Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование изменчивости ДНК периферической крови людей, подвергшихся радиационному воздействию

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование изменчивости ДНК периферической крови людей, подвергшихся радиационному воздействию"

На правах рукописи

Митрошина Ирина Юрьевна

Исследование изменчивости ДНК периферической крови шодей, подвергшихся радиационному воздействию

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.01.02 - биофизика

25 СЛН 2014

005552811

Пущино 2014 г.

005552811

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Безлепкин Владимир Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Гапеев Андрей Брониславович (г.н.с ФГБУН ИБК РАН)

доктор биологических наук Исмаилов Анвар Джураевич (в.н.с. МГУ имени М.В. Ломоносова)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение Медико-генетический паучпый центр Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится « ^ » йСТО^цр 2014 года в /'6 ч мин, на заседании секции совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290 Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290 Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3.

Автореферат разослан « $ » ^^¿¿Ыкр 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат физико-математических наук Панина Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ионизирующая радиация является неотъемлемым компонентом окружающей среды, однако при увеличении интенсивности превращается в негативный фактор воздействия на здоровье и благополучие человека. В настоящее время пагубность воздействия радиации не требует дополнительных доказательств в связи с активным изучением последствий атомных бомбардировок, аварийных ситуаций на АЭС и широким распространением радиоактивных элементов в окружающей среде. Эффекты острого воздействия больших доз радиации на организм человека и биоты выявлены и изучены достаточно хорошо. Однако биологическое воздействие малых доз ионизирующего излучения на живые организмы до сих пор изучено недостаточно. Нерешенным вопросом остается влияние хронического облучения в малых дозах, поскольку его эффекты нивелируются адаптацией организма с вовлечением комплекса процессов, реализующихся на клеточном, тканевом и организменном уровнях. Эффекты воздействия могут проявляться спустя годы после непосредственного контакта с источником излучения (Аклеев, 2009). Существуют способы количественной оценки повреждений, вызванных средними и большими дозами ионизирующей радиации. Они основаны на обнаружении мутаций в поврежденных радиацией областях ДНК, кодирующих белки. Такой подход имеет множество ограничений, связанных с поиском мест локализации генетических повреждений, невозможностью их обнаружения через длительные периоды времени. Эти ограничения можно преодолеть, расширяя число анализируемых мест в геноме. Для этого используют выявление полиморфизма микросателлитных локусов, известных своей вариабельностью и широким распространением в некодирующих областях ДНК человека. Неповторимость каждого генома обусловливает возможность формирования индивидуального ответа каждого человека, подверженного воздействию генотоксических факторов.

Использование новых подходов, в частности поиск мутаций не только ядерной, но и менее защищенной митохондриальной ДНК (Газиев, Шайхаев 2007), дает надежду на их практическое применение в медицинских целях в будущем, в том числе для мониторинга злокачественных новообразований, что является одной из важнейших задач современной медицины.

Все это создает предпосылки для дальнейшего исследования эффектов хронического облучения в малых дозах на организм человека.

Целью работы является исследование изменчивости ядерной и митохондриальной ДНК в периферической крови людей, подвергшихся хроническому воздействию ионизирующего излучения.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

• определение уровня изменчивости микросателлитных повторов в препаратах ДНК периферической крови мужчин-работников производственного объединения «Маяк» (г. Озерск), подверженных воздействию ионизирующей радиации в течение длительного периода профессиональной деятельности;

• определение уровня изменчивости микросателлитных повторов в препаратах ДНК периферической крови онкологических пациентов в процессе радиационной и химиотерапии;

• определение уровня изменчивости микросателлитных тринуклеотидных (CTG)n повторов в З'-нетранслируемой области гена миотонической протеинкиназы человека в препаратах ДНК периферической крови онкологических пациентов в процессе радиационной и химиотерапии;

• определение уровня внеклеточной митохондриальной ДНК с мутациями в составе общей циркулирующей ДНК плазмы крови больных раком легких, прошедших курс радиотерапии;

• определение изменения соотношения числа копий митохондриального и ядерного генов в плазме крови больных раком легких, прошедших курс радиотерапии.

Научная новизна.

1) Показана возможность использования метода ПЦР с мультилокусным праймером для анализа микросателлитной нестабильности генома человека в условиях воздействия генотоксических факторов in vivo.

2) Выявлена нестабильность микросателлитных (CTG)n повторов в З'-нетранслируемой области гена миотонической протеинкиназы человека у онкологических пациентов.

3) Показана возможность выявления мутаций во внеклеточной митохондриальной ДНК плазмы крови онкологических пациентов, прошедших курс радиационной терапии, с использованием ферментативного метода,

основанного на расщеплении СЕЬ-1 эндонуклеазой участков ДНК с неспаренными основаниями.

4) Выявлены индивидуальные изменения динамики ядерной и митохондриальной ДНК в плазме крови онкологических пациентов в процессе лечения.

Научно-практическая значимость. Выполнены исследования изменчивости молекулярно-генетических маркеров в группах пациентов онкологической клиники, у здоровых лиц, подвергшихся пролонгированному воздействию ионизирующей радиации, а также у здоровых людей, не имевших контактов с генотоксическими факторами. Стандартизация клинического материала по ряду важных параметров (характер производственной деятельности, сходство патологии, схем лечения) позволила выявить и исследовать индивидуальные ответы в гетерогенных группах людей.

Показана возможность выявления с помощью исследуемых молекулярных маркеров индивидуальной реакции пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями, на проводимые им курсы радиационной и химиотерапии. Маркеры, очевидно, могут служить сигнальными молекулами для мониторинга злокачественных новообразований.

Исследование малых доз ионизирующего излучения, хронически воздействующего на организм человека, актуально с точки зрения оценки вреда здоровью людей, проживающих в неблагополучных регионах с повышенным радиоактивным фоном, а также для оценки генетических рисков, связанных с производственной деятельностью на предприятиях атомной энергетики. Предварительные данные позволяют приблизиться к практической оценке хронического воздействия на организм человека малых доз ионизирующей радиации.

Апробация диссертации и публикации. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК, 13 - в тезисах научных конференций. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: 10 - 17 Путинская школа - конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино 2006 - 2013 г), II Международный молодежный медицинский конгресс (Санкт-Петербург 2007г), «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение

среды» (Сыктывкар 2009г), VI Съезд по радиационным исследованиям (Москва 20 Юг), 7th International Meeting on the Effect of Low Doses of Radiation in Biological Systems LOWRAD (Portugal 2008), 38th Annual Meeting of the European Radiation Research Society (Sweden 2010), 39th Annual Meeting of the European Radiation Research Society (Italy 2012).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, основных выводов работы, заключения и списка литературы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 5 рисунков, 20 таблиц. Список литературы включает 155 ссылок, из них 100 на английском языке.

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ

Исследования выполнены на следующих препаратах: 1. ДНК периферической крови 115 мужчин-работников производственного объединения «Маяк» (г. Озерск), полученных из Радиобиологического Репозитория Тканей Человека Южно-уральского института биофизики ФМБА. Контроль - 45 работников «Маяка», не имевших профессиональных контактов с источниками ионизирующей радиации. 2. ДНК периферической крови 19 онкологических пациентов Российского научного центра Рентгенорадиологии Росмедтехнологий (РНЦРР) (г. Москва), страдающих раком молочной железы и раком легких. Контроль - препараты ДНК периферической крови 16 условно здоровых доноров, проходивших плановую диспансеризацию в Больнице ПНЦ РАН (г. Пущино).

Выделение ДНК. Получение препаратов тотальной ДНК из периферической крови и плазмы крови проводилось по стандартной методике фенольно-хлороформенной экстракции (Gupta et al., 1994).

Определение уровня изменчивости микросателлитных повторов в некодирующих областях генома была выполнена на препаратах ДНК периферической крови работников производственного объединения «Маяк» (ПО «Маяк»), а также из периферической крови онкологических пациентов, страдающих раком молочной железы, с помощью технологии ПЦР с мультилокусным праймером (AP-PCR). Для анализа полиморфизма были использованы 2 праймера (НПК СИНТОЛ, Москва). Праймеры: Telo - 5'-(TTAGGG)j-3'; Мог+1 - 5'-AAAGGCGAGGACTTTGTCAA-3'. Условия ПЦР:

94°С 1 мин; №С 1 мин, 72°С 5 мин. 35 циклов, где N - температура отжига праймеров (48°С и 42°С соответственно) (Uitteründen, Vijg 1994, Santos et al. 1995). Продукты амплификации разделяли посредством 6% полиакриламидного гель - электрофореза в 1х трис-ацетатном буфере (Williams at al., 1990).

Гели окрашивали в растворе азотнокислого серебра (AgN03) (Caetano-Annoles, Gresshoff 1994) и высушивали. Фиксированные с применением системы Док - принт Vilber Lourmat Systems Inc (Франция) изображения гелей оцифровывали и проводили их анализ с помощью специально разработанного программного обеспечения (Скосырев, Васильева 2013). Электрофоретическая подвижность Rf и размер каждого фрагмента оценивались по его положению в ДНК-паттерне (на дорожке геля) относительно коммерческих стандартов молекулярной массы.

Исследуемые параметры: Уровень полиморфизма (А)

А = (Ыпм / No6u0 X 100 %, где NnM - количество полиморфных фрагментов на дорожке геля, No6i4 - общее количество фрагментов на дорожке геля.

Определение уровня изменчивости микросателлитных тринуклеотидных (CTG)n повторов была выполнена на препаратах ДНК периферической крови 8 пациентов, страдающих раком молочной железы, и 7 пациентов, страдающих раком легких. Был использован метод локус-специфической ПЦР для богатой (CTG)n - повторами З'-нетранслируемой области гена миотонинпротеинкиназы человека (DMPK). Используемые праймеры: 102 - 5'-GAA CGG GGC TCG AAG GGT ССТ TGT AGC-3'. 101 - 5'-СТТ ССС AGG ССТ GCA GTT TGC CAA ТС-3' (НПК СИНТОЛ, Москва). Условия ПЦР: 94°С 10 с, 62°С 30 с, 72°С 30 с. 35 циклов (Brook et al. 1992). Далее применялась технология электрофореза в 6% полиакриламидном геле и окраски азотнокислым серебром.

Для определения уровня внеклеточной митохондриальной ДНК с мутациями использовался метод, основанный на высокоспецифичном расщеплении эндонуклеазой CEL-I участков ДНК с неспаренными азотистыми основаниями (Tsuji, Niida, 2008). Исследуемые препараты - ДНК плазмы периферической крови 8 пациентов, страдающих раком легких. Была проведена ПЦР-амплификация участка митохондриальной ДНК 2066 пар нуклеотидов (в

позиции 4155-6220) в составе общей циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы.

Праймеры: SC-C for (5'-САА СТС ATA САС CTС СТА TGA-3') и SC-C rev (5'-AGG ТАА GAG ТСА GAA GCT TAT G-3') (НПК СИНТОЛ, Москва). Условия ПЦР: 94°С, 12 мин. 94°С 1 мин, 58°С, 1 мин, 72°С 1.5 мин. 72°С 8 мин. 35 циклов (Taylor at al., 2001).

Для получения гетеродуплексов смешивали равные объемы ПЦР-ампликонов внеклеточной митохондриальной ДНК плазмы пациента (до и после лучевой терапии) и донора молодого возраста («молодой донор»). Условно принято, что ДНК «молодого донора» не содержит мутаций (Qiu, Shandilya, 2004). Далее к раствору гетеродуплексов добавляли 2.5 единицы активности CEL-I эндонуклеазы и инкубировали при 40°С в течение 60 мин. Полученные продукты разделяли с помощью 1% агарозного гель-электрофореза в ЮОмМ Tris-HCl буфере (pH 8.0) и окрашивали с помощью бромистого этидия (EtBr). В качестве маркера использовали MassRuler Express DNA Ladder Mix, 100 - 10000 (Fermentas). Интенсивность флуоресценции полос ДНК на электрофореграммах регистрировалась с помощью гель-документирующей системы (Alpha Imager, Alpha Innotech).

Процент расщепления гетеродуплексов вычисляли как долю суммарной флуоресценции полос, отщепившихся в результате действия CEL-I эндонуклеазы, по отношению к интегральной интенсивности полос ДНК на гелях.

Определение изменения соотношения числа копий митохондриальиого и ядерного генов было выполнено на препаратах ДНК периферической крови 9 пациентов, страдающих раком легких, с применением ПЦР в режиме реального времени (GeneAmp PCR system 7500, Applied Biosystems). Количество копий митохондриальной ДНК (по гену ND1) сопоставлялось с количеством копий ядерной ДНК (по гену АСТВ) в образцах плазмы онкологических пациентов, страдающих раком легких, до и после проведения курсов радиотерапии. Оценивался параметр Ct - (Cycle threshold) - значение цикла реакции амплификации, соответствующее началу образования соответствующего продукта амплификации. Значение параметра обратно пропорционально количеству копий исследуемого фрагмента ДНК.

Праймеры (Bogacka at al., 2005, Salani at al., 2007): ND1 for 5'-CCC TAA AAC CCG CCA CAT CT-3\ ND1 rev 5'-GAG CGA TGG TGA GAG СТА AGG T-3'. ACTB for 5'-GCA CCA CAC CTT СТА CAA TGA-3', ACTB rev 5'-GTC АТС TTC TCG CGG TTG GC-3' (НПК СИНТОЛ, Москва). Условия ПЦР: 50°C 2 мин, 95°C 10 мин, 95°C 15 с. 60°C 1 мин. 40 циклов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Определение уровня изменчивости микросателлитных повторов в некодирующих областях генома. Для оценки вариабельности повторяющихся последовательностей ДНК использовали 2 «мультилокусных» праймера. Сайты связывания этих праймеров распределены по геному человека случайным образом, а полиморфизм в них выражается как наличие или отсутствие соответствующих продуктов ПЦР на электрофореграмме (Williams et al. 1993) (рисунок 1). Полный спектр таких продуктов для каждого ДНК-паттерна

называют «анонимным генетическим маркером» (Welsh et al. 1995). Изменение спектра является следствием перестроек генома типа амплификаций, инсерции, делеции в местах посадки или отжига праймеров. Оценка изменения размеров продуктов ПЦР на основе анализа их сдвига является основой для вывода о возникновении полиморфизма.

Определение уровня изменчивости микросателлитных повторов в отдаленные сроки после облучения осуществлялось в ДНК периферической крови 80 мужчин-работников ПО «Маяк», подвергавшихся в период

профессиональной деятельности внешнему фракционированному воздействию гамма-радиации. Забор крови производился через 18-27 лет после окончания работы с источником ионизирующей радиации. В контрольной группе были использованы препараты ДНК из периферической крови работников «Маяка», не имевших профессиональных контактов с источниками ионизирующего излучения. Суммарная дозовая

Рисунок 1.

Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР с использованием в качестве матрицы препаратов ДНК 2 здоровых доноров. Буквами обозначены типы обнаруживаемых фрагментов: а -мономорфные, б -полиморфные.

нагрузка (СДН) за период профессиональной деятельности составила от 0,01 до 5,5 Гр. Учитывая тот факт, что скорость накопления дозы по времени была неравномерной, было предложено разделить исследуемую группу на 5 подгрупп по суммарной дозовой нагрузке.

В таблице 1 представлены значения доли полиморфных полос в спектрах

продуктов ПЦР, полученных при электрофоретическом разделении амплифицированных фрагментов ДНК из клеток периферической крови работников ПО «Маяк» подвергшихся и не подвергшихся («контроль») пролонгированному воздействию ионизирующей радиации.

Не было выявлено дозовой зависимости в исследуемом диапазоне доз, однако уровень полиморфизма работников по всем диапазонам суммарной дозовой нагрузки статистически достоверно превышал таковой в контрольной группе. Отсутствие линейной зависимости эффекта от накопленной дозы не позволяет использовать анализируемый параметр для ретроспективной оценки суммарной дозовой нагрузки. Выявлена тенденция к понижению уровня исследуемого признака при возрастании дозовой нагрузки до диапазона 1.1-2 Гр с дальнейшим его увеличением для праймера Мог+1 и увеличением с последующим снижением для праймера Telo. Отсутствие линейной зависимости обусловлено выявлением эффектов in vivo, на которые в разной степени накладывают отпечаток такие модифицирующие факторы, как радиочувствительность, репарационные процессы, адаптивный ответ и т.д. С одной стороны, происходит адаптация -отбор и размножение клеток с более резистентным генотипом. Это приводит к снижению радиочувствительности, что может выражаться в снижении уровня полиморфизма в дозовом диапазоне 1,1 - 2 Гр. Данное предположение подтверждается в работах многих исследователей, в которых дозовый диапазон

Таблица 1. Оценка уровня полиморфизма (А) ДНК периферической крови работников ПО «Маяк»_ .

Диапазоны СДН,Гр А(%) п

Мог+1 Telo

«контроль» 65.6±0.9 90.6±0.3 45

0.01-0.5 81.5*±0.8 94.3*±0.2 9

0.51-1 77.6*±0.7 92.4*±0.2 17

1.1 -2 70.2*±1.0 91.9*±0.2 17

2.1-3 78.8*±0.3 94.0*±0.3 17

3.1 -5 84.1*±0.6 92.6*±0.1 12

Примечание: * - достоверные отличия от контроля при р < 0,05 по критерию Стьюдента.

1-3 Гр характеризуется понижением значений исследуемого признака в ответ на хроническое воздействие ионизирующей радиации (Little 2010, Doss 2013). С другой стороны возникает генетическая нестабильность, приводящая к возрастанию частоты генетических нарушений, что объясняет повышенный уровень полиморфизма во всех дозовых диапазонах по сравнению с контролем.

Т.о. можно сделать вывод о повышении уровня генетической изменчивости в изучаемой группе. Длительный период между окончанием работы с источником ионизирующей радиации и моментом взятия образцов крови, составляющий 18-27 лет, позволяет предположить, что в кроветворных клетках человека при хроническом облучении формируется и длительно (вероятно, пожизненно) сохраняется состояние радиационно-индуцированной нестабильности генома.

Определение уровня изменчивости микросателлитных повторов после воздействия курсов радиационной и химиотерапии осуществлялось в ДНК периферической крови 12 пациентов Российского научного центра Рентгенорадиологии (г. Москва) с гистологически подтвержденным диагнозом рак молочной железы. Курс лечения включал фракционированное плановое (по схемам, утвержденным МЗ РФ) введение в период от 6 до 12 месяцев цитостатиков и в нескольких случаях последующие сеансы радиационного воздействия.

На рисунке 2 представлено изменение уровня полиморфизма онкологических пациентов во время прохождения курсов радиохимиотерапии по поводу рака молочной железы. В группе из 12 пациентов, прошедших курс лечения, при сравнении с контрольной точкой до лечения были выявлены 3 типа реакций: увеличение, уменьшение уровня полиморфизма и отсутствие изменений в уровне полиморфизма после лечения.

Особенностью уровня полиморфизма как показателя нестабильности генома является двунаправленность данного признака, как в сторону повышения, так и в сторону понижения значений. Это связано со структурными изменениями, происходящими в молекулах ДНК. Повышение значения связано с появлением в местах посадки праймера амплификации и инсерций, тогда как понижение ассоциировано с делениями. Любое изменение является проявлением генетической нестабильности, тогда как отсутствие изменений должно быть выражено в отсутствии отличий от контрольного значения.

Mor+1

£~~ ......1 |.....-..........................................................

; Ш__Ш _, 1 .................................*........*........'*'"

1 Ш -

ГТ 1 Í 4 1

< « 7 .......!?..........9.........10........II........1.2.....

LZ______________J

i..........

........................................................................

i. ... i !.........................................................................

Номер пациент«

Telo

..................................................................................................-—...........-

f

" i J п .n fl zz::«zz::z: .......4.........S.........$.........?.........9.........!>........W.......ti......

t .................1 1 ----------------------------—----------- )

-i... .......................................................................................................................................... ................................................................--..............................-

Hmicp iwiiicin '■<

При индивидуальной оценке в качестве контрольного было использовано значение уровня полиморфизма до проведения лечения. Оно обусловлено состоянием организма больного на момент взятия анализа и характеризует его в соответствии со степенью развития заболевания. Генотоксическое воздействие в виде лечебных курсов

радиохимиотерапии приводит к сдвигу уровня полиморфизма, фиксируемому в ДНК

периферической крови пациента после прохождении лечения.

При анализе результатов, полученных с применением

Примечание: * - сравнение не проводилось. Изменение уровня полиморфизма (ДА) показано как разница показателей полиморфизма до и праймера Мог+1, в группе из 9 после лечения у каждого пациента. пациентов повышение уровня

Рисунок 2. Индивидуальная динамика полиморфизма было выявлено у 5,

уровня полиморфизма ДНК понижение - у 3, отсутствие

онкологических пациентов по двум изменений _ у j пациента.

молекулярно-генетическим маркерам. „

При анализе результатов,

полученных с применением праймера Telo, в группе из 8 пациентов повышение

уровня полиморфизма было выявлено у 4, понижение - у 3, отсутствие

изменений - у 1 пациента.

В соответствии с критерием знаков (р=0.05) полученная в ходе

эксперимента индивидуальная изменчивость уровня полиморфизма является

значимым показателем для выявления воздействия генотоксикантов на

организм пациента для обоих исследуемых молекулярных маркеров.

Отдаленные последствия в виде метастазирования первичной опухоли были

обнаружены у пациентов № 1, 5, рецидив заболевания - у пациента №6. Для

этих пациентов изменение уровня полиморфизма по одному из маркеров

наиболее выражено. Однако для пациентов № 3, 7, также имеющих высокую разницу в уровнях полиморфизма, отдаленных последствий обнаружено не было. Можно предположить, что данная реакция организма пациента является отражением его индивидуальных свойств в поддержании нормального функционирования систем репарации, восстанавливающих поврежденные участки ДНК.

Т.о. терапевтические курсы радиохимиотерапии индуцируют повышение нестабильности генома в ДНК периферической крови лиц, проходивших лечение по случаю рака молочной железы. Значение, а также направленность изменения уровня полиморфизма после прохождения лечения может стать прогностическим показателем возникновения отдаленных последствий лечения.

Определение уровня изменчивости микросателлитных тринуклеотидных (CTG)n повторов. Тринуклеотидные тандемные последовательности (CTG)n расположены в З'-UTR (нетранслируемой) области гена миотонической дистрофии (myotonic distrophy protein kinase) на 19 хромосоме человека. Известно, что данная область богата CTG-повторами, которые в норме образуют регионы в 40 - 50 триплетных повторов. Полагают, что под воздействием внешних и внутренних факторов происходит увеличение числа повторов до нескольких сотен и тысяч пар оснований (Zerylnick et al. 1995, Сиянова, Миркин 2001). Мы предположили, что анализ увеличения количества тринуклеотидных тандемно расположенных повторов в 3'-нетранслируемой области гена миотонической дистрофии человека может быть информативным генетическим параметром для оценки индуцированной нестабильности генома.

В ходе эксперимента было выявлено, что в ДНК периферической крови контрольных доноров Основанная масса продуктов амплификации (CTG)n повторов представлена фрагментами с размером 150 пар нуклеотидов (данные не показаны), что соответствует литературным данным (Yamagata et al. 1998). В таблице 2 представлены результаты определения количества тринуклеотидных повторов в группе онкологических пациентов, страдающих раком легких.

У 4 из 7 пациентов обнаружены высокие уровни тринуклеотидных повторов до проведения радиотерапии. Выявляемое повышение количества

тринуклеотидных повторов по сравнению с показателями контрольной группы может быть обусловлено нарушением систем репарации и репликации ДНК, ассоциированным с возникновением и последующим развитием онкологического процесса (Хтапапоэ е1 а1. 2000, Неруш и соавт. 2005).

Таблица 2. Клинические показатели и динамика количества тринуклеотидных повторов (СТС)п в процессе радиационной терапии онкологических пациентов, страдающих раком легких.___^__

№ Состояние пациента до лечения Количество (СТОп, п.н. Стадия заболева ния* Период после лечения, мес. Клинический результат**

до лечения после 1к РТ

1 РЛ 0 750 Т2Ы2М, 51 прогрессирование опухоли: второй рак, метастазирование

2 был РМЖ, РЛ 650 750 Т2ЫоМо 17,6 умер от рака легких

3 РЛ 650 0 Т2Ы2М0 2 стабилизация опухоли

4 РЛ с метастазами 350 350 Т4Ы3М, 15 умер от рака легких

5 РЛ 0 0 ТзЫ.Мо 9 частичная регрессия опухоли

6 РЛ 0 750 Т4Ы2М0 26,4 умер от рака легких

7 РЛ 350 0 Т3Ы,М0 2 прогрессирование опухоли

Примечание: РМЖ - рак молочной железы, РЛ - рак легких, п.н. - пары нуклеотидов, 1к РТ - 1 курс радиационной терапии. * - в соответствии с Международной классификацией по системе ТЫМ от 1998 г. ** - в соответствии с критериями КЕОЗТ по рекомендации ВОЗ от 2000 г.

Наличие предшествующего онкологического заболевания (пациент № 2), либо метастазирование (пациент № 4) являются аргументами «за» нарушение генетических механизмов клеточной регуляции у данных пациентов. Для двух других пациентов подобной симптоматики выявлено не было.

Увеличение количества тринуклеотидных повторов после проведения 1

курса радиотерапии выявлено у 4 из 7 пациентов. Повышенные количества

тринуклеотидных повторов после проведения радиотерапии в 3 из 4 случаев

ассоциированы с летальным исходом от рака легких. Четвертый случай

(пациент №1) характеризуется появлением второго рака и его

14

метастазированием после проведения радиотерапии, что является негативным прогностическим показателем лечения.

Механизм увеличения количества тринуклеотидных (CTG)n повторов до конца не ясен. Существует несколько предположений, из которых наиболее убедительным выглядит нарушение механизма спаривания (slipping mispairing) родительской и дочерней цепей ДНК при последовательных раундах репликации с образованием устойчивой шпильки (Cooper, Krawczak 1990,

1991). Формирование неправильной шпилечной структуры на матричной ДНК приводит к увеличению длины повтора за счет формирования дополнительного фрагмента Оказаки, инициируемого в петле шпильки (Pistoni et al. 2010).

В исследуемых нами группах наблюдалось увеличение размера исследуемых блоков тринуклеотидных повторов «до лечения» вплоть до 750 пар нуклеотидов, обозначенное в литературе как «экспансия» (Brook et al.

1992).

Последующая динамика количества тринуклеотидных повторов связана с генотоксическим воздействием лечебных процедур. Фракционированность воздействия приводит к постоянной дестабилизации метаболических процессов, как в опухолевых, так и в нормальных тканях. Активность репарационных систем обусловлена энергетическими возможностями клеток, что в свою очередь является индивидуальной характеристикой каждого организма. По увеличению количества тринуклеотидных повторов можно судить о сохранении нарушений в процессах клеточной регуляции, тогда как снижение или сохранение на том же уровне характеризует стабилизацию процесса.

При исследовании микросателлитной нестабильности тринуклеотидных повторов в группе из 8 пациентов с раком молочной железы была обнаружена сходная тенденция в динамике (CTG)n в ходе лечения (данные не представлены). Однако отсутствие клинических данных о состоянии здоровья этих пациентов позволяет делать выводы только об индивидуальности ответа каждого из пациентов на проводимое лечение.

Т.о. при исследовании микросателлитной нестабильности в группе из 15 онкологических пациентов, страдающих раком молочной железы и раком легких, не было выявлено четкой зависимости количества тринуклеотидных (CTG)n повторов от увеличения курса лечения. Однако у 7 пациентов (47%)

наблюдалась тенденция к их увеличению после лечения, у 5 пациентов (33%) изменений не обнаружено, у 3 пациентов (20%) наблюдалось снижение количества тринуклеотидных повторов после лечения. Выявлена микросателлитная нестабильность тринуклеотидных (CTG)n повторов в ДНК периферической крови онкологических пациентов, как до проведения лечения, так и после его окончания. Предполагается, что динамика данного маркера может служить основой оценки индивидуальной реакции организма пациента, страдающего онкологическим заболеванием, на проводимое лечение.

На данном этапе исследований требуется увеличение количества клинического материала для выявления четкой корреляции между сохранением повышенных количеств тринуклеотидных повторов после проведения 1 курса радиотерапии и летальным исходом от онкологической патологии.

Определение уровня внеклеточной митохондриальной ДНК с мутациями. Митохондриальная ДНК до недавнего времени представляла малый интерес в качестве маркера радиационного воздействия. Однако новые данные о повышенной повреждаемости ее структуры по сравнению с ядерной ДНК, а также компенсаторная амплификация митохондриальной ДНК при энергетическом дефиците характеризуют ее как чувствительный маркер оценки генотоксических эффектов (Газиев, Шайхаев 2007). В процессе радиационной терапии опухолей можно ожидать больше изменений как в количественном содержании циркулирующей внеклеточной митохондриальной ДНК, так и частоте мутаций в ней по сравнению с ядерной ДНК плазмы крови пациентов. Среди множества методов, используемых для скрининга неизвестных мутаций, для определения мутаций митохондриальной ДНК была выбрана технология анализа ДНК с использованием CEL-I эндонуклеазы. Этот фермент специфически расщепляет фрагменты ДНК, содержащие в своей структуре неспаренные азотистые основания.

Количественная регистрация флуоресценции отдельных полос по отношению к интегральной интенсивности полос ДНК на дорожках электрофореграммы позволила определить долю продуктов амплификации, отщепившихся в результате действия CEL-I эндонуклеазы (рисунок 3). Количественные оценки показали 2-кратное повышение процента расщепления гетеродуплексов после проведения радиотерапии по сравнению с данными, полученными у этих же пациентов до лечения.

14.0 12.0 8 « 10,0 8,0 6.0

г | I

4,0 2,0 0.0

, т

- •

—I—

долечегам после лечения

момент лечения

Примечание: значения представлены в виде средних по группе из 8 пациентов и стандартных отклонений.

Рисунок 3. Проценты расщепления гетеродуплексов до и после проведения 1 курса лучевой терапии в группе онкологических пациентов РНЦРР, страдающих раком легких.

Повышение гетеродуплексного расщепления после проведения лечения служит доказательством локализации мутаций на амплифицируемом участке

митохондриальной ДНК.

Источником мутаций является поступление в кровоток

повышенного количества

мутантных копий внеклеточной митохондриальной ДНК из поврежденных радиотерапией

клеток опухоли.

Результаты экспериментов

позволяют полагать, что ионизирующее излучение (курсы

радиотерапии) приводит к повышению доли мутантных копий внеклеточной митохондриальной ДНК в составе общей циркулирующей ДНК плазмы крови пациентов, страдающих раком легких.

Определение изменения соотношения числа копий митохондриального и ядерного генов осуществлялось в группе из 9 онкологических пациентов, страдающих раком легких, до и после проведения курса радиотерапии. Стандартная схема при проведении лечения злокачественных новообразований легких включает воздействие пучка ионизирующего излучения (3 Гр за сеанс) в локальной области грудной клетки. Суммарная доза, в зависимости от стадии заболевания, может достигать 60 Гр (Ильин и соавт. 2011) и более. Однако индивидуальные особенности каждого пациента (пол, возраст, образ жизни) не позволяют разработать универсальную систему лечения. Идентичные схемы лечения при сходном диагнозе могут приводить к появлению «побочных» эффектов РТ у отдельных пациентов. Поэтому возникает необходимость персонифицировать процесс лечения, используя для этого молекулярно-генетические маркеры, расширяющие возможности диагностики онкопатологии легких, а также способствующие разработке более точных прогностических критериев.

В работе было проведено сравнительное исследование динамики двух молекулярных маркеров: числа копий митохондриального и ядерного генов, источником которых послужила свободная ДНК плазмы крови, с применением техники ПЦР в реальном времени.

Рабочая гипотеза состояла из следующих предположений:

1. Повышение содержания ядерной ДНК в плазме крови как до лечения, так и после отражает общее повреждение клеток (опухолевых и здоровых).

2. Повышение содержания митохондриальной ДНК в плазме крови после радиотерапии отражает компенсаторное увеличение количества митохондриальной ДНК в митохондриях. Поврежденные действием ионизирующей радиации фрагменты молекул митохондриальной ДНК могут удаляться в межклеточное пространство и затем в кровоток. При этом не происходит нарушения функции митохондрии и клетки в целом (Газиев, Шайхаев 2007).

На рисунке 4 показана индивидуальная динамика уровня О в ходе лечения. Показано как снижение, так и увеличение уровня исследуемых маркеров. Предполагается, что до начала лечебных курсов наличие нуклеиновых кислот в плазме крови отражает спонтанный уровень выделения их из тканей и характеризует состояние пациента на момент взятия анализа.

Особенностью хронического

воздействия ионизирующей радиации (режим воздействия 3 Гр ежедневно, 1

яДНК

1.4 1,2 1

0.8 0.6 0,4 0.2 0

...И...

.....9.....

номер пациента

мтДНК

1,8 : 1.6

1,4 7 '

1.2 4"

0,8 4-1

0,6 4.....

0.4 1

0,2 4-О 1

...И..

,, п,п;

3---4'..... 5

б----7

т

номер пациента

Примечание: показатели рассчитаны . 2 месяца до накопления суммарной как отношение О до и О после

проведения терапии для пациента

каждого

Рисунок 4. Индивидуальное изменение копийности ядерной и митохондриальной ДНК после проведения 1 курса радиотерапии.

дозы, определяемой радиологом, максимальное значение 60 Гр) является длительность воздействия, при котором эффекты повреждения клеточных структур с одной стороны и

адаптивные процессы с другой стороны протекают параллельно.

Соотношение процессов повреждения и адаптации в динамике хронического облучения в итоге определяют интегральный ответ ткани на радиационное воздействие (Аклеев 2009).

По динамике исследуемых молекулярно-генетических маркеров относительно момента «до лечения» выявлены несколько индивидуальных типов реакций организма пациента на проводимое лечение (таблица 3). В группе из 9 пациентов, наблюдается 5 различных сочетаний динамики

молекулярных маркеров. Изучение исследуемой выборки не позволило в полной мере выявить все возможные сочетания

динамики молекулярных маркеров, либо

преобладание какой-либо из них. Полученные

соотношения не

ассоциированы с

эффективностью терапии, оцениваемой с помощью традиционных способов по критериям ЛЕОвТ. Разнородность полученных результатов определяется индивидуальностью каждого организма, в частности индивидуальной способностью репарационных систем и иммунного ответа организма пациента компенсировать повреждающее действие радиации. В связи с этим необходимо существенное увеличение клинического материала для выявления закономерностей динамики исследуемых молекулярно-генетических маркеров и их связи с эффективностью терапии. Динамика исследуемых в данной работе молекулярных маркеров показывает индивидуальный ответ пациента на проводимое лечение, что в дальнейшем может послужить основой персонификации процесса лечения.

Таблица 3. Индивидуальное сочетание исследуемых молекулярных маркеров_

№ пациента Уровень яДНК Уровень мтДНК Эффективность терапии*

1,8 - - СЯ, БТ

2,3 0 + РЯ, БТ

4,5 + + БТ, БТ

6,7 - + РЯ, РЯ

9 + - БТ

Примечание: яДНК - ядерная ДНК, мтДНК -митохондриальная ДНК. «+»-увеличение уровня ДНК. «-»-снижение уровня ДНК. «0»-уровень ДНК не изменялся. СЯ-полная регрессия, РЯ-частичная регрессия, вТ-стабилизация. *-критерии ЯЕС18Т по рекомендации ВОЗ от 2000г.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные результаты диссертации позволяют полагать, что предложенные в работе молекулярно-генетические маркеры могут быть информативным средством выявления повышенного риска у лиц, имевших контакты с ионизирующим излучением. Кроме того, эти маркеры следует рассматривать в качестве основы для разработки вспомогательных диагностических средств при мониторинге лечения онкопатологии, а также при прогнозировании отдаленных последствий воздействия ионизирующей радиации, в том числе рецидивов заболевания и возникновения нестабильности генома.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена нестабильность микросателлитных повторов в геноме работников ПО «Маяк», подвергшихся фракционированному воздействию гамма-радиации в период производственной деятельности, а также у онкологических пациентов, прошедших курс радиохимиотерапии. Это свидетельствует о развитии радиационно-индуцированной нестабильности генома в соматических клетках человека в условиях фракционированного радиационного воздействия.

2. Выявлена нестабильность микросателлитных (СГО)п повторов в 3'-нетранслируемой области гена миотонической протеинкиназы у онкологических пациентов. Оценка динамики маркера может быть показателем индивидуальной реакции организма пациента на проводимое лечение.

3. Показано двукратное увеличение доли мутантных копий внеклеточной митохондриальной ДНК у больных раком легких после проведения 1 курса радиотерапии. Используемый метод может быть применен для выявления мутаций митохондриальной ДНК в составе общей циркулирующей ДНК плазмы крови после воздействия ионизирующего излучения.

4. Выявлено индивидуальное изменение соотношения числа копий митохондриального и ядерного генов в плазме крови больных раком легких после проведения 1 курса радиотерапии. В исследуемой выборке данный параметр не может быть использован в качестве показателя эффективности проводимой радиационной терапии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СТАТЬИ

1. Стрелкова И.Ю.,* Антипова В.Н., Богомазова А.Н., Гурова Е.И., Ломаева М.Г., Фоменко Л.А., Безлепкин В.Г. Нестабильность простых повторов ДНК периферической крови как генетический маркер последствий радиохимиотерапии по поводу рака молочной железы // Альманах клинической медицины. Том XVII, часть 1. 2008г. С. 278 - 281.

2. Стрелкова И.Ю.,* Ломаева М.Г., Антипова В.Н., Богомазова А.Н., Гурова Е.И., Фоменко Л.А., Безлепкин В.Г. Молекулярно-генетические маркеры ДНК периферической крови как возможный фактор оптимизации назначений курсов радиохимиотерапии по поводу рака молочной железы // Астраханский медицинский журнал. №3. 2008г. С. 194 - 197.

3. И.Ю. Стрелкова,* С.А. Абдуллаев, Г.П. Снигирева, В.Г. Безлепкин, А.И. Газиев Доля мутантной внеклеточной митохондриальной ДНК повышается у больных раком легких после радиотерапии // Биомедицинская химия. Том 56, вып.4. 2010г. С. 517 - 525.

4. М.Л. Захарова, В.Г. Безлепкин, E.H. Кириллова, А.И. Газиев, Ю.В. Дроздова, Т.И. Урядницкая, И.Ю. Стрелкова*, С.Н. Соколова Генетический материал радиобиологического репозитория тканей человека и некоторые результаты его исследования // Медицинская радиология и радиационная безопасность. Том 55, №5.2010г. С. 5 -13.

5. М.Г. Ломаева, Л.В. Малахова, М.Л. Захарова, С.Н. Соколова, Л.А. Фоменко, В.Н. Антипова, И.Ю. Соболева*, В.Г. Безлепкин, E.H. Кириллова, А.И Газиев Вариабельность простых нуклеотидных повторов в ДНК клеток периферической крови мужчин, подвергшихся пролонгированному воздействию ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. Т. 53, № 1. 2013. С. 25-32.

ТЕЗИСЫ И ТРУДЫ КОНФЕРЕНЦИЙ

1. Стрелкова И.Ю.*, Поздяева И.Ю., Ежова A.B., Антипова В.Н., Ломаева М.Г. Повышенная вариабельность простых повторов ДНК периферической крови людей как генетический маркер ранних и отдаленных последствий радиационного воздействия. 11-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века». 2007г. С. 278.

2. Стрелкова И.Ю.,* Щербатенко А.В., Новикова Е.И., Антипова В.Н. Анализ изменений в геноме периферической крови больных, проходящих курс радиохимиотерапии по поводу РМЖ. II Международный молодежный медицинский конгресс. «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007». Санкт - Петербург, 2007г. С. 98.

3. I.Y. Strelkova*, E.I. Gurova, V.G. Bezlepkin Expansion of trinucleotide (CTG)n repeats in DNA of peripheral blood in breast cancer patients 7th International Meeting on the Effect of Low Doses of Radiation in Biological Systems LOWRAD 2008. Lisbon. P. 149.

4. Стрелкова И.Ю.,* Новикова Е.И., Снигирева Г.П., Безлепкин В.Г.. Полиморфизм простых повторов ДНК крови людей, подвергшихся сочетанному воздействию цитостатиков и фракционированного гамма-облучения в курсе терапии онкопатологии. Международная конференция «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды». Сыктывкар, 2009. С. 368 — 371.

5. Стрелкова И.Ю.,* Безлепкин В.Г. Сочетанное воздействие лечебных курсов радио- и химиотерапии приводит к повышению нестабильности генома пациентов с раком молочной железы. 13-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века». 2009г. С. 122.

6. Стрелкова И.Ю.,* Гурова Е.И., Кононова Е.А., Безлепкин В.Г. Влияние радиотерапии на состояние внеклеточной митохондриальной ДНК у больных раком легкого. 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века». Том 1. 2010г. С. 182.

7. Strelkova I.,* Bezlepkin V., Gaziev A. The use of CEL I endonuclease as a new method for detection of mutations. (Poster Presentation)// Abstracts of the 38th Annual Meeting of the European Radiation Research Society ERR2010. Stockholm, 2010. P. 149.

8. Стрелкова И.Ю.,* Фоменко JI.A., Снигирева Г.П., Безлепкин В.Г. Микросателлитная изменчивость и полиморфизм гена DMPK онкологических пациентов. VI Съезд по радиационным исследованиям. Том I. Москва, 2010г. С. 244.

9. Соболева И.Ю.,* Безлепкин В.Г. Оценка индивидуальной реакции организма пациентов, страдающих раком легких, на лучевую терапию//16-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология -наука21 века». 2012 г. С. 338.

10. Соболева И.Ю.,* Ильин М.А., Сирота Н.П., Безлепкин В.Г., Снигирева Г.П., Сотников В.М. Исследование внеклеточной митохондриальной и ядерной ДНК в плазме больных раком легких в процессе радиотерапии// Материалы международной конференции «Медико-биологические проблемы действия радиации». Москва, 2012. С. 85.

11. Соболева И.Ю.,* Безлепкин В.Г. Использование ДНК плазмы крови для диагностической оценки состояния здоровья пациентов с раком легких // Материалы VTI Международного симпозиума «Актуальные проблемы биофизической медицины». Киев, 2012. С. 131.

12. Soboleva I.,* Mitroshin I., Bezlepkin V. Molecular genetic markers for assessment of individual radiosensitivity of cancer patients//39th Annual Meeting of the European Radiation Research Society. Italy, 2012. P. 73.

*- Стрелкова И.Ю. - до 2011 г. Соболева И.Ю. - с 2011 по 2012 г. С 2013 г. -

Митрошина И.Ю.

Подписано в печать:

15.08.2014

Заказ № 10160 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru