуры МСК плазмидой п(рДНК) в низких концентрациях (50 нг/мл). Преимущества использования плазмиды - низкая действующая концентрации и высокая устойчивость к нуклеазному гидролизу.

«Сильноокисленная» ДНК в высокой концентрации (250 нг/мл и выше) и высокие концентрации ГЦ-ДНК в составе вкДНК вызывали апоптоз клеток. Введение специфичных антител к вкДНК или блокирование сигнала от вкДНК на уровне рецепторов может нейтрализовать негативное действие высоких концентраций вкДНК.

2.12. Влияние вкДНК на функциональную активность клеток

Действие окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК может значительно изменять функциональную активность клеток различного типа. Например, циркулирующая ДНК больных острым инфарктом миокарда (ОИМ) и ишемической болезнью сердца (ИБС) и окисленная вкДНК негативно влияют на функциональную активность клеток сосудистого эндотелия: снижают уровень МО/еМОЭ, что приводит к дисфункции клеток эндотелия. В совокупности с увеличением уровня активных форм кислорода и реорганизацией цитоскелета это может приводить к нарушению проницаемости эндотелия и развитию патологии. При этом вкДНК плазмы крови здоровых доноров и ГЦ-ДНК в биологической концентрации, наоборот, повышают уровень N0. Таким образом, циркулирующая окисленная ДНК - потенциальная мишень для терапии при сердечно-сосудистой патологии. Мы показали, что окисленная ДНК активирует в МСК гены транскрипционных факторов миогенной дифференцировки (\iyoDl, \lyoG, МУР5, МЯР). С другой стороны, установлено, что окисленная ДНК является фактором, повышающим жизнеспособность раковых клеток (МСГ7). Причем, эта устойчивость развивается на фоне индуцированной нестабильности генома клеток. Такое опасное сочетание может приводить к появлению еще более агрессивных клонов опухоли. Таким образом, при проведении лучевой терапии необходимо принимать в расчет образование значительных

количеств окисленной ДНК, которая является фактором, стимулирующим выживание клеток с хромосомными нарушениями.

ВЫВОДЫ

1. На основании сравнения количества ГЦ-богатой последовательности рибосомного повтора в составе вкДНК и гДНК у 736 человек (больных аутоиммунными, сердечно-сосудистыми заболеваниями, беременных женщин, лиц, контактировавших с ионизирующим излучением, и здоровых доноров) показано увеличение содержания ГЦ-богатой последовательности рибосомного повтора в составе циркулирующей вкДНК плазмы периферической крови по сравнению с гДНК независимо от статуса здоровья (а«10'ш).

2. Концентрация ГЦ-богатой последовательности рибосомного повтора в составе циркулирующей вкДНК плазмы периферической крови достоверно выше в группах больных заболеваниями, сопровождающимися увеличением клеточной гибели (ревматоидный артрит, атеросклероз сосудов головного мозга, артериальная гипертония, ОИМ, ИБС), лиц, подвергшихся воздействию ионизирующего облучения, и беременных женщин по сравнению с выборкой здоровых доноров (а«10"'°). В составе вкДНК больных ОИМ и РМЖ обнаружено накопление окисленных остатков дезоксигуанозина (р<0,05). Выраженная биологическая активность вкДНК обусловлена накоплением ГЦ-богатой ДНК и окисленных оснований в её составе.

3. Окисленные фрагменты вкДНК обладают большей проникающей способностью как в нормальные (HUVEC), так и в злокачественные клетки (MCF7) по сравнению с неокисленными фрагментами вкДНК, (р<0,05). Окисленные фрагменты проникают в цитоплазму и локализуются вблизи ядра, неокисленные связываются с мембраной клетки.

4. Показан новый, ранее не описанный ответ клеток на фрагменты вкДНК: ГЦ-обогащенные и окисленные фрагменты вкДНК вызывают в злокачественных (MCF7) и нормальных клетках (HUVEC, МСК, фибробластах человека) кратковременный (от 15-30 минут в МСК и MCF7, до 3 часов - в HUVEC) синтез активных форм кислорода рядом с ядерной мембраной (р<0,05). Синтез активных форм кислорода связан с митохондриями (в MCF7) и ассоциирован с повышением уровня экспрессии гена NOX4 (в HUVEC, МСК, MCF7) и количества белка NOX4 (в HUVEC).

5. Окисленные фрагменты вкДНК вызывают окислительную модификацию ДНК в ядрах раковых (MCF7) и нормальных клеток (HUVEC, МСК), что сопровождается транзиторным образованием быстрорепарируемых одно- и двунитевых разрывов ДНК и нестабильностью генома, которая сильнее выражена в раковых клетках MCF7.

6. В клетках эндотелия человека, фибробластах и злокачественных клетках линии MCF7 окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают кратковременное блокирование пролиферативной активности, сопровождающееся повышением уровня экспрессии гена CCND1 (р<0,05). Фрагменты окисленной и, в меньшей степени, ГЦ-богатые фрагменты вкДНК блокируют клеточный цикл в клетках линии MCF7 в G0/G1- фазе, в культуре клеток HUVEC - в G1-, S - и G2/M - фазах клеточного цикла.

7. Общей закономерностью реакции клеток разного типа на окислительный стресс, вызываемый ГЦ-богатыми и окисленными фрагментами в составе вкДНК, на уровне транскриптома является адаптивный ответ. Характерной особенностью адаптивного ответа является достоверное повышение уровня экспрессии антиапоптотических генов BCL2, BCL2A1, BCL2LI, BlRC2(c-IAPl) и BIRC3 (с-1АР2), гена репарации BRCA-I, 30 генов адаптеров, костимуляторов и эффекторов сигнального пути NF-kB, и генов транскрипционных факторов PPARG и STAT3. Результатом изменений транскриптома является повышение выживаемости всех типов клеток.

8. В клетках МСК, HUVEC и MCF7 достоверно изменяется транскрипционная активность генов NFKB1 и мастер-регулятора антиокислительного ответа клеток NRF2. Реакция транскриптома клеток на воздействие ГЦ-богатых и окисленных фрагментов различается по длительности и амплитуде профиля экспрессии генов транскрипционных факторов NRF2 и NF-kB (р<0,05).

9. Развитие инициируемого вкДНК адаптивного ответа клеток человека сопровождается перемещением транскрипционных факторов NF-kB, NRF2 и STAT3 из цитоплазмы в ядро в клетках MCF7, HUVEC, МСК и в фибробластах, что приводит к усилению экспрессии гена SOD1, генов цитокинов (TNF, IL1B, IL8, 1L6, IL-1), генов молекул адгезии (1САМ1, VCAM1, VEGF в HUVEC) и повышению синтеза белков - цитокинов.

10. Действие на клетки фрагментов вкДНК вызывает повышение уровня экспрессии внутриклеточных рецепторов TLR9, AIM2 и RIG1 (р<0,05), участвующих в распознавании чужеродных нуклеиновых кислот.

11. Эпигенетическая модификация фрагментов вкДНК, вызванная окислением, блокирует их способность стимулировать синтез в клетках эндотелия человека низкомолекулярного сигнального медиатора внутриклеточных и внеклеточных процессов - оксида азота II (р<0,05). Окисленные фрагменты вкДНК повышают в МСК экспрессию генов ключевых транскрипционных факторов миогенной дифференцировки (MYODI, MYOG, MYF5, MRF4) (р<0,05).

12. Фрагменты вкДНК с умерено повышенным содержанием ГЦ- пар (5 - 200 нг/мл) или слабым окислением остатков гуанозина (до 400 8-oxodG на 10 нуклеозидов) обладают способностью защищать клетки от гибели при воздействии химических и физических повреждающих факторов.

ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Результаты исследования, вошедшие в диссертацию, могут быть использованы при разработке тест-систем для диагностики хронических патологических процессов и состояний, характеризующихся повышенным уровнем гибели клеток организма. Часть результатов диссертационной работы была получена и использована в рамках выполнения прикладных разработок по Государственному Контракту № 14.512.11.0090 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ по теме «Разработка высокоточной тест-системы для оценки и прогнозирования индивидуальной радиочувствительности человека».

2. При выполнении диссертационной работы выявлено, что в составе внеклеточной ДНК накапливаются ГЦ-обогащенные фрагменты транскрибируемой области рибосомного повтора. Этот факт является базой для разработки диагностических систем эпигенетических маркеров. По результатам работы зарегистрирован патент регистрационный номер 2013147906/20 (074505). «Определение содержания СС-богатой последовательности генома (ОС-ДНК) в составе циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы периферической крови как способ определения уровня гибели клеток при хронических заболеваниях, при физиологических состояниях (беременность) и при хроническом действии неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека».

3. В диссертационной работе показано, что фрагменты внеклеточной ДНК с умеренно повышенным содержанием ГЦ-обогащенных и окисленных фрагментов могут повышать жизнеспособность клеток. На основании этого факта было разработана альтернативная стратегия «прекондиционирования» мезенхимных стволовых клеток при трансплантации и подана заявка на патент регистрационный номер 2013147907/20 (074506) «Применение фрагмента ДНК транскрибируемой области рибосомного повтора для повышения устойчивости мезенхимных стволовых клеток к действию агрессивных факторов окружающей среды».

4. Обнаруженный при выполнении диссертационной работы факт повышения выживаемости раковых клеток при контакте с фрагментами внеклеточной ДНК может привести к коррекции схем проведения радиотерапевтических процедур при лечении в онкологии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Вейко H.H. и др. Стимулирующее действие фрагментов транскрибируемой области рибосомного повтора на лимфоциты периферической крови человека / H.H. Вейко, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, C.B. Костюк, A.B. Ермаков, С.М. Иванова, Т.А. Рязанцева, H.A. Еголина, H.A. Ляпунова, Д.М. Спитковский // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. - 2006. - Т. 10. - С. 410-414.

2. Вейко H.H. и др. Сыворотка периферической крови здоровых людей содержит антитела к фрагменту транскрибируемой области рибосомного повтора / H.H. Вейко, C.B. Костюк, A.B. Ермаков, Е.А. Калашникова, Т.А. Рязанцева, А.И. Сперанский // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. - 2007. -Т. 9. - С. 277-282.

3. Вейко H.H. и др. Изменение свойств внеклеточной ДНК периферической крови при ревматоидном артрите / H.H. Вейко, C.B. Костюк, Н.О. Шубаева, С.М. Иванова, А.И. Сперанский. // Иммунология. - 2007. - Т. 28. - № 3. - С. 389394.

4. Ермаков A.B. и др. Сигнализация между лимфоцитами человека после индукции эффекта свидетеля ионизирующей радиацией в адаптирующих дозах / A.B. Ермаков, C.B. Костюк, H.A. Еголина, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, Е.М. Малиновская, H.H. Вейко // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2007. - Т. 476. - № 6. - С. 650-657.

5. Ермаков A.B. и др. Фрагменты ДНК, обнаруживаемые в среде после воздействия ионизирующей радиации в адаптирующих дозах, являются фактором стресс-сигнализации между лимфоцитами и клетками-свидетелями / A.B. Ермаков, C.B. Костюк, H.A. Еголина, Е.М. Малиновская, H.H. Вейко, Д.М. Спитковский // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2007. - Т. 47. - № 2.

- С. 133-140.

6. Ермаков A.B. и др. Фрагменты внеклеточной ДНК из среды культивирования лимфоцитов человека, облученных в малых дозах, запускают развитие окислительного стресса и адаптивного ответа в необлученных лимфоцитах -свидетелях / A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, H.A. Еголина, H.H. Вейко // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2008. - Т. 48. - С. 485-496.

7. Малиновская Е.М. и др. Изменение комплекса рибосомных генов человека при старении / Е.М. Малиновская Т.Д. Смирнова, H.A. Еголина, Т.Г. Цветкова, Н.В. Косякова, И.А. Мандрон, Е.В. Мхитарова C.B. Костюк, С.М. Терехов, Г.М. Местсргази, H.H. Вейко, H.A. Ляпунова // Медицинская генетика. - 2008. - Т. 7.

- № 2. - С. 10-16.

8. Костюк C.B. и др. Изменение свойств внеклеточной ДНК периферической крови и частоты TCR-мутантных клеток при действии на организм человека ионизирующей радиации / C.B. Костюк, И.А. Замулаева, Р.К. Агапова, A.B. Ермаков, A.C. Саенко, Н.В. Орлова, С.Г. Смирнова, H.H. Вейко, Д.М. Спитковский // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2008. - Т. 48. - С. 513.

9. Ермаков A.B. и др. CpG-ДНК ингибирует клеточные реакции, сопровождающие развитие адаптивного ответа в лимфоцитах человека после воздействия рентгеновского излучения в малых дозах / A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, H.A. Еголина, H.H. Вейко // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2009. - Т. 49. - № 1. - С. 34-41. Ю.Ермаков A.B. и др. Реакция раковых стволовых клеток человека на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах / A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, Е.С. Ершова, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Л.В. Ефремова, Л.Н. Любченко, H.H. Вейко И Радиационная биология. Радиоэкология. - 2009. - Т.49. -№5.-С. 528-537.

И.Ермаков A.B. и др. Развитие адаптивного ответа и эффекта свидетеля в мезенхимальных стволовых клетках человека после воздействия рентгеновского излучения в малой дозе / A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, H.H. Вейко, И.Ю. Кубасова, Л.Н. Любченко, H.H. Вейко // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2010. - Т. 50. - Ksi. - С. 4251.

12. Костюк C.B. и др. Окисленная внеклеточная ДНК снижает продукцию окиси азота эндотелиальной NO - синтазой (eNOS) в эндотелиальных клетках человека (HUVEC) / C.B. Костюк, А.Ю. Алексеева, М.С. Конькова, К.В. Глебова, Т.Д. Смирнова, Л.А. Каменева, В.Л. Ижевская, H.H. Вейко Окисленная внеклеточная ДНК снижает продукцию окиси азота эндотелиальной NO-синтазой (eNOS) в эндотелиальных клетках человека (HUVEC) // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. - 2014. - Т. 157.-№ 2-С. 163-168.

13.Ефремова Л.В. и др. Внеклеточная ДНК влияет на количество NO в эндотелиальных клетках человека / Л.В. Ефремова, А.Ю. Алексеева, М.С. Конькова, C.B. Костюк, Е.С. Ершова, Т.Д. Смирнова, И.Л. Конорова, H.H. Вейко II Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. - 2010. - Т. 149.

- № 9. - С. 156-162.

14. Костюк C.B. и др. Внеклеточная ДНК влияет на функциональную активность клеток эндотелия / C.B. Костюк, А.Ю. Алексеева, М.С. Конькова, Т.Д. Смирнова, A.B. Ермаков, Л.В. Ефремова, И.Л. Конорова, H.H. Вейко // Медицинская генетика. - 2010. - Т.1. - С. 38-46.

15.Костюк C.B. и др. Увеличение экспрессии iNOS в эндотелиальных клетках человека при длительном культивировании с фрагментами внеклеточной ДНК / C.B. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Ефремова, М.С. Конькова, А.Ю. Алексеева, Л.И. Каменева, H.H. Вейко // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. - 2010. - Т. 149. - № 9. - С. 151-156.

16. Ермаков A.B. и др. ДНК-сигнальный путь, обеспечивающий развитие радиационного эффекта свидетеля в клетках человека / A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, H.H. Вейко // Радиационная биология. Радиоэкология.

— 2011, — Т.51 -№6.-С. 651-659.

17.Баскова И.П. и др. Применение нового реагента Cu-FL для анализа стимуляции синтеза NO секретом слюнных клеток медицинской пиявки в эндотелии человека (HUVEC) и кардиомиоцитах крысы / И.П. Баскова, А.Ю. Алексеева, C.B. Костюк, М.Е. Неверова, Т.Д. Смирнова, H.H. Вейко II Биомедицинская химия. - 2012. - Т. 58. - № 1. - С. 65-76.

18.Костюк C.B. и др. Фрагменты внеклеточной ДНК усиливают транскрипционную активность генома мезенхимальных стволовых клеток человека, активируют TLR-зависимый сигнальный путь и ингибируют апоптоз / С.В. Костюк, Е.М. Малиновская, A.B. Ермаков, Т.Д. Смирнова, JI.B. Каменева, О.В. Чвартацкая, П.А. Лосева, Е.С. Ершова, Л.Н. Любченко, H.H. Вейко // Биомедицинская химия. -2012. - Т. 58. -X» 6. - С. 673-683.

19. Дарий М.В. и др. Димерные бисбензимидазолы: цитотоксичность и влияние на метилирование ДНК в нормальных и раковых клетках человека / М.В. Дарий, А.Р. Рахимова, И.Н. Ташлицкий, С.В. Костюк, H.H. Вейко, A.A. Иванов, А.Л. Жузе, Е.С. Громова // Молекулярная биология. - 2013. - Т. 47, №2. - С. 292-301

20. Костюк С.В. и др. Хроническое действие ионизирующего излучения вызывает значительное снижение концентрации циркулирующей ДНК плазмы крови / С.В. Костюк, Е.С. Ершова, H.H. Вейко // Медицинская генетика. - 2013. - Т.12. -№11 (137).-С. 29-35.

21.Костюк С.В. и др. Хроническое действие ионизирующего излучения вызывает увеличение содержания рибосомного повтора в составе циркулирующей ДНК плазмы крови / С.В. Костюк, Е.С. Ершова, И.Л. Конорова, H.H. Вейко // Медицинская генетика.-2013.-Т. 12.-№ 12(138)-С. 20-28.

22.Ermakov A.V. et al. Oxidative stress as a significant factor for development of an adaptive response in irradiated and nonirradiated human lymphocytes after inducing the bystander effect by low-dose X-radiation / A. V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, N.A. Egolina, L.V. Efremova, N.N. Veiko // Mutation Research -Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. - 2009. - V. 669 (1-2). -P. 155-161.

23. Ermakov A.V. et al. An extracellular DNA mediated bystander effect produced from low dose irradiated endothelial cells / A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, E.M. Malinovskaya, L.V. Efremova, N.N. Veiko II Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. - 2011. - V. 712.-№ 1-2.-P.1-10.

24. Kostyuk S.V. et al. Role of extracellular DNA oxidative modification in radiation induced bystander effects in human endotheliocytes / S.V. Kostyuk, A.V. Ermakov, A.J. Alekseeva, T.D. Smirnova, K.V. Glebova, L.V. Efremova, A. Baranova, N.N. Veiko // Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. - 2012. - V. 729. -№ 1-2. - P. 52-60.

25.Kostjuk S. et al. Extracellular GC-rich DNA activates TLR9- and NF-kB-dependent signaling pathways in human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) / S. Kostjuk, P. Loseva, O. Chvartatskaya, E. Ershova, T. Smirnova, E. Malinovskaya, O. Roginko, V. Kuzmin, V. Izhevskaia, A. Baranova, E. Ginter, N. Veiko И Expert Opinion on Biological Therapy. - 2012. - V.12. Suppl. 1. - P. 99-111.

26. Loseva P. et al. Extracellular DNA oxidation stimulates activation of NRF2 and reduces the production of ROS in human mesenchymal stem cells / P. Loseva, S. Kostyuk, E. Malinovskaya, N. Clement, C. Dechesne, C. Dani, T. Smirnova, K. Glebova, G. Baidakova, A. Baranova, V. Izhevskaia, E. Ginter, N. Veiko // Expert Opinion on Biological Therapy. - 2012. - V.12. Suppl. 1. - P. 85-97.

27. Glebova K. et al. Oxidized extracellular DNA as a stress signal that may modify response to anticancer therapy / K. Glebova, N. Veiko, S. Kostyuk, V. Izhevskaya, A. Baranova // Cancer Letters. - 2013. - V.S0304-3835. - № 13. - P.00658-7.

28. Kostyuk S.V. et al. An exposure to the oxidized DNA enhances both instability of genome and survival in cancer cells / S.V. Kostyuk, M.S. Konkova, E.S. Ershova, A.J. Alekseeva, T.D. Smirnova, S.V. Stukalov, E.A. Kozhina, N.V. Shilova, T.V. Zolotukhina, Z.G. Markova, V.L. Izhevskaya, A. Baranova, N.N. Veiko // PLoS One. - 2013 - V. 8. - № 10. - P e77469.

29. Kostyuk S.V. et al. Oxidized DNA induces an adaptive response in human fibroblasts / S.V. Kostyuk, V.J. Tabakov, V.V. Chestkov, M.S. Konkova, K.V. Glebova, G.V. Baydakova, E.S. Ershova, V.L. Izhevskaya, A. Baranova, N.N. Veiko // Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. - 2013. - V. 747.-P. 6-18.

Публикации в других изданиях:

30.Ermakov A.V. et al. Extracellular DNA Fragments Factors of Stress Signaling between X-Irradiated and Nonirradiated Human Lymphocytes / A.V. Ermakov, S.V. Kostyuk, M.S. Konkova, N.A. Egolina, E.M. Malinovskaya, N.N. Veiko // Annals of the New York Academy of Sciences. -2008. - V.l 137. - P. 41-46.

