Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы образования однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах крови человека при воздействии УФА-излучения

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы образования однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах крови человека при воздействии УФА-излучения"

005552306

На правах рукописи

СМЕТАНИНА Надежда Михайловна

МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ И ЩЕЛОЧНОЛАБИЛЬНЫХ САЙТОВ ДНК В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ УФА-ИЗЛУЧЕНИЯ

03.01.01- радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2014

11 СЕН 2Щ

005552306

Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна» ФМБА России

Научный руководитель:

Осипов Андреян Николаевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией радиационной биофизики ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России

Официальные оппоненты:

Сынзыныс Борис Иванович, доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры экологии Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ» (НИЯУ МИФИ) Обнинский институт атомной энергетики (ИАТЭ)

Снигирёва Галина Петровна, доктор биологических наук, руководитель лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики ФГБУ «Российский научный центр рентгенора-диологии» Минздрава РФ

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится «06» ноября 2014 г. в 15 час 00 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной Библиотеке МГУ по адресу: Ломоносовский проспект, 27. Отзывы просим присылать по адресу: Веселовой Т.В., Биологический факультет МГУ, Москва, 119991. Факс +7(495)939-11-15 (обязательно 2 экземпляра в бумажном варианте с подписью и печатью учреждения).

Автореферат разослан « Ц » е^и-ы^Ьи. 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.В. Веселова

Актуальность проблемы. Согласно современной международной классификации, УФ-излучение делится на три диапазона: коротковолновый (УФС, 200-280 нм), средневолновый (УФВ, 280-320 нм) и длинноволновый (УФА, 320-400 нм). УФС- и УФВ-фотоны поглощаются ДНК и индуцируют в основном такие повреждения, как циклобутан-пиримидиновые димеры (CPD) и пиримидин-(6-4)-пиримидон фотопродукты ((6-4)-PD) (Mitchell and Karentz, 1993; You et al, 2000; Friedberg et al, 2000; Yoon et al, 2000; Clingen et al, 1995). Однако весь спектр УФС- и ~ 90 % УФВ-излучения поглощается озоновым слоем и атмосферой земли. Длинноволновое УФА-излучение, 90 % которого достигает земной поверхности, почти не поглощается ДНК, но передаёт энергию различным хромофорам, таким как меланин, порфирины, хиноны, флавины и т.д., которые действуют как эндогенные фотосенсибилизаторы. В ходе фотоокислительных реакций II типа происходит образование активных форм кислорода (АФК), таких как синг-летный кислород, супероксид-анион-радикал, гидроксил-радикал и пероксид водорода (Cadet et al, 2009; Cadet and Douki, 2011; Swalwell et al, 2012). Эти реакции протекают одновременно, однако отношение скоростей этих реакций зависит от природы фотосенсибилизатора и субстрата (Dougherty et al, 1998).

Показано, что длительное воздействие УФА-излучения вызывает лизосомальную дисфункцию в фибробластах кожи человека (Lamore et al, 2013), онкотрансформацию в культивируемых кератиноцитах человека (Не et al, 2006) и развитие сарком кожи у «голых» мышей (de Laat et al, 1997). Неясна роль УФА-излучения в развитии меланом. Экспериментальные работы свидетельствуют о том, что УФА-излучение не индицирует ме-ланомы у модельных животных (Mitchell et al, 2010), тогда как эпидемиологические данные говорят о наличии положительной корреляции между количеством посещений солярия и частотой заболеваний меланомой у человека (Autier et al, 2011). УФА-излучение, а именно 340-400 нм (известное также как УФА1-излучение), используется для терапевтических процедур (Kerr et al, 2012) и в соляриях. На 365 нм приходится пик фототерапии УФА1 -излучением. При этом существуют данные о том, что 365 нм УФ-излучение может иметь даже больший канцерогенный эффект, чем УФВ-излучение (de Laat et al, 1997). Показано, что при этой длине волны наблюдается максимум увеличения частоты заболеваний меланомой (Setlow et al, 1993).

Большинство работ по изучению биологического действия УФА-излучения выполняется на клетках базалыюго слоя кожи. При воздействии УФА-излучения происходит облучение клеток периферической крови, в том числе и лимфоцитов, поскольку дерма богата капиллярами. Лимфоциты периферической крови обладают высокой чувствительностью к генотоксикантам, большой продолжительностью жизни и возможностью перемещения по организму. Показано, что после острого УФА-облучения кожи в относительно низких дозах (10-20 кДж/м2) в лимфоцитах периферической крови голых

3

мышей регистрируется повышенное количество повреждений ДНК (ЗуоЬоёоуа й а1, 2012). При наличии заболеваний, ассоциированных с нарушениями работы защитных молекулярных и клеточных систем, наблюдается повышенная чувствительность лимфоцитов к УФА-излучению. Так, лимфоциты периферической крови онкологических больных или пациентов в предраковом состоянии гораздо чувствительнее к УФА-излучению, чем лимфоциты здоровых доноров (Т^аГгаёеЬ с! а1, 2012). Тем не менее, до настоящего времени работы, посвященные изучению ДНК-повреждающего действия УФА-излучения на лимфоциты периферической крови человека, практически отсутствовали в доступной литературе. Отдельные работы по этой теме стали появляться лишь в последнее время О^аЕгайеИ е! а1, 2012; 8уоЬо<1оуа е! а1, 2012). Поэтому представлялось актуальным изучить особенности индукции повреждений ДНК лимфоцитов периферической крови человека при воздействии УФА-излучения.

Цель работы состояла в изучении закономерностей образования однонитевых разрывов (ОР) и щелочнолабильных сайтов (ЩС) ДНК в лимфоцитах крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- Провести анализ зависимости «доза-эффект» образования ОР и ЩС ДНК в лимфоцитах крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения;

- Сравнить количественный выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в лимфоцитах крови человека с выходом данных повреждений при воздействии рентгеновского излучения и перекиси водорода;

- Исследовать влияние скавенджеров гидроксил-радикала (НО ) и синглетного кислорода ('02) на выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения;

- Изучить влияние инкубации лимфоцитов крови в гипертонических растворах №С1, вызывающих ступенчатую депротеинизацию хроматина, на выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением.

Положения, выносимые на защиту:

1) 365 нм УФ-излучение вызывает дозозависимое увеличение однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека;

2) Основными источниками однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучение являются гидроксил-радикал и синглетный кислород;

3) Количественный выход однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением в лимфоцитах периферической

крови человека, зависит от структурной организации хроматина, защищающего ДНК от атак активных форм кислорода.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведён сравнительный анализ образования ОР и ЩС ДНК в лимфоцитах периферической крови человека при воздействии трёх различных повреждающих агентов: 365 нм УФ-излучения, рентгеновского излучения и перекиси водорода. Исследовано влияние ска-венджеров гидроксил-радикала - диметилсульфоксида, и синглетного кислорода - азида натрия, на выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения. Получены результаты, свидетельствующие о важной роли гидроксил-радикала и синглетного кислорода в образовании этих повреждений ДНК при воздействии 365 нм УФ-излучения. Изучено влияние инкубации в гипертонических растворах ЫаС1 на повреждаемость ДНК лимфоцитов крови человека 365 нм УФ-излучением. Показано, что по сравнению с эффектами в клетках, инкубированных в изотоническом растворе ИаС1, статистически достоверное увеличение выхода как спонтанных, так и индуцированных УФА-излучением повреждений ДНК наблюдается при концентрации ЫаС1, вызывающей диссоциацию линкерного гистона Н1 (0,5 моль/л). Разработана простая, чувствительная и хорошо воспроизводимая модификация метода ДНК-гало для анализа ОР и ЩС ДНК в живых клетках.

Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведённых лабораторией радиационной биофизики ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна с личным вкладом диссертанта в получение представленных в работе материалов не менее 70 %. Результаты работы получены лично автором или же при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на международной конференции молодых учёных «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2013) и XIII международной молодёжной научной школы «Проблемы фундаментальной и прикладной радиобиологии^. Обнинск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 100 страницах машинописного текста и включают 33 рисунков, 4 таблицы, 1 приложение. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список цитируемой литературы», который содержит 195 ссылок, из них 190 на иностранном языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследований использовали кровь 30 физически здоровых мужчин-доноров в возрасте 21-28 лет. Забор периферической крови проводили в К2ЭДТА-вакутейнеры (Vacuette). У всех доноров было получено согласие на проведение данного исследования.

Выделение лимфоцитов крови человека проводили путём центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (Histopaque, Sigma-Aldrich) в соответствии с прилагаемой инструкцией. После выделения лимфоциты отмывали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) до конечной концентрации 1 х 10б клеток/мл.

Иммобилизация клеток в агарозу. 200 мкл суспензии клеток (1 х 106 клеток/мл) смешивали с 600 мкл 1% раствора легкоплавкой агарозы (тип IV) в фосфатно-солевом буфере при температуре 37°С. 60 мкл полученной суспензии клеток в жидкой агарозе наносили на предварительно покрытые слоем 1% нормоплавкой агарозы предметные стёкла, накрывали покровными стёклами и оставляли на 5 мин при 4°С до образования плотного геля. Удаляли покровные стёкла. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью двойной флуоресцентной окраски акридиновым оранжевым и йодистым пропи-дием согласно общепринятой методике (Mascotti et al, 2000). В этих условиях клетки сохраняли жизнеспособность (не более 5 % погибших клеток) в течение нескольких часов. Время самих экспериментов не превышало 15 мин.

Получение нуклеоидое лимфоцитов. Агарозные слайды с иммобилизированными в них клетками инкубировали 1 ч при 4°С в лизирующем буфере (2,5 моль/л NaCl, 100 ммоль/л Ыа2ЗДТЛ, 20 ммоль/л Трис-HCl, pH 10,0, 1% Triton Х-100) без ДМСО и азида натрия или с добавлением 10% ДМСО (AppliChem) или 100 ммоль/л азида натрия.

Инкубация клеток в растворах NaCl с различной тоничностью. Агарозные слайды инкубировали 1 ч при 4°С в фосфатно-солевом буфере (pH 7.4), содержащем NaCl в разных концентрациях (0,14; 0,2; 0,35; 0,5 моль/л).

УФ-облучение. Для ультрафиолетового облучения нуклеоидов или клеток, иммобилизованных в агарозу, использовали установку BLX-365 (Bio-Link), длина волны 365±10 им. Облучение проводили при 4°С в дозах 5-50 кДж/м2. Интенсивность излучения - 2,92 кДж/м2 в 1 мин.

Рентгеновское облучение. Облучение клеток рентгеновскими лучами в дозах 0,33-5 Гр проводили на рентгеновской биологической установке РУБ РУСТ-MI (Россия) при мощности дозы 0,85 Гр/мин и температуре 4°С (для охлаждения использовали термогранулы LAB ARMOR BEADS).

Воздействие перекиси водорода. Для обработки клеток 30% раствор перекиси водорода Н202 (Sigma-Aldrich) разводили в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) до конеч-

ной концентрации 1, 2, 5, 10, 25, 50 и 100мкмоль/л (для клеток) или 100, 200 и 500 мкмоль/л (для нуклеоидов) и инкубировали 5 мин при 4°С.

Анализ ОР и 1ДС ДНК проводили с помощью методов ДНК-комет (Osipov et al, 2002, 2004) и ДНК-гало (Сметанина и др., 2013).

Метод ДНК-комет в щелочных условиях. После облучения (для нуклеоидов) или лизиса клеток слайды помещали в холодный (4°С) щелочной буфер (300 ммоль/л NaOH, 1 ммоль/л №2ЭДТА, pH > 13) и выдерживали 20 мин для расплетания (щелочной денатурации) нитей ДНК. Электрофорез проводили в щелочном буфере при напряжении 0,75 В/см при комнатной температуре в течение 20 мин. После электрофореза проводили нейтрализацию для ренатурации (восстановления нативности) ДНК (3-кратная промывка в 0,4 моль/л Трис-HCl буфере, pH 7,4), после чего слайды слегка подсушивали и фиксировали в 70% этаноле в течение 10 мин. Для окраски ДНК использовали SybrGreen I (Invitrogen). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью люминесцентного микроскопа Axioscop-40 FL (Carl Zeiss) и видеосистемы на основе цифровой камеры MRc 5 (Carl Zeiss) с программой AxioVision 4.8 (Carl Zeiss). На каждом слайде регистрировали по 100 комет. Обрабатывали по 3 слайда от каждого донора на экспериментальную точку. Для анализа и обработки микрофотоизображений ДНК-комет использовали программу CASP 1.2.2 (CASPlab).

Модифгщироваиный метод ДНК-гало в щелочных условиях. После облучения (для нуклеоидов) или лизиса клеток слайды переносили в холодный (4°С) щелочной буфер (300 ммоль/л NaOH, 2 ммоль/л №2ЭДТА, pH > 13) и выдерживали 20 мин, после чего проводили 3-кратную промывку в трис-боратном буфере, pH 8,2. Слайды фиксировали в 70% этаноле в течение 10 мин. Для окраски ДНК использовали SybrGreen I (Invitrogen). Визуализацию ДНК-гало проводили с помощью люминесцентного микроскопа Люмам Р-8 (JIOMO, Россия) с использованием системы визуализации микрофотоизображений «Микромед-1600-Зф» (JIOMO, Россия). На каждом слайде регистрировали по 100 нуклеоидов. На каждую точку обрабатывали по 3 слайда от каждого донора. В зависимости от степени диффузии ДНК нуклеоиды относили к одному из трёх классов: А - отсутствие гало; Б - гало присутствует, но при этом размеры и интенсивность флуоресценции ядерной области меняются незначительно; В - максимальная выраженность гало, большая часть ДНК фрагментирована. Индекс ДНК-гало рассчитывали по формуле ИДГ = (0»пА + 1-пБ + 2'пВ)/1, где пА, пБ и пВ - число нуклеоидов в категориях Л, Б и В, а £ - сумма всех подсчитанных нуклеоидов.

А) Б) В)

Рис. 1. Микрофотографии различных классов ДНК-гало нуклеоидов лимфоцитов периферической крови человека: А) отсутствие гало; Б) гало присутствует, но при этом размеры и интенсивность флуоресценции ядерной области меняются незначительно; В) максимальная выраженность гало, большая часть ДНК фрагментирована.

Статистический анализ полученных данных. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета статистических программ Statistica8.0 (StatSoft). Результаты исследований представлены как среднее арифметическое результатов серии независимых экспериментов ± стандартная ошибка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека, подвергшихся воздействию 365 нм УФ-излучения, рентгеновского излучения и перекиси водорода.

В настоящей главе представлены результаты исследований ОР и ЩС ДНК, индуцированных тремя различными повреждающими воздействиями в лимфоцитах периферической крови человека in vitro. Было поставлено две задачи: 1) изучить изменения относительного количества ОР и ЩС ДНК в зависимости от дозы 365 нм УФ-излучения; 2) сравнить количественный выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, с выходом этих повреждений при воздействии рентгеновского излучения и перекиси водорода. Для того чтобы минимизировать вклад клеточных метаболических процессов (продукция свободных радикалов в митохондриях, эксцизионная репарация ДНК) в наблюдаемые эффекты, облучение клеток или обработка перекисью водорода проводились при низкой температуре (4°С), а сам анализ повреждений ДНК выполнялся сразу (10-15 мин) после облучения. Для количественной оценки ОР и ЩС ДНК была использована щелочная версия метода ДНК-комет (метод гель-электрофореза ДНК единичных клеток). Этот метод отличается высокой чувствительностью и позволяет анализировать изменения количества ОР и ЩС ДНК при дозах редкоионизирующего излуче-

8

ния всего ~ 10-20 сГр (Osipov et al, 2004). После щелочной денатурации (рН > 13) ДНК иммобилизованных в агарозу клеток проводится электрофорез, во время которого петли и фрагменты ДНК мигрируют в геле агарозы к аноду, создавая своеобразный «хвост». Таким образом, % ДНК в хвосте ДНК-комет отражает степень повреждённое™ ДНК.

Результаты исследований изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК в лимфоцитах периферической крови человека при их облучении in vitro 365 нм УФ-излучением в дозах 5-20 кДж/м2 представлены на рис. 2.

Доза 365 вм УФ-излучения, кДж/м2 Рис. 2. Зависимость изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК (% ДНК в хвосте) в лимфоцитах периферической крови человека от дозы 365 нм УФ-излучения.

Показано, что при воздействии 365 нм УФ-излучения в дозах 5-20 кДж/м2 наблюдается линейное увеличение % ДНК в хвосте комет во всём изученном диапазоне доз (рис. 2). Зависимость «доза-эффект» хорошо аппроксимируется линейной функцией у=6,13+0,65х (Я2=0,99), где у - % ДНК в хвосте комет, ах- доза облучения, кДж/м2.

На рис. 3, для наглядности, представлены выборочные микрофотографии ДНК-комет лимфоцитов, подвергшихся воздействию 365 нм УФ-излучения в различных дозах.

Рис. 3. Микрофотографии ДНК-комет лимфоцитов периферической крови человека, подвергшихся воздействию 365 нм УФ-излучения в различных дозах.

В живых клетках энергия УФА-излучения поглощается различными фотосенсибилизаторами, например эндогенным меланином (Wood et al, 2006), белками, содержащими порфирины, гемы, хиноны или флавины (Kawanishi et al, 2001). В процессе фотоокислительной реакции I типа возбуждённый сенсибилизатор принимает электрон (или атом водорода) непосредственно от находящейся вблизи молекулы. По реакции I типа в ДНК происходит в основном окисление наиболее реакционного основания - гуанина - с образованием 8-оксо-7,8-дигидрогуанина (8-оксо-гуанина) и 2,6-диамино-4-гидрокси-5-формамидопиримидина (Cadet and Douki, 2011; Ravanat et al, 2001). В ходе фотоокислительной реакции II типа происходит образование синглетного кислорода (основной путь) и супероксид-анион-радикала (минорный путь) (Ridley et al, 2009). Синглетный кислород, взаимодействуя с ДНК, также, в конечном счете, индуцирует образование 8-оксо-гуанина (Ravanat et al, 2001), в то время как супероксид-анион в реакциях спонтанной и ферментативной дисмутации образует перекись водорода, которая затем в реакциях Фентона и Габер-Вейса генерирует НО-радикал, индуцирующий ОР и НДС ДНК (Cadet et al, 2009). Таким образом, согласно современным представлениям, воздействие УФА-излучения на клеточную ДНК приводит к образованию преимущественно 8-оксо-гуанина, а выход ОР и ЩС ДНК должен быть-минорен (Cadet and Douki, 2011; Ridley et al, 2009; Cadet et al, 2009).

Представлялось интересным сравнить количественный выход ОР и ЩС ДНК при воздействии 365 нм УФ-излучения с выходом этих повреждений при воздействии таких хорошо изученных генотоксикантов, как перекись водорода и рентгеновское излучение.

10

В живых клетках перекись водорода в реакциях с ионами металлов переменной валентности и супероксид-анион-радикалом (реакции Фентона и Габер-Вейса) приводит к образованию повреждающего ДНК НО-радикапа.

Результаты исследований индукции ОР и ЩС ДНК в лимфоцитах периферической крови человека при воздействии перекиси водорода (5 мин при 4°С) представлены на рис. 4. Зависимость изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК от концентрации перекиси водорода можно аппроксимировать линейной функцией у=5,70+0,22х (112=0,98), где у - % ДНК в хвосте комет, ах- концентрация перекиси водорода в мкмоль/л.

Концентрация перекиси водорода, мкмоль/л

Рис. 4. Зависимость изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК (% ДНК в хвосте) в лимфоцитах периферической крови человека от концентрации перекиси водорода.

В целом при использованных экспериментальных условиях эффект воздействия 365 нм УФ-излучения на лимфоциты в дозе 10 кДж/м2 по количеству ОР и ЩС ДНК соответствует эффекту воздействии перекиси водорода в концентрации 25 мкмоль/л.

В качестве другого агента сравнения было выбрано рентгеновское излучение. На рис. 5 представлены результаты.исследований выхода ОР и ЩС ДНК в лимфоцитах периферической крови человека при их облучении in vitro рентгеновским излучением в дозе 1-5 Гр. Зависимость «доза-эффект» хорошо описывается линейной функцией у=5,53+6,72х (R2=0,99), где у - % ДНК в хвосте комет, ах- доза облучения в Гр.

Сравнительный анализ кривых «доза-эффект», полученных при воздействии рентгеновского и 365 нм УФ-излучений, показал, что при использованных нами экспериментальных условиях, а именно относительно короткое время облучения (до 15 мин) и низкая (4°С) температура, значительно снижающая эффективность работы клеточных систем репарации повреждений ДНК, количество ОР и ЩС ДНК, индуцированных в лимфоцитах рентгеновским излучением в дозе 1 Гр, соответствует эффекту при воздействии 365 нм УФ-излучения в дозе 10 кДж/м2 (рис. 5).

Доза рентгеновского излучения, Гр Рис. 5. Изменение относительного количества ОР и ЩС ДНК (% ДНК в хвосте) в лимфоцитах периферической крови человека в зависимости от дозы рентгеновского излучения.

Ионизирующее излучение (ИИ) повреждает ДНК как при прямом попадании кванта или частицы в молекулу ДНК (непосредственная передача энергии молекуле ДНК и молекулам воды, вплотную прилегающим к ДНК), так и косвенно, индуцируя свободные радикалы, вызывающие преимущественно модификацию оснований и одно-нитевые разрывы ДНК. Хорошо известно, что около 70 % повреждений ДНК можно предотвратить добавлением низкомолекулярных антиоксидантов, нейтрализующих свободные радикалы (Roots et al, 1972). С другой стороны, важнейшей характеристикой ра-диационно-индуцированных повреждений ДНК является их сложность и кластеризация (Sutherland et al, 2000). Среди повреждений ДНК, вызываемых ИИ, двунитевые разрывы (ДР) ДНК являются наиболее критическими для дальнейшей судьбы клетки (Osipov

et al, 2013), в то время как индукция ДР при атаке ДНК свободными радикалами довольно редкое событие, наблюдаемое, как правило, при образовании близколежащих одно-нитевых разрывов (ОР) на противоположных нитях ДНК или при репликации и репарации повреждённой ДНК (Banâth et al, 2010). Установлено, что соотношение ДР/ОР при атаке ДНК свободными радикалами составляет ~ 1/2000-1/3250 (Lôbrich et al, 2010). Например, для воздействия ионизирующего излучения оно равно ~ 1/25 (Ward, 1988). При сравнительной оценке биологической значимости УФА- и ионизирующего излучения необходимо учитывать разный спектр повреждений ДНК и их значение для судьбы клетки. Потому важно подчеркнуть, что в наших исследованиях мы сравнивали только количественный выход ОР и ЩС ДНК при различных типах излучений, но не биологические эффекты этих излучений. Тем не менее, мы можем провести предварительные расчёт количественного выхода ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением в лимфоцитах. Хорошо известно, что при облучении редко-ионизирующим излучением в дозе 1 Гр в клетке в среднем образуется 500-1000 ОР, 250-300 ЩС и 2040 ДР. Таким образом, после несложных вычислений мы можем сделать предварительное заключение, что при облучении лимфоцитов крови 365 нм УФ-излучением в дозе 1 кДж/м2 образуется ориентировочно 80-130 ОР и/или ЩС ДНК на клетку.

Сравнительная оценка повреждений ДНК, индуцированных различными ге-нотоксическнми агентами, с помощью метода ДНК-гало.

В данной главе представлены результаты дополнительных исследований, проведённых для подтверждения полученных методом ДНК-комет дозовых зависимостей изменений относительного количества ОР и ЩС в УФА-облучённых лимфоцитах крови человека.

Известно, что помимо несомненных достоинств метода ДНК-комет существует и серьёзный недостаток, а именно существенная межлабораторная вариабельность результатов, полученных с использованием одной и той же модификации и в сходных экспериментальных условиях. Одной из причин этой вариабельности являются различия в конструкциях электрофоретических камер, не позволяющие получить полностью идентичных параметров электрофореза. Для решения этой проблемы и упрощения самого метода был разработан метод «щелочного гало» (alkaline-halo assay) (Sestili et al, 1999), позднее модифицированный и названный «быстрый метод гало» (Sestili et al, 2006; Sestili, 2009). Денатурированная в щелочных условиях фрагментированная ДНК быстро диффундирует в геле агарозы, создавая своеобразное гало вокруг «ядерной» области. То есть метод позволяет оценивать изменения в количестве однонитевых разрывов ДНК без проведения электрофореза.

В рамках данного диссертационного исследования была разработана собственная модификация метода ДНК-гало, отличающаяся простотой, высокой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью (Сметанина и др., 2013). С использованием разработанной модификации были проведены исследования индукции ОР и ЩС ДНК рентгеновским излучением, перекисью водорода и 365 нм УФ-излучением в лимфоцитах периферической крови человека in vitro.

На рис. 6 представлены усреднённые результаты исследований изменений индекса ДНК-гало в лимфоцитах периферической крови человека, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения в дозах 0,3-2 Гр. Видно, что в использованном дозовом диапазоне наблюдается линейное увеличение индекса ДНК-гало. Зависимость «доза-эффект» в этом диапазоне доз аппроксимируется линейной функцией у=0,29+0,39х (R2=0,99), где у - индекс ДНК-гало в усл. ед., ах- доза облучения в Гр.

Доза рентгеновского излучения, Гр Рис. 6. Зависимость изменений индекса ДНК-гало лимфоцитов периферической крови человека от дозы рентгеновского излучения.

Результаты, полученные при воздействии перекиси водорода, представлены на рис 7. Показано, что вплоть до концентрации 25 мкмоль/л зависимость «доза-эффект» можно описать линейной функцией у=0,26+0,03х (112=0,96), где у - индекс ДНК-гало в усл. ед., а х - концентрация перекиси водорода в мкмоль/л.

Концентрация перекиси водорода, мкмоль/л Рис. 7. Изменение индекса ДНК-гало лимфоцитов периферической крови человека в зависимости от концентрации перекиси водорода.

При воздействии длинноволнового ультрафиолетового излучения наблюдается линейное увеличение индекса ДНК-гало во всём изученном диапазоне доз (рис. 8).

Доза 365 нм УФ-нзлучепия. кДж/и-

Рис. 8. Зависимость изменений индекса ДНК-гало лимфоцитов периферической крови человека от дозы УФ-излучения с длиной волны 365 нм.

Зависимость «доза-эффект» для ультрафиолетового излучения аппроксимируется линейной функцией у=0,26+0,03х (Я2=0,99), где у - индекс ДНК-гало в усл. ед., а х - до-

15

за облучения в кДж/м2. Сравнение полученных дозовых зависимостей показывает, что эффект 365 нм УФ-облучения в дозе 10 кДж/м2 соответствует эффекту рентгеновского излучение в дозе ~ 0,81 Гр или воздействия перекиси водорода в концентрации 10 мкмоль/л. Полученные значения ниже, чем в исследованиях с помощью метода ДНК-комет, но в целом подтверждают высокий выход ОР и ЩС в лимфоцитах крови при воздействии 365 нм УФ-излучения.

Влияние скавенджеров активных форм кислорода на повреждаемость ДНК в нуклеоидах лимфоцитов крови человека при воздействии 365 им УФ-излучения.

В данной главе представлены результаты исследования влияния скавенджеров активных форм кислорода (АФК) на выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения. Задачей исследования было изучение вклада основных АФК, повреждающих ДНК при УФА-облучении клеток, а именно гидроксил-радикала (НО-) и синглетного кислорода ('02), на выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека. В качестве скавенджера НО* был взят диметилсульфоксид (ДМСО), а в качестве скавенджера '02 - азид натрия (NaN3). Для оценки степени повреждённости генома, обусловленной ОР и ЩС ДНК, использовали метод ДНК-комет и метод ДНК-гало. Выбор нуклеоидов в качестве модели был обусловлен несколькими причинами:

1) Хотя облучение лимфоцитов проводилось при низкой температуре (4°С), когда метаболические процессы клеток сильно замедленны, мы не могли полностью исключить вклад эксцизионной репарации ДНК и свободных радикалов, продуцируемых в митохондриях, в наблюдаемые эффекты. Так, в работе Bock et al (1999) было показано, что в культуре лимфобластов человека эффективная репарации УФА-индуцированных повреждений ДНК происходит даже при 4°С;

2) NaN3 и ДМСО в высоких концентрациях цитотоксичны, что не может не иметь своего влияния на наблюдаемые нами эффекты.

Поэтому исследования влияния скавенджеров АФК на повреждаемость ДНК 365 нм УФ-излучением проводились на нуклеоидах лимфоцитов в буфере, содержащем ингибитор нуклеаз (Na2EDTA), то есть на модели и в условиях, где вышеперечисленные процессы были полностью исключены.

Результаты исследований показали, что 365 нм УФ-излучсние в дозах 10, 20 и 50 кДж/м2 индуцирует дозозависимое увеличение ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах, регистрируемых методом ДНК-комет (рис.9, кривая 1). Добавление в буфер для облучения скавенджеров АФК заметно снижало выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах (рис. 9, кривые 2 и 3).

50

ь

о

g

<1 40

Ci

| 30

и

= 20 *

10

О -,-,-,-,-r_

О 10 20 30 40 50

Доза 365 нм УФ-излучення, кДж/м:

Рис. 9. Зависимости изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при облучении в буфере без скавенджеров АФК (1), с добавлением 100 ммоль/л азида натрия (2), с 10% ДМСО (3), полученные с помощью метода ДНК-комет.

Сравнение линейных угловых коэффициентов, характеризующих прирост эффекта на единицу дозы, показывает, что азид натрия и ДМСО снижают выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением в нуклеоидах лимфоцитов, ~ в 2,5 и 2,8 раз соответственно (рис. 10).

Результаты, полученные с использованием скавенджера НО", были в определённой мере предсказуемы. Известно, что НО" без какой бы то ни было селективности повреждает основания ДНК и индуцирует ОР и ЩС (Kawanishi and Hiraku, 2001; Cadet et al, 2009). И хотя выход НО' при УФА-облучении невысок, считается, что именно этот высокоактивный радикал главным образом ответственен за индукцию ОР и ЩС ДНК при УФА-облучении (Petersen et al, 2000), в то время как данные, полученные с использованием скавенджера '02, были неожиданными.. Согласно современным представлениям, '02 повреждает преимущественно гуанин с образованием 8-оксо-гуашша (Cadet and Douki, 2011). Однако есть данные, показывающие, что синглетный кислород кроме модификаций оснований способен индуцировать другие типы повреждений ДНК: АП-

сайты (Blazek et al, 1989; Boye and Moan, 1980; Epe et al, 1993) и однонитевые и двуни-тевые разрывы ДНК (Devasagayam et al, 1991; Ribeiro et al, 1992).

Доза 365 mi УФ-отлученпя, кДж/м2

Рис. 10. Зависимости изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при облучении в буфере без скавенджеров АФК (1), с добавлением 100 ммоль/л азида натрия (2), и с 10% ДМСО (23), полученные с помощью метода ДНК-гало.

Показано, что однонитевые молекулы ДНК более реакционноспособны с синглетным кислородом, чем двунитевые (Devasagayam and Ката!, 2002), что может привести к дву-нитевому разрыву в случае атаки однонитевых участков ДНК, образующихся в процессе нормального функционирования хроматина (транскрипция, репликация, репарация). При воздействии УФА-излучения до 80 % повреждений ДНК в живых клетках индуцируется именно '02 (Pouget й а1, 2000). С учётом того факта, что примерно 30 % повреждений ДНК, индуцированных '02, представляют собой ЩС (№еи\уш1 е1 а1, 1985; ЬаПеиг е1 а1, 1987), а ещё 2-5 % ОР Маясю с1 а1, 1989), можно заключить, что при воздействии УФА-излучения '02 является не менее важным источником ОР и ЩС ДНК, чем НО*, что и было продемонстрировано в наших исследованиях.

В целом резкое снижение выхода УФА-индуцированных ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов в присутствии азида натрия и ДМСО свидетельствует о ведущей

18

роли '02 и НО* в образовании этих повреждений ДНК при воздействии 365 нм УФ-излучения. Повышенная продукция '02 и НО», повреждающих ДНК лимфоцитов крови при воздействии 365 нм УФ-излучения, косвенно свидетельствует о высокой концентрации в этих клетках хромофоров с максимумом поглощения при этой длине волны.

Исследование влияния инкубации в гипертонических растворах NaCl на выход ОР и ЩС ДНК.

Как правило, при рассмотрении клеточной защиты от повреждающего действия активных форм кислорода и азота основное внимание обращают на механизмы нейтра-лизации/детоксикации свободных радикалов, в которые вовлечены ферменты (суперок-сиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и др.), хелаторы редокс-активных металлов, низкомолекулярные антиоксиданты (витамины Е и С, каротин, глутатион и др.), белки с высоким содержанием SH-групп (например, металлотионеины) и т.д. (Blokhina et al, 2003). Гораздо меньше внимания обращают на конформационную защиту хроматина. В то же время хорошо известно, что активный хроматин (эухроматин) в большей степени повреждается свободными радикалами, чем неактивный (гетерохроматин) (Oleinick et al, 1984). Это обусловлено тем, что активно транскрибируемые последовательности не защищены от атак свободных радикалов структурными белками хроматина. Основой процесса самоорганизации хроматина являются слабые взаимодействия его базовых структурных компонентов - ДНК и белков. Изменение ионной силы, например с помощью гипертонических растворов NaCl, приводит к нарушению этих взаимодействий и депротеинизации хроматина (Kobori et al, 2007). Использование растворов NaCl с постепенно повышающейся тоничностыо позволят проводить своеобразное, ступенчатое «раздевание» хроматина: при концентрации NaCl 0,35 моль/л происходит диссоциация негистоновых белков; 0,5-0,6 моль/л - негистоновых белков и линкерного гистона; 1,2 моль/л - негистоновых белков, линкерного гистона и коровых гистонов Н2А-Н2В; 2 моль/л - полная депротеинизация хроматина (Elia and Bradley, 1992). Использование этого подхода позволяет изучать роль конформации хроматина в защите ДНК от повреждающего действия свободных радикалов.

Поэтому задачей этого раздела диссертационного исследования стало изучение влияния гипертонических растворов NaCl, вызывающих частичную депротеинизацию хроматина, на выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных УФА-излучением, в лимфоцитах периферической крови человека in vitro. Изменение повреждённое™ ДНК оценивали двумя методами: методом ДНК-комет и методом ДНК-гало.

На рис. 11 представлены результаты исследований влияния инкубации в гипертонических растворах NaCl на выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных УФА-излучением, в

лимфоцитах периферической крови человека in vitro, полученные с помощью метода ДНК-комет.

30

00.14 М 00.2 М H0.3S м ■ 0.5 М

......

20 4

10

О to 20

Доза 365 нм УФ-излученпя, кДж/м2

Рис. ] 1. Изменение относительного количества ОР и ЩС ДНК, индуцированных УФА-излучением, в лимфоцитах периферической крови человека in vitro, полученных с помощью метода ДНК-комет, в зависимости от дозы при инкубации в растворах с различной концентрацией NaCl.

* р < 0,05; ** р < 0,01 - достоверность различий по отношению к эффектам в клетках, инкубированных в изотоническом растворе NaCl.

В клетках, облучённых в изотоническом (0,14 моль/л) растворе №С1, наблюдается линейное увеличение выхода ОР и ЩС в зависимости от дозы облучения. Зависимость «доза-эффект» в этом случае хорошо описывается линейной функцией у=9,08+0,63х (К2=0,98), где у - % ДНК в хвосте ДНК-комет в усл. ед., ах - доза облучения в кДж/м2. Инкубация клеток в растворах ЫаС1 с концентрацией 0,2 и 0,35 моль/л не приводила к статистически достоверному увеличению выхода УФА-индуцированных повреждений ДНК (рис. 11), в то время как в'клетках, инкубированных в растворе №С1 с концентрацией 0,5 моль/л, увеличивался выход как спонтанных (~ в 1,9 раза), так и индуцированных УФА-излучением повреждений ДНК. Зависимость «доза-эффект» для клеток, инкубированных в растворе №С1 с концентрацией 0,5 моль/л, можно аппроксимировать линейной функцией у=17,09+1,06х (К2Ю,97), где у - % ДНК в хвосте ДНК-комет в усл.

ед., а х - доза облучения в кДж/м2. Сравнение линейных угловых коэффициентов, характеризующих прирост эффекта на единицу дозы, свидетельствует о том, что в клетках, инкубированных в растворе ЫаС1 с концентрацией 0,5 моль/л, выход индуцированных УФА-излучением ОР и ЩС ДНК ~ в 1,7 раза выше, чем в клетках, инкубированных в изотоническом растворе ЫаС1.

Аналогичные результаты были получены в независимых экспериментах с помощью метода ДНК-гало (рис. 12). Было показано, что инкубация клеток в 0,5 моль/л растворе ИаС1 увеличивает выход спонтанных (~ 1,5 раза) и УФА-индуцированных ОР и ЩС ДНК ~ в 1,6 раза. Соответствующие уравнения линейной регрессии для клеток, облучённых в изотоническом и гипертоническом растворах №С1: у=0,349+0,021х (И2=0,99) и у=0,529+0,033х (Я2=0,99), где у - индекс ДНК-гало в усл. ед., ах- доза облучения в кДж/м2.

1.4

00.14 мочь'л И 0,2 моль л 0 0.35 моль 71 80,5 моль л

10

20

Доза 365 нм УФ-пзлучения, кДж/м5 Рис. 12. Изменение относительного количества ОР и ЩС ДНК, индуцированных УФА-излучением, в лимфоцитах периферической крови человека т уИго, полученных с помощью метода ДНК-гало, в зависимости от дозы при инкубации в растворах с различной концентрацией ЫаС1.

* р < 0,05; ** р < 0,01 - достоверность различий по отношению к эффектам в клетках, инкубированных в изотоническом растворе №С1.

Сведения о влиянии гипертонических растворов NaCl на повреждаемость клеточной ДНК УФА-излучением в открытой литературе отсутствуют. Однако хорошо известно, что гипертонические растворы увеличивают выход повреждений ДНК, индуцированных ионизирующим излучением (Elia and Bradley, 1992; Lyungman, 1991; Reitsema et al, 2005). Предполагается, что ведущую роль в этом играет диссоциация белков хроматина, лимитирующих доступ активных форм кислорода и азота к ДНК. Ключевым белком, обеспечивающим корректную сборку нуклеосом в компактные архиструктуры хроматина и тем самым ограничивающим доступ свободных радикалов к ДНК, является линкерный гистон HI. Удаление этого белка приводит к серьёзным нарушениям структуры хроматина, снижению компактности, образованию глыбчатой структуры и существенному увеличению доступа свободных радикалов к ДНК. Показано, что инкубация клеток линии СНО-1 в среде, содержащей 0,5 моль/л NaCl и вызывающей диссоциацию гистона HI, увеличивает выход повреждений ДНК, индуцированных у-излучением, примерно в два раза (Roos et al, 2002), что близко к значениям, полученным в результате наших экспериментов с УФА-излучением. Подобные результаты были получены и при облучении HI-обеднённого хроматина фибробластов китайского хомяка линии V79 рентгеновским излучением (Heussen et al, 1987).

В последние годы было показано, что инкубация клеток в гипертонических растворах NaCl вызывает увеличение количества двунитевых разрывов ДНК в некодирую-щих последовательностях (Dmitrieva et al, 2004; Dmitrieva et al, 2011; Redon and Bonner, 2011). Механизм этого феномена до конца не понят, но предполагается, что этот эффект обусловлен активацией биологических программ, направленных на адаптацию клеток к гипертоническим условиям (Dmitrieva et al, 2011; Redon and Bonner, 2011).

Таким образом, результаты проведённых исследований свидетельствуют о том, что инкубация лимфоцитов периферической крови человека в растворах NaCl в концентрациях 0,2, 0,35 и 0,5 моль/л приводит к статистически достоверному увеличению спонтанных повреждений и увеличению повреждаемости ДНК УФА-излучением только при концентрации NaCl 0,5 моль/л. Предполагается, что при этой концентрации NaCl происходит диссоциация линкерного гистона HI, нарушается структура хроматина и резко увеличивается выход свободно-радикальных повреждений ДНК.

выводы

1. Воздействие 365 нм УФ-излучения на лимфоциты периферической крови человека in vitro в диапазоне доз 5-20 кДж/м2 индуцирует дозозависимое увеличение количества однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК, детектируемое методами ДНК-комет и ДНК-гало.

2. Количественный выход однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах крови человека, индуцированных 365 нм УФ-излучением в дозе 10 кДж/м2, сравним с выходом этих повреждений при облучении тех же клеток рентгеновским излучением в дозе ~ 0,5-1,0 Гр или при воздействии перекиси водорода в концентрации 10-25 мкмоль/л.

3. Скавенджеры активных форм кислорода диметилсульфоксид и азид натрия значительно снижают количественный выход однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК, образующихся в нуклеоидах лимфоцитов при воздействии 365 нм УФ-излучения.

4. Инкубация лимфоцитов периферической крови человека в гипертонических растворах NaCl (0,2-0,5 моль/л) приводит к статистически достоверному увеличению спонтанных повреждений и увеличению повреждаемости ДНК 365 нм УФ-излучением только при концентрации NaCl 0,5 моль/л, вызывающей диссоциацию линкерного гистона HI и нарушения конформации хроматина.

5. Анализ повреждаемости ДНК лимфоцитов периферической крови человека, основанный на методах ДНК-комет и ДНК-гало, при тест-воздействии УФА-излучения in vitro может быть использован для оценки чувствительности человека к воздействию УФА-излучения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах из списка ВАК

1. Сметанина Н.М., Пустовалова М.В., Осипов А.Н. Модифицированный метод ДНК-гало для оценки повреждений ДНК, индуцированных различными генотоксически-ми агентами. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2013. Т. 53. № 4. С. 389393.

2. Сметанина Н.М.. Пустовалова М.В., Осипов А.Н. Влияние инкубации в гипертонических растворах хлорида натрия на повреждаемость ДНК лимфоцитов крови человека длинноволновым УФ-излучением. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2013. Т. 53. № 6. С. 620-624.

3. Сметанина Н.М.. Пустовалова М.В., Бушманов А.Ю., Осипов А.Н. Сравнительные исследования выхода однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК при воздействии 365 нм ультрафиолетового и рентгеновского излучений на лимфоциты периферической крови человека. // Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т. 9. №4. С. 791-795.

4. Сметанина Н.М.. Пустовалова М.В., Осипов А.Н. Влияние диметилсульфоксида на выход однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в нуклеоидах лимфоцитов крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения. // Радиационная биология. Радиоэкология. 2014. Т. 54. № 2. С. 169-173.

5. A.N. Osipov, N.M. Smetanina. M.V. Pustovalova, E. Arkhangelskaya, D. Klokov. The formation of DNA single-strand breaks and alkali-labile sites in human blood lymphocytes exposed to 365 nm UVA radiation. // Free Radical Biology and Medicine. 2014. V. 73. P. 34-40.

6. Тезисы конференций

1. Сметанина H.M., Пустовалова M.В., Осипов А.Н. Влияние инкубации в гипертонических растворах хлорида натрия на повреждаемость ДНК лимфоцитов крови человека длинноволновым УФ-излучением. // Международная конференция молодых учёных «Экспериментальная и теоретическая биофизика»: Сборник тезисов докладов. Пущино. 2013. С. 124.

2. Пустовалова М.В., Сметанина Н.М.. Осипов А.Н. Модифицированный метод ДНК-гало для оценки однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК, индуцированных различными повреждающими 'агентами. // Международная конференция молодых учёных «Экспериментальная и теоретическая биофизика»: Сборник тезисов докладов. Пущино. 2013. С. 123.

Сметанина Надежда Михайловна

МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ И ЩЕЛОЧНОЛАБИЛЬНЫХ САЙТОВ ДНК В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ УФА-ИЗЛУЧЕНИЯ

Автореферат

Подписано в печать 29.08.2014. Формат 60 х 84 1/16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 283. Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский физико-т"ехнический институт (государственный университет)» Отдел оперативной полиграфии «Физтех-полиграф» 141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9