Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия и характеристика новых изоформ лиганда Wnt11

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия и характеристика новых изоформ лиганда Wnt11"

На правах рукописи

Посвятенко Александра Викторовна

ЭКСПРЕССИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ИЗОФОРМ ЛИГАНДА \VNT11

Специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 лрР ?0;2

Москва 2012 год

005020381

Работа выполнена в лаборатории генной терапии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Ларин Сергей Сергеевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится <ДО» апреля 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

Автореферат разослан «ХЬ » марта 2012 г.

Официальные оппоненты:

Яровая Ольга Владимировна, доктор биологических наук, профессор, ИБГ РАН, главный научный сотрудник

Севостьянова Ирина Александровна, кандидат биологических наук, ФББ МГУ, доцент

Ученый секретарь диссертационного совета,«

кандидат фарм. наук с^Г/ ^ъ^^ТТТ^^-^-^-Грабовская Любовь Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Генетические нарушения, влияющие на активность сигнальных путей, контролирующих эмбриональное развитие, рост, дифференцировку клеток и устойчивость к апоптозу, могут приводить к возникновению и развитию опухоли (Logan С.Y., Nuss R., 2004). При этом нестабильность генома опухолевых клеток сильно затрудняет создание эффективных лекарственных препаратов, так как трансформированные клетки, в силу высокой лабильности генома быстро приобретают устойчивость к терапевтическому воздействию. Понимание молекулярных механизмов, сопровождающих злокачественную трансформацию, позволит в дальнейшем разработать инструменты, препятствующие этому процессу.

Сигнальные пути Wnt играют ключевую роль как в эмбриональном развитии, так и в поддержании гомеостаза взрослого организма (Cadigan K.M. and Nuss R., 1997). Аберрантная активация сигнальных путей, активируемых семейством белков Wnt, вызывает или усугубляет злокачественную трансформацию клеток (Polakis Р. 2000, Lustig В. and Behrens J., 2003). Эффекты от активации сигнальных путей Wnt в нормальной ткани определяют последствия их аберрантной активации в опухолевых тканях. Например, описана активация канонического сигнального пути Wnt в процессе позиционирования и дифференцировки меланоцитов (Dunn K.J. et al., 2000). При этом пациенты с диагнозом меланома имеют лучший прогноз в случае, если в клетках опухоли детектируется активация канонического сигнального пути Wnt (Chien A.J. et al., 2009). И наоборот, при колоректальном раке в 80% случаев установлена аберрантная активация канонического сигнального пути Wnt (Rubinfeld В. et al., 1997). Вероятно, в данном случае канонический сигнальный путь Wnt является одним из компонентов процесса злокачественного перерождения клеток, так как в норме его активация регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток эпителия крипт-ресничек (Ouko L. et al., 2004). Лиганд неканонического сигнального пути Wnt (путь планарной клеточной полярности) Wntll регулирует подвижность клеток в процессе формирования нервного гребня, а в эпителии кишечника Wntll экспрессируется как в эмбриональном развитии, так и во взрослом организме, регулируя пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток (Matthews H.K. et al., 2008, LickertH. et al., 2001). Роль пути планарной клеточной полярности в формировании и профессии меланомы и колоректального рака не исследована, хотя показано, что в клетках колоректального рака экспрессия лиганда Wntll выше, чем в нормальных клетках (Nishioka M. et al., 2011). И в клетках-предшественниках меланоцитов, и в эпителии кишечника путь планарной клеточной полярности, активируемый лигандом Wntll, регулирует подвижность клеток. Миграция клеток является неотъемлемой частью процессов инвазии и метастазирования. Метастазирование - наиболее опасное проявление опухолевой прогрессии, являющееся основной причиной смерти онкологических больных.

Данная работа посвящена исследованию экспрессии лиганда пути планарной клеточной полярности Wntll человека (hWntll) в опухолевых клетках. Для различных сигнальных каскадов описаны механизмы, регулирующие активность лигандов за счет

3

альтернативного сплайсинга (Park J.E. et al., 1993, Лукьянов E.B. и др., 2002). Однако в случае сигнального пути Wnt, информация о существовании изоформ лигандов Wnt ограничивается несколькими фактами (Fear M.W. et al., 2000, Struewing I.T. et al., 2006). Экспериментальные данные о существовании изоформ лиганда hWntll отсутствуют. Потенциально, разные изоформы одного белка могут обладать различной функциональной активностью и, как следствие, по-разному влиять на опухолевую прогрессию. Цели и задачи:

В связи с вышеизложенным, целью работы является изучение экспрессии лиганда hWntll в клеточных линиях опухолей различного происхождения и его роли в регуляции сигнальных путей Wnt.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) исследовать экспрессию лиганда hWntl 1 в опухолевых клеточных линиях;

2) провести поиск изоформ лиганда hWntl 1;

3) исследовать функциональные свойства изоформ лиганда hWntl 1. Научная новизна работы.

Активация пути планарной клеточной полярности регулирует подвижность клеток -свойство, необходимое для прогрессии опухоли. Несмотря на это, экспрессия лиганда hWntll, активирующего путь планарной клеточной полярности, не была ранее исследована в меланомах. В данной работе впервые методом ОТ-ПЦР анализа исследована экспрессия лиганда hWntll в клеточных линиях меланомы человека. Показано, что экспрессия hWntll характерна для большинства исследованных клеточных линий меланомы человека (75%). Установлено, что в результате ОТ-ПЦР детектируется несколько различающихся по размеру ПЦР-фрагментов, нуклеотидная последовательность которых соответствует кДНК hWntl 1.

В настоящей работе впервые экспериментально установлено, что экспрессию белка hWntll в клетках линий меланомы человека, в клетках линий колоректального рака и в ряде нормальных тканей человека сопровождает альтернативный сплайсинг. Использованные в исследовании праймеры позволили детектировать четыре не описанных ранее сплайс-варианта hWntll. Трансляция обнаруженных сплайс-вариантов потенциально приводит к образованию четырех разных белковых продуктов, отличных от полноразмерного лиганда. Полученные результаты отличаются от опубликованных ранее теоретических данных о существовании двух сплайс-вариантов hWntll, кодирующих идентичные белковые продукты (Katoh М. & Katoh М., 2009).

В работе исследованы свойства и функциональная активность белковых продуктов двух изоформ мРНК hWntll. Продемонстрировано, что белковые продукты исследуемых сплайс-вариантов способны связываться с гепарином, но hWntl lsp3 не секретируется, тогда как продукт трансляции hWntl lspl сохраняет способность секретироваться. Также белок, кодируемый сплайс-вариантом hWntl lspl, обладает способностью взаимодействовать с секретируемым ингибитором сигнального пути Wnt - молекулой WIF-1. В качестве критерия функциональной активности была проанализирована способность лиганда ингибировать канонический сигнальный путь Wnt. Установлено, что

образующиеся в результате альтернативного сплайсинга белки hWntl lspl и hWntl lsp3 не обладают той же функциональной активностью, что и полноразмерный лиганд. Теоретическое и практическое значение работы.

В работе впервые установлено, что при экспрессии лиганда hWntl 1 происходит альтернативный сплайсинг, который приводит к образованию изоформ мРНК, кодирующих белки с разными свойствами. Продукты трансляции выявленных изоформ лишены функциональной активности лиганда hWntl 1, однако в разной степени сохраняют свойства, характерные для полноразмерного белка. Тот факт, что новые изоформы мРНК представляют собой кодирующие последовательности, а транслируемые с них белки обладают различными свойствами, дает основание предполагать, что изоформы лиганда hWntl 1 имеют индивидуальные функции. Дальнейшее изучение функций белков, образующихся в результате альтернативного сплайсинга hWntl 1, является перспективным направлением исследований.

Обнаруженный в данной работе феномен альтернативного сплайсинга, сопровождающего экспрессию лиганда hWntl 1, не только важен для понимания механизмов канцерогенеза, но и может иметь значение для разработки противоопухолевых препаратов в будущем.

Личное участие автора в проведении исследований:

Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований, проведены обработка и анализ полученных экспериментальных данных, подготовлен иллюстративный материал, сформулированы основные положения диссертации, составляющие её новизну и практическую значимость, а также подготовлены материалы публикаций в научных журналах. Неоценимую помощь при обсуждении и интерпретации полученных результатов оказал с.н.с., к.б.н. Кибардин A.B. (ИБГ РАН, Москва), имена остальных соавторов указаны в соответствующих публикациях. Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на 10 всероссийских и международных школах и конференциях в том числе Moleda Summer School "Non-viral gene transfer into muscle and skin" (Франция, 2007), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009), ЕМВО Molecular Medicine Workshop "Invasive Growth: a Genetic Programme for Stem Cell and Cancer" (Турин, Италия, 2009), International symposium "Control of gene expression and cancer" (Москва, Россия, 2010) и других. Публикации

По результатам диссертационной работы опубликованы 17 печатных работ, из них три -статьи в рецензируемых российских журналах. Структура и объем диссертации

Диссертация включает разделы: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы. Материал диссертации изложен на листах машинописного текста, содержит 24 рисунка и одно приложение. Библиографический список включает^/ раб ~ ,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспрессия лиганда й \Vntll наблюдается в различных клеточных линиях меланомы человека

Анализ экспрессии гена ИУУп¡11 проводили методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Из клеточных линий меланомы человека была выделена РНК, которую использовали в качестве матрицы для синтеза первых цепей кДНК. Полученные кДНК послужили матрицей для полимеразной цепной реакции. ОТ-ПЦР анализ проводили с использованием двух пар праймеров (Рисунок 1). Пара праймеров АР+СЛ была сконструирована таким образом, чтобы участки гена, которым они комплементарны, располагались в разных экзонах. Ожидаемый размер продукта ПЦР при использовании этих праймеров и кДНК в качестве матрицы

составляет около 260 п.н. Праймер ВР сконструирован таким образом, что праймеры ВР и СЯ фланкируют последовательности, которые располагаются в разных, причем не соседних экзонах. Ожидаемый размер продукта ПЦР при использовании праймеров ВБ+СК и кДНК Ь\¥пП 1 в качестве матрицы составляет 739 п.н.

Рисунок 1. Схема структуры гена ИХУпи 1 с указанием экзонов (ех1-ех5) и расположением праймеров, использованных для ОТ-ПЦР анализа и гнездовой ПЦР.

В результате ОТ-ПЦР анализа экспрессии И'УУпШ было обнаружено, что при использовании пары праймеров АР+СЛ, соответствующих З'-области кДНК ЬХУпШ, детектируется ПЦР-продукт, размер которого соответствует расчетной величине - 263 п.н. Соответствие амплифицированного фрагмента последовательности кДНК Ь\¥п111 было подтверждено секвенированием ампликона, полученного в результате ПЦР. Данные, представленные на рисунке 2 (А), позволяют сделать вывод об экспрессии лиганда в девяти из двенадцати исследованных клеточных линий меланомы человека. В трех линиях ПЦР-продукт не наблюдается. В одном случае амплифицируемый фрагмент детектируется в виде слабо выраженной полосы. Таким образом, показано, что в исследованных клеточных линиях меланомы экспрессия лиганда Ь\¥пИ 1 является частым событием.

В результате ОТ-ПЦР с использованием праймеров ВР+СЯ наблюдается набор ПЦР-фрагментов различного размера. Размер наибольшего ампликона (отмечен верхней стрелкой на рисунке 2 (Б)) соответствует расчетной величине фрагмента, который должен

6

амплифицироваться с последовательности, кодирующей hWntl 1 (739 п.н.). Из девяти линий меланомы человека, в которых экспрессия hWntl 1 детектируется при помощи пары праймеров AF+CR, в восьми клеточных линиях она подтверждается в результате ОТ-ПЦР с праймерами BF+CR. Исключением является клеточная линия Mel ME, в которой экспрессия лиганда hWntl 1 методом ОТ-ПЦР с парой праймеров BF+CR не регистрируется.

** ^ # ^ # ^ # # # J* J'm-

250п.н." w w w w - - А

750n.ii." —► ' Штё Б

500n.ii." -V

450п.н." w W |иим# ^ Ъшшшф Sommé ЩщщшФ Ътт* ЩтшР В

Рисунок 2. Результат ОТ-ПЦР анализа с применением двух пар праймеров: AF+CR (панель А) и BF+CR (панель Б) в клеточных линиях меланомы человека. Стрелками отмечены области на электрофореграмме, в которых располагаются ампликоны различных размеров. Для контроля количества анализируемого материала использовали праймеры к гену глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (панель В); для отрицательного контроля -реакцию без добавления обратной транскриптазы (RT-).

Ампликоны меньшей величины, чем расчетная (739 п.н.) наблюдаются в продуктах ПЦР с кДНК из 6 исследованных линий. В пяти клеточных линиях меланомы человека (Mel R, Mel 226, Mel Ibr, Mel Si и Mel 82) детектируется как большой (739 п.н.) ампликон, так и ампликоны размера 575 и 463 п.н. В клеточной линии Mel Ksen наблюдается только ПЦР-продукт, соответствующий размеру 575 п.н. Чтобы подтвердить соответствие последовательности наблюдаемых ПЦР-продуктов кДНК hWntl 1, фрагменты каждого размера секвенировали.

В клеточных линиях меланомы человека были детектированы транскрипты hWntl 1 разного размера. Чтобы установить, характерно ли данное явление только для клеток меланомы, или в опухолевых клетках другого происхождения также образуются разные транскрипты hWntl 1, были исследованы клетки линий колоректального рака Т84 и НТ29.

Экспрессия лиганда h Wntll в клетках линий колоректалъно рака

Экспрессия лиганда hWntl 1 в клетках линий колоректального рака Т84 и НТ29 была исследована методом ОТ-ПЦР с использованием двух пар праймеров: AF+CR к З'-области

и ЭР+ЭЯ к 5'- и центральной области кДНК ИХУпИ1 (Рисунок 1). Результаты ОТ-ПЦР с применением пар праймеров АР+СЯ и ПРЯЖ приведены на рисунке 3.

НТ29 Т84 НТ29 Т84

250п.н:-- А

700п.н! ■ ■ 500п.ш" 400п.н; ■ ■ * щтт Б

450п.н!" ШШйгЩт В

НТ-

Рисунок 3. Результат ОТ-ПЦР анализа с применением пар праймеров: АР+СЯ (панель А) и ОР+ЭЯ (панель Б) в клетках линий карциномы кишечника НТ29 и Т84. Стрелкой на электрофоремграмме отмечен ампликон, выбранный для исследования. Для контроля количества анализируемого материала использовали праймеры к гену глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (панель В); для отрицательного контроля - реакцию без добавления обратной транскриптазы (ЯТ-).

Результаты ОТ-ПЦР анализа с парой праймеров АР+СЯ дают основания полагать, что в обеих клеточных линиях экспрессируется лиганд Ь\>/п1:11, так как на электрофореграмме можно наблюдать полосу, соответствующую ожидаемому размеру ПЦР-продукта - 263 п.н. (Рисунок ЗА). В то же время, при использовании пары праймеров БР+ОЯ зарегистрирован набор ПЦР-фрагментов различного размера, как и при исследовании клеточных линий меланом человека (Рисунок ЗБ). Среди продуктов ПЦР с ^ЦНК клеток линий НТ29 и Т84 присутствуют ампликоны размером 517, 405 и 342 п.н. При этом в клетках линий карциномы кишечника НТ29 не наблюдается ампликон, соответствующий по размеру расчетной полноразмерной последовательности. Соответствие нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов кДНК подтверждено

секвенированием. В результате ОТ-ПЦР анализа установлено, что в клетках колоректального рака, как и в клетках меланомы, детектируются ампликоны разного размера. Вероятно, присутствие ампликонов разного размера свидетельствует об образовании разных транскриптов Ь\¥пП 1.

Чтобы установить, является ли образование ампликонов разного размера при ОТ-ПЦР анализе экспрессии И'Л'пШ опухоль-специфичным явлением или встречается и в норме, была исследована экспрессия лиганда Ь\УпП 1 в образцах нормальной ткани.

Экспрессия лиганда hWn.il 1 в клетках нормальных тканей человека

Исследование экспрессии лиганда 1 в клетках нормальных тканей человека

было проведено методом ОТ-ПЦР анализа с использованием праймеров АР+СЯ и ВР+СИ. (Рисунок 1). Была исследована тотальная РНК, выделенная из легких, плаценты, прямой кишки, жировой ткани, лимфоцитов, эмбриональных стволовых клеток. Результаты представлены на рисунке 4.

Рисунок 4. Результат ОТ-ПЦР анализа экспрессии лиганда Ь^/пП1 с применением двух пар праймеров: АР+СЯ (панель А) и ВР+СЛ (панель Б) в клетках нормальных тканей человека. Цифры обозначают источник РНК: 1,2-эмбриональный стволовые клетки, 3-лимфоциты, 4-плацента, 5-жировая ткань, 6-легкие, 7-прямая кишка. Стрелками отмечены четыре ПЦР-продукта разного размера, амплифицируемые в легких. Отрицательный контроль - реакция без добавления обратной транскриптазы (ЯТ-).

В результате ОТ-ПЦР анализа экспрессии лиганда ЬУ/пШ в образцах нормальных тканей человека установлено, что использование пары АР+СЛ приводит к амплификации ПЦР-продукта, размер которого соответствует расчетной величине 263 п.н. (Рисунок 4А). Это дает основание утверждать, что во всех исследованных тканях происходит экспрессия лиганда ИХУпи 1. Однако в результате ОТ-ПЦР с использованием пары праймеров ВР+СЯ амплифицируется набор фрагментов разного размера. В эмбриональных стволовых клетках, лимфоцитах, клетках плаценты и прямой кишки детектируется два ампликона размером 739 и 575 п.н. В клетках жировой ткани наблюдается ампликон размера 575 п.н., и отсутствует ПЦР-продукт, соответствующий расчетной величине (739 п.н.). Наибольший интерес представляет результат ОТ-ПЦР анализа РНК из клеток человеческого легкого. При использовании пары праймеров ВР+СЯ происходит амплификация четырех фрагментов различной величины: 739, 575, 463 и 400 п.н. Самый большой ПЦР-продукт по своему размеру соответствует расчетной величине полноразмерного лиганда (739 п.н.). Соответствие амплифицированных фрагментов последовательности кДНК Ь\УпШ было подтверждено секвенированием выделенных из геля и очищенных ПЦР-продуктов.

Исследование экспрессии лиганда hWntll в клетках нормальных тканей человека, проведенное методом ОТ-ПЦР, показало, что образование транскриптов hWntl 1 разного размера не является опухоль-специфичным явлением. Во всех исследованных образцах детектируются ПЦР-продукты, имеющие размер меньше расчетного. Более того, в жировой ткани не наблюдается ампликон ожидаемого размера (739 п.н.). В большинстве исследованных образцов нормальной ткани человека (пять из семи) присутствуют два ампликона разной величины. В клетках ткани человеческого легкого детектированы четыре ПЦР-продукта разного размера.

Экспрессия лиганда h Wntll сопровождается альтернативным сплайсингом

In silico анализ последовательности амплифицированных фрагментов позволил сделать заключение об их структуре. Последовательность всех исследуемых ампликонов соответствует кДНК hWntl 1 (GenBank № ВС113386.1). Однако только те ПЦР-фрагменты, размер которых соответствует расчетному (739 п.н. для праймеров BF+CR и 681 п.н. для праймеров DF+DR), имеют последовательность идентичную кДНК hWntl 1. Изоформы мРНК, которые детектируются в результате ОТ-ПЦР в виде ПЦР-продуктов другого размера, характеризуются различными делециями и/или сдвигом рамки считывания. На основании результатов in silico анализа был сделан вывод об альтернативном сплайсинге, происходящем при экспрессии лиганда hWntl 1.

Вопреки предположениям о возможной опухоль-специфичной природе разнообразия транскриптов hWntl 1, наибольшее количество вариантов детектируется в ткани человеческого легкого - четыре амплифицированных фрагмента (Рисунок 4Б). Наибольший ампликон соответствует по размеру расчетной величине, и его нуклеотидная последовательность идентична кДНК hWntl 1 (GenBank № ВС113386.1).

Нуклеотидная последовательность фрагмента, который при ОТ-ПЦР анализе с использованием праймеров BF+CR детектируется в виде ПЦР-продукта величиной 463 п.н., также соответствует кДНК hWntl 1. Однако, по сравнению с полноразмерной кДНК, имеется делеция размером 276 п.н., которая идентична части последовательности третьего и четвертого экзонов гена hWntl 1 (Рисунок 5A). In silico анализ показывает, что делеция не приводит к сдвигу рамки считывания. Нуклеотидная последовательность данного фрагмента депонирована в NCBI GenBank (№ JF800675) в качестве сплайс-варианта hWntl lsp3. Размер предполагаемого альтернативного белкового продукта соответствует 262 аминокислотным остаткам и имеет расчетную молекулярную массу в 29.5 кДа (Рисунок 5Б).

В результате ОТ-ПЦР анализа экспрессии hWntl 1 с использованием праймеров BF и CR детектируется ампликон размером 575 п.н. (Рисунки 2 и 4). Однако, применение других праймеров (DF+DR, NF+NR) и in silico анализ последовательности амплифицированных фрагментов вьивили, что существуют два варианта мРНК, которые при использовании праймеров BF+CR детектируются как один ампликон. Обнаруженные изоформы мРНК hWntl 1 были названы hWntllspl и hWntl lsp2.

100 п.н.

1062

ВБ Ш- ['Ж • 681 Хр СЖ

: ( 739'

263 '

100 а.о. I-

ех1 ех2 ехЗ ех4 ех5

354

МЛУ 39179.33 Да

| ех![ ех2

27

ьшпгпвр!

Йн

Вр

^

ех 1 ех2 АехЗйех4

154

575

МШ 16576.24 Да

263

"§Р 281 ,! ХР бй

575'

263 :

11\¥пШ8р2

ех1

28 45*

405

384 ИАУпШзрЗ

рР ВР бё. 405 3: Хр а

463'

263

ех 1 ех2ЛехЗАех4

262

М\У 29533.10 Да

387

|ех11 ех2 Ае;р~

рр Нр

:___342

60

ех 1 ех2 АехЗАех4

оа

400

15Щ

263

149

М\¥ 16461.1 Да

Рисунок 5. А - схема структуры кодирующей области изоформ мРНК ЬШпИ 1 с указанием экзонов (ех1-ех5) и расположением праймеров, использованных для ОТ-ПЦР анализа. Серым закрашены области, соответствующие сдвигу рамки считывания. Б - схема белковых продуктов сплайс-вариантов с указанием экзонов (ех1-ех5). Заштрихованная область соответствует фрагменту, который использовали для иммунизации.

Благодаря т ¡Шсо анализу последовательности сплайс-варианта Ь\Уп1Шр2 установлено, что в ходе альтернативного сплайсинга мРНК лишается последовательности, кодирующей функциональный участок белка. Это обусловлено сдвигом рамки считывания. Идентичным исходной последовательности остается только участок, соответствующий первому экзону, далее возникает стоп-кодон. Даже если предположить, что, благодаря сдвигу рамки считывания, формируется кодирующая последовательность, её свойства будут кардинально отличаться от свойств лиганда Ь\УпШ, и их непосредственное сравнение нецелесообразно. Подробное изучение сплайс-варианта Ь\УпШзр2 и его возможных белковых продуктов представляет собой объект самостоятельного исследования, которое было вынесено за рамки данной работы.

Согласно результатам анализа т ¡Шсо, сплайс-вариант ЬА¥пШ5р1 представляет собой неизмененные первый и второй экзоны, третий экзон, лишенный участка размером 162 нуклеотидов, и фрагмент четвертого экзона. Участок четвертого экзона составляют всего лишь 27 п.н., причем в результате альтернативного сплайсинга происходит сдвиг рамки считывания (Рисунок 5А). Результаты т ¿Шсо анализа дают основания предполагать, что белковый продукт этого сплайс-варианта отличается от полноразмерного ЬАУпШ не только делецией, но и последовательностью из девяти аминокислот. Нуклеотидная последовательность данной изоформы депонирована в МСВ1 вепВапк (№ .1(3716612). Предполагаемый белковый продукт альтернативного сплайсинга образован 154 аминокислотными остатками и имеет предполагаемую молекулярную массу в 16.5 кДа (Рисунок 5Б).

Сплайс-вариант 1^пШ5р4 образован в результате частичной делеции третьего и четвертого экзонов, а также сдвига рамки считывания, обуславливающего последовательность последних 20 аминокислот. Нуклеотидная последовательность, соответствующая Ь\УпШ5р4, депонирована в N001 вепВапк (№Л3716613). Продукт трансляции ЬигпШзр4 образован 149 аминокислотными остатками, из которых первые 129 идентичны последовательности Ь\УпШ8р1 (всего 154 а.о.).

Таким образом, в данной работе впервые экспериментально установлено существование четырех сплайс-вариантов, образующихся при экспрессии лиганда И^УпИ 1. В результате трансляции обнаруженных изоформ мРНК Ь\УпИ 1 предполагается образование четырех белковых продуктов, которые отличаются от полноразмерного лиганда.

Получение антител к белку А УУпШ, создание экспрессионных конструкций

Для изучения функций и паттерна экспрессии исследуемого лиганда было необходимо получить антитела, специфически распознающие 11\¥пШ. Нуклеотидную последовательность, кодирующую участок лиганда, выбранный для иммунизации «Ьу» (01п231-Рго320), клонировали в плазмиды рОЕХ-4Т-1 и рРЕ-ЗО для экспрессии в бактериальной экспрессионной системе. Наработанные химерные белки использовали для получения антител: белок, слитый с вБТ, - для иммунизации кроликов, а белок, несущий 6 гистидиновых остатков, - для аффинной очистки антител из сыворотки (Рисунок 6).

А Б

+-20кДа

15кДа

бШэ-Ьу

~Т Т 3 м,лг 1 2 3 МХ¥

Рисунок 6. Электрофорез в ДСН-ПААГ продуктов экспрессии иммуногенного фрагмента лиганда Ь\УпП1 в бактериальной экспрессионной системе. Порядок нанесения: 1 - лизат неиндуцированных бактерий; 2 - лизат бактерий, индуцированных ИПТГ; 3 - очищенный белок. Бактерии трансформированы плазмидами рОЕХ4Т1-Ьу (А) и рОЕЗО-Ьу (Б).

Для исследования свойств изоформ лиганда Ь\¥пН1 были созданы экспрессионные конструкции на основе плазмиды рсОЫА5/РЯТ/ТО, кодирующие сплайс-вариант ИШиШврЗ, полноразмерный лиганд и фрагмент Ь\¥пШ, не содержащий С-концевой участок после Суз283 (Ь\¥п111ДС). Вариант лиганда семейства \Vrit, лишенный С-концевого участка, способен связываться со специфическими рецепторами, но не имеет функциональной активности и считается доминантно-негативной формой лигандов семейства Шщ. Исследование свойств Ь\УпШзр1 осложнено тем, что аминокислотная последовательность белкового продукта этого сплайс-варианта не содержит участка, детектируемого полученными антителами (Рисунок 5Б). Поэтому для исследования свойств этой изоформы создали экспрессионную конструкцию на базе рЭЕО.

Проверку функциональности полученных экспрессионных генетических конструкций на базе рсОНА5/РКТ/ТО проводили по следующей схеме: клетки линии СНО были транзиторно трансфицированы, наличие рекомбинантых белков подтверждали методом Вестерн-блот анализа, результаты которого представлены на рисунке 7.

Рисунок 7. Вестерн-блот анализ функциональности экспрессионных

конструкций, созданных на базе рсВКА5/РЯТ/ТО, и последовательностей, кодирующих Ь\¥пШ(1), Ь^УШШрЗ (2) и Ь\УпШДС (3). Лизат нетрансфицированных клеток СНО использован в качестве отрицательного контроля (4). Использованы полученные в работе антител к белку Ь\¥пП 1.

В клеточных лизатах транзиторно трасфицированных клеток линии СНО зарегистрированы иммунореактивные полосы с молекулярными массами, соответствующими расчетным. На основании данных Вестерн-блот анализа сделан вывод,

пуд - я**.-*- ш - . .. 4

■¿■Г А

-37кДа -----вЗТ-Ьу

ч-25кДа

■

— —

-*-50кДа

«1

• • ч-37кДа

12 3 4 MW

что в результате трансфекции в клетках экспрессируются hWntll, hWntllsp3 и hWntl 1ДС и все эти формы hWntl 1 распознаются полученными антителами.

Белковый продукт альтернативного сплайсинга hWntllsp3 не секретируется

Лиганды семейства Wnt являются секретируемыми белками, аутокринно действующими на клетки, которые их экспрессируют, и паракринно - на соседние клетки. Белки Wnt связываются с внеклеточным матриксом, в частности с гепаран-сульфатом и гепарином. Это их свойство используется для детекции малых концентраций различных форм Wnt (Bradley R.S., Brown A.M., 1990). Метод инкубации с гепарин-сефарозой позволяет выявить присутствие исследуемого лиганда hWnt в кондиционной среде или лизате. При исследовании новых изоформ лиганда, свойства которых неизвестны, инкубация с гепарин-сефарозой позволяет ответить на вопрос, связываются ли исследуемые белки с гепарином. В случае положительного результата, инкубация с гепарин-сефарозой позволяет обнаружить присутствие исследуемых белков в кондиционной среде или лизате.

Исследование способности белкового продукта сплайс-варианта hWntl lsp3 секретироваться проводили, определяя его присутствие в кондиционной среде транзиторно трансфицированных клеток линии СНО. Связывание белков с гепарин-сефарозой выявляли методом Вестерн-блот анализа (Рисунок 8).

Рисунок 8. Вестерн-блот анализ связывания исследуемых форм белка Ь\УпШ с гепарин-сефарозой, которая проинкубирована или со средой, кондиционированной трансфицированными клетками (верхняя панель), или с лизатами клеток линии СНО, трансфицированных 1ЛУпШ-, ЬШпПЬрЗ- и 1^пН 1ДС-кодирующими конструкциями (нижняя панель).

В качестве отрицательного контроля использованы нетрансфицированные клетки линии СНО

Оказалось, что полноразмерный и доминантно-негативный (11\УпП 1ДС) варианты связываются с гепарин-сефарозой, инкубированной с кондиционной средой, и достоверно выявляются в результате Вестерн-блот анализа, в отличие от новой изоформы лиганда Ь\¥пШзрЗ, чье присутствие в культуральной среде не было обнаружено. В то же время при инкубации гепарин-сефарозы с лизатами трансфицированных клеток было

обнаружено присутствие всех трех изучаемых белков во внутриклеточном компартменте. Этот факт свидетельствует о том, что все формы белка экспрессировапись в результате трансфекции и что белковый продукт альтернативного сплайсинга ЬШпШзрЗ, также как доминантно-негативная и полноразмерная формы ЬШпШ, способен связываться с гепарином.

Отсутствие ИШпШэрЗ в кондиционной среде указывает на нарушение секреции белкового продукта соответствующего сплайс-варианта, что отличает его от полноразмерного лиганда и позволяет предположить их функциональную разницу.

В клетках линии НТ29 антителами против ИУУп!!I выявлен набор иммунореактивных полос различной молекулярной массы

В результате ОТ-ПЦР анализа РНК из клеток линии НТ29, установлено, что в этих клетках происходит альтернативный сплайсинг «неканонического» лиганда 1.

Подобная посттранскрипционная модификация может приводить к образованию нефункциональных мРНК. Образование нетранслируемых изоформ мРНК может быть одним из методов подавления экспрессии белка. Чтобы установить, сопровождается ли альтернативный сплайсинг лиганда ЬШпШ экспрессией белковых продуктов сплайс-вариантов в нативных условиях, был проведен Вестерн-блот анализ кондиционной среды и лизатов клеток линии НТ29 (Рисунок 9). Кондиционную среду и клеточные лизаты инкубировали с гепарин-сефарозой, а затем связавшиеся белки детектировали с помощью полученных в данной работе антител к лиганду ИХУпН 1. В кондиционной среде обнаружена единственная иммунореактивная полоса с молекулярной массой, соответствующей полноразмерному Ь\*/пШ. При этом в клеточных лизатах наряду с полосой, соответствующей полноразмерному лиганду, обнаружен ряд иммунореактивных полос с меньшими, чем у полноразмерного Ь\Ущ11, молекулярными массами.

50кДа-»-

37кДа-+-

1 2

Рисунок 9. Экспрессия лиганда ЬШпШ клетками линии карциномы кишечника НТ29. Вестерн-блот анализ связывания изоформ лиганда И\УпШ с гепарин-сефарозой, проинкубированой с кондиционной средой (1) или лизатом клеток линии НТ29 (2).

В результате Вестерн-блот анализа установлено, что в клетках линии карциномы кишечника НТ29 экспрессируется не только полноразмерный лиганд Ь\УпП1, но и белковые продукты меньшей молекулярной массы, которые могут быть результатом альтернативного сплайсинга, происходящего в этих клетках. Эти данные согласуются с присутствием в клетках линии НТ29 1-транскриптов разного размера, выявленных

методом ОТ-ПЦР.

Белковый продукт альтернативного сплайсинга ИМмИхр! сохраняет способность секретироваться

Инкубация с гепарин-сефарозой также была использована для исследования свойств белкового продукта Ь\УпШ8р1. Клетки СНО транзиторно трансфицировали конструкциями, кодирующими полноразмерный лиганд Ь'Л'пШ и изоформу 1Бр1

слитые с эпитопом БЕО. Кондиционная среда и лизаты трансфицированных клеток были инкубированы с гепарин-сефарозой. Связывание белков с гепарин-сефарозой выявляли методом Вестерн-блот анализа (Рисунок 10).

Рисунок 10. Вестерн-блот анализ присутствия изоформ ЬХУпШ-ЕЖО и Ь\Уп111зр1-ОЕО в кондиционной среде. Среда, кондиционированная нативными клетками СНО (1) или клетками СНО, экспрессирующими рекомбинантный белок 11\УпШ-ОЕО (2) либо ИХУпШзрЬОЕО (3), была инкубирована с гепарин-сефарозой. Связывание белков с гепарин-сефарозой детектировано с использованием антител к эпитопу БЕО.

В результате анализа способности Ь\Упи1зр1 связываться с гепарин-сефарозой и присутствия в кондиционной среде установлено следующее. Как и полноразмерный лиганд 11\¥п1:11 изоформа Ь\¥пШзр1 связывается с гепарин-сефарозой, что свидетельствует о потенциальной способности взаимодействовать с гепарином внеклеточного матрикса. Исследуемая изоформа Ь\¥пН 1 эр 1, также как и полноразмерный лиганд Ь\¥пИ 1, присутствует в кондиционной среде.

В результате данного эксперимента выявлено, что изоформа 11\¥пШ8р1 не только сохраняет способность взаимодействовать с гепарином, но и секретируется. На следующем этапе исследования был проведен эксперимент, иллюстрирующий способность Ь\¥п1:11 Бр 1 взаимодействовать с белком \VIF-1, секретируемым ингибитором сигнальных путей \¥п!

Белковый продукт сплайс-варианта // Wntl¡spl связывается с регуляторным белком \VIF-1

Для исследования способности изоформ Ь\¥пи 1 взаимодействовать с белком \VIF-1 лизат клеток СНО, трансфицированных экпрессионными конструкциями, инкубировали с сефарозой, несущей антитела к ОЕО-эпитопу. На втором этапе сефарозу с ковалентно пришитыми антителами и связавшимися с ними белками инкубировали с белком \VIF-1. Присутствие в пробах изоформ И\¥пШ и белка-партнера \VIF-1 детектировали методом Вестерн-блот анализа, используя антитела против ЭЕВ-эпитопа или белка \VIF-1, соответственно (Рисунок 11). Чтобы исключить возможность неспецифического

1 2 3

50кДа->- В*

25кДа-►

связывания \VIF-1 с сефарозой, использовали инкубацию с лизатом нетрансфицированных клеток СНО на первом этапе.

I

Рисунок 11. Вестерн-блот анализ связывания регуляторного белка \VIF-1 с изоформами Ь\¥пИ 1. Детекция анти-БЕО антителами (верхняя панель). Детекция анти-\У1Р антителами (нижняя панель). Снизу указано, подвергалась ли сефароза инкубации с раствором, содержащим \VIF-1 (+ и соответственно)

В результате эксперимента установлено, что белок \VIF-1 достоверно выявляется в пробах, содержащих лизаты клеток, трансфицированных экспрессионными конструкциями. В контрольной пробе, содержащей лизат нативных клеток СНО, детектируются следовые количества \VIF-1. Эти данные свидетельствуют о том, что полноразмерный белок ЬХУпИ 1 и его изоформа 1 эр 1 способны взаимодействовать с

регуляторным белком \VIF-1.

Исследование свойств обнаруженных сплайс-вариантов показало, что белковый продукт Ь\УпШзр1, также как и полноразмерный лиганд, секретируется клетками и способен взаимодействовать с веществом межклеточного матрикса - гепарином, а также с регуляторным белком \VIF-1.

Исследование функциональной активности изоформлиганда \tWntll

В результате активации неканонического сигнального пути Шщ может происходить подавление канонического сигнального пути \¥п1. Поэтому в качестве критерия функциональной активности 1 и новых изоформ лиганда была выбрана способность

ингибировать канонический сигнальный путь \Vrit.

контроль 11\УШ 11 -РЕР И\¥т 11 ар 1 -РЕР

37кДа. \У№

Экспрессия лиганда h Wntll ингибирует активацию канонического сигнального пути Wnt

С целью установить влияние экспрессии белка hWntl 1 на активацию канонического сигнального пути Wnt был использован двойной люциферазный тест. Для эксперимента была выбрана клеточная линия меланомы человека, характеризующаяся отсутствием экспрессии hWntl 1, - Mel G (Рисунок 2). Клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей фермент люциферазу светлячка (Photinus pyralis) «ф» под TCF-зависимым промотором, и плазмидой, кодирующей люциферазу морских кишечнополостных (Renilla reniformis) «р». Активация канонического сигнального пути Wnt приводит к экспрессии генов, находящихся под контролем TCF-зависимого промотора. Ген люциферазы «ф» находится под контролем TCF-зависимого промотора, поэтому экспрессия люциферазы «ф» происходит в ответ на активацию канонического сигнального пути Wnt. Экспрессия люциферазы «р» происходит независимо от активации сигнальных путей Wnt и используется для контроля уровня трансфекции и базальной экспрессии. Активация канонического сигнального пути Wnt происходит в результате трансфекции клеток конструкцией, кодирующей лиганд hWnt3a, и детектируется, благодаря увеличению уровня относительной биолюминесценции. Воздействие на канонический сигнальный путь Wnt производили путем котрансфекции плазмидой, кодирующей лиганд hWntl 1. Данный эксперимент показал, что в результате экспрессии рекомбинантного hWntl 1 не происходит активация канонического сигнального пути Wnt (рисунок 12).

Рисунок 12. Результат двойного люциферазного теста: активация канонического сигнального пути происходит вследствие экспрессии рекомбинантного лиганда Т^МЗа и сопровождается увеличением уровня относительной люциферазной активности. Котрансфекция конструкцией, кодирующей 1^пИ1, приводит к подавлению канонического сигнального пути (*отмечены достоверно отличающиеся значения; р < 0,05 и^О

В результате двойного люциферазного теста установлено, что трансфекция конструкцией, кодирующей лиганд Р^МЗа, приводит к повышению уровня относительной биолюминесценции. Котрансфекция плазмидами, кодирующими Ь^йЗа и приводит к понижению уровня относительной биолюминесценции. Таким образом, есть основания утверждать, что экспрессия рекомбинантного 1 ингибирует активацию

канонического сигнального пути, происходящую в результате экспрессии лиганда 1^п13а.

Полученный результат согласуется с литературными данными о способности «неканонического» лиганда hWntl 1 ингибировать канонический сигнальный путь Wnt.

Экспрессия эндогенного hWntll подавляет активацию канонического сигнального пути Wnt

С целью изучения эффекта, оказываемого ингибированием экспрессии эндогенного «неканонического» лиганда hWntl 1 на активацию канонического сигнального пути Wnt, был использован метод, основанный на явлении РНК-интерференции. Чтобы блокировать естественную экспрессию hWntl 1 в клетках линии меланомы человека, использовали трансфекцию конструкцией, кодирующей первичный транскрипт микроРНК, комплементарной мРНК лиганда hWntl 1. Расчет кодирующей нуклеотидной последовательности производили с помощью программного обеспечения, доступного на сайте компании Invitrogen. Были разработаны три варианта последовательности, кодирующей пре-микроРНК к разным областям мРНК hWntl 1. Плазмида, далее условно обозначаемая «102», содержит последовательность, кодирующую пре-микроРНК комплементарную 5'-области мРНК hWntl 1, плазмиды «939» и «958» содержат последовательности, кодирующие пре-микроРНК, комплементарные 3'-области мРНК лиганда hWntl 1 (Рисунок 13). Плазмиды, содержащие данные последовательности были созданы с помощью набора Block It (Invitrogen).

)00п.н.

.-J-ex 1 1 ех2 ехЗ ех4 —kx5--k мРНК

102 939 958 микроРНК

Рисунок 13. Схема расположения участков мРНК 11\Уп111, к которым образуются микроРНК в результате трансфекции клеток плазмидами «102», «939» и «958».

Клетки линии СНО трансфицировали смесью из трех плазмид. Чтобы проверить функциональную активность созданных конструкций, клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей 1^пП1, и одной из конструкций, кодирующих первичные транскрипты микроРНК. Также трансфекционная смесь включала плазмиду, содержащую ген зеленого флуоресцентного белка (вРР), по присутствию которого в клеточном лизате можно установить эффективность трансфекции и специфичность воздействия микроРНК. Для контроля количества анализируемого материала использовали окрашивание антителами к а-тубулину. В качестве отрицательного контроля были использованы лизаты нетрансфицированных клеток линии СНО. В них не детектируется лиганд ЬМпШ и отсутствует СРР. Чтобы удостовериться, что появление в клетке микроРНК не влияет на экспрессию лиганда были использованы плазмиды «N£0» и «176»,

обеспечивающие образование неспецифических микроРНК. Эффективность трансфекции

полученными плазмидами и её влияние на уровень экспрессии генаИ\¥пШ тестировали с помощью Вестерн-блот анализа (Рисунок 14).

pcDNA5/FRT/TOhWntl 1 pFRT/TO GFP

hWntll

GFP а-тубулин

без трансф.

микроРНК контрольные

микроРНК hWntl 1

176

NEG

1ИШ| • 'ШЩЯШ

102

939

958

маем

Рисунок 14. Вестерн-блот анализ экспрессии hWntl 1 в клетках, трансфицированных конструкциями, кодирующими пре-микроРНК к мРНК hWntl 1 (102, 939, 958) и неспецифические пре-микроРНК (176 и NEG), и в контрольных клетках. Были использованы антитела против hWntl 1, GFP (контроль эффективности трансфекции) и а-тубулина (контроль количества нанесенного материала).

Результат Вестерн-блот анализа клеток, трансфицированных контрольными плазмидами «NEG» и «176», дает основания утверждать, что трансфекция проходит успешно, но подавления экспрессии лиганда hWntl 1 не происходит. В случае с трансфекцией плазмидами «102», «939» и «958» образуются микроРНК, комплементарные мРНК лиганда hWntl 1. На основании результатов Вестерн-блот анализа лизатов клеток, трансфицированных этими плазмидами, можно сделать вывод, что происходит подавление экспрессии лиганда hWntl 1. Тот факт, что в результате Вестерн-блот анализа детектируется зеленый флуоресцентный белок, в том числе и в тех клетках, которые были трансфицированы плазмидами «102», «939» и «958», свидетельствует о том, что образующиеся микроРНК специфичны и ингибируют только продукцию целевого белка -hWntl 1(Рисунок 14).

Для выявления влияния эндогенного лиганда hWntl 1 на канонический сигнальный путь использовали двойной люциферазный тест. В качестве контроля эффекта котрансфекции конструкциями, кодирующими пре-микроРНК, была использована котрансфекция плазмидой «176», кодирующей первичный транскрипт микроРНК, неспецифичной к мРНК hWntl 1. Тест проводили трансфицируя клетки линии меланомы человека, в которой методом ОТ-ПЦР ранее детектировали экспрессию лиганда hWntl 1, Mel IL (Рисунок 2).

В результате трансфекции последовательностью, кодирующей hWnt3a, увеличение уровня относительной люциферазной активности не происходит. В случае котрансфекции плазмидами, кодирующими первичный транскрипт микроРНК специфичной к

«неканоническому» лиганду детектируется более высокий уровень относительной биолюминесценции (следствие люциферазной активности). В результате котрансфекции контрольной плазмидой «176» рост относительной биолюминесценции не является статистически достоверным. Рост уровня относительной биолюминесценции происходит в результате активации канонического сигнального пути, обусловленной транскрипцией ТСР-зависимого гена люциферазы «ф». Отсутствие увеличения уровня относительной люциферазной активности в результате трансфекции последовательностью, кодирующей ЬШйЗа, и увеличение уровня относительной люциферазной активности в результате котрансфекции с плазмидами «102» и «939» свидетельствуюют об активации канонического сигнального пути в случае подавления экспрессии ЬХУщ! 1(Рисунок 15).

к 2

е«ч

ш к о ига-5x5 О о ь о га о

х а

® „ _

о 0,5 ■

2 с

(1\/Уп13а микроРНК

+ + + + 176 102 939

Рисунок 15. Подавление экспрессии эндогенного лиганда ЬМпП 1 приводит к активации канонического сигнального пути \Viit. Результат двойного люциферазного теста: активация канонического сигнального пути происходит в результате экспрессии рекомбинантного лиганда Ь\Уп$а и сопровождается увеличением уровня относительной биолюминесценции; котрансфекция последовательностями, кодирующими пре-микроРНК к Ь\УпП1 (939 и 102) и контрольную пре-микроРНК (176) (*отмечены достоверно отличающиеся значения; р < 0,05 ШеБ^

Тот факт, что ингибирование экспрессии эндогенного лиганда Ь\¥пП 1 приводит к активации канонического сигнального пути \Vrit, означает что, в случае экспрессии ЬШпП 1 этот лиганд подавляет активацию канонического сигнального пути

Исследование функциональной активности сплайс-вариантов лиганда /; \Vntl I

Способность белковых продуктов альтернативного сплайсинга ЬХУпШ подавлять активацию канонического сигнального пути оценивали с помощью двойного

люциферазного теста. Клетки линии меланомы человека Mel Р трансфицировали репортерной и контрольной плазмидами «ф» и «р», соответственно. Активацию канонического сигнального пути Wnt осуществляли путем трансфекции экспрессионной конструкцией, кодирующей лиганд hWnt3a, и детектировали уровень относительной люциферазной активности (биолюминесценции). Влияние экспрессии изоформ лиганда h Wnt 11 на активацию канонического сигнального пути Wnt выявляли путем котрансфекции экспрессионными конструкциями, кодирующими hWntll, hWntllspl и hWntl lsp3. Для контроля влияния котрансфекции на уровень относительной биолюминесценции производили котрансфекцию пустым вектором (Рисунок 16).

Л н о о

X

К о

ГО 5

М*

щ к О н го ■

s 1 Е

° " о

0 го о

1 Q. 1- ф О •&

£

2 с

3,5-

2,5-

1,5

0,5

| hWnt3a -

s

О) #

%плазмида —

Рисунок 16. Результат двойного люциферазного теста: активация канонического сигнального пути происходит в результате экспрессии рекомбинантного лиганда Ь\Уп13а и сопровождается увеличением уровня относительной люциферазной активности. Котрансфекция конструкцией, кодирующей Ь\УпШ, приводит к подавлению канонического сигнального пути, котрансфекция конструкциями, кодирующими сплайс-варианты не оказывает влияния на активацию канонического сигнального пути как и контрольная котрансфекция пустым вектором (^отменены достоверно отличающиеся значения; р < 0,05 и^евО

В результате трансфекции конструкцией, кодирующей 1^гйЗа, происходит увеличение уровня относительной биолюминесценции. Это свидетельствует о том, что в результате экспрессии лиганда ЬШйЗа происходит активация канонического сигнального пути. При котрансфекции плазмидой, кодирующей уровень относительной

люциферазной активности в пять раз меньше, чем при экспрессии рекомбинантного лиганда 1^пОа без котрансфекции. Это означает, что полноразмерный лиганд

ингибирует активацию канонического сигнального пути \Vrit. В результате котрансфекции конструкциями, кодирующими Ьи'пШвр! и hWntllspЗ, не происходит уменьшения уровня относительной биолюминесценции. Это свидетельствует о том, что в результате экспрессии белковых продуктов сплайс-вариантов не происходит ингибирование канонического сигнального пути \Vnt- Контрольная котрансфекция пустым вектором показывает, что увеличение количества и разнообразия экзогенной ДНК не влияет на уровень относительной люциферазной активности.

Результаты двойного люциферазного теста показали, что ингибировать активацию канонического сигнального пути способен только полноразмерный лиганд Ь\УпШ. Экспрессия в клетках модельной системы сплайс-вариантов ЬШп111эр1 и Ь\УпШзрЗ не подавляет активацию канонического сигнального пути.

Выводы

1. Экспрессия лиганда Ь\УпН 1 детектируется в 75% исследованных клеточных линий меланомы человека.

2. Впервые показано, что в опухолевых клетках и нормальных тканях существует механизм альтернативного сплайсинга лиганда ИХУпН 1.

3. Изоформа ЬрЗ лиганда ИХУпН 1, в отличие от полноразмерного белка, не является секретируемым белком.

4. Изоформа ЬШпИ 1 Бр1 лиганда Ь\УпН 1 сохраняет способность секретироваться, а также взаимодействовать с секретируемым ингибитором сигнального пути \Уп1 белком WIF-l.

5. Обнаруженные изоформы лиганда ЬХУпН 1, в отличие от полноразмерного белка, не способны ингибировать активацию канонического сигнального пути.

Статьи:

1.Посвятенко А.В.. Кибардин А.В., Кошелев А.Ю., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Новая модельная система на основе генетически модифицированной клеточной линии карциномы кишечника мыши С26, позволяющая проведение быстрой in vivo оценки биологических эффектов экспрессии отдельных генов. Молекулярная медицина, 2008, № 5: 34-37

2. Куликова К.В., Посвятенко А.В.. Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Кибардин А.В., Ларин С.С. Внутриядерная локализация р-катенина не может считаться достаточным условием для активности канонического сигнального пути Wnt в клеточных линиях меланомы человека. Молекулярная биология, 2011,45(5): 884-891.

3. Посвятенко А.В.. Куликова К.В., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Кибардин А.В., Ларин С.С. Функциональные свойства новой изоформы лиганда Wntll, экспрессирующейся в клетках линии карциномы кишечника человека НТ29. Молекулярная биология, 2012,46(1): 129-138.

Тезисы конференций:

1.Aleksandra V. Posvyatenko, Alexey V. Kibardin, Georgii P. Georgiev and Sergei S. Larin. Timeframe limitations for inducible in vivo gene expression in mouse colon carcinoma model system. Moleda Summer School "Non-viral gene transfer into muscle and skin". France, Evry-Maison Alfort -Paris, September, 16th-22th,2007.

2. Посвятенко A.B., Кибардин А. В., Гнучев H.B., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Механизмы регуляции взаимодействия сигнальных путей Wnt клеточных линиях меланомы. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». Казань, Россия, 23-27 июня 2009 сборник тезисов, школа молодых ученых, тезисы стендовых докладов, секция 4 «Биологическая активность. Механизм действия», с. 349.

3.A.V. Posvyatenko, A.V. Kibardin, K.V. Kulikova, N.V. Gnuchev, G.P. Georgiev, and Sergei S. Larin. Mechanisms of Wntll signaling pathway regulation in human melanoma cell lines. EMBO Molecular Medicine Workshop "Invasive Growth: a Genetic Programme for Stem Cell and Cancer". Torino, Italy, September 10th-12th, 2009. Abstract book p. 52.

4.Aleksandra V. Posvyatenko, Alexey V. Kibardin, Ksenia V. Kulikova, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergei S. Larin. Wntll splice-variant expression in HT29 colon carcinoma cell line. International symposium. "Control of gene expression and cancer". Russia, Moscow, June 21th-25th, 2010. Proceedings, section "Cancer", p. 75.

5.Kseniya V. Kulikova, Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Noncanonical Wnt cascades interplay in melanoma aggressive phenotype formation. The FEBS/EARC Advanced Lecture Course. Greece, Spetses, August 16th—25th, 2009.

6. Куликова K.B., Кибардин A.B., Посвятенко A.B., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С.. Влияние активации неканонических Wnt сигнальных путей на формирование агрессивного опухолевого фенотипа линий меланомы человека. Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии». Россия, Звенигород, 12-16 октября 2009, сборник тезисов с. 52.

7. Kseniya V. Kulikova, Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Wnt signaling and melanoma aggressive phenotype formation. Curie School Cell Shape Changes: Cell Motility and Morphogenesis. Paris, France 19-23 October, 2009.

8. Kseniya V. Kulikova, Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Expression pattern of EMT associated markers in different human melanoma cell lines. International symposium. "Control of gene expression and cancer". Russia, Moscow, June 21th-25th, 2010. Proceedings, section "Cancer", p. 76

9. Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Kseniya V. Kulikova, Sergei Nabirochkin, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Effect of Wntll ligand alternative splicing on Wnt signaling regulation. International symposium. "Control of gene expression and cancer". Russia, Moscow, June 21th-25th, 2010. Proceedings, p. 44.

10. Куликова K.B., Посвятенко A.B., Гнучев H.B., Георгиев Г.П., Кибардин А.В., Ларин С.С. Анализ взаимосвязи внутриклеточной локализации бета-катенина и активности канонического сигнального пути Wnt в клеточных линиях меланомы человека. XXIII Международная зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Москва, 7-10 февраля 2011 г, сборник тезисов с. 10

11. Ksenia V. Kulikova, Alexey V. Kibardin, Aleksandra V. Posvyatenko, Nikolay V. Gnuchev, Georgii P. Georgiev and Sergey S. Larin. Motility related gene expression pattern and its correlation with noncanonical Wnt ligand expression in human melanoma cell lines. FEBS advanced lecture course trends in genetics: genomic instability and pathways response. Yerevan, Armenia, 20-26 February, 2011, p. 82

12. Посвятенко A.B., Куликова K.B., Кибардин A.B., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Экспрессия сплайс-вариантов Wntl 1 в клетках линии колоректального рака (НТ29). VII симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 1-4 июня, 2011 г. Онкогематология №2 (2011), Стр. 49

13. Куликова К.В., Кибардин А.В., Посвятенко А.В., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Выявление роли лигандов WNT в формировании агрессивного опухолевого фенотипа линий меланомы человека. VII симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 1-4 июня, 2011 г. Онкогематология №2 (2011), Стр. 44-45

14. Кибардин А.В., Посвятенко А.В., Куликова К.В., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Ларин С.С. Изоформы лиганда Wntl 1 и их функциональные свойства. VII симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 1-4 июня, 2011 г. Онкогематология №2 (2011), Стр. 40

Заказ № 95-П/03/2012 Подписано в печать 20.03.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 \ С*^у \vw\v. с/г. ги; е-таИ: ¡п/о@с/г. ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Посвятенко, Александра Викторовна, Москва

61 12-3/827

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

На правах рукописи

Посвятенко Александра Викторовна

Экспрессия и характеристика новых изоформ лиганда

\Vntll.

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук (03.01.03 - молекулярная биология)

Научный руководитель: к.б.н. С.С. Ларин

Москва 2012

Список использованных сокращений..........................................................................................4

1. Общая характеристика работы....................................................................................................6

1.1 Введение...................................................................................................................................6

2. Обзор литературы.........................................................................................................................8

Современные представления о механизмах регуляции сигнальных путей Wnt и их

роль в канцерогенезе........................................................................................................................8

2.1 Белки Wnt.................................................................................................................................8

2.2 Сигнальный путь Wnt.............................................................................................................9

Канонический ß-катенин-зависимый сигнальный путь..........................................................9

Неканонический, кальций-зависимый сигнальный путь Wnt................................................11

Неканонический сигнальный путь Wnt. Путь планарной клеточной полярности............12

2.3 Многообразие сигнальных путей Wnt и факторы, определяющие тип активируемого сигнального каскада....................................................................................................................18

Классификация лигандов Wnt и рецепторов Fzd...................................................................18

Роль корецептора LRP5/6 в определении типа активируемого сигнального пути...........19

Контроль активации сигнальных путей Wnt с участием регуляторных молекул............20

Активация сигнальных путей Wnt может происходить с участием

альтернативных рецепторов..................................................................................................22

Альтернативные рецепторы или корецепторы?..................................................................23

Механизмы активации сигнального пути Wnt с участием белков, не принадлежащих к семейству Wnt........................................................................................................................24

2.4 Роль сигнальных путей Wnt в канцерогенезе.....................................................................26

Канонический сигнальный путь и его роль в канцерогенезе................................................26

Роль неканонических сигнальных путей Wnt в формировании и прогрессии опухолей.....30

3. Материалы и методы исследований.........................................................................................35

Ферменты и реактивы.................................................................................................................35

Выделение РНК, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией........................35

Гель-электрофорез ДНК.............................................................................................................36

Секвенирование...........................................................................................................................36

Молекулярное клонирование.....................................................................................................36

Создание экспрессионных конструкций, кодирующих микроРНК.......................................37

Трансформация клеток Е. coli....................................................................................................37

Культивирование клеточных линий, трансфекция..................................................................38

Получение антител к белку hWntl 1...........................................................................................38

Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот анализ.............39

Двойной люциферазный тест.....................................................................................................40

Аффинная хроматография..........................................................................................................40

Аффинная хроматография с сефарозой, несущей антитела к DED-эпитопу........................41

Статистическая обработка результатов.....................................................................................42

Программное обеспечение..........................................................................................................42

4. Результаты и обсуждение..........................................................................................................43

4.1 Исследование экспрессии лиганда hWntll в различных опухолевых и нормальных клетках..........................................................................................................................................46

Экспрессия лиганда hWntll наблюдается в различных клеточных линиях меланомы

человека.....................................................................................................................................46

Экспрессия лиганда hWntll в клетках линий колоректалъно рака.....................................49

Экспрессия лиганда hWntll в клетках нормальных тканей человека................................52

4.2 Экспрессия лиганда hWntl 1 сопровождается альтернативным сплайсингом................54

4.3 Исследование свойств белковых продуктов сплайс-вариантов hWntl lspl и hWntl lsp3.....................................................................................................................................57

Создание экспрессионных конструкций и получение специфических антител против

hWntll........................................................................................................................................57

Белковый продукт альтернативного сплайсинга hWntl lsp3 связывается с

гепарин-сефарозой, но не секретируется..............................................................................59

В клетках линии НТ29 антителами против hWntll выявлен набор

иммунореактивных полос различной молекулярной массы..................................................61

Белковый продукт альтернативного сплайсинга hWntl lspl связывается с

гепарин-сефарозой и сохраняет способность секретироваться.......................................62

Белковый продукт сплайс-варианта hWntl lspl связывается с регуляторным белком WIF.............................................................................................................................................64

4.4 Исследование функциональной активности изоформ лиганда hWntl 1...........................68

Экспрессия лиганда hWntll ингибирует активацию канонического сигнального

пути Wnt....................................................................................................................................68

Экспрессия эндогенного hWntll может влиять на активацию канонического

сигнального пути Wnt...............................................................................................................70

Исследование функциональной активности сплайс-вариантов лиганда h Wnt 11..............74

5. Заключение..................................................................................................................................78

6. Выводы........................................................................................................................................81

Список литературы.........................................................................................................................83

Благодарности...............................................................................................................................102

Список использованных сокращений

АРС Adenomatous Polyposis Coli (аденоматозный полипоз толстой кишки)

ЬТгСР beta-Transducin repeat Containing Protein (белок, содержащий ß-

трансдуциновый повтор) САМКИ Ca2+/Calmodulin-dependent protein Kinase II (Са2+/кальмодулин-зависимая киназа II)

CKI Casein Kinase 1 (казеин киназа 1)

CRD Cysteine-Rich Domain (домен богатый цистеиновыми аминокислотными

остатками)

Cthrcl Collagen triple helix repeat containing 1 (белок, содержащий коллаген

подобный повтор)

Daaml Dishevelled associated activator of morphogenesis 1 (активатор морфогенеза,

ассоциированный с Dishevelled) Dkk Dickkopf

Dsh Dishevelled

EGF Epidermal Growth Factor (эпидермальный фактор роста)

Fmi Flamingo

Fzd Frizzled

GAPDH Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase

(глицеральдегидЗ-фосфатдегидрогеназа) GSK-3ß Glycogen Synthase Kinase-3 (киназа-3 гликогенсинтазы)

JNK c-Jun N-terminal Kinase (c-Jun N-терминальная киназа)

LRP Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein (белок родственный

рецепторам липопротеинов низкой плотности) ММР Matrix Metalloproteinase (матриксная металлопротеиназа)

РСР Planar Cell Polarity (планарная клеточная полярность)

Pk Prikle

РКС Protein Kinase С (протеинкиназа С)

PVDF Polyvinylidene diFluoride (поливинилиденфторид)

ROCK Rho-associated protein Kinase (Rho-ассоциированная протеинкиназа)

Ror Receptor tyrosine-kinase like Orphan Receptor (рецептор семейства

тирозинкиназ, подобный рецепторам - сиротам) Ryk Related to Receptor tyrosine (Y) kinase (родственный тирозинкиназным

рецепторам)

SFRP Secreted frizzled-related protein (секретируемые белки родственные Frizzled)

Stbm Strabismus

TAE Tris-Acetate-EDTA (трис-ацетатный буфер с ЭДТА)

TBS Tris-Buffered Saline (трис-HCl солевой буфер)

TCF/LEF T-Cell Factor/Lymphoid Enhancer Factor (Т-клеточный/лимфоидный

транскрипционный фактор)

Vangl Van-Gogh like protein

wg Wingless

WIF-1 Wnt Inhibitory Factor (Wnt ингибирующий фактор)

XGAP Xenopus GTPase-Activating Protein (белок активирующий ГТФазу у Xenopus)

ХР АРС Xenopus Paraxial Protocadherin (параксиальный протокадгерин у Xenopus)

zw3 zeste-white3 kinase

а.о. аминокислотные остатки

ГТФаза гуанозинтрифосфатаза

Да (кДа) дальтон (килодальтон)

ДСН-ПААГ полиакриламидный гель, содержащий додецилсульфат натрия

ИПТГ изопропил-Р-Э-тиогалактозид

мРНК матричная РНК

ОТ-ПЦР Обратная Транскрипция с последующей Полимеразной Цепной Реакцией

п.н. пар нуклеотидов

1. Общая характеристика работы

1.1 Введение

Среди характерных свойств злокачественных новообразований особого внимания заслуживают инвазивный рост и метастазирование. Именно благодаря этим качествам опухоль поражает не только исходный орган или ткань, но проникает в соседние ткани и распространяется в организме пациента. В основе инвазивного роста лежат взаимосвязанные изменения в организации цитоскелета, нарушается взаимодействие клеток между собой и с межклеточным матриксом. Метастазирование - образование вторичных очагов опухолевого роста - наиболее опасное проявление опухолевой прогрессии, являющееся основной причиной смерти онкологических больных. Чтобы дать метастаз клетка должна приобрести ряд свойств: умение проникать в глубину окружающих нормальных тканей, в том числе в кровеносные или лимфатические сосуды; способность выживать после попадания в сосуды, а затем выходить из них и размножаться в несвойственном для данного типа клеток микроокружении, давая новый очаг опухолевого роста [1].

Инвазивный рост и метастазирование объединяет способность клеток к движению. Это свойство также как и некоторые другие черты опухолевой клетки (высокий пролиферативный потенциал, отсутствие клеточной дифференцировки) характерно для клеток эмбриональных тканей. Сигнальные пути, регулирующие эмбриональное развитие, часто активированы в опухолевых клетках, например, Notch, BMP и Wnt [113]. Роль лигандов Wnt в формировании меланоцитов в образовании, а затем в прогрессии меланомы активно исследуется и может иллюстрировать общность процессов эмбрионального развития и злокачественного перерождения. Сочетание лигандов Wnt контролирует образование нервной трубки и нервного гребня [210]. Также активацией различных компонентов сигнального каскада Wnt сопровождается процесс созревания, позиционирования и дифференцировки клеток нервного гребня, будущих меланоцитов [57]. В то же время установлено, что нарушения в регуляции сигнальных каскадов, запускаемых лигандами семейства Wnt, играют ключевую роль в злокачественном перерождении меланоцитов - образовании меланомы [106, 158].

Меланобласты пролиферируют и мигрируют, тогда как меланомные клетки

пролиферируют и метастазируют. Растет число свидетельств того, что эти процессы,

контролируются одними и теми же сигнальными путями [194]. В эмбриональном

развитии движение клеток нервного гребня, предшественников меланоцитов,

регулируется лигандом Wnt 11 [50, 120]. Однако роль этого лиганда в процессе

метастазирования меланом остается не изученной. Усиление экспрессии Wntll

6

детектировано в клетках различных опухолей, в том числе колоректального рака [98, 137]. В норме этот лиганд задействован в регуляции пролиферации, трансформации и миграции клеток эпителия кишечника [143]. Естественно предположить, что \Vntll играет непосредственную роль в процессах формирования и, особенно, прогрессии колоректального рака. Для различных сигнальных каскадов описаны механизмы, регулирующие активность лигандов за счет альтернативного сплайсинга [4, 146]. Однако, в случае сигнального пути \Viit, информация о существовании изоформ лигандов \Уп1 ограничивается несколькими фактами [61, 169]. Экспериментальные данные о существовании изоформ лиганда Ь\¥пШ отсутствуют, хотя они потенциально могут иметь другое функциональное значение и играть роль, в том числе, и при развитии опухолевых заболеваний.

В связи с вышеизложенным, цель настоящей работы состояла в изучении экспрессии лиганда ЬЛУпЙ 1 в клеточных линиях опухолей различного происхождения и его роль в регуляции сигнальных путей \¥п1:. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. исследовать экспрессию лиганда 1г\\/п1;11 в опухолевых клеточных линиях;

2. провести поиск изоформ лиганда ИАУп! 11;

3. исследовать функциональные свойства изоформ лиганда 1Л^п1;11;

2. Обзор литературы.

Современные представления о механизмах регуляции сигнальных путей Wnt и их роль в канцерогенезе.

2.1 Белки Wnt

В восьмидесятых годах прошлого века было положено начало исследованиям, которые ведутся по сей день и становятся все более и более актуальными. Речь идет об изучении сигнального пути Wnt. В 1982 году в журнале Cell была опубликована статья, в которой сообщалось о гене int-1, активируемом в результате интеграции вируса (инсерционной мутации), происходящей при заражении вирусом опухоли молочной железы мышей (Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV) [140]. В 1987 году было показано, что белок int-1 является гомологом белка wingless плодовой мушки Drosophila melanogaster, относящегося к классу белков, регулирующих полярность каждого сегмента тела насекомого [155, 192]. Объединение названий этих белков образовало имя Wnt. Сейчас семейство белков Wnt активно изучается, с точки зрения строения генов, кодирующих белки, структуры и свойств самих белков и, главное, эффектов, вызываемых ими [126].

Уже первые исследования белка int-1 дали основания полагать, что этот белок является секретируемым. Данное предположение было сделано на основании анализа аминокислотной последовательности (наличие лидерного пептида) и посттрансляционных модификаций (гликозилирование). В дальнейшем было подтверждено, что int-1 секретируется, но остается связанным с поверхностью клетки, не являясь при этом трансмембранным белком. Было высказано предположение, что его функции сродни ростовым факторам, причем с паракринным или аутокринным типом сигнала [144, 145]. Сейчас известно о существовании белков семейства Wnt у различных многоклеточных животных. Число типов белков семейства разнится от пяти (С. elegans) до девятнадцати (Я. sapiens). Для всех членов семейства характерна определенная консервативность в структуре генов (обычно четыре экзона), аминокислотной последовательности (около 370 аминокислот, лидерный пептид, консервативно расположенные цистеины) в строении и свойствах белка (гликозилирование, гидрофобность, презентация на поверхности клетки) [126].

Рассмотрение белков wg и int-1 как членов одного семейства предполагает, что информация об одном из них хотя бы отчасти справедлива и для другого. Исходно int-1 был обнаружен в опухолевых клетках, позднее было показано, что экспрессия int-1 (Wntl) характерна для эмбриональных тканей, в частности, для формирующейся нервной

системы [138, 204]. Свою естественную функцию белок int-1 выполняет в развивающихся тканях, а во взрослом организме только инсерционная мутация переводит int-1 из молчащего гена в состояние низкоэкспрессируемого [62]. С другой стороны, ген wg был открыт при нарушениях нормального развития крыльев у мух, вызванных рецессивной мутацией [163]. Исследования wg дали основания полагать, что действие белка Wingless обеспечивает взаимодействие клеток между собой, и показали, что он является внеклеточным фактором дифференциации, в частности, регулирующим полярность сегментов тела (т.е. относящимся к классу генов segment-polarity) [54, 131].

2.2 Сигнальный путь Wnt

В 1984 году было показано, что мутации в гене arm нарушали нормальное развитие сегментов мух и приводили к фенотипу аналогичному тому, который вызван мутацией wg [203]. Эти наблюдения навели исследователей на мысль, что белки, кодируемые этими генами (Armadillo и Wingless соответственно), принадлежат к одному сигнальному пути. Генетические и биохимические подтверждения этой гипотезы были опубликованы в 1994 году [99, 166]. В частности, было показано, что уровень Armadillo в клетке изменяется в ответ на воздействие Wingless и что регуляция уровня внутриклеточного Armadillo осуществляется с участием киназы zw3 [149]. Так в середине 90-х годов был впервые описан сигнальный путь, который сейчас называется каноническим сигнальным путем Wnt.

На данный момент известно три основных сигнальных пути, активируемых белками семейства Wnt. Это так называемый канонический/р-катенин-зависимый путь и два неканонических сигнальных пути - кальций-зависимый и путь планарной клеточной полярности.

Канонический (3-катенин-зависимый сигнальный путь

Р-катенин-зависимый сигнальный путь был впервые описан в 1994 году. В отсутствие активации белками Wnt Р-катенин (гомологичный белку Armadillo у D. melanogaster) накапливается в межклеточных контактах (adherens junctions), а уровень внутриклеточного Р-катенина остается низким. Свободный Р-катенин в таких клетках связывается с деградационным комплексом, в состав которого входят опухолевые супрессоры АРС и Axin [45]. Связь с последними позволяет киназам GSK3P (гомолог киназы zw3 у D. melanogaster) и CKI последовательно фосфорилировать соответствующие сайты на N-конце Р-катенина (Рисунок 1). Убиквитин-лигаза, содержащая F-box белок Slimb/bTrCP, распознает правильно фосфорилированный р-катенин и определяет его дальнейшую судьбу - полиубиквитинилирование и пр