31.Efremova L.V. et al. Accumulating fragments of extracellular DNA (ecDNA) influence rat primary cerebellum granule cell culture / L.V. Efremova, S.V. Kostyuk, I.L. Konorova, G.P. Khaspekov, N.N. Veiko // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V. - 2010. - Chapter 29.-P. 213-218.

32. Ermakov A.V. et al. Development of the adaptive response and bystander effect induced by low-dose ionizing radiation in human mesenchymal stem cells / A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, L.V. Efremova, L.N. Lyubchenko, N.N. Veiko // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V. - 2010. - Chapter 16. - P. 225-231.

33. Alekseeva A.Y. et al. Cell Free DNA (cfDNA) Influences Nitric Oxide and ros Levels in Human Endothelial Cells / A.Y. Alekseeva, N.V. Bulicheva, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, N.N. Veiko // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V. - 2011,- Chapter 31. - P. 219-223.

34. Malinovskaya E.M. et al. Fragments of Cell-free DNA (cfDNA) Enhance Transcription Activity in Human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) and Inhibit Their in vitro Differentiation / E.M. Malinovskaya, S.V. Kostyuk, A.V. Ermakov, M.S. Kon'kova, T.D. Smirnova, L.V. Kameneva, L.V. Efremova, A.Yu. Alekseeva, L.N. Lyubchenko, N.N. Veiko // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V. - 2011. - Chapter 27. - P. 199-205.

35.Ermakov A.V. et al. Oxidized extracellular DNA as a stress signal in human cells / A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, V.L. Izevskaya, A. Baranova, N.N. Veiko // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2013. - P. 649747.

36.Вейко H.H. и др. Внеклеточная ДНК периферической крови больных ревматоидным артритом является сильным стимулятором клеток иммунной системы / H.H. Вейко, С.М. Иванова, С.В. Костюк, A.B. Ермаков, H.A. Еголина, А.И. Сперанский // Аллергология и иммунология. Материалы 6 съезда аллергологов и иммунологов СНГ. — 2006. — Т. 7. - № 3. — С. 348.

37. Калашникова Е.А. и др. Активация мононуклеаров периферической крови фрагментами транскрибируемой области рибосомного гена человека in vitro / Е.А. Калашникова, H.H. Вейко, С.Н. Кокаровцева, С.В. Костюк, A.B. Ермаков,

H.A. Еголина, H.A. Ляпунова, Д.М. Спитковский // Медицинская иммунология Материалы X международной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», тезисы докладов). - 2006. - Т. 8. -№ 2-3. - С. 143-144.

38. Костюк C.B. и др. Периферическая кровь здоровых доноров содержит антитела к фрагментам ДНК рибосомного повтора человека (ТОрДНК) / C.B. Костюк, H.H. Вейко, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, С.М. Иванова, Т.А. Рязанцева, А.И. Сперанский // Аллергология и иммунология. Материалы 6 съезда аллергологов и иммунологов СНГ. - 2006. — Т. 7. - № 3. - С. 254.

39. Вейко H.H. и др. Фрагменты внеклеточной ДНК - факторы клеточной стресс-сигнализации при действии ионизирующей радиации / H.H. Вейко, A.B. Ермаков, C.B. Костюк, Е.М. Малиновская, H.A. Еголина, И.А. Замулаева, A.C. Саенко // Тезисы международной конференции «Новые направления в радиобиологии». - 2007. - С. 10-13.

40. Ляпунова H.A. и др. Накопление в составе внеклеточной ДНК фрагментов транскрибируемой области рибосомного гена может провоцировать аутоиммунные реакции и быть причиной гибели зародыша в раннем эмбриогенезе / H.A. Ляпунова, H.H. Вейко, C.B. Костюк, Е.А. Калашникова, Л.Н. Пороховник, Р.К. Агапова // Цитология. Материалы 2-го Съезда Общества клеточной биологии. - 2007. - Т. 49. - № 9. - С. 772.

41.Ермаков A.B. и др. Ранние изменения пространственной структуры хроматина лимфоцитов человека при действии повреждающих факторов / A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, H.A. Еголина, H.A. Ляпунова, H.H. Вейко // Цитология. Материалы 2-го Съезда Общества клеточной биологии). - 2007. - Т. 49. - № 9. - С. 744-745

42. Вейко H.H. и др. Внеклеточная ДНК - фактор стресс-сигнализации в организме / H.H. Вейко, A.B. Ермаков, Е.С. Ершова, C.B. Костюк, И.Л. Конорова, М.С. Конькова, H.A. Мкртумова, М.Е. Неверова, Т.Д. Смирнова, О.В. Фиделина // Материалы IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов.-2008.-С. 211.

43.Ермаков A.B. и др. Значение окислительного стресса для развития адаптивного ответа в облученных лимфоцитах человека и необлученных лимфоцитах-свидетелях после воздействия ионизирующей радиации в малых дозах / A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, H.A. Еголина, H.H. Вейко // Материалы IV съезда Российского Общества биохимиков и молекулярных биологов. - 2008. -С. 201.

44. Ермаков A.B. и др. Внеклеточная ДНК - Значимый фактор реализации эффекта свидетеля при действии малых доз ионизирующей радиации / A.B. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, Е.С. Ершова, H.A. Еголина, H.H. Вейко // Вестник Российской Военно-медицинской академии (приложение 1). - 2008. - Т. 3. - № 23.-С. 125.

45. Ермаков A.B. и др. Фрагменты CpG-ДНК блокируют адаптивный ответ, индуцируемый малыми дозами ионизирующей радиации / A.B. Ермаков, C.B. Костюк, Р.В. Вейко, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, H.A. Еголина, H.H. Вейко // Вестник Российской Военно-медицинской академии (приложение 1). -2008. - Т. 3. -№ 23. - С. 125-126.

46. Конькова М.С. и др. Взаимодействие клеток реципиентов с факторами сигнализации при эффекте свидетеля, индуцированного в лимфоцитах человека ионизирующей радиацией в малых дозах / М.С. Конькова, A.B. Ермаков, C.B.

Костюк, H.H. Вейко // Вестник Российской Военно-медицинской академии (приложение 1). - 2008. - Т. 3. - № 23. - С. 132.

47. Конькова М.С. и др. Развитие адаптивного ответа посредством ДНК-сигнального пути в необлученных лимфоцитах-свидетелях после воздействия рентгеновского излучения в малой дозе на лимфоциты человека / М.С. Конькова, A.B. Ермаков, C.B. Костюк, JI.B. Ефремова, H.A. Еголина, H.H. Вейко // Материалы V съезда Радиобиологического общества Украины. - 2009.

- С. 76-77.

48. Ефремова JI.B. и др. Ответ мезенхимальных и раковых стволовых клеток человека на воздействие малых доз ионизирующей радиации / JI.B. Ефремова, М.С. Конькова, A.B. Ермаков, C.B. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Л.Н. Любченко, H.H. Вейко // Материалы V съезда Радиобиологического общества Украины. - 2009. - С. 72-73.

49. Ефремова JI.B. и др. Некоторые реакции стволовых клеток человека на воздействие ионизирующей радиации в малых дозах / Л.В. Ефремова, М.С. Конькова, A.B. Ермаков, C.B. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Л.Н. Любченко, H.H. Вейко // Материалы Международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды». - 2009. - С. 50-51.

50. Конькова М.С. и др. После воздействия рентгеновского излучения в малой дозе на лимфоциты человека посредством ДНК-сигнального пути в необлученных лимфоцитах-свидетелях начинает развиваться адаптивный ответ / М.С. Конькова, A.B. Ермаков, C.B. Костюк, Л.В. Ефремова H.A. Еголина, H.H. Вейко // Материалы Международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды». -2009. - С. 69-70.

51. Булычева Н.В. и др. Реакция раковых стволовых клеток человека на воздействие малых доз ионизирующего излучения / Н.В. Булычева, Ф.В. Ермаков, М.С. Конькова, C.B. Костюк, H.H. Вейко // Медицинская генетика (Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков). - 2010.

- С. 29-30.

52. Конькова М.С. и др. Развитие эффекта свидетеля индуцированного малой дозой ионизирующего излучения в мезенхимальных стволовых клетках человека / М.С. Конькова, A.B. Ермаков, C.B. Костюк, H.H. Вейко // Медицинская генетика. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. -2010.-С. 90.

53. Костюк C.B. и др. ГЦ-обогащенные фрагменты внеклеточной ДНК усиливают транскрипционную активность мезенхимальных стволовых клеток и активируют ТЬ119-сигнальный путь / C.B. Костюк, A.B. Ермаков, Е.М. Малиновская, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Л.Н. Любченко, H.H. Вейко // Медицинская генетика. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. - 2010. - С. 92-93.

54. Конькова М.С. и др. Развитие эффекта свидетеля, индуцированного адаптирующей дозой рентгеновского излучения в эндотелиоцитах человека / М.С. Конькова, A.B. Ермаков, C.B. Костюк, H.H. Вейко // Материалы Международной научной конференции «Современные проблемы радиобиологии». - 2010. - С. 35

55.Чвартацкая O.B. и др. GC-обогащенные фрагменты внеклеточной ДНК активируют TLR-, NFkB-, JNK/p38- и IRF-сигнальные пути в мезенхимальных стволовых клетках человека / О.В. Чвартацкая, H.H. Вейко, С.В. Костюк, Г.А. Севастьянова // Материалы Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова».-2011.-С. 74.

56. Вейко H.H. и др. Биологически активные димерные бисбензимидазолы -потенциальные радиопротекторы; исследование на культурах клеток / H.H. Вейко, К.В. Глебова, A.A. Иванов, С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, В.А. Кузмин, A.JI. Жузе // Материалы международной конференции «Медико-биологические проблемы действия радиации». - 2012. - С. 13

57. Костюк С.В. и др. Циркулирующая внеклеточная ДНК крови (вкДНК) - маркер для диагностики и объект терапии при радиационном воздействии / С.В. Костюк, К.В. Глебова, И.Л. Конорова, A.B. Ермаков, H.H. Вейко // Материалы международной конференции «Медико-биологические проблемы действия радиации». - 2012. - С. 24

58.Konkova M.S. et al. The cell-free DNA fragment are factors of stress-signaling from irradiated to non-irradiated human lymphocytes after exposure by low doses of the X-radiation / M.S. Konkova, A.V. Ermakov, S.V. Kostyuk, N.A. Egolina, E.M. Malinovskaya, N.N. Veiko // Clinical Chemistry, Abstracts for CNAPS V. - 2007. -V. 53.-P. 10.

59.Alekseeva A.Yu. et al. Role of extracellular DNA oxidative modification in human endotheliocytes / A.Yu. Alekseeva, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, A. Baranova, O.A. Roginko, V.A. Kuz'min, N.N. Veiko // Journal of Nucleic Acid Investigation. Abstracts for CNAPS VII. - 20II. - V. 2. № 1S. - P. 20.

60. Alekseeva A.Yu. et al. Possible Role of Extracellular Human DNA in Development of Vascular Endothelial Dysfunction / A. Yu. Alexeeva, N.N. Veiko, S.V. Kostyuk // Abstracts for LIMSC. - 2011. - P. 269.

61.Chvartatskaya O.V. et al. GC-rich cell-free DNA (GC-cfDNA) activates TLR-, NFkB-, JNK/p38- and IRF-dependent signaling pathways in adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC) / O.V. Chvartatskaya, S.V. Kostjuk, P.A. Loseva, E.S. Ershova, T.D. Smirnova, L.V. Kameneva, E.M. Malinovskaya, L. Lyubchenko, O.A. Roginko, V.A. Kuz'min, N.N. Veiko // Journal of Nucleic Acid Investigation. Abstracts for CNAPS VII. - 2011. - V. 2. - № IS. - P. 10.

62. Konkova M.S. et al. Apoptosis is an essential event to mediate the stress-signalisation factors formation in irradiated lymphocytes in radiation-induced bystander effect / M.S. Konkova, A.V. Ermakov, L.V. Efremova, S.V. Kostyuk,N.N. Veiko // Journal of Nucleic Acid Investigation. Abstracts for CNAPS VII. - 2011. - V. 2. - № IS. - P. 26.

63. Loseva P.A. et al. Cell-free DNA" (cIDNA) from cancer cell cultivation medium upregulates PPARG2 expression in adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSC) / P.A. Loseva, S.V. Kostyuk, N. Clement, C.A. Dechesne, C. Dani, T.D. Smirnova, L.V. Kameneva, L.N. Lyubchenko, N.N. Veiko // Journal of Nucleic Acid Investigation. Abstracts for CNAPS VII. - 2011. - V. 2. -№ IS. - P. 29.

64. Malinovskaya E.M. et al. GC-rich fragments of cell-free DNA (cfDNA) induce an adaptive response (AR) in human adipose-derived mesenchymal stem cells (MSC) / E.M. Malinovskaya, V.P. Shubin, S.V. Kostyuk, P.A. Loseva, T.D. Smirnova, L/V/

Kameneva, L.N. Lyubchenko, A.V. Karpukhin, N.N. Veiko // Journal of Nucleic Acid Investigation. Abstracts for CNAPS VII. - 2011. - V. 2. - № IS. - P. 28.

65. Alekseeva A.Yu. et al. Influence of cfDNA fragments on cellular pathways in endothelium and their significance in patients with myocardial infarction / A.Yu. Alekseeva, N.N. Veiko, S.V. Kostyuk // Abstracts for 19th International Student Congress of (Bio)Medical Sciences (ISCOMS). - 2012. - Vol 1. - P. 308.

66.Gromova E. et al. Inhibition of murine DNA methyltransferase Dnmt3a by dimeric bisbenzimidazoles and mechanism-based inhibitors / E. Gromova, N. Cherepanova, A. Rakhimova, M. Darii, A.L. Zhuze, A.A. Ivanov, S.V. Kostyuk, N.N. Veiko // Abstracts for 22nd IUBMB - 37th FEBS Congress FEBS J. - 2012. - V. 279 (Suppl. 1).-P. 490.

67.Baranova A. et al. Oxidized circulating DNA as a potential target for cancer therapy / A. Baranova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, L.V. Kameneva, N.N. Veiko // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. P. Gahan (ed.). Springer Science+Business Media B.V. Abstracts for CNAPS VIII. - 2013. - P. 56.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

SOD - супероксиддисмутаза;

TLR - «Toll» - рецепторы;

АФК - активные формы кислорода;

АО - адаптивный ответ;

вкДНК - внеклеточная ДНК;

вкДНКокси- окисленная in vitro ДНК;

гДНК - геномная ДНК;

ГЦ-ДНК - ДНК, обогащенная GC парами азотистых оснований; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; ДР - двунитевые разрывы; ЗД - здоровые доноры;

инг-ОДН - ингибирующие олигодезоксинуклеотиды;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ОИМ - острый инфаркт миокарда;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РА - ревматоидный артрит;

СатШ - субфрагмент сателлита 3;

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания;

СКВ - системная красная волчанка;

ФНО - фактор некроза опухоли;

ЭС-эффект свидетеля;

я ДНК - ядерная ДНК;

Подписано в печать:

09.02.2014

Заказ № 9422 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Костюк, Светлана Викторовна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК.

05201450801 На пРавах рукописи

Костюк Светлана Викторовна

РОЛЬ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

03.02.07 — генетика

Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук Вейко Наталья Николаевна

Москва-2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 9 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (Внеклеточная ДНК - биологически активная

молекула) 16

1.1. Свойства внеклеточной ДНК 17

1.1.1. Стандартизация методов выделения и хранения вкДНК 17

1.1.2. Концентрация вкДНК 21

1.1.3. Фрагментация вкДНК 23

1.1.4. Содержание различных последовательностей в составе вкДНК 26

1.1.5. Эпигенетические модификации вкДНК: метилирование фрагментов вкДНК 30

1.1.6. Окислительная модификация оснований вкДНК 31

1.1.7. Свойства вкДНК определяют ее характеристики как маркера при

патологии и при опасных для генома воздействиях 34

1.1.7.1. Применение вкДНК в качестве маркера ранней диагностики в

онкологии 37

1.1.7.2. Применение вкДНК в качестве маркера в пренатальной диагностике, трансплантологии и других областях диагностики 39

1.2. Происхождение вкДНК. Механизм появления вкДНК в циркуляции 42

1.3. Формы существования вкДНК 48

1.4. Биологическая активность вкДНК 53

1.4.1. ВкДНК как активатор иммунных реакций 53

1.4.2. ВкДНК как фактор стресс - сигнализации в индуцированном ионизирующей радиацией эффекте свидетеля 56

1.5. Способы проникновения вкДНК внутрь клетки 58

1.6. Внутриклеточные рецепторы, опознающие фрагменты вкДНК 60

1.6.1. Белки семейства TLR - сенсоры фрагментов вкДНК 61

1.6.1.1. Общая характеристика белков TLR 61

1.6.1.2. Природные и синтетические лиганды TLR9 64

1.6.1.3. Ингибиторы взаимодействия CpG -ДНК с TLR9 67

1.6.1.4. Механизм доставки лигандов к TLR, расположенным на эндосомах 70

1.6.1.5. Шапероны - роль в подготовке и перемещении TLR в эндосомы 75

1.6.1.6. Как иммунная система отличает нуклеиновые кислоты болезнетворных микроорганизмов и собственные нуклеиновые кислоты 79

1.6.2. Другие рецепторы - кандидаты на роль связывания вкДНК 82

1.6.2.1. ZBP1 или DAI - сенсоры цитозольной ДНК 84

1.6.2.2. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК 85

1.6.2.3. AIM2 и инфламмасома gg

1.7. Внеклеточная ДНК — индуктор окислительного стресса в клетках 88 1.7.1. Роль фермента N0X4 в синтезе активных форм кислорода, индуцированном вкДНК gg

1.8. Внеклеточная ДНК принимает участие в регуляции клеточного цикла 92

1.9. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, активирующиеся в клетках 96 при действии внеклеточной ДНК

1.9.1. Внеклеточная ДНК вызывает активацию транскрипционного фактора кВ

1.9.2. Внеклеточная ДНК вызывает активацию ядерного фактора N111^2

1.9.3. Взаимодействие между N111^2 - и ИР-кВ - сигнальными путями

1.10. Заключение по данным литературы 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Анализируемая выборка

2.2. Выделение внеклеточной ДНК

2.3. Определение концентрации и размеров фрагментов вкДНК

2.4. Определение содержания повторяющихся последовательностей генома в

составе вкДНК 107

2.5. Определение нуклеазной активности 108

2.6. Метод ИФА на ДНК-связывающих мембранах 108

2.7. Культивирование мезенхимных стволовых клеток (МСК) 109

2.8. Культивирование HUVEC (клеток эндотелия из вены пуповины) Ю9 2.9 Культивирование фибробластов 109

2.10. Выделение лимфоцитов 109

2.11. Приготовление образцов ДНК 110

2.12. Определение количества активных форм кислорода 111

2.13. Определение уровня окиси азота в клетках 111

2.14. Определение количества нитритов и нитратов (метаболитов окиси азота)

в среде культивирования Ш

2.15 Определение F-актина 111

2.16. Определение содержания 8-окси-7,8-дигидрогуанозина (8-oxoG) в 112 составе вкДНК

2.17. Определение одно- и двуцепочечных разрывов ДНК в клетках. Метод 112 ДНК-комет (single cell gel electrophoresis)

2.18. Определение двуцепочечных разрывов ДНК ядер клеток методом 112 иммунофлуоресценции

2.19. Анализ разрывов ДНК в клетках методом TUNEL 113

2.20. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) 113

2.21. Определение ферментативной активности каспазы 3 113

2.22. Определение уровня экспрессии белков 114

2.23. Ингибирование TLR9 клеточного пути 114

2.24. Оценка уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени 114

2.25. Статистическая обработка результатов 118

3. РЕЗУЛЬТАТЫ и ОБСУЖДЕНИЕ 119

3.1. Свойства внеклеточной ДНК. Поиск свойств, определяющих 119 биологическую активность вкДНК

98 100 102 104 106 106 106 107

3.1.1. Концентрация вкДНК не может служить маркером хронического 119 низкоуровнего повреждающего воздействия или хронически протекающего патологического процесса

3.1.1.2. Концентрация вкДНК зависит от нуклеазной активности плазмы крови 124

3.1.2. Длины фрагментов вкДНК 126

3.1.3. Концентрация повторяющихся последовательностей генома человека в плазме крови 127

3.1.3.1. ГЦ-богатая последовательность рибосомного повтора накапливается в составе вкДНК 130

3.1.3.2. Содержание АТ-богатой последовательности генома в

циркулирующей вкДНК плазмы крови лиц, подвергавшихся 133

профессиональному хроническому воздействию ионизирующего излучения, снижено по сравнению с контрольной группой

3.1.4. Окислительная модификация вкДНК 135

3.1.5. Фрагменты рДНК, накапливающейся в составе вкДНК, образуют в крови комплексы с антителами 137

3.1.5.1 Титры антител к рДНК в выборке облученных лиц выше, чем в контрольной 141

3.2. Влияние внеклеточной ДНК на функциональную активность генома

гистологически различных культивируемых клеток человека с разным 143 иролиферативным потенциалом

3.2.1. Общая схема эксперимента 143

3.2.2. Характеристика культивируемых клеток 144

3.2.3. Характеристика образцов вкДНК и модельных фрагментов 146

3.2.4. Локализация окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК в разных

типах клеток 152

3.2.5. Изменение уровня активных форм кислорода в разных типах клеток при действии окисленных и неокисленных ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 15^

3.2.5.1. Количество АФК в НиУЕС определяется свойствами вкДНК 157

3.2.5.2. Синтез АФК в МСК при воздействии окисленных и неокисленных фрагментов вкДНК 165

3.2.5.3. Окисленные фрагменты вкДНК индуцируют в раковых клетках

МСР7 кратковременный окислительный стресс 171

3.2.5.4. Изменение уровня активных форм кислорода в фибробластах при действии гДНК и гДНКокси 175

3.2.6. Окислительные модификации вкДНК индуцируют повышение уровня окислительных модификаций собственной ДНК в ядрах клеток 173

3.2.7. Окисленные фрагменты вкДНК индуцируют кратковременную экспрессию N0X4 в разных типах клеток 131

3.2.8. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают быстро репарируемые разрывы ДНК ядер клеток 137

3.2.8.1. Окисленные и ГЦ-богатые фрагменты вкДНК вызывают в ядрах ЬШУЕС быстро репарируемые разрывы ДНК 133

3.2.8.2. Внеклеточная ДНК с измененными свойствами стимулирует образование и репарацию разрывов хроматина культивируемых мезенхимных 194 стволовых клеток человека

3.2.8.3. Окисленные фрагменты вкДНК стимулируют увеличение количества разрывов ДНК в ядрах клеток МСР7 199

3.2.8.4. Окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень двунитевых

разрывов в НЕР и 1ГОР, культивируемых в условиях окислительного стресса 203

3.2.9. Окисленные фрагменты вкДНК повышают уровень нестабильности 206 генома

3.2.9.1. Окисленные фрагменты вкДНК транзиторно увеличивают содержание фракции зиЬС1 в разных типах клеток 210

3.2.10. Изменение свойств вкДНК влияет на пролиферацию разных типов

клеток 212

3.2.10.1. Снижение содержания К1-67 в клетках в ответ на присутствие

вкДНК 212

3.2.10.2. Изменение экспрессии маркера пролиферации и репарации РСЫА в клетках в ответ на присутствие фрагментов вкДНК 216

3.2.11. ВкДНК вызывает остановку клеточного цикла 220

3.2.11.1. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции клеточного цикла при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 223

3.2.12. Активация процессов репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 227

3.2.12.1. Изменение пространственного положения локусов прицентромерного гетерохроматина района lq\2 при действии фрагментов 229 вкДНК

3.2.13. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают уровень гибели клеток разных типов 232

3.2.14. ГЦ-богатые и окисленные фрагменты вкДНК снижают количество

клеток с признаками апоптоза в разных клеточных популяциях 237

3.2.14.1. ВкДНК снижает активность каспазы 3 в разных типах клеток 240

3.2.14.2. Изменение экспрессии генов, участвующих в регуляции апоптоза

при действии окисленных и ГЦ-богатых фрагментов вкДНК 241

3.2.15. ВкДНК повышает транскрипционную активность клеток 247

3.2.16. ТЫ19 - рецептор, через который фрагменты вкДНК реализуют стимулирующее действие 249

3.2.16.1. ВкДНК больных ревматоидным артритом, модельные ГЦ- богатые фрагменты увеличивают экспрессию гена ТЫ19 в лимфоцитах человека 250

3.2.16.2. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию ТЫ19 в эмбриональных фибробластах легкого человека 252

3.2.16.3. ГЦ-ДНК снижает экспрессию Т1Л19 в лимфоцитах больного СКВ 252

3.2.16.4. ГЦ-ДНК усиливает экспрессию ТЬЯ9 в СЭ34+ клетках и мононуклеарах костного мозга 254

3.2.16.5. При действии ГЦ-богатых фрагментов вкДНК активируются рецепторы Т1Л19 в МСК 255

3.2.16.6. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК реализуют свое активирующее действие на НЦУЕС с участием ТЫ19 264

3.2.16.6.1. Изменение уровня экспрессии белка ТЫ19 при действии па НиУЕС вкДНК с измененными свойствам 266

3.2.16.7. Изменение уровня экспрессии TLR9 в MCF7 при действии вкДНК с измененными свойствами 268

3.2.16.8. ГДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК TLR9 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании 271

3.2.17. Участие рецепторов AIM2 в проведении сигнала от вкДНК в клетках человека 274

3.2.17.1. Влияние фрагментов вкДНК на уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в МСК 274

3.2.17.2. ВкДНК повышает уровень экспрессии гена рецептора AIM2 в

HUVEC 276

3.2.17.3. Изменение экспрессии рецептора AIM2 на уровне гена и на уровне белка при действии фрагментов вкДНК на культуру раковых клеток MCF7 280

3.2.17.4. Геномая ДНК и гДНКокси снижают уровень сенсора ДНК AIM2 в культивируемых фибробластах при длительном культивировании 283

3.2.18. Роль рецептора RIG1 в проведении сигнала от вкДНК 284

3.2.18.1. Влияние вкДНК на уровень экспрессии гена RIG1 в МСК 285

3.2.18.2. Влияние вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в HUVEC 287

3.2.18.3. Влияние вкДНК на экспрессию рецепторов RIG1 в MCF7 и HDF 288

3.2.19. Роль STING в проведении сигнала от вкДНК 289

3.2.20. Влияние вкДНК на экспрессию белков семейства TLR 291

3.2.21. ВкДНК активирует TLR-сигнальный путь 296

3.2.21.1. Изменение уровня экспрессии гена MyD88 -адаптера TLR-сигнального пути в ответ на стимуляцию МСК фрагментами п(рДНК) 296

3.2.21.2. Динамика изменения количества мРНК гена MyD88 - адаптера TLR-сигнального пути в ответ на стимуляцию HUVEC и MCF7 фрагментами 301 вкДНК

3.2.21.3. Влияние фрагментов вкДНК на активацию адаптера TLR9 -сигнального пути - MyD88 на уровне транскрипции в лимфоцитах, CD34+ 3Q2 клетках костного мозга и фибробластах

3.2.22. ВкДНК активирует NF-kB- сигнальный путь в разных типах клеток 303

3.2.22.1. ВкДНК активирует экспрессию генов NF-kB - сигнального пути в

МСК 304

3.2.22.2. Фрагменты вкДНК активируют экспрессию транскрипционного фактора NF-kB (RelА или р65) и его перемещение в ядро в МСК 3Q7

3.2.22.3. Активация процессов транскрипции генов цитокинов при действии фрагментов п(рДНК) на МСК. Активация синтеза цитокинов - ILIO и TNFa 312 фрагментами ГЦ-обогащенной вкДНК

3.2.22.4. Изменение экспрессии генов молекул сигнального каскада, контролирующего транскрипционный фактор NF-kB, в HUVEC при действии 315 фрагментов вкДНК

3.2.22.5. Влияние фрагментов вкДНК на количества белка р65 и его локализацию в HUVEC 315

3.2.22.6. ВкДНК повышает экспрессию генов цитокинов IL8, IL6, ILIO и

TNFa в HUVEC 319

3.2.22.7. Изменение уровня экспрессии генов молекул адгезии: ICAM1, SELE и VCAM1, контролируемых фактором NF-kB, при действии окисленных и ГЦ-

богатых фрагментов вкДНК в НиУЕС 321

3.2.22.8. ГЦ-обогащенная п(рДНК) активирует ЫР-кВ - сигнальный путь в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров 322

3.2.22.9. Активация экспрессии генов ОТ-кВ - сигнального пути образцами окисленной и неокисленной вкДНК в МСР7 324

3.2.22.10. Влияние окисленных фрагментов вкДНК на активность КР-кВ -сигнального пути в фибробластах в условиях окислительного стресса 238

3.2.23. Активация фрагментами вкДНК N1^2 - сигнального пути 331

3.2.23.1. ВкДНК активирует N1^2 - сигнальный путь в МСК 332

3.2.23.2. Активация К11Р2- сигнального пути фрагментами вкДНК в НиУЕС 336

3.2.23.3. Окисленные и неокисленные образцы вкДНК снижают активность транскрипционного фактора Ы1?Р2 и активируют транскрипционный фактор 339 БТАТЗ в клетках МСР7

3.2.23.4. Окисленные вкДНК активируют N1^2 - сигнальный путь в фибробластах 341

3.2.23.5. Изменение уровня экспрессии гена 80Б1 при действии ГЦ-богатых

и окисленных ДНК в разных типах клеток 342

3.2.24. Активация БТАТЗ - сигнального пути фрагментами вкДНК в разных

типах клеток 346

3.2.24.1. Активация экспрессии БТАТЗ фрагментами вкДНК в МСК 347

3.2.24.2. Активация БТАТЗ - сигнального пути фрагментами вкДНК в

НЦУЕС 348

3.2.24.3. Активация БТАТЗ - сигнального пути фрагментами вкДНК в МСР7 350

3.2.25. Активация транскрипционного фактора РРА1Ш2 фрагментами вкДНК в клетках разных типов 353

3.2.26. Окисленная вкДНК - фактор стресс-сигнализации в передаче сигнала

при радиационно-индуцируемом эффекте свидетеля 357

3.2.27. Окисленная вкДНК повышает устойчивость НОР к ионизирующей радиации 353

3.2.28. Воздействие ГЦ- ДНК улучшает выживаемость МСК после облучения 359

3.2.29. ГЦ-богатые фрагменты вкДНК стимулируют в МСК устойчивость к повреждающему действию этанола ^61

3.2.30. Влияние изменения свойств вкДНК на специфическую

функциональную активность клеток 3^3

3.2.30.1. Изменение свойств вкДНК влияет на количество окиси азота в

НиУЕС 363

3.2.30.2. Изменение уровня экспрессии и полимеризации актина 368

3.2.30.3. Повышение экспрессии генов миогенной дифференцировки при действии вкДНКокси на МСК 37О

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 374

ВЫВОДЫ 389

Применение результатов научных выводов 339

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 390

СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

CpG-ОДН - CpG-содержащие олигонуклеотидные аналоги; GAPDH - глицеральдегид фосфодигедрогеназа;

IRF3/7 - фактор, регулирующий транскрипционную активность гена интерферона;

МАРК — митоген активируемая протеинкиназа;

MyD88 -миелоидный фактор дифференцировки;

NBT - нитротетразолий голубой (nitro blue tetrazolium chloride);

NOX - НАДФН-оксидаза;

PRR - образ-распознающие рецепторы;

RIG-I - цитоплазматическая РНК-геликаза, рецепор, узнающий dsPHK (retinoic acid

inducible gene 1);

SDS - додецилсульфат натрия;

SSC - стандартный солевой раствор;

SOD - супероксиддисмутаза;

TCR - Т-клеточный рецептор;

TLR - «Toll» - рецепторы;

TNF- а - фактор некроза опухоли альфа;

АФК - активные формы кислорода;

АО - адаптивный ответ;

вкДНК - внеклеточная ДНК;

вкДНКокси- окисленная in vitro ДНК;

гДНК - геномная ДНК;

ГЦ-ДНК - ДНК, обогащенная GC парами азотистых оснований; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; ДР - двуцепочечные разрывы; ЗД - здоровые доноры; ИЛ - интерлейкин;

инг-ОДН - ингибирующие олигодезоксинуклеотиды;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ИФН - интерферон;

КД - контрольные доноры;

ОД - облученные доноры;

ОДН - олигодезоксинуклеотиды;

ОИМ - острый инфаркт миокарда;

ОНП - однонуклеотидный полиморфизм;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РА - ревматоидный артрит;

СатШ - субфрагмент сателлита 3;

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания;

СКВ - системная красная волчанка;

ТОрДНК - транскрибируемая область рибосомного повтора;

ФНО - фактор некроза опухоли;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЭС - эффект свидетеля;

я ДНК - ядерная ДНК;

ЯОР - ядрышкообразующие районы хромосом.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Фрагменты ДНК, циркулирующие вне клеток в межклеточной среде организма или в среде культивирования клеток, называют внеклеточной ДНК (вкДНК) [Galeazzi et al., 2003]. Существует несколько гипотез о происхождении внеклеточной ДНК, основными из которых являются - образование пула внеклеточных нуклеиновых кислот в результате гибели клеток ("гипотеза клеточной гибели") и активная секреция ДНК живыми клетками (гипотеза "метаболической ДНК") [Pisetsky, 2012; Peters and Pretorius, 2011; Gahan et al., 2008].

Повышенный интерес к внеклеточной ДНК связан с возможностью ее использования в качестве маркера для диагностики. В составе внеклеточной ДНК, выделенной из плазмы или сыворотки периферической крови, обнаруживается ДНК опухоли (при онкологической патологии), ДНК плода (при беременности), что позволяет анализировать соответственно геном опухоли или плода, не прибегая к биопсии. Определение концентрации внеклеточной ДНК позволяет в ряде случаев оценить уровень гибели клеток при патологии или при действии повреждающих факторов, в том числе, ионизирующей радиации и ультрафиолета [Schwarzenbach, 2013; El Messaoudi et al., 2013; Gonzälez-Masia et al., 2013; Jung et al., 2010; Zhang et al.,2010; Chiu et al.,2013]. К моменту начала данного исследования гораздо меньшее число работ было посвящено биологическому действию внеклеточной ДНК на активность генома клеток организма человека [Gahan et al., 2010]. Вместе с тем, внеклеточная ДНК циркулирует в составе крови организма и потенциально может влиять на функциональную активность клеток разного типа. Известно, что многи�

Информация о работе

Костюк, Светлана Викторовна
доктора биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.02.07

Диссертация

Роль внеклеточной ДНК в функциональной активности генома человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Роль внеклеточной ДНК в функциональной активности генома человека ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль внеклеточной ДНК в функциональной активности генома человека"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Костюк, Светлана Викторовна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль внеклеточной ДНК в функциональной активности генома человека
ВАК РФ 03.02.07, Генетика