Модулирующий эффект экзогенного белка теплового шока (БТШ70) на клетки врождённого иммунитета млекопитающих при действии липополисахаридов разной структуры

Антонова, Ольга Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Модулирующий эффект экзогенного белка теплового шока (БТШ70) на клетки врождённого иммунитета млекопитающих при действии липополисахаридов разной структуры
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модулирующий эффект экзогенного белка теплового шока (БТШ70) на клетки врождённого иммунитета млекопитающих при действии липополисахаридов разной структуры"

На правах рукописи

Антонова Ольга Юрьевна

МОДУЛИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА (БТШ70) ИА КЛЕТКИ ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛИПОЛИСАХАРИДОВ РАЗНОЙ СТРУКТУРЫ

03.01.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г Я МАР 2013

ПУЩИНО - 2013

005051229

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук и Путинском государственном естественно-научном институте

Научный руководитель: Вннокуров Максим Григорьевич

доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Новоселов Владимир Иванович

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, главный научный сотрудник лаборатории механизмов рецепции

Зацепина Ольга Георгиевна

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. Л. Энгельгардта РАН старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации

Ведущая организации: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита диссертации состоится «11 » апреля 2013 года в 14 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Путинского научного центра РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан « ' ' » марта 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук // /с:, Смолихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В экономически развитых странах Европы и в США ежегодно более чем у 750000 пациентов развивается сепсис, летальность при котором может достигать 40-80%. 11есмотря на многолетние исследования, направленные на поиск подходов к лечению сепсиса, количество подтверждённых случаев возрастает на -1,5% в год (Salomao etal, 2012).

В настоящее время в практической медицине нет эффективных средств защиты от грамотрицателыюго и грамположителыюго сепсиса. Активатором патологических процессов при сепсисе являются структурные компоненты бактериальных клеток (PAMPs - pathogen-associated molecular patterns) (Ray et al, 2013). У грамположительных клеток, наряду с другими PAMPs - это липотейхоевая кислота (ЛТК). У грамотрицательных -липополисахариды (ЛПС, эндотоксины). ЛПС также играют важную роль в развитии таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, метаболический синдром и др. (Мапсо et al., 2010). Поступая в кровяное русло, ЛПС сначала взаимодействуют с липополисахарид-связывающим белком, затем - с CD 14 мембранным белком клеток-мишеней (в том числе фагоцитов крови). После этого происходит передача ЛПС от CD14 к MD-2 (лимфоцитариый антиген 96) и последующее образование двух комплексов ЛПС-МО-2-ТЬЯ-4 (Toll-like receptor 4), которые впоследствии формируют гетеродимерный рецепторный комплекс в мембране клеток-мишеней (Park et al., 2009). Трансдукция сигнала от этого комплекса приводит к запуску клеточного ответа, на ранних стадиях которого происходит увеличение продукции активных форм кислорода (АФК) фагоцитами и увеличение экспрессии факторов адгезии. В более поздний период происходит активация факторов транскрипции (в частности, NF-kB - ядерный фактор каппа В) и синтез провоспалительных цитокинов, среди которых первым секретируется TNF-a (Buttenschoen et al., 2010). ЛТК вызывает стимуляцию клеток врожденного иммунитета через активацию TLR-2, CD14 и CD36 рецепторов (Weidenmaier, Peschel, 2008).

В развитии сепсиса и септического шока важная роль принадлежит клеткам врожденного иммунитета - фагоцитам (нейтрофилам, моноцитам, макрофагам), основной функцией которых является защита млекопитающих от бактериальной инфекции. Нейтрофилы играют ключевую роль в воспалительном ответе и одними из первых отвечают па действие ЛПС и ЛТК, которые вызывают активацию нейтрофилов и ингибируют их апоптоз, что приводит к увеличению продолжительности жизни этих клеток (El Kebir, Filep, 2010; Осапа et al, 2008). Наряду с нейтрофилами в системе врожденного иммунитета важная роль принадлежит макрофагам, которые происходят из моноцитов, и в качестве секреторных клеток участвуют во многих иммунных и воспалительных реакциях, в которых не участвуют нейтрофилы (Odegaard et al., 2011). Под действием ЛПС моноциты и макрофаги продуцируют различные цитокины и клеточные медиаторы и играют важную роль в воспалительном процессе.

Большинство грамотрицательных бактерий содержат S-форму ЛПС, в состав которой входит гидрофобный липид А, олигосахаридный кор и О-антиген. Помимо S-формы ЛПС, бактерии синтезируют и кор-дефектные молекулы ЛПС (R-хемотипы), имеющие в своем составе липид А и коровую часть разной длины. Кор-дефектные структуры обозначаются как Rb - Re-хемотипы, а структуры, имеющие полный внешний кор, как Ra-хемотип (Freudenberg et al., 2008). Известно, что при ряде патологий доля R- хемотипов ЛПС может возрастать (Anas et al., 2010). Действие S-формы эндотоксинов на фагоциты в настоящее время исследовано достаточно полно, в то время как действие различных R- хемотипов ЛПС изучено недостаточно.

В ответ на стресс организм выделяет эндогенные "сигналы опасности", способные действовать как мощные активаторы системы врожденного иммунитета, вызывая продукцию различных медиаторов. Ранее было показано, что при сепсисе и различных воспалительных заболеваниях происходит увеличение синтеза и продукции белков теплового шока, в частности БТШ70, играющего важную роль в механизме защиты организма млекопитающих

от теплового и других видов стресса (Gebin et al., 2011, Ed. Henderson, 2012). Показано, что введение экзогенного рекомбинантного БТШ70 снижает гибель животных в модели эндотоксинового шока, а также подавляет индуцируемую эндотоксином активацию нейтрофилов, т.е. защищает клетки от действия ЛПС (Rozhkova et al., 2010).

Свойства внутриклеточного БТШ70 изучены достаточно полно (Lia et al., 2012, Noble et al., 2012, Joly et al., 2010). Показано, что он обладает шаперонной активностью, а также имеет различные регуляторные функции (противовоспалительные, антиапоптотические) (Zorzi et al., 2011, Young, 2010). Однако, в настоящее время мало известно о механизмах взаимодействия внеклеточного (экзогенного) БТШ70 с клетками врожденного иммунитета и внутриклеточных сигнальных путях, участвующих в трансдукции его сигнала.

Для понимания защитных функций экзогенного БТШ70 необходимо комплексное исследование его действия на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты и макрофаги), которые являются первой линией защиты организма от бактериальных патогенов и PAMPs и, соответственно, в числе первых клеток взаимодействуют с ЛПС и ЛТК. Однако, все работы по исследованию защитного действия экзогенного БТШ70 были выполнены при использовании S-формы ЛПС. Отсутствуют данные по влиянию экзогенного БТШ70 на клетки врожденного иммунитета при действии разных хемотипов ЛПС. Поэтому представляет интерес исследовать защитные эффекты БТШ70 на разные типы клеток врожденного иммунитета от действия различных хемотипов ЛПС, а также от действия ЛТК. Цель работы: исследовать влияние экзогенного белка теплового шока БТШ70 на клетки врожденного иммунитета при действии липополисахаридов разной структуры. Задачи исследования

1. Исследовать влияние экзогенного БТШ70 на функциональную активность (продукцию АФК, TNF-a) нейтрофилов, моноцитов и макрофагов при действии ЛТК и разных хемотипов ЛПС Е coli.

2. Исследовать влияние экзогенного БТШ70 на рецепторы CDllb нейтрофилов и TLR-4 моноцитов при действии разных хемотипов ЛПС Е coli.

3. Исследовать связывание, интернализацию экзогенного БТШ70, а также его влияние на ЛПС-индуцированную экспрессию TLR-2 и TLR-4 клетками врожденного иммунитета.

4. Выявить внутриклеточные сигнальные пути, задействованные экзогенным белком БТШ70, в защите фагоцитов при действии ЛПС.

Научная новизна. В работе исследовано влияние экзогенного рекомбинантного человеческого белка теплового шока БТШ70 на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты и макрофаги) при действии на эти клетки разных хемотипов липополисахаридов Е. coli. Показано, что предварительная обработка экзогенным БТШ70 снижает индуцируемое ЛТК и различными хемотипами ЛПС Е. coli увеличение продукции АФК и TNF-a нейтрофилами, моноцитами и макрофагами, а также вызывает снижение количества CD1 lb рецепторов нейтрофилов и TLR-4 рецепторов моноцитов.

Показано, что экзогенный БТШ70 увеличивает продукцию TNF-a нейтрофилами и моноцитами с участием преимущественно TLR-4 - зависимой передачи сигналов.

Установлено, что экзогенный БТШ70 увеличивает количество рецепторов TLR-2 и TLR-4 на клеточной мембране нейтрофилов и моноцитов и не влияет на экспрессию мРНК TLR-2 и TLR-4 рецепторов макрофагов RAW 264.7.

Выявлены механизмы влияния экзогенного БТШ70 на внутриклеточные сигнальные пути с участием PLC, PI3K, р38, ERK, JNK и NF-кВ, вовлеченные в продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами при действии ЛПС.

Научная н практическая значимость. Полученные результаты позволяют расширить понимание механизмов действия экзогенного БТШ70 на клетки врожденного иммунитета, что вносит важный вклад в оценку возможности использования БТШ70 в качестве основы для создания перспективных лекарственных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010, 2011, 2012); на международных конференциях "Biological mobility: from fundamental achievements

to nanotechnologies" (Pushchino, 2010, 2012); на международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011); на международной школе-конференции «Математика. Компьютер. Образование» (Дубна, 2012), на Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии» (Пущино, 2012); на И Всероссийской школе-конференции молодых учёных с международным участием «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 2012).

Публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации опубликованы в 14 печатных работах, из них 4 - статьи в рецензируемых научных журналах, 3 статьи в сборниках и 7 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на _ страницах

машинописного текста и включает введение, обзор литературы, методы, результаты,

обсуждение п выводы. Материал иллюстрирован _ рисунками и _ таблицами.

Библиографический указатель содержит_источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты исследования

Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров-добровольцев с помощью метода дифференциального центрифугирования на 2-слойном градиенте фиколла-верографина (1.119 г/мл и 1.077 г/мл). Моноциты выделяли центрифугированием мононуклеарной фракции на градиенте перколла плотностью 1.064 г/мл (Rozhkova et al., 2010).

Клеточные культуры мышиных макрофагов RAW 264.7 и промоноцитарные клетки человека ТНР-1 получены из Американской Коллекции Клеточных Культур (АТСС). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma, США), тестированной на содержание ЛПС, с добавлением 10 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США), 1% L-глутамина, 1% пенициллина, 1% стрептомицина при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2.

Для днфференцировки клетки ТНР-1 рассевали по 1- Ю6 кл в 2 мл культуралыюй среды на лунку в 24-луночный планшет, добавляли 200 нМ форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА, Sigma, США), и культивировали в течение 72 часов при 37°С и 5% СО2. Заменяли культуральную среду на свежую и использовали клетки для работы.

В работе использовали хемотипы ЛПС Е. coli 055:В5, ЛПС из Е. coli ЕН100 (Ra мутант), ЛПС из Е. coli J5 (Rc мутант), ЛПС из Е. coli F583 (Rd мутант) фирмы Sigma, США; ЛПС из Е. coli R515 (Re мутант) фирмы Alexa, США и ЛТК Staphylococcus aureus (Sigma, США).

Использовали рекомбииантный человеческий БТШ70, полученный как описано в (Rozhkova et al, 2010). Ген индуцибелыюго человеческого белка БТШ70 был клонирован для дальнейшей экспрессии под полиэдриновым промотором в бакмиду, как описано (Luckow et al., 1993). Рекомбииантный белок, индуцибельный БТШ70 с 6His-Tag на N-конце, экспрессировапи в клетках шелкопряда и очищали на Ni-NTA колонках согласно рекомендациям производителя ("QUIAGEN").

Методы исследования

Исследование продукции АФК с использованием люминол-зависимон хемилюмннесценции (ХЛ). Клетки RAW 264.7 снимали с поверхности культуралышго флакона с помощью скрепера, центрифугировали 2 мин х 150 g. В предварительных исследованиях по влиянию времени экспозиции клеток с ЛПС и влиянию различных концентраций ЛПС на продукцию АФК клетками RAW 264.7 были определены оптимальные условия эксперимента. Клетки рассевали по 1-Ю6 кл/мл в полипропиленовые пробирки (Axygen, США) в среде с добавлением 5% ЭТС и культивировали в течение 10 ч, после чего делали добавки различных хемотипов ЛПС и БТШ70 и культивировали еще 16 ч (данные не приведены). Культуральную среду заменяли на раствор Хенкса (HBSS), добавляли люминол

(300 мкМ) и инкубировали 25 мин при 37° С. Образцы помещали в люминометр 1250 (LKB, Швеция) и стимулировали 200 нМ РМА. Нейтрофилы (2-105 кл/мл) и моноциты (1-105 кл/мл) в растворе HBSS с 2%-ной плазмой и 350 мкМ люмииола инкубировали с 20 нг/мл ЛПС в течение 25 мин при 37°С, реакцию запускали добавлением 1 мкМ formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP). Хемилюминесценцшо (XJ1) регистрировали в течение 10 мин. ХЛ контрольных клеток принимали за 100 %.

Определение продукции TNF-a. Продукцию TNF-a определяли по цитотоксическому действию образцов на клетки-мишени линии мышиных фибробластов L-929. Клетки линии L-929 культивировали в 96-луночных планшетах по 2-Ю4 клеток в 100 мкл культуралыюй среды на лунку при 37°С и 5% С02. Через 24 ч культивирования к образовавшемуся монослою клеток L-929 добавляли 1 мкг/мл актиномицина D и затем по 100 мкл супернатанта исследуемых клеток. К контрольным лункам добавляли только среду. Планшеты инкубировали в течение 24 ч, затем клетки отмывали фосфатным буфером, окрашивали красителем Crystal Violet и определяли выживаемость клеток после растворения кристаллов в 1%-ном растворе додецил-сульфата натрия. Оптическую плотность измеряли при 595 нм. Продукцию TNF-a определяли по индексу цитотоксичности (Pfister et al., 1992). Специфичность цитотоксического действия TNF-a проверяли в реакции нейтрализации моноклонапьными антителами ("StressGen", Канада).

Исследование кинетики процесса взаимодействия экзогенного ETIII70 с клетками. В экспериментах по исследованию кинетики процесса взаимодействия экзогенного БТШ70 клетки ТНР-1 по 4-Ю5 кл/лунку в камерах Lab-Tek II (Nunc, США) дифференцировали 200 нМ РМА в течение 72 часов в культуральной среде, содержащей 10% ЭТС при 37°С и 5% С02. Затем заменяли культуральную среду на свежую, к клеткам добавляли БТШ70, меченный флуоресцентным зондом Alexa 555, и культивировали в течение различных периодов времени.

Определение изменения количества TLR-2 и TLR-4 на клеточной мембране методом флуоресцентной микроскопии. Изменение количества TLR-2 и TLR-4 рецепторов определяли методом флуоресцентной микроскопии (микроскоп Кеуепсе BZ 8100Е, Япония) в камерах Lab-Tek II. Обработку изображений проводили с помощью программы ImageJ (v 1.47с). Были использованы моноклональные антитела (МКАТ): aHTH-TLR-4-PE (USBiological, США), 3hth-TLR-2-PE (Santa Cruz, США).

Определение изменения количества CDllb на клеточной мембране методом проточной цнтометрни. Изменение количества рецепторов CDllb/CD18 в мембране нейтрофилов определяли методом проточной цитометрии (Rozhkova et al., 2010). К нейтрофилам 1-106 кл/мл растворе в HBSS с 2%-ной плазмой добавляли БТШ70 и ЛПС. Для исследования защитного эффекта, ЛПС добавляли к клеткам через 10 минут после БТШ70. Клетки инкубировали на шейкере в течение 30 мин, центрифугировали и фиксировали 4% формалином. Затем окрашивали анти-CDl lb-FITC (Caltag, США) МКАТ.

Определение клеточной локализации экзогенного БТШ70. В экспериментах по исследованию клеточной локализации экзогенного БТШ70 RAW 264.7 рассевали в 8-луночные камеры Lab-Tek II по 4-Ю5 кл в 500 мкл культуральной среды, содержащей 5% ЭТС при 37°С и 5% С02, для того чтобы клетки прикрепились, культивировали 16 ч, затем заменяли культуральную среду на свежую, добавляли БТШ70 и инкубировали еще в течение 8 ч, после чего клетки окрашивали антителами: первичные aHTH-HSP70 (USBiological, США) и вторичные, меченные Alexa-488 (Invitrogen, США) в различных условиях. Для исследования внутриклеточного БТШ70 клетки перед окрашиванием антителами обрабатывались Тритоном Х-100. Локализованный на клеточной мембране БТ11170 был выявлен окрашиванием антителами без обработки детергентом. Обработку изображений проводили с помощью программы ImageJ (v. 1,46k).

Исследование экспрессии TLR-4 и TLR-2 рецепторов с использованием количественной ПЦР в реальном времени. Экспрессию TLR-4 и TLR-2 рецепторов макрофагов определяли с использованием количественной ПЦР в реальном времени. Суммарную РНК выделяли с помощью Tri-reagent (Sigma, США) из 1 млн. клеток.

Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop® ND_1000 (NanoDrop Technologies Inc., США). Для получения одноцепочечной кДНК в реакцию добавляли по 1 мкг суммарной РНК, предварительно обработанной ДНКазой I (Ambion, США), гексануклеотидпые праймеры и обратную трапскриптазу из набора RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (Fermentas, Литва). Для оценки уровня мРНК в качестве контрольного выбран ген B2m (beta-2 microglobulin) как наиболее подходящий для ЛПС-стимулированных моноцитов (Piehler et al., 2010). В работе использован сравнительный, или С/, метод, позволяющий оценить изменения уровня мРНК при двойном сравнении: исследуемого гена с контрольным в клетках, подвергнутых воздействию, по сравнению с нормальными образцами. Величина RQ - Relative Quantification представляет собой логарифмическое изменение уровня мРНК, которое измерялось с помощью программного обеспечения от Applied Biosystems, США.

Исследование внутриклеточных сигнальиых путей, с участием РГЗК, PLC, ERK, р38, .INK and NF-кВ при действии экзогенного БТШ70 и ЛПС. Ингибиторы CLI-0952 (ингибитор TLR, InvivoGen, США), вортманнин и LY294002 (ингибиторы PI3K), U73122 (ингибитор PLC), PD98059 (ингибитор ERKI), U0126 (ингибитор ERK1/2), SB203580 (ингибитор р38), SP600125 (ингибитор JNK) и Bay 11-7082 (ингибитор NF-кВ) фирмы Sigma, США инкубировали с клетками в течение 30 мин до внесения добавок БТШ70 и ЛПС. Для исследования защитного эффекта БТШ70, ЛПС добавляли к клеткам через 10 минут после БТШ70.

Статистическая обработка данных. Экспериментальные данные анализировали с помощью программы SigmaPlot. Результаты приводили в виде значений в процентах от контроля ± стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование влияния экзогенного БТШ70 на функциональную активность нейтрофилов, моноцитов н макрофагов при действии ЛТК н разных хемотипов ЛПС Е.

coli.

1.1. Влияние БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами при действии ЛТК и различных хемотипов ЛПС

Одной из стадий клеточного ответа на ЛПС и ЛТК является активация НАДФН оксидазы и генерация АФК. Исследование продукции АФК фагоцитами (нейтрофилами, моноцитами и макрофагами) при стимуляции ЛТК и различными хемотипами ЛПС, показало, что ЛТК и все хемотипы ЛПС активировали клетки, увеличивая значения ХЛ (рис. 1). Анализируя результаты рис. 1А, Б и В, можно сделать следующие выводы: изменения величины генерации АФК коррелируют с уменьшением длины полисахаридной цепи; наибольшей активирующей способностью обладает полноразмерная S-форма ЛПС; защитное действие БТШ70 также зависит от структуры хемотипа и коррелирует с размером молекулы ЛПС (наибольший защитный эффект БТШ70 проявляет по отношению к S-типу, наименьшее защитное действие наблюдается от Re-формы). Исключение составляют моноциты, в случае которых Ra-хемотип является самым мощным активатором продукции

АФК.

Инкубирование нейтрофилов с липотейхоевой кислотой (рис. 1Г) значительно повышало величину ХЛ нейтрофилов (200,0+7,5%) и моноцитов (145,0+4,7%) по сравнению с контролем. Предварительная экспозиция клеток с БТШ70 (перед добавлением ЛТК) снижала величину ХЛ клеток по сравнению с активацией в присутствии только ЛТК (соответственно, для нейтрофилов до 148,0+6,0% и моноцитов до 134,0+2,8%).

С S Ra Rc Rd Re

Ra Rc

Rd Re

Рис. 1. Влияние экзогенного БТШ70 на продукцию АФК нейтрофилами (А), моноцитами (Б) и макрофагами RAW 264.7 (В) при действии хемотипов ЛПС. С - контроль. S, Ra, Rc, Rd, Re -хемотипы ЛПС. а - без БТ11170, б - в присутствии БТШ70 (2 мкг/мл). Концентрация хемотипов ЛПС (А и Б) - 20 нг/мл; (В) - 1 мкг/мл. (Г) Влияние экзогенного БТШ70 на продукцию АФК нейтрофилами (а) и моноцитами (б) при действии ЛТК. 1 -контроль; 2 - БТШ70 (1 мкг/мл); 3 - ЛТК (1 мкг/мл); 4 - экспозиция клеток с БТШ70 в течение 10 минут перед добавкой ЛТК.

1.2. Влияние БТШ70 на продукцию TNF-a фагоцитами при действии ЛТК и различных хемотипов ЛПС

Была определена продукция TNF-a, нарабатываемая фагоцитами при действии ЛТК и различных хемотипов ЛПС. Анализируя результаты, показанные на рис. 2А, Б и В, можно заключить, что при продукции TNF-a проявляется тенденция снижения эффекта при сокращении длины полисахаридной цепи хемотипа ЛПС. Макрофаги RAW 264.7 нарабатывали самое большое количество TNF-a, 5,0+0,1 нг/мл, под действием S-формы ЛПС. Следует отметить, что при взаимодействии фагоцитов крови с БТШ70 происходит значительная индукция TNF-a (нейтрофилы - 21,0+0,7 пг/мл и моноциты - 22,0+4,1 пг/мл) по сравнению с контролем, что согласуется с Tamura et al., 2012. Но при предварительной обработке клеток с БТШ70 наблюдается отрицательный синергизм, заметно проявляющийся в отношении S-формы ЛПС.

в г

Рис. 2. Влияние экзогенного БТШ70 на продукцию TNF-a нейтрофилами (А), моноцитами (Б) и макрофагами RAW 264.7 (В) при действии хемотипов ЛПС (1 мкг/мл) (S, Ra, Rc, Rd, Re -хемотипы ЛПС). С- контроль, а - без БТШ70. б - в присутствии 2 мкг/мл БТШ70. (Г) на продукцию TNF-a нейтрофилами при действии ЛТК (1 мкг/мл). К - контроль, а - без БТШ70, б - в присутствии 5 мкг/мл БТШ70.

ЛТК также увеличивала продукцию TNF-a нейтрофилами (50,0±4,0 пг/мл), но менее значительно, чем при действии ЛПС. Предварительная обработка нейтрофилов БТШ70 до стимуляции ЛТК снижала продукцию данного цитокина до 32,0+3,0 пг/мл (рис. 2Г).

1.3. Влияние БТШ70 на ЛПС и ЛТК - индуцированный апоптоз нейтрофилов

ЛПС и ЛТК увеличивают продолжительность жизни циркулирующих в кровяном русле нейтрофилов, ингибируя их апоптоз. Исследование влияния разных концентраций БТШ70 (0,1 и 1 мкг/мл) на ЛПС-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов показало, что предварительная обработка этих клеток БТШ70 (за 10 мин до добавления ЛПС в концентрациях 1, 10, 100 и 1000 нг/мл) дозозависимо уменьшала ингибирование апоптоза нейтрофилов ЛПС (рис. ЗА). При концентрации ЛПС 100 нг/мл и БТШ70 1 мкг/мл защитное действие белка было максимальным, изменяя величину апоптоза с 32,0+2,8% (при действии ЛПС) до 62,0±3,5% (при предварительной обработке клеток с 1 мкг/мл БТШ70).

На рис. ЗБ видно, что ЛТК ингибировала апоптоз нейтрофилов (на 32%), а предварительная инкубация клеток с БТШ70 снижала это ингибирование, показывая его защитное действие. При этом БТШ70 в концентрации 5 мкг/мл ингибировал апоптоз на 18%.

Концентрация ЛПС. w/мп

Рис. 3. (А) Действие БТШ70 на индуцированный ЛПС апоптоз нейтрофилов. К - без ЛПС, 1- без БТШ70, 2 - с 100 нг/мл БТШ70, 3 - с 1 мкг/мл БТШ70. (Б) Действие БТШ70 на индуцированный ЛТК (5 мкг/мл) апоптоз нейтрофилов. а - контрольные клетки; б -клетки, инкубированные с 5 мкг/мл БТШ70. (А: сравнивали столбцы 1 и 3 в колонке К: р=0.003 (п=8); Б: сравнивали столбцы а и б в колонке ЛТК: р=0.001 (п=8)). Окрашивание Hoechst 33258 (0,5 мкг/мл).

Таким образом, показано, что S-форма ЛПС обладает максимальной стимулирующей активностью, в то время как Re-ЛПС, не имеющий кора и О-антигенной части, менее эффективен в активации исследуемых реакций фагоцитов. Показано, что экзогенный БТШ70 оказывает защитное действие, снижая индуцируемую ЛПС и ЛТК продукцию АФК, TNF-a, количество CD11Ь и TLR-4 рецепторов фагоцитов, а также замедляя апоптоз нейтрофилов.

2. Исследование влияния экзогенного БТШ70 на рецепторы CDllb нейтрофилов и TLR-4 моноцитов при действии разных хемотипов ЛПС Е coli

Мы исследовали влияние экзогенного БТШ70 на изменение количества рецепторов СИ11Ь нейтрофилами и ТЬК-4 моноцитами при действии ЛТК и различных хемотипов ЛПС.

Как видно на рис. 4А, прослеживается зависимость между структурой и величиной активирующего воздействия хемотипов ЛПС на изменение количества С011Ь рецепторов в мембране нейтрофилов. БТШ70 также незначительно увеличивал количество этих рецепторов. Обработка клеток в-формой ЛПС повышала количество СЭПЬ рецепторов до 220,0+6,0% по сравнению с контрольными клетками. Протективное действие БТШ70 от этого ЛПС было максимальным, снижая количество рецепторов до уровня, соответствующего действию самого белка (137,0+6,0%). Ке-хемотип имел минимальное активирующее воздействие на клетки.

Исследование действия ЛТК на изменение количества СОПЬЛЛ>18 рецепторов нейтрофилов показало, что ЛТК увеличивала количество этих рецепторов нейтрофилов (рис. 4Б), что согласуется с данными авторов работы (СаггагеШ е1 а1„ 1996). Предварительная экспозиция нейтрофилов с БТШ70 (до добавления ЛТК) снижала количество данных рецепторов, демонстрируя защитное действие БТШ70.

Рис. 4. Влияние экзогенного БТШ70 на изменение количества рецепторов CD1 lb нейгрофилами (А) и TLR-4 моноцитами (В) при действии хемотипов ЛПС (S, Ra, Rc, Rd, Re -хемотипы ЛПС. 100 нг/мл); (Б) на изменение количества рецепторов CD lib нейтрофилами при действии ЛТК (1 мкг/мл). а - без БТШ70, б - в присутствии БТШ70 (2 мкг/мл). (Б: сравнивали столбцы а и б в колонке К: р=0.001 (п=5); сравнивали столбцы а и б в колонке ЛТК: р=0.01 (п=5); В: сравнивали столбцы а и б в колонке С: р=0.009 (п=5); сравнивали столбцы а и б в колонке Rc: р=0.01 (п=5); сравнивали столбцы а и б в колонке Rd: р=0.05 (п=5)). А и Б- количество рецепторов определяли по связыванию анти-CDl I b-FTTC-MKAT; В-количсство рецепторов определяли по связыванию анти-Т1Л4-РЕ МКАТ.

Было исследовано влияние БТШ70 на изменение количества рецепторов TLR-4 моноцитами при действии различных хемотипов ЛПС (рис. 4В). Под действием S-формы ЛПС количество TLR-4 рецепторов увеличивается до 234,0+8,6%. При этом действие Rc, Rd и Re хемотипов практически не отличалось, увеличивая интенсивность поверхностной флуоресценции клеток TLR-4 до 150%. Инкубация моноцитов с БТШ70 незначительно увеличивает (П3,3±2,5% по сравнению с контролем) изменение количества TLR-4, что может быть связано с ролью БТШ70 как лиганда для этого рецептора (Asea el al„ 2002). Предварительная обработка моноцитов с БТШ70 (до добавления ЛПС) снижала индуцируемое ЛПС изменение количества TLR-4. Максимальное понижение наблюдалось от действия S-ЛПС, а минимальное от - Rd-ЛПС.

3. Исследование связывания, интерналнзацни экзогенного БТШ70 и его влияния на ЛПС-индуцированную экспрессию ТГ.К-2 и ТЬК-4 клетками врожденного

иммунитета.

3.1. Исследование кинетики процесса взаимодействия экзогенного рекомбинантного БТШ70 с клетками и определения его клеточной локализации

Для оценки механизма взаимодействия экзогенного БТШ70 с клетками на первом этапе была исследована кинетика связывания меченного А1еха 555 БТШ70 с клетками ТНР-1. Результаты флуоресцентной микроскопии (рис. 5А, Б) показывают, что БТШ70 быстро (в течение 5 минут) связывается с рецепторами на поверхности клеток. В течение 3 часов после

добавки БТШ70 происходит постепенное увеличение уровня флуоресценции и, соответственно, связывания БТШ70, с последующим распределением интенсивности флуоресценции и, предположительно, интернализацией БТШ70 внутрь клетки в течение 6 часов.

Затем были выполнены эксперименты по определению клеточной локализации белка на макрофагах КА\У 264.7. Был обнаружен БТШ70, локализованный на поверхности плазматической мембраны контрольных клеток (рис. 5В, 1а). Инкубация макрофагов с экзогенным БТШ70 приводит к увеличению локализованного на клеточной поверхности БТШ70 (рис. 5В, 2а; 220,2± 19,9%), который встраивается в плазматическую мембрану или связывается с клеточными рецепторами (агаШо ех а1, 2010). ЯА\У 264.7 показывают достаточно высокий уровень внутриклеточного конститутивного БТШ70 (рис. 5В, 16; 1371,7+89,3%). После их инкубирования с экзогенным БТШ70 происходит увеличение уровня внутриклеточного белка возможно за счет проникновения БТШ70 внутрь клетки (рис. 5В, 26; 2052,0+118,8%).

Контроль

5 мин

ЕД

5 мин 10 мин IS мт 20 ми 30 Ml

2ч Зч 4,5ч

Рис. 5. (А) Флуоресцентная микроскопия клеток ТНР-1 при взаимодействии с экзогенным белком БТШ70, меченным флуоресцентным зондом Alexa 555, в течение указанного времени.

(Б) Кинетика взаимодействия экзогенного БТШ70, меченного флуоресцентным зондом Alexa 555 (5 мкг/мл), с ТНР-1. (В) Взаимодействие экзогенного БТШ70 с клетками RAW 264.7. 1 - контрольные клетки; 2 - клетки, инкубированные с 5 мкг/мл БТШ70. а - пробы без обработки Тритоном X-100 (определение БТШ70 связанного с поверхностью клетки); б - пробы, обработанные с Тритоном Х-100 (определение внутриклеточного белка). Значения представлены в % от контрольных клеток без обработки Тритоном Х-100. Окрашивание МКАТ: первичные aHra-HSP70 и вторичные, меченные А1еха-488.

Таким образом, нами было показано, что экзогенный БТШ70 достаточно быстро (5 мин) связывается с цитоплазматической мембраной клеток и интернализуется внутрь клеток.

3.2. Влияние ингибитора ГЬК-4 сигнализации С1Л-095 на продукцию Т№-а нейтрофнламп и моноцитами

В предыдущих экспериментах нами было показано, что БТШ70 связывается с клеточной мембраной. В распознавании ЛТК и ЛИС участвуют, соответственно, Т1Л-2 и ТЬЯ-4 рецепторы фагоцитов. Из-за способности БТШ70 секретироваться клетками (йе Мто А., 2011) и активировать систему врожденного иммунитета, в последнее время предполагается, что БТШ70 тоже может связываться с Т1^1?-2 и ТЬЯ-4 рецепторами (Татига е1 а!., 2012). В связи с этим представляло интерес выяснить, насколько продукция цитокинов фагоцитами крови зависит от воздействия БТШ70 на ТЬЯ-4-зависимый путь передачи сигналов.

А Б

Я_ШП

Рис. 6. Влияние CL1-095 на продукцию TNF-a нейтрофилами (А) и моноцитами (Б) при действии ЛИС и БТШ70. 1 - контроль; 2 - БТШ70 (5 мкг/мл); 3 - ЛИС (1 мкг/мл); 4 -экспозиция клеток с БТШ70 в течение 10 минут перед добавкой ЛИС. а - в отсутствии ингибитора, б - в присутствии 1 мкг/мл CLI-095. (А: сравнивали столбцы а и б в 1: р=0.001 (п=4); сравнивали столбцы б в 1. 2, 3, 4: р=0.001 (п=4); Б: сравнивали столбцы а и бв2:р=0.001 (11=4)).

Для подавления TLR-4 - зависимой передачи сигнала использовался ингибитор CLI-095, который связывается с внутриклеточным доменом TLR-4 рецептора и, как следствие, блокирует передачу сигнала (Kawamoto et al., 2008). На рис. 6А, 2а и рис. 6Б, 2а, видно, что экзогенный белок БТШ70 вызывал некоторое увеличение продукции TNF-a нейтрофилами и моноцитами, но при предварительной обработке клеток (до добавления ЛИС) значительно снижал ЛПС-индуцированную продукцию TNF-a нейтрофилами (рис. 6А, 4а) и моноцитами (рис. 6Б, 4а). Инкубация нейтрофилов с CL1-095 практически полностью ингибирует продукцию TNF-a под действием БТШ70 и ЛИС (рис. 6А, 26 и 36). При предварительной обработке клеток с БТШ70 также происходит ингибирование TLR-4 - зависимой продукции TNF-a CLI-095 (рис. 6А, 46). Полученные результат!,i показывают, что БТШ70 влияет па TLR-4-зависимый путь клеточной активации продукции TNF-a. Продукция TNF-a нейтрофилами в присутствии CLI-095 и БТ11170 составляет 6,0+0,2 пг/мл, а в присутствии CLI-095. БТШ70 и ЛИС равняется 7,95+0,4 пг/мл, что оказывается несколько выше значения TNF-a при добавлении ингибитора CLI-095 и ЛИС (5,0+0,1 пг/мл). Эти данные позволяют предположить, что белок теплового шока БТШ70 взаимодействует не только с TLR-4 рецептором, но и с другими рецепторами. Одним из таких сигнальных рецепторов для БТШ70 может быть TLR-2 рецептор.

Как видно на рис. 6Б, CLI-095 значительно ингибирует TLR-4 путь трансдукции сигнала моноцитов при действии ЛПС, но менее эффективно, чем у нейтрофилов (рис. 6Б, 36 и 16). Известно, что данная концентрация CLI-095 является достаточной для ингибирования TLR-4-завиСимой передачи сигнала (Kawamoto et al., 2008). Это может быть обусловлено тем, что ЛПС связывается не только с TLR-4 клеток, но и с другими рецепторами, в

частности, с моезином, который может функционировать как рецептор для ЛПС или как дополнительная молекула для TLR-4 рецептора (Amar et al., 2001). Продукция TNF-a при инкубации клеток с БТШ70 менее подвержена ингибирующему действию CLI-095 (22,0±0,5 пг/мл (рис. 6Б, 2а) по сравнению с 12,0+0,6 пг/мл (рис. 6Б, 26) в присутствии ингибитора), что также может свидетельствовать о наличии альтернативного рецептора на клеточной мембране моноцитов.

3.3 . Влияние экзогенного БТШ70 на изменение количества TLR-2 и TLR-4

фагоцитами крови

Несмотря на появление работ, указывающих на то, что TLR-2 и TLR-4 могут выступать в роли рецепторов для связывания внеклеточного БТШ70, данные о его влиянии на количество этих рецепторов на клеточной мембране отсутствуют.

Рис. 7. Влияние экзогенного БТШ70 на изменение количества Ти*-2 (а) и Т1Л-4 (б) нейтрофилами (А) и моноцитами (Б) при действии ЛПС и БТШ70. 1 - контроль; 2 -БТШ70 (5 мкг/мл); 3 - ЛПС (1 мкг/мл); 4 - экспозиция клеток с БТШ70 в течение 10 минут перед добавкой ЛПС. (А: сравнивали столбцы 26 и 46: р=0.001 (п=4)). Окрашивание антителами: анти-ТЫ^-4-РЕ и анти-Т1Л-2-РЕ.

В связи с этим нами было исследовано изменение количества ТЬК-2 и на

клеточной мембране нейтрофилов и моноцитов при действии ЛПС и экзогенного БТ11170. ЛПС вызывает увеличение количества Т1Л*-4 (191,8±15,6%) и Т1^-2 (306,6+15,1%) на клеточной мембране нейтрофилов (рис. 7А, соответственно, 36 и За). При действии БТ11170 происходит увеличение количества Т1^-4 (251,2+19,9%; рис. 7А, 26) и Ти*-2 (152,8+7,0 %; рис. 7А, 2а). В то же время предварительная обработка с БТШ70 снижала ЛГ1С-индуцируемое количество Ти^-2 на клеточной мембране нейтрофилов, проявляя защитный эффект. Предварительная обработка нейтрофилов белком теплового шока БТШ70 до экспозиции с ЛПС также вызывала увеличение количества Т1Л<-4 рецептора (234,4+4,8%; рис. 7А, 46), показывая значения, сравнимые с величинами, полученными при обработке клеток только с БТШ70 (194,9+8,6%; рис. 7А, 26).

Экспозиция моноцитов с БТШ70 незначительно увеличивала количество Т1^-4 (112,0+3,1%; рис. 7Б, 26), а предварительная обработка клеток с БТШ70 снижала индуцируемое ЛПС количество ТЬК-4 (145,2+4,2%; рис. 7Б, 46) по сравнению с контролем. Исследование изменения количества Т1Л^-2 моноцитами при действии БТШ70 и ЛПС показало увеличение мембранного ТЦ<-2 при экспозиции моноцитов с БТ11170 (118,2±3,1%; рис. 7Б, 2а) и ЛПС (185,2+6,0%; рис. 7Б, За) и проявление защитного эффекта от действия ЛПС при предварительной экспозиции клеток с БТШ70 (136,3+3,7%, рис. 7Б, 4а).

Следует отметить, что нами исследовался достаточно короткий промежуток времени экспозиции клеток с ЛПС (30 минут), поэтому можно предположить, что увеличение

поверхностной экспрессии исследуемых рецепторов происходит за счёт внутриклеточного пула. Однако в ряде работ (Zhang el al., 2004), (Zhang et al., 2005) показано, что за исследуемый промежуток времени может осуществляться регуляция транскрипции генов. На сегодняшний день нет четкого представления о том, каким образом происходит модуляция экспрессии семейства TLR. Поэтому одной из наших задач было исследовать роль NF-кВ в изменении количества TLR-4 рецептора экзогенным БТШ70, поскольку данный транскрипционный фактор является заключительным звеном в TLR-4 - зависимой передачи сигнала.

3.4. Влияние ингибитора NF-кВ Bay 11-7082 па изменение количества TLR-4 рецептора моноцитами

Фактор транскрипции NF-кВ играет важную роль во многих клеточных процессах, таких как воспаление, иммунитет, клеточная пролиферация и апоптоз. Известно, что ЛПС активируют NF-кВ и, как следствие, транскрипцию генов, кодирующих цитокины, хемокины, молекулы адгезии и ингибиторы апоптоза (Oeckinghaus et al.,2011).

Рис. 8. Влияние Bay 1 1-7082 на изменение количества TLR-4 рецептора моноцитами при действии ЛПС и БТП170. I - контроль; 2 - БТ1Л70 (5 мкг/мл); 3 - ЛПС (1 мкг/мл); 4 - экспозиция клеток с БТШ70 в течение 10 минут перед добавкой ЛПС. а - в отсутствии ингибитора, б - в присутствии 2 мкМ Bay 11-7082. (Сравнивали столбцы а колонок 1 и 2: р=0.001 (п=4); сравнивали столбцы а и б в колонке 4: р=0.001 (п=4)). Окрашивание aHTH-TLR^-PE антителами.

В присутствии ингибитора NF-кВ (рис. 8) происходит снижение ЛПС-индуцируемого количества TLR-4 рецептора с 234,0+8,6% до 163,3+6,6% (рис. 8, соответственно, За и 36), что указывает на участие транскрипционного фактора NF-кВ в инициируемом ЛПС увеличении количества TLR-4 на цитоплазматической мембране моноцитов. Bay 1 1-7082 увеличивает количество TLR-4 контрольными клетками на 55% (рис. 8, 16). БТШ70 сам незначительно повышает уровень локализованного на клеточной мембране TLR-4 рецептора, а при обработке моноцитов с Bay 11-7082 наблюдается существенное увеличение количества TLR-4 рецептора, достигающее 221,9+9,1% (рис. 8, 26). Кроме того, Bay 11-7082 практически не влияет на защитный эффект БТШ70, поскольку количество TLR-4 на клеточной мембране в отсутствии и присутствии ингибитора отличается незначительно (соответственно, 169,3+4,1% и 181,1 + 14,1%; рис. 8, 4а и 46). Столь сильное повышение количества TLR-4 в контрольных и БТШ70-стимулируемых клетках в присутствии Bay 117082 может говорить о том, что NF-кВ является одним из отрицательных регуляторов количества TLR-4 в моноцитах при действии БТШ70.

II.

3.5. Влиянне экзогенного БТШ70 и теплового шока на экспрессию рецепторов TLR-2 и

TLR-4 макрофагами А Б

I I

й_

Рис. 9. Влияние экзогенного БТШ70 и теплового шока (ТШ) на экспрессию мРНК TLR-2 (А) и TLR-4 (Б) макрофагами RAW 264.7. 1 - контроль; 2 - БТШ70 (5 мкг/мл); 3 -ЛПС (1 мкг/мл); 4 - экспозиция клеток с БТШ70 в течение 10 минут перед добавкой ЛПС. а - при 37°С; б - ТШ (нагрев 42,5°С в течение 30 минут). ПЦР в реальном времени. RQ - Relative Quantification.

Известно, что при эндотоксиновом шоке происходит повышение уровня БТШ70 в крови (Gelain el al., 2011). Кроме того, в последнее время выдвигаются предположения о том, что БТШ70 является агонис гом TLR-2 и TLR-4 рецепторов. Предполагается также, что агонисты TLR могут влиять на регуляцию экспрессии этих рецепторов (Nhu el al., 2006). В связи с этим представляло интерес исследовать влияние ЛПС и теплового шока (ТШ, нагрев 42,5°С в течение 30 минут) на регуляцию экспрессии рецепторов TLR-2 и TLR-4.

Наши эксперименты показали, что при 37°С экзогенный БТШ70 незначительно увеличивал экспрессию мРНК TLR-2 (рис. 9А, 2а). С другой стороны, ЛПС вызывал значительное повышение экспрессии мРНК TLR-2 (рис. 9А, За), что согласуется с результатами публикации (Yao el al., 2011). Предварительная обработка макрофагов с БТШ70 до обработки с ЛПС также приводила к повышению экспрессии мРНК TLR-2 (рис. 9А, 4а).

При ТШ наблюдается уменьшение экспрессии мРНК TLR-2 (рис. 9А, 16) по сравнению с контрольными клетками без тепловой обработки (рис. 9А, 1а). Инкубация клеток RAW 264.7 с экзогенным БТШ70 также показывала пониженные значения уровня мРНК TLR-2 по сравнению с контролем (рис. 9А, 26).

ТШ приводит к снижению уровней мРНК TLR-2 клеток, обработанных ЛПС, а также прекондиционированных с БТШ70 до добавления ЛПС (соответственно, рис. 9А, 36 и рис. 9А, 46) по сравнению с клетками, не подвергнутыми ТШ.

На рис. 9Б видно, что экзогенный БТШ70 при 37°С практически не влияет на экспрессию мРНК TLR-4 (рис. 9Б, 2а). При действии ЛПС на клетки RAW 264.7 происходит достоверное снижение уровня мРНК TLR-4 (рис. 9Б, За) по сравнению с контрольными значениями (рис. 9Б, 1а), что согласуется с (Akaslti et al., 2000). При предварительной обработке клеток БТ1П70 до добавления ЛПС наблюдали снижение экспрессии TLR-4 (рис. 9Б, 4а), что указывает на преобладающее влияние ЛПС на экспрессию мРНК TLR-4.

ТШ клеток RAW 264.7 приводил к значительному увеличению количества мРНК TLR-4 рецептора (рис. 9Б, 16) по сравнению с контрольными клетками при 37°С (рис. 9Б, 1а). Инкубация макрофагов с экзогенным БТШ70 при ТШ также приводила к увеличению содержания мРНК TLR-4 (рис. 9Б, 26). При 42,5°С наблюдали увеличение экспрессии мРНК TLR-4 при действии ЛПС и при предварительной обработке клеток с БТШ70 до добавления ЛПС (рис. 9Б, 36 и 46, соответственно) по сравнению со значениями для макрофагов, инкубированных в тех же условиях при 37°С (рис. 9Б, За и 4а, соответственно).

Полученные результаты позволяют предположить, что экзогенный БТШ70 не влияет на активацию генов, контролирующих синтез TLR-4. При ТШ независимо от наличия экзогенного БТШ70 происходит увеличение транскрипции TLR-4 генов и нивелируется индуцируемое ЛПС снижение экспрессии TLR-4.

Таким образом, показано, что экзогенный БТШ70 увеличивает количество TLR-2 и TLR-4 рецепторов на клеточной мембране нейтрофилов и моноцитов, но не влиет на уровень мРНК TLR-2 и TLR-4 макрофагов. Предварительное инкубирование с БТШ70 до обработки ЛПС увеличивает количество TLR-4 на клеточной мембране нейтрофилов и снижает индуцируемое ЛПС количество TLR-4 моноцитов. В то время как предварительная обработка с БТШ70 до обработки с ЛПС уменьшает количество TLR-2 на цитоплазматической мембране нейтрофилов и моноцитов.

Поскольку фагоциты крови (нейтрофилы и моноциты) являются первой линией защиты организма от PAMPs, дальнейшие исследования были направлены на выявление внутриклеточных сигнальных путей, участвующих во взаимодействии фагоцитов крови с экзогенным БТШ70 и ЛПС.

4. Изучение внутриклеточных сигнальных путей, задействованных экзогенным белком БТШ70, в защите фагоцитов при действии ЛПС.

4.1. Исследование участия внутриклеточных сигнальных молекул в продукции АФК фагоцитами крови при действии экзогенного БТШ70 и ЛПС

Нами было исследовано действие различных концентраций ингибиторов внутриклеточных сигнальных путей. На рис. 10 и 11 показаны результаты действия наиболее эффективных концентраций ингибиторов. Известно, что сборка и активация НАДФН-оксидазы напрямую зависят от активации фосфолипазы С (PLC) и фосфатидилинозитол 3 киназы (PI3K). Полученные нами данные подтверждают важность PLC в генерации АФК fMLP - стимулируемыми нейтрофилами и в ЛПС-индуцированной активации НАДФН-оксидазы, поскольку ингибитор PLC U73122 снижает продукцию АФК контрольных (на 54,6+5,6%; рис. 10) и обработанных ЛПС клеток (с 233±11,8% до Зб,8±7,8%). В случае моноцитов картина несколько отличается. U73122 не снижает стимулируемую fMLP генерацию АФК моноцитами (рис. 10; 113,7±3,5%), но уменьшает индуцируемый ЛПС респираторный взрыв (с 214,б±13,9% до 149,4±7,8%). Также нами показано, что экспозиция нейтрофилов и моноцитов (соответственно, рис. 10 и 11) с БТШ70 аннулирует действие U73122. В работе Евдонина и коллег было показано, что ингибирование активности PLC ингибитором U73122 заканчивалось быстрым (10 минут) уменьшением содержания внутриклеточного БТШ70 (Evdonin et al., 2004). Исходя из этого, можно предположить, что U73122 ингибируег PLC, приводя к снижению внутриклеточного и повышению внеклеточного БТШ70, а истощение внутриклеточного белка в свою очередь приводит к повышению активации НАДФН-оксидазы, компенсируя участие PLC в процессе генерации АФК.

На рис. 10 и 11 видно, что инкубация нейтрофилов и моноцитов с вортманнином снижает продукцию АФК контрольными и ЛПС-индуцированными клетками. Однако, ингибирование ЛПС-индуцированных клеток не достигает уровня ХЛ клеток, обработанных только вортманнином. Это может говорить о том, что ЛПС для индукции АФК использует не только PI3K - зависимую передачу сигнала, но и другие сигнальные молекулы для активации НАДФН-оксидазы. При этом вортманнин не воздействует на продукцию АФК нейтрофилами (рис. 10) и моноцитами (рис. 11) при действии БТШ70. Также ингибирование вортманнином ХЛ не наблюдалось при предварительной экспозиции нейтрофилов и моноцитов с БТШ70 до добавления ЛПС.

I 200

X ~

in,In

Рис. 10. (А) Влияние U73122 (1 мкг/мл), вортманнина (10 нг/мл), LY294002 (10 мкг/мл), Bay 11-7082 (2 мкг/мл); (В) PD98059 (1 мкг/мл), U0126 (50 мкг/мл), SB203580 (0,5 мкг/мл), SP600125 (20 мкг/мл) на продукцию АФК нейтрофилами при действии ЛПС (20 нг/мл) и БТШ70 (5 мкг/мл).

Также для исследования влияния PI3K на продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами использовался еще один ингибитор PI3K - LY294002. Как показано на рис. 10 и 11 LY294002 снижал fMLP-стимулируемую и активированную ЛПС ХЛ нейтрофилов (рис. 10) и моноцитов (рис. 11). LY294002 также значительно понижал интенсивность ХЛ нейтрофилов и моноцитов в присутствии БТШ70. Ингибирующий эффект LY294002 проявлялся в отношении нейтрофилов и моноцитов, предварительно обработанных с БТШ70 до добавления ЛПС.

А Б

U73 Wort LY

ÉLlá

С PD

Рис. 11. Влияние U73122 (1 мкг/мл), вортманнина (50 нг/мл), LY294002 (2 мкг/мл), Bay 11-7082 (2 мкг/мл) (A); PD98059 (1 мкг/мл), U0126 (25 мкг/мл), SB203580 (0,5 мкг/мл), SP600125 (20 мкг/мл) (Б) на продукцию АФК моноцитами при действии ЛПС (20 нг/мл) и БТШ70 (5 мкг/мл).

Возможно, различное действие LY294002 и вортманнина связано с селективностью данных соединений. Показано, что LY294002 сильнее, чем вортманнин инактивирует путь PI3K - протеинкиназа В (РКВ) (Lee et al., 2013). Можно предположить, что PI3K участвует во внутриклеточных событиях, запускаемых взаимодействием нейтрофилов с БТШ70. Кроме того, наши результаты позволяют предположить об участии РКВ в инициируемом экзогенным БТШ70 внутриклеточном сигнальном пути при генерации АФК. Данные выводы согласуются с результатами работы (Lee et al., 2013), где показано, что экзогенный БТШ70, связываясь с TLR-4 при участии Р13К/ РКВ пути, вызывал индукцию синтеза БТЩ70.

Известно, что под действием fMLP происходит фосфорилирование всех трех митоген-активируемых протеинкиназ (MAP киназ): регулируемые внеклеточным сигналом киназы 1 и 2 (ERK1/2), р38 киназа и c-Jun N-терминальная киназа (JNK/SAPK).

Как видно на рис. 10, U0126 ингибировал генерацию АФК контрольными нейтрофилами, в отличие от PD98059, который не влиял на продукцию АФК. Кроме того, экспозиция с ингибитором ERK1/2 U0126 не влияла на продукцию АФК нейтрофилами, обработанными с БТШ70. А при экспозиции нейтрофилов с ингибитором ERK1 PD98059 в присутствии БТШ70 незначительно увеличивались значения ХЛ с 85,8±5,1% до 111,1±5,1%. Данные результаты показывают, что ERK1/2 не участвуют в fMLP-стимулируемом образовании АФК, также как и в продукции АФК при взаимодействии нейтрофилов с БТШ70. При этом наблюдается сильное ингибирование ЛПС-индуцируемых нейтрофилов U0126 (рис. 10), что подчеркивает независимую от стимуляции fMLP роль ERK1/2 в TLR4-зависимой активации НАДФН-оксидазы под действием ЛПС.

Мы показали, что различные ингибиторы ERK по-разному действуют на продукцию АФК в присутствии БТШ70. Ингибирование ERK1/2 U0126 снижает значения ХЛ при предварительной обработке нейтрофилов с БТШ70 до обработки с ЛПС ниже уровня ХЛ нейтрофилов, обработанных только U0126. При этом ингибитор ERK1 PD98059 не понижал продукцию АФК в условиях предварительной инкубации клеток с БТШ70 до добавления ЛПС. Это может говорить о том, что защитный эффект БТШ70 от действия ЛПС реализуется с участием ERK2.

Ингибитор ERK1/2 U0126 в 2 раза снижал fMLP - стимулируемую продукцию АФК моноцитами. Однако ингибитор ERK1 PD98059 не влиял на генерацию АФК контрольными моноцитами, что может быть связано с тем, что ERK2 в большей степени задействована в активации НАДФН оксидазы при стимуляции fMLP моноцитов. U0126 и PD98059 в равной степени снижали индуцируемое ЛПС образование АФК моноцитами. Возможно, что при действии ЛПС на моноциты в числе прочих сигнальных молекул активируется ERK1/2, что запускает сборку субъединиц НАДФН-оксидазы.

Инкубация моноцитов с PD98059 (рис. 11) - ингибитором ERK1 - практически не влияла на генерацию АФК в присутствии БТШ70. Также данный ингибитор снижал интенсивность ХЛ предварительно обработанных с БТШ70 моноцитов практически до значений, соответствующих значениям клеток, обработанных только с ингибитором. Однако, ингибитор ERK1/2 U0126 снижал продукцию АФК моноцитами, инкубированными с БТШ70 и ХЛ моноцитов, предварительно обработанных БТШ70 до добавления ЛПС, до значений близких к значениям клеток, обработанных только ингибитором. Можно сделать предположение, что ERK2 вовлечена в реализацию защитного эффекта экзогенного БТШ70 от действия ЛПС. Кроме того, авторами работы (Lee et al., 2013) было показано, что экзогенный БТШ70 при связывании с TLR4 активирует ERK, которая, в свою очередь, является ингибитором синтеза внутриклеточного БТШ70.

Видно, что ингибирование JNK снижает fMLP-стимулируемую ХЛ контрольных и инкубированных с ЛПС нейтрофилов и моноцитов (рис. 10 и 11). Кроме того, наблюдается сильное ингибирование генерации респираторного взрыва клетками, инкубированными с БТШ70 и клетками, предварительно обработанными с БТШ70 до введения ЛПС. Данные результаты подтверждают, что экзогенный БТШ70 вовлекает сигнальные пути с участием JNK (при генерации АФК фагоцитами).

Нами показано (рис. 10), что инкубация с SB203580 не влияла на ХЛ контрольных нейтрофилов, однако снижала величину ХЛ моноцитов (до 54,0±6,7%; рис. 11). При этом ингибитор р38 МАРК снижал вызванную ЛПС ХЛ до уровня ХЛ клеток в присутствии этого блокатора, подтверждая важную роль р38 МАРК в образовании АФК нейтрофилами и моноцитами под действием ЛПС. Также SB203580 снижает значения ХЛ нейтрофилов, предварительно инкубированных с БТШ70 до обработки с ЛПС. Однако он не снижал образование АФК нейтрофилами, экспонированными с БТШ70, что может указывать на отсутствие участия р38 МАРК в активации НАДФН оксидазы при стимуляции fMLP и продукцию АФК в присутствии БТШ70. Однако, можно предположить, что р38 МАРК участвует в защитном действии экзогенного БТШ70 при активации клеток ЛПС.

Ингибитор NF-кВ Bay 11-7082 вызывает снижение генерации АФК fMLP-стимулируемых нейтрофилов (рис. 10), подчеркивая роль NF-кВ в стимулируемой fMLP

продукции АФК нейтрофилами. Кроме того, Bay 11-7082 значительно понижает ЛПС-индуцируемую продукцию АФК, тем самым полностью ингибируя индуцируемую ЛПС передачу сигнала. Bay 11 -7082 значительно снижал величину ХЛ нейтрофилов, инкубированных с БТШ70. Наиболее сильное ингибирование наблюдалось при комбинированном воздействии на клетки Bay 11-7082, БТШ70 и ЛПС, что позволяет предположить, что NF-кВ участвует в защитном эффекте БТШ70 от действия ЛПС (рис. 10).

В случае генерации респираторного взрыва моноцитами ингибитор NF-kB увеличивает генерацию АФК fMLP-стимулируемыми моноцитами (рис. 11), данные

___£ТШ70

- i

■ ЛПС

|БТ^7С+ЛПС

МуС88-эависимый путь TRIF-зависимый путь сигнальные пути, запускаемые fMLP

* V4acrns з защитном де?ствии БТШ7С отсутствие действия

А увеличение ^ снижение

T4F-a L-12 INF-a.ß DNA

IL-lß L-8

Рис. 12. Влияние ингибиторов сигнальных путей на продукцию АФК нейтрофилами.

LP¿ äTJJ70

чонтролз I 5T1Í.70 |ЛПС

■етшттлгс

NAC = H

- Му088-зависимый путь ох dase

—— ТШР-эааисимым путь

• сигнальные пути, запускаемые TV1LP

Д увеличение TNF-a IL-12 4F-a,ß DNA

V снижение * Уыас-ие в зенитном действии ЕТШ70 )L_g

О отсутствие ¿ейсвия

Рис. 13. Влияние ингибиторов сигнальных путей на продукцию АФК моноцитами.

результаты согласуются с данными статьи (Zanotto-Filho et al, 2010). При этом также наблюдается сильное повышение ЛПС-индуцируемой генерации АФК моноцитами при действии БТШ70 и при предварительной обработке моноцитов с БТШ70 до обработки с ЛПС. Повышение продукции АФК в присутствии ингибитора может говорить о том, что NF-кВ служит отрицательным регулятором активации НАДФН оксидазы в данной клеточной модели.

Обобщенные результаты наших исследований по участию внутриклеточных сигнальных молекул в продукции АФК иейтрофилами и моноцитами при действии экзогенного БТШ70 и ЛПС схематично представлены, соответственно, на рис. 12 и рис. 13. Как следует из этих рисунков в реализации защитного действия БТШ70 от ЛПС у нейтрофилов принимает участие ERK2, а у моноцитов - ERK1/2. Кроме того, при взаимодействии экзогенного БТШ70 с иейтрофилами р38 МАРК не вовлечена в процесс генерации АФК, по участвует в защитном эффекте БТШ70 от действия ЛПС, а в случае моноцитов р38 МАРК задействована и в трапсдукции сигнала БТШ70 и в защитном эффекте БТШ70.

4.2 Влннние ингибитора NF-кВ Bay 11-7082 на продукцию TNF-a фагоцитами крови

Связывание ЛПС с TLR-4 приводит к Му088-зависимой активации NF-кВ и последующему выделению провоспалительных цитокинов, в частности, TNF-a. В связи с этим представляет значительный интерес исследовать участие NF-кВ в трапсдукции сигнала БТШ70. Ингибитор NF-кВ наиболее сильно понижает продукцию этого цитокина, стимулируемую ЛПС, с 48,0±1,5 пг/мл до 11,3±0,9 пг/мл иейтрофилами (рис. 14А, За и 36). Однако Bay 11-7082 усиливает индуцируемое БТШ70 выделение TNF-a до 17,0±0,85 пг/мл по сравнению с 6,1:10,5 пг/мл без ингибитора (рис. 14А, 2а и 26). Это позволяет предположить, что для инициирования секреции TNF-a экзогенный белок использует NF-kB - независимый путь. Возможно, что БТШ70 индуцирует синтез TNF-a, активируя транскрипционный фактор АР-1, который также контролирует синтез провоспалительных цитокинов. NF-кВ и АР-1 находятся в тесном взаимодействии между собой и могут иметь общие внутриклеточные каскады трапсдукции сигнала (Oeckinghaus et al., 2011). С этим может быть связано и отсутствие защитного эффекта при инкубации нейтрофилов с блокатором NF-кВ, поскольку продукция цитокина увеличивается по отношению к уровню, наблюдаемому при инкубации клеток с ингибитором и ЛПС (соответственно, защитный эффект без ингибитора - 22,0+0,75 пг/мл и в присутствии ингибитора- 19,0±0,4 пг/мл (рис. 14А, 4а и 46)).

Подобные результаты были получены на клетках ТНР-1. В этих клетках экзогенный БТШ70 вызывал значительную продукцию TNF-a (36,5±1,7 пг/мл; рис.14Б, 2а) по сравнению с контрольными клетками (4,0±0,3 пг/мл; рис.14Б, 1а), в то же время БТШ70 демонстрирует протективное в отношении ЛПС действие, подавляя уровень секреции исследуемого цитокина до уровня индуцируемого самим белком, аннулируя влияние эндотоксина (рис.14Б, 4а). Интересно, что при инкубации ТНР-1 с Bay 11-7082 увеличивается продукция TNF-a контрольными клетками (21,0+0,95 пг/мл; рис. 14Б, 16) и стимулируемыми с БТШ70 (44,0±1,1 пг/мл; рис. 14Б, 26), но значительно понижается ЛПС-индуцируемая продукция (15,0±0,6 пг/мл; рис. 14Б, 36). При предварительной обработке клеток с БТШ70 в присутствии ингибитора NF-кВ продукция TNF-a снижается по сравнению со значениями без ингибитора (рис. 14Б, 4а и 46).

Рис. 14. Влияние Bay 11-7082 на продукцию TNF-a нейтрофилами (А) и ТНР-1 (Б) при действии ЛПС и БТШ70. 1 - контроль; 2 - БТШ70 (5 мкг/мл); 3 - ЛПС (1 мкг/мл); 4 -экспозиция клеток с БТШ70 в течение 10 минут перед добавкой ЛПС. а - в отсутствии ингибитора, б - в присутствии 2 мкМ Bay 11-7082. (А: сравнивали столбцы а и б в колонке 1: р=0.001 (п=5); сравнивали столбцы а в колонках 1 и 2: р=0.001 (п=5); А: сравнивали столбцы а и б в колонке 4: р=0.001 (п=5)).

Таким образом, нами показано, что БТШ70 влияет на внутриклеточные сигнальные пути, с участием PLC, Р13К, р38, ERK, JNK и NF-кВ, вовлеченные в продукцию АФК. NF-kB является отрицательным регулятором индуцируемой БТШ70 продукции TNF-a и количества TLR-4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные экспериментальные данные, имеющиеся в научной литературе, не позволяют сделать однозначный вывод о механизме влияния внеклеточного (экзогенного) БТШ70 на клетки врожденного иммунитета. Это связано с тем, что ряд исследователей обнаруживал у внеклеточного рекомбинантного БТШ70 провосиалительную активность, что в определенной степени может быть обусловлено контаминацией БТШ70 компонентами бактериальных клеток (PAMPs).

В наших экспериментах использовался препарат рекомбинантного БТШ70, экспрессированного в клетках шелкопряда, который свободен от контаминации с ЛПС. В представленной работе мы показываем, что данный препарат БТШ70 имеет провоспалительные свойства, инициируя продукцию цитокинов (в частности, TNF-a) фагоцитами. В тоже время мы показываем, что БТШ70 обладает и защитным действием на клетки врожденного иммунитета, снижая индуцируемые PAMPs (в частности, ЛПС) клеточные реакции. В настоящее время механизмы регуляции сигнальных путей клеток врожденного иммунитета при действии экзогенного белка теплового шока БТШ70 изучены недостаточно. Практически не исследованы эти механизмы при действии ЛПС разной структуры (хемотипов ЛПС).

Нами получены уникальные данные, показавшие способность экзогенного БТШ70 защищать клетки не только от действия ЛПС, но и от действия различных хемотипов ЛПС, а также от действия ЛТК, что может говорить об уникальных модулирующих свойствах БТШ70, так как ЛПС и ЛТК используют разные рецепторы и различные механизмы для активации клеток. В представленном исследовании показано, что экзогенный БТШ70 воздействует как на клеточные рецепторы клеток врожденного иммунитета, так и на внутриклеточные сигнальные пути этих клеток, причем действие БТШ70 зависит от типа клеток и от структуры ЛПС. Показано, что экзогенный БТШ70 увеличивает количество рецепторов TLR-2 и TLR-4 на клеточной мембране нейтрофилов и моноцитов за счет внутриклеточного пула данных рецепторов. Кроме того, выявлено влияние экзогенного

БТШ70 на внутриклеточные сигнальные пути с участием PLC, PI3K, р38, ERK, JNK и NF-kB, вовлеченные в продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами при действии ЛПС.

Полученные результаты позволяют рассматривать возможность использования БТШ70 в качестве основы для создания перспективных лекарственных препаратов для защиты млекопитающих от действия эндотоксинов.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что предварительная обработка клеток с экзогенным БТ11170 снижает индуцируемое различными хемотипами ЛПС Е. coli увеличение продукции АФК и TNF-a нейтрофилами, моноцитами и макрофагами.

2. Установлено, что предварительная обработка клеток с экзогенным БТШ70 снижает индуцируемое хемотипами ЛПС увеличение количества CDllb рецепторов на клеточной мембране нейтрофилов и TLR-4 моноцитов.

3. Предварительная инкубация нейтрофилов с БТШ70 замедляет индуцируемое ЛПС и ЛТК ингибирование апоптоза нейтрофилов.

4. Обнаружено, что экзогенный БТШ70 быстро (в течение 5 минут) связывается с поверхностью клеток ТНР-1. На клетках RAW 264.7 показано, что происходит интернализация БТШ70 внутрь этих клеток.

5. Показано, что экзогенный БТШ70 увеличивает продукцию TNF-a нейтрофилами и моноцитами с участием преимущественно TLR-4 - зависимой передачи сигналов.

6. Экзогенный БТШ70 увеличивает количество рецепторов TLR-2 и TLR-4 па клеточной мембране нейтрофилов и моноцитов и не влияет на уровень экспрессии мРНК TLR-2 и TLR-4 рецепторов макрофагов RAW 264.7.

7. Предварительное инкубирование с БТШ70 до обработки ЛПС повышает количество рецепторов TLR-4 на клеточной мембране нейтрофилов и снижает количество TLR-4 рецепторов моноцитов. При этом количество TLR-2 рецепторов на цитоплазматической мембране нейтрофилов и моноцитов снижается.

8. Показано, что БТШ70 влияет на внутриклеточные сигнальные пути с участием PLC, PI3K, р38, ERK, JNK и NF-kB, вовлеченные в продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах

1. Юринская M. М„ Евгеньев М. Б., Антонова О. Ю.. Винокуров М. Г. Экзогенный белок теплового шока БТШ70 подавляет активацию нейтрофилов человека под действием бактериальных патогенов // Доклады Академии Наук, 2010, том 435, № 3, с. 407—410.

2. Vinokurov M., Ostrov V., Yurinskaya M., Garbuz D., Murashev A., Antonova P.. Evgen'ev M. Recombinant human HSP70 protects against lipoteichoic acid-induced inflammation manifestations at the cellular and organismal levels // Cell Stress and Chaperones. 2012. V. 17. №1. P. 89-101.

3. Антонова О. Ю., Юринская M. M., Евгеньев M. Б., Сусликов А. В., Винокуров М. Г. Защитная роль экзогенного белка теплового шока БТШ70 при действии различных хемотипов липополисахарида на фагоциты крови человека // Доклады Академии Наук, 2012, том 447, № 1, с. 98-102.

4. Антонова О. Ю.. Юринская M. М., Евгеньев М. Б., Винокуров М. Г. Роль TLR-зависимого сигнального пути в механизме защиты фагоцитов экзогенным белком теплового шока БТШ70 от действия эндотоксинов // Доклады Академии Наук, 2013 (в печати).

Статьи в сборниках

1. Антонова О.Ю.. Юрниская М.М., Грачев С. В., Винокуров М. Г. ß- адреноблокатор пропранолол модулирует активацию и апоптоз нейтрофилов при действии липополисахаридов // Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 2011. С. 568-572.

2. Antonova О. Y„ Yurinskaya М. М., Evgen 'ev М. В., Suslikov А. V., Vinokurov М. G. Heat shock proteins (HSP70) inhibit lipopolysaccharide-induced activation of human neutrophils // Biological mobility: from fundamental achievements to nanotechnologies. Pushchino.2010. P. 19-22.

3. Antonova O.Y., Yurinskaya M.M., Evgen'ev M.B., Vinokurov M. G. Effect of lipopolysaccharide structure on the functional activity of human blood phagocytes // Biological mobility: fundamental and applied science. Pushchino. 2012. P. 20-22.

Тезисы докладов

1. Антонова О.Ю., Юринская М.М., Винокуров М.Г. Экзогенный белок теплового шока БТШ70 снижает активацию фагоцитов крови человека при действии хемотипов липополисахаридов // 14-ая Международная Пущинская школа-конферепция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино. 2010. С. 199-200.

2. Наумов A.A., Антонова О.Ю.. Поцечуева М.М. Модификация хемилюминесцентного метода регистрации активных форм кислорода в биохимических и химических системах использованием энхансеров // 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино. 2010. С. 85-86.

3. Антонова О.Ю., Юринская М.М., Винокуров М. Г. Экзогенный белок теплового шока БТШ70 защищает клетки иммунной системы от действия бактериальных патогенов // 15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология -наука XXI века". Пущино. 2011. С. 114-115.

4. Антонова О.Ю., Юринская М.М., Винокуров М.Г. Исследование механизмов активации фагоцитов человека и животных при действии разных хемотипов эндотоксинов // XIX-ая международная школа-конференция «Математика. Компьютер. Образование». Дубна. 2012. С. 15.

5. Антонова О.Ю.. Юрниская М.М., Винокуров М. Г. Исследование механизмов защиты клеток врожденного иммунитета внеклеточным белком теплового шока БТШ70 от действия липополисахаридов и липотейхоевой кислоты // 16-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино. 2012. С. 53-54.

6. Антонова О.Ю., Юринская М.М., Евгеньев М.Б., Винокуров М.Г. Экзогенный белок теплового шока человека БТШ70 индуцирует толерантность к липополисахаридам миелоидных клеток // Всероссийская молодежная конференция «Актуальные проблемы химии и биологии». Пущино. 2012. С. 46-47.

7. Антонова О.Ю., Юринская М.М., Евгеньев М.Б., Винокуров М.Г. Исследование механизма взаимодействия экзогенного белка теплового шока БТШ70 с фагоцитами крови человека при действии ЛПС различной структуры // II Всероссийская школа-конференция молодых учёных с международным участием «Биология будущего: традиции и новации». Екатеринбург. 2012. С. 231-234.

Подписано в печать 06.03.2013 г.

Усл.п.л. - 1.5 Заказ №12626 Тираж: 100 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.rn

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Антонова, Ольга Юрьевна, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201354927

АНТОНОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

МОДУЛИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ ЭКЗОГЕННОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА (БТШ70) НА КЛЕТКИ ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ РАЗНОЙ СТРУКТУРЫ

03.01.04 - Биохимия

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук М. Г. Винокуров

Пущино, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................6

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................8

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.............................................................13

1.1. Клетки врожденного иммунитета...........................................................13

1.2. Липополисахариды...................................................................................16

1.2.1. Строение молекулы ЛПС. Хемотипы ЛПС......................................17

1.2.2. Физико-химические свойства молекулы ЛПС................................20

1.2.3. Механизм взаимодействия ЛПС с клеткой......................................24

1.3. Липотейхоевая кислота............................................................................31

1.4. Белки теплового шока..............................................................................33

1.4.1. Строение молекулы БТШ70..............................................................34

1.4.2. Внутриклеточные функции БТШ70..................................................35

1.4.2.1. Антиапоптотическая роль БТШ70..............................................37

1.4.2.2. Противовоспалительные функции БТШ70................................39

1.4.3. Внеклеточный БТШ70........................................................................40

1.4.3.1. Механизмы выхода БТШ70 из клетки.......................................41

1.4.3.2. Взаимодействие внеклеточного БТШ70 с клетками врожденного иммунитета...........................................................................46

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................53

2.1. Объекты исследования...............................................................................53

2.2. Методы исследования.................................................................................54

2.2.1. Исследование продукции АФК с использованием люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ)..........................................................54

2.2.2. Определение секреции ТМмх.............................................................55

2.2.3. Исследование кинетики процесса взаимодействия экзогенного БТШ70 с клетками..........................................................................................55

2.2.4. Определение изменения количества ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 на клеточной мембране методом флуоресцентной микроскопии.....................................55

2.2.5. Определение изменения количества CD1 lb на клеточной мембране

методом проточной цитометрии...................................................................56

2.2.6. Определение клеточной локализации экзогенного БТШ70.............56

2.2.7. Исследование экспрессии TLR-4 и TLR-2 рецепторов с использованием количественной ПЦР в реальном времени......................57

2.2.8. Исследование внутриклеточных сигнальных путей с участием PI3K, PLC, ERK, р38, JNK and NF-кВ при действии экзогенного БТШ70 и ЛПС. 58

2.2.9. Использованные реактивы.................................................................58

2.2.10. Статистическая обработка данных................................................59

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ...............................................59

3.1. Определение оптимальных условий для исследования защитного

эффекта экзогенного БТШ70 на продукцию АФК макрофагами RAW 264.7 ..............................................................................................................................59

3.1.1. Исследование влияния времени инкубации и различных концентраций ЛПС на продукцию АФК клетками RAW 264.7................59

3.2. Исследование влияния экзогенного БТШ70 на функциональную активность нейтрофилов, моноцитов и макрофагов при действии разных хемотипов ЛПС Е. coli.......................................................................................60

3.2.1. Влияние БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами при действии ЛТК и различных хемотипов ЛПС...............................................................60

3.2.2. Влияние БТШ70 на продукцию TNF-a фагоцитами при действии ЛТК и различных хемотипов ЛПС...............................................................63

3.2.3. Действие БТШ70 на ЛПС и ЛТК - индуцированный апоптоз нейтрофилов....................................................................................................65

3.3. Исследование влияния экзогенного БТШ70 на рецепторы CD1 lb нейтрофилов и TLR-4 моноцитов при действии разных хемотипов ЛПС Е. coli........................................................................................................................66

3.4. Исследование взаимодействие экзогенного БТШ70 с фагоцитами.......69

3.4.1. Исследование кинетики процесса взаимодействия экзогенного рекомбинантного БТШ70 с клетками и определения клеточной локализации.....................................................................................................69

3.4.2. Влияние ингибитора TLR-4 сигнализации CLI-095 на секрецию TNF-a нейтрофилами и моноцитами............................................................71

3.4.3. Влияние экзогенного БТШ70 на изменение количества TLR-2 и TLR-4 фагоцитами крови...............................................................................73

3.4.4. Влияние ингибитора NF-кВ Bay 11-7082 на изменение количества TLR-4 рецептора моноцитами.......................................................................75

3.4.5. Влияние экзогенного БТШ70 и теплового шока на экспрессию рецепторов TLR-2 и TLR-4 макрофагами....................................................76

3.5. Изучение внутриклеточных сигнальных путей, задействованных экзогенным белком БТШ70, в защите фагоцитов при действии ЛПС.........79

3.5.1. Исследование участия внутриклеточных сигнальных молекул в продукции АФК фагоцитами крови при действии экзогенного БТШ70 и ЛПС..................................................................................................................79

3.5.1.1. Влияние ингибитора фосфолипазы С U73122 на продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами...........................................................79

3.5.1.2. Влияние ингибиторов фосфатидилинозитол 3-киназы (PI3K) вортманнина (wortmannin) и LY294002 на продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами.....................................................................81

3.5.1.3. Влияние ингибиторов МАРК на продукцию АФК

нейтрофилами и моноцитами.....................................................................83

3.5.1.2. Влияние ингибитора NF-кВ Вау-11-7082 на продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами.....................................................................87

3.5.2. Влияние ингибитора NF-кВ Bay 11-7082 на секрецию TNF-a фагоцитами крови...........................................................................................97

ВЫВОДЫ............................................................................................................100

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................101

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ БЛАГОДАРНОСТИ..........................................

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АР-1 - транскрипционный фактор CCL - лиганд СС хемокина

CD - дифференцировочные антигены лейкоцитов

CD 14 - дифференцировочный антиген моноцитов и макрофагов

CMC - критическая концентрация мицеллобразования

CXCL - лиганды хемокинов, содержащих С-Х-С мотив

DAMPs - damage-associated molecular patterns - молекулярные структуры,

ассоциированные с повреждением

ERK - регулируемая внеклеточным сигналом киназа

FITC - флуоресцеинизотиоцианат

fMLP - formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine

IKK - 1кВ киназа

IL - интерлейкины

INF - интерфероны

1RF - интерферон - регулирующий фактор

IRAK - киназа, ассоциированная с рецептором для интерлейкина-1 HBSS - раствор Хенкса

KDO - 2-кето-З-дезоксиоктулозоновая кислота

JNK - c-Jun N-терминальная киназа

LBP - липополисахарид - связывающий белок

LOX-1 - лектин -подобный рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности

МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа

MD2 - миелоидный белок дифференциации

MyD88 - миелоидный дифференцировочный фактор 88

NF-к - ядерный фактор каппа В

NK - натуральные киллеры

NO - оксид (окись) азота

PBS - фосфатный буфер

PAMPs - pathogen-associated molecular patterns - патоген-ассоциированные

молекулярные структуры

PI3K - фосфатидилинозитол 3 киназы

PLC - фосфолипаза С

РМА - форбол-12-миристат-13-ацетат

PRRs - паттернраспознающие рецепторы

SREC - скавенджер рецепторы эпителиальных клеток

SR - скавенджер рецепторы

TIR - То11-интерлейкин-1-рецепторный домен

TIRAP - TIR-доменсодержащий адаптерный белок

TLR - Толл-подобный рецептор

TNF-a - фактор некроза опухоли - a

TRIF - TIR-доменсодержащий адаптерный белок, индуцирующий Р-интерферон

АПК - антиген-презентирующие клетки

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АФК - активные формы кислорода

БТШ - белки теплового шока

БТШ70 - белок теплового шока 70 кДа

ДК - дендритные клетки

ЛПС - липополисахарид

ЛТК - липотейхоевая кислота

МВТ - мультивезикулярные тела

МКАТ - моноклональные антитела

ТШ - тепловой шок

ФС - фосфатидилсерин

ХЛ - хемилюминесценция

ЭКП - электрокинетический потенциал

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В экономически развитых странах Европы и в США ежегодно более чем у 750000 пациентов развивается сепсис, летальность при котором может достигать 40-80%. Несмотря на многолетние исследования, направленные на поиск подходов к лечению сепсиса, количество подтверждённых случаев возрастает на -1,5% в год (Salomao et al, 2012).

В настоящее время в практической медицине нет эффективных средств защиты от грамотрицательного и грамположительного сепсиса. Активатором патологических процессов при сепсисе являются структурные компоненты бактериальных клеток (PAMPs - pathogen-associated molecular patterns) (Ray et al., 2013). У грамположительных клеток, наряду с другими PAMPs - это липотейхоевая кислота (ЛТК). У грамотрицательных - липополисахариды (ЛПС, эндотоксины). ЛПС также играют важную роль в развитии таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, метаболический синдром и др. (Мапсо et al., 2010). Поступая в кровяное русло, ЛПС сначала взаимодействуют с липополисахарид-связывающим белком, затем - с CD 14 мембранным белком клеток-мишеней (в том числе фагоцитов крови). После этого происходит передача ЛПС от CD 14 к MD-2 (лимфоцитарный антиген 96) и последующее образование двух комплексов ЛПС-МО-2-ТЬК-4 (Tolllike receptor 4), которые впоследствии формируют гетеродимерный рецепторный комплекс в мембране клеток-мишеней (Park et ah, 2009). Трансдукция сигнала от этого комплекса приводит к запуску клеточного ответа, на ранних стадиях которого происходит увеличение продукции активных форм кислорода (АФК) фагоцитами и увеличение экспрессии факторов адгезии. В более поздний период происходит активация факторов транскрипции (в частности, NF-kB - ядерный фактор каппа В) и синтез провоспалительных цитокинов, среди которых первым секретируется TNF-a (Buttenschoen et al., 2010). ЛТК вызывает стимуляцию клеток врожденного

иммунитета через активацию ТЬЯ-2, СБ 14 и СОЗб рецепторов (Жегс!еггта1ег, РевсИе1, 2008).

В развитии сепсиса и септического шока важная роль принадлежит клеткам врожденного иммунитета - фагоцитам (нейтрофилам, моноцитам, макрофагам), основной функцией которых является защита млекопитающих от бактериальной инфекции. Нейтрофилы играют ключевую роль в воспалительном ответе и одними из первых отвечают на действие ЛПС и ЛТК, которые вызывают активацию нейтрофилов и ингибируют их апоптоз, что приводит к увеличению продолжительности жизни этих клеток (Е1 КеЫг, П1ер, 2010; Осапа а1., 2008). Наряду с нейтрофилами в системе врожденного иммунитета важная роль принадлежит макрофагам, которые происходят из моноцитов, и в качестве секреторных клеток участвуют во многих иммунных и воспалительных реакциях, в которых не участвуют нейтрофилы {Odegaard et а1, 2011). Под действием ЛПС моноциты и макрофаги продуцируют различные цитокины и клеточные медиаторы и играют важную роль в воспалительном процессе.

Большинство грамотрицательных бактерий содержат Б-форму ЛПС, в состав которой входит гидрофобный липид А, олигосахаридный кор и О-антиген. Помимо 8-формы ЛПС, бактерии синтезируют и кор-дефектные молекулы ЛПС (Я-хемотипы), имеющие в своем составе липид А и коровую часть разной длины. Кор-дефектные структуры обозначаются как ЯЬ - Яе-хемотипы, а структуры, имеющие полный внешний кор, как Яа-хемотип {Freudenberg et а1, 2008). Известно, что при ряде патологий доля Я-хемотипов ЛПС может возрастать (АпаБ е1 а\., 2010). Действие 8-формы эндотоксинов на фагоциты в настоящее время исследовано достаточно полно, в то время как действие различных Я- хемотипов ЛПС изучено недостаточно.

В ответ на стресс организм выделяет эндогенные "сигналы опасности",

способные действовать как мощные активаторы системы врожденного

иммунитета, вызывая продукцию различных медиаторов. Ранее было

показано, что при сепсисе и различных воспалительных заболеваниях происходит увеличение синтеза и продукции белков теплового шока, в частности БТШ70, играющего важную роль в механизме защиты организма млекопитающих от теплового и других видов стресса (Gelain et al, 2011, Ed. Henderson, 2012). Показано, что введение экзогенного рекомбинантного БТШ70 снижает гибель животных в модели эндотоксинового шока, а также подавляет индуцируемую эндотоксином активацию нейтрофилов, т.е. защищает клетки от действия ЛПС (Rozhkova et al, 2010).

Свойства внутриклеточного БТШ70 изучены достаточно полно (Liu et al, 2012, Noble et al., 2012, Joly et al, 2010). Показано, что он обладает шаперонной активностью, а также имеет различные регуляторные функции (противовоспалительные, антиапоптотические) (Zorzi et al, 2011, Young, 2010). Однако, в настоящее время мало известно о механизмах взаимодействия внеклеточного (экзогенного) БТШ70 с клетками врожденного иммунитета и внутриклеточных сигнальных путях, участвующих в трансдукции его сигнала.

Цель работы: исследовать влияние экзогенного белка теплового шока БТШ70 на клетки врожденного иммунитета при действии липополисахаридов разной структуры. Задачи исследования

Научная новизна. В работе исследовано влияние экзогенного рекомбинантного человеческого белка теплового шока БТШ70 на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты и макрофаги) при действии на эти клетки разных хемотипов липополисахаридов Е. coli. Показано, что предварительная обработка экзогенным БТШ70 снижает индуцируемое ЛТК и различными хемотипами ЛПС Е. coli увеличение продукции АФК и TNF-a нейтрофилами, моноцитами и макрофагами, а также вызывает снижение количества CDllb рецепторов нейтрофилов и TLR-4 рецепторов моноцитов.

Показано, что экзогенный БТШ70 увеличивает продукцию TNF-a нейтрофилами и моноцитами с участием преимущественно TLR-4 -зависимой передачи сигналов.

Установлено, что экзогенный БТШ70 увеличивает количество рецепторов TLR-2 и TLR-4 на клеточной мембране нейтрофилов и моноцитов и не

влияет на экспрессию мРНК TLR-2 и TLR-4 рецепторов макрофагов RAW 264.7.

Выявлены механизмы влияния экзогенного БТШ70 на внутриклеточные сигнальные пути с участием PLC, PI3K, р38, ERK, JNK и NF-kB, вовлеченные в продукцию АФК нейтрофилами и моноцитами при действии ЛПС.

Научная и практическая значимость. Полученные результаты позволяют расширить понимание механизмов действия экзогенного БТШ70 на клетки врожденного иммунитета, что вносит важный вклад в оценку возможности использования БТШ70 в качестве основы для создания перспективных лекарственных препаратов.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Клетки врожденного иммунитета

Наряду со специфическим (приобретенным иммунитетом) в организме млекопитающих присутствует также система врожденного (неспецифического) иммунитета (Ройт и др., 2001). Система врожденного иммунитета включает фагоцитирующие клетки (нейтрофилы, моноциты, макрофаги, базофилы и эозинофилы); клетки, выделяющие медиаторы воспаления (тучные клетки и др.); натуральные киллеры (NK-клетки) и гуморальные факторы или молекулы, такие как белки комплемента, белки острой фазы воспаления и цитокины (Назаров, 2005).

Бактериальные клетки содержат патоген-ассоциированные молекулярные структуры - (pathogen-associated molecular patterns - PAMPs). PAMPs узнаются клетками врожденного иммунитета при взаимодействии со специфическими рецепторами - рецепторами распознавания паттернов (PRRs). Выделяют два класса PRRs:

1) рецепторы фагоцитов, запускающие эндоцитоз; они способствуют захвату, поглощению и разрушению патогена, например, маннозные рецепторы и скавенджер (фагоцитарные) рецепторы (SR) и

2) сигнальные рецепторы, активирующие внутриклеточные процессы, например, То11-подобн

Информация о работе

Антонова, Ольга Юрьевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Модулирующий эффект экзогенного белка теплового шока (БТШ70) на клетки врождённого иммунитета млекопитающих при действии липополисахаридов разной структуры - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы