Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция ядерных рецепторов PPARα,-β,-γ при стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция ядерных рецепторов PPARα,-β,-γ при стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии"

На правах рукописи

Чистяков Дмитрий Викторович

РЕГУЛЯЦИЯ ЯДЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ РРАИа, -р, -у ПРИ СТИМУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В УСЛОВИЯХ ГИПЕРГЛИКЕМИИ.

03.01.03 - молекулярная биология Автореферат

диссертации на соискание ученой степени 8 АПР 2015

кандидата биологических наук

Москва-2015

005566902

Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук и отделе биокинетики НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор,

академик Скрябип Константин Георгиевич

Официальные оппоненты:

Безуглов Владимир Виленович, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова» Российской академии наук, заведующий лабораторией оксилипинов.

Павлова Галина Валерьевна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биологии гена» Российской академии наук, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза.

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»

Защита диссертации состоится 2015 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 501.001.76 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте www.bio.msu.ru.

Автореферат разослан

2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

В последнее десятилетие значительно повысился интерес к исследованиям системы врожденного иммунитета, поскольку стало понятно, что нарушения механизмов неспецифической защиты организма имеют отношение не только к клеткам иммунной системы, но и ко всем другим клеткам организма. Активация врожденного иммунитета сопровождается развитием воспалительных процессов и, как следствие, участвует в патогенезе системных заболеваний с воспалительной компонентой. К таким заболеваниям относят диабет 2 типа, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания и другие. Более того, у пациентов с гипергликемией и гиперлипидемией наблюдаются нарушения в протекании воспалительных процессов, что указывает на взаимосвязь метаболизма, потребления энергии и системы врожденного иммунитета.

Ядерные рецепторы РРАЯ (дословный перевод «рецепторы активации пролиферации пероксисом») относят к факторам транскрипции, которые регулируют пересечение воспалительных процессов и энергетического метаболизма. Существует три изоформы этих рецепторов а, р, у, которые имеют структурное сходство, ряд общих агонистов, но кодируются разными генами. Синтетические специфические агонисты РРАЯхх. и РРАЯу используют для лечения гипергликемии и гиперлипидемии, а также исследуются как потенциальные противовоспалительные препараты. Агонисты РРАЯР считаются перспективными для лечения ожирения и нарушений механизмов восстановления и регенерации тканей. Терапевтическая привлекательность использования агонистов привела к значительному количеству исследований РРАЯ на молекулярном уровне. Однако, основное внимание уделено характеристике действия агонистов и активируемых ими рецепторов на различные клеточные ответы, в то время как регуляция самих рецепторов РРАЯ изучена относительно мало. В то же время, понимание молекулярных механизмов регуляции этих рецепторов

3

может дать ключ к управлению процессами на пересечении метаболических, энергетических и воспалительных каскадов реакций.

Традиционно изучают отдельные изоформы РРАЯ на разных клеточных объектах. Однако в исследованиях последних лет было показано, что при разворачивании клеточных ответов на различные стимулы изоформы РРЛЯ вступают на регуляторном уровне во взаимодействие между собой. Поэтому в данной работе выбраны для исследования типы клеток, на которых экспрессированы все три изоформы (линии клеток человека НеЬа, глиомы крысы С6, первичные астроциты крысы).

Изучение воспалительных процессов в центральной нервной системе, которая защищена от проникновения «чужеродных» стимулов представляет особый интерес. Исследования последних десятилетий показывают, что на клеточном уровне воспалительные процессы характерны для различных заболевания мозга, в том числе рассеянный склероз, вторичные травмы, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Важную роль при этом играют глиальные клетки мозга - астроциты и микроглия. Если микроглию по своим основным функциям можно отнести к клеткам иммунной системы, то основная роль астроцитов заключается в энергетическом, метаболическом и сигнальном сопровождении функций нейронов. Понимание молекулярного механизма регуляции РРАИ. на астроцитах при активации врожденного иммунитета является актуальной задачей современных исследований в нейробиологии.

Активация системы врожденного иммунитета происходит через рецепторы различных классов, наиболее изученным из которых являются Толл-подобные рецепторы (ТЬЯ), расположенные на плазматической и внутриклеточных мембранах большинства клеток. В данной работе фокус исследований на взаимосвязи ТЫ1, локализованных на плазматических мембранах (типы ТЫ12, ТЫ14, ТЬК5) и трех изоформ РРЛК - РРАКа, РРАЯр, РРАЛу. Целью работы являлось установление механизмов регуляции ядерных рецепторов трех изоформ при стимуляции указанных ТЬЯ.

4

Исследования молекулярных процессов проводили на клеточных моделях. Условия гипергликемии создавали адаптацией клеток к повышенному содержанию глюкозы, т.е на клеточном уровне. Такой подход позволил построить общую схему регуляции РРАЯ с учетом регуляции на посттранскрипционном уровне и оценить возможность направленного управления процессом с использованием ингибиторов

митогенактивированных протеинкиназ (МАРК).

Цели и задачи исследования

В настоящей работе была поставлена цель изучить процессы регуляции РРАЯа, РРАИр и РРАЯу при активации Толл-подобпых рецепторов в условиях гипергликемии и исследовать возможность модулировать активность этих изоформ для изменения характера и направления клеточного ответа в условиях гипергликемии. Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

- Охарактеризовать взаимосвязь активации ТЬЯ и РРАЯ в условиях гипергликемии на линии клеток человека НеЬа и оценить возможность использования этой линии для изучения ТЬЯ/РРАК сигнального пути.

- Исследовать влияние гипергликемии на экспрессию и ДНК-связывающую активность РРАИа, РРАЯР и РРАЯу на первичных астроцитах крысы.

- Сравнить влияние различных лигандов Толл-подобных рецепторов ("Ш11/2, ТЬЯ4, ТЫ15) на экспрессию РРАКа, РРАЯр и РРАЯу.

- Оценить возможность регуляции на уровне деградации мРНК ядерных рецепторов РРАИ..

- Исследовать возможность модулирования при активации 'ГЛР экспрессии и активности РРА11 с помощью селективного ингибирования элементов сигнального пути врожденного иммунитета (ингибиторы МАРК, фактора транскрипции ЫР-кВ, белкового синтеза).

Научная новизна работы

В работе впервые проведен сравнительный анализ влияния агонистов ТЛР2, ТЫ14 и ТЛР5 на активацию трех изоформ РРАЯ. Полученные данные показывают, что агонисты разных типов ТЪК проявляют схожие между собой этапы регуляции экспрессии РРАЯа, -р, -у в астроцитах. Сравнение кинетики экспрессии рецепторов РРАИа, -р, -у и СОХ-2 при стимуляции Т1Л14 показало, что в экспрессии РРАЯр и СОХ-2 есть схожие элементы. Оба гена имеют фазу индукции и разрешения воспалительного ответа. Кинетика экспрессии РРАЯа и РРАЯу проходит через минимум, затем восстанавливается до исходного уровня. Впервые была показано, что экспрессия и активность трех изоформ РРАЙ. при активации системы врожденного иммунитета регулируются через различные механизмы. Детально охарактеризовано участие различных ветвей сигнального каскада МАРК (р38, ЕШС1/2, ХЫК) в этой регуляции, а также зависимость процессов регуляции от времени. Изучение влияние ингибирования белкового синтеза показало наличие эффекта «супериндукции» генов для всех Зх изоформ РРАИ.. Изучение этого эффекта в клетках без/с активацией системы врожденного иммунитета позволило предположить, что в системе регуляции экспрессии РРАЯ существует неизвестный лабильный белок - супрессор экспрессии всех трех изоформ РРАЯ, при этом действие этого белка различно в необработанных и ЬР8-стимулированных клетках. Показано изменение времени полужизни мРНК РРАЯа, -Р, -у при стимуляции ТЬЯ4, и участие р38 МАРК в регуляции этого процесса.

Практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют детализировать механизмы регуляции транскрипционных факторов РРАК. при активации системы врожденного иммунитета. Поскольку известно, что данные факторы являются ключевыми компонентами в развитии целого ряда нейродегенеративных заболеваний и заболеваний с нарушением метаболических процессов (Альцгеймер,

Паркинсон, диабет, ожирение и т.д:), то результаты; работы могут бьдь применены для разработки эффективной целевой терапии этих заболеваний.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Ломоносов» (Москва 2008, 2011), Всероссийской научной школе для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород 2009), международной конференции «Molecular Medicine Conference 2012» (2012, Бангкок, Таиланд), международной конференции «3rd European lipidomics meeting» (2013, Пардубицы, Чешская республика), международной конференции «Nuclear receptors: Linking molecules, genomes & physiology» (2013, Италия, Неаполь), международной конференции «Nuclear receptors. From Molecular Mechanism to Health and Decease» (2011, Барселона, Испания).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых международных и отечественных журналах, входящих в перечень ВАК РФ и 10 материалов отечественных и международных конференций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 5 глав и списка цитируемой литературы из 220

наименований. Работы изложена на_страницах машинописного текста и включает

33 рисунка и 2 таблицы.

Список сокращений

PPAR - рецепторы активаторов пролиферации пероксисом, СОХ- циклооксигеназа, GAPDH - глииеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа, PGE2 . простагландин К2; TNFa -фактор некроза опухоли альфа, TLR- Толл-подобные рецепторы, PON -пептидогликан, FGL - флагеллин I.PS - липополисахарид, МАРК - митоген-акгивирусмыс нротеинкиназы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные культуры: линия клеток человека HeLa, первичные астроциты крысы. Астроциты выделяли из мозгов новорожденных крыс и культивировали со сменой среды 14 дней перед экспериментами. Условия клеточной гипергликемии моделировали 48 часовой инкубацией клеток при повышенной концентрации глюкозы (25 мМ для HeLa, 22,5 мМ для астроцитов). Контрольные клетки инкубировали при 5 мМ глюкозы. Экспрессию генов (PPARa, PPARß, PPARy, СОХ-1, СОХ-2, GAPDH, актин) определяли методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе iCycler Bio-Rad с использованием набора "SYBR green PCR Master Mix" (Bio-Rad). Для определения количества белка (PPARa, PPARß, PPARy, СОХ-2, р38, р-р38 ß-тубулин) использовали метод иммуноблоттинга. Концентрацию простагландина Е2 и TNFa определяли методом ИФА. ДНК-связывающая активность PPAR определялась с использованием иммуноферментного набора «PPARa, -5, у Complete Transcription Factor Assay Kit». Описание морфологии клеточной культуры проводили методом конфокальной микроскопии на микроскопе LSM 510 (Carl Zeiss, Jena, Germany) с использованием антител на белки GFAP (маркёр астроцитоза) и изолектин В4 (маркёр микроглии). Все измерения проводили не менее трех раз. р<0,05. При работе с первичными астроцитами данные анализировались с трех независимых биологических повторностях. Полученные данные обрабатывали с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Характеристика воспалительного процесса в условиях гипергликемии на клетках линии человека HeLa.

Клетки HeLa выбраны для модельных исследований, поскольку они легко культивируются, в них экспрессируются все три изотипа PPAR и охарактеризован Fia молекулярном уровне LPS-стимулируемый клеточный

8

ответ. Целью этого этапа работы было показать, что 1) условия клеточной гипергликемии меняют чувствительность клеток к действию LPS, что проявляется на уровне экспрессии классического маркера воспаления — циклооксигеназы (изоформы СОХ-1 и СОХ-2); 2) ядерные рецепторы PPAR меняются в условиях гипергликемии; 3) синтетический PPARy агонист росиглитазон позволяет модулировать LPS-стимулированные ответы в различных условиях культивирования. Результаты получены совместно с С.А. Грабеклис.

Получено, что стимуляция LPS приводит к увеличению экспрессии СОХ-2 и увеличению экспрессии PPARa, -Р и -у. В условиях клеточной гипергликемии (25 мМ глюкозы) происходит снижение экспрессии СОХ-2, PPARa и PPARP на нестимулированных клетках и их стимуляция LPS не приводит к увеличению экспрессии СОХ-2, PPARa, -Р и -у, уровень экспрессии СОХ-1 снижается. Результаты получены совместно с Н.В. Поповой и Л.Ю. Андреевой. Агонист PPARy росиглитазон, лекарственное средство, используемое как гипогликемический препарат, обладает антивоспалительными свойствами в нормальных условиях (снижает LPS-стимулированное увеличение экспрессии всех исследуемых генов), но не проявляет этого эффекта в условиях клеточной гипергликемии на PPARP и PPARy.

2. Характеристика TLR-стимулироваиных ответов астроцитов в условиях клеточной гипергликемии

Объектом исследования являлись первичные астроциты. Задачи исследования на этом этапе: 1) сравнить астроциты, культивируемьП при 22,5 мМ глюкозы (гипергликемия) и 5 мМ глюкозы (контрольные условия) морфологически, иммуноцитохимически, По способности синтезировать воспалительные маркёры при активации TLR агонистами; 2) показать изменения изучаемых генов PPARa, PPARy, PPARP и возможность модуляции их экспрессии в присутствии ингибиторов МАРК.

9

Показано, что морфологически и иммуноцитохимически астроциты, культивируемые в контрольных условиях и при гипергликемии, не различаются.

2.1. Влияние гипергликемии на способность LPS-стимулированных астроцитов синтезировать воспалительные маркёры PGE2 и TNFa.

К началу нашей работы было известно, что в модели гипергликемии наблюдается изменения в развитии воспалительного ответа, однако как в этих условиях меняются астроциты исследовано не было. Нами показано, что базовый уровень выброса PGE2 увеличивается при культивировании клеток в условиях гипергликемии с 133 ± 23 нг/мл до 264 ± 37 нг/мл, а при стимуляции клеток LPS синтез PGE2 увеличивается с 434 ± 64 пг/мл (контрольные условия) до 786 ± 42 пг/мл (клетки культивировали в условиях гипергликемии) (Рис. 1.а). В контрольных клетках без обработки LPS уровень выброса TNFa был ниже пределов детектирования, однако стимуляция LPS вызывает выброс TNFa, на уровне 140+22 пкг/мл при нормальной концентрации глюкозы и 250 ± 25 пкг/мл при гипергликемии (Рис. 1.6). Таким образом, клеточная гипергликемия приводит к увеличению выброса провоспалительных маркеров PGE2 и TNFa и усиливает чувствительность клеток к действию LPS.

(б) сГ

s

300

к 200 -

£ 100 -

□ NG ■ HG

LPS

LPS

Рис. 1. Влияние гипергликемии на LPS-стимулированный выброс PGEj (а) и TNFa (б).

Астроциты культивировали в течении 48 ч в среде с концентрацией глюкозы 5 мМ(NG) или 22,5 мМ (HG), затем культивировали 4 ч без дополнительных обработок (С) или в присутствии LPS (100 нг/мл). Концентрацию PGE2 и TNFa определяли с помощью ИФА. яр < 0,05. *р < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками.

2.2. Изменение экспрессии и ДНК-связывающей активности РРАЯа, РРА и РРАЯу при культивировании астроцитов в условиях гипергликемии

Данных характеризующих изменение активности и экспрессии изоформ РРАЯ в клетках мозга при использовании гипергликемических моделей ранее не было описано, поэтому мы изучили, как меняется экспрессия и ДНК-связывающая активность трех изоформ РРАЯ в условиях культивирования астроцитов при различных концентрациях глюкозы.

Показано, что условия гипергликемии не влияют на ДНК-связывающую активность (Рис. 2.а), однако меняют уровень экспрессии мРНК грех изоформ РРАК (Рис. 2.6). Происходит снижение экспрессии мРНК РРАЯа и РРАКу, наблюдается увеличение экспрессии мРНК РРАИр. Из литературы известно, что подобные изменения экспрессии РРАЯ характерны для воспалительных процессов, т.е. адаптация астроцитов при гипергликемии имеет воспалительный характер.

(а) Ю

л 25 .) айв ■ не | ам<3 инс

I г. {!'" 5:

Н I Ц-гЬ Л ^

I °;1 г** 11 1 ■ II I И

РРАЯа РРАЯР РРАЯу РРАЯа РРАЯр РРАЯу

Рис. 2 Влияние гинергликемии на ДНК-связывающую активность (а) и уровень экспрессии мРНК РРАНи, РРАЯр и РРА Ну (б). Лапроциты культивировались 48 часов в среде с нормальной (5 мМ) и повышенной концентрацией глюкозы (22,5 мМ). (а) ДНК-связывающую активность измеряли методом ИФА. (б) Уровень экспрессии мРНК РРАЯа, РРАИр и РРАИу определяли методом ПЦР в реальном времени. За 100% принят уровень мРНК соответствующего гена в клетках культивируемых при нормальной концентрации глюкозы. *р < 0.05

Было известно, что астроциты на плазматической мембране имеют несколько подтипов Толл-подобных рецепторов: ТЬЯ4, 1/2 и, возможно, 5. Поэтому мы сравнили влияние ЬР8, пептидогликана (РО!Ч) и флагеллина (ИОЬ) являющихся агонистами Т1Л14, ТИ12 и ТЬЯ5 соответственно, на выброс РОЕ2 и 1Тч1Ра и экспрессию трех изоформ РРАЯ. Получено, что все три агониста

г

вызывают выброс провоспалительных маркеров и влияют на экспрессию мРНК PPARa, PPARp и PPARy. Действие TLR5 агониста как участника системы врожденного иммунитета на астроцитах показано впервые и открывает возможности его развернутого изучения на клетках мозга. Нами также показано, что адаптация астроцитов при гипергликемии приводит к увеличению чувствительности к действию агонистов LPS и PGN, но не FGN на уровне мРНК PPAR.

2.3. Влияние ингибиторов р38, JiN'K, ERK МАРК на экспрессию трех изоформ PPAR в условиях активации системы врожденного иммунитета при гипергликемии

Ингибиторы МАРК в настоящее время активно изучаются как противовоспалительные вещества широкого спектра действия. Мы предположили, что ингибиторы МАРК могут регулировать экспрессию мРНК PPARa, -р, -у в условиях гипергликемии при стимуляции TLR. Для проверки этого предположения выбрали действующие концентрации ингибиторов по их способности модулировать LPS -стимулированный выброс TNFa и PGE?, затем исследовали их влияние на экспрессию PPAR (Рис. 3). Значимые различия в условиях гипергликемии получены при действии ингибитора р38 (SB203580) для PPAR(3 (Рис. 36) и ингибитора ERK1/2 (PD98059) для PPARy. Другие ингибиторы модулировали экспрессию PPAR не зависимо от адаптации клеток к различным концентрациям глюкозы. Это указывает на их перспективность как противовоспалительных препаратов независимо от данной адаптации. Возможность модуляции экспрессии PPAR открывает новые возможности в использовании МАРК ингибиторов, однако встал вопрос о механизме регуляции экспрессии PPAR, который не был изучен. Поэтому в дальнейшей работе мы сосредоточились на выяснении этого механизма при гипергликемической модели культивирования астроцитов.

L

(а)

SB 203580 * ♦ "

U0126 _..*■ + -

SP600125 ... - - ♦ ♦

PD98059 . . - + +

Рие.З. Эффект р38, МЕК1/2, ERK1/2 и JNK ингибиторов на экспрессию PPARa, р, -у в наивных и LPS-стнмулированных клетках при культивировании астроцитов в среде с повышенной концентрацией глюкозы. Лстроциты культивировали в условиях нормальной 6VG" 5тМ) и повышенной концентрации глюкозы (HG. 22.5тМ) 48 ч, затем на 1 ч добавляли ингибиторы МАРК: р38 <SB203580, 20 рМ), МЕК1/2 (V0126, 10 рМ), ERK1/2 (PD98059, 20 рМ). .JNK (SP600125. 10 иМ) и стимулировали LPS (100нг/мл) на 4 ч. Контрольные клетки не стимулировали LPS. Количество мРНК PPARa (a), PPARfi (б) и PPARy (с) определят методом ПЦР в реапьном времени. *р < 0,05 по сравнению с необработанными клетками, # р < 0.05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками,. Ар < 0,05.

3. Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов PPAR при активации TLR на астроцитах.

Для выяснение механизмов регуляции PPAR при стимуляции TLR рецепторов на астроцитах решали следующие задачи: 1) показать, есть ли общий механизм в действии агонистов разных TLR на экспрессию (уровень мРНК и белка) и ДНК связывающую активность PPARa, -р. -у; 2) меняются ли параметры деградации мРНК трех изотипов PPAR при TLR-стимуляции; 3)

зависит ли экспрессия PPAR от ингибиторов синтеза белка; 4) можно ли регулировать уровень экспрессии PPAR с помощью ингибиторов МАРК. В каждой серии клеточных экспериментов параллельно изучению генов PPARa, PPARy, PPARp исследовали экспрессию СОХ-2, как классического маркера воспаления.

3.1. Агонисты TLR1/2, TLR4, TLR5- подавляют уровень экспрессии PPARa и PPARy, но увеличивают экспрессию PPARp

В данной серии экспериментов использованы агонисты TLR рецепторов, которые показали свою активность в модуляции мРНК PPAR. Для PPARa, PPARp, PPARy одновременно оценили ДНК-связывающую активность PPAR (Рис. 4с), уровень экспрессии мРНК (Рис. 4д), уровень экспрессии белка (Рис. 46) при действии агонистов дШ11/2, TLR4, TLR5. Для всех тестируемых агонистов наблюдалось подавление уровня экспрессии генов PPARa и PPARy и рост уровня экспрессии гена PPARp (Рис. 4д). Изменения на уровне мРНК коррелировали с изменениями на уровне белка и ДНК-связывающей активности. В работе впервые показано влияние агонистов TJIP2 и ТЛР5 на активацию всех трех изоформ PPAR. Более того, впервые описаны функциональные эффекты активации TLR5 на астроцитах.

Несмотря на большое разнообразие запускаемых сигнальных ответов при активации различных TLR, для исследуемых рецепторов существует сходство в активации фактора транскрипции NF-кВ. Мы использовали ингибитор Bay 117085 и показали, что он снимает действие исследуемых агонистов (Рис. 4д), т.е. существует сигнальный путь TLR/NF-kB/PPAR.

Для доказательства, что данные агонисты действуют через рецепторы используют антагонисты, однако для изучаемых типов TLR такой антагонист, CLI-095 , существует только для TLR4 рецептора. Используя его, мы показали, что в нашей экспериментальной системе все эффекты LPS на экспрессию PPARa, PPARP, PPARy и СОХ-2, осуществляются через TLR4 рецептор. Поэтому дальнейшие исследования проводили с LPS.

14

х 2.5- ОPPARa BPPAR(3 ■ PPARy

LPS PGN FQt

Рнс. 4. Сравнение влияния агониетов Толл-подобных рецепторов (TLR) и ингибирования NF-кВ на уровень белка (а,б), активность (в), удельную активность (г) и экспрессию (д) PPARa, -ß, -у. Астроциты стимулировались 4 часа с агонистами Толл-подобных рецепторов: липополисахаридом (LPS, 100нг/мл, TLR4'); пептидогликаном (PGN, 5 мкг/мл, TLR1/2) и флагеллином (FGL, 5 мкг/мл. TLR5) и. ингибитором NF-кВ (Bay 11-7085, 5 мкМ). (а,б) концентрацию белка PPARa, -ß, -у определяли методом иммуноблоттинга. данные нормализовались на ß-тубулин. Приведена типичная электрофореграмма и результаты денситометрии. Уровень белка в контрольных клетках принят за 1. (в) ДНК-связывающую активность измеряли как описано в материалах и методах. За 1 принята активность соответствующей изоформы PPAR в не-стимулированных астроцитах. (г) удепышя активность. Считалась как А/Б, где А это значение активности данной изоформы PPAR, а Б - концентрация белка полученное методом иммуноблоттинга. (д) уровень мРНК PPAR определяла методом ПЦР в реальном времени. *р < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками.

3.2. Кинетика экспрессии PPARa, PPARp, PPARy и COX2 при стимуляции

астроцитов LPS

За последние годы показано, что при активации системы врожденного иммунитета клеточные ответы включают процессы провоспалительные (стадия активации ответа) и антивоспалительные (стадия разрешения (resolution) ответа). Это активные процессы, которые разворачиваются во времени и от их регуляции зависит возвращение клеточной системы в исходное состояние или установление нового адаптивного состояния (возможно, характеризующего хроническое воспаление на уровне организма). Однако до нашей работы не былочданных характеризующих кинетику экспрессии PPARa, PPAR(3, PPARy при стимуляции LPS. Мы провели это исследование в сравнении с экспрессией гена-йровоспаяительнаго маркёра СОХ-2 (Рио#5).

(б)

(г)

PPARa PPARP PPARy p-tubutin

16 24

■I ее 2 ? 1 й" Л О.

5 5

I I I I I-1—1—1-1-1-г—

О 2 4 6 8 10 12 24

Время (ч) -PPARa —»—PPARp - А - PPARy

0 2 4 16 24

Время (ч)

Рис. 5. Изменение уровня экспресии PPARa, -Р -у и СОХ-2 при стимуляции астроцитов LPS. (а,б) Астроциты стимулировали LPS (100 иг/мл) и через указанные промежутки времени уровень мРНК PPARa,р,у и СОХ-2 определяли с помощью ПЦР в реальном времени, (в,г) Концентрацию белков трех изоформ PPAR определяли с помощью иммупоблоттинга. *р < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #р< 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. Результаты получены совместно с С.Е. Алешиным.

Для изучения временной зависимости экспрессии PPARa, -(3, -у и СОХ-2 от стимуляции TLR4 в астроцитах измеряли уровень экспрессии мРНК и белка для PPARa, -р, -у в заданные временные промежутки после стимуляции (Рис. 5) методом ПЦР в реальном времени и иммуноблоттингом, соответственно. Значительное снижение (более чем в 3 раза) уровня мРНК для PPARa и PPARy было отмечено уже на 2х часах после стимуляции клеток LPS (Рис. 5а). Для PPARy уровень мРНК не вернулся к уровню не-стимулированных клеток даже при 24ч инкубации (Рис. 5а). Уровень мРНК PPARa к этому времени вернулся в норму. Для PPARP же наоборот происходит постепенное увеличение уровня мРНК до 2,5 раз с максимумом на 4х часах, далее уровень мРНК PPARP начинает снижаться и через 24 часа приходит к уровню экспрессии гена в необработанных клетках (Рис. 5.а). Эти изменения коррелировали с уровнем белка (Рис.5в,г). Из полученных результатов видно, что в экспрессии PPARp так же как и экспрессии СОХ-2 (Рис. 56) есть схожие элементы. Оба гена имеют фазу индукции и разрешения воспалительного ответа.

Полученные данные показывают, что регуляция экспрессии PPARs тесно связана с системой клеточного ответа на активацию TLR4 рецептора. В дальнейшей работе мы сконцентрировались на краткосрочной стадии клеточного ответа, т.е. на точке 4ч после стимуляции LPS чтобы оценить вклад транскрипционных и пост-транскрипционных процессов в регуляцию PPARa, PPARP, PPARy.

3.3. Скорость распада мРНК PPARa, PPARp, PPARy. замедляется при активации TLR4

Полученные данные, что PPAR меняются в процессе развития ответа на LPS, позволило выдвинуть предположение, что экспрессия этих генов может регулироваться на пост-транскрипционном уровне. В последнее время посттранскрипционная регуляция генов на уровне времени жизни мРНК вызывает большой интерес, поскольку показано, что многие гены, активно вовлеченные в про-воспалительные процессы меняют скорость деградации мРНК при

17

действии на клетки про-воспалительных агентов. Поэтому, мы провели серию экспериментов по определению изменения уровня экспрессии мРНК PPARa, PPARp PPARy в присутствии ингибитора транскрипции актиномицина Д. Известно, что после добавления актиномицина изменяется только уровень уже существующей мРНК, что позволяет определять время полужизни мРНК. Сравнивали стабильность мРНК в нативных и LPS-стимулированных клетках (Рис. 4.15). Для определения стабильности мРНК в LPS-стимулированных клетках мы добавляли к клеткам LPS на 1 ч, затем синтез новой мРНК блокировался с помощью актиномицина Д (5 мг/мл). Уровень мРНК PPARa, -Р, -у до добавления актиномицина Д был взят за 100%.

Время полужизни мРНК PPARa и PPARy в не стимулированных клетках меньше одного часа: примерно 30 мин для PPARa (Рис. 6а), 75 мин для PPARy (Рис. 6в) и 90 минут для PPARp (Рис. 66). Для удобства отображения в астроцитах обработанных LPS уровень мРНК PPARa, -р, -у был взят за 100% после 1ч инкубирования клеток с этим агонистом TLR4. Мы определили, что время полужизни мРНК PPARa и PPARy в LPS-стимулированных клетках стало примерно 80 мин для PPARa, 90 мин для PPARy и 130 минут для PPARP (Рис. 6). Таким образом LPS замедляет деградацию мРНК для всех трех типов PPAR, т.е. происходит регуляция ядерных рецепторов на посттранскрипционном уровне.

Ранее было показано, что LPS вызывает активацию р38 МАРК в астроцитах. Мы так же показали, что ингибитор р38 МАРК снижает выброс воспалительных маркеров PGE2 и TNFa в астроцитах и влияет на экспрессию PPARp, т.е. р38 МАРК может быть активным участником регуляции PPAR и на стадии деградации мРНК. Для проверки этого предположения мы измерили скорость деградации мРНК PPARa, -Р, -у в присутствии специфического ингибитора р38 МАРК SB203580 (Рис. 6). Получили, что в LPS-стимулированных клетках инкубирование астроцитов с SB 203580 снижает скорость деградации мРНК до скорости деградации в необработанных клетках для PPARa (Рис. 6а), PPARy (Рис. 6в) и PPARp (Рис. 66).

18

*—не обработанные • - LPS ^— LPS+SB

•—не обработанные • - LPS •ft—LPS+SB

(В)

2 3 Время (ч)

—■—не обработанные - • - LPS -л-LPS+SB

cl

а.

*

х о.

S

Phospho р38 Total р38 р-tubulin

LPS

SB 203580

1 2

Время (ч) |

Рис. 6. Влияние ингибирования р38 МАРК и добавления LPS на скорость деградации мРНК PPARa, PPARJ5 и PPARy. (а, б, в) Астроциты культивировали без дополнительных обработок (черная сплошная линия), с добавлением LPS (100 нгУмл) на I час (пунктирная линия) ичи совместно инкубировались с ингибитором р38 МАРК SB203580 (SB, 20 мкМ) и липополисахаридом (LPS, 100 нг/мл) (серая линия). Затем клетки обрабатывав актиномицином Д (5 мкг/мл). Через указанные промежутки времени образцы собирачи и уровень экспрессии мРНК PPARa, -Д -у анализировали методом ПЦР в реальном времени. За 100% на графике принят уровень экспрессии мРНК PPARa, -Д -у для необработанных астроцитов, и уровень экспрессии после 1ч обработки L.PS соответственно, (г) приведена электрофореграмма определения количества фосфо-р38 белка после 30 минут обработки LPS-стимулированных астроцитов ингибитором р38 МАРК *р < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #р< 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками.

3.4. Роль циклогексимида в регуляции экспрессии мРНК РРАИя, РРАЯр, РРАЯу.

Известно, что для ряда генов воспалительных ответов, таких как СОХ-2 или интерлейкин-6 показан эффект, называемый «супериндукция» Это явление, при котором экспрессия гена возрастает в присутствии ингибиторов белкового синтеза. Схожесть всех Зх изоформ РРАЯ как белков, и их взаимосвязь с СОХ-2 позволила нам предположить, что исследуемые нами гены также могут регулироваться через механизм супериндукции. Действительно, полученные данные показывают, что для всех Зх изоформ РРАЯ наблюдается рост их мРНК при обработке ингибитором белкового синтеза циклогексимидом (Рис. 7). Мы оценили вовлеченность р38 и ЖК МАРК, а так же транскрипционного фактора ОТ-кВ в регуляцию этого эффекта (Рис. 7).

PPARjB Ш PPARy

SB 203580 SP600125 Bay 11-7085 LPS

Рис. 7. Модулирование циклогексимид-стимулированной экспрессии мРНК PPARa, -р, -у LPS и МЛРК-ингибиторами. Астроциты обрабатывали 0,5ч ингибиторами МАРК р38 (SB 203580. 20 мкМ), JNK (SP600125. 10 мкМ) и Bay ¡1-7085 (5 мкМ), ингибитором NF-kB или в течении 1ч LPS (100 нг/мл) и затем инкубировали 4ч с ингибитором белкового синтеза циклогексимидом (5 мкг/мл). Уровень экспрессии мРНК PPAR определяли методом ПЦР в реальном времени. *р < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками. # р < 0,05 по сравнению с клетками стимулированными только циклогексимидом

Полученные данные позволяют предположить, что в системе регуляции экспрессии PPAR существует неизвестный лабильный белок - супрессор экспрессии всех трех изотипов PPAR, при этом, несмотря на то, что все три

исследуемых белка относятся к одному суперсемейству, регуляция механизма супериндукции происходит у них по разным механизмам. Для РРАЯсх ключевыми факторами являются р38 МАРК, и №-кВ. Для РРАЛр - р38 МАРК, для РРАЯу это ЛЧК МАРК. Дальнейшее изучение этого эффекта в клетках при активации системы врожденного иммунитета позволило предположить, что действие этих лабильных белков различно для необработанных и ЬР8-стимулированных клеток, что указывает на новые возможные точки регуляции данной системы взаимосвязанных генов.

3.5. Общая схема регуляции PPARa, PPARP, PPARy в астроцитах

Полученные данные позволили предложить обобщённую схему влияния МАРК и регуляции трех изоформ PPAR в астроцитах при стимуляции клеток LPS (Рис. 8).

■ С//-С95

SB203580

SP600125

PD 9В059

U0126-

Рис. 8. Схема регу ляции мРНК шформ РРАЯ в ЬРв-стимулированных астроцитах.

' * - активирующее, ' - ингибирующее влияние, —> - стабилизация мРНК

Схема отображает важную роль фактора транскрипции ОТ-кВ в

регуляции экспрессии мРНК всех трех изоформ РРАЯ. Известно, что активация

ТЪЯ сопровождается активацией каскада МАРК, а это, в свою очередь, влияет

на активность разных изоформ РРАЛ. Наши результаты показывают, что

21

МДРК участвует в регуляции экспрессии PPAR в ходе клеточного ответа при активации TLR (Рис. 8). Схема учитывает обнаруженный в ходе исследования механизм регуляции ядерных рецепторов PPAR на пост-транскрипционном уровне с участием р38 МАРК. Полученные данные позволяют предположить возможность модулирования ядерных рецепторов PPAR с помощью МАРК ингибиторов раздельно, как на уровне экспрессии, так и ДНК-связывающей активности. Используя различные МАРК ингибиторы можно изменить баланс между тремя изотипами PPAR, важной триадой рецепторов, регулирующей различные функции астроцитов.

Полученные данные указывают на новые возможности применения МАРК ингибиторов для регуляции воспалительных процессов на уровне экспрессии мРНК PPAR. Нами получено, что активность PPARa находится под негативным контролем JNK в необработанных астроцитах, так же как ингибирование р38 МАРК приводит к увеличению активности PPARy. Что примечательно, этот механизм регуляции не применяется при активации клеток LPS, гак исследуемые ингибиторы МАРК не влияют на LPS-стимулированное снижение экспрессии мРНК PPARa и ДНК-связывающую активность. С другой стороны, регуляция PPARy ингибитором JNK снимает LPS-стимулированное подавление экспрессии этой изоформы PPAR. PPARP активируется при всех исследуемых обработках. Схема на (Рис. 8) показывает, что, не смотря на схожесть изотипов PPAR мРНК PPARP модулируется всеми предполагаемыми МАРК. Все три изоформы регулируются р38 на уровне деградации мРНК, а мРНК PPARy находится под контролем JNK и ERK каскадов МАРК.

Эти результаты могут представлять интерес при комбинированном применении синтетических агонистов PPAR и ингибиторов МАРК. Например, сочетание росиглитазона и JNK ингибитора может свести к минимуму снижение экспрессии PPARy и усилить противовоспалительное действие агонистов PPARy. Такие подходы позволяют снизить действующие концентрации лекарственных средств и уменьшить их токсические воздействия.

Выводы.

1 . Показано, что адаптация клеток к гипергликемии приводит к увеличению выброса провоспалительных маркеров РвЕз и ТМ^а и меняет чувствительность клеток к действию агонистов Т1_Я на клеточной линии НеЬа и первичных астроцитах крысы.

2. Выявлено, что адаптация астроцитов к гипергликемии не влияет на ДНК-связывающую активность ядерных рецепторов РРАИ., однако меняет уровень экспрессии РРАЛа, РРАЯР и РРАЯу на уровне мРНК и белка.

3. Впервые показано, что при стимуляции ТЫ14 на астроцитах происходит стабилизация мРНК РРАЯа, РРАЯР и РРА11у . Установлено, что этот процесс зависит от активации р38 МАРК.

4. Показано, что экспрессия мРНК РРАИа, РРАЬф и РРАЯу при стимуляции системы врожденного иммунитета увеличивается в присутствии ингибиторов белкового синтеза, т.е. регулируется через механизм «супериндукции», характерный для других генов, участвующих в воспалительных ответах.

5. Охарактеризована вовлеченность в регуляцию экспрессии РРАЯа, -Р -у, ингибиторов р38, ЖК, ЕЮС и МЕК1/2 МАРК, фактора транскрипции МБ-кВ.

5. Построена обобщенная схема регуляции экспрессии РРАЯа, РРАЯр и РРАЯу при активации Толл-подобных рецепторов системы врожденного иммунитета на первичных астроцитах крысы в условиях клеточной гипергликемии.

Благодарности

Выражаю свою искреннюю благодарность моим научным руководителям Скрябину Константину Георгиевичу и Сергеевой Марине Глебовне за помощь в постановке экспериментов и научные консультации при работе над диссертационным проектом, а также директору Института Нейробиологии университета Отто-фон-Герике г. Магдебург, (Германия) профессору Георгу Райзеру за курирование и помощь в организации работы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ:

1. Chistyakov D.V., Aleshin S.E., Sergeeva M.G., Reiser G. Regulation of peroxisome proliferator-activated receptor p/5 expression and activity levels by tolllike receptor agonists and MAP kinase inhibitors in rat astrocytes // Journal of Neurochemistry. 2014. V.130 (6) P. 563-74.

2. Грабеклис C.A., Чистяков Д.В., Андреева Л.Ю., Сергеева М.Г. Совместное участие агонистов ядерных рецепторов PPAR и ингибиторов циклооксигеназ в регуляции пролиферации клеток глиомы С6 // Биологические мембраны. 2012. Т. 29. № 6. С. 429-432.

3. Чистяков Д.В., Попова Н.В., Грабеклис С.А., Алешин С.Е., Сергеева М.Г.. Росиглитазон как регулятор врожденного иммунитета в клеточной модели гипергликемии // Биологические мембраны. 2011. Т. 28. № 6. С. 515-522.

Тезисы конференций и статьи в сборниках:

4. Чистяков Д.В., Борисевич Д.И., Астахова А.А., Ивлиев А.Е., Сергеева М.Г., Скрябин К.Г. Изменение метаболизма жирных кислот при полногеномном анализе разных типов глиомы. // Международная конференция «Липидология -наука XXI века». Москва (Россия). 2013. Т.1, С. 229-233.

5. Чистяков Д.В., Гончар М.В., Сергеева М.Г. Использование ингибиторов белкового синтеза для изучения сигнальных путей в клетках эукариот: супериндукция и действие бруфена как агониста ядерных рецепторов PPAR. // Международная конференция "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация". Пущино (Россия). 2013. Т. 2, С. 479-484.

6. Chistyakov D.V., Astakhova A.A., Karatasso U.O., Sergeeva M.G. Comparison of LPS-stimulated and control U937 cells by shotgun lipidomics analysis to distinguish between two types of cellular response. // International conference «3rd European lipidomics meeting». Pardubice (Czech Republic). 2013. P. 20.

7. Chistyakov Dmitry V., Georg Reiser, Sergeeva Marina G. Mechanisms of

superinduction for PPARalpha, PPARgamma, PPARbeta expression in astrocytes.

24

// International conference «Nuclear receptors: Linking molecules, genomes & physiology, abstract». Sorrento (Italy). 2013. P. 128.

8. Chistyakov D.V., Astakhova A.A., Sergeeva M.G. Alterations of Toll-like Receptor Signaling Pathway in Glioma. // International conference «Alternative Strategies against Cancer and Inflammation». Bangkok (Thailand). 2012. P. 89.

9. Чистяков Д.В., Попова H.B., Грабеклис C.A., Алешин С.Е., Сергеева М.Г. Взаимосвязь изоформ ядерных рецепторов PPAR при регуляции экспрессии циклооксигеназы СОХ-2 в условиях повышенной концентрации глюкозы. // Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». Пущино (Россия). 2011. Т. 1, С. 70-74.

10. Chistyakov D., Grabeklis S., Aleshin S., Sergeeva M. Cells exposition to high glucose environment changes expression of nuclear receptors PPARs and sensitivity to LPS stimulation. // International conference «ЕМВО: Nuclear receptors. From Molecular Mechanism to Health and Decease». Barcelona (Spain). 2011. P. 121.

11. Чистяков Д.В. Влияние ингибитора p38 МАРК (SB203580) на экспрессию ядерного рецептора PPAR0 в глиальных клетках мозга при гипергликемии. // XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». 2010. С. 75.

12. Чистяков Д.В., Алёшин С.Е., Грабеклис С.А. Сергеева М.Г. Изменение экспрессии ядерных рецепторов PPAR и циклооксигеназы при стимуляции клеток HeLa, липополисахаридом в условиях высокой концентрации глюкозы. // Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии». 2009. Звенигород (Россия) С. 32.

13. Руднева В.А., Зезина Е.А., Каратассо Ю.О., Чистяков Д.В. Бионформатические стратегии в липидомике: применение для медицинской диагностики. // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». 2008. С. 2-3.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 8 (495) 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 13.03.2015 г.