Молекулярно-клеточные маркеры лимфоцитов больных меланомой как прогностический показатель клинического ответа на химиотерапию

Артамонов, Дмитрий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-клеточные маркеры лимфоцитов больных меланомой как прогностический показатель клинического ответа на химиотерапию
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-клеточные маркеры лимфоцитов больных меланомой как прогностический показатель клинического ответа на химиотерапию"

На правах рукописи

Артамонов Дмитрий Николаевич

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ КАК ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ ПОКАЗАТЕЛЬ КЛИНИЧЕСКОГО ОТВЕТА НА ХИМИОТЕРАПИЮ

03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011 1 О МДР 2011

4840253

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН.

Тронов Виктор Александрович Горбачева Лора Борисовна

Пальмина Надежда Павловна

Карпухин Александр Васильевич

Ведущая организация: биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, кафедра биофизики.

Защита диссертации состоится "_" марта 2011 г. в 13 00 часов на заседании

диссертационного совета Д 002.039.01 Учреждения РАН Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 117977, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН.

Автореферат разослан "_" февраля 2011 г.

Научные руководители:

доктор биологических наук

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук, профессор

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.039.01 кандидат химических наук

Мазалецкая Л.И.

Актуальность проблемы.

Меланома, высоко агрессивное неопластическое заболевание, поддается лечению на начальных стадиях. По мере прогрессии заболевания эффективность лечения снижается. На стадии метастазирования меланома характеризуется высокой лекарственной устойчивостью и высокой летальностью. Ведущее место среди терапевтических процедур, применяемых при меланоме, занимает цитотоксическая химиотерапия. Монофункциональные алкилирующие агенты дакарбазин, прокарбазин а также нитрозомочевины, кармустин и ломустин, входят в состав стандартного протокола лечения меланомы. Однако частота положительного ответа больных в случае терапии только дакарбазином или комбинацией дакарбазина с кармустином и ломустином не превышает 20%. Две исследовательские стратегии направлены на преодоление низкой эффективности химиотерапии: разработка новых терапевтических подходов и поиск маркеров, позволяющих прогнозировать индивидуальную устойчивость/чувствительность больных к химиотерапии.

Наиболее часто используемыми показателями для прогноза меланомы кожи являются максимальный вертикальный размер опухоли, глубина инвазии и наличие или отсутствие изъязвлений.

Актуальным является исследование новых маркеров прогноза заболевания, основанных на изучении механизмов устойчивости клеток к химиотерапии. Таковыми являются эффективность удаления повреждений ДНК и связанная с ней способность к предотвращению апоптоза.

С большим основанием предполагается, что толерантность опухоли к химиотерапии связана с дефектами в одном из механизмов репарации ДНК -коррекции неспаренных оснований (mismatch repair, MMR). Это предположение было подтверждено экспериментально в работах, выполненных на культивируемых клетках, полноценных и дефицитных по MMR. Совокупность полученных данных позволила сделать вывод о том, что вторичные разрывы ДНК в пролиферирующих клетках в ответ на действие метилирующего агента формируются в результате функционирования механизма MMR. В таком случае эти «отсроченные» вторичные разрывы могут быть показателем активности системы MMR. Это позволяет предположить, что вторичные разрывы, индуцированные в геноме стимулированных лимфоцитов, могут быть биофизическим маркером как самого заболевания (ассоциированного с дефицитом MMR), так и эффективности терапии.

В настоящей работе проводилось изучение эффективности MMR в сочетании с другими показателями, такими как активность эксцизионной репарации оснований (BER), экспрессия проапоптотического рецептора FasR и ключевых белков системы MMR, MLH1 и MSH2, в лимфоцитах крови больных меланомой в ходе одного цикла химиотерапии. Протокол химиотерапии включает ломустин, дакарбазин, цисплатин, ингарон (ЛДЦИ-протокол). Клинический ответ больных сопоставляли с полученными значениями маркеров лимфоцитов и оценивали степень корреляции между ними.

Цель работы.

Оценить значение некоторых молекулярно-клеточных маркеров лимфоцитов крови больных диссеминированной меланомой кожи (эффективности репарации ДНК, уровней экспрессии белков MLH1, MSH2, FasR и гибели лимфоцитов) в прогнозе индивидуальной чувствительности к химиотерапии.

Задачи исследования.

- Определить типы повреждений ДНК в лимфоцитах в результате 1-го цикла химиотерапии (XT).

- Изучить эффективность механизмов репарации ядерной ДНК в лимфоцитах крови больных меланомой.

- Сравнить показатели ответа лимфоцитов на химиотерапию и тест-воздействие метилнитрозомочевины (МНМ).

- Определить зависимость между скоростью удаления однонитевых (single-stranded, ss) разрывов (OP) ДНК в лимфоцитах после химиотерапии и эффективностью системы эксцизионной репарации оснований (BER).

- Определить связь между скоростью накопления двунитевых (ds) разрывов (ДР) ДНК в лимфоцитах после химиотерапии и эффективностью системы MMR.

- Оценить возможность использования уровня повреждения ДНК и эффективности репарации (BER и MMR) как прогностических показателей химиотерапии больных диссеминированной меланомой.

- Оценить возможность использования экспрессии белков MLH1, MSH2, FasR и гибели лимфоцитов как прогностических показателей химиотерапии больных меланомой кожи.

Научная новизна.

- Показано, что межиндивидуальные вариации эффективности BER не влияют на цитотоксический ответ лимфоцитов и клинический ответ больных на химиотерапию.

- Показано, что повреждения однонитевой ДНК вносят незначительный вклад в цитотоксический эффект химиотерапии.

- Разработан метод оценки эффективности пострепликативного механизма MMR в лимфоцитах с помощью BrUdR-меченых ДНК-комет.

- Показана корреляция количества индуцированных вторичных ds-разрывов ДНК в ФГА-стимулированных лимфоцитах больных с эффективностью MMR в них.

- Впервые показана достоверная корреляция между количеством вторичных ds-разрывов ДНК, индуцированных химиотерапией в лимфоцитах больных, и клиническим ответом этих больных на химиотерапию.

- Впервые обнаружена достоверная корреляция между ответом лимфоцитов больных меланомой на химиотерапию и на тест-воздействие метилнитрозомочевиной in vitro, что делает возможным определение неинвазивных маркеров, прогнозирующих клинический ответ до начала химиотерапии.

Научно-практическая значимость.

Установлено, что функциональная эффективность системы MMR и связанное с ней накопление двунитевых разрывов ДНК являются прогностическими маркерами клинического ответа опухоли и могут быть использованы в качестве дополнительного фактора прогноза с учетом клинико-гистологических параметров. Применение данного критерия в клинической практике позволяет стратифицировать больных с учетом потенциального развития заболевания и может использоваться для назначения адъювантной терапии.

Положения, выносимые на защиту.

- Разработаны методы оценки эффективности в лимфоцитах больных меланомой дорепликативного механизма BER и пострепликативного механизма репарации MMR.

- Межиндивидуальные вариации эффективности BER не влияют на цитотоксический ответ лимфоцитов и клинический ответ больных на химиотерапию. Вместе с тем, не исключается антиапоптотическое влияние BER, снижающее эффективность химиотерапии.

- Уровень вторичной деградации dsДHK в лимфоцитах пациентов, подвергнутых химиотерапии, является независимым прогностическим маркером ЛДЦИ-протокола химиотерапии. Этот показатель включает в себя как эффективность MMR, так и частично эффективность механизма эксцизионной репарации нуклеотидов (NER).

Апробация результатов. .

Основные результаты работы были представлены на:

7-ом Международном симпозиуме по таргетной противоопухолевой терапии (7th International Symposium on Targeted Anticancer Therapies, Amsterdam, The Netherlands, March 23-25, 2009),

8-ой Международной конференции «Биохимическая физика», Москва, 11-13 ноября, 2008,

8-ой Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21-22 апреля 2009,

10-ой международной летней школе по биофизике (10-th International Summer School on Biophysics "Supramolecular Structure and Function", Sept. 19 - Oct.Ol, Rovinj, Croatia, 2009),

9-ой Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Н.Новгород, 21 мая 2010,

III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010», Москва, 21-25 июня 2010,

10-ой Международной конференции «Биохимическая физика», Москва, 8-10 ноября, 2010.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 103 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 93 источника. Работа иллюстрирована 37 рисунками и 1 таблицей.

Содержание работы.

Методы.

Характеристика больных и процедура химиотерапии.

В работе использовали лимфоциты крови больных диссеминированной меланомой кожи, проходивших курс лечения в отделении химиотерапии и

комбинированных методов лечения злокачественных опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Протокол лечения (LDCI, ЛДЦИ, ломустин, дакарбазин, цисплатина, ингарона) включал в себя ежедневное введение ингарона 5 105МЕ в течение 5 дней, ломустина (80 мг/м2 перорально в 1-й день), дакарбазина (250 мг/м2 в/в в1-й -3-й дни) и цисплатина (80 мг/м2 в/в в 3-й день). Введение ингарона (5 ■ 105МЕ три раза в неделю) продолжалось еще три недели. Следующий курс начинали на 6-й неделе с ежедневного введения ингарона. Было исследовано 12 больных (8 женщин и 4 мужчин) диссеминированной меланомой кожи, имеющих гистологическое подтверждение диагноза. Клинический ответ определялся по критериям для солидных опухолей (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors - RECIST). У 3 больных была достигнута частичная (>50%) регрессия опухоли (4P), у 2 отмечена стабилизация болезни (СЗ), у остальных наблюдали прогрессию заболевания (ПЗ).

Выделение лимфоцитов и оценка доли погибших клеток.

У больных брали кровь из вены до начала, спустя 8 дней после начала первого цикла химиотерапии и после завершения первого терапевтического цикла (30 дн). Лимфоциты выделяли из венозной гепаринизированной крови больных сразу после получения образцов. Кровь наслаивали на разделяющую смесь фиколла-верографина (р= 1.078 г/смЗ) и центрифугировали при комнатной температуре 800 g, 30 мин. Выделенные лимфоцита суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей L-глутамин 3 мг/мл, 20% фетальную сыворотку, антибиотики, ФГА 10 мкг/мл. Часть лимфоцитов исследовали сразу после их выделения, часть культивировали в течение 48 ч при 37 °С. Погибшие клетки определяли по выпетливанию нуклеоида из спонтанно пермеабилизованных клеток. Для этого клетки суспендировали в растворе низкоплавкой агарозы при 37 °С, суспензию наносили на предметное стекло (30 мкл) и накрывали покровным стеклом. После застывания геля покровное стекло удаляли и слайд помещали в метанол при комнатной температуре. Дегидратированный слайд высушивали на воздухе, окрашивали красителем Sybr-Green и микроскопировали в режиме флуоресценции. Определяли долю пермеабилизованных клеток, имеющих характерное гало из петель нуклеоида, окаймляющего клетку.

Определение повреждения ДНК методом комет.

Использовали два варианта метода - нейтральный для оценки уровня поврежденности двунитевой ДНК (сЬДНК-кометы) и щелочной, для определения однонитевых разрывов ДНК (ss/ЩК-кометы). В первом случае 100 мкл суспензии клеток (0.5-1x106 в PBS (Phosphate buffered saline)) смешивали с 200 мкл 1%-ного раствора легкоплавкой агарозы тип IV (Sigma). Смесь (30 мкл) наносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом (18x18 мм). После застывания геля стекло удаляли и слайд погружали в лизирующий раствор, содержащий 2.5 М NaCl, 30 mM EDTA, 10 тМ Tris-НС1, 1% лаурилсаркозинат, 0.03 мг/мл протеиназы К, pH 8.0. Спустя 12-16 ч

лизиса при 37 °С слайды погружали в раствор, содержащий 2.5 MNaCl, 0.1 М EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1% Triton Х-100, 1% DMSO, рН 10 на > 1 ч в холодильнике. Слайды помещали в горизонтальную камеру для электрофореза, заполненную ТАЕ-буфером (Tris-acetate-EDTA) (рН 8.3) и выдерживали в течение 40 мин в холодильнике. Электрофорез проводили при 0.56 В/см в течение 40 мин. После электрофореза слайды погружали в охлажденный раствор 0.3 М NaOH, 1 mM EDTA (15 мин), трижды ополаскивали 0.4 М Tris-HCl, рН 7.4 и 1 раз в PBS. Слайды дегидратировали метанолом и высушивали на воздухе. После высыхания и окрашивания Sybr-Green слайды микроскопировали во флуоресцентном режиме. Для определения однонитевых разрывов слайды после инкубации в лизирующем буфере при рН 10 помещали в электрофоретическую камеру, заполненную охлажденным раствором 0.3 М NaOH, 1 mM EDTA, рН > 13. После инкубации в течение 40 мин в холодильнике, проводили электрофорез 0.75 В/см, 22 мин. После электрофореза слайды ополаскивали раствором 0.4 М Tris-HCl и проводили те же операции, что и для нейтральных комет. В процессе микроскопии накапливали изображения комет в памяти компьютера и обсчитывали их по программе CASP. Показателем поврежденности ДНК служил параметр момент хвоста комет, mt (Olive tail moment).

Оценка эффективности механизмов репарации BER и MMR.

Для оценки эффективности механизма эксцизии оснований (BER) измеряли способность лимфоцитов больных до химиотерапии элиминировать АР-сайты, индуцированные в них тестирующим воздействием метилнитрозомочевины (МНМ). Для этого в суспензию лимфоцитов в культуральной среде добавляли МНМ до концентрации 50 мкМ. В параллельную пробу вместе с МНМ добавляли метоксиамин (MX, 10 мкМ), блокирующий репарацию. Суспензии инкубировали 20 ч при 37 °С и измеряли повреждения в ДНК, используя щелочной вариант метода комет. Показателем эффективности BER было отношение mt комет лимфоцитов после добавления МНМ+МХ к mt комет лимфоцитов после добавления только МНМ (mtMHM+Mx/ mtMHM)-

Эффективность MMR оценивали по количеству вторичных двунитевых разрывов ДНК, формирующихся спустя 24-48 ч после тест-воздействия метилнитрозомочевиной на стимулированные лимфоциты. Кратко метод включал в себя стимуляцию лимфоцитов (48 ч) в среде, содержащей BrUdR (100 мкМ); обработку клеток метилнитрозомочевиной (50 мкМ) с одновременным подавлением 06-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) с помощью 06-бензилгуанина (OóbzG, 100 мкМ). Спустя 24-48 ч после добавления агентов определяли количестко двунитевых разрывов, используя нейтральный вариант метода ДНК-комет. Для визуализации делящихся клеток на влажные слайды после нейтрализации раствором 0.4 М Tris-HCl (рН 7.4) наносили раствор анти-BrUdR антител в PBS (30 мкл, 20 мкг/мл), накрывали покровным стеклом и инкубировали 1 ч в темноте при

комнатной температуре. После инкубации стекло удаляли и слайд трижды отмывали холодным PBS. Последнюю отмывку проводили PBS, содержащим 2% фетальную сыворотку. После удаления излишков влаги с поверхности слайда, наносили 30 мкл PBS, содержащие 10 мкг/мл FITC-коньюгат вторичного антитела, накрывали покровным стеклом и инкубировали 1 ч в темноте. После удаления покровного стекла слайды отмывали в PBS, дегидратировали в метаноле, высушивали, окрашивали иодистым пропидием (1 мкг/мл) и микроскопировали в режиме флуоресценции с набором фильтров для FITC. Кометы, формируемые делящимися клетками, содержали BrUdR и FITC и флуоресцировали в зеленой области. Покоящиеся клетки были окрашены оранжевым цветом. Эффективность MMR характеризовалась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками после тест-обработки и необработанными (mtMHM+o6bzG/nito6bzG)-

Иммуноцитохимическое определение экспрессии белков.

Лимфоциты иммобилизовали в низкоплавкой агарозе в виде тонкого слайда на поверхности предметного стекла. Клетки фиксировали, инкубируя слайды 20 мин в 3%-ном формальдегиде в PBS в холодильнике. Затем пермеабилизовали в 0.2% тритоне Х-100 в PBS (20 мин в холодильнике). Слайды, предназначенные для определения уровня FasR, процедуре пермеабилизации не подвергались. После каждой процедуры слайды трижды отмывались в PBS, последняя отмывка после первичного антитела проводилась в PBS, содержащем 2% феталыгой сыворотки. Обработка слайдов антителами проводилась как описано выше. Контролем служили слайды с иммобилизованными клетками, которые подвергались такой же обработке, но без первичных антител. В конце слайды дегидратировали в метаноле, высушивали и хранили в темноте. FITC-флуоресцирующие клетки фотографировали, полученные изображения анализировали на компьютере. Регистрировали флуоресценцию не менее 150 клеток в каждом слайде и определяли долю FITC-позитивных клеток. Представляемым показателем уровня экспрессии каждого белка было произведение средней флуоресценции одной клетки, умноженной на долю FITC-позитивных клеток в каждом слайде.

В таблице 1 приведены все использованные в данной работе параметры и методы их определения.

Статистический анализ.

Оценка линейной корреляции проводилась в Origin 6.0 методом наименьших квадратов. Для определения достоверности различий в 2-х группах использовался критерий Манна - Уитни - Вилкоксона. Для оценки эффективности маркеров были выбраны стандартные параметры -чувствительность (TPF - true-positive fraction) и 1-специфичность (FPF - false-positive fraction).

Табл. 1. Набор исследованных параметров и методов их определения. BER -эксцизионная репарация оснований, MMR - коррекция неспаренных оснований,, АР-сайты - апурин/апиримидиновые сайты, ХТ- химиотерапия, МНМ - метилнитрозолючевина, MX - метоксиамин, ФГА

Определяемый параметр Метод определения

Поврежденность ДНК После ХТ(2 ч., 48 ч., 30 сут.) или тест-воздействия МНМ, одно-, двунитевые разрывы ДНК, АР-сайты. Метод ДНК комет.

Эффективность BER 2 ч. после тест-воздействия МНМ±МХ, однонитевые разрывы ДНК

Эффективность MMR 48 ч. после тест-воздействия МНМ + [ФГА-стимул.+06ВгС+Вги<Ж], двунитевые разрывы ДНК

Уровень hMLHl и hMSH2 Иммуноцитохимия 48 ч. после ФГА-стимуляции

Уровень FasR Иммуноцитохимия после 48 ч. инкубации

Индекс пролиферации Иммуноцитохимия 48 ч. после ФГА-стимуляции+ ВгШЯ

Цитотоксичность Релаксация нуклеоида через 2 ч. после ХТ

Результаты.

1. Повреждение явДНК и её репарация с участием механизма ВЕЯ.

В результате одного цикла ЛДЦИ-химиотерапии в лимфоцитах пациентов накапливаются повреждения ДНК, которые значительно увеличивают электрофоретическую подвижность однонитевой ДНК. Как видно из рисунка 1, обработка метилнитрозомочевиной также увеличивает электрофоретическую подвижность хяДНК. В обоих случаях возникшие повреждения ббДНК с большей или меньшей скоростью репарируются (Рис.1). Это позволило оценить в лимфоцитах больного фактическую эффективность репарации повреждений бзДНК, индуцированных одним циклом ЛДЦИ-терапии, и эффективность механизма ВЕЯ. Эффективность репарации ббДНК определялась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками через 2ч. и 48 ч. после х/т - т12ч /ш148ч. Для оценки эффективности механизма ВЕЯ в лимфоцитах использовался метод с использованием ингибитора репарации ВЕЯ метоксиамина (МХ). Показателем эффективности ВЕЯ, определяемой до химиотерапии, в этом случае было отношение пи комет лимфоцитов после добавления смеси МНМ+МХ к пи комет лимфоцитов после добавления только МНМ (пимнм+мх/ пИмпмгч)-

Связь между эффективностью репарации повреждений БвДИК и эффективностью ВЕЯ, представленная на рисунке 2а, с высокой достоверностью (Я2 = 0.89, р<0.001) описывается линейной зависимостью.

Это говорит о том, что в удалении повреждений бзДНК, возникших в результате химиотерапии, принимает участие механизм ВЕЯ.

^ 50 Е

* 40 П

(Л ..

« 30

5 20

£. 10

с 0

й-

¡у-

¡I

§>о

V2.

-о

4h-

V •о

0 5 10 15 20 46 48 Время инкубации in vitro, ч

Рис. 1. Динамика поврежденности si-ДНК в процессе инкубации лимфоцитов in vitro.

1 — интактные лимфоциты, 2- после обработки метилнитрозомочевиной (50 мкМ) in vitro, 3- лимфоциты, выделенные из крови больного после I цикла XT.

2. Повреждение я.яДНК и механизм ВЕЯ не коррелируют с клиническим ответом на ЛДЦИ-терапию.

Полученные результаты обнаруживают значительную межиндивидуальную вариабельность эффективности ВЕЯ и степени повреждения зб-ДНК в лимфоцитах больных в результате химиотерапии (Рис. Зг). Исходные повреждения (2 ч. после химиотерапии) удаляются с различной эффективностью в лимфоцитах всех больных (48 ч. после ХТ). Спустя месяц после первого цикла у трех больных наблюдали полное восстановление целостности бэ-ДЖ (Рис. Зг). На рис. За-в приведены микрофотографии характерных ББ-ДШС-комет из лимфоцитов больных до, спустя 2 ч. и 30 суток после 1 цикла химиотерапии.

ф , sf

<= Е 1°-го ®

ш fr ■8-о

Р? = 0.89, р < 0.001

I ! 1-1-Г—'-1 ' I---1-

1.0 1.5 10 2,5 3,0 3,5

Эффективность ВЕЯ, отн.ед.

—I— 4.0

§ ?

с <в

I 5 '8

„ X О Ct

5 « а-о

t ш ■вв-сз

R =0.96, р< 0.0001

1 2 3

Эффективность MMR, отн.ед.

Рис. 2. Зависимость репарации повреждений ss- и ds-ДНК от эффективности систем репарации BER и MMR.

а. Корреляция скорости удаления повреждений ssДНК в лимфоцитах за 48ч после 1 цикла химиотерапии с активностью механизма BER в лимфоцитах 7 пациентов. Эффективность репарации ssflHK определялась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками через 2ч. и 48 ч. после ХТ -mt24/mt4a4.

б - Корреляция накопления вторичных повреждений dsflHK спустя 48 ч после I цикла химиотерапии с эффективностью механизма MMR в лимфоцитах 11 больных меланомой. Эффективность накопления вторичных повреждений dsflHK численно равняется отношению моментов хвостов комет, формируемых клетками через 48 ч. после химиотерапии и интактными клетками - mt4S4/mtin,aci.

Принимая во внимание такое единообразие ответа лимфоцитов разных больных, следует ожидать, что повреждения на уровне ss-ДНК (АР-сайты, однонитевые разрывы) и ассоциированный с ними механизм BER вряд ли могут быть хорошими прогностическими маркерами ЛДЦИ-протокола химиотерапии.

Подтверждение этого предположения получено на 5 пациентах. Связь эффективности удаления поврежденности ss-ДНК с типом клинического ответа больных на химиотерапию представлена на рисунке Зд. Эффективность репарации повреждений вэДНК определялась на основании данных, приведенных на рис. Зг, и численно равнялась отношению моментов хвостов комет, формируемых клетками через 2ч. и 48 ч. после XT - mt2., /mt484. Результат демонстрирует отсутствие разницы в эффективности репарации поврежденности ss-ДНК в лимфоцитах пациентов с различными клиническими ответами на ЛДЦИ-терапию (TPF = 0 , FPF = 0.67). Поскольку, как показано ранее рисунке 2а, эффективность репарации поврежденности ss-ДНК линейно связана с эффективностью BER, то последний параметр также не может быть прогностическим маркером данного протокола химиотерапии.

3. Двунитевые разрывы после химиотерапии связаны с активацией механизма MMR.

Несмотря на высокий уровень повреждения ssflHK, химиотерапия не вызывает формирование двунитевых разрывов (Рис. 4а). Напротив, классический индуктор разрывов ДНК гамма-излучение увеличивает электрофоретическую подвижность ssflHK и сЬДИК Тем не менее, отмечается изменение ds-нуклеоидов: хотя они и сохраняют симметрию, но становятся менее компактными и менее яркими. Такое же различие между ss-и ds-кометами наблюдалось после воздействия на лимфоциты МНМ in vitro.

Эти наблюдения указывают на то, что превалирующим типом повреждений ДНК после химиотерапии являются AP-сайты. АР-сайты трансформируются в однонитевые разрывы в щелочных условиях (в ss-кометах). При нейтральном pH сохраняется целостность фосфодиэфирной цепи ДНК.

Таким образом, в результате лизиса клеток в нейтральном буфере формируются разрыхленные, симметричные ds-нуклеоиды, ДНК в которых не мигрирует в электрическом поле. На рис. 4 б-г приведены гистограммы распределения клеток по моментам хвостов ds-комет и микрофотографии соответствующих комет через 2 ч. после химиотерапии, через 48 ч., спустя 30 суток. На рис. 4а приведена динамика накопления вторичных двунитевых разрывов за этот период времени. Только спустя 48 ч. после химиотерапии в лимфоцитах формируются двунитевые разрывы ДНК, и наблюдается миграция dsflHK и формирование хвоста ds-комет. Спустя 30 суток накапливается значительное количество нерепарированных повреждений dsflHK.

ж.

л а 3 а

Я о.

V +

до ХТ

2ч. пост»

<55 ч газа» 30 суг. газет УСТ ХТ

.....................................................-■"•""•

ПБ+СБ ЧР

Рис. 3. Влияние химиотерапии на поврежденность а-ДНК в лимфоцитах больных.

а, б, в - микрофотографии ДНК-комет из лимфоцитов больных до, спустя 2 ч и 30 сут после 1 цикла химиотерапии соответственно; г -поврежденность ¡¡йЫА, выраженная в значениях момента комет (т!) до химиотерапии (ХТ), 2 ч., 48 ч. и 30 сут после ХТ; д — связь между клиническим ответом у 5 больных меланомой и эффективностью репараг^ш ¡¡-разрывов ДНК, вызванных ХТ, в лимфоцитах этих же больных. Эффективность репарсщии повреждений ¡¡ДНК определялась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками через 2ч. и 48 ч. после ХТ - тЬ., /тицч. ПБ~ прогресс заболевания, СБ - стабилизация заболевания, ЧР -частичная ремиссия.

s го

а. х ,

® ь

с О & ^ '

1 о

I ¥

•9- и

л |

Таким образом, была определена эффективность накопления вторичных ds-разрывов. Она представляет собой отношение моментов хвостов комет, формируемых клетками через 48 ч. после химиотерапии и интактными клетками - mt484/mtintact.

Эффективность накопления ДР ДНК в лимфоцитах пациентов после ЛДЦИ-химиотерапии была сопоставлена с эффективностью механизма MMR в лимфоцитах. Эффективность MMR, определяемая до химиотерапии, характеризовалась отношением моментов хвостов комет, формируемых клетками после тест-обработки и необработанными (mtMHM+o6bzo'rnto6bzG)484. Результат такого сопоставления для 11 исследованных больных представлен на рисунке 26. Прослеживается линейная корреляция между эффективностью MMR и степенью деградации dsДHK в лимфоцитах больных, подвергнутых одному циклу химиотерапии. Этот факт отражает с высокой вероятностью (R2=0.96, pO.OOOl) вовлеченность механизма MMR в процесс вторичной деградации ds-ДНК в лимфоцитах пациентов после цикла ЛДЦИ-химиотерапии.

4. Вторичная деградация ds-ДНК коррелирует с клиническим ответом на ЛДПИ-терапию.

Ds-деградация ДНК (и ассоциированная с ней активация механизма MMR) также, как и ss-повреждение ДНК, является вторым исследованным генотоксическим ответом лимфоцитов на химиотерапию. Однако, в отличие от последней, ds-деградация инициируется спустя 48 и более ч. после первого цикла терапии (Рис.4а) и нарастает во времени. Спустя 1 месяц уровень вторичной деградации dsflHK возрастает более чем в 3 раза по сравнению с начальным (Рис. 4а). Корреляция накопления вторичной поврежденности 0бДНК в лимфоцитах с клиническим ответом пациентов на ЛДЦИ-химиотерапию представлена на рис. 5а. Поврежденность dsflHK численно равняется отношению моментов хвостов комет, формируемых клетками через 48 ч. после химиотерапии и интактными клетками - гШ48ч/т1:|тас,.

У пациентов в состояниях прогрессии и стабилизации заболевания обнаружен одинаковый генотоксический ответ лимфоцитов на химиотерапию (практически отсутствие такового). У больных с частично положительным клиническим ответом обнаружена высокая степень вторичной ds-деградации генома лимфоцитов в ответ на химиотерапию (pO.OOOl, TPF= 1, FPF= 0).

5. Уровень экспрессии белков не коррелирует с клиническим ответом.

На рисунках 5 б-г представлена связь между клиническим ответом больных меланомой и тремя исследованными параметрами ответов лимфоцитов на первый курс ЛДЦИ-терапии. Таковыми в данном случае являлись экспрессия основных белков системы MMR, hMLHl и hMSH2, экспрессия проапоптотического рецепторного белка FasR и доля погибших клеток в результате первого цикла химиотерапии. Все параметры определялись спустя 48 ч. после терапии.

Не было обнаружено различий в экспрессии белков системы MMR (Рис.5б) и проапоптотического рецепторного белка FasR (Рис. 5в) среди больных с различным ответом на химиотерапию (р=0.74 , TPF = 0.67, FPF = 0.5 для FasR; р=0.32, TPF = 0.33 , FPF = 0.25 для MLH1+MSH2). Вместе с тем, в ответ на химиотерапию увеличивалась доля погибших и погибающих лимфоцитов в крови больных с положительным ответом на химиотерапию (р=0.025, TPF = 1, FPF = 0.4, Рис. 5г).

Е 7-X 6

2 5-] ш

2 4 el 4 Г)

ГО о

а з ■

(л

тз 21

ДОХТ

р=0,0121

т /1

-1-т7-

2ч 24ч 45ч

ЗОЯ

После хт

¿»•разрывы ДНК, mt

d»-pai pwвы ДНК, mt

dс-pвзрывы ДНК, mt

Рис. 4. Вторичная деградация (кДИК в лимфоцитах больных меланомой после химиотерапии (ХТ) (а). Микрофотографии типичных комет и соответствующие им гистограммы распределений клеток по степени повреждений через 2 ч. (б), спустя 48 ч (в) и 30 суш. (г) после химиотерапии.

S 4

f 3 с

§2

(Л

тз

05 s X

о о с

ПБ

О □

СБ

□

р < 0.0001

р ~ 0.74

р в 0.32

Рис. 5. Корреляция между клиническими ответами больных на химиотерапию и степенью вторичной поврежденности йзДНК в лимфоцитах спустя 48 ч. после химиотерапии (а), уровнем экспрессии белков МЬН1 и М8Н2, определенном через 48 ч. после первого цикла химиотерапии, (б), экспрессией рецептора РобЯ, определенном через 48 ч. после первого цикла химиотерапии, (в) и долей погибших лимфоцитов через 48 ч. после первого цикла химиотерапии (г). Поврежденность ¿бДНК численно равняется отношению моментов хвостов комет, формируемых клетками через 48 ч. после химиотерапии и интактными клетками - пг1мУт(Шас.,. ПБ -прогресс заболевания, СБ - стабилизация заболевания, ЧР - частичная ремиссия.

Обсуждение.

В нашем исследовании мы намеревались оценить эффективность двух важных механизмов репарации ДНК после химиотерапии, BER и MMR, в связи с клиническим ответом больных меланомой. Как показали наши результаты, наилучшая корреляция наблюдалась между клиническим ответом и степенью вторичной ds-деградации ДНК. Природа процесса вторичной ds-деградации ДНК была описана ранее на опухолевых клетках человека, культивируемых фибробластах человека и стимулированных лимфоцитах человека. Была показана его связь с активной системой пострепликативной MMR, приводящей к формированию двунитевого

разрыва в ответ на появление в ДНК аддукта, метилированного по О6 гуанина, под действием алкшшрующих соединений. В данной работе мы показали линейную корреляцию между эффективностью MMR в лимфоцитах и вторичной ds-деградацией ДНК, сопровождающей химиотерапию (Рис. 26), что свидетельствует в пользу участия MMR в процессе деградации ДНК. Однако, отсутствие корреляции экспрессии MLH1 и MSH2 с клиническим ответом (Рис.5а) не позволяет считать эти белки прогностическими маркерами химиотерапии. В литературе данные по экспрессии белков системы MMR противоречивы. В случае проапоптотического FasR тенденция к увеличению его экспрессии у пациентов с положительным ответом на терапию более выражена, но все же не достоверна (р=0.32, Рис.5б). Достоверное увеличение доли погибших лимфоцитов у больных с положительным ответом на химиотерапию (Рис.5г) говорит о том, что, по крайней мере, частично этот ответ ассоциирован с индукцией апоптоза в клетках. Скорее всего, апоптоз инициируется двунитевыми разрывами преимущественно по Fas-независимому пути. Разрывы формируются благодаря активации системы пострепликативной MMR, но без заметного увеличения экспрессии ключевых белков MLH1 и MSH2.

Часто из-за невозможности получения образцов ткани опухоли лимфоциты крови больных представляются удобным и репрезентативным объектом исследований с целью прогноза развития заболевания и клинического ответа на химиотерапию. Такой подход осуществлен и в данной работе. Закономерно возникает вопрос, в какой степени данные, полученные на лимфоцитах крови, могут отражать закономерности и процессы, протекающие в опухолевых клетках. Для ответа на этот вопрос применительно к ЛДЦИ-протоколу рассмотрим схему, представленную на рисунке 6.

На схеме показано, что ЛДЦИ-протокол терапии индуцирует в клетках повреждения ДНК трех типов: апуриновые/апиримидиновые сайты, метилированный по Об гуанин и сшивки ДНК.

АП-сайты формируются главным образом из метилированных по N3 аденина и по N7 гуанина. Сшивки ДНК формируются под действием ломустина и цисплатина и включают в себя внутрицепочечные, межцепочечные сшивки и сшивки ДНК с белками хроматина.

Как показано на рисунке 6, удаление возникших повреждений и репарация ДНК осуществляется тремя механизмами - BER, MMR и NER. Каждый механизм удаляет преимущественно один из возникших типов повреждений, хотя возможно частичное перекрывание механизмов репарации (например, в репарации сшивок могут участвовать элементы системы MMR). До начала репарации лимфоциты и опухолевые клетки одинаково отвечают на вызванный терапией химический стресс.

ЛДЦИ-терапия

Повреждение ДНК

AP-сайты 06meG ДНК-сшивки

BER

MMR * NER *

DS-разрывы ДНК

Алопто;

регрессия опухоли

Рис. 6. Схема реализации цитотоксического эффекта ЛДЦИ-протокола химиотерапии. Цифрами обозначены следующие механизмы: I- р53-зависимая активация Fas, 2 - деградация Bcl-2 в митохондриях, 3 -транслокация AIF из митохондрий в ядро. * - пояснения в тексте.

Теперь рассмотрим участие репарации. На сегодня в клетках меланомы не идентифицированы мутации в генах, кодирующих белки системы BER. Таким образом, активность механизма репарации BER примерно одинакова в клетках меланомы и в лимфоцитах.

Многие опухолевые клетки обнаруживают дефицит системы MMR (колоректальный рак, рак яичников, рак шейки матки и некоторые другие). Дефицит может быть связан как с соматической мутацией, так и с эпигенетическим ингибированием соответствующего промотора. Тем не менее, в клетках меланомы не обнаружены мутации в системе MMR. В тех же случаях, когда дефицит MMR был подтвержден по нестабильности микросателлитов, это не отражалось на клиническом ответе на химиотерапию. Этот путь отмечен одной звездочкой (*), говорящей о возможном источнике различий между опухолевыми клетками и лимфоцитами. Что касается механизма эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) у больных меланомой, то здесь сведений очень мало. Кроме того, из-за большого числа генов, участвующих в этом механизме репарации,

идентификация мутаций или анализ полиморфизма затруднены. Поэтому этот механизм тоже отмечен одной звездочкой, как и в случае MMR.

Таким образом, лимфоциты и опухолевые клетки к этапу формирования двунитевых разрывов ДНК в ответ на химиотерапию приходят с примерно равным успехом. Двунитевые разрывы ДНК являются индуктором апоптоза во всех клетках. Трансляция сигнала от него проходит различными путями. На сегодня известны по крайней мере 3 пути: активация Fas; подавление активности Вс1-2 и транслокация в ядро митохондриального апоптотического фактора AIF (отмечены тремя звездочками ***). Два последних пути связаны с митохондриями. В этой части можно ожидать максимальных различий в ответах опухолевых клеток и лимфоцитов. Это усложняет корреляцию гено- и цитотоксического эффектов на лимфоцитах с токсическим эффектом на опухолевых клетках, который лежит в основании клинического ответа на химиотерапию. И, тем не менее, наши данные свидетельствуют о наличии такой корреляции, что является обнадеживающим фактом, побуждающим к дальнейшим исследованиям.

Выводы.

1. Превалирующим типом повреждений, прослеживаемых на уровне ssflHK после химиотерапии, являются АП-сайты.

2. Эффективность репарации повреждений на уровне ss/JHK после одного цикла ЛДЦИ-терапии линейно зависит от эффективности системы BER. Все повреждения ssflHK в лимфоцитах больных элиминируются к началу следующего цикла терапии, что указывает на низкую прогностическую значимость этих дефектов и механизма BER. Тем не менее, нельзя полностью исключить антиапоптотическое влияние BER, снижающее эффективность химиотерапии.

3. Двунитевые разрывы ДНК в лимфоцитах больных появляются только спустя 48 ч. Эта вторичная деградация с1эДНК коррелирует с эффективностью механизма MMR в лимфоцитах.

4. Уровень вторичной деградации скДНК в лимфоцитах пациентов, подвергнутых химиотерапии, является независимым прогностическим показателем эффективности ЛДЦИ-терапии меланомы кожи.

5. Эффективность накопления вторичных повреждений dsflHK в ответ на химиотерапию коррелирует с ответом на тест-воздействие метилнитрозомочевиной, что позволяет прогнозировать клинический ответ больных на химиотерапию по результатам тестирования ответа лимфоцитов больных in vitro до начала химиотерапии.

7. Не обнаружено достоверных различий в экспрессии белков системы MMR и FasR среди больных с различным ответом на химиотерапию.

8. В ответ на химиотерапию достоверно увеличивалась доля погибших и погибающих лимфоцитов в крови больных с положительным ответом на химиотерапию.

Практические рекомендации.

Проведение исследований с определением поврежденности ds-ДНК в лимфоцитах крови больных меланомой кожи целесообразно для оценки прогноза ответа опухоли на ЛДЦИ-протокол химиотерапии. Их использование позволяет:

- выделять группы больных с повышенным риском прогрессировать заболевания и с ожидаемым позитивным ответом на химиотерапию;

- индивидуализировать назначение адъювантной терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. D. N. Artamonov, V. A. Tronov, L. U. Dederer, and L. В. Gorbacheva.

Correlation between Responses of Peripheral Blood Lymphocytes of Melanoma Patients to Chemotherapy and Methylnitrosourea Treatment in vitro. Annals of Oncology, Volume 20, Supp. 3, (2009), p, 39.

2. B.A. Тронов, Д.Н. Артамонов, Л.Ю. Дедерер, М.Е. Абрамов, М.Р. Личиницер, Л.Б. Горбачева.

Ответы лимфоцитов крови больных меланомой на химиотерапию и тест-воздействие метилнитрозомочевиной. Российский биотерапевтический журнал, Т. 8, №2, (2009), 23.

3. D.N. Artamonov, V.A. Tronov, L.B. Gorbacheva.

Efficiency of DNA Repair Mechanisms in Blood Lymphocytes of Melanoma Patients as Possible Prognostic Factor of Chemotherapy. Book of abstracts. Tenth International Summer School on Biophysics, Sept.19- Oct.Ol, Rovinj, Croatia, (2009), 80.

4. Тронов В.А., Артамонов Д.Н., Горбачева Л.Б. Генетические маркеры меланомы. Генетика. Т. 46, №2, (2010), 168-179.

5. В.А. Тронов, Д.Н. Артамонов, М.Е. Абрамов, М.Р. Личиницер, Л.Б. Горбачева.

Ответ лимфоцитов крови больных меланомой на химиотерапию. Корреляция с клиническим ответом. Российский биотерапевтический журнач, Т. 9, №2, (2010), 46.

6. Д.Н. Артамонов, В.А. Тронов, Л.Б.Горбачева.

Одно- и двухнитевые разрывы ДНК и эффективность их репарации в лимфоцитах крови больных меланомой кожи как прогностический фактор терапии, III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика-2010" 21-25 июня 2010 г. Сборник материалов, 175177.

7. Тронов В.А., Артамонов Д.Н., Абрамов М.Е., Личиницер М.Р., Горбачева Л. Б.

Связь эффективности репарации ДНК, уровня экспрессии белков МЬН1, М8Н2 и НаБЯ в лимфоцитах больных диссеминированной меланомой кожи с клиническим ответом на химиотерапию. Вопросы онкологии, 1.51, №2, (2011), 181-187.

8. Тронов В. А., Артамонов Д.Н., Абрамов М.Е., Горбачева Л.Б.

Эффективность репарации ДНК лимфоцитов, их гибель, а также экспрессия белков МЫП, МБН2, РазЯ как факторы прогноза клинического ответа на химиотерапию больных диссеминированной меланомой. Цитология. Т. 53, №1, (2011), 10-16.

Подписано в печать: 12.02.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 775 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Артамонов, Дмитрий Николаевич

1. Введение.

2. Обзор литературы по теме.

2.1 .Механизмы цитотоксичности препаратов, применяемых в химиотерапии меланомы.

2.2. Гены системы коррекционной репарации как маркеры меланомы.

2.3. Изменение генов, контролирующих Fas-сигналинг при меланоме.

3. Собственные исследования.

3.1. Материалы и методы.

3.1.1. Характеристика больных и процедура химиотерапии.

3.1.2. Выделение лимфоцитов.

3.1.3. Определение повреждения ДНК методом комет.

3.1.4. Оценка эффективности механизмов репарации BER и MMR.

3.1.5. Иммуноцитохимическое определение экспрессии белков.

3.1.6. Определение пролиферативного индекса и доли погибших клеток.

3.1.7. Статистический анализ.

3.2. Результаты.

3.2.1. Повреждение ss/IHK и ее репарация с участием механизма

3.2.2. Двунитевые разрывы после химиотерапии связаны с активацией механизма MMR.

3.2.3. Повреждение ss,HHK и механизм BER не коррелируют с клиническим ответом на LDCI-терапию.

3.2.4. Вторичная деградация ds-ДНК коррелирует с клиническим ответом на LDCI-терапию.

3.2.6.Сравнение ответов лимфоцитов на химиотерапию и тест-воздействие МНМ в течение 7 циклов.

3.3 Обсуждение.

4. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-клеточные маркеры лимфоцитов больных меланомой как прогностический показатель клинического ответа на химиотерапию"

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

Меланома, высоко агрессивное неопластическое заболевание, поддается лечению на начальных стадиях. По мере прогрессии заболевания эффективность лечения снижается. На ранних стадиях развития меланома поддается хирургическому лечению.

На стадии метастазирования меланома характеризуется высокой лекарственной устойчивостью и высокой летальностью. Ведущее место среди терапевтических процедур, применяемых при меланоме, занимает цитотоксическая химиотерапия. Монофункциональные алкилирующие агенты дакарбазин, прокарбазин а также нитрозомочевины, кармустин и ломустин, входят в состав стандартного протокола лечения меланомы (Gogas et al., 2007). Однако частота положительного ответа больных в случае терапии только дакарбазином или комбинацией дакарбазина с кармустином и ломустином не превышает 20% (Anderson et al., 1995; Chapman et al., 1999; Wagner et al., 2000, Mays et al., 1999). Две исследовательские стратегии направлены на преодоление низкой эффективности химиотерапии: разработка новых терапевтических подходов и поиск маркеров, позволяющих прогнозировать индивидуальную устойчивость/ чувствительность больных к химиотерапии.

Большинство меланом адекватно диагностируется с использованием гистологических критериев. Наиболее часто используемыми показателями для прогноза меланомы кожи являются максимальный вертикальный размер опухоли, глубина инвазии и наличие или отсутствие изъязвлений (Balch et al., 2001).

Однако до сих пор отсутствуют неинвазивные маркеры, позволяющие с приемлемой вероятностью прогнозировать индивидуальный терапевтический ответ, хотя потребность в них высока. Пилотное исследование на лимфоцитах с целью сопоставления с клиническим ответом' на химиотерапию было ранее проведено на 25 больных различными онкологическими заболеваниями (из них 11 - опухоль Ходжкина) в ходе химиотерапии, использующей' различные- схемы, в зависимости от заболевания (Nadin et all, 2006). В работе (Sobol et al:, 2006) исследовали корреляцию между репаративными механизмами MMR и BER в клетках опухолевой ткани, извлеченной из больных меланомой и клиническим ответом на монохимиотерапию пациентов (дакарбазин и темозоломид).

Активность репарации оценивали иммуноцитохимически по уровню экспрессии белков системы MMR (MLH1 и MSH2) и ДНК-полимеразы, участвующей в механизме BER. Однако авторам не удалось обнаружить корреляции ни в одном случае заболевания ни одного, из исследованных ими биомаркеров. Высокая экспрессия генов ДНК репарации в клетках меланомы ассоциировалась с неблагоприятным развитием заболевания и повышенной вероятностью метастазирования (Kauffmann, et al., 2008).

С большим основанием предполагается, что толерантность опухоли к химиотерапии связана с дефектами в одном из механизмов репарации ДНК — коррекции неспаренных оснований (mismatch repair, MMR). Это предположение было подтверждено экспериментально в работах, выполненных на культивируемых клетках, полноценных и дефицитных по MMR (Тронов, 2006). Совокупность полученных данных позволила сделать вывод о том, что вторичные разрывы ДНК в пролиферирующих клетках в ответ на действие метилирующего агента формируются в результате функционирования механизма MMR. В таком случае эти «отсроченные» вторичные разрывы могут быть показателем активности системы MMR. Это позволяет предположить, что вторичные разрывы, индуцированные в геноме стимулированных лимфоцитов, могут быть биофизическим маркером как самого заболевания (ассоциированного с дефицитом MMR), так и эффективности терапии. В настоящей работе проводилось изучение эффективности MMR в сочетании с другими показателями, такими как активность эксцизионной репарации оснований (BER) и экспрессия FasR.

Часто из-за невозможности получения образцов ткани опухоли лимфоциты крови больных представляются удобным и репрезентативным-объектом исследований с целью прогноза развития заболевания и клинического ответа на химиотерапию (Nadin et al., 2006; Sobol et al., 2006).

Предполагается, что условием, благоприятствующим максимальной эффективности химиотерапии, было бы подавление активности BER и активная MMR в опухолевых клетках.

Цель работы состояла в экспериментальной проверке этого утверждения путем сопоставления клеточных показателей активности' BER, MMR; уровня экспрессии белков MLH1, MSH2, FasR и доли погибших клеток с клиническим ответом больных на стандартную цитотоксическую химиотерапию. Все показатели измеряли в лимфоцитах кровигпациентов дои после 1- цикла химиотерапии и оценивали как возможные прогностические показатели химиотерапии больных диссеминированной меланомой: Протокол химиотерапии включаал в себя ломустин, дакарбазин, цисплатин и1 ингарон (интерферон гамма) (ЛДЦИ-протокол). Такое сочетание лекарств обусловливает появление двух доминирующих видов повреждений ДНК в клетках - метилированных оснований и' сшивок (внутри-, межцепочечных ДНК-сшивок и сшивок ДНК-белок). Эти повреждения удаляются, прежде всего, тремя механизмами репарации - BER, MMR и NER (эксцизионная репарация нуклеотидов). BER'протекает через формирование однонитевых разрывов до репликации; MMR активируется после 1 -2 циклов репликации и ассоциирован с накоплением двунитевых разрывов ДНК; механизм NER, удаляющий сшивки, связан с формированием временных двунитевых разрывов ДНК. Таким образом, механизм BER может быть идентифицирован по динамике однонитевых разрывов в ДНК лимфоцитов в первые часы после воздействия. В этот же период по накоплению двунитевых разрывов в ДНК может быть охарактеризован механизм NER. Механизм MMR идентифицируется по отсроченному от воздействия (48 ч) формированию двунитевых разрывов в стимулированных к делению лимфоцитах. В связи с этим была поставлена цель работы.

Основные задачи исследования.

- Определить типы повреждений ДНК в лимфоцитах в результате 1-го цикла ЛДЦИ-протокола терапии.

- Изучить эффективность механизмов репарации ядерной ДНК в лимфоцитах крови больных меланомой.

- Сравнить показатели ответа лимфоцитов на химиотерапию и тест-воздействие МНМ.

- Определить зависимость между скоростью удаления однонитевых разрывов

ДНК в лимфоцитах после химиотерапии и эффективностью системы BER.

- Определить связь между скоростью накопления двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах после химиотерапии и эффективностью системы MMR.

- Оценить возможность использования повреждения ДНК, эффективности репарации (BER и MMR) как прогностических показателей химиотерапии больных диссеминированной меланомой.

Научная новизна.

- Разработан метод оценки эффективности дорепликативного механизма BER в лимфоцитах с использованием ингибитора метоксиамина (MX).

Показано, что межиндивидуальные вариации эффективности BER не влияют на цитотоксический ответ лимфоцитов и клинический ответ больных на химиотерапию.

- Разработан метод оценки эффективности пострепликативного механизма MMR в лимфоцитах с помощью BrUdR-меченых с^ДНК-комет.

Научно-практическая значимость.

Установлено, что функциональная эффективность системы MMR и связанное ней накопление dsДHK разрывов являются прогностическими маркерами клинического ответа опухоли и могут быть использованы в качестве дополнительного фактора прогноза с учетом клинико-гистологических параметров. Применение данного критерия в клинической практике позволяет стратифицировать больных с учетом потенциального развития заболевания и может использоваться для назначения адъювантной терапии.

Положения, выносимые на защиту.

- Разработаны методы оценки эффективности в лимфоцитах больных меланомой дорепликативного механизма BER и пострепликативного механизма MMR.

- Уровень вторичной деградации ds,HHK в лимфоцитах пациентов, подвергнутых химиотерапии, является независимым прогностическим маркером ЛДЦИ-протокола химиотерапии. Этот показатель включает в себя как эффективность MMR, так и частично эффективность механизма эксцизионной репарации нуклеотидов (NER).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Артамонов, Дмитрий Николаевич

4. Выводы.

1. Превалирующим типом повреждений, прослеживаемых на уровне ss/lHK после химиотерапии, являются АП-сайты.

2. Эффективность репарации этих повреждений после одного цикла ЛДЦИл терапии, линейно зависит от эффективности системы BER (R =0.89, pcO.OOl). Однако, несмотря на значительную межиндивидуальную вариацию этого параметра, все повреждения эбДЕЖ в лимфоцитах больных элиминируются к началу следующего цикла терапии, что указывает на низкую прогностическую значимость этих дефектов и механизма BER (TPF = 0 , FPF = 0.67). Тем не менее, нельзя полностью исключить антиапоптотическое влияние BER, снижающее эффективность химиотерапии.

3. Повреждения однонитевой ДНК вносят незначительный вклад в цитотоксический эффект химиотерапии (гибель лимфоцитов in vitro).

4. Сразу после химиотерапии в лимфоцитах больных не обнаруживаются ds-разрывы ДНК, но они появляются спустя 48 ч. Эта вторичная деградация ds/IHK коррелирует с эффективностью механизма MMR в лимфоцитах (R2=0.96, pO.OOOl).

5. Уровень вторичной деградации ds,ZlHK в лимфоцитах пациентов, подвергнутых химиотерапии, является независимым прогностическим: показателем эффективности ЛДЦИ-терапии меланомы кожи, (р < 0.0001, TPF = 1, FPF = 0).

6. Исследованный показатель лимфоцитов (эффективность накопления вторичных повреждений ёэДНК) в ответ на химиотерапию коррелирует с ответом на тест-воздействие метилнитрозомочевиной (R = 0.96, р = 3-10 ), что открывает возможность прогнозировать клинический ответ больных на химиотерапию по результатам тестирования ответа лимфоцитов больных in vitro до начала химиотерапии.

7. Не обнаружено достоверных различий в экспрессии белков системы MMR и FasR среди больных с различным ответом на химиотерапию (р=0.74 , TPF = 0.67, FPF = 0.5 для FasR; р=0.32, TPF = 0.33 , FPF = 0.25 для mlh1+MSH2).

8. В ответ на химиотерапию достоверно увеличивалась доля погибших и погибающих лимфоцитов в крови больных с положительным ответом на химиотерапию (р=0.025, TPF = 1, FPF = 0.4).

Практические рекомендации.

- выделять группы больных с повышенным риском прогрессирования заболевания и с ожидаемым позитивным ответом на химиотерапию;

- индивидуализировать назначение адъювантной терапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Артамонов, Дмитрий Николаевич, Москва

1. Тронов В.А., Артамонов Д.Н., Горбачева Л.Б. Генетические маркеры меланомы. Генетика. Т 46, №2, (2010), 168-179.

2. Тронов BA, Крамаренко ИИ, Смирнова ТД, Терехов СМ Сравнение гено- ц цитотоксических эффектов метилнитрозомочевины на линиях клеток:^ дефицитных и профицитных по коррекционной репарации ДНК. Цитология; 2006. Т. 48 (1): 19-27.

3. Тронов В.А., Крамаренко И.И., Карпухин A.B. Рак толстой кишки: дефицц-^ репарации, нестабильность генома, устойчивость к апоптозу, оценка pncic^ заболевания // Вопросы онкологии. 2005. Т. 52 (2). С. 159-166.

4. Aebi, S.; Kurdi-Haidar, B.; Gordon, R.; Cenni, B.; Zheng, H.; Fink,D.; Christen, R.D.; Boland, C.R.; Koi, M.; Fishel, R.; Howell, S.B. Loss of DNA mismatch repair in acquired resistance to cisplatin. Cancer Res. 1996, 56, 3087-90.

5. Anderson C.M., Buzaid A.C., Legha S.S. Systemic treatments for advanced cutaneous melanoma // Oncology (Huntingt).-1995.-Vol. 9.-P. 1149-1158.

6. Aquilina, G.; Ceccotti, S.; Martinelli, S.; Hampson, R.; Bignami, M. N-(2-chloroethyl)-N'-cyclohexyl-N-nitrosourea sensitivity in mismatch repair-defective human cells. Cancer Res. 1998, 58, 135-41.

7. Aquilina, G.; Crescenzi, M.; Bignami, M. Mismatch repair, G(2)/M cell cycle arrest and lethality after DNA damage. Carcinogenesis 1999, 20, 2317-26.

8. Balch C.M., Soong S.J., Gershenwald J.E., et al. Prognostic factor analysis of 17,600 melanoma patients: Validation of the American Joint Committee on Cancer melanoma staging system // J. Clin. Oncol. 2001. V. 19. P. 3622-3634.

9. Bedi A., Pasricha P.J., Akhtar A.J., et al. Inhibition of apoptosis during development of colorectal cancer // Cancer Res.-1995.-Vol. 55.-P. 1811-1816.

10. Beranek D.T. 1990. Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation with monofunctional alkylating agents.Mutat. Res. 231 : 11-30.

11. Bignami M., O'Driscoll M., Aquilina G., Karran P. Unmasking a killer: DNA 06-methylguanine and the cytotoxicity of methylating agents // Mut. Res. 2000. V. 462. P. 71-82.

12. Boulikas, T.; Vougiouka, M. Recent clinical trials using cisplatin, carboplatin and their combination chemotherapy drugs. Oncol. Rep. 2004, 11, 559-95.

13. Boyd JC. Mathematical tools for demonstrating the clinical usefulness of biochemical markers. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1997;227:46-63.

14. Bucci B., D'Agnano I., Amendola D., et al. Myc down-regulation sensitizes melanoma cells to radiotherapy by inhibiting MLH1 and MSH2 mismatch repair proteins // Clin. Cancer. Res. 2005. V. 11(7). P. 2756-67.

15. Castiglia D., Bernardini S., Alvino E. et al. Concomitant activation of Wnt Pathway and Loss of Mismatch Repair Function in human melanoma // Genes, Chromosomes & Cancer. 2008. V. 47. P. 614-624.

16. Chapman P.B., Einhorn L.H., Meyers M.L., et al. Phase III multicenter randomized trial of the Dartmouth regimen versus dacarbazine in patients with metastatic melanoma// J. Clin. Oncol.-1999.-Vol. 17.-P. 2745-2751.

17. Chaney, S.G.; Sancar, A. DNA repair: enzymatic mechanisms and relevance to drug response. J. Natl. Cancer Inst. 1996, 88, 1346-60.

18. Chen, W.; Jinks-Robertson, S. The role of the mismatch repair machinery in regulating mitotic and meiotic recombination between diverged sequences in yeast. Genetics 1999, 151, 1299-313.

19. Drablos, F.; Feyzi, E.; Aas, P.A.; Vaagbo, C.B.; Kavli, B.; Bratlie, M.S.; Pena-Diaz, J.; Otterlei, M.; Slupphaug, G.; Krokan, H.E. Alkylation damage in DNA and RNA-repair mechanisms and medical significance. DNA Repair 2004, 3, 1389407.

20. Eigentler T., Garbe C. Malignant melanoma: classification and staging of malignant melanoma // Front Radiat Ther Oncol. 2006. V. 39. P. 149-58.

21. Fink, D.; Nebel, S; Aebi, S.; Zheng, H.; Kim, H.K.; Christen, R.D; Howell, S.B. Expression of the DNA mismatch repair proteins hMLHl and hPMS2 in normal human tissues. Br. J. Cancer 1997, 76, 890-3.

22. Fink, D.; Nebel, S.; Aebi, S.; Zheng, H.; Cenni, B.; Nehme, A.; Christen, R.D.; Howell, S.B. The role of DNA mismatch repair in platinum drug resistance. Cancer Res. 1996, 56, 4881-6.

23. Friedman H.S., Keir S., Pegg A.E., Houghton P.J., Colvin O.M., Moschel R.C., Bigner D.D., Dolan M.E. 2002. 06-Benzylguanine-mediated enhancement of chemotherapy. Mol. Cancer Ther. 1: 943-948.

24. Friesen,C., Herr,I., Krammer,P. H., and Debatin,K-M. Involvement of th.^^. (APO-l/Fas) receptorfligand system in drug-induced apoptosis in leukemic cells // Nat. Med. V. 2. P. 574-577.

25. Fuchs H., Posovszky C., Lahr G., et al. Residual CD95-Pathway Fuixc^-tion in Children with Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome is independ^^^ from clinical state and genotype of CD95 mutation // Pediatr. Res. 2009. V. 65(^> ^

26. Fulda S., Sieverts H., Friesen C., et al. The CD95 (APO-lIFas) system xixediates drug-induced apoptosis in neuroblastoma cells // Cancer Res. 1997. V. 57. 3823 29.

27. Gail MH. Some statistical methods for immunodiagnostic cancer tests. Ittlrnuno| Ser. 1990;53:13-25.

28. Garcia J.J., Kramer M.J., O'Donnell R.J., Horvai A.E. Mismatch repaid . •1. Ar proteinexpression and microsatellite instability: a comparison of clear cell sarcoma Gf parts and metastatic melanoma // Modern Pathology. 2006. V. 19. P. 950—957

29. Gogas H,J., Kirkwood J.M., SondakW.K. Chemotherapy for metastatic Hielanoma //Cancer.-2007.-Vol. 109.-P. 455-464.

30. Hansen R.J., Nagasubramanian R., Delaney S.M., Samson L.D., Dolan M.E. Role of 06-methylguanine-DNA methytransferase in protecting from alkylating agent-induced toxicity and mutations in mice. Carcinogenesis. 2007. 28 : 1111—1116.

31. Jackson C.E., Puck J.M. Autoimmune lymphoproliferative syndrome, a disorder of apoptosis // Curr. Opin. Pediatr. 1999. V. 11(6). P. 521-7.

32. Jenkins G.J.S., Doak S.H., Johnson G.E., Quick E., Waters E.M., Parry J.M. 2005. Do dose response thresholds exist for genotoxic alkylating agents? Mutagenesis. 20 : 389-398.

33. Jensen R, Glazer PM. Cell-interdependent cisplatin killing by Ku/DNA-dependent protein kinase signaling transduced through gap junctions.Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Apr 20;101(16):6134-9.

34. Kauffmann A, Rosselli F, Lazar V, et al. High expression of DNA repair pathways is associated with metastasis in melanoma patients. Oncogene. 2008 Jan 24;27(5):565-73.

35. Kohonen-Corish M.R.J., Cooper W.A., Saab J., et al. Promoter hypermethylation of the 06-methylguanine DNA methyltransferase gene and microsatellite instability in metastatic melanoma // Journal of Investigative Dermatology. 2006. V. 126. P. 167-171.

36. Mann, H. B.; Whitney, D. R. (1947). "On a Test of Whether one of Two Random Variables is Stochastically Larger than the Other". Annals of Mathematical Statistics 18 (1): 50-60.

37. Mays S.R., Nelson B.R. Current therapy of cutaneous melanoma // Cutis.-1999.-Vol. 63.-P. 293-298.

38. McGovern V.J., Mihm M.C. Jr., Bailly C., et al. The classification of malignant melanoma and its histologic reporting // Cancer. 1973. V. 32. P. 1446-1457.

39. Middleton, M.R.; Margison, G.P. Improvement of chemotherapy efficacy by inactivation of a DNA-repair pathway. Lancet Oncol. 2003, 4, 37-44.

40. Miller A.J., Mihm M.C. Jr., Mechanisms of disease: Melanoma // N Engl J Med 2006. V. 355. P. 51-65.

41. Min Sun Shin, Won Sang Park, Su Young Kim, et al. Alterations of Fas (Apo-1/CD95) Gene in Cutaneous Malignant Melanoma // Am. J. Pathol. 1999. V. 154(6). P. 1785-91.

42. Mohindra A., Hays L.E., Phillips E.N., et al. Defects in homologous recombination repair in mismatch-repair-deficient tumour cell lines // Hum. Mol. Genet. 2002. V. 11(18). P. 2189-2200.

43. Nadin S.B., Vargas-Roig L.M., Drago G., et al. DNA damage and repair inperipheral blood lymphocytes from healthy individuals and cancer patients: A pilot95study on the implications in the clinical response to chemotherapy. Cancer Lett. 2006. 239. 84-97

44. Naumann S.C., Roos W.P., Jost E., et al. Temozolomide- and fotemustine-inducedapoptosis in human malignant melanoma cells: response related to MGMT, MMR,

45. DSBs, and p53 // British Journal of Cancer. 2009. V. 100. P. 322 333.

46. Ochs K., Kaina B. Apoptosis induced by DNA damage 06-methylguanine is Bcl-2 and caspase-9/3 regulated and Fas/caspase-8 independent // Cancer Res. 2000. V. 60. P. 5815-5824.

47. Papouli, E.; Cejka, P.; Jiricny, J. Dependence of the cytotoxicity of DNA-damaging agents on the mismatch repair status of human cells. Cancer Res. 2004, 64, 3391-4.

48. Peter M.E., Krammer P.H. The CD95 (APO-l/Fas) DISC and beyond // Cell Death Differ. 2003. V. 10. P. 26-35.i

49. Peter M.E., Legembre P., Barnhart B.C. Does CD95 have tumor promoting activities? //Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. Jan. 1775(1). P. 233-4.

50. Peterson-Roth E, Brdlik CM, Glazer PM. Src-Induced cisplatin resistancemediated by cell-to-cell communication. Cancer Res. 2009 Apr 15;69(8):3619-24.96

51. Porras B.H., Cockerell C.J. Cutaneous malignant melanoma: classification andclinical diagnosis // Semin Cutan Med Surg. 1997. V 16(2). P. 88-96.

52. Povey JE., Darakhshan F. DNA repair gene polymorphisms and geneticpredisposition to cutaneous melanoma Carcinogenesis vol.28 no.5 pp.1087-1093,2007.

53. Sarasin A, Dessen P. DNA repair pathways and human metastatic malignant melanoma. Curr Mol Med. 2010 Jun;10(4):413-8.

54. Schneider P., Holler N., Bodmer J.L., et al. Conversion of membrane-bound Fas(CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity // J. Exp. Med. 1998. V. 187. P. 1205-13.

55. Shpitz B., Klein E., Malinger P., et al. Altered expression of the DNA mismatch repair proteins hMLHl and hMSH2 in cutaneous dysplastic nevi and malignant melanoma // Int. J. Biol. Markers. 2005. V. 20(1). P. 65-8.

56. Sobol R.W., Watson D.E., Nakamura J., et al. Mutations associated with base excision repair deficiency and methylation-induced genotoxic stress // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99(10). P. 6860-6865.

57. Tanaka M., Suda T., Takahashi T, Nagata S. Expression of the functional soluble form of human Fas ligand in activated lymphocytes // EMBO J. 1995. V. 14. P. 1129-1135.

58. Tawbi HA, Buch SC. Chemotherapy resistance abrogation in metastatic melanoma. Clin Adv Hematol Oncol. 2010 Apr;8(4):259-66.

59. Tentori L, Graziani G. Recent approaches to improve the antitumor efficacy of temozolomide. Curr Med Chem. 2009;16(2):245-57.

60. Trauth, B. C., Klas, C., Peter, A. M. et al. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis // Science (Washington DC). 1989. V. 245. P. 301-305.

61. Trivedi R.N., Almeida K.H., Fornsaglio J.L., et al. The role of base excision repair in the sensitivity and resistance to temozolomide-mediated cell death // Cancer Res. 2005. V. 65(14). P. 6394-6400.

62. Wagner J.D, Gordon M.S., Chuang T.Y., et al. Current therapy of cutaneous melanoma//Plast. Reconstr. Surg.-2000.-Vol. 105.-P. 1774-1799.

63. Wood R. D. 1996. DNA repair in eukaryotes. Annu. Rev. Biochem. 65:135-167.

64. Xuan Li, Heyer W-D. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance // Cell Res. 2008. V. 18. P. 99-113.

65. Использованные сокращения:

66. MM (mispairs) неправильные пары;

67. МСН — микросателлитная нестабильность, MSI (microsatellite instability);

68. FasR-трансмембранный гликопротеид (FasR/APO-l/CD95, Mw 45000), принадлежащий суперсемейству рецепторов TNF (Tumor Necrosis Factor). FasL Fas-лиганд AIF -Apoptosis inducing factor Bcl-2 - B-cell lymphoma 2

69. CI (ЛДЦИ-протокол химиотерапии) ломустин, дакарбазин, цисплатин и ингарон (интерферон гамма). MX — метоксиамин BrUdR- Bromodeoxyuridine ds,HHK (double strand DNA)- двунитевая ДНК ss/lHK (single strand DNA)- однонитевая ДНК

70. ALPS аутоиммунный лимфопролиферативный синдром NFkB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells) -антиапоптотический факторc-Jun— транскрипционный фактор, онкоген СБ стабилизация болезни

71. ЧР частичная регрелзия опухоли ПБ - прогрессия заболевания

72. FITC(fluorescein isothiocyalate), Sybr Green, PI (propidium iodide) флуоресцентные красители I XT химиотерапия \ TP - true positive \1. TN true negative \1. FP false positive1. FN false negative |

73. TPF true-positive fraction или чувствительность FPF - false-positive fractioni

Информация о работе

Артамонов, Дмитрий Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Молекулярно-клеточные маркеры лимфоцитов больных меланомой как прогностический показатель клинического ответа на химиотерапию - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Молекулярно-клеточные маркеры лимфоцитов больных меланомой как прогностический показатель клинического ответа на химиотерапию - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы