Биохимические основы и фенотипические особенности регуляции роста клеток злокачественной меланомы

Суханов, Виктор Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические основы и фенотипические особенности регуляции роста клеток злокачественной меланомы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические основы и фенотипические особенности регуляции роста клеток злокачественной меланомы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н.БАХА

„ .. . л ^ На правах рукописи

, <

1 Я Ш

Суханов Виктор Александрович

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ РОСТА КЛЕТОК ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ МЕЛАНОМЫ

03.00.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на медико-биологическом факультете Российского Государственного Медицинского Университета и во Всесоюзном научном центре молекулярной диагностики и лечения МЗ СССР

Научные консультанты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор П. В. Сергеев

доктор биологических наук, профессор А. Н. Сапрнн

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор В. А. Ткачук

доктор биологических наук, профессор А. С. Соболев доктор биологических наук А. А. Замятин

Ведущая организация - Онкологический научный центр РАМН

Защита состоится 1997 г. в "10" часов на

заседании диссертационного совета Д 002.96.01 в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН, по адресу: 117071 Москва, Ленинский проспект,

д-33.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Диссертация в виде научного доклада разослана 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т. А. Валуева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Злокачественная меланома является наиболее прогрессирующим и летально опасным для человека раковым заболеванием. Статистические популяционные исследования, проведенные в США за период с 1973 по 1987 г. показали, что частота встречаемости заболевания злокачественными формами меланомы возросла за это время на 600 %, причем белое население США в 13 раз более подвержено этим заболеваниям, по сравнению с негроидами [Eider D.E. (1995) Cancer, suppl., 75, 245-256]. Подобные тенденции типичны также для скандинавских и европейских стран, России, для представителей европеоидной расы в Австралии и ЮАР. Большинство пациентов со злокачественной меланомой не излечивается хирургически и методами радиотерапии, болезнь быстро прогрессирует и больные умирают в течение 6-8 месяцев. В химиотерапии меланомы используются многие противоопухолевые препараты, прежде всего на основе нитрозомочевины и триазенов (нитрозометилмочевинадакарбазин и др.), однако они не проявляют высокой эффективности. Так, например, эффективность действия дакарбазина составляет всего лишь 15-20%, с периодом ремиссии 4-6 мес. [Keilholz U. (1995) Cancer, 75, 905-907]. Комбинация из двух или более препаратов при химиотерапии может увеличить первоначальный эффект по торможению роста опухоли до 40%, однако ценой побочной токсичности, и окончательный результат не превышает 10%, то есть коэффициент выживаемости не улучшается. В последнее время были показаны возможности и некоторые преимущества иммуномедиируемой регрессии опухолей при применении интерлейкина-2 в комбинации с а-интерфероном, цитотоксическими агентами или с помощью ex-vivo-активации эффекторных клеток, однако только для пациентов с I и II стадиями развития опухолей. При этом наблюдался эффект до 20-25%. Комбинированная химиотерапия дакарбазином, нимустином, цисплатином и винкристином без или вместе с ß-интерфероном мало действенна [Ueda Е. et al. (1995) J. Dermatol., 22, 467-474]. Лечение мегастазирующих меланом трудно прогнозируемо, так как чувствительность разных клонов и клеточных фенотипов к химиотерапевтическим агентам может значительно отличаться. Для возможного предсказания эффективности препаратов предлагаются различные клоногенные системы по тестированию активности лекарственных средств in vitro, что особенно необходимо для оценки множественной лекарственной резистентности опухолевых клеток [Schadendorf D. et al. (1994) Cancer, 73, 103-108]. Однако, для этого у конкретного пациента необходимо выделять клетки как непосредственно из меланомы, так и из метастазов, что в случае

меланомных опухолей противопоказано. Даже при таком подходе трудно подобрать индивидуальный курс лечения, так как почти все клетки меланомы обладают высокой резистентностью к известным цитостатикам и другим лекарственным препаратам.

В связи с вышеизложенным, поиск новых препаратов и подходов к лечению меланомы является задачей первостепенной важности. Успех может быть достигнут при более детальном изучении процессов и механизмов регуляции роста клеток злокачественной меланомы, с учетом их феногипических особенностей. В настоящее время известно, что в этих процессах наиболее активную роль играют регуляторы пептидной природы - гормоны и другие ростовые факторы. Однако,несмотря на значительные успехи в изучении действия таких факторов, в частности нейропептидов типа меланотропных гормонов, их биологическая активность и механизмы ее проявления до сих пор до конца невыяснены. Например, до сих пор остается спорным значение меланотропинов как физиологических регуляторов пигментации кожи у человека, хотя и показано, что меланотропины являются регуляторами процессов меланогенеза и пигментации у животных. На клеточных культурах меланомы мыши и хомяка было показано, что регуляция меланогенеза сопряжена с аденилатциклазной системой [Miles R.N. et al. (1978) J. Cell Physiol., 96, 355-360; Hruby V.J. et al. (1980) J. Med. Chem., 23, 1432-1437]. Наблюдаемую в некоторых экспериментах рост-ингибирующую активность меланотропинов связывали с усилением процесса меланогенеза, в ходе которого образовывались интермедиаты, токсичные для этих клеток [Halaban R. et al. (1977) Exp. Cell Res., 108, 111- 117]. При этом оказалось, что ингибирование роста клеток меланомы мыши сопровождалось увеличением уровня сАМР. С другой стороны, было показано, что сАМР и его аналоги ингибируют рост клеток меланомы [Kreider J.W. et al. (1973) J. Natl. Cancer Inst., 50, 555-558; Dipasquale A. et al. (1973) J. Cell Biol., 59, 82a; Niles R.M. et al. (1978) J. Natl. Cancer Inst., 61, 523528; Prasad K.N. etal. (1978) Experimentia, 34, 1575-1576; Legros F. (1981) Cancer Res., 41, 1539-1544]. На клетках меланомы хомяка линии Bomirski AbCl наблюдали сАМР-индуцируемое образование дендритов и ингибирование роста клеток под действием ß-меланоцитстимулирующего гормона [Slominski A. et al. (1989) J. Cell Sei., 92, 551-559]. При этом происходило значительное возрастание активности тирозиназы, что не позволяет связать индукцию уровня сАМР под действием гормона только с ингибированием роста клеток. В этой работе также показано, что передача гормонального сигнала посредством других G-белок-связанных систем, генерирующих вторичные мессенджеры, то есть cGMP и фосфаты мио-инозита, мало реальна. Однако, теоретически возможность участия других систем постоянно рассматривается. Таким образом, до проведенных в данной

диссертационной работе исследований было непонятно, могут ли меланотропины влиять только на пигментацию или только на рост клеток меланомы и насколько сопряжены эти процессы и механизмы их протекания. Представлялось важным изучить молекулярные механизмы физиологической активности меланотропинов, которые связаны, прежде всего, с их возможным рост-модулирующим действием на клетки злокачественной меланомы.

Процессы регуляции пролиферативной активности клеток злокачественной меланомы человека с участием других пептидных гормонов и факторов роста фактически вообще не изучены. Представленные в научной литературе данные носят фрагментарный характер. В целом, накопленные к настоящему времени знания со всей очевидностью подтверждают тот факт, что для нормального роста и развития любых клеток необходимо наличие в окружающей среде ростовых факторов и, часто, молекул клеточной адгезии и внеклеточного матрикса. Механизмы регуляции роста включают в себя эндокринную, паракринную и аутокринную системы. Сложная система регуляции способствует динамичному протеканию всех жизненно важных для клетки процессов и создает больший запас прочности при наступлении неблагоприятных для клетки событий. Для опухолевых клеток характерно нарушение протекающих в норме процессов регуляции роста. Имеются основания предполагать, что для злокачественных форм опухолей наиболее вероятным становится аутокринный и паракринный типы регуляции, когда клетки для поддержания роста фактически переходят на самообеспечение, транслируя собственные ростовые факторы, оказывающие влияние на эти же клетки и, возможно, на клетки ближайшего окружения. Концепция аутокринной регуляции роста интересна тем, что наиболее полно объясняет атипичный рост опухолей, особенно на стадии злокачественного роста. Число биолигически активных веществ, участвующих в регуляции роста разнообразных клеток, и которые уже выделены и охарактеризованы, постоянно увеличивается [1]. Показана необходимость в кооперативном действии многих факторов с различными видами активности для обеспечения регуляции пролиферативных процессов. При этом, для определенного типа клеток, различают собственно ростовые факторы и факторы, ингибирующие рост, составляющие основное звено в системе рост-модулирующих факторов. Деление известных ростовых факторов на стимулирующие и ингибирующие весьма условно и зависит от типа клеток [1]. Известные ростовые факторы отличаются большим разнообразием по строению и функциям. Ряд факторов, таких как EGF*, a-TGF, PDGF, инсулин, IGF и IL-1

* - Список принятых в работе сокращений см. на стр.68.

являются универсальными факторами, оказывающими стимулирующее влияние на рост многих типов клеток. Другая часть ростовых факторов, таких как бомбезин, GRP, NGF, цитокины и колоний-стимулирующие факторы, обладает более выраженной специфической активностью по отношению к определенным типам клеток. В некоторых случаях ростовые факторы, оказывающие стимулирующий эффект на рост одного типа клеток, могут ингибировать рост других типов клеток. Например, ростовые факторы системы кроветворения - G-CSF, GM-CSF и IL-6 не стимулируют синтез ДНК в некоторых линиях клеток мезотелиомы [Schmitter D. et al. (1992) Int. J. Cancer, 51, 296-301]. Цитокин многофункционального действия IL-6 ингибирует пролиферацию некоторых линий крупноклеточного рака легких человека [Takizavva Н. et al. (1993) Cancer Res., 53, 4175-4181]. IL-1 промотирует рост клеток астроцитомы и глиобластомы, но цитотоксичен для клеток меланомы [Lachman L. et al. (1987) J.Immunol., 138, 2913-2916]. Неоднозначно влияние компонентов внеклеточного матрикса. Например, гепарин и сульфированные гепарино-подобные протеогликаны могут ингибировать рост клеток отдельных линий гепатомы и саркомы, при этом не оказывая никакого влияния на рост клеток гепатомы других линий [Sinkovics J.G. (1988) Crit. Rev. Immunol., 8, 217-298; Zvibel I. et al. (1991) Mol. Cell. Biol., 11, 108-116]. На этих же линиях гепатомы показано, что регуляция секреции клетками IGF-II осуществляется на уровне транскрипции посредством синергического действия инсулина, глюкагона и гормона роста в комбинации с гепарином. Индукция гепарином транскрипции IGF-II зависела также от трийодтиронина и пролактина. В другой работе показано, что усиление пролиферации клеток меланомы наступает при добавлении к среде так называемого "опухоле-усиливающего фактора" (TEF), выделенного из селезенки [Ershler W.B. (1992) Exp. Gerontol., 27, 551-558]. Вообще, часто наблюдается аддитивное действие нескольких факторов. Например, IL-1 вместе с дисульфид-восстанавливающим ферментом тиоредоксином, вызывает значительное увеличение синтеза ДНК в трансформированных вирусом Эпштейна-Барр B-лимфоцитах [Garzeiii С. et al. (1992) Microbiologica, 15, 303-307]. Различные пептидные гормоны типа вазопрессина, VI Р, ангиотензина, брадикинина, галанина, холецистокинина, нейротензина, другие нейропептиды, оказывающие влияние на систему клеточных медиаторов и мобилизацию Са2+, могут являться рост-модулирующими факторами различных типов клеток [Itoh Н. et al. (1993) J. Clin. Invest., 91, 22682274; Maruno К. et. al. (1993) Life Sei., 52, 267-271; Sethi Т. et. al. (1992)

Cancer Res., 52, 2737s-2742s; Verbeeck M. et. al. (1992) Pathobiology, 60, 136-142].

К рост-модулирующим факторам можно отнести и сами события, происходящие внутри клеток при передаче гормонального (или иного) сигнала с участием медиаторных систем. Клеточные медиаторы и механизмы внутриклеточной передачи сигнала продолжают оставаться ваажной темой многнх исследований. К сожалению, накопленные данные часто противоречивы или с трудом поддаются систематизации. Это, на мой взгляд, связано прежде всего с огромным фенотипическим разнообразием изучаемых клеточных моделей и представляет собой серьезную проблему, которая может быть решена только путем дальнейшего развития фундаментальных исследований в этой области. Выявление общих закономерностей и фенотипических особенностей, связанных с пролиферативной активностью клеток, в том числе открытие новых рост-модулирующих факторов и изучение механизмов их действия, является актуальной задачей.

Цель и основные задачи данной работы. Целью работы являлось изучение биохимических основ и особенностей регуляции роста клеток злокачественной меланомы человека, различающихся по фенотипическим признакам (пигментированные и амеланотичные, обладающие различной активностью тирозиназы), а также разработка и экспериментальная оценка научно-обоснованных подходов для создания новых эффективных противомеланомных средств.

Практическое выполнение работы заключалось в решении следующих основных задач:

1. Изучение биологической активности меланотропинов и аналогичных пептидов на клетках злокачественной меланомы;

2. Изучение биохимических особенностей функционирования и роста клеток меланомы разных фенотипов;

3. Выявление и выделение возможных новых факторов, участвующих в регуляции роста клеток меланомы;

4. Научное обоснование и экспериментальная проверка возможных направлений поиска противомеланомных химио-терапевтических средств.

При решении задачи по изучению биологической активности меланотропинов и их аналогов необходимо было прежде всего провести исследования по влиянию меланотропинов на пигментацию, рост и морфологию клеток меланомы. При изучении биохимических особенностей функционирования и роста клеток меланомы разных фенотипов ставилась задача выяснить:

- Особенности основных систем клеточных медиаторов и возможные механизмы, которые могут быть вовлечены в регуляцию пролиферативных процессов, включая:

Лиганд-рецепторные взаимодействия а-меланоцит-сгимулирующего гормона (a-MSH) с клетками меланомы;

- Аденилатциклазную и гуанилатциклазную системы;

- Систему клеточных медиаторов, образующих цикл внутриклеточного обмена мио-инозита и его фосфатов, участие фосфатидилннозиткиназ;

- Влияние a-MSH на активность протеинкиназы С;

- Особенности роста клеток злокачественной меланомы человека in vitro и факторов, определяющих их пигментацию.

Представлялось также важным оценить возможности аутокринной регуляции роста клеток злокачественной меланомы и другие факторы, принимающие участие в регуляции роста.

Научная новизна исследований. В результате проведенной работы были впервые получены следующие данные:

Показано, что a-MSH обладает рост-модулирующей активностью и может или активировать или ингибировать рост клеток злокачественной меланомы человека разных фенотипов. Эффект зависит от концентрации гормона и связан с биохимическими особенностями фенотипически различающихся клеток, но при этом не определяется процессами меланогенеза, изменением активности тирозиназы и пигментации клеток.

Установлено, что еще большей рост-модулирующей активностью обладает аналог a-MSH - [Nie4, D-Phe7]-a-MSH. Влияние на пролиферативную активность клеток разных фенотипов было противоположным в широком диапазоне концентраций - наблюдалось ингибирование роста пигментированных клеток линии MS и активирование роста амеланотичных клеток линии BRO.

Показано, что лиганд-рецепторные взаимодействия a-MSH с клетками меланомы обладают высокой специфичностью. Выделен и охарактеризован рецептор a-MSH.

Изучены особенности систем клеточных медиаторов клеток MS и BRO, которые могут принимать участие в передаче гормонального сигнала. Показано, что для клеток BRO наблюдается активация аденилатциклазной системы, а аденилатциклаза клеток MS неиндуцибельна.

Показано, что клетки меланомы обладают высокой активностью фосфатидилинозит- и фосфатидилинозит-4-фосфат- киназы ( PI-киназы ), превышающую в несколько раз активность фермента в фибробластах и лимфоцитах. Установлено, что основная часть PI-киназы локализована в мембранах. Выделены две формы PI-киназы из мембранных и цитозольных фракций клеток BRO. Изучены физико-химические свойства фермента, которые оказались близки к свойствам PI-киназы, выделенной нами ранее из мозга человека. На клетках

меланомы линии BRO изучена кинетика изменений активности PI-киназы при действии a-MSH. Проведено сравнительное изучение действия a-MSH на активность PI-киназы в клетках MS и BRO. Показано, что при действии гормона скорость образования фосфатидилинозит-4-фосфата (Р/ Р) и фосфатидилинозит-4,5-дифосфата (PIP2) в клетках BRO возрастает, а в клетках MS, наоборот, падает.

Изучен характер изменений внутриклеточного уровня фосфатов мио-инозита(1Р|,1Р2,1Рз) под действием a-MSH для клеток MS и BRO. Показано, что общий характер этих изменений для клеток MS и BRO носит противоположный характер. Наблюдалось значительное падение концентрации 1Рз для клеток MS без восстановления до исходного уровня, по сравнению с клетками линии BRO.

a-MSH оказывал противоположный эффект на активность фосфолипид, Са2+-зависимой протеинкиназы ( РК С ) в цитозольных и микросомальных фракциях клеток MS и BRO. Гормон оказывал стимулирующее воздействие на РК С клеток MS и ингибировал активность фермента в клетках BRO.

Изучены особенности роста клеток злокачественной меланомы человека in vitro и факторы, определяющие их пигментацию. Показано, что существенным фактором индукции пигментации является количество добавляемой к среде фетальной сыворотки, которая содержит вещества, ингибирующие окисление L-DOPA в DOPA-хинон и, таким образом, влияет на процесс меланизации. Установлено, что пигментированные и амеланотичные линии клеток различаются по способности утилизировать из среды аминокислоты и углеводы. Изучены условия культивирования клеток меланомы линии MS в бессывороточной среде.

Проведено выделение новых рост-модулирующих факторов из бессывороточной среды клеток MS - Fo.s, Fi и Fs. Показана специфичность и эффективность их действия на рост клеток MS, BRO, а также на фибробластах. Показано, что факторы Fi и Fs оказывают, в основном, ингибирующее действие на рост клеток меланомы, а фактор Fo.s является селективным рост-стимулирующим фактором только для клеток MS. Эти факторы не влияли на пролиферативную активность фибробластов.

Изучены физико-химические характеристики связывания хлороквина и параквата с меланинами разного происхождения и цитотоксичность параквата на клетках MS, BRO и фибробластах.

Проведено изучение L-DOPA-оксидазной активности тирозиназы в гомогенатах эпидермиса кожи различных животных, человека, в гомогенатах клеток меланомы, фибробластах и в меланомных опухолях. Показана высокая активность тирозиназы в пигментированных меланомных линиях клеток и в меланомных

опухолях. Обнаружено ингибирование L-DOPA-оксидазной активности гомотенатами клеток амеланотичной линии BRO и отдельными образцами кожи человека.

Выделены препараты тирозиназы из кожи крысы, кожи человека и из меланомы человека. Показана гетерогенность препаратов и наличие различающихся изоформ тирозиназы для кожи и опухолей. Из кожи человека выделен и охарактеризован ингибитор окисления L-тирозина и L-DOPA в DOPA-хром.

Изучена цитотоксичносгь ингибиторов протеинкиназ А и С (In А и Н-7 ) на клетках MS и BRO. Показана возможность использования этих соединений как потенциальных цитостатиков, в том числе в комбинации с a-MSH, но только для клеток типа линии BRO, для которых регуляция пролиферативной активности опосредована через аденилатциклазную систему и сАМР-зависимую протеинкиназу (РК А).

Получены и охарактеризованы моноклональные антитела (МКА 59) к клеткам меланомы линии BRO. Идентифицирован меланомо-ассоциированный антиген. Показана специфичность связывания МКА 59 с клетками меланомы линий BRO и MS, и с меланомными опухолями, отсутствие связывания с клеточными культурами лимфоцитов и фибробластов, а также с клетками нормальных тканей и органов.

Синтезирован иммунотоксин на основе Н- и L-цепей МКА 59 (МКА 59 - RIP ). Показана эффективность его действия на культуре клеток меланомы линии BRO по сравнению с исходным RIP.

Синтезированы конъюгаты Н- и L-цепей IgG крысы с RIP (L-RIP и H-RIP) и изучены их толерогенные свойства. Показана возможность использования этих конъюгатов в качестве толерогенов.

Предложена гипотетическая схема регуляции роста клеток злокачественной меланомы с участием эндокринных, паракринных и аутокринных факторов, в том числе Fo.5, Fi и Fe.

Предложены теоретически обоснованные и экспериментально оцененные направления поиска противомеланомных средств.

Практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представления об особенностях роста злокачественных клеток и возможных механизмах регуляции их пролиферативной активности. Изученные биохимические и фенотипические особенности роста клеток злокачественной меланомы человека позволили определить возможные направления поиска противомеланомных химиотерапевтических средств для двух основных фенотипов: пигментированных и обладающих L-DOPA-оксидазной активностью меланом, и для амеланотичных разновидностей меланом. Проведенные экспериментальные исследования по предложенным

направлениям показали перспективность путей поиска противомеланомных препаратов на основе метаболической системы меланогенеза - для пигментированных опухолей, и использование аутокринных и паракринных ингибиторов роста - для всех разновидностей меланомных опухолей, с учетом фенотипических особенностей регуляции роста отдельных популяций клеток. Обнаруженные фактор ингибирования роста и суммарный фактор Рй , обладающие высокой специфичностью и эффективностью действия (1С5о фактора Р] для пигментированных клеток меланомы - 10-9М, а 1С<ю, то есть почти полное ингибирование роста, фактора Ре - порядка 10"6М, для клеток меланомы разных фенотипов), представляют практический интерес и могут найти применение в экспериментальной онкологии. Получение новых моноклональных антител МКА 59 к клеткам меланомы и идентификация нового меланомо-ассоциированного антигена, типичного только для меланомных опухолей и отсутствующего в нормальных органах и тканях, могут также найти свое применение в экспериментальной и клинической онкологии.

Положения, выдвигаемые для публичной защиты:

1. Регуляция роста клеток злокачественной меланомы возможна и осуществляется с участием веществ пептидной природы, секретируемых непосредственно самими клетками (аутокринный уровень регуляции), клетками ближайшего окружения (паракринный уровень) и дистальными клетками (эндокринный уровень).

2. Для клеток злокачественной меланомы человека рост-модулирующими факторами являются меланотропины (а-МБН и его аналоги) и пептиды, секретируемые непосредственно клетками меланомы - типа факторов Ро.5, и Ре. Рост-модулирующие факторы могут активировать или ингибировать пролиферативную активность клеток.

3. Действие рост-модулирующих факторов высокоспецифично, избирательно и связано с биохимическими особенностями отдельных видов и типов клеток. Особенности протекания процессов передачи рост-модулирующего сигнала у клеток разного фенотипа могут в значительной степени определять биологическую активность этих факторов.

4. Эффективное ингибирование роста клеток злокачественной меланомы разных фенотипов может быть достигнуто путем использования их биологических особенностей, в том числе связанных с наличием или отсутствием меланомоассоциированных ферментов, антигенов и т. п., а также связанных с системами передачи рост-

модулирующих сигналов - путем селективного изменения активности отдельных звеньев этих систем.

Апробация диссертации. Основные результаты работы были представлены на:

- I Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран", Львов, 1978 г.

-1Y Всесоюзном биохимическом съезде, Ленинград, 1979 г.

- II Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран", Ташкент, 1980 г.

- Симпозиуме "Липосомы. Взаимодействие с клетками и тканями", Москва, 1980 г.

-1 Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982 г.

- YI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных процессов", Петрозаводск, 1988 г.

- Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки", Минск, 1990 г.

- Международном симпозиуме по биологии опухолевого роста и медицине, Москва, 1990 г.

- II Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991 г.

- 15th International Congress of Biochemistry, Jerusalem, Israel, 1991.

- 4th International Congress on Hormones and Cancer, Amsterdam, The Netherlands, 1991.

- Illrd European Congress of Endocrinology, Amsterdam, The Netherlands, 1994.

- XXIInd Meeting of International Society of Oncodevelopmental Biology and Medicine, Groningen, The Netherlands, 1994.

- Ill Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 1996 г.

-1 съезде онкологов стран СНГ, Москва, 1996 г.

Публикации. Полученные данные, включая исследования методического характера, отражены в 64 публикациях:

1 авторском свидетельстве, 40 статьях ( из них 4 главы в коллективных монографиях, 1 - за рубежом, 6 статей - в зарубежных журналах ) и 23 тезисах докладов ( в том числе 6 - в международных сборниках).

Всего являюсь автором 122 публикаций.

ОБОБЩЕННОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы и методы исследований.

Материалы. В работе использовались монослойные культуры клеток злокачественной меланомы человека, амеланотичной линии BRO [любезно предоставлена А. Локшиным, Ph.D.. Кариотип, злокачественность и другие характеристики линии описаны в работе -Lockshin A. et al. (1985) Cancer Res., 45, 345-350], и пигментированной линии MS, в некоторых экспериментах - культура клеток меланомы хомяка, линии RPMI-1846, а также культура клеток фибробластов легких эмбриона человека, линии Леч 240 (получены из банка клеточных культур ОНЦ РАМН, Москва) [1-5]*. В биохимических и гистологических исследованиях использовались также первичные лимфоциты человека, нормальные органы и ткани человека (аутопсий-ный и биопсийный материал ) - кожа, печень, почки, селезенка, головной мозг, миокард; опухолевая ткань больных, оперированных по поводу первичной меланомы и меланомы в стадии метастазирования (операционный материал был предоставлен хирургом, д.м.н., проф. И.М.Гуртовым, Московский городской онкологический диспансер). При получении гибридом использовались мыши линии BALB/ С , а в иммунологических исследованиях - белые беспородные крысы [6-8].

При изучении тирозиназы и ее фенотипического распределения использовались мыши линий BALB/C, СВА/2, С 57 Black/6J, DBA/2J; крысы Спрэг-Доули, дикие серые и гибриды первого поколения (Серая х SD)Fi.

Качество работы было обеспечено реактивами высокой степени чистоты фирм "Sigma", "Calbiochem." и "Bio-Rad" (США), "Pierce" (Англия), "LK.B-Pharmacia" (Швеция), "Serva" и "Merk" (Германия), "Fluka" (Швейцария). В некоторых случаях использовались отечественные реактивы марки х.ч., ч.д.а. или о.с.ч..

Водные растворы реактивов приготовлялись на основе деионизованной и, в тех случаях, где это было необходимо, на основе

* - порядковый номер публикации в списке основных работ, отражающих материалы диссертации (стр.62). Список работ составлен по мере их встречаемости в тексте.

апирогенной и стерилизованной воды, получаемой на трехступенчатой установке: l-"MilJi-RO 20" ("Millipore-Corp.", США); 2-"Milli-Super Q" ("Millipore"); 3- УФ-облучатель "ORGANICpure™, серии D-3600" ("Sybron-Bamstead", США). В некоторых экспериментах очистка и стерилизация растворов проводилась на оборудовании для фильтрации и ультрафильтрации фирмы "Amicon" (Нидерланды).

Методы исследований [ 2 - 45 ]

1. Пролиферативная активность клеток. Клетки злокачественной меланомы человека, линий BRO и MS, культивировали в среде RPMI-1640 или L-15 ("Flow Laboratories", Англия, или "Sigma", США), с добавлением,как правило, 10% эмбриональной телячьей сыворотки ("Flow Lab." или "Sigma"), глутамина и антибиотиков (пенициллин и стрептомицин), в атмосфере 5% СОг при 37°С в СОг-инкубаторе ("Flow-Lab."). Клетки фибробластов легких эмбриона человека, линии Леч 240, культивировали в среде F-10 ("Flow-Lab."), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина и антибиотиков, в тех же условиях, что и клетки меланомы.

Все эксперименты с монослойными клеточными культурами проводились в пластиковых флаконах различной площади и объема, а также в 6-, 24- и 96-луночных планшетах ("Costar", США-Нидерланды), в стерильных условиях, с использованием ламинарного шкафа ("Flow Lab."). Последовательность операций при определении пролиферативной активности и добавление различных агентов, оказывающих влияние на рост клеток, проводили как это нами описано [2-5]. Определение пролиферативного потенциала клеток при различных видах воздействия оценивали по их способности включать [3Н]тимидин [Freshney R.I.(ed.) Animal cell culture.Practical Approach, Oxford, 1987]. Для подсчета числа радиоактивных распадов в единицу времени использовали Р-счетчик ("LKB", Швеция). Кроме того, проводили подсчет клеток и их колоний-образующую активность визуально, с помощью гемоцитометра. В случае визуального подсчета количества клеток проводили частичную трипсинизацию монослоя и суспензировали клетки в физиологическом растворе.

Все эксперименты с клетками (здесь и далее) проводились в трех, четырех или шести повторах. Представленные на рисунках вертикальные отрезки у точек - 95%-ные доверительные интервалы средних значений.

2. Фиксация клеток и микроскопия. Клетки фиксировали 3,7%-ным формалином в PBS (10 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 1 мМ MgCh, 0,1 мМ СаСЬ), промывали PBS, добавляли свежеприготовленный флюоресцеинизотиоцианат - конкавалин А (FITC-Con А) в качестве контрастного вещества, как это описано [3].

Фазово-контрастная и флуоресцентная микроскопия проводилась с помощью микроскопа Axioplan ("Opton", США), х400.

3. Лиганд-рецепторные взаимодействия ct-MSH с клетками. MoHo-[l25I-Tyr]-a-MSH получали по стандартной методике йодирования [Markwell М.А.К. (1983) Analyt. Biochem., 125, 427-432] с помощью "Iodo-Beads" или "Iodogen" ("Pierce",Англия), с разделением получаемых производных сначала на Сефадексе G-10 ("Pharmacia", Швеция), а затем в трех-ступенчатом градиенте методом ВЭЖХ на колонке "UltrasphereTW-ODS ("Altex", США), как это описано [2].

Связывание [,25I]-a-MSH с клетками изучали при 4°С и 37°С в условиях эндоцитоза или без него. 5х105-106 клеток отмывали бессывороточным изотоническим буфером и инкубировали при 4°С или 37°С в течение 2 час с [125I]-a-MSH (0,7-60нМ) в фосфатном изотоническом буфере, рН 7,2, содержащем 1% бы чьего сывороточного альбумина, 1мМ фенилметилсульфонилфторида и 2,9 мкг/мл апротинина. Специфическое связывание с клетками вычислялось по разности числа радиоактивных распадов в мин в отсутствие и в присутствии "холодного" a-MSH (103-104-кратный молярный избыток). При проведении экспериментов по связыванию метки при 37°С для учета возможной интернализации [125I]-a-MSH в клетку при этой температуре определяли остаточную радиоактивность клеток после 5-мин инкубации последних в 0,04М натрий-ацетатном буфере, рН 4,5, содержащем 0,9% NaCl и 0,1% альбумина. Отмывку клеток от свободной метки проводили либо вручную, либо в автоматическом режиме на приборе "Harvester-530" ("Flow Lab.", Англия) при 4°С. Радиоактивность определяли с помощью счетчика "Minigamma"("LKB",Швеция). Специфическое связывание определяли из 6 параллельных опытов. При вычислении средней арифметической величины явно отклоняющиеся значения не учитывались.

4. Внутриклеточное распределение a-MSH после эндоцитоза. Выделение рецептора a-MSH. Инкубацию клеток в бессывороточной среде и последовательность операции проводили как это описано [2]. Кратко, ЗхЮ7 клеток линий BR.0 или MS переводили в бессывороточную среду и после инкубации в течение 1 часа при 37°С охлаждали до 4°С и суспендировали в 5 мл 0,02М фосфатного буфера, рН 7,2, содержащего 0,13М NaCl, 1% альбумина и 7,5x10-9М [,251]-а-MSH. После 1,5-час. инкубации при 4°С и последующей отмывки от свободной метки, клетки в течение 8 мин инкубировали в изотоническом фосфатном буфере при 37°С. Осадок клеток после центрифугирования гомогенизировали при 4°С в 3 мл 0,01 M трис-НС1-буфере, рН 7,5 в гомогенизаторе Даунса, совершая не менее 100 ходов для более полного разрушения клеток. Фракции клеток получали трехступенчатым центрифугированием при 500g ( ядра и оставшиеся интактные клетки), 9000g ( лизосомы и митохондрии ) и 105.000g

(отделение микросомальной фракции от цитозоля). Выделение тройного комплекса: a-MSH-рецептор-полирибосомальный комплекс с м-РНК рецептора проводили по методу, ранее описанному для выделения рецепторов NGF и EGF [Rakowicz-Szulizynska Е.М. et al. (1989) J. Immunol. Meth., 116, 167-173], с некоторыми модификациями [2]: 1,5х107 клеток гомогенизировали в 5 мл 0,02М трис-НС1-буфера, pH 7,6, содержащего 1мМ ЭДТА. После двухступенчатого центрифугирования при 800g и 105000g отбирали цитозольную фракцию и к ней добавляли [l25I]-a-MSH до концентрации в реакционной смеси 4,5х10-9М. Инкубацию проводили при 25°С в течение 10 мин и при 4°С в течение 2 час. Тройной комплекс осаждали центрифугированием при 105000g в течение 60 мин и далее анализировали с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, с последующей авторадиографией.

5. Определение сАМР и cGMP. Экстракция сАМР из клеток проводилась, как описано ранее [Wong G. et al. (1974) Nature, 248. 351354]. Концентрация сАМР измерялась с помощью набора для определения сАМР ("Альга-тест",Россия). Определение cGMP проводилось как описано [3], с помощью набора cGMP RIA ("Amercham", Англия).

б.Определение активности фосфатидилинозиткнназы(Р1-кнназы).

Активность PI-киназы определялась отдельно в мембранных и цитозольных фракциях [3,5], как описано нами ранее при выделении фермента из мозга человека, по включению [32Р]-у-АТР в PI и PIP, с образованием [32Р]-Р1Р и [32Р]-Р1Р2, и дальнейшим анализом методом ТСХ [9].

7. Измерение уровней фосфатов мио-инозита (IPi, IP2 и 1Рз). Проводили двумя методами:

7.1. Инкубацию клеток проводили в среде, содержащей мио-[2-3Н]-инозит ("Amercham", Англия), как это описано [3,5]. В отдельных экспериментах добавляли ЮмМ LiCl. Процесс останавливали с помощью трихлоруксусной кислоты. Инозитфосфаты (I Pi, IP2 и 1Р3 ) разделяли на колонке с ионообменной смолой "Дауэкс Wlx8", и анализировали как описано ранее [Berridge M.J. et al. (1983) Biochem. J., 212, 473-482].

7.2. Измерение уровня 1,4,5-трифосфата мио-инозита проводили как описано [3,5], используя D-myo-Inositol 1,4,5-triphosphate (1Рз) [3Н] assay system ("Amercham", Англия).

8. Определение активности фосфолипид. Саг+-зависимой протеинкиназы (PK С). Активность PK С в микросомальных и цитозольных фракциях определялась измерением скорости фосфорилирования ядерного белка - гисгона HI с помощью [ у-32Р]-АТР, как это описано ранее [Kazuhiro C.et al. (1986) Cancer Res., 46,

1055-1062], в присутствии и без активаторов фермента (Са2+, фосфатидилсерин, диолеин ).

9. Определение активности тирозиназы. Проводилось по описанному методу [Pomerantz S.H. (1964) BBRC, 16, 188-194], по скорости окисления L-DOPA в DOPA-хром при 475 нм, на спектрофотометре Хитачи-220 ("Hitachi", Япония). При низком уровне активности фермента учитывали спонтанное окисление L-DOPA в DOPA-хром [10]. Сравнительную активность изоформ фермента определяли, после электрофореза (ЭФ) или изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) и блоттинга, вымачиванием полосок нитроцеллюлозы с перенесенными белками в растворе L-DOPA, с последующей визуальной оценкой проявляющихся темных полос меланинов или их сканированием на ТСХ-сканере ("Camag", Швейцария), и обсчетом данных на интеграторе НР-4100 ("Hewlett-Packard", США).

10. Выделение тирозиназы и ингибитора окисления L-DOPA. Разработанный метод выделения состоит, в основном, из 6 стадий, с использованием гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и двух аффинных хроматографии на аминобензил-СН-сефарозе и на Con А-сефарозе [10].

11. Выделение фосфатидилинозиткиназы. PI-киназу выделяли из гомогената мозга человека и из клеток злокачественной меланомы, линии BRO, методами гидрофобной, анионо- и катионообменной хроматографии, а также гель-фильтрацией [9,11].

12. Выделение аутокринных факторов роста. Пептидные фракции, обладающие рост-модулирующей активностью, выделялись из бессывороточной кондиционированной среды клеток злокачественной меланомы, пигментированной линии MS. Для этого клетки культивировали в роллерных флаконах объемом 1л, в среде RPMI-1640 с 10% постнатальной телячьей сыворотки ("Flow Lab."). В последующих пассажах количество сыворотки постепенно снижали (5,3 и 1%). Затем удаляли среду с сывороткой и заменяли ее той же средой без сыворотки. Клетки в бессывороточной среде инкубировали 3 суток, после чего кондиционированную среду отделяли от клеток, замораживали и хранили при -70°С для накопления. Разработанный метод выделения факторов роста состоит, в основном, из 4 стадий: двойной ультрафильтрации на фильтрах РМ-30 и РМ-10 ("Amicon", Нидерланды), гель-хроматографии на сорбенте Toyopearl HW-50 ("Toyo-Soda", Япония), аффинной хроматографии на специально приготовленной гепарин-сефарозе и ВЭЖХ [12].

13. Выделение меланиновых гранул и фракций. Определение параметров связывания. Выделение меланиновых гранул и фракций проводилось из глаза быка и из субстанции "нигра" человека по описанному ранее методу Potts (1964). Связывание хлороквина и

параквата с меланиновыми гранулами оценивалось в координатах Скэтчарда при наличии нескольких центров связывания [Scatchard G. (1949) Ann. N. Y. Acad. Sci, 51,660-672].

14. Получение моноклональных антител(МКА 59V Иммунизацию мышей BALB/ С проводили подкожным введением 500 тыс. клеток линии BRO, отмытых от культуральной среды, в подушечки задних лапок или внутрибрюшинно по протоколу, как это описано [6], до достижения титра 1 -.20000. Далее проводили слияние клеток селезенки иммунизированных мышей с клетками миеломной линии NSl-Ag 4/1, клонировали и тестировали клоны методом иммуноферментного анализа с помощью лизата клеток BRO и гистологического материала, как описано [6]. Для определения класса и подкласса иммуноглобулинов использовали набор антител ("Boehringer", Германия).

15. Получение конъюгатов Н- и L-целей МКА 59 с R1P и Н- и L-цепей IgG крысы с RIP. Рибосомо-ингибирующий белок (RIP) выделяли по ранее описанному методу [Ovadia M.et al.(1988)Arch. Bioch.Bioph.,264,168-175], из зерен ячменя, с модификацией. Н- и L-цепи получали восстановлением -S-S-связей в иммуноглобулинах с помощью дигиотрейтола, и без разделения коньюгировали с RIP, используя М-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат (SPDP), как это было описано ранее для целых молекул иммуноглобулинов [Carlsson J. et al. (1978) Biochem. J., 173, 723-737]. Образующиеся конъюгаты разделяли по молек. массе гель-хроматографией [7,8].

16. Определение концентрации белка. Проводили по модифицированному методу Лоури, позволяющему проводить определение концентрации белка по наличию пептидных связей в присутствии углеводов, липидов и т. п. [Markwell М.А. (1978) Anal. Biochem., 87, 206-210].

17. Анализ белковых фракций. Проводили известными методами хроматографии, ЭФ, ИЭФ, авторадиографией и иммуноферментным анализом, с использованием новых оригинальных методик [13-16].

В ходе выполнения диссертационной работы использовались также методические приемы, описанные мною ранее при исследовании возможностей создания фосфодиэфирных структур, синтеза фосфоинозитидов и их аналогов, как субстратов фосфатидилинозиткиназ и фосфолипаз, синтеза различных конъюгатов с применением карбонилдиимидазола и других конденсирующих агентов, при фракционировании клеток и субклеточных структур [1745].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Изучение биологической активности a-MSH и его аналога

[2-5,47,50,53,55,58,64]

Меланоцитстимулирующие гормоны (меланотропины: a-, ß- и у-MSH) относятся к нейропептидам меланокортинового ряда, обладающим широким спектром физиологической активности и влияющим на такие важные процессы, как поведение животных и человека, регенерация нервов и активность нервных клеток, регуляция стероидогенеза и меланогенеза. Известно, что у человека меланотропины представлены, в основном, a-MSH, а у животных -ß-MSH [Hadley М.Е.. The melanotropic peptides, CRC Press, 1988].

Для изучения биологической активности меланотропинов чаще всего используются модельные системы на основе клеточных культур, полученных из меланом мыши и хомяка, в связи с относительной легкостью поддерживать их рост in vitro [Slominski А. et al. (1981) J. Cell Sei., 92, 551-559]. С точки зрения практической целесообразности для онкологии, эксперименты на культурах клеток злокачественной меланомы человека могут более адекватно отражать реально протекающие процессы. Изучение механизмов действия пептидных гормонов типа a-MSH, проводимое на фенотипически различающихся по пигментации клеточных линиях меланомы, может показать, насколько сопряжены процессы меланогенеза с другими возможными видами активности меланотропинов, например с рост-модулирующей активностью. Поэтому в данной работе для изучения биологической активности a-MSH были выбраны и использовались, в основном, две фенотипически различающиеся линии клеток злокачественной меланомы человека - амеланотичная линия BRO и пигментированная линия MS.

При выполнении этой части исследований оказалось, что a-MSH вызывал ингибирование роста клеток, как пигментированной линии MS, так и амеланотичной линии BRO при концентрациях порядка 10-7М и выше ( Рис. 1,2).

•НИБН (М)

Рис.1.Влияние меланоцитстимулируюшего гормона (а-М8Н) на проли-феративную активность клеток злокачественной меланомы линий ЕЖО и МБ и на фибробласты легких человека, линии Леч 240 (РЬ). Пролифера-тивный потенциал оценивался по включению рН}гимцдина в условиях эксперимента ( имп. в мин ) по отношению к контролю ( имп.о в мин ). Цифрами 1 и 2 обозначены значения 1С50 для клеггок М5 и ВЯО, соответственно.

Ингибирование роста и деления клеток было показано двумя независимыми методами - по включению в клетки [3Н]тимидина и непосредственным подсчетом количества клеток во времени (до 6 суток). В случае изучения концентрационной зависимости пролиферативной активности клеток от количества добавляемого а-МБН (Рис.1), клетки культивировались в виде монослоя в среде, содержащей различные концентрации гормона. Среда заменялась на 3-й сутки на аналогичную. Пролиферативную активность клеток оценивали на 7-е сутки по способности включать [3Н-]тимидин по сравнению с контролем. Поскольку эффективное ингибирование пролиферации клеток наблюдалось при концентрациях порядка 10-7М, то в последующих экспериментах изучали однократное воздействие

2х10'7М сс-МБН на рост клеток во времени. Для этого, после однократного добавления гормона, спустя 24 часа среда заменялась на новую, не содержащую а-МБН. В указанные на рис.2 интервалы

I \

■

0) 3

4 в 96 744

Время роста, ч

45 96 744 Время роста,«/

4 8 96 744 Время роста., ч

Рис.2. Пролиферативная активность клеток при однократном добавлении к среде а-М5Н до концентрации 2х10-7М (1), по сравнению с контролем (2). А-клетки меланомы линии МЭ, Б-клетки меланомы линии В1Ю, В-фибробласты легких эмбриона человека, линии Леч 240 (ИЬ). Пролиферативная активность оценивалась путем визуального подсчета изменения количества клеток во времени с помощью гемоцито-метра.

времени клетки снимали частичной трипсинизацией, суспензировали в физиологическом растворе и производили подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Из представленных данных видно, что однократное добавление 2х10-7М a-MSH эффективно ингибирует рост клеток обеих линий меланомы на протяжении всего времени эксперимента (6 суток). Интересно, что однократное добавление 2х10-7М гормона не вызывало ингибирования частоты деления клеток фибробластов легких человека, оцениваемое по количеству клеток во времени визуально (рис.2,в), хотя в другом тесте, по оценке пролиферативной активности клеток с помощью [3Н]тимидина, и постоянном присутствии гормона при этих же концентрациях, наблюдалось ингибирование пролиферации (Рис.1).

При ингибировании пролиферативной активности наблюдалось также изменение морфологии клеток. Это хорошо прослеживалось как при фазовоконтрастной, так и в случае FITC-Con А - флуоресцентной микроскопии фрагментов монослоя клеток (Рис.3). В норме клетки были округлой и слегка вытянутой формы, имеющие ядра с хорошо выраженными нуклеолами. Под действием a-MSH клетки принимали амебоидную форму с многочисленными выростами цитоплазмы. На 3-4 сутки наблюдался максимальный эффект. Клетки отличались сильно выраженным полиморфизмом, появлялись "гигантские" клетки с выростами цитоплазмы в виде дендритов (Рис.3). При низких концентрациях гормона, порядка 109 - 108М, наблюдалось активирование роста клеток BRO и ингибирование роста клеток линии MS (Рис.1). Еще более разительно отличалось действие аналога гормона - (Nle4,D-Phe7)- a-MSH. Ранее, в различных тестах на пигментацию, в том числе на клетках мышинной меланомы линии Cloudman S91, было показано, что этот пептид обладает наиболее мощной меланогенезной активностью, по сравнению с другими аналогами меланокортинов [Sawyer Т.К. et al. (1982) J. Med. Chem., 25, 1022-1027]. В наших экспериментах пептид усиливал пролиферативную активность клеток BRO до 260% и, наоборот, ингибировал рост клеток MS в 1,5-2 раза при концентрациях Ю-12 - 10-6М (Рис.4). Пептид не оказывал никакого влияния на рост клеток другого типа -фибробластов легких человека.

Повышенная чувствительность пигментированных клеток MS к действию a-MSH и его аналога не может быть объяснена ускорением образования в клетках цитотоксичных интермедиатов синтеза меланина за счет активации тирозиназы ( Т-азы), так как при этом не наблюдалось изменения ее активности, а также изменения пигментации клеток. В табл.1 приведены результаты эксперимента по действию a-MSH на активность Т-азы.

Таблица 1. Влияние а-М8Н (2x1 (ИМ) на активность тирозиназы (ЮОРА-оксидазы) в клетках меланомы линий МБ и В КО

! Линия клеток Ь-ООРА-оксщизная активность (нмоль/мг белка х мин)

'контроль ■ а-МБИ-обработанныеклетки(дни инкубации)

! (без а-МБНУ 1 2 4 15 8

; МБГпигменти- 7,5±2,2 ¡9,0+2.7 8.2±2,4 рованная) ! 6.1 + 1.8 1 6,7+2.0 1 9.3+2.8 1 1

ВКО(амелано- 0 ; 0 | 0 тичная) ; 0^010

Таклм образом, результаты исследований показали, что сс-МБН и его аналог - С\'1е-\0-Р11ег)-а-М5Н оказывают непосредственное воздействие на процессы, связанные с пролиферативной активностью клеток злокачественной меланомы человека, двух основных фенотипов - пигментированных и амеланотичных. При этом, в отличие от подобных экспериментов проведенных на клетках меланомы мышей и хомяка, нг выявлено влияния этих пептидов на систему меланогенеза. Это позволило более детально изучить рост-модулирующуга активность а-МБН и протекающие при этом внутриклеточные процессы на молекулярном уровне.

Рис.3. Влияние а-МЗН на рост и морфологию клеток М5. А - контроль: Б - спустя 24 часа после добавления 2.\ 1 (ИМ гормона: В - спустя 72 часа. РИС-СоиА - флуоресцентная УФ-чикра-рафпя, 400х. Подобные изменения наблюдались и для клеток линии ВЕО.

Рис.4. Рост-модулирующая активность (Ы1е4,0-РЬе7)-а-М5Н по отношению к клеткам злокачественной меланомы, линий МБ и ВИО и фибробластам легких человека линии Леч 240 (К).

ю'6 (М)

II.Биохимические особенности функционирования клеток меланомы разных фенотипов [1-5,11,12,47,49,50,52-56,58,60,61,64]

Процессы, связанные с регуляцией пролиферативной активности клеток, являются основополагающими и наиболее важными для нормального функционирования почти всех клеточных типов. Разрегулирование этих процессов может привести к нежелательному изменению функциональных свойств клеток, например к их злокачественному росту. Возможна ли регуляция роста злокачественных клеток? В предыдущем разделе было показано, что а-МБН и его аналог оказывают активное влияние на рост клеток злокачественной меланомы человека, то есть подобные пептидные гормоны могут являться эндокринными факторами роста на физиологическом уровне. Однако, выявленная рост-модулирующая активность а-МБН и его аналога по отношению к клеткам меланомы разных фенотипов была неодинаковой, а в некоторых случаях носила даже противоположный характер (Рис. 1 и 4).

Естественно было предположить, что обнаруженные различия в рост-модулирующей активности а-МБН и его аналога могут быть связаны с биохимическими особенностями функционирования клеток

разных фенотипов и с особенностями передачи гормонального сигнала. С этой целью были изучены, прежде всего, основные системы клеточных медиаторов, которые могут принимать участие в регуляции пролиферативных процессов.

2.1. Изучение возможных механизмов гормональной регуляции роста клеток

2.1.1. Лиганд-рецепторные взаимодействия а-МБН и физико-химические характеристики рецептора а-МБН

Для данных исследований был синтезирован и хроматографически очищен радиоактивно меченый гормон - моно-[|251-Туг]-а-М5Н с высокой удельной активностью - 3,9х108расп.в мин/ моль и чистотой по радиоактивности более 90%.

Проведено изучение связывания меченого гормона - моно-[1251-Туг]- а-МБН (далее обозначаемого как [ш1]-а-М5Н), с клетками в условиях, исключающих эндоцитоз лиганда (4°С), при физиологических температурах (37°С), и распределение гормона по клеточным органеллам и фракциям. Показано, что при 4°С специфические лиганд-рецепторные взаимодействия на поверхности плазматических мембран клеток отсутствуют. Разность между включением метки в клетки в присутствии и в отсутствие "холодного" гормона была незначительной и не превышала средних величин отклонений при повторных измерениях. Для изучения связывания гормона при 37°С прежде всего была определена протеолитическая активность клеток меланомы и ее влияние на устойчивость меченого сх-МЗН. Методом ВЭЖХ показали,что при 1,5-2-часовой инкубации [|251]-а-М5Н с клетками при 37°С в присутствии двух ингибиторов протеазной активности - фенилметилсульфонилфторида и апротинина, гидролиза меченого гормона не происходит. Осложнением при изучении связывания лиганда с клетками при 37°С может также явиться эндоцитоз, который существенно усложняет интерпретацию получаемых результатов. В связи с этим для оценки количества попавшего в клетку в результате эндоцитоза меченого гормона после инкубации производили обработку клеток при 4°С кислым натрий-ацетатным буфером, вызывающим диссоциацию лиганд-рецепторных комплексов на поверхности плазматических мембран. Было установлено, что даже 5-мин обработка кислым буфером вызывает практически полное (более 90%) удаление специфически связанного с клетками [' 251]-а-МБН, то есть эндоцитоз в условиях эксперимента существенного изменения в получаемые результаты по специфическому связыванию при этой температуре не вносил. Таким образом, в

условиях физиологической активности клеток (37°С) было определено специфическое связывание гормона. На рис.5 представлены данные по специфическому связыванию метки с клетками линии МБ, изображенные в координатах Скэтчарда. Вычислены КДиС. ( 9,1+ 3,1 нМ) и число мест связывания гормона на поверхности клеток, которое составляло довольно низкую величину порядка 85+20. Эти величины были примерно одинаковыми для обеих линий.

А-Оа.

-ас

^ -43

1 2 3

Рис.5. Характеристики рецептора а-М5Н клеток МБ. Специфическое связывание ['"1]-а-М5Н определялось в координатах Скэтчарда. По оси абсцисс -количество связанного а-МБН (молей/клетку х10"); по оси ординат - соотношение количества связанного и концентрации свободного гормона (молей/клетку/МхЮ9). Приведены значения константы связывания ( Кд ) и числа мест связывания на поверхности одной клетки ( Вт )• Справа приведены данные авторадиографии: 1-[1251-Туг]-а-М5Н без "холодного" а-МЭН; 2,3- в присутствии 103- и 104-молярного избытка а-МБН, соответственно. Цифрами показано положение маркерных белков с определенной молек. массой на электрофореграмме (кБа). Стрелкой обозначено положение специфического рецептора а-МБН.

С использованием больших количеств клеток показано, что в результате эндоцитоза (37°С) и интернализации радиолиганда во внутрь одной клетки за время инкубации проникает 7-8 молекул гормона. Основная часть гормона внутри клетки сосредотачивается в цитозольной и ядерной фракциях (табл.2).

Таблица 2. Распределение ( в % ) [|251]-а-М5Н по органеллам клеток МБ и ВЛО после инкубации специфически связавшегося гормона в условиях эндоцитоза, как это описано в разделе "Методы исследований".

Линия клеток Ядерная фракция Митохондрии и лизосомы Цитозоль-ная фракция Микросомы Всего расп./мин на 30 млн. клеток

MS 63,80 2,14 33,20 0,81 1468

BRO 53,50 5,70 38,80 1,95 1690

Представлялось важным выделить внутриклеточные рецепторы a-MSH. С этой целью был использован эффективный и чувствительный метод, заключающийся в осаждении рецепторов и их лигандов в виде полирибосомального комплекса с м-РНК. Этот метод был ранее применен при выявлении рецепторов EGF и NGF [Rakowicz-Szulizynska Е.М. et al. (1989) J. Immunol. Meth., 116, 167-173]. [1251]-а-М5Н-рецептор-м-РНК-полирибосомальный комплекс выделяли из цитозоля ультрацентрифугированием при 105000g, который после растворения в буфере, содержащем додецилсульфат натрия подвергали электрофорезу. Окрашивание геля серебром давало двойную полосу с молек. массой примерно 50 и 58 KÖa. Авторадиография геля выявляла эти же две полосы и наряду с ними намного более слабо выраженные полосы в высокомолекулярной области (150-200 к0а) (Рис.5, справа). Проведение опыта в присутствии 103-104-кратного избытка "холодного" a-MSH подтвердило, что выявляемые полосы в области 50 и 58 KDa относятся к рецептору a-MSH. Из представленных данных на рис.5 видно, что немеченый гормон в значительной степени ослабляет нижнюю полосу, выявляемую при авторадиографии, что подтверждает специфичность связывания. Денситометрическое сканирование треков 1,2 и 3 показало, что если принять поглощение пятна в области белков с молек. массой 50-58 к0а на треке 1 за 100%, то наблюдается значительное ослабление интенсивности этих пятен в треках 2 (61,15%) и 3 (5,15%). При этом фиксируется сдвиг в положении пятна с Rf 0,19 до R/0,23 (Табл.3). При поперечном сканировании пятна

с Rr0,19 на треках 1-3 (вдоль стрелки) наблюдалось его полное исчезновение уже в треке 2, по сравнению с треком 1, то есть добавление 103-кратного избытка "холодного" a-MSH прежде всего конкурентно замещает меченый гормон именно в этой области.

Таким образом,анализ [125I]-a-MSH - рецептор - м-РНК-полирибосомального комплекса позволил определить молек. массу рецептора a-MSH, которая составила величину порядка 50-55 кДа.

Следует отметить, что молек. масса рецептора меланотропинов, которая была определена для мембран клеток меланомы мыши (линии В16 и Cloudman S91) и для различных клеток меланомы человека (линии DIO, Ме8, А375 и подобные) классическим методом, а именно с помощью фотореактивных производных меланотропинов, составляет величину порядка 45 кДа [Eberle A.N. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264, 14277-14281]. Более того, молек. масса рецептора меланокортинов (MSH и АСТН), определяемая с помощью клонирования и секвенирования последовательности R-MSH- и R-АСТН-кДНК, составляет величину 35 кДа [Wikberg J. et al. (1992) FEBS Lett., 309, 417420], что может указывать на посттрансляционные изменения строения рецептора.

Таблица 3. Результаты сравнительного денситометрического сканирования треков 1, 2 и 3 на авторадиографическом снимке (Рис.5,справа)

Номер Rr Площадь Площадь

трека пятна пятна

(усл. ед.) (%)

1 0,19 3268824 100,00

2 0,23 1998790 61,15

3 0,23 168202 5,15

2.1.2. Аденилатциклазная и гуанилатииклазная системы

При анализе аденилатциклазных комплексов клеток МБ и BRO необычным оказалось почти полное отсутствие индуцибельности АС в пигментированных клетках МБ, даже под действием такого мощного и селективного индуктора АС, каким является форсколин (Рис.6,Б). В тех же условиях эксперимента наблюдалось 40-кратное возрастание внутриклеточного содержания сАМР для линии ВЯО. Высокая концентрация а-МБН (2x10 7М), которая приводила к ингибированию роста клеток обоих линий ( в разной степени ), не влияла на уровень

сАМР в цитозоле клеток МБ и вызывала 20-кратное возрастание уровня сАМР внутри клеток ВЯО к 30 мин. (Рис.бА).

а-МБН не влиял на гуанилатциклазу и активность сСМР-фосфодиэстеразы в клетках МБ и ВЯО, что следует из неизменяющегося уровня свМР во время всего эксперимента. Уровень свМР на 0,3,10,30,60 и 120 мин составлял 0,40+0,10 пкМ на 106 клеток для линии МБ, и 0,45+0,10 пкМ на 106 клеток для линии ВЯО до и после добавления 10-6М гормона.

К 3' 10'30'24« 72ч К 3' Ю'ЗС/24ч 72ч ф 0РСК0/1ИН (мкМ1

Рис.6. Фенотипические различия в функционировании аденилатциклазной системы между клетками злокачественной меланомы человека, линий МБ и В1Ю.

А - индуцируемые а-МЗН ( 2хЮ7М ) изменения внутриклеточного уровня сАМР в течение трех суток; Б - влияние селективного индуктора аденилатциклазы - форсколина на внутриклеточный уровень сАМР.

2.1.3. Влияние а-МЭН на систему клеточных медиаторов, образующих цикл внутриклеточного обмена мио-инозита и его фосфатов

Известно,что фосфоинозитиды - одни из наиболее функционально-активных фосфолипидов клеточных мембран. Они являются предшественниками вторичных мессенджеров, кратковременное накопление которых в результате рецептор-зависимого гидролиза фосфоинозитидов приводит к активации важнейших клеточных процессов. Распад всех представителей фосфоинозитидов приводит к повышению внутриклеточной концентрации диацилглицерина, который активирует Са2+, фосфолипид-зависимую протеинкиназу ( РК С ). Гидролиз же фосфатидилинозит-4,5-дифосфата (Р1Рг)

одновременно приводит к освобождению мио-инозит-1,4,5-трифосфата ( 1Рз ) - метаболита, вызывающего мобилизацию внутриклеточного кальция [Berridge M.J. (1984) Biochem. J., 220, 345-360]. В роли сигнальных молекул могут выступать также моно-, ди- и тетра-фосфаты мио-инозита. Фосфатидилинозиткиназы ( PIK и PIPK ) способны регулировать синтез предшественников и в определенной степени самих вторичных мессенджеров. Более того, известно, что иммунопреципитаты продуктов экспрессии некоторых онкогенов, типа mT-p60csrc, p60v src, p68vros, обладают PI-киназной активностью; PIK участвует в процессах трансформации и митогенеза [Taylor M.V. et al. (1984) Nature, 312, 462- 465]. В связи с исключительной ролью Р1-киназ в регуляции обмена фосфатов мио-инозита, их изучению в данной работе уделялось большое внимание.

2.1.3.а. Определение активностей PI-киназ. субклеточного распределения ферментов и действия q-MSH

При разработке оригинальных методов определения активностей PIK и PIPK, эти ферменты были выделены нами прежде всего из богатой фосфоинозитидами коры головного мозга человека и были изучены их физико-химические характеристики [9]. Далее было показано, что меланомные клеточные линии обладают высокой активностью PIK и PIPK, превышающую в несколько раз активность PI-киназ в фибробластах и лимфоцитах.

Определение активностей PI-киназ в клетках злокачественной меланомы проводилось отдельно для цитозольной и микросомальной фракции как в присутствии только эндогенных субстратов, так и при добавлении экзогенных субстратов - фосфатидил-мио-инозита (PI) и фосфатидил-мио-инозит-4-фосфата (PIP). На клетках линии BRO показано, что основная часть PIK локализована в мембранах ( около 90%), однако при изменении морфологии клеток количество фермента в цитозоле может достигать 40-50%. Из клеток линии BRO были выделены 2 формы PIK, различающиеся по связыванию с ионообменными носителями (катионная и анионная формы). В цитозоле клеток линии BRO PIK-активности обнаруживались только после добавления экзогенных PI и PIP (Рис.7). a-MSH (2xl07M) вызывал уменьшение скорости образования цитозольного PIP в первые 3-30 мин, и возрастание скорости образования Р1Рг. Мембраносвязанные формы PI-киназ обладали более высокой активностью. После добавления a-MSH через 3 мин от начала эксперимента наблюдалось падение уровней PIP и PIP2 как в случае эндогенных субстратов, так и после добавления экзогенных PI и PIP с последующим "всплеском" уровня PIP и PIP2 к 10 мин (Рис.8).

Рис.7. Изменение активностей фосфатидилинозиткиназы (1) и фосфатидилинозит-4-фосфат-киназы (2) в цитозольной фракции клеток мелано.мы линии BRO, вызываемое a-MSH. Гормон добавляли к клеткам до концентрации 2х10-7М и определяли активность ферментов с помощью экзогенных PI и PIP по скорости образования 32Р-меченых PIP* и Р1Рг*.

300

I too

Fip

/ ■—

/ г

ISO S;

SO,

25 мин

'--„^3

-л

то

500Х

Рис.8. Изменение активностей Р1-киназы и Р1Р-киназы в мембранной фракции клеток ВЯО, вызываемое а-МБН (2х 1(ИМ). Активность РЬкиназы обнаруживалась даже без добавления Р1, то есть по фосфорилированию эндогенных субстратов (1), а также после добавления Р1 (2). Активность Р1Р-киназы определялась по скорости фосфорилирования Р1Р в Р1Рг* (3).

В сравнительном эксперименте для клеток ВЯО и МБ показано, что через 30 мин после добавления а-МБН наблюдалось увеличение

скорости образования PJP и PIP2 в мембранных фракциях клеток BRO и, наоборот, уменьшение скорости образования этих фосфатов в мембранных фракциях .клеток MS, по сравнению с контролем, как в случае эндогенных, так и экзогенных субстратов (Рис.9). Подобный результат был получен также и для цитозольных форм Р1-киназ.

кн кн кн кн

Е PI PIP PJP (PIP*)

КН КН кн кн

Е PI PIP PJP (pjpp

Рис.9. Различия в действии a-MSH (2x107М) на активность PI- и PIP- киназ в мембранах клеток MS и BRO. К - контроль ( инкубация клеток без гормона ); Н - инкубация в присутствии гормона; Е - в присутствии только эндогенных субстратов; PI и PIP - в присутствии экзогенных субстратов.

Пунктиром показано образование р2Р]-Р1Рг ( Р1Рг*). Приведены данные на 30 мин инкубации с гормоном.

2.1.3.б.Влияние ос-МЭН на уровень фосфатов мио-инозита --1Р|, 1Р2и 1Рз

В случае клеток линии МБ, в течение первых 30-90 сек а-МБН (2х10 7М) индуцировал резкие изменения внутриклеточного

уровня moho-, ди- и три- фосфатов мио-инозита (IPi, 1Рги 1Рз) (Рис.10). Наиболее значительным было уменьшение уровня 1Рз. К 5 мин наблюдалось увеличение уровня IP2, однако уровень 1Рз не восстанавливался до исходного. Уровни всех фосфатов мио-инозита были выше в присутствии ионов Li+, который, как известно, блокирует дефосфорилирование IPi. Для клеток линии BRO изменения в системе инозитольного цикла были менее значительными. Наблюдалось восстановление концентрации IP2 и 1Рз до исходного уровня к 2-3 мин после добавления a-MSH ( в эксперименте без ионов Li+). Резкие изменения уровней IPi и 1Рз наблюдались в секундном диапазоне, на 30 сек. Общий характер всех изменений был противоположным по отношению к наблюдаемым изменениям для клеток MS, особенно в случае изменений концентрации 1Рз (Рис.10).

5000

1000

3000 v*

и*

MS , ■i—

5000

3000 г/ а

1000 _1— , BRO

~f"\ г ,--■

1 2 3 4 5

t, мин

5000 3000 1000

Рис.10. Различия в динамике изменений внутриклеточных уровней мио-инозит фосфатов-1Р,(А), 1Р2(Б) и 1Р3(В) между линиями клеток МБ и ВЯО, выявляемые при инги-бировании роста а-МЭН (2х10-'М) в отсутствие и в присутствии ионов и*.

i___i

i_i

2.1.4. Действие а-МБН на активность фосфолнпид.Са2*-зависимой протеинкиназы (РК С)

Активность РК С определялась по фосфорилированию гистона Н1, отдельно в цитозольных и микросомальных фракциях клеток линий МЗ и ВЛО, без активаторов, а также в присутствии активаторов РК С (фосфатидилсерин, диолеин и Са2+)- На рис. 11 представлены результаты эксперимента на 30 мин после добаления 2х10-7М а-МБН. Результаты показали, что а-МБН индуцировал активность цитозольных и микросомальных форм РК С в клетках МБ и приводил к уменьшению активности этих же форм РК С в клетках В1Ю, как в присутствии активаторов, так и без.

„ вяо

МБ

С А цито^оль

С А

МИКРОСОМЬ!

МБН

С А С А

иито^аль иикросомы

I МБН

МБ

ВРО

С А С А цто^оль микросоны

С А СД

ЦИТО^ОМ) микросомы

Рис. 11. Влияние а-МБН на активность протеинкиназы С ( РК С ) в цитозольных и микросомальных фракциях клеток МБ и ВШЭ: С - активность РК С без активаторов; А - активность РК С в присутствии фосфатидилсерина, диолеина и Са2+. Активность фермента оценивалась по степени фосфорилирования белка - гистона Н 1 [у-з:Р]АТР.

Таким образом, выявленные отличия в различных системах клеточных медиаторов между фенотипически различающимися клетками меланомы линий MS и BRO могут быть связаны с особенностями гормональной регуляции пролиферативной активности этих клеток. Для пигментированных клеток линии MS основная регуляция может осуществляться посредством медиаторов инозитольного цикла и их предшественников - PIP, PIPz, IPi и 1Рз и без участия аденилатциклазной системы. Для амеланотичных клеток меланомы линии BRO более вероятна регуляция пролиферативных процессов посредством АС и изменения уровня сАМР. Роль PK С в регуляции пролиферативной активности клеток MS и BRO также может быть различной. Известно, что PK С контролирует каскад реакций, связанных с активацией транскрипции таких онкогенов как ras, ros, src, sis, fms, fos и jun [Binetruy B. et al. (1991) Nature, 351. 122124; Cook R.M. et al. (1993) Curr. Probl. Cancer, 17, 69-141]. Возможно,что PK С в клетках MS, при их активации a-MSH, может, в свою очередь, активировать транскрипцию какого-то неизвестного гена, кодирующего рост-ингибирующий фактор, а для клеток BRO может быть обратный эффект, где PK С активирует экспрессию онкогена, кодирующего фактор роста. Это косвенно подтверждается результатами экспериментов с ингибиторами протеинкиназ ( см. в разделе З.2.1., рис.24 ). Не исключены и другие варианты регуляции пролиферативной активности клеток, связанные с "up"- и "down"-механизмами регуляции активности отдельных изоформ PK С, которые могут выполнять разную роль.

2.2. Изучение особенностей роста клеток злокачественной меланомы человека in vitro и факторов, определяющих их пигментацию

Изучены условия, необходимые для культивирования клеток злокачественной меланомы. Показано, что монослойные культуры клеток MS и BRO могут выращиваться на обычной среде RPMI-1640. При культивировании в этой среде клетки линии MS постепенно теряли активность Т-азы. Замена среды на обогащенную аминокислотами, особенно L-тирозином, среду L-15 и добавление Си2+ (10 s- 1 (ИМ), а также замена на среду F-10 и добавление L-тирозина (200мМ) не приводили к восстановлению активности Т-азы. Кратковременное или продолжительное воздействие a-MSH (10810 6М) не вызывало возрастания активности Т-азы и пигментации клеток. Существенным фактором индукции пигментации оказалось количество добавляемой к среде фетальной сыворотки. При снижении

концентрации сыворотки с оптимальной (10%) до 5-3% активность Т-азы восстанавливалась. Более того, был получен сильно пигментированный (черный) клон клеток ( МБт ). Показано, что фетальная сыворотка содержит факторы, ингибирующие окисление ЮОРА в ООРА-хинон и таким образом влияет на процесс меланизации.

В опытах на клетках меланомы хомяка, линии11РМ1-1846, нами было установлено, что в отличие от первичных меланоцитов клетки меланомы не требуют для своего роста присутствия форболовых эфиров. Более того, с увеличением концентрации форболовых эфиров наблюдается ингибирование роста клеток и их способности образовывать колонии в мягком агаре (Рис.12).

Показано, что пигментированные и амеланотичные линии клеток различаются качественно и количественно по способности утилизировать аминокислоты и углеводы [ Э-глюкозамин (Б-С1и-ЫНг), ¿-галактоза (0-Са1), Ь-фукоза (Ь-Ёис)]. Так, потребление клетками линии МБ Ь-Иис было в 3,4 раза выше, а О-Са) -в 8,6 раза выше, чем клетками линии ВЯО, а потребление Э-СЫ-ЫШ клетками МБ, наоборот, было меньше в 3,8 раза, по сравнению с клетками ВЯО (Рис.13). Столь значительные различия в утилизации В-С1и-МШ, Э-Оа1 и Ь-Рис, которые, как известно, используются клетками, в основном, на образование углеводной части гликопротеидов мембран и других структур, могут в значительной степени определять особенности функционирования систем регуляции клеточного роста.

% юо

75 50

Рис. 12. Влияние тетрадеканоилфорбол ацетата ( ТРА ) на пролиферативную и колоний-образующую активность клеток меланомы хомяка, линии ИРМ-Шб:

А - изменение средней площади ( Б ), занимаемой колониями клеток, по сравнению с контролем ( К ); Б - влияние ТРА на число колоний, образуемых клетками. Приведены результаты эксперимента на 14 день после воздействия ТРА.

Рис. 13. Различия в утилизации меченых углеводов: Ь-фукозы ( 1_-[6-5Н]Рис ), Р-галактозы ( 0-[!Н]0а1 ) и О-глюкозамина ( В-[6-3Н](31и->Ш2 ) клетками меланомы линий ВЬЮ и М5. Приведены данные на 3 сутки после введения меток.

2.3. Аутокринная регуляция роста клеток злокачественной меланомы

2.3.1 .Обнаружение и выделение новых рост-модулирующих факторов

При культивировании клеток МБ в условиях снижения концентрации фетальной сыворотки, нами было отмечено, что некоторые клоны пигментированных клеток продолжали расти в бессывороточной среде. Это послужило основой для предположения о трансляции клетками собственных ростовых факторов, которые могут выделяться в культуральную среду. Представлялось также интересным

выявить наличие собственных факторов, ингибирующих рост клеток. Гипотеза об аутокринной регуляции роста опухолевых клеток в общем виде была высказана ранее [Sporn М. В., Roberts А. В. (1985) Nature, 313, 745]. Наши эксперименты подтверждают эту гипотезу, по крайней мере для клеток злокачественной меланомы.

В бессывороточной культуральной среде клеток меланомы линии MS нами была обнаружена рост-модулирующая активность, а затем разработана стратегия выделения рост-модулирующих факторов. Методами ультрафильтрации, аффинной хроматографии и гель-фильтрации при низком и среднем давлениях было проведено выделение новых рост-модулирующих факторов. Кратко, супернатант, после центрифугирования и фильтрации "отработанной" бессывороточной кондиционированной среды клеток линии MS, подвергали концентрированию и ступенчатому фракционированию с помощью мембранной ультрафильтрации на основные фракции с молек. массой: А - более 30 KDa и Б - менее 30 KDa. Затем эти фракции разделяли гель-фильтрацией на носителе Тойоперл HW-50. Рост-модулирующей активностью обладали фракции 3-4А (условное обозначение) и ЗБ, которые далее подвергались афинной хроматографии на специально приготовленной гепарин-сефарозе-4В. Гепарин был выбран нами в связи с тем, что, как известно, этот гликозаминогликан является важным компонентом внеклеточного матрикса, широко представлен в организме (кожа, легкие, печень, тучные клетки) и обладает высоким сродством ко многим ростовым факторам [Klagsbrun М. et al. (1987) Methods in Enzymol., N.Y.: Acad. Press, 147, 95-119]. При вымывании с аффинной колонки в градиенте концентрации NaCl (0,1-2,ОМ), рост-модулирующая активность была обнаружена лишь в части элюента - во фракциях 3-4Ааф. и ЗБаф. (условн. обознач.). Далее эти фракции были подвергнуты высокоэффективной гель-хроматографии на колонке Superóse 12 HR 10/30 ("LKB-Pharmacia", Швеция). Профили элюции представлены на рис.14. Видно, что фракции 3-4Ааф. и ЗБаф, представляют собой сложную смесь макромолекул с различной молек. массой. Тестирование на рост-модулирующую активность позволило выявить активные фракции, которые не соответствовали максимумам пиков (заштрихованные области на рис.14,а и 14,в, условные обозначения - Fi, Fo.s и Fs). Последующая наработка активных фракций и повторная гель-хроматография на предварительно откалиброванной по молек. массам колонке Superóse 12 HR 10/30, а также определение белка по Лоури во фракциях (на наличие пептидных связей) показали,что фактор Fi представляет собой полипептид с молекулярной массой около 1 KDa (рис.14,г), а фактор F0.5 - 0,5-1 к0а (рис.14,б). Фракция белков Fe (4-12 KDa), после повторной высокоэффективной гель-хроматографии

и анализа отдельных фракций, не проявляла рост-модулирующей активности в отдельных элюентах, эффект был только кооперативным.

Показана эффективность и селективность действия новых рост-модулирующих факторов на клетках меланомы разных фенотипов -MS и BRO, и на фибробластах (Рис.15). Данные показывают, что фактор Fos оказывает на клетки злокачественной меланомы человека, линии MS, рост-стимулирующее воздействие, причем в диапазоне концентраций фактора 10-9-10"7М эффект был в 2-3 раза сильнее по сравнению с обычно добавляемой эмбриональной сывороткой (Рис. 15а). Фактор Fi и суммарный фактор Fs оказывали на рост клеток меланомы линии MS ингибирующий эффект (Рис. 156,в). В случае суммарного фактора Fs ингибирующий эффект возрастал с увеличением концентрации, при этом 1Сэо, то есть почти полное ингибирование роста клеток, наблюдалось при концентрации 10-2мг/мл, что соответствует величине приблизительно 10бМ. Для фактора Fi наблюдалась "колокол"-подобная зависимость, с максимальным ингибированием при концентрации ÍO MO 'M. Для изучения селективности выделенных факторов использовались также клетки меланомы амеланотичной линии BRO и клетки фибробластов легких человека, линии Леч 240 (Fb). Из данных, представленных на рис.15, видно, что суммарный фактор Fs оказывает на рост клеток злокачественной меланомы другого фенотипа (BRO) более выраженный ингибирующий эффект, чем на клетки линии MS, при концентрациях 10"8 - 10 э мг/мл, с ICso Ю-7 мг/мл, то есть порядка 10-"М, а фактор Fi ингибирует рост клеток BRO только при концентрациях выше 10'6М. Фактор Fo.s не активирует рост клеток линии BRO, по сравнению с эмбриональной сывороткой. Все выделенные факторы не оказывали никакого влияния на рост клеток фибробластов легких. Выделенные низкомолекулярные селективные росг-модулирующие факторы могут участвовать в аутокринной и паракринной регуляции роста клеток злокачественной меланомы разных фенотипов. Сложная концентрационная зависимость проявления рост-модулирующей активности выделенных факторов, их кооперативный эффект в сочетании с влиянием других ростовых факторов, присутствующих в межклеточной среде организма и секретируемых другими клетками могут значительно затруднить практическую реализацию подходов к регуляции роста опухолевых клеток. Тем не менее, низкие молекулярные массы выделенных факторов Fo.j и Fi , по сравнению с описанными ранее ростовыми факторами и цитокинами [1], и высокая эффективность ингибирования роста клеток меланомы факторами Fi и Fe, представляют интерес для дальнейших исследований в онкологии.

0,006 H

0,002 J

0,5 \

280 i 0.008H

0,004-1

12 20 № фракции

-i-1-г-

í I

№ фракции

Рис. 14. Высокоэффективная гель-хроматография на колонке Superóse 12 HR 10/30 отдельных фракций, проявивших

рост-молулирующую активность: а ~ фракция 3-4Ааф. Заштрихованные области — фракции полипептидоп с молекулярными массами 8-12 кДа (F^) и 0,5-1 кДа (Fot5>, проявившие рост-ин-гибирующую и рост-стимулирующую активности, соответственно; б — фракция Fot5 (после многократной аффинной хроматографии фракции 4А); а -фракция ЗБаф. Заштрихованная область — фракции с молекулярной массой около 1 кДа (Fj), проявившие рост-ингибирующую активность; г - фракция Fj (объединенные фракции с биологической активностью, после многократной хроматографии фракции ЗБ). Основной пик - полипептид с молекулярной массой около 1 кДа. Скорость элюции — 30 мл/ч. Стрелками и цифрами над профилем элюции показано местоположение выхода полипептидов с определенными молекулярными массами, к Да.

и> »о

мкг/м и

Рис.15. Рост-модулирующая активность выделенных факторов: а - фактор Ро.5', б - фактор Н"|; в - суммарный фактор Рв. В качестве контроля использовались клетки, выращиваемые с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки. МБ, В1Ю -линии клеток злокачественной меланомы, РЬ - линия Леч 240 фибробластов легких человека. По оси абсцисс указана концентрация добавляемых пептидов, выраженная в М или мкг/.чкл; по оси ординат - относит, радиоактивность ( рН]тимидин), % от таковой в контроле.

2.3.2. Гипотетическая схема регуляции роста клеток злокачественной меланомы

На основании проведенных исследований по изучению особенностей регуляции роста клеток злокачественной меланомы различных фенотипов и с учетом имеющихся литературных данных может быть предложена гипотетическая схема регуляции роста клеток меланомы, в которой рост-модулирующие факторы участвуют в регуляции преимущественно паракринным или аутокринным путями (Рис.16).

Аутокринная система регуляции подразумевает наличие так называемой аутокринной петли, когда клетки экспрессируют не только ростовые факторы, но и их рецепторы на поверхности этих же самых клеток. Аномальная экспрессия рецепторов ростовых факторов отмечена для многих опухолевых клеток [Hedlin С.Н. et al. (1987) ВВА, 907,219-244; Fathi Z. et al. (1993) J. Biol. Chem., 268 , 5979-5984].

Накопленные данные свидетельствуют, что аутокринная форма регуляции роста типична для наиболее злокачественных форм рака типа мелкоклеточной карциномы легких и злокачественной меланомы [Cook R.M.et al. (1993) Curr. Probl. Cancer, 17, 69-141; Rodeck U. (1993) Cancer Metastasis Rev., 12, 219-226]. Для метастазирующих опухолей отмечено, что на ранних стадиях прогрессии проявляется тенденция для большинства типов опухолей метасгазировать и расти в определенных тканях, при этом доминирует паракринный тип регуляции роста. На поздних стадиях развития метастазов, когда происходит обсеменение различных тканей и органов, наоборот, предполагается доминирование аутокринного типа регуляции роста метастазирующих клеток. Развитие злокачественных клеток может привести к полному автономному (акринному) состоянию. На этой стадии развития предполагается, что рост клеток полностью не зависит от аутокринных и паракринных рост-модулирующих факторов [Nicolson G. L. (1993) Cancer Metastasis Rev., 12, 325-343].

Аутокринная регуляция роста клеток злокачественной меланомы человека может осуществляться посредством таких известных ростовых факторов, как фактор роста из тромбоцитов (PDGF, А и В), фактор роста опухолей-а (TGF-а), фактор роста фибробластов (bFGF), интерлейкины-1, 4 и 8, фактор некроза опухолей (TNF-a), а также с участием ингибиторов роста - интерлейкина-6 и фактора роста опухолей-ß (TGF-ß, 1 и 2). Для отдельных линий клеток злокачественной меланомы в качестве аутокринных факторов могут выступать

недавно обнаруженные факторы - так называемые "стимулирующая рост меланом активность" (MGSA) и "ингибирующая рост меланом активность" (MIA) [Bogdahn U. et al. (1989) Cancer Res., 49, 5358-5363; Apfel R. et al. (1992) Melanoma Res., 2, 327-336], а также открытые нами в это же время рост-модулирующие факторы F0.5 , Fi и Fe [12,53,55]. Для клеток меланомы отмечается сверхэкспрессия рецептора EGF и изменение клеточных протоонкогенов, участвующих в передаче сигнала (ras, myb) и супрессии роста (по белку р53 ), а также высокая экспрессия онкогенов, регулирующих процесс транскрипции ( fos, jun, ski ) [Kraehn G.M. et al. (1995) Cancer, 75, 1228-1237].

Представленный материал убедительно доказывает существование аутокринного типа регуляции роста для клеток злокачественной меланомы. При этом поддержание определенного клеточного фенотипа может определяться соотношением между аутокринными факторами роста и их количеством, а разрегулирование процессов аутокринной регуляции и соотношения между ростовыми факторами может инициировать рост клеток определенных фенотипов. Следует сказать, что биологический контроль за регуляцией клеточного роста может осуществляться не только на уровне синтеза ростовых и ингибирующих факторов и экспрессии их рецепторов, но и с помощью молекул внеклеточного матрикса, а также латентных, неактивных форм ростовых факторов. Механизмы активации этих комплексов могут быть вовлечены в процессы регуляции роста. Кроме того, возможна модуляция аутокринного роста процессами дифференцировки [1].Таким образом, с учетом вышеизложенного, общая схема гормональной регуляции роста опухолевых клеток может рассматриваться лишь с большой долей условности. Каждый тип и фенотип клеток обладает своими особенностями регуляции , своим набором росг-модулирующих факторов и концентрационными соотношениями между ними. На процессы регуляции роста оказывают влияние многие факторы, и в каждом случае необходима их конкретизация. На рис.16 представлена возможная схема регуляции роста клеток злокачественной меланомы человека, линии MS, с участием уже изученных медиаторных систем. Для клеток амеланотичной линии BRO схема регуляции будет иной. В частности, в регуляции пролиферативной активности этих клеток под действием a-MSH принимает участие аденилатциклазная система и PK А (см. разделы 2.1.2. и З.2.1.).

МБН

Рис.16. Гипотетическая схема регуляции роста клеток линии МБ злокачественной меланомы человека. Для клеток линии вкО в регуляции пролиферативной активности принимает участие аденилатциклаза и сАМР-зависимая протеин-киназа ( РК А).

.к ы

2.4. Другие факторы, оказывающие влияние на рост опухолевых клеток

Известно, что в организме среди гуморальных факторов, оказывающих влияние на рост опухолевых клеток, немаловажное значение имеет наличие или выработка специфических иммуноглобулинов, связывающихся с определенными антигенными детерминантами на поверхности этих клеток. Выявление разнообразных опухолеассоциированных антигенов является важным для экспериментальной онкологии, особенно при изучении процессов прогрессии и метастазирования опухолей.

К настоящему времени доказано наличие специфического иммунного ответа на меланому у человека. Основой доказательства является обнаружение специфических антител в крови больных и выявление цитотоксических лейкоцитов, инфкльтрующих опухолевую ткань [Hersey P. etal. (1985) Pathology, 17, 346-354; Kawakami Y. (1995) Immunol. Front., 5, 23-28]. Непрямая иммунотерапия меланомных опухолей также может оказаться эффективной при использовании высокоспецифичных моноклональных антител (МКА) к меланомо-ассоциированным антигенам. Положительные результаты достигнуты при клинических испытаниях МКА R24, направленных против GDs-ганглиозидных антигенов [Hougton А.Н. et al. (1985) PNAS USA, 82, 1242-1246]. Эти же антитела показали удовлетворительные результаты в комбинированной иммунотерапии с интерфероном [Caulfield M.J. et al. (1990) J. Biol. Response Modifiers, 9, 319-328] и в сочетании с рекомбинантным макрофаг-колоний-стимулирующим фактором при лечении пациентов с метастазирующей меланомой [Minasian L.et al. (1995) Cancer, 75, 2251-2257]. Поиск новых меланомоассоциированных антигенов остается актуальной проблемой, во-первых, в силу большого фенотипического многообразия меланомных опухолей и, во-вторых, в связи с тем, что несмотря на большое количество идентифицированных антигенов и получение МКА, не все из них обладают высокой меланомоассоциированной специфичностью и не представляют практической ценности для клиники.

Нами для получения МКА были взяты клетки злокачественной меланомы человека, линии BRO, которые использовались в нативном виде для иммунизации мышей. Гибридомы получали по ранее описанному методу [Kehler N., Milstein М. (1975) Nature, 256, 495] (работа выполнялась совместно с А.В.Яхъяевым и В.К.Сологуб). В результате проведенной работы получен и отобран клон клеток, продуцирующих МКА ( МКА 59 ) к клеткам меланомы. Показана

специфичность связывания МКА 59 с клетками меланомы линий ВГЮ и МБ, отсутствие связывания с клеточными культурами лимфоцитов и фибробластов. Иммуногисгохимическими методами анализа криостатных срезов показана специфичность связывания МКА 59 с меланомными опухолями (операционный материал) и отсутствие связывания с клетками нормальных органов и тканей - печень, почки, селезенка, головной мозг, миокард, кожа (аутопсийный материал) (работа выполнена совместно с О.В.Макаровой). Наблюдалось лишь слабое связывание с фибробластами соединительнотканной стромы. Путем иммунохлмического анализа белков гомогената клеток ВЯО, после их разделения методом ЭФ и последующего блоттинга, удалось идентифицировать меланомоассоциированный антиген,

связывающийся с МКА 59. Определена молек. масса нового белка-антигена - 160 кГЗа (Рис.17). Меланомоспецифичные антитела МКА 59 охарактеризованы как иммуноглобулины класса в, подкласса ^

N. и., кОа

150—-

94—-67—-

и—-

30---

16—-

Рис.17. ЭФ-блот-анализ меланомоассоциированного антигена к МКА 59, выявляемого в гомогенате клеток Б КО. Стрелками с цифрами указаны местоположения белков-маркеров с определенной молек. массой в кДа.

III. Разработка экспериментально-обоснованных направлений поиска лротивомеланомных химиотерапевтических средств (1-4,6-8, 10, 12, 14, 47, 48,51, 54, 56-64]

Изученные биохимические и фенотипические особенности клеток меланомы, а также теоретические предпосылки, позволили определить следующие возможные направления поиска противомеланомных химиотерапевтических средств:

3.1. Для пигментированных и обладающих L-DOPA-оксидазной активностью меланом:

3.1.1. Использование соединений с высокой степенью связывания с меланинами;

3.1.2. Использование регуляторов и особенностей метаболической системы меланогенеза.

3.2. Для всех разновидностей меланом, в том числе непигментированных и амеланотичных:

3.2.1. Поиск препаратов на основе аналогов сАМР и ингибиторов протеинкиназ А и С ;

3.2.2. Использование моноклональных антител к специфическим антигенам меланомных опухолей и иммунотоксинов на их основе;

3.2.3. Создание препаратов с использованием пептидных регуляторов роста типа a-MSH и его аналогов. Гибридные токсины на основе меланотропинов;

3.2.4. Использование аутокринных и паракринных селективных ингибиторов роста, в сочетании с МКА к ростовым факторам и их рецепторам.

3.1. Пигментированные и обладающие L-DOPA-оксидазной активностью меланомы

3.1.1. Использование соединений с высокой степенью связывания с меланинами

Теоретически пигментация наиболее злокачественных форм меланомы может быть использована в качестве мишени направленного воздействия противоопухолевых препаратов. Известно, что способность меланина связывать лекарственные вещества намного

превосходит способность всех остальных биополимеров в живых тканях. При этом механизм цитотоксического воздействия может быть любым. Еще в 1973 г. было показано, что противомалярийный препарат хлороквин (хлорохин) преимущественно связывается с пигментированными меланомами [Kim S.H. et al. (1973) Cancer, 32, 536570]. Подобной высокой аффинностью к меланинам обладают многие ароматические и полициклические соединения, например гербициды паракват и дикват [Larsson L. et al. (1977) Ехр.Еуе Res., 25, 353-359]. Однако это является и ограничением применения подобных препаратов в качестве лекарственных средств, так как меланин содержится также в субстанции "нигра" мозга, определяет пигментацию глаз и кожи. Подобные препараты обладают высокой аффинностью к меланинам различного происхождения (Рис.18). Кроме того, цитотоксичность и селективность действия подобных препаратов по отношению к клеткам злокачественной меланомы низка, что было показано нами при изучении действия параквата на клетки пигментированной линии MS, амеланотичной линии BRO и на фибробласты легких человека (Рис.18, Г)- Поэтому данное направление поиска следует отнести к мало перспективным.

Связывание хлороквииа с меланиновыми гранулами Связывание хлороквнна с желто-серо» фракцией (черный глаз быка) субстанции "нигра" мозга человека

Связывание параквата с меланиновы.ми

гранулами (черный глаз быка)

Ингибирующее действие параквата на рост клеток мелаиомы МБ и В110, и фибробластов легких человека (П))

Г.

Рис.18. Определение характеристик связывания хлороквина и параквата с меланиновыми гранулами, выделенными из черного глаза быка, и с желто-серой фракцией субстанции "нигра" мозга человека в координатах Скэтчарда ( А, Б, В), и специфичности цитотоксического действия на клетки, содержащие (линия МБ ) или несодержащие ( клетки ВЯО и РЬ ) меланин (Г).

Приведены значения констант связывания ( К| , Кг, Кз ) и число микромолеи лиганда, связавшихся с 1 мг меланина данной аффинности ( т, п2, го ), V - число микромолей лиганда, связавшихся с 1 мг меланина; С - концентрация несвязавшегося "свободного" лиганда в мкМ.

3.1.2. Использование регуляторов и особенностей метаболической системы меланогенеза

Процессы меланогенеза представляют значительный интерес с точки зрения возможностей разработки эффективных средств лечения пигментированных опухолей. Известно, что в процессе меланогенеза из L-тирозина, L-DOPA и L-DOP-амина образуются токсичные для клеток ингермедиаты - DOPA-хинон, DOPA-хром и другие [Graham D. G. et al. (1978) J. Invest. Dermatol., 70, 113-116]. Естественно предположить, что увеличение концентрации этих интермедиатов за счет активации Т-азы, а также возможного ингибирования их дальнейшего окисления может привести к усилению эффекта. Кроме того, перспективным может быть направление по поиску субстратов Тазы, образующих в процессе превращений токсичные продукты. Таким образом, во всех этих процессах ключевым ферментом является Т-аза и ее активность.

Нами было проведено изучение L-DOPA-оксидазной активности Т-азы различного происхождения. Показано, что активность Т-азы в гомогенатах эпидермиса кожи коррелирует с ее цветностью. Максимальная DOPA-оксидазная активность обнаружена для пигментированных клеток меланомы линии MS и в меланомных опухолях ( операционный материал ) (Рис. 19).

Нм ООФА

•хромо

мг 8елка х15мин

120

¿0

160

ЬГ-3

СП

о сг

кРысы клеток

Рис.19. Сравнительная оценка L-DOPA-оксидазной активности в различного происхождения.

° £

£ S

о <

§ §

« 9.

s S

образцах

Клетки меланомы хомяка, линии ЯРМ1-184б, и фибробласты легких человека не обладали активностью Т-азы, а амеланотичная линия клеток меланомы, ВЯО, тормозила окисление ЮОРА по сравнению со спонтанным окислением Ь-БОРА кислородом воздуха в контроле. Подобный эффект наблюдался и для отдельных образцов кожи белого человека ( Рис.20, 46 образцов, Московский регион).

Рис.20. Кинетические кривые каталитической ЮОРА-оксидазной активности в гомогенатах эпидермиса кожи человека ( Московский регион). Цифрами в конце кривых указаны номера образцов (всего 46 образцов).

Для изучения процессов окисления ЮОРА в ООРА-хром и причин, связанных с ингибированием окисления, было проведено выделение Т-азы из кожи серой крысы, белого человека и меланомы человека. Методами хроматографии ( гель-фильтрация, анионо-обменная хроматография, двойная аффинная хроматография на Соп А -сефарозе и аминобензоил-СН-сефарозе ) из эпидермиса кожи серой крысы был выделен гомогенный по данным электрофореза препарат Т-азьг. В коже белого человека Т-аза не обнаружена. Более того, обнаружен ингибитор неферментативного окисления Ь-ЭОРА, который был выделен и охарактеризован (Рис.21). Этот же белок, в незначительных количествах, содержался в коже крысы и не отделялся от Т-азной фракции до последней стадии выделения (Рис.22). Данный белок при концентрации 2,6 мкМ ингибировал Ь-тирозин-оксидазную активность Т-азы на 80%, причем характер ингибирования был конкурентным по отношению к Ь-тирозину как субстрату. Однако этот белок не оказывал никакого влияния на скорость окисления ЮОРА препаратами Т-аз, выделенных из кожи крысы и меланомы человека. Таким образом, выделенный белок ингибировал стадию окисления Ь-тирозина в Ь-ООРА, но не влиял на ферментативное окисление Ь-ООРА в ООРА-хром. Ингибирование окисления ЮОРА было не связано с наличием или отсутствием фермента. Зависимость ингибиторных свойств выделенного белка от субстрата Т-азы может говорить о наличии разных форм Т-азы, участвующих в этих процессах. С целью изучения гетерогенности ЭФ-гомогенных препаратов Т-азы было проведено изоэлектрическое фокусирование, которое позволило выявить для препарата из кожи 9 изоформ Т-азы, обладающих Ь-ООРА-оксидазной активностью, основными из которых являются белки с р1 4,26 и 4,33. Препарат Т-азы, выделенный из меланомы человека, состоял из двух ЭФ-изоформ, которые при изоэлектрическом фокусировании проявляли высокую гетерогенность в более кислой области - р! 3,0-3,6 (Рис.23). Удельная активность препарата из меланом существенно превышала активность Т-азы из эпидермиса кожи.

Таким образом, основываясь на высокой активности Т-азы в клетках меланомы и наличии изоформ фермента, которые отличаются по своим физико-химическим характеристикам от препаратов Т-азы, выделенных из других источников, можно рассматривать данное направление по поиску противомеланомных средств как достаточно перспективное для пигментированных опухолей. Поиск новых препаратов следует проводить среди субстратов Т-азы - синтетических аналогов Ь-Туг и ЮОРА, которые могут образовывать под действием Т-азы высокотоксичные продукты. Кроме того, возможно использование обнаруженных нами и типичных только для меланомы

изоформ Т-азы в качестве антигенов при получении специфических моноклональных антител. с

Рис.21. Электрофореграмма эпидермального белка, выделенного из кожи человека. Цифры слева - молек. массы (кБа) белков-стандартов (1). Эпидер-мальный белок (2) представлен фракцией, элюируемой с СНБ-сефарозы-4В 0,01 М натрий-фосфатным буфером, рН 8,0, и ингибирующей окисление Ь-БОРА в РОРА-хром. Окрашивание - Кумасси К-250.

9Í —

61 — АЗ

30 —

«*

Рис.22. Аффинная хроматография на СНБ-сефарозе-4В Con А-гликопротеидных фракций, выделенных из кожи серой крысы (а) и кожи человека (б). Колонку промывали буфером с рН 4,7 (I); буфером, содержащим 5 мМ L-тирозина (II); буфером, рН 4,7 (III); 0,01 М натрий-фосфатным буфером, рН 8,0 (IY). 1 - A¡so, 2 - L-DOPA-оксидазная активность.

; 4 pi • -f 5,20 — 4,55 —;

'3,50

2 ""j

a**» V

4»

jfi

1-2.3 4

Рис.23. Блот-анализ препаратов тирозиназы, выделенных из кожи серой крысы ( I - 3 ) и меланомы человека ( 4 ). Изоэлектрическое фокусирование проводилось в диапазоне pH 2,5 - 5,0. Ферментативная активность препаратов после переноса на мембрану определялась по окислению L-DOPA в меланины ( темные полосы ). Слева приведены положения белков-стандартов ( pl ). Стрелками без цифр указаны положения изоформ тирозиназ, наиболее активно окисляющих L-DOPA. Количество белка в треках - 23 (1), 38 (2), 125 (3), 14 мкт (4).

3.2. Все разновидности меланом, в том числе непигментированные и амеланотичные

3.2.1 .Использование аналогов сАМР и ингибиторов протеинкиназ А и С

Данное направление активно разрабатывается для различных видов опухолей [Langdon S.P., Smyth J.F. (1995) Cancer Treatment Rev., 21, 65-89]. Для изучения возможностей использования ингибиторов PK А и PK С в качестве потенциальных противомеланомных средств

были выбраны эффективные ингибиторы активностей протеинкиназ: 1-(5-изохинолинсульфонил)-2-метилпиперазин ( Н-7 ) с K¡ 6 мкМ для РК С и K¡ 3,0 мкМ для РК А, а также селективный ингибитор РК А -пептид H-Thr2-Tyr-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Ser-Gly-Arg-Thr-Gly-Arg2-Asn-Ala-Ile-His-Asp-OH ( In А ), с K¡ 0,0023 мкМ. Пептид является активным участком ингибиторного белка скелетной мышцы [Cheng

H.С. et al. (1986) J. Biol. Chem., 261, 989].

При изучении влияния этих ингибиторов протеинкиназ на рост клеток злокачественной меланомы нами получены данные, хорошо согласующиеся с биохимическими особенностями и механизмами гормональной регуляции роста фенотипически различающихся клеточных линий MS и BRO, которые были описаны в разделе II. На рис.24 представлены данные по влиянию Н-7 и In А на пролиферативную активность клеток. Видно, что ингибирование активностей протеинкиназ в диапазоне концентраций 10'7 - Ю^М практически не оказывает влияния на рост клеток меланомы линии MS, а ингибитор Н-7 при концентрации 4x104М даже вызывал увеличение пролиферативной активности этих клеток .Добавление a-MSH(2xl0 7M) приводило к небольшому снижению пролиферативно-го потенциала клеток. Селективный ингибитор РК А - 1пА не оказывал никакого влияния на рост клеток MS даже при концентрациях

I,8х10-3М. Совершенно противоположный эффект наблюдался для амеланотичных клеток линии BRO - ингибирование активностей киназ, прежде всего РК А, приводило к значительному ингибированию роста клеток. Эффективным было действие InA, для которого 1Сзо составила величину 9х10 5М, а для Н-7 IC50 была порядка 2х10"4М. Почти полное, на 90-100%, ингибирование роста клеток BRO наблюдалось при концентрации InA l,8xl0 3M. Как в случае Н-7, так и для InA добавление a-MSH усиливало эффект. Таким образом, проведенные эксперименты косвенно подтверждают прежде всего тот факт, что регуляция роста амеланотичных клеток линии BRO осуществляется посредством и с участием АС и сАМР-зависимой протеинкиназы, в то время как пигментированные клетки линии MS не чувствительны к ингибированию сАМР-зависимых путей передачи рост-модулирующих сигналов. Приведенные экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что данное направление по поиску противомеланомных препаратов может быть эффективным только в случае детального изучения биохимических особенностей разных типов и видов раковых клеток и требует создания соответствующей диагностической системы по тестированию киназных активностей, которая может быть пригодна для клиники.

5 Z со

10° 10" (M) хДЭля Н-7 х185ля1пА

Рис.24. Действие ингибиторов протеинкиназ А (1п А и Н-7 ) и С ( Н-7 ) на рост клеток МБ и ВЯО, оцениваемое по включению [3Н]тимидина. 1 - Н-7; 2 - Н-7 в присутствии а-МЭН ( 2х10-'М ); 3 - 1п А; 4 - 1п А в присутствии а-МЭН (2х10 7М).

3.2.2. Моноклональные антитела к специфическим антигенам меланомных опухолей и иммунотоксины на их основе

МКА, помимо непосредственной иммунотерапии в сочетании с иммуномодуляторами, могут использоваться и как химиотерапевтичес-кие средства в виде конъюгатов с цитостатиками, радиоизотопами и токсинами. Данный подход интенсивно разрабатывается в онкологии последние 15 лет. При лечении меланом также была показана эффективность иммунотоксинов, в том числе в клинике [Spitter L.E. et al. (1987) Cancer Res., 47, 1717-1723]. В качестве токсинов наибольшее применение нашли полипептиды растительного происхождения -рицин, абрин, модесцин, ингибирующие рибосомальные субъединицы, а следовательно и трансляцию белков в опухолевых клетках, с высокой скоростью. Недостатком данных токсинов является их изначальная,

без конъюгации с МКА, высокая токсичность, что приводит к нежелательным эффектам при побочном протеолитическом расщеплении конъюгатов в организме. Недостатком иммунотоксинов, полученных на основе мышинных МКА является также их иммуногенность, проявляющаяся при необходимом многократном введении во время проводимого курса лечения. Эти недостатки были преодолены нами следующим образом.

В качестве токсина был использован практически нетоксичный для целых клеток белок, но который эффективно ингибировал 60S субъединицу и трансляцию пептидов в бесклеточной системе - RIP. Белок был выделен нами из зерен ячменя по ранее описанному методу [Ovadia М. et al. (1988) Arch. Bioch. Biophys., 264, 168-175], с небольшими модификациями. Поскольку иммунотоксин МКА 59 - RIP не удалось получить непосредственной конъюгацией с использованием известного бифункционального гетеросшивающего реагента - N-сукцинимидил-3- (2-пиридилдитио)-пропионата (SPDP), так как во время реакции выпадал нерастворимый преципитат, то проводили конъюгацию предварительно полученных L- и Н-цепей (без разделения) МКА 59 с RIP. Конъюгаты были очищены и охарактеризованы по молек. весу гель-хроматографией, а сохранение специфичности связывания конъюгата с меланомоассоциированным антигеном было проверено методом клеточной ELISA на клетках BRO. Показана эффективность полученного иммунотоксина, по сравнению с исходным RIP, на клетках меланомы линии BRO (Рис.25).

Другой недостаток иммунотоксинов - нежелательное развитие иммунитета при многократном введении препарата и развитие анафилактических симптомов, может быть устранен созданием толерогенных форм препарата. Известно, что толерогенными могут быть гаптены, связанные с собственными глобулинами (хозяина) [Borel J. (1980) Immunol. Rev., 50, 71-104]. Для изучения возможностей получения толерогенных форм препарата, был поставлен модельный эксперимент на животных - белых б/п крысах. В качестве возможных толерогенов изучались конъюгаты L- и Н-цепей Ig G крысы с RIP. Были получены и выделены гель-хроматографией конъюгаты L-RIP (1:4) и H-RIP (1:3). Оценку иммуногенности и толерогенности конъюгатов проводили на трех группах животных, которым вводили: 1 - RIP; 2 - конъюгаты L-RIP и H-RIP; 3 - многократное введение RIP на фоне L-RIP и H-RIP по определенной схеме. Содержание анти-RIP-антигел (A-RIP-A) в сыворотке крови животных определяли методом ELISA через каждые 14 дней в течение 8 мес. Показано, что титры A-RIP-A в группе 1 возрастали в 130 раз спустя 2 мес. от начала эксперимента, в то время как в гр.2 отмечалось падение титра A-RIP-A спустя 1,5-2 мес., после появления слабого титра на 14 день. В гр.З титр также был слабым. Однако титры A-RIP-A в гр.2 и 3 также

повышались к 4-5 мес. Таким образом, толерогенность конъюгатов может быть использована при многократном введении RIP и иммунотоксинов на его основе в сроки до 4 мес.

Следует отметить, что при разработке данного направления по использованию в качестве химиотерапевтических средств иммунотоксинов ( и других препаратов на основе белков и пептидов) предстоит также выяснить - развивается ли при длительном курсе лечения у раковых клеток резистентность по отношению к этим препаратам аналогичная, например, хорошо изученной так называемой множественной лекарственной резистентности клеток по отношению к низкомолекулярным цитосгатикам [14, 57, 59, 63]?

Рис.25. Действие иммунотоксина МКА 59-RIP на рост клеток меланомы линии BRO в сравнении с цитотоксичностью исходного RIP.

3.2.3. Пептидные регуляторы роста типа a-MSH и его аналогов. Гибридные токсины на основе меланотропинов

В разделе I было показано, что a-MSH и его аналог - (Nie4, D-Phe7)- a-MSH обладают рост-модулирующей активностью и являются

эффективными регуляторами роста при довольно низких концентрациях. Однако этот эффект в значительной степени зависит от биохимических особенностей клеток меланомы разных фенотипов. Поскольку, как это было показано в разделе 2.1.1., a-MSH обладает специфическим связыванием с клетками меланомы и имеет собственные рецепторы на поверхности меланомных клеток, то молекулу a-MSH можно использовать в качестве "узнающей" части гибридного токсина. Нами был синтезирован гибридный токсин на основе a-MSH и RIP, путем присоединения ОН-аналога цистеина к тирозиновому остатку молекулы a-MSH с помощью

карбониддиимидазола, с последующей конденсацией образовавшегося активированного аналога SH,OH-Cys-a-MSH с RIP-PDP, полученного, в свою очередь, из RIP и SPDP. К сожалению, синтезированный конъюгат не обладал ингибирующей активностью по отношению к клеткам меланомы MS и BRO. Это может быть объяснено тем, что, возможно, тирозин входит в участок "узнавания" гормона. Недавно показано, что некоторых успехов можно добиться конъюгацией с a-MSH низкомолекулярных веществ [Morandini R. et al. (1994) Int. J. Cancer, 56, 129-133]. Авторами были синтезированы 4 конъюгата a-MSH с мелфаланом - по С-терминальному концу и по центральному фрагменту гормона. Показали специфичность цитотоксического действия синтезированных конъюгатов на клетках трех разных видов -меланоме, карциноме и фибробластах, однако цитотоксический эффект был в 5-10 раз ниже, чем исходного мелфалана, хотя и была показана важность сохранения конфигурации центрального фрагмента гормона. Таким образом, предпринимаемые в этом направлении попытки могут быть успешными лишь в случае дальнейшего более детального изучения взаимодействий на уровне гормон-рецептор.

3.2.4. Аутокринные и паракринные селективные ингибиторы роста, в сочетании с МКА к ростовым факторам и их рецепторам

В разделе 2.3. описано выделение новых аутокринных факторов роста клеток злокачественной меланомы, среди которых фактор Fi и суммарный фактор Fs являются эффективными ингибиторами роста. Ингибирующая концентрация ICso фактора Fi составляет величину порядка 10-9М для пигментированных клеток меланомы линии MS, а IC» суммарного фактора Fs - порядка 10-6М для обоих фенотипов клеток меланомы.

В аналитическом обзоре по гормональной регуляции роста опухолевых клеток [1] приведены все возможные и известные к этому времени рост-модулирующие аутокринные и другие факторы, оказывающие влияние на пролиферативную активность клеток меланомы. Кроме обнаруженных нами ингибирующих факторов Fi и

р8 в подавлении пролиферативной активности клеток меланомы могут принимать участие следующие ростовые факторы: TGF-Pi.z, TNF-a, интерлейкин-6, ингибитор металлопротеиназы-2 (TIMP-2) и MIA. Теоретически, ингибирования роста клеток можно также достичь связыванием рецепторов ростовых факторов соответствующими МКА. Показано, что клетки меланомы разных линий могут экспрессировать рецепторы таких ростовых факторов как EGF, TGF-a, IGF-1, PDGF (А,В), bFGF. Также могут использоваться МКА против самих ростовых факторов. Перспективность данного направления в настоящее время изучается.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований биохимических особенностей клеток злокачественной меланомы разных фенотипов подтверждают гипотезу о возможной эндокринной, в том числе аутокринной и паракринной регуляции роста этих клеток. Изучение рост-модулирующей активности факторов пептидной природы, выделенных из бессывороточной среды клеток пигментированной меланомы линии МБ, а именно рост-активирующего фактора Ро5 и рост-ингибирующих факторов Р] и Ре, показывает, что эти факторы могут участвовать в аутокринной регуляции роста клеток меланомы, а соотношение между ингибиторами и собственно факторами роста может определять и контролировать пролиферативную активность клеток определенного фенотипа. Регуляция роста отдельных клеток может осуществляться посредством комбинации собственных факторов, что следует из изучения рост-модулирующей активности выделенных факторов, которая была различной по отношению к клеткам разных фенотипов и видов ( клетки меланомы -фибробласты ). Контроль за выработкой ростовых факторов, индуцирующих пролиферативную активность опухолевых клеток, их "экранирование", стимуляция увеличения выработки клетками собственных ингибиторов или их дополнительное введение может оказаться эффективным подходом к лечению злокачественных новообразований.

В эндокринной регуляции роста клеток злокачественной меланомы могут принимать участие и другие ростовые факторы и пептидные гормоны, например а-МБН и его аналоги. Однако и в этих процессах, как и в случае аутокринной регуляции, биохимические различия отдельных фенотипов, и генотипов в целом, определяют рост-модулирующую активность гормонов. В данном исследовании

показано, что рост-модулирующая активность a-MSH по отношению к клеткам злокачественной меланомы человека двух основных фенотипов - пигментированных и амеланотичных, непосредственно определяется природой процессов трансмембранной передачи гормонального сигнала и участием различных систем клеточных медиаторов, что было продемонстрировано нами при изучении влияния a-MSH на активность аденилатциклазной и гуанилатциклазной систем и уровни сАМР и cGMP, на активность фосфатидилинозиткиназ и скорости образования PIP и Р1Рз, на характер изменений внутриклеточных уровней фосфатов мио-инозита -IPi, IP2 и 1Рз, а также при изучении влияния a-MSH на рост клеток в присутствии ингибиторов протеинкиназ А и С.

Изучение особенностей роста клеток злокачественной меланомы разных фенотипов позволило оценить основные факторы, оказывающие влияние на рост этих клеток и предложить гипотетическую схему регуляции роста, которая может служить рабочей моделью при дальнейших исследованиях. Предлагаемая модель регуляции роста клеток злокачественной меланомы, с учетом особенностей трансмембранной передачи гормонального сигнала и участием различных медиаторов в зависимости от клеточного фенотипа, может также служить основой для поиска новых подходов при создании эффективных и избирательных противоопухолевых препаратов и средств.

ВЫВОДЫ

1.Изучены биохимические основы и фенотипические различия процессов регуляции роста клеток злокачественной меланомы человека. Получены новые данные, расширяющие представления о возможных механизмах регуляции роста злокачественных клеток. В регуляции роста, в качестве эндокринного фактора, на физиологическом уровне у человека, может принимать участие меланотропин - а-МБН и подобные пептиды, так как показано, что а-МБН и его аналог - [Ы1е4,Б-РЬе7]-а-М5Н обладают значительной рост-модулирующей активностью и могут, в зависимости от фенотипа, или активировать или ингибировать рост клеток злокачественной меланомы. При этом эффект не определяется процессами меланогенеза, изменением активности тирозиназы и пигментации клеток.

2. Показано, что лиганд-рецепторные взаимодействия а-МБН с клетками злокачественной меланомы высокоспецифичны. Выделен и

охарактеризован рецептор a-MSH. Изучены особенности основных систем клеточных медиаторов пигментированных клеток злокачественной меланомы, линии MS, и амеланотичных клеток, линии BRO, которые могут принимать участие в передаче гормонального сигнала. Показано, что клетки линии BRO обладают высокоиндуцибельной формой аденилатциклазы, в отличие от клеток линии MS. Показано, что a-MSH вызывает возрастание активностей фосфатидилинозипсиназ и скорости образования фосфатидилинозитов ( PIP и PIPj) в микросомальных и цитозольных фракциях клеток BRO и, наоборот, их уменьшение в клетках MS. При этом характер изменений внутриклеточных уровней фосфатов мио-инозита ( IPi, IP2 и 1Рз ) также был различен, как и изменения в активностях фосфолипид, Са2+- зависимой протеинкиназы ( РК С).

3. Изучены особенности роста клеток злокачественной меланомы человека in vitro и факторы, определяющие их пролиферативную активность и пигментацию. Установлено, что пигментированные и амеланотичные линии клеток меланомы различаются по способности утилизировать из среды аминокислоты и углеводы. Показано, что фетальная сыворотка содержит вещества, ингибирующие окисление L-DOPA в DOPA-хинон и таким образом влияет на процесс меланизации. Сильно пигментированный клон клеток линии MS может быть получен при уменьшении концентрации добавляемых сывороток. Изучены условия культивирования клеток линии MS в бессывороточной среде.

4. Обнаружены новые рост-модулирующие факторы и проведено их выделение из бессыворогочной кондиционированной среды клеток MS: ингибирующих факторов Fi и Fs, рост-стимулирующего фактора Fo.5. Показана специфичность и эффективность их действия на пролиферативную активность клеток меланомы линий MS и BRO, а также на рост фибробластов легких человека, линии Леч 240. Факторы не оказывали никакого влияния на рост клеток фибробластов и были высокоспецифичны для отдельных линий клеток злокачественной меланомы. Ингибирующая концентрация IC50 фактора Fi составляет величину порядка 109M для клеток меланомы линии MS, а IC90 суммарного фактора Fs - КИ мг/мл, то есть порядка 10-6М для обеих фенотипически различающихся клеточных линий, MS и BRO.

5. Предложена гипотетическая схема регуляции роста клеток злокачественной меланомы, включающая в себя эндокринные, паракрин ные и аутокринные факторы. Экспериментально подтверждено участие в аутокринной регуляции селективных факторов роста Fo.5, Fi и Fs.

6. Проведено выделение различных изоформ тирозиназы и ее ингибитора ( кожа, меланомы ) и фосфатидилинозиткиназы ( мозг, меланомы ). Показано, что для всех исследованных линий клеток

меланомы и для меланомных опухолей характерна высокая активность фосфатидилинозиткиназы, а для пигментированных опухолей, помимо высокой активности тирозиназы, характерно наличие более "кислых" изоформ фермента, отсутствующих в коже.

7. Предложены и экспериментально оценены направления поиска противомеланомных средств. Показано, что для пигментированных опухолей перспективно использование особенностей метаболической системы меланогенеза и наличия большого числа изоформ тирозиназы. Эффективным является ингибирование роста клеток злокачественной меланомы с помощью ингибиторов протеинкиназ ( А и С ), а также с помощью пептидных рост-модулирующих факторов типа Fi и Fs, секрегируемых самими клетками. Показана возможность использования в экспериментальной онкологии иммунотоксинов на основе МКА 59 и RIP, а также толерогенных конъюгатов RIP.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОТРАЖАЮЩИХ МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ

1. В.А.Суханов (1995) Механизмы гормональной регуляции роста опухолевых клеток. Успехи биол. химии,35, 97-134.

2. В.А.Суханов, Л.Ф.Морозова, В.В.Лалаев, А.В.Яхъяев, В.Л. Дьяков (1991) Ингибирование пролиферации меланомных клеток человека MS и BRO а-меланоцитстимулирующим гормоном. Вопросы мед. химии, N6, 73-77.

3. В.А.Суханов, И.М.Воронкова, С.В.Швец, Л.Ф.Морозова (1993) Меланоцитстимулирующий гормон ингибирует рост амеланотичных клеток злокачественной меланомы человека с изменением концентрации сАМР, фосфатидилинозитов и фосфатов инозита. Биохимия,58, 211-223.

4. Л.Ф.Морозова, В.Л.Дьяков, В.А.Суханов (1993) Влияние меланоцитстимулирующего гормона и его аналога на рост клеток меланомных линий человека с различным фенотипом. Цитология,35, 101-104.

5. V.A.Sukhanov, I.M.Voronkova, S.V.Shvets, V.L.Dyakov, L.F. Morozova (1991) Melanocyte-stimulating hormone ( a-MSH ) inhibits the growth of human malignant melanoma cells with the induction ofphospha-tidylinositol and myo-inositol phosphate levels. Biochemistry Internat., 24, 625-632.

6. А.В.Яхъяев, В.А.Суханов, В.К.Сологуб, Л.Ф.Морозова, O.B. Макарова (1997) Получение моноклональных антител к клеткам злокачественной меланомы человека и идентификация антигена. Иммунология, N 4, 60-63.

7. А.В.Яхъяев, О.В.Макарова, Л.Ф.Морозова, В.К.Сологуб, В.А. Суханов (1996) Иммунотоксины как средство лечения злокачественной меланомы человека. III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, Тезисы докл.,249.

8. В.А.Суханов, В.С.Лебедева (1996) Получение и эффективность толерогенных форм иммунотоксинов. III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, Тезисы докл.,289.

9. С.В.Швец, С.Е.Северин, В.А.Суханов (1990) Выделение и частичная очистка фосфатидилинозиткиназы из мозга человека. Биологические мембраны,7, 805-812.

10. В.А.Суханов, В.Л.Дьяков, В.В.Лалаев, А.В.Яхъяев (1991) Гетерогенность препаратов тирозиназы, выделенных из кожи крыс, кожи и меланомных опухолей человека. Биохимия,56, 1026-1035.

11. С.В.Швец, С.Е.Северин, В.А.Суханов, Л.Ф.Морозова (1991) Множественность форм фосфатидилинозиткиназы в клетках злокачественной меланомы человека BRO . Материалы II Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 209.

12. В.А.Суханов, В.Л.Дьяков, В.В.Лалаев, Л.Ф.Морозова (1996) Выделение рост-модулирующих факторов, секретируемых клетками злокачественной меланомы человека. Биохимия,61,697-706.

13. А.В.Яхъяев, И.М.Воронкова, В.А.Суханов (1991) Способ подготовки смеси белков и гликопротеидов к анализу с помощью молекулярных зондов. Авторское свидетельство SU 1681265 Al. Приоритет изобрегения-27.12.1988г. по заявке N 4641445.

14. В.А.Суханов, В.Л.Дьяков, В.В.Лалаев, А.В.Яхъяев, И.М. Воронкова, Ф.В.Доненко, Н.В.Боровкова, Л.В.Мороз (1991) Экспрессия Р-гликопротеина в клетках лейкоза Р 388 с индуцированной устойчивостью к доксорубицину. Бюллетень эксперим. биол. и медицины, N 3, 290-291.

15. A.V.Yakhyayev, I.M.Voronkova, V.A.Sukhanov (1991) А simplified method of protein electroblotting after isoelectric focusing. Electrophoresis, 12, 680-682.

16. В.Л.Дьяков, А.В.Дубовской, О.А.Климова, В.А.Суханов (1989) Использование иммуноспецифических методов для определения количества микросомальной эпоксидгидролазы. Вопросы медицинской химии, N1, 47-52.

17. В.А.Суханов, Н.Л.Серговская, В.И.Швец, Р.П.Евстигнеева (1977) Исследования в области сложных липидов. ЖОХ, 47, 2130-2136.

18. В.А.Суханов, Р.И.Жданов, В.И.Швец, Р.П.Евстигнеева (1977) Спин-меченые монофосфоинозитиды. Биоорганич. химия, 3, 135-136.

19. М.К.Грачев, В.А.Суханов, Д.А.Предводителев, В.И.Швец, Э.Г.Нифантьев (1977) Синтез новых глицерофосфолипидов. ЖОрХ, 13, 1830-1836.

20. В.А.Суханов, Р.И.Жданов, В.И.Швец, Р.П.Евстигнеева (1977) Химический синтез спин-меченых фосфолипидов. Доклады академии наук СССР, 236, 1386-1389.

21. В.А.Суханов, Р.И.Жданов, В.И.Швец, Р.П.Евстигнеева (1978) Синтез фосфатидилхолина, содержащего спин-меченый ацильный остаток в положении 1 (3). Биоорганич. химия, 4,785-790.

22. Г.В.Гюльханданян, В.А.Суханов, Р.И.Жданов, А.Н.Кузнецов (1978) Связывание спин-меченой пальмитиновой кислоты бычьим сывороточным альбумином. Биофизика, 23, 589-594.

23. V.A.Sukhanov, R.I.Zhdanov, V.I.Shvets (1979) Synthesis of spinlabeled phosphatidylethanolamine. Chem. Phys. Lipids, 23, 155-162.

24. V.A.Sukhanov, V.V.Okhanov, R.I.Zhdanov, V.I.Shvets (1979) Spin-labeled phosphatidyl myo-inositol. Chem. Phys. Lipids, 23, 163-172.

25. В.А.Суханов, В.А.Башарули, А.П.Каплун, В.И.Швец (1979) Имидазолидный метод создания фосфодиэфирной структуры в ряду глицерофосфолипидов. ЖОХ, 49, 235-236.

26. Р.И.Жданов, В.К.Кольтовер, В.А.Суханов, В.И.Швец (1979) Двухспиновые липидные зонды для изучения биологических мембран. Доклады академии наук СССР, 245, 242-245.

27. В.А.Суханов, В.А.Башарули, А.П.Каплун, В.И.Швец, О.Ю. Сидоров, В.В.Оханов (1979) Синтез спин-меченого фосфатидилхолина алкильного типа. Биоорганич. химия, 5, 1503-1508.

28. В.А.Суханов, Р.И.Жданов, В.И.Швец (1979) Липидные зонды бирадикальной природы для исследования мембранных систем. Биоорганич.химия ,5,1819-1825.

29. В. А. Суханов, А. П. Каплун, В. А. Башарули, В. И. Швец,

A.В.Пятницкий (1979) Изучение структурных перестроек в липидных мембранах с помощью флуоресцентных и парамагнитных зондов. Тезисы IY Всесоюзного биохимического съезда, Ленинград, 2,100-101.

30. В.А. Суханов, В.В. Оханов, В.И. Швец, А.И. Мирошников (1980) Взаимодействие фосфолипазы из яда кобры со спин-мечеными фосфолипидами. Молекулярная биология,14,606-614.

31. В.А.Суханов, В.И.Швец (1980) О применении имидазолидов кислот при синтезе спиновых зондов сложноэфирной структуры. ЖОХ,50,1191-1194.

32. В. А. Суханов, О. Ю. Сидоров, В. В. Оханов, В. А. Башарули,

B. И. Швец (1981) Изучение взаимодействия фосфолипазы Аг из яда кобры с организованными поверхностями фосфолипидов. Молекулярная биология,15,139-144.

ЗЗ.А.И.Сотниченко,В.А.Суханов,А.Н.Саприн (1985) Микросомаль-ный метаболизм 3,4-бензпирена. Химико-фармацевтический журнал, 19, 1435-1440.

34. А. И. Сотниченко, О. А. Сердюк, М. И. Старовойтов, Э. А. Парфенов, В. А. Суханов, А.Н.Саприн (1985) Хроматографический

метод определения активности мембранной эпоксидгидролазы. Антибиотики и медицинская биотехнология, N7, 535-538.

35.В. А. Суханов, В. В. Оханов, А.И. Мирошников (1981) Изучение взаимодействия липосом с экзогенными фосфолипазами. Сборник трудов симпозиума "Липосомы. Взаимодействие с клетками и тканями", Москва,1980,51-62.

36.Г.В.Гюльханданян,В.А.Суханов,А.Н.Кузнецов (1978) Изучение связывания спин-меченой кислоты с бычьим сывороточным альбумином. Биофизика,23,906-907.

37.В.Б.Ритов,А.Г.Артемова,О.А.Азизова,П.Г.Комаров,А.Г.Макси-на, М.К.Мурзахметова.В.А. Суханов,Р.И. Жданов,Ю.А. Владимиров, Ю.П. Козлов,В.И. Швец (1982) Взаимодействие спин-меченого фосфатидилхолина с Са-зависимой АТФ-азой саркоплазматического ретикулума. Биохимия,47,2042-2047.

38.0.А.Азизова,А.Г.Максина,Н.К.Клаан,В.Е.Каган,Ю.В.Архипе-нко,В.А.Суханов,Ю.А.Владимиров,Ю.П.Козлов (1983) Модификация ферментной системы транспорта Ca в саркоплазматическом ретикулуме при перекисном окислении. Биохимия,48, 861-869.

39.Э.А.Авакян,В.Б.Ритов,О.А.Азизова,А.Г.Максина,Ю.П.Козлов, В. А. Суханов, В. И. Швец, Ю. А. Владимиров (1981) Взаимодействие свободных жирных кислот с Са-зависимой АТФ-азой саркоплазматического ретикулума. Биохимия,46,809-824,

40.В.А.Суханов,Р.И.Жданов,В.И.Швец (1981) Глава У1:"Гидро-фобные спиновые зонды" в книге: "Парамагнитные модели биологически активных соединений" (Под редакцией В.И.Швеца), "Наука", Москва, 162-184.

41. Л.Г.Артемова, П.Г.Комаров, В.Б. Ритов, В. А. Суханов, Р.И. Жданов, В. И.Швец (1982) Различие в состоянии 1-ой и 2-ой жирнокис-лотных цепей парамагнитных моделей фосфатидилхолина в препаратах Ca.Mg-АТФ-азы. Тезисы докладов I Всесоюзного биофизического съезда,Москва,т. 1,270.

42.В. А. Суханов, Р. И. Жданов, В. И. Швец (1984) Спин-меченые фосфолипиды. Синтез, свойства, применение. Сборник статей "Спиновые метки и зонды в биологии и медицине", "Наука",Москва, 60-90.

43.V. A. Sukhanov, R. I. Zhdanov, V. I. Shvets (1992) Synthesis and properties of spin-labeled phospholipids. In book: "Bioactive Spin-Labels" (Ed.R.Zhdanov), Springer-Verlag, Heidelberg, Germany, 297-315.

44.B.A.Суханов,Р.И.Жданов,В.И.Швец(1986) Глава: "Спин-меченые фосфолипиды" в книге: "Метод спиновых меток и зондов. Проблемы и перспективы", "Наука",Москва,124-143.

45. А. А.Шуль га, А.Э.Габриэлян,Д. А.Долгих,С. А.Лопатин,В.П.Варламов,Л.Ф.Морозова, В. А. Суханов, М. П. Кирпичников,К.Г.Скрябин (1992) Картирование участков в молекуле соматотропина человека, ответственных за лактогенную активность. Биотехнология, N5, 22-26.

46.C.B.Швец,С.Е.Северин,В.А.Суханов (1988) Тетрадеканоил фор-бол ацетат активирует фосфатидилинозиткиназу в мозге человека. Тезисы докладов YI Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных процессов", Петрозаводск, 94-95.

47. В. А. Суханов, Л.Ф. Морозова, В.В. Лалаев, В.Л. Дьяков (1990) Меланоцитсгимулирующий гормон ингибирует пролиферацию мела-номных клеток человека MS и BRO. Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Биохимия опухолевых клеток", Минск, 97.

48.Е.Л.Требухина,H.H.Юровская,С.В.Сучков,В.А.Суханов (1990) Антигены увеальной меланомы и их значение для офтальмоонко-логии. Тезисы докладов международного симпозиума по биологии опухолевого роста и медицине, Москва, 85.

49.В.А.Суханов,А.В.Яхъяев,В.Л.Дьяков,В.В.Лалаев, Л.Ф.Морозова (1991) Выделение и характеристика рецепторов а-МСГ, обнаруженных в клетках злокачественной меланомы человека. Тезисы докладов II Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 219.

50.В.А.Суханов,И.М.Воронкова,В.Л.Дьяков,Л.Ф.Морозова (1991) Рост - модулирующая активность МСГ не связана с индукцией АС-комплекса и уровнями сАМР и cGMP в клетках злокачественной меланомы человека, MS. Тезисы докладов II Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 186.

51.С.В.Сучков,Е. Л. Требухина, И. Ю. Кондратьев, H.A. Коченова, В. А. Суханов (1991) Изучение антигенной структуры сетчатки - ключ к пониманию молекулярных механизмов аутоиммунной офтальмологии. Тезисы докладов II Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 188.

52. Л. Ф. Морозова, В. Л. Дьяков, В. А. Суханов (1991) Изучение факторов, определяющих пигментацию меланомных клеточных линий. Тезисы докладов II Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 136.

53.И.М.Воронкова, С.В.Швец, В.А.Суханов, Л.Ф.Морозова (1991) Молекулярные механизмы ингибирования роста амеланотичных клеток злокачественной меланомы человека BRO меланоцитстимулирующим гормоном. Тезисы докладов II Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 45.

54. V. A. Sukhanov, V. L. Dyakov, Y. V. Lalaev, L.F. Morozova (1991) Autocrine-secreted growth factors from human malignant melanoma. 15th Internat.Congress of Biochemistry, Abstracts, Jerusalem, Israel, 224.

55. Y. A. Sukhanov, I. M. Voronkova, S.V. Shvets, L. F. Morozova,

V. L. Dyakov, E. S. Severin (1991) Specific features of hormonal signal transduction determine the growth-inhibiting activity of a-MSH for human malignant melanoma cells. 4th Internat.Congress on Hormones and Cancer, Abstracts, Amsterdam, The Netherlands, 415.

56. V. A. Sukhanov, V. L. Dyakov, V.V. Lalaev, L. F. Morozova (1991) Growth - inhibiting activity from human malignant melanoma. 4th Internat.Congress on Hormones and Cancer, Abstracts, Amsterdam, The Netherlands, 414.

57. V. A. Sukhanov, I.M.Voronkova, F.V.Donenko (1994) P-Glycopro-tein expression by P-388 Leukemia cells with induced resistance to doxorubicin. XXII Meeting of ISOBM, Abstracts, Groningen, The Netherlands, 244.

58. V. A. Sukhanov, I. M. Voronkova, V. V. Lalaev, L. F. Morozova (1994) Features of hormonal and autocrine regulation of human malignant melanoma cell growth. Illrd Europian Congress of Endocrinology, Abstracts,Amsterdam, The Netherlands, P 2.068.

59. Y. A. Sukhanov, I.M.Voronkova, F.V.Donenko (1995) P-Glycopro-tein expression by P-388 Leukemia cells with induced resistance to doxorubicin. Tumor Biology, 16, N2-3, 189.

60. V. A. Sukhanov, I.M. Voronkova,V.V.Lalaev.L.F.Morozova (1994) Features of hormonal and autocrine regulation of human malignant melanoma cell growth. Europian Journal of Endocrinology, 130,Suppl.2, 158.

61. В. А. Суханов, И. M. Воронкова, JI. Ф. Морозова (1996) Эффективность противоопухолевых препаратов на основе ингибиторов протеинкиназ. III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, Тезисы докладов, 217.

62. В. А. Суханов, А. Н. Саприн (1996) Проблемы и перспективы химиотерапии рака с использованием систем "АДЕПТ" и иммунотоксинов. I съезд онкологов стран СНГ, Москва, Тезисы докладов, т.1, 59-60.

63. А. Н. Саприн, Е. В. Калинина, В. А. Суханов (1996) Биохимические механизмы мультилекарственной резистентности раковых клеток. I съезд онкологов стран СНГ, Москва, Тезисы докладов, т.1, 58-59.

64. В. А. Суханов (1996) Биохимические основы и фенотипические особенности регуляции роста клеток злокачественной меланомы. I съезд онкологов стран СНГ, Москва, Тезисы докладов, т.1, 87-88.

Выражаю благодарность за оказанную помощь при выполнении экспериментальной работы сотрудникам: к.х.н. В.Л.Дьякову, к.б.н. Л.Ф.Морозовой, к.б.н. А.В.Яхъяеву, к.х.н. С.В.Швецу, И.М.Воронковой, В.В.Лалаеву и В.С.Лебедевой.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

MS - меланома Симпсона, линия пигментированных клеток

злокачественной меланомы человека; BRO - линия амеланотичных клеток злокачественной меланомы человека;

RPMI-1846 - культура клеток меланомы хомяка; Леч 240 (Fb) - фибробласты легких эмбриона человека, линии Леч 240;

RPMI-1640, L-15, F-10 - среды для культивирования клеток; a-MSH - а-меланоцитстимулирующий гормон; пептид (13 а.к.); [Nle4,D-Phe7 ]- a-MSH - аналог a-MSH с норлейцином по 4- и с D-фенилаланином по 7-положениям;

АС - аденилатциклаза;

сАМР - циклоаденозинмонофосфат;

cGMP - циклогуанозинмонофосфат;

АТР - аденозинтрифосфат;

РК А - сАМР-зависимая протеинкиназа;

РК С - фосфолипид,Са2+ -зависимая протеинкиназа;

PIK - фосфатидилинозиткиназа;

PIPK - фосфатидилинозит-4-фосфат-киназа;

PI - фосфатидилинозиты;

PIP - фосфатидилинозит-4-фосфаг;

PIP2 - фосфатидилинозит-4,5-дифосфат;

IPi - монофосфат мио-инозита;

1Рг - дифосфат мио-инозита;

1Рз - 1,4,5-трифосфат мио-инозита;

DAG - диацилглицерин;

ТРА -тетрадеканоилфорболацетат;

TIMP-2 - ингибитор металлопротеиназы 2;

In А - ингибитор РК А, пептид (20 а.к.) из скелетной мышцы;

Н-7 - ингибитор РК А и РК С, 1-(5-изохинолинсульфонил)-2-

метилпиперазин; L-DOPA - L-дигидроксифенилаланин; EGF - эпидермальный фактор роста; TGF ( a, р) - фактор роста опухолей ( а, р); IGF-(I,II) - инсулиноподобный ростовой фактор (1,11); TNF-a - фактор некроза опухолей (a); MIA - "меланомоингибирующая активность"; MGSA - фактор стимулирования роста меланом; PDGF (А,В) - фактор роста из тромбоцитов (А,В); bFGF - фактор роста фибробластов (basic);

G(M)-CSF - гранулоцит (макрофаг)-колоний-стимулирующий фактор; GRP - "связанный с гастрином пептид"; NGF - фактор роста нервов; VIР - вазоактивный пептид кишечника; IL-1, IL-4, IL-6, IL-8 - интерлейкины; р 170c-erb в - рецептор EGF; NGF-R - рецептор фактора роста нервов; р50 - рецептор a-MSH;

c-ras, c-erb, c-rac, c-src, c-myb, c-mel, c-ski, c-fos, c-jun -

- меланомоассоциированные онкогены; Fos, Fi, Fi - факторы аутокринной регуляции роста клеток меланомы,

линии MS; МКА - моноклональные антитела;

RIP - "протеин, ингибирующий рибосомы", белок с молек. массой

30 KDa, выделен из ячменя; A-RIP-A - am-n-RIP-антитела;

Н- и L-цепи - тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов;

PBS - фосфатный буфер (10 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7.4,

содержащий 1 мМ MgCh, 0.1 мМ СаСЬ); SPDP - \'-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1

Актуальность проблемы 1

Цель и основные задачи данной работы 5

Научная новизна исследований 6

Практическая значимость работы 8

Положения, выдвигаемые для публичной защиты 9

Апробация диссертации 10

Публикации 10

ОБОБЩЕННОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 11

Материалы и методы исследований 11

Материалы 11

Методы исследований 12

1. Пролиферативный потенциал клеток 12

2. Фиксация клеток и микроскопия 12

3. Лиганд-рецепторные взаимодействия а-М5Н с клетками 13

4. Внутриклеточное распределение а-МБН после эндоцитоза. Выделение рецептора а-МЯН 13

5. Определение внутриклеточного содержания сАМР исОМР 14

6. Определение активности фосфатидилинозиткиназы (Р1-киназы *) 14

7. Измерение уровней фосфатов мио-инозита (1Ри 1Рг и!Рз) 14

8. Определение активности Фосфолипид. Са2+-зависимой протеинкиназы С РК С ) 14

9. Определение активности тирозиназы 15

10. Выделение тирозиназы и ингибитора окисления Ь-РОРА 15

11. Выделение фосфатидилинозиткиназы 15

12. Выделение аутокринных Факторов роста 15

13. Выделение меланиновых гранул. Определение параметров связывания 15

14. Получение моноклональных антител ( МКА 59 ) 16

15. Получение конъюгатов Н- и Ь- цепей МКА 59

с ШР и Н- и Ь- цепей 1еС крысы с ШР 16

16. Определение концентрации белка 16

17. Анализ белковых фракций 16

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 17

I. Изучение биологической активности a-MSH и

его аналога 17

П. Биохимические особенности функционирования

клеток меланомы разных фенотипов 23

2.1. Изучение возможных механизмов гормональной регуляции роста клеток 24

2.1.1. Лиганд-рецепторные взаимодействия a-MSH

и физико-химические характеристики рецептора a-MSH 24

2.1.2. Аденилатциклазная и гуанилагциклазная системы 27

2.1.3. Влияние a-MSH на систему клеточных медиаторов, образующих цикл внутриклеточного

обмена мио-инозига и его фосфатов 28

2.1.3.а. Определение активностей Р1-киназ. субклеточного распределения ферментов и

действия a-MSH 29

2.1.3.6. Влияние a-MSH на уровень фосфатов мио-инозита - IPi. IPz и 1Рз 31

2.1.4. Действие a-MSH на активность фосфолигшд.

Са2+- зависимой протеинкиназы (РК С) 33

2.2. Изучение особенностей роста клеток злокачественной меланомы человека in vitro и факторов, определяющих их пигментацию 34

2.3. Аутокринная регуляция роста клеток злокачественной меланомы 36

2.3.1. Обнаружение и выделение новых рост-модулирую-щих факторов 36

2.3.2. Гипотетическая схема регуляции роста клеток злокачественной меланомы 41

2.4. Другие факторы, оказывающие влияние на рост

опухолевых клеток 44

Ш. Разработка экспериментально-обоснованных

направлений поиска противомеланомных

химиотерапевтических средств

3.1. Пигментированные и обладающие Ь-БОРА-оксидазной активностью меланомм

3.1.1. Использование соединений с высокой степенью связывания с меланинами

3.1.2. Использование регуляторов и особенностей метаболической системы меланогенеза

3.2. Все разновидности меланом, в том числе непигментированные и амеланотичные

3.2.1. Использование аналогов сАМР и ингибиторов протеинкиназ А и С

3.2.2. Моноклональные антитела к специфическим антигенам меланомных опухолей и иммунотоксины на их основе

3.2.3. Пептидные регуляторы роста типа а-МБИ

и его аналогов. Гибридные токсины на основе мелано-тропинов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОТРАЖАЮЩИХ МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

46 46 49

53 53

62 68

12.03. 5?г.

ип мдс 3.2Т8 Т.1СО - 97 г Москва., ново-ьасманная, до!

Информация о работе

Суханов, Виктор Александрович
доктора биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы