Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние WNT лигандов на формирование фенотипа клеточных линий меланомы человека

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние WNT лигандов на формирование фенотипа клеточных линий меланомы человека"

На правах рукописи

КУЛИКОВА Ксения Валерьевна

ВЛИЯНИЕ \VI4T ЛИГАНДОВ НА ФОРМИРОВАНИЕ ФЕНОТИПА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

• 5 ДПР 2072

Москва 2012

005020537

Работа выполнена в лаборатории генной терапии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук ЛАРИН Сергей Сергеевич

Официальные оппоненты:

САЩЕНКО Лидия Павловна доктор биологических наук, профессор, ИБГ РАН, заведующий лаборатории

ТРУБИЦЫНА Ирина Евгеньевна

доктор медицинских наук, профессор,

ГБУЗ ЦНИИГ ДЗГМ, заведующий лаборатории

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «<К"?"» Ол^'-к^ 2012 г. в А часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан года.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук

^^^г^абовская Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На долю меланомы приходится больше половины всех смертей, спровоцированных злокачественными новообразованиями кожи (Tsao et al., 2004). В основе летальности этого заболевания лежат высокая изменчивость и метастатическая активность клеток опухоли, делающие современные методы ее лечения слабо эффективными.

Метастатическая меланома представляет собой гетерогенное образование. Она содержит несколько популяций клеток, соответствующих различным этапам и направлениям опухолевой прогрессии. Эти популяции отличаются по свойствам, что сильно затрудняет изучение отдельных закономерностей. Имея набор клеточных линий и изучая свойства каждой из них, можно получить представление о совокупности молекулярных процессов, влияющих на формирование опухолевого фенотипа меланомы человека в целом.

Многие процессы, ассоциированные с прогрессией меланомы, подвержены влиянию со стороны компонентов сигнального каскада, активируемого белками семейства Wnt (Weeraratna et al., 2002; Shah et al., 2008; Chien et al., 2009). Белки семейства Wnt способны стимулировать как минимум три различных сигнальных каскада: канонический Р-катениновый, неканонический Са2+-зависимый и неканонический PCP сигнальный путь (Weeraratna, 2005). В период эмбрионального развития белки Wnt регулируют подвижность и дифференцировку предшественников меланоцитов (Dorsky et al., 1998), а во взрослом организме поддерживают гомеостаз самих пигмент продуцирующих клеток. Считается, что нарушение этого гомеостаза приводит к злокачественной трансформации меланоцитов, сопровождающей образование меланомы (Haass and Herlyn, 2005). При меланоме экспрессия "генов, кодирующих белки Wnt, часто изменена (Pham et al., 2003; Da Forno et al., 2008).

На настоящий момент не существует однозначного понимания, каким образом сигнальный каскад Wnt участвует в развитии данного онкологического заболевания. Ряд исследований указывает на противоопухолевый эффект канонической ветви Wnt сигнального пути (Chien et al., 2009). При этом, согласно другим данным, чрезмерная активация канонического Wnt сигнального каскада, напротив, ассоциирована со злокачественной трансформацией меланоцитов (Larue et al., 2009). Неканонический Wnt/Са^-зависимый сигнальный каскад способствует метастазированию меланомы (Dissanayake et al., 2007). Однако высокий уровень экспрессии гена неканонического лиганда Wnt5a детектируется не только в метастазирующей меланоме, но и в доброкачественных невусах (Pham et al., 2003).

Таким образом, определение эффектов, оказываемых каноническими и неканоническими Wnt лигандами на активность внутриклеточных сигнальных путей и на поведение клеточных линий меланомы человека, представляет собой крайне

актуальную задачу, решение которой даст ключ к пониманию особенностей развития меланомы в целом.

Цель и задачи исследования

Основной целью работы стало выявление роли различных белков семейства Wnt в формировании опухолевого фенотипа клеточных линий меланомы человека. Для достижения поставленной цели были определены следующие экспериментальные задачи:

1. Определить уровень экспрессии генов маркеров эпителиально-мезенхимального перехода: Slug, Twistl и Sipl в клеточных линиях меланомы человека.

2. Исследовать взаимосвязь между активностью канонического Wnt сигнального пути и локализацией р-катенина в имеющемся наборе клеточных линий меланомы человека.

3. Изучить вклад канонических и неканонических Wnt лигандов в формирование фенотипа клеточной линии меланомы человека MelP.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе было показано, что в клеточных линиях меланомы человека MelR, MeIG, MelME, MelKsen, MelKis, Mel226, Mellbr, MellL, MelKor, MelP, MelSi, Mel82 экспрессируются гены базовых маркеров программы эпителиально-мезенхимального перехода (Slug, Twistl и Sipl), указывая на активированное состояние этой программы в исследованных образцах. Кроме того, было впервые показано, что в клеточных линиях меланомы человека внутриядерная локализация р-катенина не является достаточным условием для активации канонического Wnt сигнального пути. Канонический лиганд Wnt3a в модельной клеточной линии меланомы человека способен активировать два Wnt сигнальных каскада: канонический р-катениновый и неканонический Wnt/Ca2+ -зависимый. Этот лиганд блокирует пролиферацию опухолевых клеток и стимулирует их подвижность. Неканонические лиганды Wnt5a и Wntl 1 также способны активировать Wnt/Ca2+-3aBHCHMbifi сигнальный путь в модельной клеточной линии меланомы человека. При этом Wnt5a влияет на миграционную способность клеток, a Wntl 1 способствует пролиферации.

Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие представлений об особенностях функционирования Wnt сигнального пути в меланоме человека. Полученные данные могут быть использованы при поиске и изучении молекулярных мишеней для диагностики и терапии злокачественных опухолей.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научной школе для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, Россия, 2009), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых

«Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), XXIII Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2011), VII Международном симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, Россия, 2011) и на международных школах, конференциях и симпозиумах: FEBS/EARC Advanced Lecture Course "Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer" (Spetses, Greece, 2009), EMBO Molecular Medicine Workshop IRCC (Institute for Cancer Research and Treatment) "Invasive Growth: a Genetic Program for Stem Cell and Cancer" (Torino, Italy, 2009), Curie School "Cell Shape Changes: Cell Motility and Morphogenesis" (Paris, France, 2009), International symposium "Control of Gene Expression and Cancer" (Moscow, Russia, 2010), FEBS Advanced lecture course "Trends in genetics: genomic instability and pathways of response" (Yerevan, Armenia, 2011).

Личный вклад соискателя

Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований, проведены обработка и анализ полученных экспериментальных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие её новизну и практическую значимость, а также подготовлены материалы публикаций в научных журналах. Эксперименты по определению статуса активности канонического Wnt сигнального пути в клеточных линиях меланомы человека выполнены при участии Посвятенко А.В. (ИБГ РАН, Москва). Клеточные пулы, продуцирующие лиганды Wnt, получены при участии Литвинчук А.В. (МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва). Обсуждение и интерпретация полученных результатов проводились с участием Кибардина А.В. (ИБГ РАН, Москва).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ. Из них статей - 2, глава в монографии -1, материалов конференций -13.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 124 страницах, содержит 30 рисунков и 1 таблицу, включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Материалы и Методы, Результаты и Обсуждения, Заключение, Выводы, Список литературы (включает 322 цитируемых источника) и одно приложение.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Клетки линий меланомы человека экспрессируют гены базовых молекулярных компонентов, необходимых для миграции

Высоко агрессивный характер развития меланомы прежде всего связан в высокой метастатической активностью клеток этого новообразования. Клеточная подвижность, в свою очередь, на молекулярном уровне ассоциирована с присутствием набора компонентов, среди которых базовые маркеры эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП): транскрипционные факторы Slug, Twist 1, Sipl и Snail, и компонент промежуточных филаментов виментин.

Определение уровня экспрессии генов основных маркеров ЭМП методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в различных клеточных линиях меланомы человека позволило показать, что исследованные клеточные линии различаются между собой по набору детектированных транскриптов, при этом все они содержат мРНК как минимум четырех из пяти указанных генов (Slug, Тwistl, Sipl, Snail или Vimentin) (рисунок 1).

Рисунок 1. Анализ экспрессии генов маркеров эпителиально-мезенхимального перехода в клеточных линиях меланомы человека методом ОТ-ПЦР. Л, в, МЕ, Кэеп, Юв, 226,1Ьг, 1Ь, Ког, Р, 81, 82 - клеточные линии меланомы человека; (КТ-) - отрицательный контроль ОТ-ПЦР; вАРОН - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.

Наличие экспрессии генов основных маркеров ЭМП говорит о том, что во всех исследованных клеточных линиях активирована программа эпителиально-мезенхимального перехода. Более того, присутствие базового набора транскрипционных факторов, обеспечивающих миграцию, также указывает на потенциальную способность клеток к активному движению.

2. Клеточные линии меланомы человека различаются по паттерну экспрессии генов молекулярных компонентов, ассоциированных с подвижностью

Реализация программы подвижности требует наличия определенных условий. Известно, что злокачественная трансформация меланоцитов сопровождается сменой типа молекул клеточной адгезии (Е-кадгерин на N-кадгерин) (Hsu et al., 2000; Li et al., 2001) и подавлением экспрессии генов, регулирующих клеточную дифференцировку,

. І, J Чче Snail

-- ------- Slug

' iatf «ш* ->■ • м* •• Ш Twistl

■ %т Ш w ы Sipl

^ И Ми у tf W к - — ы — ** Vimentin

»4. itli *т GAPDH

например MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) (Lekmine et al., 2007). При прогрессии меланомы повышается экспрессия ряда генов, включая S100A4/MTS1 (Maelandsmo et al., 1996). Исследование клеточных линий меланомы человека на предмет наличия транскриптов Е-кадгерина, N-кадгерина, MITF и S100A4/MTS1 позволило сгруппировать эти линии в порядке, соответствующем традиционным представлениям о прогрессии опухоли.

Более ранним стадиям развития заболевания соответствуют клеточные линии MelIL и Ме!82. Появление транскрипта N-кадгерина в линиях MelP и MelKsen позволяет соотнести эти линии со следующей стадией прогрессии меланомы. Линии Ме1226 и MelSi отличаются от предыдущих полным отсутствием экспрессии гена Е-кадгерина. Для линий MelKis, Mellbr и MelME, помимо отсутствия Е-кадгерина, характерно еще и уменьшение экспрессии гена, кодирующего белок MITF, на фоне появления транскрипта S100A4/MTS1. Клеточные линии меланомы человека MelR и MelG можно отнести к наиболее поздним стадиям развития опухоли (рисунок 2, А и Б).

Рисунок 2. Распределение клеточных линий меланомы человека согласно степени прогрессии опухоли. (А) Анализ экспрессии генов S100A4/MTS1, кадгеринов и MITF в клеточных линиях меланомы человека методом ОТ-ПЦР. (Б) Клеточные линии меланомы человека в порядке, соответствующем опухолевой

прогрессии.

Обозначения соответствуют рисунку 1.

Таким образом, на основании экспрессии генов МІТР, 8100А4/МТ81 и кадгеринов исследованные клеточные линии меланомы человека были группированы в порядке, соответствующем степени прогрессии опухоли.

3. В клеточных линиях меланомы человека отсутствие выраженной ядерной локализации р-катенина не отражает статус активности канонического \Viit сигнального пути

С возникновением и развитием меланомы связывают сигнальный путь, активируемый белками семейства \Viit Роль канонической, или р-катениновой, ветви \Vrit сигнального пути в меланомах спорна. Согласно одной группе данных, конститутивная активации данного сигнального каскада способствует возникновению заболевания (ОеІтаБ й а1., 2007). Другие исследования, напротив, указывают на супрессорное действие канонического сигнального пути в прогрессии меланомы,

— w Е-кадгерин

_<ы_ ІмІ W N-кадгерин

W -fe ■ ■ «M. %aa# MITF

w Ш ■ S100A4/MTS1

. ** . w w GAPDH

MellL MelP

MeJ226

Mel82 MelKsen MeiSi

-Опухолевая прогресси

MeîR MelG.:

демонстрируя положительную корреляцию между накоплением Р-катенина в ядрах клеток первичной опухоли/метастазов и продолжительностью жизни пациентов (Chien et al., 2009).

С целью выяснить значение р-катенинового сигнального каскада в формировании фенотипа меланомы человека клеточные линии меланомы были проанализированы на предмет внутриклеточной локализации основного медиатора канонического Wnt сигнального каскада Р-катенина. Внутриклеточное распределение Р-катенина изучалось при помощи иммуноцитохимического окрашивания исследуемых клеточных линий антителами к Р-катенину. Обработка изображений проводилась в программе ImageJ, где измерялись интенсивности свечения ядер и клеток в целом. Границы ядер определялись с помощью окрашивания DAPI. Использованная методика позволила четко выделить границу между цитоплазматическим/мембранным и ядерным Р-катенином (рисунок 3).

Полученные данные позволили условно разделить исследованные клеточные линии меланомы человека на две группы: с преимущественно ядерной (MelIL, Ме182, MelP, MelKor, Mel226, MelR) и с преимущественно цитоплазматической/мембранной (MelSi, MelME, MelG) локализацией р-катенина.

Правомочность подобного деления была подтверждена биохимическим методом. Для этого лизаты представителей каждой группы были подвергнуты фракционированию на конканавалин А (СопА)-сефарозе, после чего проанализированы методом вестернблот-анализа. В ходе подобного фракционирования происходит разделение внутриклеточного Р-катенина на "свободный" (цитоплазматический и ядерный) и входящий в состав белкового комплекса адгезионных контактов (мембранно-связанный) (Aghib and McCrea, 1995).

Сравнение содержания Р-катенина в обеих фракциях показало, что в MelG и MelME большая часть этого белка связана с мембраной, в то время, как в MelP и MelKor имеет место противоположное распределение. Эти данные полностью согласуются с результатами иммуноцитохимического анализа.

Сопоставление данных о внутриклеточном распределении Р-катенина в клеточных линиях меланомы человека с проделанной ранее классификацией этих линий по степени прогрессии заболевания позволило выявить следующую тенденцию. Клеточные линии, соответствующие более ранним стадиям развития меланомы, демонстрируют преимущественно ядерную локализацию Р-катенина. В то время как для линий, соответствующих более поздним стадиям (MelSi, MelME, MelG), характерна преимущественно мембранная/цитоплазматическая локализация этого белка. Исключение составляет только клеточная линия MelR, которая по наличию транскриптов маркеров клеточной подвижности и дифференцировки может быть соотнесена с терминальными стадиями развития опухоли, но при этом

В-кат • f IL лЛЦ^ . >» 1 1» « шш ЕЯ ЛЛт ^уЛЧО Г

DAPI в В и Щ

+ _ 2 < ц В в

ß-кат 226 ' Si ' •'.-'■'•■А ' МЕ R f G /

DAPI - 8 -е т С КЯВ Ц

+ — ¥ Q CO.1-1 * в % щ- - -% ü В

-Я

1 1,6

ф

§ =51,4

& g- 1,2 >s <

2 к 1,0 х ш

IL 82 Р Kor Ksen 226 Si ME R

Клеточные линии меланомы человека Рисунок 3. Локализация ß-катенииа в клеточных линиях меланомы человека. (А) Иммуноцитохимическое окрашивание клеточных линий меланомы человека антителами к ß-катенину. Ядра клеток окрашены DAPI. (Б) Содержание ß-катенина в ядре по отношению к общему содержанию ß-катенина внутри клетки. По оси ординат отложена величина InAc, отражающая уровень ß-катенина в ядре по отношению к общему уровню внутри клетки. IN - средняя яркость области ядра, а 1с - средняя яркость всей клетки. Звездочкой отмечены статистически достоверные различия в распределении ß-катенина (ядро/ клетка), измеренные по отношению к MelG (р< 0,05).

демонстрирует ярко-выраженную ядерную локализацию Р-катенина. Отклонение МеШ от прослеживающейся тенденции может быть объяснено наличием иных

внутриклеточных компонентов, чье влияние на фенотип данной линии оказывается более значимым, чем распределение Р-катенина. Описанная тенденция потери внутриядерной локализации Р-катенина при развитии меланомы ранее показана для солидных опухолей (Chien et al., 2009). Таким образом, в исследованных клеточных линиях внутриядерную локализацию р-катенина можно рассматривать как фактор, препятствующий развитию опухоли.

Согласно существующим представлениям ядерная локализация р-катенина должна сопровождаться активацией канонического Wnt сигнального пути (Weeraratna, 2005). В связи с этим, в исследованных клеточных линиях при помощи репортерной системы TOPFlash был проанализирован статус эндогенной активности Р-катенинового сигнального каскада, а также определена способность этих линий активировать Р-катениновый сигнальный каскад в ответ на лиганд Wnt3a.

Сравнительный анализ относительной активности TCF/LEF-зависимого промотора в отсутствии и при наличии лиганда Wnt3a выявил, что из восьми исследованных клеточных линий только в двух (MelP и MelG) активность TCF/LEF-зависимого промотора значительно усиливается в результате экспрессии Wnt3a (рисунок 4). В остальных клеточных линиях активации TCF/LEF-зависимого промотора при воздействии Wnt3a не происходит. При этом в двух из шести нечувствительных к Wnt3a линий (MelIL и MelKor) обнаружен высокий уровень активности TCF/LEF-зависимого промотора в отсутствие каких-либо дополнительных воздействий, что свидетельствует об эндогенной активности канонического Wnt сигнального пути. В оставшихся четырех линиях (MelKsen, Ме1226, MelSi и Ме182) уровень активности репортерной конструкции был крайне низок по сравнению с другими клеточными линиями, причем в двух из них (Ме1226 и Ме182) ранее была обнаружена ядерная локализация Р-катенина. Отсутствие активности канонического Wnt сигнального пути при ярко выраженной преимущественно ядерной локализации основного эффектора р-катенина указывает на наличие дополнительных механизмов, препятствующих активации этого сигнального каскада.

Таким образом, для исследованных клеточных линий меланомы человека наблюдается тенденция потери выраженной внутриклеточной локализации р-катенина по мере прогрессии заболевания. В то же время подобной тенденции для статуса активности канонического Wnt сигнального пути в исследованных линиях не прослеживается. Для клеточных линий меланомы человека внутриядерная локализация Р-катенина не является достаточным условием для активации канонического Wnt сигнального пути.

Клеточные линии меланомы человека

Рисунок 4. Активация TCF/LEF - зависимого промотора в клеточных линиях меланомы человека под воздействием лиганда Wnt3a.

Все клеточные линии были трансфицированы смесью плазмид TOPFIash+Ren+FRT (неокрашенные столбики) или смесью плазмид TOPFIash+Ren+FRT+Wnt3a (окрашенные столбики), где TOPFlash - плазмида, содержащая репортерный ген люциферазы светлячка под контролем TCF/LEF-зависимого промотора, Ren - нормирующая плазмида pRL-CMV, FRT - плазмида pcDNA™5/FRT/TO, используемая в качестве пустого вектора, Wnt3a - плазмида pCMV-hWnt3a, содержащая ген Wnt3a человека. Звездочкой отмечены статистически достоверные различия между группами (р< 0,05).

4. Вариабельность паттерна экспрессии генов транскрипционных факторов TCF/LEF семейства в клеточных линиях меланомы человека

Одним из факторов, способных повлиять на активацию канонического Wnt сигнального каскада, может быть доступность ядерных белков-партнеров ß-катенина, принадлежащих к семейству TCF/LEF, насчитывающему четыре транскрипционных фактора: LEF1, TCF1, TCF3, TCF4. При активации канонического Wnt сигнального каскада ß-катенин транслоцируется в ядро и образует транскрипционно активный комплекс с TCF/LEF (Daniels and Weis, 2005).

Возможно неспособность ядерного ß-катенина активировать канонический Wnt сигнальный путь в некоторых клеточных линиях меланомы человека является следствием отсутствия транскрипционных факторов семейства TCF/LEF. Для проверки данной гипотезы в имеющихся клеточных линиях меланомы человека была оценена экспрессия генов белков этого семейства методом ОТ-ПЦР (рисунок 5).

* ° if /JÍ? •=*"

Рисунок 5. Анализ экспрессии генов транскрипционных факторов

семейства TCF/LEF в клеточных линиях меланомы человека методом ОТ-ПЦР.

R, G, ME, Ksen, Kis, 226, Ibr, IL, Kor, P, Si, 82 - клеточные линии меланомы человека; (RT-) - отрицательный

контроль ОТ-ПЦР; GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.

Было установлено, что транскрипты факторов TCF/LEF присутствуют во всех исследованных клеточных линиях. При этом набор этих транскриптов от линии к линии существенно отличается. Единственным представителем семейства TEF/LEF, чей уровень транскрипта сравнительно одинаков для всех исследованных клеточных линий, является TCF-4. Экспрессия генов остальных членов семейства варьирует. Для большинства исследованных линий меланомы человека характерен низкий уровень мРНК LEF-1 и TCF-1. Транскрипт TCF-3, напротив, на достаточно высоком уровне детектируется в большинстве клеточных линий. Полученные данные позволили заключить, что неспособность некоторых клеточных линий меланомы человека, характеризующихся ярко-выраженной ядерной локализацией ß-катенина, активировать канонический Wnt сигнальный путь не связана с отсутствием транскриптов факторов семейства TCF/LEF.

5. Транскрипционный фактор TCF-3 при меланоме может служить ингибитором канонического Wnt сигнального пути

Известно, что в некоторых системах TCF-3 может негативно влиять на активацию канонического Wnt сигнального пути (Yi et al., 2011). Учитывая эти данные и тот факт, что транскрипт TCF-3 был обнаружен во всех клеточных линиях с низким уровнем эндогенной активности канонического Wnt сигнального пути, была проверена потенциальная способность TCF-3 ингибировать активность TCF/LEF репортерной системы в клеточной линии меланомы человека. В качестве модельной системы была выбрана не экспрессирующая ген TCF-3 клеточная линия МеЮ со средним уровнем эндогенной активности канонического Wnt сигнального пути, чувствительная к воздействию лиганда Wnt3a. Плазмида, кодирующая белок xTCF-3 Xenopus laevis, была любезно предоставлена профессором Сергеем Соколом (Mount Sinai School of Medicine, NY, USA). Клеточная линия MelG была протрансфицирована смесью репортерной плазмиды TOPFlash и нормирующей плазмиды pRL-CMV. Кроме того, часть трансфекционной смеси помимо TOPFlash и pRL-CMV содержала Wnt3a-KOÄHpyK>HjyK> плазмиду, xTCF-3-кодирующую плазмиду или смесь этих двух

плазмид. В рамках данного эксперимента для активации канонического Wnt сигнального пути помимо ХУШЗа-кодирующей плазмиды использовался также 1ЛС1, который в отличие от N¥111 лигандов воздействует на сигнальный путь не на уровне рецепторов, а на уровне Р-катенин-деградирующего комплекса.

Трансфекция клеточной линии МеЮ хГСТ-'-і-содержащей плазмидой сопровождалась существенным снижением транскрипции ТСР/ЬЕР-репортерного гена, стимулированной как лигандом WntЗa, так и ЬіСІ (рисунок 6).

Т+1Ч вРР W3a Ша 1_101 1дС1 хТСРЗ хТСРЗ

Рисунок 6. Экспрессия гена хТСР-З подавляет активацию транскрипции ТСР/ЬЕР - зависимого репортерного гена, стимулированную лигандом \Vnt3a и ЬЮ, в клеточной линии меланомы человека МеЮ.

Т - ТОРПавЬ (плазмида, содержащая репортерный ген люциферазы светлячка под контролем ТСР/ЬЕР-зависимого промотора); Я - нормирующая плазмида рЯЬ-СМУ; W3a - плазмида рСМУ-Ь\Уп13а, кодирующая лиганд WntЗa человека; хТСРЗ -плазмида, кодирующая транскрипционный фактор хТСР-З; 1лС1 - 20 шМ хлорида лития. Звездочкой отмечены статистически достоверные различия в активности ТСР/ЬЕР - репортерного гена (р< 0,05).

Таким образом, в клеточной линии меланомы человека MelG TCF-3 может действовать как ингибитор канонического Wnt сигнального пути.

6. Для клеточных линий меланомы человека характерна экспрессия гена неканонического лиганда Wnt5a

Полагают, что неканонический Wnt сигнальный путь, активируемый Wnt5a, способствует метастазированию меланомы (Bittner et al., 2000; Weeraratna et al., 2002; Dissanayake et al., 2007). Функциональным антиподом неканонического Wnt5a в меланоме считают канонический Wnt3a. В то время как действие Wnt5a направлено на усиление метастатического потенциала клеток, для Wnt3a показано негативное влияние на способность клеточной линии меланомы мыши В16 к метастазированию (Chien et al., 2009; O'Connell and Weeraratna, 2009).

В имеющихся клеточных линиях меланомы человека методом ОТ-ПЦР было исследовано наличие транскриптов \Vnt5a и "МтЗа (рисунок 7).

\ШЗа \ZVnt5a САРОН

Рисунок 7. Анализ экспрессии генов канонического и неканонического лигандов Wnt в клеточных линиях меланомы человека методом ОТ-ПЦР.

R, G, ME, Ksen, Kis, 226, Ibr, IL, Kor, P, Si, 82 - клеточные линии меланомы человека; (RT-) - отрицательный контроль ОТ-ПЦР; GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.

Транскрипт Wnt5a присутствует в подавляющем большинстве исследованных образцов (75%), ген Wnt3a экспрессируется лишь в нескольких клеточных линиях меланомы человека. По результатам, ранее полученным в нашей лаборатории, транскрипт другого неканонического лиганда Wntl 1 также часто встречается в исследованных клеточных линиях (75%).

При сравнении паттерна экспрессии гена Wnt5a в исследованных клеточных линиях меланомы человека с характером распределения этих линий относительно степени прогрессии опухоли, выяснилось, что транскрипт Wnt5a присутствует во всех выделенных группах. Данное наблюдение говорит о том, что лиганд Wnt5a важен для всех этапов прогрессии опухоли.

7. Неканонические и канонический Wnt лиганды вызывают усиление миграции клеточной линии меланомы человека MelP

Для изучения влияния лигандов Wnt5a, Wntll и Wnt3a на поведение клеток меланомы человека была выбрана модельная клеточная линия меланомы человека MelP. Выбор клеточной линии определялся тем, что для исследования необходима модель, способная реагировать на разнонаправленные воздействия, поскольку Wnt5a и Wnt3a в меланоме считаются функциональными антагонистами (Weeraratna et al., 2002) (Chien et al., 2009). Клеточная линия меланомы человека MelP, согласно ранее сделанной в данной работе классификации, может быть отнесена к промежуточным стадиям прогрессии метастазирующей меланомы. Ее фенотип может быть изменен в сторону как более поздней, так и более ранней стадии заболевания.

§§II

м •— «>• ММ м

\ ' ^ ■ : : w . W • w Ътф w

аз

н

^

JD (D

° Л-

О Ф о. q: о s ^ s

04 J if

1°

5 c 2i

si о I

0 (U

1 3 H

о ™

О

MelP MelPi MelP/ MelP/ MelP/ GFP Wnt3a Wnt5a Wnt11 Рисунок 9. Относительная скорость восстановления "дефекта" клетками родительской линии MelP и клетками пулов MelP/Wnt3a, MelP/Wnt5a, MelP/Wntl 1 и MelP/GFP, измеренная при помощи теста миграция в "дефект".

Звездочкой отмечены статистически достоверные различия между группами (р< 0,05).

8. Неканонический лиганд Wntl 1 стимулирует пролиферацию клеток MelP

Изменение скорости сокращения площади "дефекта" в ответ на стимулирующее воздействие может быть связано не столько с усилением подвижности, но и с активацией пролиферации клеток (здесь и далее в тексте под пролиферацией понимается увеличение числа жизнеспособных клеток в культуре). Для выявления вклада этого фактора для клеток родительской клеточной линии MelP и клеток всех стабильных пулов MelP/GFP, MelP/Wnt3a, MelP/Wnt5a и MelP/Wntl 1 была измерена эффективность пролиферации.

Эффективность клеточной пролиферации оценивалась при помощи теста CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS). При этом считается, что оптическая плотность раствора, полученного в результате реакции, в лунках культурального планшета, прямо пропорциональна числу живых клеток в культуре. В качестве отрицательного контроля использовалась среда для культивирования.

Полученные данные позволили прийти к следующему заключению. Как и в случае с миграцией, продукция GFP не влияет на скорость пролиферации родительской линии MelP (рисунок 10). Графики, описывающие пролиферацию MelP и MelP/Wnt5a, также совпадают, что указывает на близкие скорости роста этих культур. Учитывая, что в эксперименте на миграцию клетки пула MelP/Wnt5a закрывали "дефект" быстрее, чем клетки родительской линии MelP, можно заключить, что разница в скоростях закрывания "дефекта" между этими двумя линиями преимущественно является следствием различий в подвижности клеток, а не скорости их деления. В случае с Wntll ситуация противоположна. Клетки пула MelP/Wntl 1 пролиферируют быстрее, чем клетки родительской линии MelP. Отсюда следует, что эффект ускоренного затягивания "дефекта" клетками MelP/Wntl 1

обусловлен во многом именно высокой скоростью их пролиферации. Скорость роста культуры МеШЛМгйЗа, напротив, ниже, чем та, что характерна для родительской линии Ме1Р. При этом скорость затягивания "дефекта" этими клетками примерно в 3 раза выше, чем клетками линии Ме1Р. Все это говорит о том, что экспрессия гена \УмЗа усиливает именно миграцию клеточной линии меланомы человека, в то время как скорость роста культуры, напротив, падает.

6-| *

О 5-1 § §

X 5 т X

Ь- Ю 3J

О о

я °

CL о

Ё.5 2

с ш

со

S 1

*

nh

т Йгг

ЕЕ

—

i

□ MelP

□ MelP/GPF

□ MelP/Wnt3a

□ MelP/ Wnt5a

□ MelP/ Wnt11

24 часа 48 часов 72 часа

Рисунок 10. Изменение числа жизнеспособных клеток в культуре для клеточной линии

Ме1Р и пулов Ме1РЛУшЗа, Ме1РЛУт5а, Ме1РЛУпШ и Ме1Р/СРР.

Звездочкой отмечены статистически достоверные отличия между группами (р< 0,05).

Таким образом, несмотря на то, что все исследованные Wnt лиганды сходно влияют на скорость затягивания искусственного "дефекта" опухолевыми клетками MelP, природа их стимулирующего воздействия различается. Wnt5a активирует подвижность клеток, Wntl 1 усиливает преимущественно скорость роста культуры, а Wnt3a стимулирует подвижность, но при этом подавляет пролиферацию клеток.

9. Усиление миграции клеточной линии меланомы человека MelP под действием Wnt3a не связано с активацией канонического Wnt сигнального пути

В клеточной линии MelP лиганд Wnt3a активирует канонический Wnt сигнальный путь. Учитывая этот факт, было необходимо выяснить, является ли усиление миграции клеток MelP под действием Wnt3a следствием активации данного сигнального каскада. С этой целью в родительской клеточной линии MelP канонический Wnt сигнальный путь активировали двумя способами: специфически посредством рекомбинантного белка Wnt3a и неспецифически при помощи LiCl. Лиганд Wnt3a запускает передачу сигнала на уровне рецептора, а действие LiCl

непосредственно направлено на белковый комплекс, участвующий в деградации основного медиатора канонического сигнального пути |3-катенина (рисунок 11).

*

*

О'

MelP mrWnt3a LiCI

Рисунок 11. Относительная скорость восстановления "дефекта" клетками родительской линии меланомы человека MelP в присутствии рекомбинантного белка mrWnt3a или LiCI.

mrWnt3a (mouse recombinant Wnt3a) - 50 ng/ml рекомбинантного белка Wnt3a мыши; LiCI - 20 mM хлорида лития. Звездочкой отмечены статистически достоверные различия между группами (р<0,05).

Анализ полученных результатов показал, что добавление рекомбинантного белка Wnt3a усиливает, в то время как добавление LiCI не влияет на скорость закрытия "дефекта" клетками MelP. Поскольку LiCI считается неспецифическим активатором ß-катенинового сигнального пути, его неспособность стимулировать миграцию клеток MeiP говорит о независимом от активации канонического Wnt сигнального каскада характере действия Wnt3a на клеточную подвижность.

10. В клеточной линии MelP лиганды Wnt3a, Wnt5a и Wntll активируют сигнальный путь, связанный с увеличением уровня внутриклеточного кальция

Существует целая группа данных, говорящих о том, что эффект от связывания Wnt лигандов сильно зависит от комбинации доступных рецепторов и корецепторов на поверхности клетки (Smit et al., 2004; Тао et al., 2005; Wallingford and Habas, 2005; Mikels and Nusse, 2006). Учитывая, что в изменении клеточной подвижности преимущественно задействованы неканонические Wnt сигнальные пути, была проверена способность канонического Wnt3a и неканонических Wnt5a и Wntl 1 активировать Wnt/Са^-зависимый сигнальный каскад в исследуемой клеточной системе MelP.

С этой целью была создана генно-инженерная конструкция, содержащая репортерный ген люциферазы светлячка (FFly) под контролем минимального промотора SV40, которому предшествуют 8 сайтов связывания для транскрипционного фактора NFAT (Nuclear factor of activated T-cells). Активность

транскрипционного фактора №АТ подвержена регуляции под действием Са+-зависимого сигнального пути. Принцип действия репортерной системы №АТ напоминает тот, что характерен для репортерной системы ТОРИТЬ. Связывание лиганда, индуцирующее повышение уровня внутриклеточного Са2+, приводит к транслокации ОТАТ в ядро и к активации экспрессии №АТ-зависимого репортерного гена (Ое]тек еі аі., 2006).

Проверку функциональной активности созданной репортерной системы №АТ осуществляли с использованием неспецифического активатора \¥пі/Са2+-зависимого сигнального пути ионофора А23187. Для этого клеточную линию МеІР, трансфицируемую смесью №АТ-репортерной и нормирующей плазмид, обработали А23187 (рисунок 12).

Рисунок 12. Активация №АТ - зависимой репортерной системы в присутствии ионофора А23187.

N - ОТАТ-репортерная плазмида;

Я - нормирующая плазмида рКЬ-СМУ; А23187 - Са2+- ионофор. Звездочкой отмечены статистически достоверные различия между группами (р< 0,05).

N+1* А23187

Добавление ионофора к культуре клеток Ме1Р, транзиторно трансфицированных смесью №АТ-репортерной и нормирующей плазмид, приводило к увеличению уровня экспрессии ОТАТ-зависимого репортерного гена почти в 4 раза.

Полученная репортерная система позволила оценить вклад различных лигандов Wnt в изменение активности "\Уп1/Са2+-зависимого сигнального пути в клеточной линии меланомы человека Ме1Р. С этой целью данная клеточная линия была одновременно трансфицирована смесью ОТАТ-репортерной и нормирующей плазмид, а также плазмидой, кодирующей лиганд АУЩ (\Vnt3a, \Vnt5a или Wntll), либо пустым вектором в качестве отрицательного контроля. Результаты анализа относительной активности люциферазы РР1у показали, что в исследуемой системе \Vrit лиганды \Vntll, Wnt5a и \Vnt3a могут стимулировать \Уп1/Са2+-сигнальный путь (рисунок 13).

Ы+Я Вектор \Л/пН1 Wnt5a WntЗa

Рисунок 13. Активация NFAT - зависимой репортерной системы под действием лигандов \Vnt5a, WIltЗa, Wntll.

N - №АТ-репортерная плазмида; И - нормирующая плазмида рЯЬ-СМУ; Вектор - пустой вектор; \Vnt5a - плазмида, содержащая ген ¡¥ш5а человека; WntЗa- плазмида, содержащая ген ІУп/За человека; \Vntll - плазмида, содержащая ген іУпіІІ человека. Звездочкой отмечены статистически достоверные различия между группами (р< 0,05).

Таким образом, в клеточной линии меланомы человека Ме1Р как неканонические лиганды \Vnt5a и Wntll, так и классический канонический лиганд \Vnt3a способны активировать сигнальный путь, связанный с изменением уровня внутриклеточного Са2+. Более того, эффект от \УЩЗа-опосредованной стимуляции сигнального пути оказался сравнимым с эффектом от \Vnt5a, который рассматривается как основной лиганд сигнального каскада, связанного с изменением уровня цитоплазматического Са2+.

С целью подтвердить, что обнаруженная \¥гИ;За-опосредованная активация \Уп1/Са2+-сигнального пути не связана с генными манипуляциями, которым подвергаются клетки, предыдущий эксперимент был модифицирован. Трансфекция ЖмЗа-содержащей плазмидой была заменена добавлением рекомбинантного белка т^щЗа. Обработка клеточной линии Ме1Р рекомбинантным тг'УМЗа приводила к возрастанию экспрессии ОТАТ-зависимого репортерного гена (рисунок 14, А).

Учитывая тот факт, что в исследуемой клеточной линии лиганд \Vnt3a успешно активирует канонический \Vrit сигнальный путь, необходимо было исключить вероятность

Р-катенин-зависимого влияния \Vnt3a на \Уп1/Са2+-сигнальный каскад. Обработка клеток Ме1Р неспецифическим ингибитором ОЭК-ЗР ЫС1 вызывала частичное ингибирование активности №АТ-репортерной системы (рисунок 14, Б), указывая на независимый от стабилизации Р-катенина характер активации \Vnt3a-стимулированного \¥п1/Са2+-зависимого пути.

Таким образом, \¥Щ/Са2+-стимулирующий эффект '\ynt3a является специфичным, не связан с действием процедуры трансфекции белок-кодирующей

плазмидой и не зависит от стабилизации основного медиатора канонического \Vrit сигнального пути (3-катенина.

А 2'5'

I-

*

Б - 2-

А

ь

О

U О

=г 2 с;

*

О-

О'

N+R mrWnt3a

N+R

LiCI

Рисунок 14. Активация NFAT - зависимой репортерной системы в клеточной линии MelP под действием рекомбинантного белка mrWnt3a (А) и LiCI (Б). N - NFAT-репортерная плазмида; R - нормирующая плазмида pRL-CMV; mrWnt3a (mouse recombinant Wnt3a) - культивирование клеток в присутствии 50 нг/мл рекомбинантного белка Wnt3a мыши, LiCI - культивирование клеток в присутствии 20 мМ хлорида лития.

Звездочкой отмечены статистически достоверные различия между группами (р<0,05).

Исходя из изложенных выше данных, можно заключить, что клетки всех исследованных в работе линий меланомы человека потенциально способны к активной миграции, поскольку содержат набор базовых молекулярных компонентов, необходимых для передвижения. Тем не менее, одного наличия базовых компонентов, обеспечивающих миграцию клеток, не достаточно для формирования высоко подвижного фенотипа опухоли. Успешная реализация программы подвижности зависит от ряда факторов, в числе которых активность внутриклеточных сигнальных каскадов, влияющих на продукцию разнообразных молекулярных компонентов, способствующих миграции.

В данной работе было впервые показано, что выраженная ядерная локализация ß-катенина не является достаточным условием для активации канонического Wnt сигнального пути в клеточных линиях меланомы человека. Подобное наблюдение дает возможность по-новому взглянуть на роль канонического Wnt сигнального пути в формировании фенотипа опухоли. Для меланомы характерна тенденция к потере внутриядерной локализации ß-катенина по мере прогрессии опухоли. При этом аналогичной тенденции по изменению статуса активности канонического Wnt сигнального пути при прогрессии меланомы в рамках данного исследования выявлено не было. Таким образом, несмотря на то, что, по крайней мере, в некоторых экспериментальных системах внутриядерную локализацию ß-катенина можно

рассматривать как фактор, препятствующий развитию опухоли, зависимость между локализацией р-катенина и степенью прогрессии меланомы определяется не столько активностью канонического Wnt сигнального пути, сколько наличием альтернативных молекулярных факторов, также способных влиять на внутриклеточную локализацию Р-катенина.

В рамках данного исследования было изучено не только значение конкретного сигнального пути для прогрессии меланомы, но и характер влияния лигандов семейства Wnt на формирование фенотипа опухоли. Wnt3a способен активировать миграцию, a Wnt 11 еще и пролиферацию опухолевых клеток MelP. Более того, эффект на миграцию от канонического Wnt3a имитировал действие, оказываемое неканоническим Wnt5a, что опровергает предположение о функциональном антагонизме данных лигандов при меланоме. WntЗa-oпocpeдoвaннaя миграция не зависит от активации канонического Wnt сигнального пути, поскольку добавление LiCl не влияет на подвижность клеток. Помимо миграции Wnt3a также оказывает влияние на пролиферацию опухолевых клеток, снижая скорость их роста. Несмотря на кажущееся противоречие эффектов, оказываемых Wnt3a, как активизация подвижности, так и ингибирование пролиферации способны положительно повлиять на метастазирование опухоли.

В исследованной системе MelP все Wnt лиганды, вне зависимости от того, считаются они каноническими или неканоническим, активируют сигнальный каскад, связанный с увеличением уровня цитоплазматического Са2+. При этом, Wnt3a также активирует канонический р-катениновый сигнальный путь.

ВЫВОДЫ

1. Для всех исследованных клеточных линий меланомы человека характерна экспрессия генов маркеров эпителиально-мезенхимального перехода: Slug, Twistl, Sipl, виментина, что свидетельствует об активированном статусе программы эпителиально-мезенхимального перехода в изученных линиях.

2. Впервые показано, что накопление Р-катенина в ядрах клеток линий меланомы человека не может служить достаточным условием для активации канонического Wnt сигнального пути.

3. Как канонический Wnt3a, так и не канонический Wnt5a лиганды усиливают подвижность клеток линии меланомы человека MelP.

4. Неканонический лиганд Wntl 1 усиливает пролиферацию культуры клеточной линии меланомы человека MelP, в то время как канонический лиганд Wnt3a оказывает противоположное действие.

5. В клеточной линии меланомы человека MelP канонический лиганд Wnt3a способен активировать сигнальный путь, связанный с увеличением уровня внутриклеточного кальция.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. К.В. Куликова. А.В. Посвятенко, Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев, А.В. Кибардин, С.С. Ларин (2011). Внутриядерная локализация Р-катенина не может считаться достаточным условием для активности канонического сигнального пути Wnt в клеточных линиях меланомы человека. Молекулярная биология 45(5): 884-891.

2. А.В. Посвятенко, К.В. Куликова. Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев, А.В. Кибардин, С.С. Ларин (2012). Функциональные свойства новой изоформы лиганда Wntll, экспрессирующейся в клетках линии карциномы кишечника человека НТ29. Молекулярная биология 46(1): 129-138.

Главы в монографиях:

1. Ksenia Kulikova. Alexey Kibardin, Nikolay Gnuchev, Georgii Georgiev and Sergey Larin (2011). Research on Melanoma - A Glimpse into Current Directions and Future Trends. Chapter Dual Function of Wnts in Human Cutaneous Melanoma (pp 243-268). InTech. ISBN 978-953-307-293-7.

Тезисы конференций:

1. Kseniya V. Kulikova, Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Noncanonical Wnt cascades interplay in melanoma aggressive phenotype formation. The FEBS/EARC Advanced Lecture Course " Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer" Co-sponsored by CGC, the Island of Spetses, Greece. August 16-25,2009.

2. A.V. Posvyatenko, A.V. Kibardin, K.V. Kulikova. N.V. Gnuchev, G.P. Georgiev, and Sergey S. Larin. Mechanisms of Wntll signaling pathway regulation in human melanoma cell lines. Invasive Growth: a Genetic Program for Stem Cell and Cancer. EMBO Molecular Medicine Workshop IRCC, Institute for Cancer Research and Treatment, Torino, Italy. September 10-12,2009, p. 52

3. Куликова K.B.. Кибардин A.B., Посвятенко A.B., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Влияние активации неканонических Wnt сигнальных путей на формирование агрессивного опухолевого фенотипа линий меланомы человека. Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии», Звенигород, Россия. 12-16 октября 2009, стр. 52.

4. Kseniva У. Kulikova. Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Wnt signaling and melanoma aggressive phenotype formation. Curie School Cell Shape Changes: Cell Motility and Morphogenesis, Paris, France. October 19-23,2009.

5. Куликова K.B.. Кибардин A.B., Посвятенко A.B., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Гетерогенность паттерна экспрессии молекулярных маркеров в клеточных линиях меланомы человека. 14 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, Россия. 1923 апреля 2010, стр. 149.

6. Aleksandra V. Posvyatenko, Alexey V. Kibardin, Ksenia V. Kulikova. Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergei S. Larin. Wnt 1 1 splice-variant expression in HT29 colon carcinoma cell line. International symposium "Control of Gene Expression and Cancer", Moscow, Russia. June 21-25,2010, p. 75.

7. Ksenia V. Kulikova, Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Expression pattern of EMT associated markers in different human melanoma cell lines. International symposium "Control of Gene Expression and Cancer", Moscow, Russia. June 21-25,2010, p. 76.

8. Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Kseniya V. Kulikova. Sergei Nabirochkin, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Effect of Wntll ligand alternative splicing on Wnt signaling regulation. International symposium "Control of Gene Expression and Cancer", Moscow, Russia. June 21-25,

2010, p. 44.

9. Куликова K.B.. Посвятенко A.B., Гнучев H.B., Георгиев Г.П., Кибардин А.В., Ларин С.С. Анализ взаимосвязи внутриклеточной локализации бета-катенина и активности канонического сигнального пути Wnt в клеточных линиях меланомы человека. XXIII Международная зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, Россия. 7-10 февраля 2011, стр. 10.

10. Ksenia У. Kulikova. Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Motility related gene expression pattern and its correlation with noncanonical Wnt ligand expression in human melanoma cell lines. FEBS Advanced lecture course "Trends in genetics: genomic instability and pathways of response". Yerevan, Armenia. February 20-26,2011, p. 82.

11. K.B. Куликова. A.B. Кибардин, A.B. Посвятенко, H.B. Гнучев, Г.П. Георгиев, С.С. Ларин. Выявление роли лигандов WNT в формировании агрессивного опухолевого фенотипа линий меланомы человека. VII симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, Россия. 1-4 июня, 2011. Онкогематология №2 (2011), стр. 44-45.

12. А.В. Посвятенко, К.В. Куликова. А.В. Кибардин, Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев, С.С. Ларин. Экспрессия сплайс-вариантов Wntll в клетках линии колоректального рака (НТ29). VII симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, Россия. 1-4 июня,

2011. Онкогематология №2 (2011), стр. 49.

А.В. Кибардин, А.В. Посвятенко, К.В. Куликова, Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев, С.С. Ларин. Изоформы лиганда Wntll и их функциональные свойства. VII симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, Россия. 1-4 июня, 2011. Онкогематология №2 (2011), стр. 40.

Заказ № 96-ПУ03/2012 Подписано в печать 20.03.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 \^«у/ www.с/г.ги; е-таИ:т/о@с/г.ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куликова, Ксения Валерьевна, Москва

61 12-3/826

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

КУЛИКОВА КСЕНИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ \У1ЧТ ЛИГАНДОВ НА ФОРМИРОВАНИЕ ФЕНОТИПА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук (03.01.03 - молекулярная биология)

Научный руководитель: к.б.н. С.С. Ларин

МОСКВА 2012

СОДЕРЖАНИЕ

и .

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ 4

ВВЕДЕНИЕ 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ВКЛАД \¥ОТ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В

ВОЗНИКНОВЕНИЕ И РАЗВИТИЕ МЕЛАНОМЫ 9

1.1 Лиганды ХУяЛ и их внеклеточные партнеры по взаимодействию 9

1.2 Пути передачи сигнала, активируемые белками семейства 12

1.2.1 Канонический \yrit сигнальный путь 12

1.2.2 Неканонические \Угй сигнальные пути 28

1.3 Значение сигнального пути для поддержания гомеостаза кожи 31

1.4 Роль сигнального пути в формировании и прогрессии меланомы 35

1.4.1 Роль канонического \Vrit сигнального пути при развитии меланомы 36

1.4.2 Вклад неканонического \yrit сигнального пути в метастазирование меланомы 40

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46

2.1 Ферменты и реактивы 46

2.2 Плазмидные векторы и клонирование 46

2.2.1 Создание экспрессионной конструкции, кодирующей лиганд 11\¥п15а 46

2.2.2 Создание ОТАТ-репортерной системы 46

2.3 ДНК электрофорез в агарозном геле и ПААГ 47

2.4 Трансформация клеток Е. соЫ 47

2.5 Культивирование клеточных линий 47

2.6 Выделение тотальной РНК и ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией 48

2.7 Транзиторная трансфекция культуры опухолевых клеток 49

2.8 Получение клеточных пулов, стабильно продуцирующих рекомбинантные белки 49

2.9 Вестерн-блот (иммуноблот) анализ 50

2.10 Выделение мембрано-связанного пула Р-катенина 51

2.11 Иммуноцитохимический анализ 52

2.12 Люциферазный тест 52

2.13 Определение жизнеспособности и пролиферативной активности клеток 53

2.14 Тест на восстановление повреждений монослоя 53

2.15 Статистическая обработка результатов 55

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 56

3.1 Клетки меланоцитарного невуса и клетки линий меланомы человека экспрессируют

гены базовых молекулярных компонентов, необходимых для миграции 56

3.2 Клеточные линии меланомы человека различаются по паттерну экспрессии генов молекулярных компонентов, ассоциированных с подвижностью 57

3.3 В клеточных линиях меланомы человека отсутствие выраженной ядерной локализации р-катенина не отражает статус активности канонического \Viit сигнального пути 61

3.4 Вариабельность паттерна экспрессии генов транскрипционных факторов ТСР/ЬЕБ семейства в клеточных линиях меланомы человека 68

3.5 Для клеточных линий меланомы человека характерна экспрессия гена неканонического лиганда \Vnt5a 72

3.6 Получение экспрессионных конструкций, кодирующих лиганды Wnt 73

3.7 Экспрессия гена канонического лиганда приводит к накоплению Р-катенина и к активации ТСР/ЬЕР-зависимого промотора в модельной клеточной линии меланомы человека Ме1Р 75

3.8 В клеточной линии Ме1Р неканонические лиганды ингибируют активацию канонического \Vrit сигнального пути, стимулированную \Vnt3a, но не 1лС1 77

3.9 Как неканонические, так и канонический лиганды вызывают усиление миграции клеточной линии меланомы человека Ме1Р 80

3.10 Неканонический лиганд \Vntl 1 стимулирует пролиферацию клеток Ме1Р 86

3.11 Усиление миграции клеточной линии меланомы человека Ме1Р под действием \Vnt3a не связано с активацией канонического \Viit сигнального пути 89

3.12 В клеточной линии Ме1Р лиганды \Vnt3a, \Vnt5a и \¥п1;11 активируют сигнальный путь, связанный с увеличением уровня внутриклеточного кальция 91

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 98

5. ВЫВОДЫ ЮЗ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 104 ПРИЛОЖЕНИЕ А 122 БЛАГОДАРНОСТИ 124

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ Аденозинтрифосфат

ВКМ Внеклеточный матрикс

Да (кДа) Дальтон (килодальтон)

ДСН Додецилсульфат натрия

ДСН-ПААГ Полиакриламидный гель, содержащий додецилсульфат натрия

ОТ-ПЦР Полимеразная Цепная Реакция, сопряженная с Обратной

Транскрипцией

цАМФ Циклический аденозинмонофосфат

ЭМП Эпителиально-мезенхимальный переход

АРС Adenomatous Polyposis Coli (Аденоматозный полипоз толстой кишки)

CAMKII Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Кальций/Кальмодулин-зависимая киназа)

СВР cAMP response element-binding protein (CREB)-Binding Protein

CDR Cysteine-Rich Domain (Цистеин-богатый домен)

CKI Casein kinase 1 (Казеин киназа 1)

ConA ConcanavalinA (Конканавалин A)

CRM1 Chromosome Region Maintenance 1 (Экспортин 1)

Daam-1 Dishevelled-associated activator of morphogenesis 1 (Dishevelled-

ассоциированный активатор морфогенеза 1)

DAG Diacylglycerol (Диацилглицерол)

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole (4',6-диамидино-2-фенилиндол)

Dkk Dickkopf

Dvl Disheveled

Fz Frizzled

GAPDH Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase (Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа)

GFP Green Fluorescent Protein (Зеленый флюоресцентный белок)

GPCR G-Protein-Coupled Receptor (Рецептор, сопряженный с G-белком)

GSK-3ß Glycogen synthase kinase-3ß (Гликоген синтаза киназа 3ß)

IP3 Inositol(l ,4,5)- trisphosphate (Инозитол(1,4,5)-трифосфат)

JNK c-Jun N-terminal Kinase (c-Jun N-терминальная киназа)

LRP 5/6 Low density lipoprotein (LDL) receptor-Related Protein 5/6 (Белок,

родственный рецепторам липопротеинов низкой плотности)

MITF Microphthalmia-Associated Transcription Factor (Микрофтальмия-

ассоциированный транскрипционный фактор) ММР Matrix Metalloproteinase (Матриксная металлопротеаза)

MTS 3-(4,5-dimethylthiazol-2~yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-

(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолий) MVB Multivesicular bodies (Мультивезикулярные тельца)

NCC Neural Crest Cells (Клетки нервного гребня)

NES Nuclear Export Signal (Сигнал ядерного экспорта)

NFAT Nuclear Factor of Activated T-cells (Ядерный фактор активированных

Т-клеток)

NLS Nuclear Localization Sequence (Сигнал ядерной локализации)

PBS Phosphate Buffered Saline (Фосфатно-солевой буфер)

PCP Planar Cell Polarity (Планарная клеточная полярность)

PI4KII Phosphatidylinositol-4-Kinase type II (Фосфотидилинозитол-4-киназа

второго типа) PIP2 Phosphatidylinositol(4,5)-bisphosphate

(Фосфотидилинозитол(4,5)-дифосфат) PIP5KI Phosphatidylinositol-4-Phosphate-5-Kinase I

(Фосфотидилинозитол-4-фосфат-5-киназа 1) PKC Protein Kinase С (Протеинкиназа Ц)

PLC Phospholipase С (Фосфолипаза Ц)

РР2А Protein Phosphotase 2А (Протеинфосфатаза 2А)

PVDF Polyvinylidene fluoride (Поливинилиден фторид)

ROCK Rho-associated kinase (Rho-ассоциированная киназа)

RTK Receptor Tyrosine Kinase (Рецепторная тирозинкиназа)

sFRP soluble Frizzled-Related Protein (растворимый Frizzled-подобный белок)

TCF/LEF T-Cell Factor/Lymphoid Enhancer Factor (Т-клеточный

транскрипционный фактор/лимфоидный транскрипционный фактор) TNKS1 /2 Tankyrase 1 /2 (Танкираза 1 /2)

WGA Wheat Germ Agglutinin (Агглютинин из зародышей пшеницы)

WIF-1 Wnt inhibitory factor 1 (Wnt ингибирующий фактор 1)

(ЗТгСР P-Transducin repeat Containing Protein (Белок, содержащий повторы

Р-трансдуцина)

ВВЕДЕНИЕ

Диагностика меланомы на ранних стадиях сильно затруднена значительным внешним сходством меланоцитарных невусов и новообразованных меланом. Пациенты зачастую не обращают внимания на незначительные изменения цвета, размера или контура родинок, сопровождающие их злокачественную трансформацию. Помимо внешнего сходства клетки невуса и меланомы имеют и общее происхождение. Меланома не всегда возникает в ходе перерождения меланоцитарного невуса, она, как и последний, может образоваться напрямую из видоизмененных меланоцитов, являющихся производными клеток нервного гребня (neural crest cell, NCC). Несмотря на столь очевидное сходство меланомы и невуса, эти два новообразования имеют и принципиальные различия. Так, невус - это повреждение, имеющее доброкачественную природу. Каждый человек несет на поверхности кожи несколько меланоцитарных невусов. При рождении невусы наблюдают лишь у 1-6 % детей [1], в то время как у оставшихся они появляются во время взросления. Если с невусами люди живут всю жизнь, не слишком замечая их присутствие, то с меланомой дело обстоит иначе. Меланома представляет собой довольно агрессивное злокачественное новообразование. Составляя всего 3-5 % всех кожных новообразований, она является причиной смерти 80 % пациентов с онкологическими заболеваниями кожи [2]. Тем не менее, течение заболевания сильно различается среди пациентов, страдающих этим недугом. Некоторые угасают за считанные месяцы, а другие живут годами. Таким образом, возникает вопрос, что именно отличает невус от меланомы и почему течение заболевания сильно различается среди пациентов. Исследование молекулярно-биологических аспектов, характеризующих клеточные процессы в невусах и меланомах, способно приблизить человечество к пониманию особенностей их течения и помочь в борьбе с онкологическими заболеваниями.

Высокая смертность больных меланомой определяется в первую очередь

высоким метастатическим потенциалом опухолевых клеток данного вида. В основе

метастазирования, с свою очередь, лежит способность к активной миграции, благодаря

которой клетки опухоли распространяются по всему организму и дают начало новым

очагам поражения. При метастазировании меланомы активируются те же генетические

программы, которые контролируют процессы эмбриогенеза. Клеточная подвижность

связана с экспрессией таких генов, как Slug, Twistl, Sipl, Snail. Все они являются

маркерами высоко подвижных клеток нервного гребня (NCC), а также задействованы в

индукции процесса под названием эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП).

ЭМП подразумевает изменение морфологии эпителиальных клеток в сторону

6

мезенхимальных, сопровождающееся деламинированием, разрушением межклеточных контактов и активацией синтеза металлопротеиназ [3]. Snail и Slug принадлежат к одному семейству транскрипционных факторов [4]. Подавление экспрессии их генов совпадает с ингибированием миграции клеток нервного гребня [5]. Twistl и Sipl также задействованы в увеличении клеточной подвижности. Ингибирование продукции Twistl приводит к снижению подвижности и метастатической активности клеток рака молочной железы [6] и гепатоцеллюлярного рака [7]. Sipl задействован в регуляции гена виментина, экспрессия которого характерна для подвижных клеток [8].

Помимо экспрессии генов маркеров ЭМП, клетки нервного гребня и меланомы роднит и высокая значимость сигнальных каскадов, активируемых белками семейства Wnt, для регуляции внутриклеточных процессов. Wnt сигнальные пути контролируют процессы, связанные с формированием и дифференцировкой клеток нервного гребня. Они же участвуют в возникновении и развитии меланомы. Wnt сигнальный каскад включает в себя довольно сложную сеть внутриклеточных взаимодействий. Его лиганды способны запускать несколько различных цепей передачи сигнала: каноническую и две неканонические. В соответствии с современными представлениями, каноническая ветвь Wnt сигнального пути задействована в основном в контроле пролиферации и дифференцировки, осуществляя действие на уровне регуляции транскрипции. Неканонические Wnt сигнальные пути, напротив, преимущественно влияют на организацию цитоскелета и клеточную подвижность. На настоящий момент предполагают, что в меланомах канонический и неканонические Wnt сигнальные каскады могут выполнять роль антагонистов, по-разному влияя на развитие меланомы. Неканонические Wnt сигнальные пути способствуют метастазированию опухолей. В то время как канонический участвует в супрессии развития меланомы путем стимулирования клеточной дифференцировки.

В связи с вышеизложенным цель настоящего исследования состояла в выявлении роли различных белков семейства Wnt в формировании опухолевого фенотипа клеточных линий меланомы человека.

Для выполнения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Определить уровень экспрессии генов маркеров эпителиально-мезенхимального

перехода: Slug, Twistl и Sipl в клеточных линиях меланомы человека.

2. Исследовать взаимосвязь между активностью канонического \VrLt сигнального пути и локализацией р-катенина в имеющемся наборе клеточных линий меланомы человека.

3. Изучить вклад канонических и неканонических лигандов в формирование фенотипа клеточной линии меланомы человека Ме1Р.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ВКЛАД WNT СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В ВОЗНИКНОВЕНИЕ И РАЗВИТИЕ МЕЛАНОМЫ

1.1 Лиганды Wnt и их внеклеточные партнеры по взаимодействию

Гены, кодирующие белки семейства Wnt, были идентифицированы в геноме как позвоночных, так и беспозвоночных. Они отсутствуют у растений, одноклеточных эукариот и прокариот [9]. У человека семейство Wnt насчитывает 19 различных представителей. Все белки Wnt представляют собой сильно модифицированные гликопротеины размером около 40 кДа, которые обладают чертами, характерными для секретируемых факторов роста [10]. Полагают, что посттрансляционные липидные модификации крайне важны для биологической активности белков семейства. Обработка ферментом, удаляющим остатки пальмитиновой кислоты, снижает гидрофильность и сигнальную активность лигандов Wnt [11].

Для передачи сигнала внутрь клетки белки семейства Wnt должны связать соответствующий рецептор или группу рецепторов на поверхности клетки. Среди многообразия трансмембранных молекул, выполняющих функцию рецепторов для Wnt лигандов, первыми были открыты рецепторы семейства Frizzled (Fz). Белки семейства Fz встречаются как среди позвоночных, так и у беспозвоночных. У человека и мыши на настоящий момент идентифицировано по меньшей мере 10 представителей семейства [12]. Белки Fz относят к обширной группе рецепторов, связанных с G-белками, GPCR, (G-protein-coupled receptors). Они осуществляют передачу сигнала внутрь клетки посредством влияния на гетеротримерные G-белки [13]. Как все типичные GPCR, Fz рецепторы содержат семь гидрофобных трансмембранных доменов, сайты гликозилирования и фосфорилирования для цАМФ-зависимой протеинкиназы (РКА), протеинкиназы С (РКС) и казеинкиназы 2 (СК2). Более того, как GPCR, так и рецепторы Fz способны формировать гомо- и гетеромерные комплексы с другими членами своих семейств. Однако, несмотря на очевидное сходство Fz рецепторов и типичных GPCR, между ними существует ряд существенных различий. Прежде всего Fz рецепторы лишены двух консервативных мотивов, характерных для GPCR. Примечательно, что один из этих мотивов отвечает за взаимодействие рецепторов с G-белками [14]. В структуре классического Fz рецептора выделяют внеклеточный iV-концевой домен, семь трансмембранных доменов и короткий цитоплазматический хвост. Для связывания Wnt лиганда ключевым является именно iV-концевой участок молекулы. Он представляет собой высоко гликозилированный цистеин-богатый домен

9

CRD (cysteine-rich domain), состоящий из 120 аминокислотных остатков [15]. С-концевой домен, содержащий консенсусную последовательно S/T-X-V задействован в связывании цитоплазматических белков [9]. Согласно классическим представлениям комбинация Wnt и его рецептора определяет тип запускаемого сигнального каскада: канонический с участием Р-катенина или один из неканонических (путь клеточной поляризации РСР или Wnt/Ca21 -сигнальный путь) [16].

Помимо Fz рецепторов, на поверхности клетки расположены и другие белки, способные акцептировать лиганды Wnt. Среди них LRP5/6, Rorl/2 и Ryk. Семейство рецепторных молекул LRP (low density lipoprotein (LDL) receptor-related protein) представляет собой белки, содержащие единственный трансмембранный домен, обеспечивающий передачу Wnt сигнала. В структуре LRP выделяют внеклеточный домен ECD (extracellular domain), обеспечивающий взаимодействие LRP с лигандами, и внутриклеточный домен ICD (intracellular domain), осуществляющий передачу внеклеточного сигнала цитоплазматическим эффекторам. Вероятно, ECD выполняет роль автоингибиторного сигнала. Отсутствие этого домена в LRP6 сопровождается конститутивной активацией Wnt сигнального пути. В отличие от ECD домена, ICD домен участвует в активации Wnt сигнального пути, поскольку его суперэкспрессия индуцирует конститутивную активацию канонического Wnt сигнального каскада [17]. Считается, что взаимодействие Wnt-LRP способствует стабилизации тройственного комплекса Fz-LRP-Wnt. Поскольку аффинность лигандов Wnt к LRP значительно ниже, чем к Fz, предполагают, что образованию тройственного комплекса Fz-LRP-Wnt предшествует связывание Wnt с рецептором Fz [18]. У позвоночных два члена семейства LRP, LRP5 и LRP6, способны связывать белки Wnt. Фенотипы нокаутных по LRP5/6 мышей имитируют эффекты от выключения экспрессии некоторых генов Wnt [19]. Например, выключение экспрессии LRP6 приводит к нарушению развития среднего и заднего отделов головного мозга (имитация блокирования Wntl), смещению конечностей в вентральную сторону (Wnt7a) и увеличению объема нервной ткани (Wnt3a) [19]. LRP5/6 считается участником канонического Wnt сигнального каскада. Его суперэкспрессия в клетках Xenopus приводит к активации р-катенинового сигнального пути [18]. А взаимодействие LRP5/6 с некоторыми внеклеточными ингибиторами, напротив, блокирует эффект от Wnt лигандов [20, 21].

Репертуар рецепторных молекул для белков Wnt не исчерпывается представителями семейств Fz и LRP. Передача сигнала от лигандов Wnt может также осуществляться с помощью альтернативных рецепторов: Rorl, Ror2 и Ryk. Rorl и Ror2 считаются корецепторами неканонического Wnt сигнального пути. Являясь структурно

10

близкими гомологами, они принадлежат к семейству рецепторных тирозиновых киназ RTK (receptor tyrosine kinase) [22]. Трансгенные мыши, дефектные по гену Ror2, демонстрируют фенотип, сходный с fFhíJa-делеционными мутантами [23]. В структуре Ror2 выделяют домены трех типов: внеклеточные Fz-подобные