Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-биохимические аспекты вариабельности компонентов системы теплового шока

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биохимические аспекты вариабельности компонентов системы теплового шока"

ШШИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ТУРКМЕНИСТАНА ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ

р г б о;\

. , На правах рукописи

1 1 МАР

УД К:577.217.5:616—СО. 16: 612.591.1:636.295

КАРАЕВ Кара

Э ко Л О ГО- Б И О X И М И Ч Е С К И Е АСПЕКТЫ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ ТЕПЛОВОГО ШОКА

03.00.04 — Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

АШГАБАТ — 1938

Работа выполнена в лаборатории белкового обмена Института физиологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Туркменистана.

Научные консультанты:

доктор биологических наук, член Иыо-йорксиой Академии наук, профессор Евгеньев М. Б.

доктор биологических наук, член Ныо-Р1оркской Академии наук Ульмассв X. А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член АНТ, член АМНТ, профессор Курбанов X. К.

доктор медицинских наук Султанов Г. Ф.

доктор ветеринарных наук, профессор Дурдысв С. Д.

Ведущее учреждение: Туркменский сельскохозяйственный институт им. С. А. Ниязова.

Защита диссертации состоится « ^У» J996 г. в

/^""часов на заседании Специализированного совета

Д.4А.023 при Институте физиологии МЗ и ¿МП Туркменистана не адресу: 744012, ш. Ашгабат, ул. Островского, 30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фи: пологий МЗ и МП Туркменистана.

Автореферат разослан » (^у? О-р ^ 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат медицинских наук

караджаева б. г.

-11. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Проблема адаптации человека и животных к изменяющимся условиям внешней среды является одной из основных проблем медико-биологической науки. В качестве кардинальной составляющей -эта проблема органично входит в глобальную программу изучения основ жизнедеятельности' человека и животных в аридном регионе. Высокая к'.мперлiypä как псспсцпфнчсскпП фактор оказывает влияние практически на все процессы, протекающие' п клетке, в том числе на биосинтез белков и нуклеиновых кислот. В этой связи актуальным является изучение действия высокой температуры на генетический аппарат клетки, регуляцию его активности, а также на структур!ю.-функииональное состояние важнейших клеточных систем, пьгполняюших защитные. функции в условиях теплового стресса. Среди таких систем наиболее универсальной и зволюцнонно ранней является так называемая система теплового шока, активируемая при действии высокой температуры и других стрессовых факторов. Основным функ1п;оналъныя звеном этой системы являются белки теплового Шока (ЬТШ) [Lindqüist.'Craig, 19S8] или Сфегсовые белки [Pardue et al., 1989].

БТП1 в клетках самых различных организмов - от Е. coli до человека -выполняют важные универсальные функции, позволяющие км пережить сгрессогенное действие тепла, н других агентов (Schlesinger et al., 1982; Lindquist, 1?8б]. В последние годы выяснилось,- что БТШ и родственные ИМ нолипептиды интимно связаны с многими яшзненнопажными для клетки процессами и являются неотъемлемыми компонентами клеточного метаболизма в нормальных условиях. Генерализованные функции БТШ рз семейства. БТШ70 на основе выраженных белок-белковмх взаимодействий реализуются на уровне блокирования агрегации денатурированных и абберантных белков, стабилизации • компетентных форм .вновь синтезированных полипептидов, irx транспорта а различные компартменты клетки, сборки в мультимерные комплексы. Совокупность свойств БТШ70 позволяет сегодня рассматривать их ках белки широкого спектра действия, принимающих участие в контроле за состоянием, организацией и растipeделением пула внугрнклеточ1шх белков [Pelham, 1988; 1989; Ellis, 1990; Riaböwol et al., 1988].

Эксперименты, проведённые в различных Лабораториях продемонстрировали . важную роль БТШ в адаптации клеток к условиям гипертермии. Однозначные эксперименты в пользу адаптивной ролл БП1170 были получены, во-первых, благодаря исследованию ts-мугаппИ

с нарушенной системой генов ТШ и, во-вторых, когда удавалось избирательно блокировать те или иные гены этой системы и анализировать последействия таких нарушений [Jacobson, Craig, 1984]. Нарушения метаболизма, вызванные дефектами в функционировании генов ТШ и приводящие к гибели клеток или снижению их термоусгойчивости, и другие метаболические сдвиги блокируются увеличением внутриклеточной концентрации этих стрессовых белков [Lindquist, 1986; Lindquist, Craig, 1988; Craig, 1989; "Welch et aL. 1989; Bukan et al.. 1989; Vau Dyk et al., 1989]. В клегках эу^дриот акснрсссня хеиоь Till j-ibucm от акшвацни изначально присутствующего в клетке фактора транскрипции генов ТШ (HSF). У высших эукариот активация HSF заключается в конверсии неактивного фактора в форму, способную специфически связываться с HSE [Abravaya et al., 1992; Morimoto et al.. 1990; Sarge et al., 1993].

Однако, несмотря на очевидные успехи в изучении фундаментальных защитных свойств БТШ на различных культурах клеток in vitro, по-прежнему, мало изученным остается вопрос о роли основного стрессового белка (Б1Ш70) в есге« пенной адаптации организма к теплу, о. его взаимосвязи с другими компонентами системы ТШ в эгом процессе, а также структурно-функцнональном шеюяшш факюра транскрипции генов теплового шока у видов различного происхождения. Практически полностью, отсутствуют такие данные у этнически и эколошчсски различных популяций человека. Единичные сообщения зарубежных авторов [Bosch et al., 1988; Kimpel, Key, 1985; Lindquist, Craig, 1988] и наши предварительные . данные [Ульмасов, 19921 указывали на существование закономерности между БТШ и температурными условиями существования организма. Общебиологическим критерием значимости таких взаимосвязей Может быть фронтальный межвидовой эколого-бнохиынческий мониторинг состояния различных компонентов системы ТШ (БТШ, кодирующие их мРНК, факторы транскриппии генов ,ТШ) in vivo и in vitro у организмов эволюцнонно привязанных к различным климатогеографнческим, экологическим и другим нишам. Другими словами, закономерная вариабельность состояния компонентов системы ТШ, отражающая- выраженное действие одного (высокая температура) или совокупное влияние нескольких факторов (ТШ, вирусная ийфекцня и др.), может, быть чутким информативным параметром сС1есгвеыной адаптации организма к высокой температуре и другим факторам внешенй среды, его устойчивости и готовности к восприятию различных стрессовых нагрузок.

1. 2. Цели п задаче. Целесообразным подходом к решению згой

проблемы является масштабный, сравнительный, межвидовой анализ системы ТШ у широкого спектра уникальных природных моделей пойкнло-, гетеро- и гомойотермных организмов, включал человека, как наиболее важного в научном и социальном плане объекта. Основным содержанием данной работы- является зколого-биохимический анализ некоторых компонентов системы ТШ in vivo и in vitro у организмов эволюционно привязанных к различным климатогеорафичсским и экологическим нишам, резко отличающимся по температурным параметра». '

В качестве основных целей и задач предполагается изучпть следующие вопросы:

1. Дать базовую межвидовую характеристику физико-химических" свойств стрессовых белков от простейших до млекопитающих. .

2. У животных, обитающих в контрастных по температурным параметрам экологических нишах, изучить: • .

- содержать и экспрессию БТШ и кодирующих их мРНК;

- состояние и активацию фактора транскрипции генов ТШ.

3. Выявить особенности тепловых стресс-реакций в' клетках экологически и этнически различных популяций человека. .

4. На моделях латентных и острых стрссовых воздействий изучить • экспрессию компонентов системы .ТШ при комбинированном действии ТШ и вирусиой инфекции.

5. Провести коррелятивную оценку взаимосвязи ' вариабельности состояния некоторых копонеитов системы ТШ и температурных условий жизнедеятельности орпшпзма. ■ *

1. 31 Научная новизна. Впервые на большом числе природных мо- . делей проведен комплексный сравнительный анализ некоторых компонентов клеточной системы ТШ, формирующий новые представления о важной роли БТШ (70 кДа), других кЬмпонентоп системы ТШ d естесг-венной адаптации организма к высокой температуре среды:

- выявлена позитивная .корреляция между уровнем экспрессии генов ТШ, содержанием и синтезом БТШ70-подобных белков, термеус-тойчивостыо организма и - температурными условиями его обитания. Показано, что терморезистенпше оргашцмы отличаются болте пнеоким уровнем содеряшпмн конститутивного синтеза БТШ70, они обладают более широким температурным диапазоном тщукцин и продолжающегося синтеза БТШ. В клетках этих видов синтез нормального набора клеточных белков сохраняется при более высоких температурах; -

- обнаружено, что синтез БТШ70 и кодирующих их мРНК в клетках

южных видов шелкопряда.и ящериц, в отличие от видов, обитающих в средних и северных широтах, наблюдается при значительно более высоких температурах, вплоть до 45-50°С. Высокоэффективная транскрипция мРНК-БТ11170 у тутового шелкопряда сохраняется и при комбинированном дейс-1 вин ТШ и вируса ядорло1 о по.'Ш-ароза (БЯ11);

- обнаружены отличия в тепловых стресс-реакциях культивируемых ;фибробластов кожи экологически и этнически различных популяций человека. В отличие от клеток индивидуумов, проживающих в умеренных широтах РФ (русские), клетей Коренных представителей Туркменистана (туркмены) наряду с более высоким процентом выживаемости сохраняют интенсивный синтез всех членов семейства БТШ70 (!ис, Ь5Х, кзр) и ряда других белков после жёсткого теплового шока ( 42,5°С); терморезистентный фенотип ¡слеток туркмен проявляется не на уровне индукции мРНК-БТ11170, а на более поздних стадиях развития стресс-реакции;

- ктегтет! ягцернп южного и сгверпого прелехогкдегтя существенно отличаются о количественном и качественном соотношении двух исходно присутствующих (конститутивных) активных форм ШР, при этом Терморезнстентные южные виды характеризуются меньшим уровнем этих форм НББ наряду с доминированием одной га них; выявлена чёткая негативная и позитивная корреляция между исходным уровнем активных форм НБР и, соответственно, внутриклеточным содержанием БТЩ70-• подобных белкой и интенсивностью температурной индукции. Б'ГВД;

- дана базовая межвидовая характеристика стрсссовьр белков у представителей пойкило-, ^егеро- и гоыойофрщцщ оргщщщор р

сах простейших, насекомых, рептилий н млекодоггающ^х;

- показано, что комбинированное действие ■тепловою -шока н вирусной ннфекщщ (ВИЧ) на лимфо^ластондные клствд ^ело§ека дриродну к умеренному у зол и четно татра вирус-специфических бе^ко^;

- установлено, что тканеспецпфическая экспрессия основных БТШ 1> различных типах клеток верблюда и гусениц тутового шелкопряда реализуется на уровне отдельных членов семейств ВДП170 и |Л1Ш0.

1.4- Научяо-црмпическая цештое^г.. Резушлатк работы существевдо расширяют и углубляют представления о цлсточных белковых факторах адаптации организма к высокой температуре. Совокупность полученных данных, позволяет рассматривать систему тепловогошока как унн-версальную отобранную в процессе эволюции клеточную систему, являющуюся неотъемлемым компонентом стратегии- биохимической' адаптации клетки и целого организма к температурным условия»! внешней среды. Высокая.темперагура среды, как эволюционный фактор,

способсгвует закреплению некоторых клеточных механизмов, одним из которых является дозированная, в зависимости от значений- внешней температуры, активность системы генов белков теплового шока (70 кДа), реализующаяся в конечном счёте в повышенной внутриклеточной концентрации БТТИ70 и кодирующих их мРНК. Очевидно, что • высокая концентрация лих стрессовых белков у "южных" видов, обитающих при высоких внешних температурах, (в сравнении с "северными" видами, необходима для обеспечения возросших, в соответствии с высокими , абсолютными значениями температуры внешней среды и тела животных, нормальными клеточными и защитными функциями БТШ. Это обстоятельство также отражает готовность организма к резкому изменению' температурных условий среды, что возможно при временных перемещениях в пространстве, добывании пищи, возникновении опасности.

Значимость представленных данных, впервые полученных на широком спектре видов с чрезвычайно разнообразными температурами естественных срсд обитания позволяют' говорить о наличии реальной закономерности, связывающей температурные условия обитания вида с экспрессией генов ТШ, содержанием мРНК-БПШО и БТШ70-подобных белке л. Проведенные эксперименты езидетельегзуют, что белки из * семейства БТШ70, особенно констнтутизио синтезируемые стрессовые белки, играют важную роль в естественной адаптации организма к теплу, их- повышенная экспрессия является -одним из неотъемлемых клеточных механизмов, обеспечивающих существование вида в условиях действия высоких внешних температур. Проведенный сравнительный анализ HSF создал .предпосылки' для более детального понимания . механизмов реализации ответа на стрессовые воздействия у организмов с различной адаптацией т: теплу. В плане фундаментальной значимости эти молеяулярхго-зкологачеехпе псслйдбпанля позволяют глубже понять пути эволюции системы ТШ, варианты взаимодействия её ке.мпен'ллоо. механизмы регулггщш. Боле» того, значимая -вариабельность в структурно-функциональном состояшш некоторых компонентов системы ТШ имеет палапмй прогностический петенщшг, на основе которого ' могут быть разработаны особые решшы адаптации я различным стрессам, созданы новые формы с повышенной термоустойчив остью, разработаны новые критерии профотбора' для работы в экстремальных условиях.

Создана научно-практическая база для проведения широкомасштабных популяционных, медико-генетических к молекулярно-экологичесхнх исследований, содержащих, в своей основе определение содержания . БТШ70 в клетках больных и здоровых людей с различной профгс-

-6. атональной ориентацией.

Продемонстрированное умеренное увеличение титра вирусных . частиц (ВИЧ) после теплового шока может быть использовано в целях ускорения промышленного получения дорогостоящих препаратов вируса для иммунологических тест-наборов.

Проведешше исследования составляют основу нового перспективного направления в изучении адаптивных свойств системы теплового шока. Результаты исследований могут быть использованы при чтении курсов лекции по физиологии, биохимии, молекулярной биологии.

f. 5. Пуилмкжцни. Основное содержание диссертационной работы изложено в 20 опубликованных научных работах.

1.6. Аппрооадия работы. Материалы диссертации были доложены, обсуждены и одобрены на рззлнчных семинарах, симпозиумах и ' съездах: 1 всесоюзное' совещание по белкам теплового шока (Гатчина, .1986), IY конференции биохимиков республик Средней Азии и Казах. стана (Ашхабад, 1986), научные конференции институтов физиологии (1987) и зоологии (1991) АН Туркменистана, УП1 всесоюзная конференция по экологической физиологии (1989), III съезд терапевтов Туркменистана (Ашгабат, 1995), II Международный азиатский герпетологический конгресс (Ашгабат, 1995), заседание межлабораторною коордиици-диного совета института физиологии МЗ и МП Туркменистана ( 1996).

1.-17. Структура и объём работы. Диссертация ихтожена на 251 страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы, яксиериментальной части, результатов собственных исследований и их обсуждения. Данные документированы 29 рисунками и 4 таблицами. Список цитированной литературы содержит 367 наименований, из них 22 работы отечественных и 345 зарубежных авторов.

Работа выполнялась в рамках научных программ института физиологии АН Туркменистана (номера госрсгистрацни 01860023443 и 01900005377), программы 'Тедом Человека" (номер госрешсаравдш 01900050785) и договора о научном сотрудничестве с Институтом молекулярной биологии РАН им. В.А.Энгельгардта.

Автор выражает глубокую благодарность профессору, д . б. п. М. Б. Евгеньеву и д. б. н. X. А. Ульмасову за постоянное внимание, высококвалифицированную кчндультатавиую и экспериментальную помощь. В экспериментах также ' принимали участке Е. А. Титаренко, О. Е.ЗаЦсш'ша (ИМБ им. Энгельгардга РАН),. В. К. Дашкевич, И.Ю. Абрамова (Институт физиологии МЗ и МП Туркменистана), А. Овезмухамедов (Институт зоолопга АН Туркменистана), В. 11. Пят'-, ко, В. К. Викулова, В. Г. Черников (Медико-тктический Центр

РАМТГ), Т. Н. Платонова (Ин-т внрусолопш им. Ивановского РАМП) Большую помощь в сборе биологического материала и соответствующие консультации оказали С. Щаммаков, Ч. Атасв (Ин-т зоологии АН Туркменистана), Б. Туннев (Сочинский заповедник), Н. Л. Орлов; Н. Б. Ананьева (Зоологический ин-т РАН). В. А. Черлин (Н^ЭБМЖ РАИ). В. Ф. Орлова (Зоомузен МГУ). Важную поддержку экспериментальных исследований оказали Б. А. Маргулис (Ин-т цитологии РАН), ,Т. я. Браудс-Золотарева ÍPAIT). Э. В. Карамов (Ин-т внрусолопш РАМН). Е. В. Лесникова (НИИ профилактической и клинической медицины им. Дурсунопой МЗ и МП Туркменистана), В. Н. Ляшко, предоставившие для исследований соответствующие культуры клеток, антитела и другие препараты. Всем перечисленным коллегам, а также сотрудникам лаборатории белкового обмена Ин-та физиологии МЗ и МП Туркменистана автор'выражает искреннюю признательность и благодарность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. 1. Реактивы н препараты. В работе использовали различные радиоизотопы аминокислот и нуклеотндтрнфосфатов (Amersham (Англия), Spofa (Чехия), ИЗОТОП (Узбекистан)), применяемых для мочения белков и нуклеиновых кислот. Для выделения, очистки, элекгро-форетического фракционирования биологических макромолекул и других процедур использовали реактивы и препараты фирм Sigma, (США), Serva (Германия), Pharmacia (Швеция), Инка. (Швейцария), Reanal (Венгрия), Реахнм (РФ) и др.

Моноклональпыс антитела C92F3A-5 и N27F3-4, специфичные к штдуцпбелыюй и конститутивной формам БТШ70.человека соответственно, получены от д-ра V/. Welch ( Колд Сприиг Харбор, США); специфические кроличьи поликлональные антитела к HSF, получены'от д-ра С. Wu (Национальный Институт здоровья, США) и предоставлены М. Б. Езгеньспым. Полпклснальпьтс антитела N7 к БТШ73 телёнка любезно предоставлены Б. А. Маргулиссм. В нсследоБалнях также использовали коныогнрованные с перокендазой кроличьи, мышиные или козьи вторые антитела (Pharmacia, Швеция; Медбнопром РФ).

В работе использовали клон 229.1 (S7C1), Содержащий ген БТО170 D. mclanogaster (получен- из лаборатории • Mesclson, Гарвардский университет; США); клон XL10, содержащий ген БТТО70 Xtuopus Iacvis, (получен от д-ра М. Bien?, (Лондонский центр медицинских исследований, Англия); клон, содержащий ген HSF человека (получен от д-ря С.

Wu), плазмида ph2,3, несущая ген БТШ70 человека (получена от д-ра R. Mórimbto, Северо-западный Университет, Иллинойс, США). Все клоны любезно предоставлены М.Б.Евгеньевым.

2; 2. Жшотпыс. Условия тепловых воздействий, введение метки в белки iu vivo. В работе использовали различных представителей насекомых, рептилий и млекопитающих.

• Гусениц тутового шелкопряда (гибрид белококонный, грена получена на Лннауском грензаводе, Туркменистан) весенней выкормки выращивали на свежих листьях шелковицы при 23-25°С. Уход за гусеницами, кормление, определение иола, возраста и др. проводили согласно рекомендациям Михайлова (1950, 1953, 1958). Белки отдельных органов гусениц мстили радиоактивным мстпонином до или посте Till' in situ п фосфатном буфере для насекомых [Braude-Zolotareva et ' al.,1986] с течение 45 мнн мин при 25°С.

В экспериментах использовали 16 видов ящериц, относящихся к 9 родам в пределах семейств Agamidae, Gekkooidae и Laccrtidae: дневные южные .виды - золотистая мабуя (Mabuya aurata, Linnaeus, 175?), кавказская агама (Agama caucasica. F.ichwald. 18311, степная агама (Agimá sanguinolenta, Pallas, 1813), азиатский гологлаз (Ablepharxis panuonicus," Lichtenstein, 1823), песчаная круглоголовка (Phrynocepha-lus inícrscapularis, Lichtenstein, 1856), закаспийская круглоголовка (Phr. raddei, Boettger, 1890), такырная круглоголовка (Phr. helioscopus, Pallas, 1771), линейчатая ящурка (Eremias lincolata., Nikolsky, 1896), сетчатая ящурка (Eremias gramica,. Lichtcustein, 1923); дневные северные виды: скальная ящерица (Lacerta saxieola, Eversmaun, 1S34), нры гкал'ящерпца (Lacerta agilis, Linnaeus. 1758), живородящая ящерица (Lacerta vivípara, Jacquin, 1787), разноцветная ящурка (Eremias arguta, Pallas, 1773); ночные южные виды: гребнепалый геккон (Crossobarcon eversmauni, Wiegmanu, 1834), каспийский геккон (Gymnodactilus caspius, Eichwald, .183Г). сциш;овь!Й геккон (Tcratoscincus scincus, Schlegel, 1858). Живородящую ящерицу отлавливали в Карелии, Ленинградской, Московской и Тверской областях, прыткую н скальную ящериц - в Московской, Харьковской областях и. в черте т.. Сочи,- соответственно, разноцветную ящурку.- В Астраханской области и Калмыкии, каспийского геккона - в черте г. Ашгабата, азиатского гологлаза - на Юго-Западном Копст-Даге на высоте 1500 м. Остальных ящериц - в предгорной равнине Копст-Дага и в песчаной пустыне севернее г. Ашгабата. ..'.•'

В опытах по температурнорму воздействию использовали ящериц обоего пола весом 0,8-10 г. Животных перегревали при различных

температурях и течение I часа в специальной пластмассовой, кювете с 1,5-сантнметровой песчаной подложкой, помешенной в воздушный термостат. Затем им вводили внутрнбрюшннно 25-40 мкл физраствора, содержащего — S-mcthohhh, из расчета 40-50 мкКн на 1 г веса и содержали еще один час при 25"С. Через 1 час после введения метан животных забивали дехагштяштеи. Печень гомогсотпнровялн un холоду в буфере, . содержащем 50 мM трнс-IICl (рН 6,8) и 1 мМ PMSF. Белки осаждали четырех-крашнм ¡••Гчемом хшо.амто я а пола и хранили при -20 "С.

В опытах на устойчивость к действию высокой температуры ящериц перегреиалн при еоотчегпующих температурах в течение 1 часа. В качестве летальных принимали значения температур в камере, при" которых погибало 80-100% взятых а эксперимент животных.

2. 3. ТС.гспл!. Лимфоциты и эрщроии ты выделяли из евежесобранной крови человека и верблюда в ступенчатом градиенте Ficoll- Paque или фиколла-всрографнна (d = 1,078 для лимфоцитов, d =1, 110 для эритроцитов) к о протоколу фирмы-изготовителя (Pharmacia).

В раба ¡с также использовали другие культуры клеток млекопн-.таютнит: зараженные (П9/Ш.ТЛППВ) и незяраженные (П9) вирусом иммунодефицита. человека (ВИЧ) лнмфобластондные клепки (любезно предоставлены Э. TJ. Каралювыл^ культуры фибробластов ке;:ш человека (гуркмены - KopcHm.ie представ!riели Туркменистана и русские - предега-витеш! РФ) п верблюда (находятся в банке клеточных культур Медико-генетического центра PAMII).

В экспериментах с клетками насекомых использовали следующие перевиваемые линии .клеток: speb МЗб - кулыура клеток яичников куколок тутовою шелкопряда Bombyx xnori; ApMci - культура клеток яичников куколок дубового шелкопряда AiUeraca pernyi Guer; JBLB-Ld65-2 - кулыура клеток яичкикон 'куколок непарного шелкопряда Lyraantria dis par (эти клетки, а икже аард;кснаа» ВЛП культура клеток В. mori были потученм от Т. я. Брауре-Золотаревой). В качестве контроля использовали линии эмбриональны?; -¿теток Drosopiiila virilr, 79f7Dv3g, Заражение культивируемых клеток В. mori и гусениц тутового шелкопряда вирусом ядерного полиэдром (ВЛП) колт.чатого шелкопряда Ма'асоасша neusrria проводил!! по методике Сухорада и соавт. (19S4).

В опытах с культурами клеток д с Тасмании использовали два изолята промаспиот: 1. REIT (SU)82/R19-IC-Lcisl:;nania- (SaurolcUhmanin) gym-nodactyli (Chadukin et SofîelT, 1940). Выделен из крови каспийскою геккона, отловленного п 1S33 г. т» Сера хеком этрапс Туркменистана; 2.

REPT (8.1) 3214-KA-Lcishma.ma (Sauroleishmania.) guluki (Ovczmuchamedov et- Safiauova, 1987). Выделен от кавказской агамы, пойманной в ущелье Ай-Дере в Кара-Калинском этрапе Туркменистана. В работе эти клетки, полученные и предоставленные А. Оаезмухамедоаым, мы называем изол ягами R-19 и 3214 coorceici венно.

Контрольные и прогретые клеточные культуры метили in vitro 35S-мстиоинном 1 час при 25°С.

2.4. Me «еды исследования. Одно- н двумериый электрофорез меченых in vivo или in vitro белков в полиакрнламидном геле (ПААГ) проводили по метопам L.aemmli (19701 к O'Farrelí et al. (1977), флюорографию гелей согласно Bonner и Las key (1974). В качестве маркеров мол. масс использовали меченые БТШ дрозофилы и стандартный набор белковых метчиков .(Pharmacia). В соответствующих экспериментах на гели наносили равные кролнчества белка или равные количества радиоактивности. Экспозиция на ренггенонскую пленку велась в соответствии с количеством нанесенной радиоактивности. Пятна и полосы, соответствующие БТШ на. флюоро- или иммунноэлектрофореграммах, сканировали на денситометрах типа "XL Ultrascan" (Швеция), "Optou" (Германия). Компьютерный анализ денситометрнческих данных проводили с использованием- прибора "Molecular Dynamics" (США-).

Gcl-shifl mobility uicuropiioresisiipoiiivtiwit соыасно (Liu el al., 1S93J.

Иммунный блоттинг вели по методу Towbm et al. (1979). После обработки перенесенных на нитроцеллюлозу белков специфическими моно- или поликлоналышмн анппеламн фнлыр обрабатывали кроличьими IgG, НОЛуЧСННЫМИ llpOllIB ИММуНОГЛобуЛИНОВ мыши, или козьими антикроличьимн IyG, коньюгированны.мн с пероксидазон. Полосы нммуннопрецитггации регистрировали по перокендазиой реакции с хлорнафтолсм или днамннобецэвдшюм в качесгае субстратов, а также при Помоши набора реахентов 1 и 2 (ECL).

"Выделение нуклеиновых кислот, мечеинс в реакции ник-трансляцни, дот- и нозерп-гибрндизашпо проводили как описано в руководстве Маннатнса и соавт.'(1984). Включенную радиоактивность определят: при помощи жидкостного сцинтпляцнонного счетчика "Iutertecluiique SL-30" (Франция). Концентрацию белка определят но методу Lowrv et al. (1951).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ Й ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3. 1. Общая межвидовая характеристика БТШ. ЬТШ являклея уни-

версальнымн консервативными белками, обнаруживаемые ' у всех изученных организмов. Вместе с тем, поскольку большинство-уникальных моделей, использованных в данной работе, изучены в этом плане впервые, мы сочли целесообразным в начале дать базовую межвидовую характеристику стрессовых -белков у отобранных в эксперимент организмов и клеток. Она включает такие основные параметры как молекулярная масса, разнообразие нзоформ, изоэлектричесхая ?очка, геансвая специфичность. С этой 'целмо были получены одно- и двумерные электро- и иммуноэлектрофореграммы- клеточных белков, выяпнв-пте как консерватизм физико-химических параметров БТШ у изучаемых организмов, так и их некоторые отличия. . • "

3. 1. 1. Базовые физнко-хпмячеекпё харакгерастакя БТШ у пссле-дозаппых организмоа в классах нростсЗших, насекомых, реотклаш а млекоиитаннилх. Пользуясь общепринятым подходом [Вигёоп, 1976] изученные БТШ можно условно подразделить на две основные группы -высокомолекулярных (68-110 кДа) и низкомолекулярных (22-48 кДа) белков. В свою очередь, у различных организмов каждая из этих групп образована соответствующими белками, формирующими основные семейства БТШ: семейство БТШ70, семейство БТШ90, семейство БТШ22-27, а также группы подпнептндов с молекулярными массами 35-48 кДа.'

Так, у одноклеточных паразитов ящериц - лейшманий - молекулярные массы основных БТШ довольно равномерно перекрывают диапазон от 25 кДл до 100 кДа, при'этом БТШ25,'БТШ48, БТШ70 и БТШ84 представлены лишь одним, типом полнпе:ш!Дов. тогда как БТШ39, БТШ88 и БТШ 100 представлены группами из 2-3 бе}гков.

Аналогичное распределение БТШ по , молекулярным массам, охватывающим диапазоны низко-- (25-35 кДа), срсднет (46-48 кДа) и высокомолекулярных (68-35 кДа) БТШ.'наблюдастся и у рептилий.

В отл51чие от . лейшмшшй и ящериц, характерной чертой всех изученных типов культивируемых кгсеток насекомых является выраженное подразделение БТШ на группы с достаточно близкими значениями молекулярных масс (22-27 кДа и 68-83 кДа) и отсутствие основных БТШ с молекулярными млссямн в области 35-60 кДл. Интересно, что у культивируемых клеток насекомых, также как и у рептилий нзоформами обладают лишь основные стрессовые белки из семейства БТШ70.

Что касается нсследозанных типов клеток млекопитающих, то в этом случае размеры основных БТШ сдвинуты в область высокомолекулярных белков (60-110 кДа),, а самыми ннзкомолекулярными яштяиггея БТШ40 и БТШ48. Другой характерной чертой исследованных плеток

цлекошгаиощих является то, что большинство высокомолекулярных БТШ представлены более чем одним типом полипептадов.

Сравнение кажущихся значений Р> у исследованных групп организ-

. мов показало, что в пределах каждого семейства БТШ наблюдаются некоторые отличня. В целом, показатели Pi БТШ рептилий и простейших смещены в .щелочную область по сравнению с насекомыми и млекопитаю-лцдош. Самым кислым белком из изученных БТШ являемся БТШ88 (Pi=5,3-5,4), самым основным - БТШ43 (Fi=7,8-8,4).

X 1. 2. Клеточная и ткапепая сцепифячнлеть БТШ. Другим важным показателем ' состояния стрессовых белков организма является их кдеточно-тканевая специфичность. В этой части исследований основными объектами' были выбраны различные органы гусениц тутового шелкопряда Y возраста (жировое тело,-половая и шелкоот делительная ' железы) и дифференцированные'клетки человека и верблюда (лимфоциты, эритроциты', .фнбробласты кожи). В табл. 1 ■ сведены результирующие данные одномерных и двумерных электро- и иммуноэлектрофореграмм, выявившие заметные отличня в тканеспецнфичеекой экспрессии Б1Ш вышеперечисленных тканей а клеток. В отличие от жирового тела, • ЬПИЯЗ'в деловой железе представлен дуплетом. Другим отличительным признаком кодовой железы является индукция двух изоформ БТШ23, в го время как в жировом теле после .ТШ низкомолекулярные БТШ представлены гремя типами .ткансспецифичных белков (БТШ27, БТШ25, БТШ2311 Интересным представляется тот фага, что выраженной орган-uo!i специфичностью обладают конститутивные и нидуцибельиые члены семейства БТШ70. Действительно, БТШ74 язляется конститутивным белком в жировом lene и шел.!сое>тде:/!Пелгноа железе - при uineptcpMjnt его синтез лишь усиливается, - в то врам;: ка:; в половой «-слезе он. по-видимому. индуцируется do novo. Напротив, БТШ70 синтезируется в норне при 2:А'С а жировом tеле н иолоеои желе.-.е. я в ;ие;,Кйо1м«"П• е-НЛЮЙ желе-fc прояьляеюя лишь при гипертермии. Другой член семейства -БТШ 68 н ero иэсформц - является строго индуцибельным белком в жировом теле и половой железе. по практически по заметен на дву,мерной флюорограмме БТШ нз шелхоотделитеяыюй железу. Отмеченные отличия в ткапсспсцнфнческоп экспрессии БТШ у гусениц тутового шелкопряда могут быть связаны с различным уровнем пролиферации клеток и общей интенсивностью синтеза белка в органах, с другой стороны дифференциальной регуляцией членов мультпгенпог'о семейства БТШ68-74 [РеШага, 1986]. Различное количество цэоформ (.например, для £ТШ83) может быть обусловлено .радом посттрансляциошшх модификаций этих

ТаСлнца 1. Тканевая а клеточная специфичность БТШ

Контроль Тепловой пюк' .

Организм, (253С) (42,543

орган,

клетки Мол. массе Число ; Мол. масса Число

БТШ « пзоформ БТШ пзоформ

кДа кДа

ГУСЕНИЦЫ

ТУТОВОГО

ШЕЛКОПРЯДА

33 1 . БЗ I

74 . 4-5 74 4-5

жиропое тело 70 • 1 ' ' .70 . 2-3 .

• - ■ - 63 ' 2

•27 1 27 2

- 25 1

23

2 1з

■ » _ '. ■ 74 5-6

половая ¿«слезя 70 " '.1 70 1-2

- 63 : 2-з

- 23 2

т 83 «мммгамн.^, * '

74 «м 74 • 2 4

ш^псоотделительпая - 70 1

- 36 *

железа - - 25

длительность ТЩ.1 час ■, . • ' -

продолженвс та5л. 1

. Организм, Контроль (ЗГС) Тепловой шок (42 °С)

орган, :клеткн Иол. масса БТШ Члсло пзоформ Лол. мисся БТШ Члсло тоформ

человек п*1>5- люд чело-пек верблюд человек ВС1>и- ■люд человек верблюд

лимфоциты эритроциты ■ фнброиласты. даш!ы Тотсутстиуют* ** - ПТШ73 присутствует но синтезируется лшш> глобин 95 88 73 60 73 83 73 Ш1Мк 110 88 75 73 60 : 73** 4 88 75 73 1 2 г 1 * 1 ■ г ям» «а* 1 1 2 2 1 •» 2 1 2 • •««л 110 95 88 73 74 60 45 73 88 73 72 110 100 88 75 73 60 73** 75 73 72 » • • • 2 1 2-3 2 14 1 ~ * 2-3 1 2-3 1 «к «п

белков flyover et al., 1984].

Интересные особенности экспрессии БТШ были также обнаружены у-трёх типов клеток исследованных млекопитающих (табл. 1). Сравнительный анализ спектров БТШ лимфоцитов и фибробластов кожи человека и верблюда показал, что вышеупомянутые клетки верблюда характеризуются также наличием характеристического стрессоного белка БТШ75, относящеюся, по-пилимому, к классу глюкозо-регулируемых С>елков [Mi/zen et и1„ 1975]. Более того, как оказалось в лимфоцитах верблюда на . фоне моиыоГо усиления синтеза костшугнвного БТШ73 сник-> do u'ovo индуцибелыюй формы БТШ70. хорошо выраженный в лимфоцитах человека (табл. I) и других клетках млекопитающих [Welch. Mizzen, 1988],* остаётся практически незаметен. Обнаруженная видоспецифнчсская экспрессия БТШ прослеживается и на клеточном уровне. Она связана с различными мол. массами шшуцибсльного компонента БТШ 70 п этих клетках. D фнбробластах кожи верблюда н человека, как и в большинстве других клеток млекопитающих, мол. масса этого белка меньше, чем у конститутивного БТШ7Л н составляет 72 кДа [Welch et al.. 1989]. Однако, в нормальных лимфоцитах и культуре,- лимфоблястоняньгх клеток Н9 человека (см. ниже) кажущаяся мол. мЛсса нндуцибельного компонента составляет 73-74 кД.т. • Возможно эти различия связаны с тканеспецпфи-ческой поеттранедяппониой модификацией индуцнбелъных БТШ70 в этих клетках, влияющей на их подвижность при SDS-электрофорезе.

Наиболее ярко клеточная специфичность экспрессии стрессовых белков была обнаружена на примере эритроцитов верблюда. Верблюд и филогенетически близкая к нему лама (Lama guanicoe, Cuvier, 1800), по-ииднмому, являются единственными. млекопитающими, эритроциты которых содержат ядро [Васильев, 1948]. Однако, п.отличие от эрнтро-tmm и амфибий; также содержащих ядра и способных индуцировать синтез БТШ70 при ТШ [Atkinson. Dean, 1985], нам не удалось заретстрировать индукцию или усиление синтеза каких-либо белков, в том числе из семейства БТШ70, в эритроцитах верблюда при 42°С или 44°С. При этих температурах, как и при 37°С. d этих клетках наблюдался слабый синтез лишь одного единственного белка - глобина (табл. 1). Таким образом, зрелые эритроциты верблюда являются интересным примером клеток, находящихся на-конечной стадии своего развития, не способных ни синтезировать, ни индуцировать при ТШ синтез стрессовых белков из семейства. БТШ70. Ранее аналогичные случаи, за исключением клеток прорастающей пыльцевой трубки растений [Mas-

carcnhas,» Altschular, 1985] и сперматоцитов [Вошзег et al., 1984] были, описаны лишь дЛя клеток эмбрионов различных организмов, находящихся на ранних стадиях своего развития (до стадии бластулы) [Heikkila et al., • 1985] и в некоторых недифференцированных культурах эмбриональных клеток [Wittig et al., 1983]. .'■•■.

Таким образом, суммируя данные этого раздела можно заключить, что клеточно-гканевая специфичность экспрессии БТШ в , изученных клетках н-оргапах человека, верблюда и тутового шелкопряда реализуется на уровне отдельных членов сгмейстаа БТШ70 и БТШ90.

На следующем этапе для изучения роли БТО170 в естественной адаптации организма к теплу нами был проведён сравнительный анализ реакций на тепловой шок. состояния некоторых компонентов системы теплового шока у относительно близких групп видов в пределах классов млекопитающих, рептилий, насекомых и простейших.

3. 2. Срзшигтсльиый эколого-бнохизшческин аиалю пекогормх гсомио-ueisroB cuciewu ТШ у видов, кошрастаих цо температур üll\j параметрам их экологических пшл.

3. 2.1. Уровень общего белкового сишсзи и «метких котраетиых форм.

Из диаграммы, представленной на рис. 1, видно, что для лейшманий кавказской-агамы (3214) и каспийского геккона (R19) характерно общее увеличение .включения метки при .нодшшешш температуры с 24"С до • 36°С. Вместе с тем, нельзя не отмстить, что при*температурах 38^0 и 40°С лейшмании агамы, как более термоустойчивого вида (см. табл. 2), включают относительно большее количество 353-метионина, чем лейшманни геккона. Таким образам, лейшманни агамы более терморезистентны, чем лейшмании геккона, в смысле более высокой устойчивости белкового сшпеза к действию высокой температуры.

Более высокая устойчивость общего белкового синтеза к 'ГШ обнаружена также и у культивируемых «легок тутового шелкопряда южниго происхождения в сравнении с D. virilis. Из диаграммы, представленной на рис. 1, видно, что. у .D. viriib при 40°С включите меченного предшественника. в10-15.раз шил-, чем при 25°С. При более высоких температурах включение метки' прекращает с;;' полностью. С другой стороны, в клетках готового шелкопряда при .40°С меченый метиошш включается практически; также, как в контроле, более того, достоверное включение метки рсл!стрнруегся при' 45°С и далее прн 49°С. В другой пару клеток шелкопрядов, распространённых п южных' (дубовый шелкопряд - A; perayi) и средних широтах (непарный шелкопряд - L. dispar) прослеживается аналогичная ситуация (рис. J). Таким

вглючешгс метка (%)

10090-Я0-7»!

6050 40302010;

0

гнчггп iü

¿Thvvi-'ii

Уф ir-i-r^j ПШ-ТТЛ'

ш

ЗТ'С

□ - верблюд" 0- человек

42"С

44"С

л включение мегсэ

10090 : 3070605040 ЗОН 20

юч

D. virilis

... : Б. morí .

A. pernyi

L, «ibjbjr

200-J50-10050-

ЕЕЛ10чсппе.четки (%) -

Pfl

•3214

I

21

R19

P;:c. 1. Действие теплового ■ гаока -na cmrrc? белка в клетках, организмов, от-личяинцнхея по температурам ергд обптяпня. Bptria згссозацня - 1 час.

оир.иом, вид шелкопряда, обитающий и умеренных широтах, чётко от-лнча'сгся но атому признаку от других видов южною происхождения. Замечательно, что если клетки культур тутового и дубового шелкопрядов были способны переносить несколько пассажей при температуре 37°С (три пассажа, срок наблюдения), то клетки непарного шелкопряда при эгой температуре быстро погибали.

Обнаруженная закономерность оказалась справедливой и для пары видов (человек-верблюд) в классе млекопитающих. После Ш1 (42°С, 1 час) включение меченного метионина в белки лимфоцитов верблюда остается на уровне контрольных величин (.рис, 1) и усиление синтеза БТШ73 идет параллельно с продолжающимся синтезом многих других клеточных белков. В то же время во йтятых для сравнения лимфоцитах человека -уровень общего белкоиию синтеза в :)1 н.ч же условиях приблизительно на 40®'« ниже контрольною. При ттыиктш темпора-1 ур1.1 до 440С (рнс. 1) синтез белка и лнмфоцшах человека и верблюда резко падает» хотя и остаётся болге высоким в последнем случае. Отмстим. что конститутивный БТШ 73 являеюя единственным представителем семепсгня ШШ70 н основным клеточным белком, синтезируемым при эгой-1 емпературе у лимфоцитах верблюда (данные не прияецены).

Таким образом, во ассх изученных классах органн .мов (рептилии -с.\(. ниже) более терморелюгешные ьиды южного происхождения . обладают более высокой устойчивостью синтез* клеючного белка к действию высоких тгмпернтур.

3. 2.2. Температурные ^редели экспрессия БТШ. Коасттгтутшшьш тцц сишш БТШ в кленках терморстцстснтсих форм. Основные результаты данного раздела нссиеяошишп были получены на широком представительном спектре ящериц, населяющих различные температурные ниши. Независимо от происхождения и условий среды обитания у псе.-, изученных ьплоп ящериц при ПИ индуцируются идентичные по мол. массам БТШ (85, <>8, 25 ьДа). из которых основными чилякпея БТШКз и БТШ68. Повыше пне внешней температуры сопровождается увеличением синтеза основных БТШ, достигающего максимального при сублегальных температурах. Дальнейшее повышение температуры в термостате вызывало у ящериц состояние комы и их гибель. Различные верхние температурные грашщь! сштЬа БТШ у изученных видов ящериц (отличающиеся на 1-2°С ос предельно переносимых ящерицами темеператур) хороша коррелируют с температурами их сред обитания' (табл. 21, и. таким образом, являются характеристическими пок:1 »ателами и-плоиои устойчивоуш. Вмеси: с к-.м. существенные различия были

'Гэилица 2. Ландиифтпие и температурные у словна сред обиташш и характеристики некоторых кошюненгов системы теплового шока ящериц северного н ижиого нроисхождспда

2132

жгурлпасля группа]

| пгсчакг.з круглоголощЦ

I*'i'Aríш^í•J•lA<!/aJ •янтархкги

такаепнЦская

круглшояовка (РНгЬххсрНаЫ* ги^Ма) такыр з ая кругло! оловка Р}-,гЬюгеркй1т ¡кИихера) | (рсбиеизлыЦ геккоа Г/СмюЬзтоа екптсяс!)

Проюлжепяе тебл. 2

'■ 1 ■ . ' 2 -3 ,4 . . 5 ' "6 . ; 7:

ТУ РАЙСКАЯ 1 'РУ1ША

каснпйсксй геккоз ~ (ОрпиоЛсс/^ш Щзр'шз) гл пнистая к кесчгкяя п)х1!.пи, рязпалипы н грегзкпи строений, хол-могорье 28-32 37-43 * 80 •п

сппоковив гскков (Тас.о'сЬпх 5л:гл-;.'5) пасчяиЕЯ иустыпя 26-30 36-43 32 72 «

лппейчягая «цу^нг. (ЕгстшхМасоЫс) • пссчяргя с глеглзс1ЯЯ иустыпя 38-44 37-48 * 93 1/1

сетчатая ящурке-(Егеттз ¡¡гйтткв) песлпгг пустым 38-41 37-47 * : 85 1"

стел к я я 8г«ме (Авств ¡ев^ЫевЬша) глгппстяя с пгсч8кая пуст мия, холмогорье 41-44,8 38-48 * 92 1/1

Продолжен:» габл. 2

1 ;" 2". . 3 - 4' 5 6. ' 7

Ч i'A ¡i ü-.'l Ф/. 1 H'ClCTiT ■ГРУППА • • •

кашч'азсказ. агаа (. tgamü глыеде!ta) камсЕвстиг.склони и ущгльз 28-33 37-47 * 91. *

ainmcxaii io.¡cr:¡,tj (Abltphanu patir.oiJews) 21 XA РО-СШ UICKAIl хат\гшорье, анюрнгя степь, склони гор, додшш jen 28-34 36-42 * .- * *

ГРУППА

золоткстзд м.буя (Mabuya eurata) ЕВРОПЕЙСКАЯ ГРУППА еклоаи гор, Gtjcronue оЗрыгм, narcjnaa стснь 33-34 37-43 * * *

прыткая ящерица . (Lstcriacgilis) rojLi, стегш, овраги, лссвые полявы, сады" 27-35 36-42 33 20-46*** *

жаа050дящз« ¡гщегаца (Leecria г¡ripa.-з) ластвсииые а хвойные. леса 27-32 35-42 .17т30*** i/i

Продолжение тпбл. 2

.1 : : 2 • '.3' • 4 ' 5 ' 6 ■ 7

СТЕПНАЯ ГРУППА

ратноцистпай; яи\уркг (ЕтетгЛт с г ¿г.* а) КЛВКАЗО-ШЛО-13НА ГСЖАЯ ГРУ 7/ПА 1СЦ!, долапм, плато 35-40 36-43 * 48 *

скглМ!г:.' ящгрппя (1м(сг!а зсл!ср!г) екалпетке в К£лгеспсгы( уЧЕСТКВ гор 28-32 36-42 24 ■Ф .37 «

•* --паяем« отсутетвуот . '

"* - <}к>рие. {КГ с промежуточной по.таижл остью по «тцоспегшге к СИЧЯР! II с1Н5Р2 .

*** - содерж-алне ПТ11170 варьирует в зависимости от ареала обитания впДа

' . - далкме взяты тп рлГют следующих акторов; Шачмахов СI*?81Лтаев (1985), Богданов (1962), Кт(ато\' &

ЯЬ-ипшакот (19Р2 ), Дарепскнн(19б7). Налш!К1ОТи др. (1477) " • данпые получе>в.г одиоиергалм 503-эяектро-}юрс1ом мечевы* пол1тсптидов

* данныепатучеиыскэяпровзвнем'пятен БТШ70 налвумеркмх электрофорстраммал "" - давяыеволучены скашфованнем одномерных вммутшоэлектрофоретрз™ - данные г.атучегпл методом ре]-з1иГ^ гсаМпу з«зу

зарегистрированы в температурных интервалах индукции а продолжающегося синтеза БТШ. Из результирующих данных, приведённых в табл. 2. видно, чзо в отличие от "северных" представителей семейства Lacer-tidae, синтезирующих БТШ в диапазоне (35-36С)-42°С. у дневных ящериц южного происхождения гттот рннтез индуцируется при температурах в среднем на 2°С выше и продолжается вплоть до 47-50°С. Промежугочнос положение занимают изученные ночные южные виды - гекконы. Имея сравнимую с лацертидами температуру индукции БТШ68 (36-37°CJ, они обладают более высоким верхним пределом их синтеза (43-4.',"С). Дан-, ные табл. 2 позволяют заключить, что ширина, диапазона абсолютных значений внешних температур, при которых наблюдается индукция н-нродолжающийся синтез БТШ,. хорошо коррелируют с температурными условиями среды обитания вида. Из всех изученных в данной работе яшериц, обитающих на территории Туркменистана, лишь азиатский гологлаз (вид, отловленный на высоте 1500 м) имеет аналогичные лацертидам (живородящая, прыткая и скальная ящерицы) температурные параметры нндукшш и продолжающегося синтеза БТШ (ьаСш. 2).

Следует также указать, что использояашше в данной работе ящерицы из семейства Lac'erfidae, в частности живородящая и скальная ящерицы. п природе практически не встречаются при температура:; воздуха, вызывающих у них индукцию БТТ11 (табл. 2). Другими словами, такие температуры для них являются экстремальными, а синтезируемые в огаст на это воздействие БТШ, по-вндпмому, полностью мобилизованы на осуществление экстренных функций по защите организма от гипертермии и, таким образом, па сохранение вида. С другой стороны, у теплолюбивых южных видов, таких как закаспийская, такырная и в особенности песчаная круглоголовка, оптимальная • температура тела которой п летний период составляет 41-М°С [Чсрлин, 1989], индукция ».активный синтез БТШ 63 как раз находятся п пределах температурного интервала активности айда [Шаммаков, 1981; Черлин. 1989]. что указывает на участие этах белков з обеспечении нормального протекания мстаболн-чесхспх процессов в этом диапазоне температур.

В тесной взаимосвязи с темпёратурпшт условиями обитания ящериц находится и уровень конститутивного синтеза БТШ70, определяемого и стандлртных- условиях'. Данные сканирования соответствующих участком двумерных флюорограмм, приведенные п табл. 2. в целом отражают убывание относительных суммарных скоростей синтеза членов семейства . БТШ70 в клетках -печени различных видов Ящериц но мере снижения

средней характеристической температуры среды обитания, и, таким образом, хорошо коррелируют с температурными условиями существования вида (табл. 2) и содержанием БТШ70-подобных белков (см. ниже).

Параллельно полученные данные на культивируемых клетках насекомых свпдстельсгзукл о том, что в клетках дрозофилы при повышении температуры до 37°С происходит ннзукция новых белков (БТШ) на фо-. не постепенного уменьшения син теза нормальных клеточных белков, тогда как- в клетках кулыуры тутового шелкопряда лишь при температуре 40°С и выше заметна индукция дополнительного белка в области 70 кДа,. Аналогичную ситуацию мы наблюдали и в культуре клеток дубового ше.тсопряда. Клетки этого вида также характеризуются высокой термоусгойчивостыо, они продолжают активно синтезировать белки даже при 43°С (данные не приведены).

Двумерные флюорограммы белков, синтезируемых в клетках туто-еого шелкопряда В. mon показали, что здесь мы имеем дело в основном не с индукцией синтеза нолнпептидов de novo, как это происходит у дрозофилы, а с сохранением и усилением синтеза КПП, образующихся в норме, т. е. с нх активным конститутивным синтезом.

3. 2. 3. Внутриклеточное содержание Селков семейства БТШ70 в клетках хо.юдиок-ровних ирслстадшслеи различив« климагогеографичес-i.'iix зои. Сопоставление количественных результатов иммунного блог-тиша суммарных белков печени различных видов-ящерни и температурных условий обитания вида (табл. 2) однозначно свидетельствует: содержпние БТШбЗ существенно зависит от температурных условий обитания вида, при этом чем пыше температура внешней среды, тем выше относительное содержание этих белков. Особенно ярко зт отличия проявляются у животных, занимающих полярные по температурным характеристикам экологические ниш;:. Крайние значения относительного содержания БТИ168, различающиеся в 5-6 раз, отмечены для пеечнной круглоголовки (.принято за MG0/») - самого термофильно! о m всех изученных видов рептилий.- и живородящей ящерицы, обитающей в северных шпротах 'Европейской части СССР. С увеличением средней характеристической температуры среды обитания наблюдается и увеличение содержания БТШ63. ' Так. для прыткой ящерицы, южная граница распространения которой доходит до Киргизии |Яблоков, 1976], характерно 2,5-кратпое увеличение содержания БТШбЗ, в сравнении с живородящей ящерицей; однако, оно в 1,5-2 раза, как и а случае' разноцветий «турки, уступает количеству БТШ6& у ящериц туранской фаунистической группы., обитающих б пустынях н полупустынях

Центральной Азии. Интересно, ■ что . наряду с относительно высоким содержанием БТШ68, свойственным всем ящерицам южного пропсхож--дения, определённые сгппгчия этого показателя можно отмстить у дневных и ночных видов этой группы. Содержание БТШбЗ у ецпнко-вого и гребнепалого гекконов} ведущих ночной образ жизни,' характеризуется наименьшими значениями в рамках этой группы животных и в среднем на 10-20% уступает Содержанию КПД68 у термофильных дленных видогг - песчаной круглоголовки к линейчатой ящурки;

Сходная зависимость содержания БТШ68 от телтсраТуры среды, обитания наблюдается и для ящериц, обитающих я горах и предгорьях. Так, скальная ящерица, обитающая во влажных ущельях Кавказа на' высотах до 30G0 м Щарезсяий, 1967], содержит примерно в 2,5 раза меньше БТШбЗ, чем кавказская агама, населяющая хорошо прогреваемые предгорные лолмпстке участкл южных склонов Копст-Дага [Araen, 1985]. .

Таким образом, судапгруя данные rio содержанию БТШ70-нодобных белков для всех изучению п этом, плане видов ящериц, следует отмстить чёткую полоаагтельиую корреляцию между температурными условиями обитания вида в природе и исходным уровнем БТН170-подобных белков. Очевидно, что высокая хокцентрацня стрессовых белков' у видов, обитающих з киагых . шпротах, д сравнении с "ссг.ерныд.т" видами, пеобходгшз.' для обееяечепия возросших, в соответствии, с высокими абсолютными значениями температуры внешней среды и тела животных, нормальными . клеточными. я "спасающими" (рспатуращм частично дснатурлравашшз. белков и др.) функциями 5ТШ70. Это обстсятсльспзо также отражает готааггесгпз. организма, к. резкому изменению. телгггер.тгур-ных условий среды, что возможно при кратковременных перемещениях а пространстве, добьшантг пища, возникновении епаскостп и т. д.

Содержание БТШбЗ - язяягтея ' кардинальной. характеристикой состояния системы теплового шока. Одной ;;з прлчнм столь дифференцированного еодерсхашгя БТШбЗ в клетках различных видов-ящериц мо;кст быть различный- уповтпъ - Еоксппупптиого пяггеза БТШбЗ, определяемого, п стондартикх условиях. С другой стороны, высокий уровень 5ТШ70-подобныд -.белкой у ящериц юяагого происхождения,-. молтвг ■. быть следствием более оффсгпнвноЙ .транскрипции мРШС с соотЕетстаукмцнз-генов тешгопого пгстса, их. нпдопянют* «".последующей' трансляции. В згой связи на следующем этапе. мы. провели- анализ..эксргсси мГШС-ЗТШ70 -з. пулт^тиЕпруемых . ^тетках различных- видов шелкопряда и клетках печени ящериц южного и северного пронехождстшя.

3.1. '1. Эхаг^сссггг г.гРШС-БТОГ70 луа пермп.-гитях я еытотсп темп^-

/

ратурах в клетках котраспшх форм. Уровень МРНК-БТШ68 оценивали при помощи дот-гибридизации суммарной РНК с геном БТШ70 Хепорш " 1аеуЬ. Животных перегревали при различных температурах (в зависимости - от термоустойчивости вида) в течение 60 мин. Далее их содержали ещё. 15 мин при 25°С, после чего забивали и выделяли суммарную РНК. Контрольных животных содержали при стандартной температуре 25°С'.

Гибридизация суммарных РНК, выделенных из контрольных животных, с геном БТШ70 лягушки выявила разительные отличия в пулах мРПК-БТШбВ у некоторых представителей туранского и европейского фауннстических комплексов (рис. 2, а). Относительно высокий уровень МРНК-БТШ68 при 25°С отмечен у такырной, закаспийской и песчаной круглоголовок. В меньшей степени он выражен у сщшкового гехкона -вида .с ночным циклом суточной активности. Напротив, сигнал гнбриди-' зацин значительно слабее в случае прыткой ящерицы.

Определённые отличия были обнаружены и в экспрессии генов БТШ68 различных видов ящериц в условиях действия высоких внешних, температур. В условиях проведения данного эксперимента у мабуи, такырной и закаспийской круглоголовок действие высокой температуры (43-45°С) приводило к некоторому увеличению содержания мРПК-ЕТШ68...Вместе с тем, хорошо выраженная нарастающая экспрессия генов БТШ68 'была обнаружена у сцинкового геккона при 37°С и 41°С и особенно ярко у песчаной круглоголовки при температурах 42°С и 4°С. Последнее обстоятельство позволяет предположит!!, что у песчаной • круглоголовки аналогична^ азстшшая экспрессия мГ'НК-БТШбЗ происходит и в естестеешшх условиях обитания, так как температуры 41-440С являются отн.мгл}>нимн для этого вида в летний .период [Черлин, 1939].

Увеличение содержат:;; мРНК-БТШ68 было зарегистрировало и у прыткой ящерицы при 42°С, однако, оно было шв;е, в сравнении с южными видами. 3:от экспериментальный факт можно обменить тег,г, что ичш;цчпе от всех представленных южных видов ящериц температура 42|ЭС является критической , для прыткой ящерицы, обитающей в регионах с умеренным климатом, а сшггсз БТШ.53, который еще наблюдается в этих условиях, по-видимому, направляется матрицами, транскрибированными при более низких температурил в процессе повышения температуры уела ящерицы. ■ •

Б случае шелкопрядов В. шоп н А. решу!, способность клеток, синтезировать БТШ при экстремально высоких телшературах может' обьясияться тем, что эти виды шелкопряда южного происхождения [Аста-уров, 1974] и тсрмоустойчивосгь может являться зволюцнонно вырабо-

-27-, -----

I 2 i « ¡ в

Гь \

I i о о:

0 ■ © О ¡ о А

' о о о <3 \ о ;

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 2. Дот-гибриднзацця суммарной PIÎIC ящериц (а) и иозери шб-ридизаштя тстеток D. virilissr В. morí Го") с клонами, содержащими ген БТШ70. a: PHIC по 5мкг, клон X XL10 из X. laevis; 1 - золотистая мабуя (25t, 43t), 2 - песчаная круглоголовка (25°С, 42t, 45 ti, 3 - закаспийская круглоголовка (251, 43t), 4 - сцинкодьш геккон (25^, 371, 41°С), 5 - такырная круглоголовка (25t, 43t), б - прыткая ящерица (25t, 4?С), 7 - дрожясевая тРНК; б: РНК по 10 мкг, клон 229.1 из D. melanog.aster, ТШ - 1 час; 1, 3 - 2^С; 2, 4 - 37°С; 5 - 40 "С; 6 - 451; D. virilis (1, 2). В. morí (3-6).

та иной особенностью. После электрофореза равны;-: количеств РНК с последующим переносом на 'нитррцеллюлозиые фильтры приладили гибридизацию сорбированных на фтхлътрг РНК с 2Р-мече;ш;и клопом 229.!, содержащим ген БТШ70 ü. melancsasrer. Для сравнения брали РНК, выделенную из клеток D. virilis, цодвершутых TU1 при 3 fC. Ha автораднограмме, представленной ira p¡rc. 2, б, шхдно, что в клетках В. тогИдоролаи! 3-6) происходит нарастание снигеза РЮС, кодирующей БТШ70, при новишепии температуры вплоть до 45аС..С другой стороны, в клетках дрозофилы при температуре 4Gt спите?. мРШС для БТШ70 падает до пуля [Aslibuner, iionner, 1979J, Таким образом, г.ю:-:с-но заключить, что в клетках В. raori регуляция синтеза Б ГШ происходит как на уровне транскрипции, так и ¡ta уровне трансляции. Способность клеток В, шоп транскрибировать мРН1С-БТ1П70 и транслировать соот-ветегаующин белок при экстремально высоких температурах коррелирует с их высокой термоустойчнвостыо.

гй» " * 9

в Î

\ '

i i

Таким образом, как у яхцериц, так и в клетках шелкопрядов южного происхождения наблюдается эффективная транскрипция мРНК-БПШО при температурах (вплоть до 45°С) значительно более высоких, чем у соответствующих видов, обитающих в умеретшх широтах.- '

3. 3. Ср ав к ктельи а я характеристика состояния п актив адии фактора трапехркицив гепоп теплового шока (HSF) у язперлц различных клвмато-геогрпфичсск-пх зои. Вариабельность состояния Б'ГШ70-подобных белков и кодирующих их мРИК в клетках, ящериц к тутового шелкопряда различного происхождения высветила закономерный вопрос о состоянии и активации другого компонента ТШ - HSF. В этой связи для более глубокого понимания механизмов развития ■ тепловой стресс-реахшш и регулягорных свойств HSF мы провели анализ состояния HSF у некоторых видов ящериц северного и южного происхождения. ■

На рис. 3 представлены результаты gel-shift mobility electrophoresis равных количеств белка экстрактов печени 4 видов ящериц северного н южного происхождения после ннкубаднн с меченым 32P-I1SE. Видно, что у всех подставленных в данном эксперименте ящериц при стандартной температуре (25®С) наблюдается Связывание ^^Г-IISE с HSF с образованием по меньшей мере двух высокомолекулярных (конститутивных) комплексов с пожженной по сравнешпо со свободной меткой элсктрофорстической подвижностью. Условно эти формы названы clHSFl и clHSF2. Связывание 32P-HSE с HSF является специфическим: добавление 200-кратного избытка измененного USE практически полностью подавляет всякое связывание. Изалторадпограммы также следует, что единственным видом, имеющим хорошо выраженные clIISFI и clH5F2 при 25°С является живородящая ящерица - вид, распространённый в северных широтах .и имеющий .существенно более низкую в сраи-ненил с южными видами тердгоргзистетгшость (табл. 2). clHSFl к clHSF2 у живородяще!1! ящерицы значительно превышают соответствующие формы HSF у видов южного происхождения. Иная картина прослеживается у трёх видов южного пропсто.'гдешга (песчаной круглоголовки, каспийского геккона и сетчатой ящурки), использованных в зтогх ж эксперименте. В отличие от живородящей ящерицы, ошт, с одной стороны, характеризуются существенно меиыша.ш количеств алш исходно присутствующих при' 25°С eJHSFl н cffiSF2,c друго*г- одна in; этих, форм HSF доминируетнад другой. , ".- ■ •

Качественный анализмежвидоВых оютгапт в соотношении исходных HSE-связывающих форм HSF у видов южного происхождения, представленный в табл. 2, выявил (за исключением степной агамы)

схожую картину вариабельности в соотношении cIHSFl и clIlSF2. Так, у гребнепалого геккона, линейчатой ящурки и песчаной круглоголовки резко доминирует cIHSFl, в то время как каспийский геккон, напротив, имеет практически лишь clHSF2. II, наконец, сетчатая яшурка имеет при 25°С конститутивную форму HSF с промежуточной одектрофореш-яеекой подвижностью в сравнении с таковыми для cIHSFl и clIISF2. Таким образом, приведённые пыше данные однозначно свидетельствуют о четких различиях в соошошеиии HSE-связывающих. форм clIISFl и cIHSF2 у ящериц северного и южного происхождения.

В экспериментах по тепловому воздействию мы использовали два значения действующих температур (42°С и 45°С) с тем, чтобы они входили в перекрывающиеся температурные диапазоны -жизненной активности и синтеза БТШ у изучаемых видов. Как показал gel-shift mobility electrophoresis экстрактов печени живородящей ящерицы (рис. 3) и каспийского геккона (данные не приведены) в норме и пойле TLH (42°Q, тепловой шок у последних сопровождается заметным снижением интенсивности cIHSFl и C1IISF2 соответственно. Аналопншое тепловое воздействие на песчаную круглоголовку не приводит к видимым . изменениям в содержании исходных форм HSF (рис. 3).

Анализ активации HSF у дневных южных видов в целом указывает на увеличение количества исходных HSE-связывающих форм после ТШ при 45сС. Если у линейчатой ящуркн количествр исходных cIHSFl и clHSF2 после бО-япшутного перегревания при данной температуре заметно не меняется в сравнении с ко!пролсм, а у степной агамы наблюдаете: и виде тенденции к увеличению, то у песчаной круглоголовки в этих же условиях хорошо заметно не только увеличение количества cIHSFl, но и появление суп ерзысок о молекулярной формы I1SF. Более д:штелъные тепловые нагрузки, как в случае с сетчатой ящуркой (45°С, SO мин.) также приводят к достаточно сильному в сравнении с контролем увеличению исходной HSE-спязьтвагощей формы HSF (данные не приведены).

В процессе анализа состояния и активации HSF у видов южного происхождения мы обратили внимание ца то, что у некоторых ящериц, в частности у сетчатой ящурки и песчаной круглоголовки, увеличение шгтенснвносш соответствующих полос HSF после перегреванил сопровождается одновременным изменением их злектрофоретической подвижности; что наводит на мысль о вероятной энзима-шческой модификации самого HSF или какого-либо клеточного белка, возможно находящегося в комплексе с HSE-HSF. Известно, что HSF дрожжей подвергается фосфо-рилированшо после ТШ, причём этот процесс коррелирует с уровнем

: ^ ' J. . ^ • . . . -i

; - fiSftli " ^la — 14

///II III! \ \\

I 2 3 4 5 6 7 6 9 10 II 12

Рис. 3. Gel-shift mobility electrophoresis экстрактов печени ящериц северного н южного нронсхождсиияглсивородящая ящерица: 1,2- 2iPC; 3, 4 - 42РС; каспийский геккон: 5,6- 25°С; сетчатая ящурка: 7, 8 - 25t; песчаная круглоголовка: 9. 11 - 25°С; 10, 12- 42t. Все экстракты (лунки 1-12) инкубировались cJiP-IISE 10 Mini, при В лунках 2, 4, б, 8, 11. 12 присутствует 200-кратный избыток немечеиною IISE.'Сбоку указашю положение clTISFl и clIISF2. Анализировались равные количества белка.

транскрипционной активности генов ТШ [Sorger, 1990 ]. Аналогичным модификациям подвергается к HSF .человека [Larson et al., 19S7], но механизм того, как фосфорнлированке может активировать HSF пока не известен. Такт: образом, нельзя исключить, что аналогичная модификация IISF может ¡шеи. место послс ТШ и у рептилии. Более того, анализ HSF из очищенных клеточных ядер печени сетчаток ящуркк показал., что I; норме ядра также содержат HSE-сияэывающую форму HSF, которая изменяет свою подвижность после ТШ (данные не приведены).

Опксашще выше присутствие коистнтупш1Шх HSE-связываюших форм in vivo в нормальных физиологических условиях у всех изученных в этом плане ящериц, по-видимому, является важным элементом в системе стресс-нндушфуемон активации генов ТШ. В пользу данного предположения указывает то, что и болыштствс изученных нами случаев

ксходио присутствующие формы clHSFl и cIHSF2, несмотря на некоторое снижение или увеличение своего количества поел? ТШ или появление более высокомолекулярных форм HSF, всё же остаются доминирующими HSÉ-связивающими формами HSF в клетках ящериц. Более того, оказалось, что на фоне полного отсутствия вновь образованных высокомолекулярных форм HSF или доминирующего присутствия конститутивных clHSFl и/или clHSF2 посте описанных выше и других режимов НИ идёт активный сиптез БТШ. Суммируя зга далшые с термоиндуци-рованным изменением электрофоретической подвижности clHSFl и присутствием вновь образованной формы в ядре (данные не приведены), можно предположить, что именно конститутивные формы clHSFl, clHSF2 и, возможно, их производные принимают участие в активации транскрипции генов ТШ. Это предположение подразумевает наличие дополнительного клеточного фактора, присутствующего наряду^ с HSF в промоторной области генов '1Ш или вносящего точечные модификации, например, посредством фосфоршшрования сериковых и треошшовых. . остатков в молекуле IISF.

Эти выводы о возможной роли исходно присутствующих конститутивных форм clHSFl и clHSF2 я активации транскрипции генов ТШ, по-ввдшому, справедливы как в отиошенип ящериц северного, так и южного происхоягдешиг. Вместе с тем, по-презшему нерешёшшм остаётся, вопрос о том, каким образом дифференциальные температурные условия существования этих видов, их различная терморезисгоггность и связанные с mura особенности состояния некоторых компонентов системы теплового шока (в частности HSPs и HSFs) оказывают взанморегулнрующее воздействие друг на друга. Вариабельность внутриклеточных концентраций БТШ70, наряду с продемонстрированными выше отличиями а содержании clHSFl и с 1HSF2 у ящериц'северного ц южного происхождения наводит па мысль о возможной негативной авторегуляции экспрессии БТШ70. В этой связи мы решили выяснить как взаимосвязаны исходно различные виутрхпслето«пше количества основного стрессового белка БТШ70 н синтез БТШ In vivo. Для исследований выбрали два вида с приблизителтлю равной тсрморсзистеитиостыо, по в 2-3 раза отличающихся по содержанию БТШ70 в нормальных условиях: самый "северный" га изучешхых лидов штородящая ящерица я ночной- "гожпый"- вид гребпепалый геккон. - Из представленных па рис. 4 (а, б) флюорограмм одномерных SDS-злсктрофарезоп, мечешшх in vivo 33S-Mem0HHH0M белков печеии э-птх ящериц хорошо видно, что после идентичных тспловременпых воздействий (например, при 39°С н 42°С) в клетках

í—.f—»•—<* —.

¿»¿WüA —

•i t

85 И^

68 f 1 ! ■

пмн • .

»мн^ггт-85 '■"iJr*— -60

i

Г-í-tr - -ТГГ- - '

M ».-• • -'- i«'"

í- f4

25 36 39 42 °C 25 37 38 3942 43 °C

Рис. 4. SDS-электрофорез меченных in vivo З?3-метиошшом белков печени живородящей яшерицы (а) и гребнепапого геккона (б) в норме и после действия ^азлшшых температур. Белки мстили in vivo через 1 час после ТШ при 2э С. Анализировались равные количества белка.

печени живородящей ящерицы in vivo синтезируется существенно больше БТШ68 и БТШ85. чем в клетках гребнепалого геккона. Иммунолггпчес-кая детекция tISF при помощи соо тветствующих специфических антител показала, что отмеченные выше отличия в содержания конститутивных форм HSF..по-видимому, не связаны с суммарным содержанием HSF. но коррелируют с впутршелгточньш содержание:.; основного стрессового белка БТШ70. Полученные in vivo данные указывают на негативную регу ляцию БТШ70 количества актпшшх фор.-.t IISF, что позволяет последнем)' самостоятельно или При помощи дополнительного клеточного фактора регулировать ар.'шскркпщно генов ТТП.

3.4. Асаллз тепловой стресс-^акцпн п клетках этничсагк н экологически j> аз л пч шдх u о и у л !щ u.ü человек^ Наиболее важным в. социальном и интересным в научном аспектах из исследованных в данной работе орга-гогзмоЕ является человек. До сих пор в различных лабораториях клетки млекопитающих, в^ том числе человека, использовались для изучения фундаментальных аспектов проблемы теплового шока [Welch et al., 1989]. В наших исследованиях надш впервые сдслала попытка выясшгп» роль эКолопргсских и этнических факторов в адаптации оргшшзма человека к высокой температуре.

-33В исследованиях использовались диплоидные фнбробласты кожи двух различных групп людей. Первая группа была представлена туркменами-аборигенами, населяющими в течение многих поколений жаркие и сухие пустыни Центральной Азии. Вторая группа состоит из русских, проживающих в умеренных климатических регионах европейской части РФ. В экспериментах использовали культуры фнбробластов, полученные от 7-10 добровольцев, в каждой из исследуемых групп. В экспериментах использовали фнбробласты кожи после 10-15 пассажей при 37°С. Клетки культивировали в среде Игла, содержащую 5% фетальную сыворотку телёнка и 5% бычью сыворотку. Выживаемость различных штаммов фибробластов после действия 'ГШ определяли с помощью метода стандартного клонирования. Так как индивидуальные клеточные линии значительно различаются в соответствии с их клоно-генетическим потенциалом, степень выживаемости определялась как процент сформированных колоний в подвергнутой ТШ культуре к таковым же в контрольной культуре. Для сравнения синтеза БТП170 и процента выхснвае.мости зяеток посте действия Till использовались параметрические тесты Wilcoxon и Wilcoxon-Maan-Wbitney (1970).

Всего было использовано десять клеточных линий группы 1 и семь клеточных линий группы 2. Сравнение авто радиограмм, иллюстрирующих процесс белкового синтеза в культурах фнбробластов этих групп при нормальной физиологической температуре (37 °С) не выявило каких-либо существенных отличий. Действие ТШ (2 часа, 42,5 °С) приводит к сильной индукшш индуцнбелыюго (lisp) и обоих конститутивных членов семейства БТШ70 (hsc, hsx). После 4-чассвого действия ТШ, все изученные клеточные линии обладали способностью синтезировать каждый из белков семейства БТШ.70 в течение нескольких часов, с одновременным заметным снижение?.! общего белкового синтеза. Вместе с тем, репрессия обычно была более заметной в клетках группы 2.

Застуживает внимания тот фатгг, что несмотря на определённый уровень изменчивости в синтезе ЭТШ посте различных режимов ТШ наблюдаемого я клеточных, линиях различного пройсхояздения, самая высокая степень вариабельности была зарегистрировала в "клеточных, линия группы 2. Клетки туркмен (группа 1) в этом аспекте были значительно белее постоянными и однородными. Азторадиограммы, представлешше на рис. 5 иллюстрируют процесс синтеза белка а клеточных линиях фнбробластов, выделенных у. двух групп индивидуумов -туркмен и нетуркмен при нормальной температуре и после действия ТШ различной длительности. Хорошо видно, что при нормальной

• . • «

В

5 . 2f-

Ä, Li.

и

', г , _ j '

1 E

Рис. 5. Влият1е^Мтста11бст11ТШ (42;5<:^!1а сЯ1гтсз белка в фиброб-ластах кояаг индивидуумов различных популяций человека (А, В, Д -туркмены (Туркменистан); Б, Г, Е - русские (РФ). Представлены авторадиограммы двумерных злектрофорезов контрольных клеток (А. Б -3/t) и посте ТШ (42, fC .: В, Г - 2 часа; Д, Е - б часов), "Стрессовые белки указаны стрелками (слева направо): hsc, hsx, hsp; ас - актин;

температуре (рис. 5, А и Б) и прсле 2-часового ТШ (рис. 3, В и Г) не обнаруживается особых качественных отличий в спектрах синтезируемых белков у сравниваемых клеточных линий. Однако, наиболее поразительные и воспроизводимые отличия между клетками туркмен и клетками другой группы становятся очевидными после 6-часового действия теплового шока (рис. 5, Д и Е). Таким, образом, клегочные линии, полученные в группе туркмен, демонстрируют устойчивый синтез всех членов семейства БТШ70 после такого . типа теплового воздействия, в то время как фнбробласты культур из второй группы характеризуются полной репрессией синтеза нндуцнбельного белка семейства БТШ70 (hsp), и едва обнаруживаемым синтезом конститутивных форм БТШ70 (hsx и hsc). Более того, после б-часового Till, клеточные линии из первой группы продолжают синтезировать многие другие клеточные белки, тогда как клегочные линии из второй, группы полностью прекращают весь белковый синтез после такого же воздействия (рис. 5, Д и Е) .

Компьютерная денентометрия размеров и интенсивности пятен, соответствующих каждому члену семейства БТШ70, показала, что в клетках первой группы людей синтез всех белков семейства БТШ70 после 6-часового Till увеличивается или остаётся на таком же уровне как и после 2- и 4-часового повышения температуры (рис. 6). С другой стороны, синтез всех трёх членов семейства БТШ70 в клетках группы 2 увеличивается после 2- и 4-часового ТШ и падает до почти нулевого уровня после 6 часов действия 1111. Поэтому, шестичасовое воздействие ТШ, вероятно, представляет собой критическую точку, где различия между группами становятся очевидными.

На следующем згапе представлялось целесообразным проверить, представлена jm как-нибудь па транскрипционном уровне экстраординарная способность фибробласгов туркмен осуществлять белковый синтез при тепловом воздействии и течение длительного периода (6 часов). Однако, проведённый анализ нозери-гибридизации не выявил каких-либо значительных отличий мезду фиброблаегалш двух сравниваемых групп в плане синтеза мРНК-БТШ70 как при нормальной температуре, так и после шестичасового воздействии тепловым шоком (данные не приведены).

Работы различных авторов [Beckmann et aL, 1992] продемонстрировали, что относительное увеличение синтеза БТШ70, по-видимому, зависит как от предсуществующего уровня БТШ70, так и степени теплового воздействия. Вероятно, регуляция синтеза членов семейства БТШ70

ИНТЕНСИВНОСТЬ СИНТЕЗА (%)

hsx

37' «,5е «,5е . Wh 6Ъ

37 е

42,5° 2-4 Ii

:42,5е ;6Ь

100 90Н 30 70 60 50 404 30 2010-

bsp

37° 42,5° 42,5° Wh 6 b

Рис. 6. Количественный аналю синтеза отдельных членов семейсгва БТШ70 в фибробластз к кожи человека , различных популяций ( О- туркмены О- русские). Предстаьлены средние значени:; сканирования пятен hsc,, hsx и hsp на двумерных авгорадиограммах трёх независимых экспериментов. За 100% . принята интенсивность пятна hsx после б-часового ТШ.

идёт по принципу обратной связи.. Можно полагать , что после б часов ТШ защитные ресурсы клеток второй группы людей некоторым образом истощаются, и эта обратная связь более не существует. Наши эксперименты по клоиальной выживаемости фнбробластов группы 1 и группы 2 подтвердили это предположение. В экспериментах, сравнивали клональ-ную выживаемость трёх индивидуальных клеточных линий группы 1 с тремя индивидуальными клеточными линиями группы 2 после 6-часового ТШ: Несмотря на высокую, вариабельность в выживаемости, выявленной в пределах каждой группы в зависимости от культуры (различия варьируют от 2 до 5 раз), во всех сравненных парах " клетки туркмен проявляют значительно больший процент выживаемости, чем клетки группы 2 (рис. 7). Статистический анализ этих экспериментов показал значительность этих различий (Р <0,05).

Проведённые предварительные . эксперименты по иммуннологичес-кой детекции уровня БТШ70 в линиях фнбробластов различного происхождения при нормальной температуре дали довольно противоречивые результата. В то время как все клеточные лшпш, принадлежащие к группе 1 (туркмены),. одинаково показывают- относительно высокие уровни Ьях 'и Ьяс, некоторые клеточные линии из группы 2 имеют меньшие количества этих белков, но при этом другие клеточные линии из группы 2 характеризовались сходными уровнями содержания Ьзр по сравнению с группой 1, а иногда превышают в этом плане группу 1. Эти результаты, вероятно, демонстрируют высокий уровень генетической изменчивости в системе, определяющей тепловой ответ на клеточном уровне у индивидуумов группы 2. Широкомасштабный пепуляционный анализ по определению . содержания в клетках человека БТ1П70 при нормальных температурных условиях, включающий в себя анализ клеток-туркмен, худившихся и выросшзпе п европейских регионах России, Вероятно, прольёт свет на эту проблему. .Также, не исключено, что различия з п редс у щ г ста у зошет, I пуле ШР, его сродство к НБЕ, иУили его зермостабилыюегь могут быть другими обгленешшми* полученных нами результатов. Нозеря-блот анализ, тем не .менее, не выявил каких-либо значительных отличий в экспрессии гепа КП.Ц70 после жёстких условий теплового шока между двумя срапшгаземыг.ш группами. Тагам образом, полученные результаты предполагают, что клетки туркмен проявляют терморезистентный фенотип не на уровне индукции мРШС-БТШ.70, а на некоторых более поздних стадиях, включая транспорт мРН1С-БТШ70 п полиссмы и/или другие уровни механизма трансляции.

3. 5. "Авалю ко.ибикярозагтого действия теоаояого гаока н внрусвой

С1ТДШ1Ь ВЫЖИВАЕМОСТИ ('/.)

20-

10 -

1 2 3 4 5 6

Рис. 7. Сравнительная выживаемость клонов фибробластог после 6 часового ПН (42,5 С) в трех независимых культурах туркмен 11. 2, 3; и русских (4. 5, б).тТ;:сло колонии в каждой соотвстси'.уит:-'! : Г'е ¡он культуре взято за 100%. Каждый результат явлтется средним трёх независимых экспериментов. Различия признавались жачлмымн при перояг-ности случай!гых отличии меньше5 - фибробласты гуркмен ;£]-фибробласты русских. •

инфекции на клетку. При тепловом шоке происходит перестройка всех уровней активности генома - от транскрипции и созревания мГНК до трансляции и сборки белков.Наряду с тепловым июком особое место п ряду стрессориых модуляторов занимает я вирусная инфекция. Следует отметить, что процессы, развивающиеся в клетке при ТШ. равно как и при подчинении ее' гснстичсского' аппарата в случае вирусной инфекции приводят к фундаментальным перестройкам в функционировании аппаратов транскр.нпщш и трансляции. Возможно, что в обоих случаях действуют сходные Л1£хаш1змы подавления или усиления экспресии определённых генов. Ряд данных, полученных-в различных лабораториях, свидетельствуют, что исход такого сочетанного влияния зависит и от особенностей самого вируса и от типа клетки-хозяина [2<тЫш с1 а!., 1986;

YerushaJmi et al., 1980]. Неоднозначность имеющихся результатов стимулирует необходимость дальнейшего изучения этого вопроса на различных моделях.

Прн изучении комбинированного действия теплового шока и вирусной инфекции на клетку мы использовали две модели такого взшшодействия: острая (IIЯП) и латентная (ВИЧ) вирусные инфекции.

3. 5. 1. Дейстгве теялезого шока а вируса здерпого полпэдроза (ВЯП) па клепзз н гусслпцц тутового шелкопряда. ВЯП относится к бакул-ловирусам и его изучение имеет большое практическое значение, так как он является причиной распространённого заболевания разных видов шелкопряда - полиэдрической болезни или "желтухи" [Скуратовская, 1984]. Более того, в последнее время этот вирус привлекает широкое внимание и используется как вектор для наработки в гусеницах шелкопряда различных полезных для человека белков, в частности, К - и У-интерферсноа [Maedaet al., 19851.

Прн инфекции клеток ВЯП в них начинается синтез многих белков [Скуратовская, 1984]. Основным белком тсл включений, или полиэдров, является полиздрнп (30 кДа). На рис. 8,а представлена флюорограмма одномерного электрофореза белков, синтезируемых в нормальных и зараженных ВЯП клетках В. morí прн разных температурах (25°С и 42°С). Видны БТШ, синтезирующиеся в незаряженных клетках при повышенной температуре. Видно, что в культуре клеток тутового шелкопряда, зараженных ВЯП (72 часа после заражения) при 25°С и 42°С синтезируется в основном один бедок с мол. массой 30 кДа (полнэдрнн).

Поскольку все вышеприведенные эксперименты проводили на культуре клеток В. morí, то для того, чтобы охарактеризовать аналогичную каршну ш vivo, гусениц тутового шелкопряда Y возраста заражали ВЯП и анализировали спектр БТШ на разных сроках вирусной инфекции. Из рис. 8,6 видно, что на шестой день посте заражения в жировом теле гусениц повышение температуры не приводит к синтезу БТШ и в клетках синтезируется преимущественно полнэдрии.

Отсутствие синтеза БТШ при заражении ВЯП может зависеть по крайней мере от двух причин. Во-первых, ВЯП может каким-то образом блокировать индукцию транскрипции генов ТШ В. топ. Во-вторых, и клетках, зараженных вирусом, при повышении температуры транскрипция соответствующих генов может нормально индуцироваться, но трансляция БТШ может не идти, поскольку весь полисомный аппарат будет насыщен мРПХ вируса.

Для того, чтобы выяснить причину отсутствия синтеза БТШ в клет-

-40..... .....- ~

I с. s \i г з ч

г з ч ». I

м

г:

a.

u —

— 25

-13 ____2J

Pue. 8. Действие ВЯЛ на экспрессию БТЩ к мРНК-БТШ70 у тутового шелкопряда. а - культивируемые клетки В. mon: флюорограмма белков. синтезируемых при 25t (1,2) и 4'fC (3. 4) в зараженных (2,4) и незараженных (1. 3) ВЯЛ клетках: б - клетки жирового тела хусениц после ТШ (42РС), зараженные (1) и незаражешше (2) ВЯЛ; на гели наносили рапные количества белка; г> - ноэерн-пгбрнднзация суммарной PIIK (по 10 мкг) контрольных (25 °С - 1. 2) и прогретых (42^, 1 ч - 3, 4) культивируемых клеток В. шоп с 32Р-мечсиы:.17слонолг 229.1. (1,4) - нормальные и (2, 3) - зараженные ВЛП клетки.

ках тутового шелкопряда, зараженных вирусом, исследовали при помощи нозерн-габриднзацш! наличие мРНК-ЕТШ70 в клетках, зараженных ВЛП, и в контроле. На рис., 8,с представлена картина иозерн-пгарпдп-зацшг суммарно н РИК клеток В. morí, заражешшх и пезарзженных ВЛП и подвергнутых ТШ (ч2"С). Проведенные эксперименты пока' зхчк. что в заражешшх ВЯП клетках тутового шелкопряда происходит нормальная индукция транскрипции гена БТЩ70 при ТШ. Вместе с тем вирусная инфекция в дшшом' случае не индуцирует синтез мРНК-БТШ70 при 25t. Таким образом, эти эксперименты свидетельствуют ц пользу того, что неспособность заражешшх клеток В. morí, синтезировать BTIji при повышенной температуре связана, по-видимому, не с нарушением транскригацпг соответствующих генов; а с цнгибнро-. ваиисм синтеза БТШ па' уровне трансляции. Вероятно, при интенсивном заражении клетках В. шоп весь полисомиый аппарат клетки участвует Е трансляции вирусных белков, в первую очередь полиэдрнна.

На следующем этапе для сравнения комбинированной стресс-реакции на ТШ и вирусную инфекцию мы провели анаши синтеза белка в заражённых и незаражённьпг ВИЧ лимфобластоидных клетках человека.

3. 5. 2. Апалта действия теплового тока па ВИЧ-ннфецпровалпис и пеоафецвропашше лпмфобластоадньгг клетка человека. Мы исследовали действие ТШ на модели инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), этиологического areirra синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). ВИЧ относится к семейству ретровирусов (подсемейству лептнвирусоэ), представители которого вызывают медленные и латентные инфекции у животных [Жданов и др., 1988]. В экспериментах использовали лнмфобластоидные клетки Н9, субклоннрованные из клеток НИТ-78, полученных от больного лейкозом и хронически инфицированные ВИЧ клетки культуры H9/HTLV ШВ. Наличие ВИЧ в инфицированных метках контролировали электронной микроскопией, иммуно-блоттинго?' и нммуноферментным анализом (ELISA). На твёрдую фазу иммобилизовали анти-ВПЧ иммуноглобулины, выделенные из сыворотки крови серопозитивных пациентов. Добавляли очищенный и концентрированный вирусный антиген в качестве стандарта и выявляли его прямым анти-ВИЧ конмогагем на основе пероксидазы. В качестве контроля использовали специфическое подавление сигнала при добавлении анги-гШЧ-позипншых референс-сыпороток (нммупоферментный анализ был проведён Платонозой Т. Н.).

При исследованни хронически инфицированной ВИЧ линии клеток H9/RTLV 1I1B было обнаружено, что сии имеют иной спектр синтезируемы.--; при ТЛ^С белков, отлтгпшй от клеток пеиифнцироланиой культуры Н9 (рис. 9). Наряду с заметным уменьшение?! скорости синтеза некоторых бе;псоных компонентов, можно выделить труппу б'.-.ткои, синтез которых существенно выше з культуре ц. лето к ii9/IITLVIIiB з сравнении с ьультурой клеток 119. В первую счеридь здесь следует отметить белки рЪ, р74. р-40 и р37. Некоторые эксперт¡енгш>мм«$ данные указывают на то, что эти белки не являются вирус-специфическими продуктами. Так, р75 п р40 с определённой скоростью синтезируются и в не ¡чгфпии-ровапной'ВПЧ культ-уре клеток 119. Что ;ка касается р74.и р37, то нм-мунобхготппгг, где в качестве антител к БИЧ' была использована сыворотка крови больного СПИД, содержащая высокий титр антител к ВИЧ (Данные не приведены), не обнаружит характерных пятен преципитации, совпадающих с поло:кснием этих белков после разделения в системе О.Фаррелла. Из отого следует, что р75, р40 и, по-видимому, р74 и р37 язляются белками клеточного происхождения. Функция лта бел-

а

б

~ , V

- . да

» "Г».

"" «¡г?1 «л %

•чй»-

10»

О

я

*

• ж

Ьь

г %

Оз? « '*

Р?5

. О . 1*

гг 70 х

&

—о»

\ Ф. ■ о

Г е.Чь

' Р37

"л\ ,».в»

- СЕЬ

-> . . РТ.»

Р37 ;

Рис. 9. Двумерные флюорограммы белков, синтезируемых в заражённых (Н9/Ш,ТУШВ) и незардженных ВИЧ (Н9) лнмфобластондных клетках человека. Н9: а - 374:. б - 42°С, 1 ч; Н9/Н1ЛЛЧПВ: в - 37Ъ, г -42<С, 1 ч. Анализировались равные количества радиоактивности. БТШ к их мол. массы указаны стрелками и цифрами. Пятна, соответствующие белкам р75, р74, р40 и р37 в культуре Н9/Н1ЛЛГ1ПВ, обведены кружком.

ков пока не известна. Тем не менее, некоторые спойсгда (мол. масса, изоэлектрическая точка, относительная независимость синтеза от повышения температуры) одного из них - р75 - напоминают аналогичные параметры одного из членов семейства БТШ70, а именно белка, индуцируемого дефицитом клеточного пула глюкозы, ингибиторами глнкознлн-рования и др. [Pelham, 1986]. Отметим, что анализ флюорограмм двумерных электрофорезов белков, синтезируемых в клетках изучаемых культур при 37°С не выявил существенных различий в синтезе конститутивных БТШ. В клетках H9/HTLV HIB конститутивный БТПГ70 синтезируется при 37°С с такой же высокой скоростью, что и н клетках 119. В хронически инфицированных ВИЧ лимфобластоидных клетках также не наблюдается синтез индуцибельных БТШ7а.

В опытах по температурному воздействию изучали реакцию на ТШ хронически зараженных и не зараженных BII4 культур клеток "(рис. 9). Полученные результаты показали, что oiBer на TL11 у отобранных в эксперимент типах клеток оказался практически одинаковым. При повышении температуры с 37°С до 42°С в культуре клеток II9/HTLV ИГО наблюдается резкое усиление синтеза БТШ с молекулярными массами 70кДа, 88кДа, ЮОкДа и 1 ЮкДа. Помимо усиления синтеза mix полнпеп-тидов наблюдается активный синтез <1е novo индуцибсльного компонента БТШ70, представленного в виде четырёх нзоформ, из которых одна является доминирующей. Аналогичные события па уровне синтеза белка развиваются и в неинфицированных клегках 119,

Особый интерес представляли эксперименты по изучению влияния ТШ на развитие ВИЧ-инфекции, продемонстрировавшие усиление репликации ВИЧ в клетках Ш/ШЪУШВ после ТШ. Меюдом иммунофеомен-тного анализа было' показано достоверное возрастание количества вирусных антигенов по сравнению с контролем (инфицированные ВИЧ,. но не прогретые клетки) на 25-30% через 72 часа посте ТШ. Таким образом, наблюдается синергизм в действии Till и ВИЧ-ннфекшш. Сходный эффект был получен при цнтомегалловирусной инфекции [Zerbini, 1986], однако авторы не объясняют механизма этого феномена. Возможен о этот процесс опосредуется активацией вирусных LTR...

В заключение, суммируя все вышеприведенные данные, следует отметить следующее. Комплексный сравнительный анализ некоторых компонентов системы теплового шока у расширенного спектра организмов, обитающих в различных клнматогеографнческих регионах позволяет заключить, что их адаптация в процессе эволюции к высоким

темпсря гурам внешней среды наряду с развитием ряда поведенческих реакиий, сопровождалась закреплением некоторых молекулярных механизмов, одним из которых является дозированная, в зависимости от значений внешней температуры, активность системы генов белков теплового шока (70 кДа), реализующаяся в конечном счёте в повышенной внутриклеточной концентрации мРНК-БТШ70 и кодируемых ими БТШ70-подобных белков. Эффективная транскрипция мРКК-БТШ70, зарегистрированная у видов южного происхождения при 40-45°С сохраняется и при комбинированном действии теплового шока и острой вирусной инфекции (ВЯП); умножение вирусных частиц при тепловом шоке может быть достигнуто также и в случае латентной вирусной инфекции (ВИЧ), по-видимому,-за счёт активации вирусных LTR. Очевидно, что высокая концентрация этих стрессовых белков у видов, обитающих в южных широтах, в сравнении с "северными" видами, необходима для обеспечения возросших, в соответствии с высокими абсолютными значениями температуры внешней среды и тела животных, нормальными клеточными и "спасающими" (ренатурация частично денатурированных белков и др.) функциями БТШ70. Эго обстоятельство также огражает готовность . организма к резкому изменению температурных условий среды, что возможно при кратковременных перемещениях в пространстве, . добывании пищи, аозникновении опасности и т.д. Анализ . HSF, проведенный in vivo у различных видов ящериц, резко отличающихся по своей термоустойчнвости и обитающих в различных по температурным характеристикам экологических нишах, показал, что все изученные виды в нормальных физиологических условиях (25°С) имеют две исходно присутствующие в клетке (констигу-тилные) высокомолекулярные формы HSF и существенно отличаются в количественном, и качественном соотношении зтпх форм. Эти формы HSF oxa3aJuicb хорошо выраженными лишь у живородящей ящерицы -вида, распространённого в северных широтах РФ, тогда как виды южного происхождения хараз.теризуются меньшим количеством этих форм HSF наряду с доминированием одной из них. Количество активных форм HSF, по-видимому, не связано с суммарным содержанием HSF. по коррелируют с внутриклеточным содержащим БТШ70. Полученные iü vivo данные свидетельствуют о негативной регуляции БТШ70 количества активных форм HSF, что позволяет последнему самостоятельно или при помощи Дополнительного клеточного фактора регулировать транскрипцию генов ТШ. Впервые проведённый анализ тепловой стресс-рсакцнн в культивируемых фнброб-ластах кожи эшичес-

ки « экологически различных популяций человека выявил существенные отличия я реакции на тепловой шок: фнбробласты коренных жителей жарких пустынь Цетральной Азии в опшчие от фнбробластов лиц, проживающих в умеренных широтах сохраняют синтез всех членов семейства БТШ70 и некоторых клеточных белков после жёстких ¡силовых воздействий. Клетки туркмен проявляют терморезистентный фенотип не на уровне индукции мРНК-БТШ70, а на некоторых более поздних стадиях, включая транспорт мРНК и полисомы и/или другие уровни механизма трансляции.

Значимость представленных данных, впервые полученных на широком спектре видов с чрезвычайно разнообразными температурами естественных сред обитания позволяют говорить о наличии реальной закономерности, связывающей температурные условия обитания вида с экспрессией генов ТШ, состоянием фактора транскрипции гецои ТШ, содержанием мРНК-БТШ70 и Б'ПШО-подобных белков и его термоустой-чивостыо. Проведенные эксперименты свидетельствуют, что бе.тки из семейства БТШ70, особенно конститутивно синтезируемые стрессовые белки, играют важную роль в естественной адаптации орпшшма к высокой температуре среды, их повышенная экспрессия является одним из неотъемлемых механизмов, обеспечивающих существование вида в условиях действия высоких внешних температур.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена позитивная корреляция между уровнем экспрессии генов теплового шока, синтезом и содержанием БТШ70-подобных белков н температурными условиями существования вида:

а) терморезнстентные организмы отяпчаГотся более высоким уровнем содержания и конститутивного ешпеза БТШ70;

б) синтез БТШ и соответствующих им мРНК в клегках южных видов шелкопрядов н ящериц, в отличие от видов, обитающих в средних и северных широтах, наблюдается при значительно более высоких температурах, вплоть да <!0-50°С.

2. Обнаружены отличия а тепловых стресе-реакииях культивируемых фнбробластов кожи экологически и этнически различных популяций человека. В отличие от клеток индивидуумов, проживающих в умеренных широтах РФ (русские), клетки коренных представителей Туркменистана (туркмены) наряду с более высоким процентом выживаемости сохраняют

ингснспшшй синтез всех членов семейства БПП70 'vi se, hsx. lisp) и рада друп'.х белков после жёсткого теплового шока (42,5°С>.

3. К.илкм ящериц южного и северного происхождения существенно отличзлотся в количественном и качественном соотношении двух исходно Присутствующих (копстп гутшшых) АКТИВНЫХ форм HSF, при этом термор-:знстстнмс южные вилы характеризуются меньшим уровнем этих форм HNF наряду с доминированием одной из них.

J. Выявлена четкая негативная и позитивная корреляция между кочеппу гньнмм уровнем активных HSE-сяязмнаюших форм HSF и, с •огнен, твенно. внугриклеточным содержанием БТШ70-подобных бел-топ и интенсивностью температурной индукции БТШ.

5. Дана б;:ловзя межвидовая 'характеристика стрессовых белков и сопряжённых реакций общего белкового синтез;!, у предстали гелей ПОЙКНЛО-. гетеро- и томснютермных организмов в классах простейших, насекомых, рептилий и млекопитающих:

а) клетки пойкнлотермных видов отличаются более широким температурным диапазоном индукции и продолжающегося синтеза БТШ, чем гомойоюрмнме виды;

б) в клетках терморезистенткых видов синтез нормального набора клеточных белков сохраняется при G а-; се высоких температурах; ira зависимость сохраняется на уровне сисгемы "хозяин - паразит" (ящерицы -леншмании);

в) пкшесг.сцифнческая экспрессия БТШ в различных органах и типах клеток у гусениц тутового шелкопрядз, верблюда н человека реализуется на уровне отдельных членов семейств БТШ70 и БТШ90.

6. В моделях острой (БЖГ) и латентной (ШГЧ) вирусных инфекций не выявлено нндукшш вирусом синтеза клеточных БТШ, при эгим:

а) эффективная транскншшя генов теплового шока сохраняется и при комбинированном действии -высокой температуры и вируса ядерного полнздроза на клетки тутового шелкопряда, при этом блокируется синтез БТШ и друшх клеточных белков, по-видимому, за счет насыщения полисом вирусными матрицами;

б) сгресс-реакцня на тепловой шок зараженных вирусом нммунодс-фшпгта человека лимфобластоидных клеток H9fiíLTVIIIB приводит к умеренному увелиякннго ттггра вирус-спенифнчсскнх белков.

7. Совокупность полученных данных позволяет рассматривать белки теплового шок;., другие компоненты ситемы теплового шока как отобранные в процессе эволюции клеточные ншредненты. являющиеся неотъ-

емлемымп составляющими стратегии адаптации клетки и целого организма к температурным условиям внешней среды. Значимая вариабельность состояния компонентов системы Till, отражающая выраженное действие одного или совокупное влияние нескольких факторов, может быть чутким информативным параметром естественной адаптации организма к высокой температуре и другим факторам внешней среды.

Основные положения диссертации отражены в следующих работах:

1. Синтез белков теплового шока в клетках культуры различных видов шелкопряда и в гусеницах// IY конференция биохимиков республик Средней Азии к Казахстана, Ашхабад.- 1986,-С. 1718. (соавт. Евгеньсв М.Б., ШейнкерВ.Ш., Левин A.B., Ульмасов X. А.,Бабаева А.Х.).

2. Индукция белкового синтеза в лимфоцитах человека при пшер-термШ1//Научная конференция, посвященная 70-летию ВОСР. Ашхабад. - 1987. - С.- 81-82. (соавт. Ульмасов Х.А., Акопов С.Б., Бабаева А.Х.).

3. Молекулярные механизмы адаптации к пшертермнн у высших организмов. I. Синтез белков теплового шока в клетках культуры различных видов шелкопряда и в гусеитщах//Молекулярная био логия. - 1987. - Т. - 21. - N. 2. - С. 484-494. (соавт. Евгеньев М.Б., ШейнкерВ.Ш., Левин A.B., Брауде-Золо гарёнаТ. Я., Щупие Н.Г., Ульмасов Х.А.).

4. Молекулярные механизмы адаптации к пшертермни у высших организмов. П. Синтез белков теплового шока у двух видов децимаций/Молекулярная биология. - 1983. -Т. 22. -N. б. -С. 1583-1589. (соавт. Ульмасов.Х. А'., Овс.змухамедов А., Евгеньев М. Б.).

5. Молекулярные механизмы адаптахрш к гипертермии у высших организмов. Ш. Действие теплового шока на клетки тутового шелкопряда Borabyxmori, зараженных вирусом ядерного полиэд-

. роза//Молекулярная биология. -1988. - Т. 22. - N. 4. - С. 1128-1131. (соавт. Брауде-ЗолотарёваТ. Я., Титаренко Е. А., Денисенко О. Н.,Ульмасов X. А., Левин А. В., Евгеньсв М. Б.).

6. Сшгтез белков теплового шока у некоторых видов ящериц аридной зоны н адаптация к пшертерши//Жур. общей биологии. - 1989. - L.50. - N. 4. - С. 437-445. (соавт. Ульмасов X. А.,

. Абрамова И. Ю., ДашкевичВ. 1С., Евгеньев М. Б.).

7. К вопросу о рогат белков теплового шока в естественной адаптации к теплу некоторых видов ящериц аридной зоны и их

эндогешшх паразитов - лейшмаиий//У1П всссоюэпая конференция по пколоппеской физиологии. Ашхабад. - 1989/- С, 324-325. (соавт.Ульмасоп X. А., Дашкевич В. К.,Абрамова И. ГО.,Овезму-хамедов А., Бабаева А. X;, Шаммаков С., Атаев Ч., Евгеньев М. Б.).

8. Дииамика синтеза фиброина и белков теплового шока в отдельных органах тутового шелкопряда Bombyx mori при гипгр;гермии //YIII всесоюзная конференция по экологической фнзислопш. Ашхабад. - 1989. - С. 11-12. (соавт. Абрамова И. Ю., Ульмасов , X. А., Акопов С. Б., Бабаева А. X., Евгеньев М. Б. )

9. О роли белков теплового шока в естественной адаптации. организма к теплу//Доклады АН СССР. -1991,- T.3I6,-N.3.-C.'749-753. (соавт. Ульмасов X. А.; Дашкевич В. К;; Шаммаков С,, Бабаева A. X., Евгеньев М, Б.) .

10. Динамика синтеза фиброина и белков теплового шока в отдельных органах и на разных стадиях онтогенеза тутового шелкопряда Bombyx morí при пшертермпи//Прикладная биохимия и микробиология. -1991. - Т. 27. rN. I. - С. 147-156. (соавт. Абрамова И. Ю., Ульмасов X. А„ Акопов С. Б., Бабаева А. X., Евгеньев М. Б.).

.11. Характеристика членов семейства БТШ70 у трёх видов круглоголовок аридного региона//Жур. общей биологии. -1991.-Т. 52. - N. 5. - С. 731-737. (соавт. Удьмасов X. А., Дашкевич В. К., Мар-гулкс Б. А.. Шаммаков С., Атаев Ч., Бабаева А. X.).

12. Стрессовые белки и адаптация//Ылым. - Ашгабат. - 1993.-212 С. (соавт. Ульмасов X. А., КаррыеваБ. Ч.).

13. Тепловой шок и вирус иммунодефицита человека. В сб.: Медшсо-биолошческне и социальные аспекты формирования проблем здоровья в Туркменистане// РИДО "Ыяхам". - 1995. - С. 94-96. (соавт. Карамов Э. В., Ульмасов X. А.).

14. Аномальная экспрессия беллсои теплового шока в лимфоцита?; человека при патологических состоящих различной этиологии. Б сб.:Медико-б1голопгческиз и социальные аспекты формирования проблем здоровья в Туршсштстмге//РЬШО "Ыпхам". -1995. - С. 96-99.(со авт. Джумагельдыев Б. Т., Каррысва Б. Ч., Карамов Э. В., Ульмасов X. А.).

15. Сравнительная характеристика со стоящи и активзщш фактора трапскршпош генов теплового шока (HSF) у ящериц различных гсшгматогеофафнчесагх зо^ДЬвеспш АНТ (серия бнол. наук). -1996. (соавт. Джумагельдыев Б.Т., Зацешша О. Г„ Ульмасов X. А.,

Андриевский А. А., Секншсова О. А., Евгениев М. Б.).

16. Клеточный ответ на тепловой шок у этнически и экологически различных популяций чсловека//3дравоохрапеиие Туркменистана. -1996. (соавт. Ляшко В. И., Викулова В. К.,Черников В. Г.,Уяьма-сов X. А., Иванов В. И., Заг;еш1на О. Г., Евгеньев М. Б.).

17. Heat shock response inBombyx mori cells infected by nuclear polyhe-drosis virus (NPVV/Mol. Gen. Genet. - 1989. - V. 215. - P. 322-325. (coauth. Evgcn'ev M. В., Braude-Zolotareva T. Y., Titarenko E. A., Levia A.V., Deuisenko O. N., Ulmasov Kh. A.).

18. Heat shock proteins and thermoresistance in lizards//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - V. 89. - P. 1666-1670. (coauth. Ulmasov Kh. A., Shammakov S. & Evgen'ev M. В.)..

19. Heat shock response in camcl (Camelus dromedarius) blood cclls and adaptation to hypcrthermia/ZComp. Biochem. PhysioL part B. - 1993. - V. 106. - P. 867-872. (coauth. Ulmasov Kh. A., Lyashko У. N. & Evgen'ev M. В.).

20. The role of heat shock proteins ir. lizards'adaptation to high temperature environmentWSecond International Asian Негреtological Meeting. Ashgabat, 6-10 Sept., 1995, P. 56-57. (coauth. Ulmasov Kh. A., DjumageldyevB.T., ZatsepinaO.G.,ShammakovS., Evgen'evM.В.).

SUMMARY

The state and expression of several compo nents of the hea t shock system ivere studied on the wide spectrum of an organisms that differ drastically by the adaptation to elevated temperature and inhabiting various temperature-dependent ecological nisbes of Russia and Turkmenistan. In contrast to species from Central and Nothern regiops of European part of Russia termoresistant species from Central Asia deserts are characterized by more pronounced constitutive synthesis of major heat shock protein (lisp70), the higher content of fcsp70-J&p proteins at normal conditions. The high level of ml!NA-hsp70 expression in species of southern origin is observed at temperatures up to 45>C. Our results suggest that overexpression of hsp70 observed in sourthern species of lizards appears to negatively regulate the constitutive level of an active HSE-binding form of HSF. It was also shown that human fibroblasts isblated from Turkmen exhibits intensive synthesis of all members of hsp70 family parallel with synthesis of many other cellular proteins after severe heat shock, while only trace of synthesis of hsps is observed in Russians. The combined action of the heat shock and two types of virus infections on insect and human cell cultures shows that nuclear polyhedrosis virus (NPV) as well as human

immunodeficicnt virus (HIV) don't induce hsp synthesis in correspondent cell lines while effective (NPV) or moderate (HTV) synthesis and maturation of virus proteins is observed. The whole complex of results suggests that hsp70-likc proteins and other components of the heat shock system play the sufficient role iu (he process of the adaptation of an organisms to high temperature environment.

Г Ы С Г А Ч А И A 3 M У Н Б Температура параметрлери боюнча дурли экологик нишалары геле-йэн ажайып тсбигы нусгаларын гич спектринде йылылык сарсгынынын системасынык/ПСБ/ кэбир компонентлеринич, мРНК-ЙСБ, йылылык сарс-гынанын генлориниц транскрипция факторларыныч ягдайларына кепта-р-аплайын анализ берилди. Орсъетич демиргазык гинишликлеринде яша-ян совукганлы векиллериндён тапавутлылыкда гунортада гелип чикан гернушлер ПСБ70 хас ёкары гурлуш синтозини, ЙСБ-а мензеш белоклары ёкары дережоде саклаянлыгы билен тапавутланярлар. Бу гернушлерич /Пупек гурчугы.хажжыклар/ мРНК-ЕСБ70 транскрипциясы тг Ц5°С-а чен-ли довам эдйэр. Гечирилен теяфибелвр ЙСБ70 эсасы стресс белогыныч ёкары деречосинич йылылык сарсгыныныч генлеринич транскрипция фак-торынин актив формаларынын мукдары билен ярамаз тэсирлешййндигини горкезди. Адвмларын дурли популяцияларыныч /ттркменлер, руслар/ дерисинде эмели есдурилйгчьфибробластлардакы стресс-реакцияларыныч илкинжи гечирилен деиешдирме анализй Туркменистаныч ерли векилле-риииц ейдуклеринич арам гинишликлерде яшаянларыч ейдуклеринден »а-павутлылыкда газаплы йылылык тэсирине /42,5°С; 6 саг./ хас чыдам-лндыгыны ве ПСБ хои-до бейлеки ейяггк белокларынн синтезламзго болам укнбыны саклаяндыгыны геркезди. Йылылык сарсгынынын ве вирус иифакциясынын билеликдэк/ тэсирипин нусга текрибелери ядро поли-сдрозыныч'вирусынын хем-дС адамыч иммунодефицит вирусынич дегиалн еЛжуоерде ЙСБ" сиптезини двретмейэндигини геркезди. Мунда йылылык сарсгынындан сон вирус белереринич интенсив /ЯГО/ я-да ортача' /ВИЧ/ топланмасы болуп гечйэр., Умуман, алнан нетиделер дашкы сре-данвч ёкары теипературасына организмич тебигы уйгунлагамасында ЙСБ70 мехум ролуныч бардыгина шаятлык эдйэр.