Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внеклеточная низкомолекулярная ДНК крови животных как прогностический признак облучения

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Внеклеточная низкомолекулярная ДНК крови животных как прогностический признак облучения"

научно- исследовательский институт военной медицины мо рф

. . • • < -■} .л

на правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА Ирина Николаевна

внеклеточная низкомолекулярная днк крови животных как прогностический признак свлучения

03.00.16 - ЭКОЛОГИЯ, 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 1994

- г -

Работу выполнена в Научно-исследовательском институте военной медицины Министерства обороны РФ.

Научные руководители: член-корреспондент Российской АТН доктор медицинских наук, профессор В.Г. Владимиров,

доктор медицинских наук a.C. Белохвостое.

Официальные оппоненты; доктор биологических наук, профессор ЛЫЗЛОВА С.Н. доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

ИВАНЧЕНКО A.B.

Ведущая организация Военно-Медицинская академия, С.-Петербург

Защита диссертации состоится " 24" ноября 1994 г. в jj9$hc. на заседании специализированного совета. Д 106.05.01 при Научно-исследовательском институте военной Медицины МО РФ (195043 ул.Лесопарковая, 4).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Научно-исследовательского института военной медицины МО РФ.

Автореферат разослан "Jlc C/f/ß^/t Л' 1994 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, ;

доктор медицинских наук ' Р.Б.Гольдин.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми последоваиия. О позиций экологии ионизирующие излучения наряду с температурными' и климатическими воздействиями относят к абиотическим факторам окружающей среди. Каждая местность имеет свой естественный радиоактивный фон, к которому приспособлены остальные компонент экосистемы. Однако с развитием научно-тохнического прогресса воздействие радиации приобрело антропогенный характер. Поскольку оно значительно отличается по величине, интенсивности и продолжительности от существуют в природе уровней, к которым адаптированы биологические системы, то в этом случае может возникнуть серьезная опасность для всего живого.

По сравнению с другими абиотическими антропогенными факторами ионизирующие излучения представляет особую опасность еще и по той причине, что у человека нет соответствующих анализаторов, способных их воспринимать, Поэтому для оценки степени воздействия ионизирующих излучений необходимы чувствительные и надежные биодозиметриче-ские критерии. к показателям, с помощью которых пытаются оценить эффект воздействия ионизирующей радиации на организм, относят прежде всего увеличение числа хромосомных аберраций в радиочувствительных клетках, а также степень лимфопении ( Т.К.Джаракьян, А.И.Воробьев, , Е.В.Гембициий, В.Г. Владимиров и др.). Оба эти поюзателя, к сожалению, не отвечают современным требованиям, и в настоящее время предпринимаются попытки поиска новых критериев, которые были бы достаточно информативными уже в ранние сроки после облучения и в то же время приемлемыми для практической медицины.

В последние годы появились сообщения, что при ряде экстремальных воздействий в плазме крови и некоторых других биологических жидкостях человека и животных появляется низкоМолекулярная ДНК (А.С.Еелохвостов и др., 1087, Belokhvostov, Zelenkova, 1978, Leon et.al., 1981, Rumore et.al., 1992). Она обнаружена в бесклеточной части крови больных системной красной волчанкой (Rumore et.al., 1992) и при различных видах раковых заболеваний (Leon et.al., 1981). У животных низкомолекулярная ДИВ определяется при экспериментальных опухолях (Belokhvostov, Zelenkova, 1978, Белохвостов A.C., '1084) и после облучения (Vladlmlrov et.al., 1992). Причина появления такой ДНК, как впрочем и ип-

точник ее происхождения, в настоящее время неясны. В опытах Ii vitro показано, что низкомолекулярная днк выделяется в среду при культивировании лимфоцитов (Федоров H.A.,1933, Anker, 1975, Rogers, 1972). IIo мнению некоторых авторов (Белохвоетов A.c., Войтенков Б.О., 1983, Васюхкн В.И., 1991, Anker et.al., 1980) она может нести информацию для других клеток. При лучевой патологии представляется весьма актуальной возможность использовали» появления ниакомолекулярной ДНК в плазме крови в качестве биоиндикатора и даже в качестве биодозиметрического критерия. С этой точки зрения настоящее исследование представляет интерес не только с позиций молекулярной биологин, но и с точки зрения радиационной экологии.

Изучение первичной структуры ДНК человека и млекопитающих в настоящее время является ключевой проблемой молекулярной биологии. Расшифровка последовательностей нуклеотидов внеклеточной ДНК важна для решения вопросов об источнике и механизмах ее происхождения.

Цель и г.адачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение фракции низкомолекулярной ДНК в плазме крови, появляющейся после облучения животных, исследование ее содержания и структуры, а также воамолности использования этого феномена в качестве показателя оценки степени тяжести лучевого поражения. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. Исследовать содержание низкомолекулярной фракции ДНК в плазме крови у крыс после облучения их ионизирующим излучением в различных дозах (в диапазоне от 8 до 100 Гр).

2. Изучить структуру внеклеточной низкомоле^лярной ДНК, для чего важно било

- определить последовательность нуклеотидов, используя для этой цели матоди клонирования и секвенирования;

- проанализировать нуклеотидйый состаЕ, распределение динуклео-тидов, выявить начичие сайтов известных рестриктаэ в исследуемой фракции ДНК;

- сравнить последовательности нуклеотидов в исследуемой ДНК с известными последовательностями ДНК, представленными в международных битах данных.

Р.. Сопоставит* структуру нивкомолекулярной ДНК, выделенной после облучения животных в дозах 9 и 100 1р,

Данное исследование выполнено согласно теме N 4921 "Создание ДНК~зондов для ранней диагностики степени тяжести радиационных поражений.

Научна! новизна работы. Новыми являются дашше по изучению закономерности изменения содержания низкомолекулярной фракции ДНК в плазме крови животных после их облучения в диапазоне доз 8-100 Гр. Установлено, что содержание ДНК изменяется прямопро-порционально в зависимости от дозы облучения в диапазоне доз воздействия от 8 до 20 Гр, а далее (до доги 100 Гр) эта зависимость имеет логарифмический характер. Впервые обнаружено, что эта ДНК состоит из двунитевых молекул линейной формы длиной около 170 пар нуклеотидов с однонитевыми концевыми участками• при отсутствии на них 5'фосфата. Разработан метод клонирования таких молекул, включающий обработку их кленовским ферментом и полинуклеотидкиназой. С использованием современных компьютерных программ установлено, что по своему нуклеотидному составу, распределению динуклеотидов, наличию сайтов рес'триктаз Alul и ЕсоКП низкомолекулярная ДНК плазмы крови Практически не отличается от ДКК генома. Новыми являются данные, согласно которым содержание В/С-пар в низкомолекулярной ДНК выре, чем среднее их содержание в ДНК генома. В составе 18 секвенированных последовательностей обнаружены сигнальные участки Са.Мг-зависимой эн-донуклеааы, расщепляющей хроматин до нуклеосом. Впервые применен анализ первичной структуры внеклеточной ДНК с использованием базы данных международного компьютерного байка EMBL. Обнаружено, что низкомолекулярная ДНК содержит фрагменты LINE-элемен-тов, которые располагаются в середине, в районе З'конца и около 5'конца элемента.

Практическая значимость. Исследование дозовой зависимости содержания низкомолекуляриой ДНК плазмы крови облученных крыс свидетельствует о принципиальной возможности использовать этот показатель в iкачестве диагностического теста в биодозиметрических целях. Обнаружение фрагментов LINE-элементов в составе низкомолекулярной фракции внеклеточной ДНК крови, в особенности фрагмента, принадлежащего к б'кониевому району LINE, может быть использовано для разработга* биоиндикаторного теста, обеспечивающего быстрое определение факта облучения.

Основные положения; выносимые на защиту: 1. Появление низкомолекулярной ДНК в плазме крови мсяет быть

- б -

использовано в качестве критерия оценки степени тяжести лучевого воздействия на ор2,аииэы.

2. Низкомолекуляркая фракция ДНК, появляющаяся в плазме крови после облучения, имеет геномное происхождение.

3. Низкомолекулярной ДНК, выделенная из плазмы после облучения б дозах 8 и 100 Гр, принципиально не различается по структуре и происходит из высокомолекулярного предшественника.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы изложены и обсувдены на конференции "Современные достижения медицинской радиологии" (Санкт-Петербург, 1933), на 1 Всесоюзном радиобиологическом съезде (москва, 1989), II Радиобиологическом съезде (Киев, 1993). на XI симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра"(Санкт-Петербург, 1993) и на юбилейной конференции, посвященной 25-легло со дна основания НИИ военной медицины (Санкт-Петербург, 1994).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 4 статьях и 6 тезисах докладов.

Объем и структура. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложения, содержащего 44 схемы. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками, 10 таблицами и 2 схемами.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты поставлены на белых крысах-самцах массой 180-250

г.Животных подвергали воздействию г-квантами 1Э7Сз на аппарате ИГУР в дозах 9, 20, 50 и 100 Гр (при мощности дозы 1,6 Гр/мин). Через 5 ч после облучения животных забивали деглпитацией. Кровь собирали в полиэтиленовые чашечки, куда предварительно добавляли 76 мкл О,Б М ЭД'ГА (рН V, 3) в соотношении 70:1. Для анализа брали кровь от 6 животных. Клеточные элементы крови тщательно удаляли последовательным центрифугированием при 900 е, а затем при 2200

д. Нуклеиновые кислоты из плазмы выделяли фенольным методом (Рязанцева И.П., 1969). Для этого к полученной плазме крови немедленно добавляли ингибиторы нуклеаа, детергенты и фенол (из расчета на <0 мл плазмы 10 мкл 0,1% поливинилсульфата калия, 10 мм 31 суспензии бентонита, 1 мл 10Х раствора додецилсульфата натрия и 330 мкл 3 М Ма-ацетатного буфера рН 5,75), после перемешивания к смеси приливали 10 мл водоиасыщениого фенола. Полу-чоннуга смесь покачив.чли п течение 10 мин на ротационной качалке

в "мягком" режиме, избегая деградации молекул ДНК. После добавления 1 мл хлороформа эту процедуру повторяли. Далее пробы центрифугировали в течение 15 мин при 12000 g и 4°С. К полученной водной фазе приливали половинный объем 80% фенола, взбалтывали и вновь покачивали 10 мин при комнатной температуре, после чего на холоду подвергали центрифугированию в течение 10 мин при 1Г000 g. Депротеинизацию водной фазы с фенолом повторяли триады, а га-тем из водной фазы с помощью этанола, охлажденного до -20°С, осаждали нуклеиновые шюлоты. Пробы выдерживали 12 ч при -ZQ°C и вновь центрифугировали при 12000 g. Полученной осадок подсушивали в вакууме и растворяли в 10-20 мкл буфера (10 мМ трис-НС1 рН 8,0 1 Мм ЭДТА). Полученный препарат подвергали электрофорезу е градиенте (2/16%) полиакриламида в 0,04 M трио-ацетатном с добавлением 0,01 H ЭДТА буфере (рН 7,7). Из соответствующего участка геля элюировали низкомолекулярную фракцию ДНК с помощью 1 M раствора ацетата аммония (рН S,0) (Manlatls et.al., 1982). Полученную ДНК очищали и клонировали В клетках Е.соИ (штаммы TG1 и XL1), используя плззмиду BLUESCRIPT М13+ (фирмы Stratagene, США). Для создания ДНК линейной формы с двухцепо-чечными (тупыми) концами ее обрабатывали рестрикта&ой Smal. Чтобы избежать самолигирования .в последующих процедурах, 5'-концы ДНК плазмиды обрабатывали бактериальной щелочной фое-фатазой (из расчета 0,5 ед. на 10 мкг) (Manlatls et.al., 1982). Поскольку концевые участки отдельных молекул клонируемой ДНК могли оказаться одиоцепочечными, с помощью кленовского фрагмента ДНК-полимеразы осуществляли достраивание второй цепи. Поврежденные 5'-концы ДНК обрабатывали полинукяеотидкинагой (из расчета 50 ед. активности на 100 яг ДНК).

Клонируемую низкомолекулярную ДНК дотировали с векторной (плазмидной) ДНК. полученную рекомбинантную ДНК использовали для трансформации компетентных клеток Е.соИ. Выделение реком-бинантных плазмид и секвеиирование по Сеягеру проводили стандартами приемами (Sanger et.al. 1977, Chen, Seeburg, 1985).

Компьютерный анализ результатов секвенирования и сопоставление с известными последовательностями.ДНК выполняли по программам DNASIS, DNASTAR и PCGENE с привлечением байта EMBL (ФРГ. версия 26).

Все эксперименты и исследования выполнены автором самосто-ятельно.

- е -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ниакомолекулярная фракция ДНК, как показали исследования, имеется в плазме крови только у облученных животных. Тем самым подтверждается ранее устаноаленный (Белохвостое A.C., 1987) факт, что такого рода фракции ДНК нет у интактных животних. Длина молекул изучаемой ДНК составляет 1Ё0-180 пар нуклеотидов. Эги данные были получены путем разделения фрагментов ДНК в 2/16% градиенте полиакриламидного геля. В качестве маркера длины молекул ДНК использовали рестрккты PBR322/BSPRI. Содержание ниэкомолекулярной ДНК в плазме крови крыс после их облучения в дозе Ö Гр составило 52±15 нг/мл. По мере увеличения дозы облучения количество ее возрастало. Согласно опубликованным данным сотрудников нашей лаборатории при увеличении дозы облучения от 1 до 8 Гр наблюдается прямопропорциональная зависимость роста содержания ниэкомолекулярной ДНК от дозы облучения. Следует отметить,, что, судя по нашим данным, эта зависимость сохраняется до дозы в 20 Гр и может быть описана уравнением линейной , регрессии у—1,25+б,95х. Далее зависимость между содержанием ниэкомолекулярной ДНК и дозой облучения принимает вид логарифмической кривой с уравнением типа у—231,29+125,SOlnx, где у -количество ДНК в плазме крови животных, (в нг/мл), х - дога облучения (Гр).

Предложенный биодозкметрический показатель выгодно отличается от существующих. Во-первых, он может использоваться как биоиндикатор, поскольку у интактных животных количество этой ДНК ничтожно мало, либо она вообще отсутствует. Поэтому сам факт появления внеклет( чной низкомолекуллрной ДНК является весьма удобным показателем, работающим по принципу "да-нет". Второе преимущество заключается в том, что обнаружена его зависимость от дозы облучения. В атом отношении предложенный показатель имеет ряд преимуществ перед таким общепризнанным критерием, как количество и вид хромосомных аберраций в клетках костного мозга, поскольку последний может быть использован лишь в диапазоне доз до минимальной смертельной (8 Гр), после которой кривая, отражающая эту вависимость, выходит на плато. И, наконец, нельзя не учитывать временной'фактор. Если по данным исследования хромосомных аберраций можно получить информацию только черва 24-30 ч, то по данным определений ниакомолекуляр-

%

ной ДИК в плазме крови сам факт и доза облучения могут быть определены уже через 5 ч. Ниакомолекулярная ДНК как Сиодоэиметри-ческий показатель имеет еще более очевидные преимущества перед лимфопенией, которая развивается в существенно более поздний период (спустя 2-3 сут после облучения). Однако говорить о практической значимости исследованного показателя еще преждевременно, поскольку он требует соответствующей адаптации для клинических условий.

Для исследования формы молекул низкомолекулярной ДНК использовали метод ограниченного гидролиза ДНК с помощью ДИКагы. Результаты опытов показали, что молекулы низкомолекулярной ДНК имеют линейную форму, о чем свидетельствует наличие "шлейфа", состоящего из частично расщепленных молекул ДНК, и расположенных непосредственно за фракцией нерасщепленных молекул. Если бы исследуемая ДНК имела кольцевую форму, то гидролиз ее ДНКазой (в малых концентрациях) приводил бы к образованию "линейной" фракции, которая при электрофорезе имела бы более значительную длину'пробега.

В структуре выделенной из плазмы крови облученных животных низкомолекулярной ДНК отсутствовали б'-фосфатные группы. Представляется, что подобная особенность полученной ДНК связана с высокой фоефатазной активностью крови у облученных животных.

В последующем была секвенирована исследуемая ДНК 26 клонов, содержащих рекомбинантную плазмиду (из них 14 содержали ДНК плазмы крыс, облученных в дозе 8 Гр и 12 клонов - в дозе 100 Гр). Длина клонированных последовательностей низкомолекулярной ДНК, выделенной от облученных животных, оказалась праки-чески одинакова и в среднем составляла около 1Б0 нуклеотидных пар (табл.1). Это укладывается в общепринятое понятие низкомолекулярной фракции ДНК и соответствует размерам мононуклеосом. Исключение составляли клоны RNBP2, -11 и 57, содержащие соответственно 71, 282 и 86 пар нуклеотидов, Короткие фрагменты, вероятно, могли образоваться иг-ва наличия однонитевых разрывов в облученной ДНК. а длинные - после воздействия ферментов, используемых для клонирования.

Анализ результатов секпенирования изучаемой ДНК с использованием программу DNASI5 показал, что все полученные клони по своей первичной структуре различны и гомология между ними отсутствует, Отметим обнаружение Фрагмента потенциал*ной 2-ДНК я

Таблица 1

Состав клонированной низкомолекулярной ДНК, выделенной из плазмы крови облученных крыс

Доза Шифр Количество Содержание нуклеотидов, в 7. Содержа-

оС лу- клона пар нуклео- ние В/С-

чения, ДНК тидов А С в Т пар, в X

в Гр

Й1ВР31 184 19,6 26,1 21.7 32,6 47,0

галзязг 131 25,2 22,1 22,9 29,8 45,0

(ШРЗЗ 163 £3,9 35,6 20,2 20,3 55,8

га®рзб 181 32,6 21,6 22,6 23, г 44,2

КНВР42 146 22,6 21,9 20,6 34,9 42,5

1ЭДВР43 155 11,6 26,4 23,9 33,1 50,3

КЫВР44 140 10,7 30,0 29,3 30,0 59,1

8 1?МВР47 134 31,3 26,4 18,7 24,6 44,0

Ю18Р52 158 29,7 31,7' 17,1 21,5 48,7

(?№Р53 185 17,7 19,5 23,3 41,5 42,7

И1ВР54 169 26,0 31,4 16,0 26,6 47,3

КНВР56 115 19,1 33,9 27.8 19,1 61,7

га©Рб7 86 21,9 37,1 10,4 33,6 44,2

КНВР8К 156 го.8 19,9 26,3 23,1 46,2

23,0 27,2 21,3

М±т 160 ±8 ±1,8 ±1,4 ±1,4 ±1,8 48,5±1,5

КМВР2 71 39,4 32,4 19,7 8,5 52,1

(?№Р4 128 26,6 21,1 22,7 29,7 41,5

!?ШР6 158 28,5 23,4 22,3 25,3 44,2

ГШР9 155 18,1 27,1 18,7 36,1 45,8

ЙМВРЮ 151 22,5 37,8 16,5 23,2 54,3

ННВРИ 282 22,3 21,3 26,3 30,1 47,5

Ю1ВР13 148 25,0 21,6 33,1 20,3 54.7

100 ЙШР14 152 19,7 21,7 19,7 38,8 41,4

КИВРЮ 139 19,4 28,8 25,9 25,9 54,7

И®Р17 123 30,1 27,6 14,6 27,7 42,3

СТШР18 123 22,0 27,6 20,3 30,1 48,0

РШРбб 154 . 22,0 22,8 36,4 18,8 59,1 ,

"ЙБ7О~ 26,1 22,7 26,2

М*т 148419,4 ±1,9 ±1.,0 ±2,0 ±2,8 48,8±1,б

____,____ __________ ___...__________ ... _________ —----- ------- -----------

- и -

составе клона HNBP2 и вырожденного гомолога поли(А)-участка в клоне RfiBPll. Посколысу такие фрагменты относятся к числу часто встречающихся в геноме, то вероятность их обнаружения в составе клонированных последовательностей достаточно велика. Данные литературы по секвенированию ДНК, выделенной из бесклеточной части крови, весьма ограничены. Нам встретилась лишь работа, посвященная изучению структуры ДНК, которая была выделена из сыворотки крови больного, страдающего системной красной волчанкой (Van Helden, 1985). Интересно отметить, что один из 10 клонов ДНК сыворотки крови при этой патологии оказался гомологичным клону RNEP2 и также представляет собой потенциальный элемент Z-ДНК.

Результаты исследования нуилеотидного состава полученной фракции ДНК указывают на отсутствие достоверной разницы в содержании какдого из 4 нуклеотйдов в струстуре изучаемой ДНК вне зависимости от того, была она выделена от животных после облучения 8 Гр или 100 Гр. Среднее содержание нуклеотйдов составляло соответственно: А - 23 и 25 X, С - 27 и 26 Z, G - 21 и 23 % иТ- 28 и 26 X. Напомним, что распределение нуклеотйдов в геномной ДНК отличается от случайного. В геноме.грызунов, судя по данным литературы (Adams, Burdon, 1985), количество комплементарных нуклеотйдов □ и С (G/C-пар) находится в пределах 40t. В нашем же случае клонированная ДНК обогащена G/С-парами (среднее содержание их составляло в обоих- случаях 48Х). Ни в одном из секвенированных нами клонов не было количества G/C-nap меньше, чем среднее по геному. ДНК, выделенная - из сыворотки больных системной красной волчанкой (Vön Helden, 1985, Hernien et.al. 1989), также обогащена G/C парами (43-51%, при среднем содержании G/C-nap в геноме здорового человека 38%). Последнее может рассматриваться в качестве доказательства сходства механизмов образования ДНК, обнаруживаемой в бесклеточной части крови при патологии различной этиологии.

Сопоставление секвенированных последовательностей низкомолекулярной фракции ДНК плазмы кроеи облученных крыс с аналогичными данными банка EMBL позволило выявить сходство (с вероятностью до 99t) с имеющимися в банке последовательностями. Наиболее значимые гомологии (с вероятность не менее OTt) приведены в табл. 2. Обратим внимание на 3 последовательности, которьга гомологичнп Фрагменту LINE (с длиной около 6,7 тыс. пчр нуклео-

- 1Й -

Таблица 2

Степень гомологии изучаемых фрагментов нигкомолекулирной ■ фракции ДНК плазмы крови облученых крыс известным структурам ДНК банка ЕШЬ

Шифр Степень Индекс Название Часть

клона гомоло- гена гена гена

гии, в % (EMBL)

8 Гр

RNBP31 81 MHL21KD1 Полипептид мМ 21 кД мышей мРНК

RNEP43 91 RNL1ALB LINE 3 крыс -

RMBP52 76 RNPPL7A Рибосомадьный белок L7A МРНК

крыс

RNBP53 96 RSLIN3A LINE 3 крыс 5'конц.

участок

RNBP54 68 • RNMT1PB Псевдогеа металло- 5'конц.

протеина~1 крыс участок

RNBP50 Со RNODC Ген орнитин-декарбоксилаэы инт-

крыс рон 1

RNBP57 63 RNKALA Ген калликреина почек крыс инт-

крыс рон 1

RNBP82 69 H3TAR3TB Теломерные повторяющееся -

последовательности

человека

100 Гр

RNBP2 91 RNRTSt Нетранскрибируемый спейсер -

после гена 28S рибосшаль-

ной РНК крыс

RNBH10 64 МШН0АВ1 Главный комплекс гнстосов- сег-

местимости мышей, классП, мент 1

А-р-2 ген

RNBP11 64 ИШй R1 поьгоры ДНК мцияй -

RNBP14 90 R3LIN3A LINE 3 крыс -

RNBP4 63 IFMB Интерферон-В человека МРНК

RNBPR6 74 HSHUMS3 Рибооомадоши белок S3 мРНК

человека

•гилов) - повторяющимся элементам ДНК (Soares et.al., 1985). Такие последовательности относительно гомогенны и составляют около 10Х генома крпс. В их состав входят 2 рамки считывания и сигнал подиаденилирования, т.е. они способны к транскрибции. Схематическое строение LIHE-элемептоь с обозначением участков, гомологичных полученным клонам, представлено на рис.1. Клон RNBP53 имеет 93Х гомологии и картируется в локусе мевду 703 и 887 парами нуклеотидов элемента LINE 3, что соответствует Б'-концу этого элемента, а клоны RÍJBP43 и -14 - 3'-концу LIME. Причем последовательность RNBP43 встречается в элементе LINE двавды и картируется приблизительно между 3,8 и 4,0 тис. пар нуклеотидов. Известно, что LINE-последовательности ограничены короткими повторами и являются легко транспозируюшммися, т.е. могут перемещаться по геному. Является ли выделение в плазму крови ДНК с такого рада последовательностями случайным процессом или воздействие ионизирующих излучений способно стимулировать подвижность генома, пока неизвестно.

ЕЕЕЕ _i»«*_

LINE 3

ЕЕ i i.

urf El

_14—

»12 I

t~

5 6 _i__i—

urf H И Е B|R _i_i im

ч 3 '

LINE 4

PA

21

Рие.1. Расположение клонов низкомолекулярно.ч ДНК плагми крови

облученных крыс на схеме строения LINE элемента«. Участки, гомологичные полученном ¡ионам, обозначены двойными линиями. 1," и 3 обозначают соответственно клоны RNSP53, -4.Э и -14, в верхней части рисунка - шкала в тис. пар нуклеотидоь, буквами й, Е, Н. R укачаны сайты рестрикции BamHI, EcoRI, Hinalli, Rsal.

Кг-ужками отиечеш; прямые повтори,

mf - начало и конец ивидеч? иодированной рсыки

считывания, рй - сигнал полиаденилирования.

R

\

Отметим, что среди изученных клонов не обнаружено фрагментов сателлитной ДНК, которая составляет около вХ генома и представлена чередующимися мономерными фрагментами длиной около £30-£40 пар нуклеотидов.

Определенный вклад в представления о первичной структуре моле^/л ДНК могут внести данные о динуклеотидном составе. В ДНК генома среднее содержание динуклеотида СрН было равно 1.3%, а СрТ - 7%, что свидетельствует о неслучайном их распределении в геноме. В противном случае оно соответствовало бы усрчднеиной величине (6,2Х). В исследуемой ДНК содержание угазанкых динук-леотидов составляло 0,7% для Срв и 9,6% для СрТ после облучения В дозе 8 Гр и 1,7% для СрЭ и 7,82 для СрТ после воздействия в дозе 100 Гр, т.е. наличие небольших структурных различий в данном случав имеется, но от геномной ДНК достоверных отличий нет (рис. 2). По-видимому, это свидетельствует о происхождении изучаемых ДНК из различных участков генома. Динуклеотид СрВ является потенциальные сайтом метилирования и широко представлен в 5'-фланкирующих областях, экзонах и интронах всех известных

7.

10

CpG

¿I

СрТ -Í-

-ЭН

12 3

Рис. 2. Относительное содержание динуклеотидов СрЗ и СрТ в клонированной ДНК плазмы крови крыс после облучения в дозах 8 Гр (2) и 100 Гр (3), а также я геноме необлученных животных (1). По оси ординат - содержание дчнуклеотидов, в Z. Содержание динуклеотидов при случайном распределении обозначено пушстирной линией.

"генов домашнего пользования", т.е. в генетических структурах, контролирующих обмен веществ в клетке. Такие гены, как полагают (Bernardl,1989), локализуются в основном в R-бандах хромосом.

Далее встает вопрос, имеется ли какая-либо корреляция между количеством динуклеотидов CpG в исследуемой ДНК и ее нуклео-тидним составом. Предполагают (Adams, Burdon, 1985), что те участки ДНК, которые обогащении параш оснований в/0, должны содержать увеличенное количество динуклеотида СрВ. Наши же данные указывают на отсутствие этой зависимости.

Компьютерный поиск рестрикциснных сайтов последовательностей низкомолекулярной ДНК плазмы крови облученных крыс позволил иа более, чем 600 участков действия известных рестриктаз выделить 6, встречающихся наиболее часто. Это прежде всего сайты рестриктаз AluI и Sau3AI. Сайт рестриктавы Mspl, имеющий в своем составе динуклеотид CpG, встречался в 3 клонах исследуемой ДНК (RNBP33,-42 и -13), а аналогичный сайт рестриктазы Пае III обнаружен в 11 монах. Отметим также сайты рестриктаз EccRI I и Sau9SI, которые, как известно, служат маркерами для выделения сателлитной ДНК.

Поскольку источником ниакомолекулярной фракции могут быть более крупные фрагменты ДНК геномного происхождения, бил произведен поиск сайтов действия Са/Мг-завмсимой эндонуклеаэы, расщепляющей ДНК. Участки GGI1GG и CCNCC (Ходарев H.H. и др, 1988) являются сайтами "узнавания" этого фермента и располагаются примерно на расстояний "5 нуклеотидов от локуса его действия. Эти сайты были обнаружены нами в составе 18 секвенированных последовательностей. Из их числа б таких сэйтое располагалось в пределах до 25 нуклеотидов от концов последовательностей, при этом клоны RNBP36 и -10 содержали, соответственно, 4 и 3 аналогичных участка.

Весьма сложным представляется вопрос о природе и причинах появления гнеклеточной ДНК. В литературе рассматривается два механизма ее происхождения. Во-первых, такая ДНК может образоваться в результате специального синтеза, что предполагает наличие у нее определенного функционального предназначения. Во-вторых, она молет появиться в результате ферментативного распада клеток. При этом должны образовываться фрагменты ДНК с определенными концевыми участками. В нашем случае они были од■

нонитевнми и не имели с 5'конца фосфатных группировок. Наличие однонитевых участков на концах низкомолекулярной ДНК по данным литературы (Van Helden, 1985, Herman et.al. 1089) обнаружено и при клонировании ДНК, выделенной из бесклеточной части крови больных системной красной волчанкой.

Идентификация последовательностей низкомолекулярной ДНК с помощью данных генетического банка позволила установить, что участки клонированных молекул этой ДНК гомологичны различным повторяющимся элементам или представителям больших кластеров генов. Это соответствует имеющимся в литературе данным, полу- . чешшм методом (мот-гибридизации внеклеточной ДНК с ДНК генома (Васюхин и др., 1966, LI, Steinman, 1989, Strouin et.al., 1987), а также нашим ранее опубликованным результата (Vladlmirov et.nl., 1932). Кроме тогй, нами обнаружены фрагменты потенциальной Z-ДНК и вырожденного гомолога поли(А)-участка. Такие последовательности весьма распространены в геномах эукариот и их относят к простым последовательностям генома (Gebhard, Zachäu, 1963). Итак, совокупность представленных в настоящей работе результатов свидетельствует о родстве Фрагментов изучаемой ДНК и ДНК генома. К сожалению, все эти данные еще не могут быть использованы для решения вопроса о конкретных механизмах появления низкомолекулярной ДНК, т^е. вопроса о том, образуется ли она путем распада геномной ДНК или синтеза на геномной матрице. И в том, и в другом случае последовательность нуклеотидов в ней будет гомологична геномной ДНК.

Однако можно представить и другую версию, которая включает оба механизма: и процесс синтеза, и процесс деградации ДНК. Известно, что воздействие иониаирукщих излучений может приводить к блоку митозов. Клетки, накопившие в фазе S практически диплоидное количество ДНК и не способные вступить в митоз, согласно этим взглядам (Rogers et.al., 1972) экскретируют излишнюю ДНК. Поскольку процесс репликации ДНК в таких случаях, как правило, остается не завершенным, а синтез сателлитной ДНК происходит на заключительном этапе фазы S, то экскретируемая ДНК не будет содержать ее.

v Еще одно предположение относительно происхождения низкомолекулярной ДНК состоит в том, что активация процесса обратной транскрипции предшествует выделению ДНК из клеток. Поэтому можно предположить, что обнаруженные в составе внеклеточной ДНК

LINE-элементы являются отражением ряда сложных процессов, предшествующих гибели клетки. В атом случае участки.генома, в которых локализованы LINE-злементы или ген pol (преимущественно 3-банды хромосом), буду? находиться в менее компактном состоянии в сеязи с активным протеканием процессов транскрипции. Это делает их доступными для воздействия ферментов, расщепляющих хроматин до отдельных нуклеосом. В пользу этой точки зрения свидетельствует обнаружение высокой (93-98%) степени гомологии LINE-элементам фрагментов 3 клонов исследованной нами ДНК. Одна из рамок считывания LIME-элементов, как известно, соответствует гену pol, кодирующему обратную транскриптазу. В работе (Herrman et.'al., 1989), относящейся к ДНК плазмы крови больных систеыной красной волчанкой, такье описан фрагмент, гомологичный гену pol ретровируса HIVI. Нам представляется, что это может указывать на связь процессов обратной транскрипции и выделения (или образовании) этой ДНК. В доступной нам литературе нет исчерпывающих сведений о роли процессов обратной транскрипции ни в клетках, нормально функционирующих в условиях организма, ни в клеточных культурах. Имеется лишь одна работа (Servomaa, Rytcmaa, 1990) с описанием факта активации процесса транскрипции LINE под воздействием г- и UV-излучений. По мнению авторов повышение транскрипционной активности LINE-элементов приводит к гибели клеток путем апоптоза.

Компьютерный анализ первичной структуры низкомоле1:улярной ДНК плазмы крови показал, что изученная ДНК имеет ряд особенностей. К кх числу относится повышенное содержание пар нуклео-тидов GC, которое достигало 48Z и не зависело от дозы облучения (8 и 100 Гр). Одним из объяснений повышенного содержания GC-пар в ДНК плазмы крови может быть селективное выделение этой ДНК из облученных клеток после воздействия на них Са^.Ц^-азьисимой эндонуклеаны. Как уже указывалось, сигнальный участок этого фермента предстаЕЛен пентануклеотидами, состоящими из нуклеоти-дов С и G. Следоьательно, выявленной нами повшаенпое содержание GC-nap в низкомолекулярной ДНК плазмы крови можно связать все-таки скорее с образованием ее в результате деградации до нуклеосом. Заметим, что в геноме есть участки, для которых характерно повышенное содержание 00-пар нуклеотидов (Bernard1, 1989, lkemura et.al., 1990). Это R-Санды хромосом, где находится активно транскрибируемый хроматин и локализованы почти еса

- IS -

известные в настоящее время гены. По-видимому, изученные нами последовательности относятся к участгам преимущественного.синтеза -ДНК.

Выявленные нами различия в содержании динуклеотидов CpG л СрТ были небольшими и в обеих сериях опытов (8 и 100 Гр) практически не отличались от среднего их содержания в геноме. Тем не менее, мы обращаем внимание на это обстоятельство, ибо некоторое увеличение содержания CpS (особенно после облучения в дозе 100 Гр) может свидетельствовать о структурных изменениях ДНК. Отсутствие корреляции между нуклеотИдным составом ДНК и содержанием динуклеотидов CpG и СрТ позволяет предположить, что клонированная низкомолекулярная ДНК является частью более крупных участков генома. Возможно, ата ДНК выделяется из клеток различного типа. Нельзя исключить и появление ее в результате распада таких клеток. В обоих случаях выделяющаяся ДНК может служить стимулятором для активации размножения радиочувствительных Тканей.

ВЫВОДЫ

1. В плазме крови белых крыс после облучения появляется низкомолекулярная ДНК. Спустя 5 ч после воздействия в дозах 8 и 20 Гр количество ее составляет соответственно 52±15 и 139129 нг/мл.

2. В диапазоне доз облучения до 20 Гр количество низкомолекулярной ДНК в плазме 1фови находится в линейной прямопропорцио-нальной зависимости от дозы облучения. Далее (при облучении вплоть до 100 Гр) эта зависимость принимает логарифмический вид. Выявленный показатель может быть использован в биодогимет-рических целях.

3. Низкомоле)сулярная фракция ДНК плазмы крови представлена дву-нитевыми молекуяами Линейной Форш длиной около 170 пар нуклео-тидов, чго соответствует раамэру нуклэосом. Концевые участки молекул являются однонитэвыми или сочетают в себе одно- и дву-нитевые участки.

4. Содержание коктлемчнтарнмх пар нуюгеотидов G/C в шюкомоле-кулярной ДКК иовшено (43%) по сравнению со средним содержанием их в гоном» (41%).

5. 3 клена низютолгкуларнпй ДНК плазмы крови содержат фрагмек-

ты повторяющихся LJNE-элементов. Обнаружение этих элементов может быть использовано для разработки специфического биоиндикаторного теста.

S. Исследуемая низкомолекулярная ДНК по распределению динуклеотидов и наличию сайтов рестриктаз Alul, EooRIJ и SauSöl сходна с ДНК генома. 14 из 26 изученных фрагментов имеют значительную (до 96%) степень гомологии известим последовательностям нукле-отидов в ДНК, содержащихся в банке EMBL.

7. Низкомолекулярная ДНК, выделенная из плазмы крови после облучения крыс в дозах 8 и 100 Гр, по своей структуре принципиально не отличается от геномной.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Владимиров В.Г., Белохвостов A.C., Шерлина С.е., Васильева И.Н., Воскресенский A.M. Содержание внеклеточной ДНК в крови облученных крыс //Бюлл.эксп. биол. и мед.- 1992.-Т. 113. М.2,-с.138-191.

2. Vladlmlrov V.G., Belokhvostov A.S., Sherllria S.S., Vasllyeva I.N., Voskresensky A.M. Extracellular DNA level In the blood of Irradiated rats //Int. J. Radlat. Biol.- 1992,- V.62.N.6,-p. 667-671.

3. Васильева K.H., Белохвостов A.C., Владимиров В.Г., Шерлина С.С., О структуре низкомолекулярной ДНК плазмы крови облученных крыс. //Радиационная биология. Радиоэкология.- 1993.- Т.33, вып. 2(5),- с.700-705.

4. Владимиров В.Г., Ттценко Л.И., Суркова Е.А., Васильева И.Н. Внеклеточная ДНК крови после облучения.// Радиационная биология. Радиоэкология.-1993.-Т.33, вып.З(б),- С.8Б4-860,

5. Белохвостов A.C., Шерлина С.С., Васильева И.Н. Анализ ДНК плазмы крови как тест ранней диагностики радиационных поражений.// Тен. докл. I Всесоюз. рвдиобиол. съезда.- М., 1989.-С.680-631.

6. Яелохвостов A.C., Васильева И.Н., Шерлина С.С., Воскресенский A.M. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики эффекта гамма-облучения.//Теэ.докл II Радиобиол. съезда (Киев).- Лущино, 1903,- 4.1. - С.98-99.

7. Владимиров В.Г., Тищенко Л.И., Суркова Е.А., Васильева И.Н. О низкомолекулярной ДНК в плазме крови облученных животных.// Тез. до»! 11 Радиобиол. съезда (Киев).- Душило, 199?..-Ч. 1.-

С. 106-187.

6. Васильева H.H., Белохвостое A.C., Владимиров В.Г. Особенности структуры низкомолекулярной ДНК плазмы крови облученных крыс.//Современные достижения медицинской радиологии: Тез.докл. науч.конф., поев. 75-л. основания ин-Та. - С. -Ш., 199-3. -С. 263-266.

9. Тшценко Л.И., Владимиров В.Г., Васильева И.Н. Роль Ca/Mg эн-донуклеавы хроматина в образовании внеклеточной ДНК крови.// Структура и функции клеточного ядра: Тез. докл. XI симпоз. -Цитология. 1993.-Т.35. N.10.-С.96.

10. Васильева И.Н., Белохвоотов A.C., Владимиров В.Г. Исследований структуры низкомолекулярной ДНК плазмы крови облученных крыс //Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава Вооруженных сил: Тез. докл. юбилейной конф., поев. 2б-л. основания НИИ ВМ.*- О.-Пб., 1994.-С.18-19.