Влияние белка теплового шока 70 КДА и липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов

Кустанова, Гульсара Амангалиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние белка теплового шока 70 КДА и липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние белка теплового шока 70 КДА и липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов"

На правах рукописи

□ОЗОБ42Э4

КУСТАНОВА Гульсара Амангалиевна

ВЛИЯНИЕ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА И ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ИЗ ЮЮООВАСТЕН САРЗиЬАШБНА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭНДОТОКСИНОВ

03.00.13 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 2007

003054294

Работа выполнена в лаборатории биологических испытаний Филиала института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук, лаборатории молекулярной биомедицины Института Фундаментальных проблем биологии Российской Академии Наук

Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент

Мурашев Аркадий Николаевич, доктор биологических наук Прохоренко Изабелла Рувимовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Маевский Евгений Ильич

доктор биологических наук, профессор Кошелев Владимир Борисович

Ведущая организация: Институт Нормальной Физиологии

им. П.К. Анохина РАМН

Защита диссертации состоится « _» февраля 2007 г. в_часов

на заседании Диссертационного совета Д002.093.01 в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан «13» января 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат физико-математических наук СЬс^Х ^ Н.Ф. Ланина

//Си^-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эндотоксины грамотрицателышх бактерий способны убить человека и животных при очень низкой концентрации в крови - 1 нг/мл (Мауеих, 1997), действуя на разные клетки организма как непосредственно, так и опосредованно, через индукцию синтеза в клетках-мишенях биологически активных веществ. При попадании в организм эндотоксины индуцируют метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме, приводя к развитию эндотоксинового шока. Развивающаяся полиорганная недостаточность при эндотоксиновом шоке, ассоциируемая (Ба1отао с1 а1., 1999) с высвобождением цитокинов, активацией каскада белков плазмы, микрососудистой коагуляцией и активацией нейтрофилов и моноцитов приводит организм в состояние сепсиса (Грачёв и др., 2003; Ш§а1о е1 а1, 2001). Недавние клинические исследования, направленные на анализ снижения смертности пациентов от грамотрицательного сепсиса в зависимости от применяемой терапии, показали практически отсутствие прогресса в лечении этого заболевания (Шес1егтап й а1., 2003). Исследования действий эндотоксинов нашли отражение в эволюции патогенетической терапии бактериальных инфекций, начиная с применения сорбентов, связывающих эндотоксины, антител к эндотоксинам, ингибиторов синтеза простагландинов и других производных арахидоновой кислоты, блокирования медиаторов воспаления до вмешательства в механизмы нарушения гемостаза (Пак и др., 2003). Однако недавние клинические исследования, направленные на анализ снижения смертности пациентов от сепсиса в зависимости от применяемой терапии, показали практически отсутствие прогресса в лечении этого заболевания (Шеёегтапп е! а1., 2003).

В последние годы после получения препаратов белка теплового шока 70 кДа

(БТШ70) (природного и рекомбинантного), возрос интерес к разработке новых

лекарственных средств на основе БТШ70 для лечения различных заболеваний.

Экспрессия белков теплового шока или стресс-белков является одним из ответов

организма на воспаление (Маргулис, Гужова, 2000). В литературе имеются указания

на то, что уровни экспрессии БТШ в организме грызунов хорошо коррелируют с их

выживаемостью в модели эндотоксинового шока (Но^Ккш й а1., 1993; Ьаррав е1 а1.,

1994). Эти наблюдения очень важны в клиническом отношении, поскольку могут

быть использованы для создания препаратов, предотвращающих развитие

эндотоксинового шока при грам-отрицательном сепсисе. В последнее десятилетие большое значение отводится изучению защитных свойств БТШ70. Однако эти исследования проведены только на клеточных культурах (Маргулис, Гужова, 2000; Guzhova et al., 1998; Guzhova et al., 2001). На сегодняшний день не вызывает сомнений тот факт, что исследование защитных свойств экзогенного БТШ70 против эндотоксинового шока in vivo представляют собой важный инструмент как для оценки ответа целого организма на септическое воздействие, так и для развития новых подходов к терапии эндотоксинового шока.

Еще одним из перспективных направлений в защите от грамотрицательной инфекции становятся природные антагонисты эндотоксинов. В этой связи поиск исходно низкотоксичных липополисахаридов (ЛПС), обладающих свойствами антагонистов эндотоксинов, имеет первостепенную значимость (Gangloff et al., 1999). Работы в этом направлении начались в 80-е годы, когда были выделены из фотосинтезирующих бактерий низкотоксичные липополисахариды (Qureshi et al., 1988, Krauss et al., 1989), и в экспериментах in vitro показана их способность конкурировать с эндотоксинами за рецепторы клеток-мишеней (Rietschel et al., 1994). ЛПС, выделенный из Rhodobacter capsulatus (Kb. capsulatus), оказался низкотоксичным. Исследования на клеточных культурах показали способность ЛПС из Rb. capsulatus проявлять защитное действие от эндотоксинов (Грачев и др., 1998; Винокуров и др., 2003). Однако исследования этого препарата in vivo не проводились.

Цель работы

Целью данной работы являлось изучение влияния БТШ70 и ЛПС из Rb. capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов из Esherichia coli (Е. coli) и Salmonella typhimurium (S. typhimurium).

Задачи исследования

1. Исследовать влияние экзогенного БТШ70, в зависимости от способа его применения, на гибель животных, вызванную эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium.

2. Изучить действие экзогенного БТШ70 на вызванные эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium изменения параметров гемостаза

3. Исследовать влияние экзогенного БТШ70 на вызванные эндотоксинами из £

coli и S. typhimurium изменения биохимических параметров крови.

4. Изучить влияние ЛПС нз Rb. capsulatus на физиологические эффекты эндотоксина из S. typhimurium.

Научная новизна работы

Значительная часть результатов, представленных в данной работе, носит приоритетный характер. Впервые проведено исследование эффектов экзогенного БТШ70 на животных in vivo. Показано, что БТШ70 при предварительном введении снижает смертность животных от шока, индуцированного эндотоксинами, отменяет эндотоксин-индуцибельное увеличение параметров гемостаза. В экспериментах in vivo впервые проведено исследование защитного действия антагониста эндотоксина низкотоксичного ЛПС из Rb. capsulatus. Показано, что предварительное введете ЛПС из Rb. capsulatus уменьшает смертность животных от эндотоксина, снижая его эффекты на организм.

Научно-практическое значение

Полученные результаты показывают, что БТШ70 и ЛПС из Rb. capsulatus могут быть рекомендованы для создания новых фармакологических препаратов для профилактики от эндотоксинов. Создание таких препаратов имеет важное социально-экономическое значение, поскольку они могут быть использованы не только как лечебное средство при эндотоксемии, но и в профилактических целях для предупреждения возникновения подобных осложнений.

Апробация работы

Результаты работы докладывались и обсуждались на VI-x чтениях,

посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2002);

Всероссийской молодежной конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань,

2004); 6-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI

века» (Пущино, 2002); Международной конференции студентов, аспирантов и

молодых ученых «Ломоносов-2004» (Москва, 2004); 1-ой международной

конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004);

Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине»

(Москва, 2004); научно-практической конференции «Новые направления в

диагностике, лечении и восстановительной медицине» (Пущино, 2004); отчетной

конференции ФИБХ РАН (Пущино, 2004); Всероссийской конференции молодых

исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005); XVIII Путинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005); на 1-ом Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); Девятой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург 2006); International Congress of Young Chemists "YoungChem2006" (Poland, Pultusk, 2006),

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, 4 из них - статьи в отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Материал иллюстрирован таблицами и рисунками. Список цитированной литературы содержит т работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на самцах нормотензивных крыс Wistar массой тела 300-350 г. Животные содержались в стандартных контролируемых условиях: 12-ти часовой период освещения с автоматическим отключением света в 20 часов, температура окружающего воздуха - 18-26°С, влажность 30-70%, получали стандартный корм и воду ad libitum. Животные содержались в клетках по 5 особей (до эксперимента) и поодиночке (во время эксперимента). Все манипуляции с животными выполнялись в соответствии с требованиями, утвержденными Институтской комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных.

Имплантацию венозных и артериальных катетеров осуществляли под общим

наркозом (хлоралгидрат, 400 мг/кг, внутрибрюшинно). Полиэтиленовые катетеры

вживляли в брюшную аорту через бедренную артерию - для регистрации

артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС), и нижнюю

полую вену через бедренную вену - для введения веществ. Концы катетеров

выводили в межлопаточную область (Мурашев и др., 1992). Объем вводимых

препаратов составлял 10 мкл/100 г массы тела для физиологического раствора и БТШ70, и 100 мкл/100 г массы тела для эндотоксинов и ЛПС из Rb. capsulatus. Регистрацию артериального давления (АД) осуществляли электроманометром «СР-01» (СТС, США). Обработку сигнала проводили с помощью компьютеризированной системы «Beat» (Medvedev et al., 1990), определяя среднее АД (СрАД) и ЧСС.

Для определения показателей гемостаза использовали стандартные методы с применением диагностических наборов (Диакон ДС). Плазму получали следующим образом: кровь собирали в пробирку, содержащую 3,8 % раствора цитрата натрия (соотношение объемов крови и цитрата натрия 1:9). Кровь центрифугировали при 1000 оборотов в течение 7 минут. Богатую тромбоцитами плазму переносили в чистую пробирку и повторно центрифугировали при 3000 оборотов в течение 15 минут. В плазме определяли следующие параметры гемостаза: тромбопласгиновое время свертывания крови, протромбиновое время свёртывания крови, концентрацию фибриногена, время фибринолиза. Параметры гемостаза измеряли на одноканальном коагулометре «Тромбостат». Принцип работы на коагулометре основан на фиксации времени образования/лизиса сгустка инициированного вращением шарика в кювете. Активированное парциальное тромбопластиновое время определяли как время свертывания крови в условиях стандартизированной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса в присутствии ионов кальция. Протромбиновое время определяли как время образования фибрина в плазме крови в присутствии добавляемых ионов кальция и тканевого тромбопластина. Определение концентрации фибриногена проводили следующим образом: получали сгусток фибрина путем последовательного смешивания в пробирке плазмы, суспензии тромбопластина и раствора хлорида кальция. Сгусток образовывался через 10 минут инкубации при 37°С. После быстрого обезвоживания сгустка измеряли массу образовавшегося фибрина, по которой рассчитывали концентрацию фибриногена в плазме. Фибринолиз оценивали как время индуцированного стрептокиназой лизиса сгустка, получаемого при свертывании эуглобулиновой фракции плазмы тромбином.

Биохимический анализ плазмы крови включал измерение концентрации глюкозы, общего белка, альбумина, триглицеридов, креатинина и билирубина. Все эти измерения проводились колориметрически с использованием планшетного спектрофотометра "Reader". Для определения параметров использовали стандартные наборы реактивов фирмы «Диакон ДС».

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы «STATTSTTCA for Windows 5.0». Для сравнения результатов внутри группы относительно исходного состояния применяли тест Wilcoxon, для межгрупповых сравнений использовали тест ANOVA-2 с последующим анализом с помощью теста Duncan. Изменения исследуемых показателей считали статистически значимыми при Р<0,05. Данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки.

Результаты исследования 1. Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Esherichia coli.

Введение эндотоксина из Е. coli в дозе 2 мг/кг вызывало гибель 50% животных в течение 24 часов. Предварительное введение БТШ70 до эндотоксина Е. coli уменьшало смертность животных до 20%. При введении БТШ70 после эндотоксина Е. coli наблюдалось увеличение смертности животных до 67%.

Из литературных данных известно, что введение эндотоксина животным вызывает каскад событий, инициированных секрецией известных цитокинов (TNF-a, IL-1, IL-б), которые изменяют экспрессию генов и индуцируют лихорадку, увеличение сердечного выброса, изменения в работе сердечно-сосудистой системы и изменяют другие характеристики крови, в частности работу системы гемостаза (Pajkrt et al 1997; Karima et al., 1999). Так, при эндотоксиновом шоке происходят нарушения в работе свертывающей, фибринолитической и противосвертывающей систем. В результате чего развивается синдром диссемшшрованного внутрисосудистого свертывания (ДВС) - дисбаланс в работе этих трех систем. В наших экспериментах (рис. 1) при введении эндотоксина Е. coli наблюдалось увеличение изучаемых параметров гемостаза. Увеличение времени свертывания как тромбопластинового, так и протромбинового свидетельствует о наступлении эндотоксин-индуцибедьной фазы гипокоагуляции (или переходной) стадии ДВС-синдрома, когда на фоне гиперколичеств циркулирующего в крови тромбопластина активируется и противосвертывающая система - активность факторов как внешнего, так и внутреннего пути свертывания крови замедляется, время свертывания удлиняется.

ИЗМШЭНМЕ ТРОМВОПЛАСТИНО0ОГО ЕРЕМ В-1И СКЭТЫЗАНИЯ КРОВИ

ИЗМЕНЕНИЕ ПРОТРОМБИНОООГО ВРЕМЕНИ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

ИЗМЕНЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ вИБРИНОГЕНА В КРОВИ

ИЗМЕНЕНИЕ ВРЕМЕНИ ФИБРИНОЛИЗА

0,8

0,0

* *

400

8 300

I 200

100 о

# #

Рис. 1. Изменения параметров гемостаза при введении ЛПС из E.coli в дозе 2 мг/кг на фоне БТШ70 в доза 266 мкг/кг. 1 - ЛПС Е. coli (п=10); 2 - БТИ170, ЛПС Е. coli (п=10); 3 - ЛПС Е. coli, БТШ70 (п=9). * - по Wilcoxon test относительно исходных значений, # - р < 0,05 по ANOVA2 относительно группы, получавшей ЛПС из Е. coli.

Из-за гипокоагуляции фибриноген не трансформируется в фибрин, концентрация его в крови увеличивается, кроме того, фибриноген как белок острой фазы начинает активно синтезироваться в печени (Сидоркина и др., 2003). При эндотоксиновом шоке в патогенезе тяжелых нарушений коагуляции играет роль ещё один механизм -увеличение ингибитора активации фибринолитической системы (в частности, ингибитор активации плазминогена), что способствует неадекватному удалению сгустков фибрина из сосудистого русла (Грачев и др., 2003). В результате время

лизиса сгустка (время фибринолиза) удлиняется. Известно, что ключевым активатором нарушений при ДВС-синдроме является IL-6, a TNF-a опосредованно влияет на этот процесс за счет воздействия на IL-б (Esmon, 2001).

Эффекты ЛПС Е. coli, направленные на повышение параметров гемостаза, полностью предотвращались с помощью предварительного введения БТШ70. Можно полагать, что предварительное введение БТШ70 снижало или предотвращало эндотоксин-индуцированную выработку цитокина, обусловливающего эти изменения. БТШ70, введенный после ЛПС Е. coli, также предотвращал изменения параметров гемостаза, за исключением тромбопластинового времени, которое на 20 минуте увеличивалось так же, как и при введении одного ЛПС Е. coli. Отличительной чертой изменения тромбопластинового времени у животных, которые получали БТШ70 после ЛПС Е. coli, было то, что повышенный уровень данного параметра, обнаруженный на 20 минуте, оставался таким же через 5 часов. Увеличение тромбопластинового времени, вызванное введением одного ЛПС Е. coli, через 5 часов было большим, чем на 20 минуте. Увеличение только тромбопластинового времени говорит о нарушениях в работе именно внутреннего пути свертывания крови - пути контактной активации, когда механизм запускается вследствие контакта фактора XII с поврежденной эндотелиальной поверхностью, с измененными клеточными мембранами. Вероятно, именно этот механизм не предотвращается при последующем введении БТШ70 после эндотоксина.

Из литературных данных известны две фазы сердечно-сосудистого ответа на эндотоксины: острая и длительная. В наших экспериментах эндотоксин К coli вызывал двухфазное снижение АД: кратковременное с пиком снижения на 10 минуте и вторая фаза более продолжительная, начиная с 45-ой минуты с пиком падения на 65-ой минуте ("рис. 2, А). Возможными причинами острой фазы гипотензии могут быть вазодилататорное действие брадикинина, простагландинов, фактора активации тромбоцитов, уровень которых повышается при введении ЛПС. Известно также, что острая фаза гипотензии ассоциирована с повышением уровня TNF-a (Bernard et al., 1998). Последующая гипотензия связана со снижением контрактильности миокарда, уменьшением сердечного выброса (Ishihara et al, 1999). БТШ70, введенный до ЛПС Е. coli, не изменил характер развития гипотензии (рис. 2, А). БТШ70, введенный после ЛПС Е. coli, также не оказывал влияние на изменения АД, вызванные одним ЛПС Е. coli.

Бремя, час

Рис. 2. Изменения среднего артериального давления (А) и частоты сердечных сокращений (Б) при введении ЛПС Е. coli в дозе 2 мг/кг и ЛПС Е. coli в дозе 2 мг/кг на фоне БТШ70 в дозе 266 мкг/кг. # - достоверные различия между группами по ANOVA 2

Как показывают данные рис. 2 (Б), под влиянием ЛПС Е. coli наблюдается двухфазное повышение ЧСС. Первая фаза короткая: в первые 10 минут ЧСС увеличивалась на 10% с последующим снижением к 20 минуте до исходного уровня, который держался до 80 минуты. Затем начиналась вторая фаза повышения ЧСС, которая сохранялась на протяжении 5 часов. БТШ70, введенный до ЛПС Е. coli, не оказывал влияния на динамику развития тахикардии и не изменил уровень тахикардии. При введении БТШ70 после ЛПС Е. coli',не наблюдали двухфазное повышение ЧСС, которое было обнаружено у животных, получавших только ЛПС Е. coli. Тахикардия у этих животных развивалась в первые 10 минут и сохранялась на протяжении всего периода регистрации.

Введение эндотоксина из Е. coli вызывало первоначальную гипергликемию (через

20 минут) с выраженной гипогликемией к 5-му часу от начала введения ЛПС (Рис. 3).

Снижение уровня глюкозы в крови по крайней мере частично связано с подавлением

эндотоксинами экспрессии фосфоенолпируват карбоксилазы (РЕРСК) (вгаппег е1 а1., 1990). Наблюдаемые нами эффекты экзогенного БТШ70 аналогичны защитным эффектам, вызываемых тепловым шоком в работе Ра1с1а5 с соавторами, которые показали, что уровни РЕРСК т!ША снижались у мышей после введения ЛПС, тогда как у мышей, предварительно подвергнутых тепловому шоку, экспрессия РЕРСК тГША не менялась (Ра1с1а5 е1 а1., 2002). В наших экспериментах введение БТШ70 до эндотоксина, а также последующее за эндотоксином введение БТШ70 не влияло на фазу гиперглюсемии, но через 5 часов исходный уровень глюкозы практически восстанавливался до исходного уровня, что указывает на восстановление глюконеогенеза.

Известно, что при эндотоксиновом шоке происходит снижение экстракции аминокислот и снижается синтез белков (Капта й а1., 1999). В нашей работе введение эндотоксина из Е. соН вызывало снижение уровня общего белка и концентрации альбумина на 20-ой минуте, и уменьшение этих показателей продолжалось и на 5-ом часе. Препарат БТШ70, введенный до эндотоксина, неоказывал влияния на эндотксин-индуцированное снижение концентрации белка и альбумина на 20-ой минуте, но на пятом часе достоверно подавлял это снижение. Введение БТШ70 после ЛПС к пятому часу достоверно подавляло это снижение концентрации белка и альбумина.

Основными показателями, характеризующими работу печени и почек при

стрессовых и патологических состояниях, являются такие биохимические показатели

как триглицериды, билирубин, креатинин. Известно, что при эндотоксиновом шоке

увеличивается в плазме уровень азота мочевины и как следствие, наблюдается

увеличение концентрации креатинина в крови, из-за увеличения в печени ЛПОНП

(липопротеины очень низкой плотности) снижается также уровень периферических

триглицеридов в крови; кроме того, в печени прогрессирует увеличение уровня

билирубина (Капта et а!., 1999). В литературе описанные эффекты эндотоксина

связывают с влиянием на печень и почки основного паракринного и аутокринного

щпокина при эндотоксиновом шоке — 1№-а. Введение эндотоксина в нашей работе

вызывало достоверное увеличение концентрации билирубина на 20-ой минуте,

которое продолжалось и на 5-ом часе, приводило к достоверному снижению

концентрации триглицеридов в крови, а также вызывало достоверное увеличение

концентрации креатинина. Лишь предварительное введение БТШ70 до эндотоксина

на 5 часе достоверно подавляло эти изменения параметров. Последующее же за

эндотоксином введение БТШ70 не влияло на изменения параметров билирубина, креатинина, триглицеридов (Рис. 3).

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО БЕЛКА

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮКОЗЫ □ 20 мин В 5 час

I £-0.2 I

¿fa..

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АЛЬБУМИНА

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БИЛИРУБИНА

0,2

io.4 i

I "0,4 1

S -0,7 -1

L • #

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КРЕАТИНИНА

■a

S 20

ИЗМ КШИЯ КОНЦШТРАЦИИ ТРИГЛЩЗМДОВ

0.10 -

о 0.00

Рис. 3. Изменения биохимических параметров и при введении ЛПС из Е. coli в дозе 2 мг/кг на фоне БТШ70 в дозе 266 мкг/кг. 1 - ЛПС E.coli (п=10); 2 - БТШ70, ЛПС Е. coli (п=10); 3 - ЛПС Е. coli, БТШ70 (п=9). * - р < 0,05 по Wilcoxon test, # - р < 0,05 по ANOVA2 относительно группы, получавшей ЛПС из Е. coli.

2. Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium

Введение ЛПС S. typhimurium в дозе 4 мг/кг приводило к гибели 80% животных в течение 24 часов. В группе, получавшей ЛПС на фоне предварительного введения БТШ70, смертность животных уменьшилась до 40%. Если БТШ70 вводили после ЛПС S. typhimurium, то из девяти животных погибло пять, что составило 56%.

При введении ЛПС S. typhimurium наблюдалось увеличение всех изучаемых параметров гемостаза (рис. 4). Предварительное введение БТШ70 полностью предотвращало развитие изменений всех изучаемых параметров гемостаза, вызванных ЛПС S. typhimurium.

изменение тромбопласткноеого

врвавм сеттывдния крови

g 20 X

I 10

□ 20 минут

И 5 часов

# » г, ..Т..

изменение протромбинового времени свертывания крови

15 -

J 10 i

* ,

5 S

# *

измввмеконцетграции фубриногшд в крови

ИЗМЕНЕНИЕ ВРЕМЕНИ ФИБРИНОЛИЗА

€ 0.8 I

S 0,4

0.0

# #

¿А

400

i300 I

| 200 п

100 о

# # t tJfA

# # I—PZZL

Рис. 4. Изменения параметров гемостаза при введении ЛПС из S. typhimurium в дозе 4 мг/кг на фоне БТШ70 в дозе 266 мкг/кг. 1 - ЛПС S. typhimurium (п=10); 2 -БТШ70, ЛПС S. typhimurium (п=10); 3 - ЛПС S. typhimurium, БТШ70 (п=9). * - р < 0,05 по Wilcoxon test относительно фоновых значений, # - р < 0,05 по ANOVA2 относительно группы, получавшей ЛПС S. typhimurium.

Введение БТШ70 после ЛПС S. typhimurium также предотвращало изменение таких параметров, как протромбиновое время и время фибринолиза, и уменьшало повышение тромбопластинового времени и концентрации фибриногена по сравнению с эффектами одного ЛПС S. typhimurium.

Введение эндотоксина из S. typhimurium приводило к следующим изменениям среднего АД: первоначальный подъем АД с максимумом повышения на 6,0±2,0% на 20-й минуте с последующим некоторым снижением АД и плавным возвращением его к исходному уровню (рис. 5, А). Интересно, что первоначальный эффект эндотоксина из 5. typhimurium в нашей работе - это гипертензивная фаза. Известно, что эффекты эндотоксинов различны и это различие может быть обусловлено дозой, схемой введения или структурой липида А. Так, мы видим, что эффект эндотоксина га S. typhimurium отличен от эффектов эндотоксина из Е. coli. Вероятной причиной этого может быть и различие в структуре липида А этих эндотоксинов - так, было показано, что самый сильный и токсичный липид А обусловлен наличием в его структуре шести жирнокислотных остатков - именно такое строение имеет липид А эндотоксина из Е. coli. Если же в структуре липида А меньше или больше чем 6 жирнокислотных остатков - это свидетельствует о менее токсичных свойствах эндотоксина.

Известно, что в ответ на введение эндотоксина повышается активность симпатических нервов и зон центрального сердечно-сосудистого контроля. Гипертензивная фаза при введении S. typhimurium обусловлена стимуляцией адренорецепторов, поскольку блокада адренорецепторов подавляет гипертензивнуто фазу, обусловленную эндотоксином S. typhimurium в такой же дозе (Гражданкин и др., 2003).

При предварительном введении БТШ70 гипотензня развивалась в большей степени по сравнению с применением одного ЛПС S. typhimurium.

ЧСС увеличивалась после введения ЛПС с максимумом на 26,7±8,0% относительно исходных значений на 255-й минуте (Рис. 5, Б). Предварительное введение БТШ70 вызывало двухфазность в развитии тахикардии, и уровень тахикардии у этих животных был ниже, чем у животных, которые получали только ЛПС S. typhimurium. БТШ70, введенный после ЛПС S. typhimurium, вызывал 30-минутнуго задержку в развитии тахикардии.

-o-LPSS.fyphimurium -й- HSP70, LPS S. typhi muri um

-10-

-20

-!-»►

-20 -!0

Вр*ИЯ,чаг

Рис. 5. Изменения среднего артериального давления (А) и частоты сердечных сокращений (Б) при введении ЛПС S. typhimurium в дозе 4 мг/кг и ЛПС S. typhimurium в дозе 4 мг/кг на фоне БШ170 в дозе 266 мкг/кг. * - достоверные различия между группами по ANO VA 2

Введение эндотоксина из S. typhimurium вызывало изменения изучаемых биохимических параметров, аналогичные тем, которые вызывал эндотоксин из Е. coli Введение БТШ70 до эндотоксина из S. typhimurium полностью предотвращало развитие этих изменений, тогда как последующее за эндотоксином введение БТШ70 вызывало нормализацию этих параметров за исключением тромбопластинового времени свертывания крови.

3. Превентивные эффекты ЛПС из Rkodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium

Внутривенное введение ЛПС S. typhimurium в дозе 4 мг/кг вызывало гибель 80 % животных в течение 24 часов. ЛПС Rb. capsulatus в дозе 4 мг/кг не вызывал летальных эффектов. Введение ЛПС Rb. capsulatus в этой же дозе за 10 минут до введения эндотоксина снижало смертность до 46 %.

Результаты изменений параметров гемостаза у животных в группах представлены на рисунке 6. Как видно, при введении ЛПС S. typhimurium наблюдалось увеличение всех изучаемых параметров гемостаза - тромбопластинового и протромбинового

времени свертывания крови, концентрации фибриногена в крови и времени фибринолиза. Низкотоксичный ЛПС ЯЬ. саряиЫия также оказывал влияние на изменение параметров гемостаза, в частности, увеличивал к пятому часу такие параметры, как тромбопластииовое время свертывания крови, протромбиновое время свертывания и время фибринолиза, однако уменьшал к пятому часу наблюдаемое на 20-ой минуте нарастание концентрации фибриногена.

изменения тромёопластинового изменения протромбинового

времени свертывания крови времени свертывания крови

□ 20 минут И5 часов

изменения концентрации фибриногена в крови

изменения времени фибринолиза

х О.в • ¥

0.2 -

Д.

\ Т.Д.

tL.

500 <00

".300

(С 1

г 200

г»

s 100

■ т Л1

■

# #

Рис. 6. Изменения параметров гемостаза в экспериментальных группах. 1 - 0,9 % NaCI; 2 - ЛПС S. typhimurium в дозе 4 мг/кг; 3 - ЛПС Rb. capsulatus. в дозе 4 мг/кг; 4 -ЛПС Rb. capsulatus, ЛПС S. typhimurium. * - p < 0,05 no Wilcoxon test относительно фоновых значений, # - p < 0,05 no ANOVA2 относительно группы, получавшей эндотоксин S .typhimurium.

Предварительное введение низкотоксического ЛПС Rb. capsulatus. полностью предотвращало развитие изменений таких изучаемых параметров гемостаза, как концентрация фибриногена и время фибринолиза, вызванные ЛПС S. typhimurium.

Такие показатели гемостаза как протромбиновое и тромбопластиновое время свертывания крови имели тенденцию к увеличению в этой группе животных, однако, уровень увеличения этих параметров на 20-ой минуте сохранялся и к 5-му часу.

Введение эндотоксина 5. (урЫтигшт приводило к следующим изменениям среднего АД: первоначальный подъем АД с максимумом повышения на 6,0±2,0% на 20-й минуте с последующим некоторым снижением АД и плавным возвращением его к исходному уровню (рис.7, А). Предварительное введение нетоксичного ЛПС ЯЬ. саряи1аШ влияло на характер изменений АД, вызванных одним ЛПС X ¡ур/птигшт, следующим образом:полностью подавлялось развитие гипертензивной фазы, а вместо пшотензии наблюдали небольшое повышение АД. Введение одного ЛПС ПЬ. сарзи1аш не вызывало достоверных изменений среднего АД.

—0—LF5 Fb.capsulatus (1) —LPS S.typfriruriura (2) —А— LF5 №.capsulatus. LPS S.typhimriiim(3)

-15

0 1 2 3 4 5

Бремя, час

Рис. 7 Изменения среднего артериального давления (А) и частоты сердечных сокращений (Б) при внутривенном введении 1) ЛПС Rb. capsulatus в дозе 4 мг/кг (п=8); 2) ЛПС S. typhimurium в дозе 4 мг/кг (п=10); 3) ЛПС S. typhimurium на фоне ЛПС Rb. capsulatus (n=6). * - р<0,05 между 1 и 2, # - р<0,05 между 2 и 3.

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛЮКОЗЫ □ 20 мин В 5 час

| 2

5" о

1-20

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО БЕЛКА

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АЛЬБУМИНА В КРОВИ

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КРЕАТИНИНА В КРОВИ

к 0,4 "

¡0.1 «

3 -ОД s

-0,5

1 J-

# tr

S. 30

s 10

ИЗМ Ж&МЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БИЛИРУБИНА

ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ В КРОВИ

1 *

оГ

тМЛ

0,1

ч-

А т # #

•

\ т j

12 3 4

Рис. 8. Изменения параметров биохимии в экспериментальных группах. 1 - 0,9 % NaCl; 2 - ЛПС S. typhimurium в дозе 4 мг/кг; 3 - ЛПС Rb. capsulatus в дозе 4 мг/кг; 4 -ЛПС Rb. capsulatus, ЛПС S. typhimurium,. * - р < 0,05 по Wilcoxon test относительно фоновых значений, # - р < 0,05 по ANOVA2 относительно группы, получавшей эндотоксин S. typhimurium.

ЧСС увеличивалась после введения ЛПС S.typhimuriurn с максимумом на 26.7±8,0% относительно исходных значений на 255-й минуте. При введении

низкотоксичного ЛПС Rb. capsulatus также развивалась тахикардия, однако степень

ей была ниже по сравнению с наблюдаемой при введении эндотоксина - максимум увеличения ЧСС наблюдали на 4-ом часе после введения ЛПС на 11,3 ± 3 % относительно исходных значений (Рис. 7, Б). Предварительное введение нетоксичного ЛПС Rb. capsulatus. снижало уровень тахикардии по сравнению с группой животных, которым вводили только ЛПС S. typhimurium - ЧСС в этой группе животных увеличивалась на 20,3 ± 4,3 % к пятому часу.

Введение эндотоксина из S. typhimurium вызывало первоначальную гипергликемию (через 20 минут) с выраженной гипогликемией к 5-му часу от начала введения ЛПС (Рис. 8). Снижение уровня глюкозы может быть связано с подавлением эндотоксинами экспрессии фосфоенолпируват карбоксилазы (РЕРСК) (Gramer et al., 1990). Введение ЛПС Rb. capsulatus достоверно не влияло на изменение параметра -наблюдалась тенденция к повышению на 20-ой минуте и тенденцию к снижению параметра к 5-му часу. Предварительное введение ЛПС Rb. capsulatus. до эндотоксина не влияло на фазу гипергликемии, но через 5 часов исходный уровень глюкозы практически восстанавливался.

ЛПС из S. typhimurium подобно ЛПС из Е. coli вызывал уменьшение в крови уровня общего белка (Рис. 8) на 20-ой минуте и это уменьшение концентрации продолжалось и на 5-ом часе. Такая же картина наблюдалась в изменении концентрации альбумина. ЛПС Rb. capsulatus также уменьшал значение этого параметра, но в меньшей степени, чем ЛПС из S. typhimurium. ЛПС Rb. capsulatus, введенный до эндотоксина, предотвращал обусловленное эндотоксином S. typhimurium уменьшение в крови концентрации общего белка. Кроме того, предварительно введение нетоксичного ЛПС до эндотоксина достоверно подавляло эндотоксин-индуцироваяное изменение в крови уровня креатшшна, билирубина и триглицеридов (Ряс. 8).

выводы

1. Показано, что экзогенный БТШ70 снижает физиологические эффекты эндотоксинов. Эффективность БТШ70 зависит как от способа его применения, так и от структуры эндотоксинов. Предварительное введение БТШ70 за 10 минут до эндотоксинов как из Е. coli, так и из S. typhimurium уменьшает гибель животных. При введении БТШ70 после эндотоксинов его защитные свойства проявляются только в случае применения эндотоксина из S. typhimurium.

2. Предварительное введение БТШ70 полностью предотвращает вызванное эндотоксинами из Е. coli или S. typhimurium увеличение следующих параметров гемостаза: тромбопластиновое время и протромбиновое время свертывания крови, концентрация фибриногена, время фибринолиза. При введении БТШ70 после эндотоксинов также наблюдается нормализация изучаемых параметров гемостаза за исключением тромбопластинового времени свертывания крови.

3. Обнаружено, что только при предварительном применении БТШ70 наблюдается его влияние на гемодинамические эффекты эндотоксинов. Введение БТШ70 после эндотоксинов не влияет на изменения гемодинамических параметров, вызванные эндотоксинами.

4. Предварительное введете БТШ70 полностью предотвращает эндотоксин-индуцированные изменения содержания в крови глюкозы, белков, креатинина, триглицеридов, билирубина, тогда как введение БТШ70 после эндотоксинов вызывает нормализацию только глюкозы и белка, вызванную эндотоксином из Е. coli.

5. ЛПС из Rhodobacter capsulatus проявляет защитные эффекты от эндотоксинов сходные с БТШ70, которые выражаются в уменьшении гибели животных, а также в нормализации биохимических параметров крови, гемостаза и гемодинамики.

6. БТШ70 и ЛПС из Rixodobacter capsulatus могут быть рекомендованы для создания новых фармакологических препаратов для защиты от эндотоксинов.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гражданкин Е.Б., Кустанова Г.А., Прохоренко И.Р., Мурашев А.Н., Грачев C.B. Изучение влияния блокады бетга-адренорецепторов на гемодинамические эффекты липополисахарида из Salmortella typhimurium. Сборник тезисов 6-Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 20-24 мая 2002 г. Т. 1: С. 69.

2. Гражданкин Е.Б., Кустанова Г.А, Хохлова О.Н., Прохоренко И.Р., Мурашев А.Н., Грачев C.B. Влияние блокады адренорецепторов на сердечно-сосудистые эффекты липополисахарида из Salmonella typhimurium. Доклады Академии Наук. 2003; Т. 392; № 2: С. 274-276.

3. Кустанова Г.А, Гражданкин Е.Б., Прохоренко И.Р., Мурашев А.Н., Грачев C.B. Роль а- и ß-адренорецепторов в реализации гемодинамических эффектов эндотоксинового шока. Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти Ю.А.Овчинникова. Москва-Пущино, 25 ноября-2 декабря 2002 г. С. 94.

4. Кустанова Г.А., Гражданкин Е.Б., Прохоренко И.Р., Мурашев А.Н. Роль ß-адренорецепторов в реализации гемодинамических реакций и жизнеспособности крыс при формировании защитных эффектов нетоксичных липополисахаридов на ранних стадиях эндотоксинового шока. Сборник тезисов молодежной конференции «Молодые ученью в медицине». Казань, 21-23 апреля 2004 г. С. 131.

5. Кустанова Г.А., Гражданкин Е.Б., Мурашев А.Н., Прохоренко И.Р., Туховская Е.А., Лобанова H.H., Лобанов A.B. Роль ß-адренорецепторов в формировании защитных эффектов нетоксических липополисахаридов при развитии экспериментального эндотоксинового шока. Тезисы докладов XI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2004». Москва, 12-15 апреля 2004 г. С. 357.

6. Прохоренко И.Р., Винокуров М.В., Юринская М.М., Кабанов Д.С., Гражданкин Е.Б., Кустанова Г.А., Зубова C.B., Прохоренко C.B., Волошина Е.В., Грачев C.B. Изучение защитного действия патогенных липополисахаридов от эффектов эндотоксинового шока в экспериментах in vivo и in vitro. Сборник тезисов первой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасностъ». Москва, 26-28 октября 2004 г. С. 159.

7. Кустанова Г.А., Гражданкин Е.Б., Прохоренко И.Р., Мурашев А.Н. Роль ß-адренорецепторов в реализации гемодинамических реакций и жизнеспособности крыс при формировании защитных эффектов нетоксических липополисахаридов на ранних стадиях эндотоксинового шока. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». Москва, 2004. С. 131-132.

8. Прохоренко И.Р., Гражданкин Е.Б., Кустанова Г.А., Кабанов Д.С., Мурашев А.Н., Косякова Н.И., Грачев C.B. Блокада ß-адренорецепторов снижает защитные эффекты нетоксических липополисахаридов при развитии эндотоксинового шока у крыс. Научно-практическая конференция «Новые направления в диагностике, лечении и восстановительной медицине». Пущино, 2004. С. 62.

9. Кустанова Г.А., Мурашев А.Н., Прохоренко И.Р. Изучение формирования защитных эффектов от эндотоксинового шока нетоксичными липополисахаридами. Материалы отчетной конференции ФИБХ РАН, Пущино, 18 ноября 2004 г. С. 12.

Ю.Прохоренко И.Р., Кустанова Г.А., Гражданкин Е.Б., Кабанов Д.С., Мурашев А.Н., Прохоренко C.B., Грачев C.B. Влияние липополисахаридов разной структуры на сердечно-сосудистые показатели крыс Wistar. Доклады Академии Наук. 2005; Т. 402; №6: С. 838-840.

11. Кустанова Г.А., Мурашев А.Н., Евгеньев М.Б., Карпов В.Л., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Изучение формирования защиты от эндотоксинового шока при экзогенном введении препарата белка теплового шока БТШ70. Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина». Санкт-Петербург, 14-16 апреля 2005 г. С. 64.

12. Кустанова Г.А., Мурашев А.Н., Прохоренко И.Р., Грачев С.В. Нетоксические липополисахариды снижают токсические эффекты эндотоксинового шока. XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе». Пущино, 19-23 июня 2005 г. С. 33.

13. Кустанова Г.А., Евгеньев М.Б., Хохлова О.Н., Мурашев А.Н., Карпов В.Л., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Экзогенное введение белков теплового шока снижает токсические эффекты липополисахарида из Esherichia coli. Научные труды I Съезда физиологов СНГ. Сочи, Дагомыс, 19-23 сентября 2005г. T.l. С.141.

14. Кустанова Г.А., Кононова Т.В., Хохлова О.Н. Белок теплового шока 70 кДа при экзогенном введении снижает токсические эффекты эндотоксинового шока. Девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей. Санкт-Петербург, 22 апреля 2006 г. С. 173.

15. Kustanova GA, Murashev AN, Karpov VL, Margulis BA, Guzhova IV, Prokhorenko IR, Grachev SV, Evgen'ev MB. Exogenous heat shock protein 70 mediates sepsis manifestations and decreases the mortality rate in rats. Cell Stress Chaperones. 2006 Autumn; 11(3): 276-86.

16. Kustanova GA, Khokhlova ON, Prokhorenko IR, Evgen'ev MB, Murashev AN Exogenous heat shock protein 70 mediates sepsis manifestations and decreases the mortality rate in rats. International Congress of Young Chemists "YoungChem2006". Poland, Pultusk, 25-29 October2006. P. 111.

17. Кустанова Г.А., Мурашев A.H., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Прохоренко И.Р., Грачев С.В., Евгеньев М.Б. Защитные эффекты экзогенного белка теплового шока 70 кДа при эндотоксшювом шоке (сепсисе). Доклады Академии Наук. 2006; Т. 411; Ка5; С. 711-714.

Принято к исполнению 11.01.2007 Исполнено 13.01.2007

Заказ № 11. Тираж 75 экз.

«Фотон-век», г.Пушино, ул. Институтская-3, тел. (827) 73-94-32

beornot@rambIer.ru

http://photon-vek.narod.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кустанова, Гульсара Амангалиевна

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Сепсис - общемедицинская проблема.

1.2. Современное состояние проблемы в области изучения эндотоксинового шока.

1.2.1. Структура бактериальных ЛПС.

1.2.2. Этиология эндотоксинового шока.

1.2.3. Рецепторы ЛПС.

1.2.4. Медиаторы эндотоксинового шока.

1.2.5. Влияние ЛПС на сердечно-сосудистую систему.

1.2.6. Влияние ЛПС на систему гемостаза.

1.2.7. Влияние ЛПС на биохимические параметры крови.

1.3. Белки теплового шока.

1.3.1 Структура, функции, протективная роль.

1.3.2. Современное состояние проблемы изучения протективной функции белков теплового шока.

1.3.3. БТШ и сердечно-сосудистая система.

1.3.4. БТШ и апоптоз.

1.3.5. Перспективы использования системы БТШ в медицине.

1.4. Антагонисты бактериальных эндотоксинов и их роль в защите от сепсиса.

Глава II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II. 1. Объект исследования.

II.2. Методы исследования.

П.2.1.Катетерная технология регистрации артериального давления и внутривенной инъекции препаратов.

11.2.2.Хирургические процедуры: имплантация артериальных и венозных катетеров.

11.2.3.Исследование параметров гемостаза.

II.2.4. Биохимические исследования.

11.3. Протоколы исследований.

11.4. Статистическая обработка результатов.

Глава III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

III. 1. Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Esherichia coli.

III. 1.1. Влияние на выживаемость животных.

III. 1.2. Влияние на параметры гемостаза.

III. 1.3. Влияние на параметры гемодинамики.

III. 1.4. Влияние на биохимические параметры.

111.2. Влияние экзогенного БТШ70 при его предварительном и последующем введении на физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium.

111.2.1. Влияние на выживаемость животных.

111.2.2. Влияние на параметры гемостаза.

111.2.3. Влияние на параметры гемодинамики.

111.2.4. Влияние на биохимические параметры.

111.3. Превентивные эффекты ЛПС из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium.

111.3.1. Влияние на выживаемость животных.

111.3.2. Влияние на параметры гемостаза.

111.3.3. Влияние на параметры гемодинамики.

111.3.4. Влияние на биохимические параметры.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние белка теплового шока 70 КДА и липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов"

Актуальность проблемы

В течение длительного времени сепсис остается проблемой медицинского, демографического и экономического значения, поскольку летальность по данным разных авторов может варьировать от 20% до 40%, а в случае развития инфекционно-токсического шока может достигать 80% (Martin et al., 2003; Белобородое, 1997). Согласно недавним литературным данным, в США и в странах Европы сепсис ежегодно развивается у 700000 пациентов, причем количество подтвержденных случаев увеличивается на 1,5 % в год (Angus, Wax, 2001; Riedermann et al., 2003).

Среди причин смертности населения США септицемия, осложненная эндотоксиновым шоком, стоит на 13-ом месте. Особо важное значение приобретают грамотрицательные инфекции в структуре внутрибольничных инфекций у детей и лиц пожилого возраста, а также у пациентов с соматическими заболеваниями. Экстремальные ситуации, стресс, физическое перенапряжение приводят к срыву адаптационных возможностей организма. Эти и другие причины в ослабленном организме приводят к генерализации процесса, крайним проявлением которого является эндотоксиновый шок. Установлено, что у 50% пациентов с сепсисом развивается септический шок, и половина из них погибает, несмотря на адекватное лечение антибиотиками и неотложную терапию (Dal Nogare, 1991).

Эндотоксин грамотрицательных бактерий способен убить человека и животных при очень низкой концентрации в крови - 1 нг/мл (Mayeux, 1997), действуя на разные клетки организма как непосредственно, так и опосредованно, через индукцию синтеза в клетках-мишенях биологически активных веществ. Специфические антитела к эндотоксину применяли в лечении септического шока в двойном слепом исследовании при внутримышечном введении антител новорожденным. Разницы между контрольной и группой новорожденных, получавших антитела, выявлено не было (Румянцев и др., 1988). В связи с изложенным, поиск средств и методов защиты от эндотоксинового шока остается чрезвычайно актуальным.

Исследования действий эндотоксинов нашли отражение в эволюции патогенетической терапии бактериальных инфекций, начиная с применения сорбентов, связывающих эндотоксины, антител к эндотоксинам, ингибиторов синтеза простагландинов и других производных арахидоновой кислоты, блокирования медиаторов воспаления до вмешательства в механизмы нарушения гемостаза (Пак и др., 2003). Однако недавние клинические исследования, направленные на анализ снижения смертности пациентов от сепсиса в зависимости от применяемой терапии, показали практически отсутствие прогресса в лечении этого заболевания (Riedermann et al., 2003).

В последние годы после получения препаратов экзогенного белка теплового шока 70 кДа (БТШ70) - природного и рекомбинантного - возрос интерес к разработке новых лекарственных средств на основе БТШ70 для лечения различных заболеваний. Экспрессия белков теплового шока или стресс-белков является одним из ответов организма на воспаление (Маргулис, Гужова, 2000). В литературе имеются указания на то, что уровни экспрессии БТШ хорошо коррелируют с выживаемостью грызунов в модели эндотоксинового шока (Hotchkiss et al., 1993; Lappas et al., 1994). Эти наблюдения очень важны в клиническом отношении, поскольку могут быть использованы для создания препаратов предотвращающих развитие септического шока при грам-отрицательном сепсисе. В последнее десятилетие большое значение отводится изучению защитных свойств БТШ70. Однако эти исследования проведены в основном на клеточных культурах (Маргулис, Гужова, 2000; Guzhova et al., 1998; Guzhova et al., 2001). На сегодняшний день не вызывает сомнений тот факт, что исследование защитных свойств экзогенного БТШ70 против эндотоксинового шока in vivo представляют собой важный инструмент в оценке ответа целого организма на септическое воздействие и способствует развитию новых подходов к терапии сепсиса.

Еще одним из перспективных направлений в защите от грамотрицательной инфекции становятся природные антагонисты эндотоксинов или аналогичные им вещества, синтезированные химическим путем. В этой связи поиск исходно низкотоксичных липополисахаридов (ЛПС), обладающих свойствами антагонистов эндотоксинов имеет первостепенную значимость (Gangloff et al., 1999). Работы в этом направлении начались в 80-е годы, когда были выделены из фотосинтезирующих бактерий низкотоксичные липополисахариды (Qureshi et al., 1988, Krauss et al., 1989) и в экспериментах in vitro показана их способность конкурировать с эндотоксинами за рецепторы клеток-мишеней (Rietschel et al., 1994). К числу таких низкотоксичных липополисахаридов относится ЛПС из фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter capsulatus (Rb. capsulatus). Проведенные ранее исследования на клеточных культурах показали способность защитного действия ЛПС из Rb. capsulatus от некоторых эффектов эндотоксинов (Грачев и др., 1998; Винокуров и др., 2003). Однако, исследования этого препарата in vivo на выявление его защитных свойств, ранее не проводились.

Цель работы

Задачи исследования

2. Изучить действие экзогенного БТШ70 на вызванные эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium изменения параметров гемостаза.

3. Исследовать влияние экзогенного БТШ70 на вызванные эндотоксинами из Е. coli и S. typhimurium изменения биохимических параметров крови.

4. Изучить влияние ЛПС из Rb. capsulatus на физиологические эффекты эндотоксина из S. typhimurium.

Научная новизна работы

Значительная часть результатов, представленных в данной работе, носит приоритетный характер. Впервые проведено исследование эффектов БТШ70 на животных in vivo. Показано, что БТШ70 при предварительном введении снижает смертность животных от шока, индуцированного разными эндотоксинами, отменяет эндотоксин-индуцибельное увеличение параметров гемостаза. В экспериментах in vivo на крысах впервые проведено исследование защитного действия антагониста эндотоксина низкотоксичного ЛПС из Rb. capsulatus. Показано, что предварительное введение низкотоксичного ЛПС из Rb. capsulatus снижает смертность животных от эндотоксинового шока, снижая его эффекты на организм.

Научно-практическое значение

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Кустанова, Гульсара Амангалиевна

выводы

2. Предварительное введение БТШ70 полностью предотвращает вызванное эндотоксинами из Е. coli или S. typhimurium увеличение следующих параметров гемостаза: тромбопластинового времени свертывания крови, протромбинового времени свертывания крови, концентрации фибриногена, времени фибринолиза. При введении БТШ70 после эндотоксинов также наблюдается нормализация изучаемых параметров гемостаза за исключением тромбопластинового времени свертывания крови.

4. Предварительное введение БТШ70 полностью предотвращает эндотоксин-индуцированные изменения содержания в крови глюкозы, белков, креатинина, триглицеридов, билирубина, тогда как введение БТШ70 после эндотоксинов вызывает нормализацию только глюкозы и белка, вызванную эндотоксином из Е. coli.

6. БТШ70 и ЛПС из Rhodobacter capsulatus могут быть рекомендованы для создания новых фармакологических препаратов для защиты от эндотоксинов.

Заключение

1. Влияние БТШ70 на физиологические эффекты эндотоксинов из Esherichia coli и Salmonella typhimurium

Эндотоксиновый шок остается одной из главных проблем, связанных с лечением инфекционных заболеваний (Martin et al., 2003). В настоящее время разрабатывается огромное количество фармакологических препаратов -потенциальных лекарств для лечения эндотоксинового шока, некоторые из которых уже есть на рынке. Действие многих из препаратов было направлено на специфические провоспалительные медиаторы и поэтому в целом оказалось неэффективным, так как процесс развития эндотоксинового шока включает широкое разнообразие медиаторов. Более успешная стратегия лечения направлена на конечную стадию сепсиса, а именно на изменённую коагуляцию. Однако клинические испытания подобных препаратов (Xigris) показали, что препарат не может применяться в клинике.

Весьма перспективной представляется альтернативная терапия, которая направлена на предотвращение связывания ЛПС с рецепторами клеток хозяина. Такая терапия может включать вещества, нейтрализующие ЛПС или антагонисты к рецепторам эндотоксинов.

Одним из этапов нашей работы было изучить протективные эффекты экзогенного белка теплового шока БТШ70, выделенного из мышцы быка, на эффекты эндотоксина на модели крыс.

Проведенные ранее исследования показали, что БТШ70 способен проявлять защитные свойства от эндотоксинов (Koh et al 1999; Meldrum et al.,1999; Ding et al 2001). Эффекты экзогенного БТШ70 на введение эндотоксина изучались в основном либо индукцией БТШ70 путем предварительной тепловой обработкой, либо другими стимулами или использованием ингибиторов и индукторов определенных БТШ (Ding et al., 2001; Paidas et al., 2002; Vega and De Maio 2003; Nakada et al., 2005). Кроме того, основные исследования в этом направлении проведены в основном на клеточных культурах (Маргулис, Гужова, 2000; Guzhova et al., 1998; Guzhova et al., 2001).

Наши исследования, проведенные на бодрствующих животных, показали, что предварительное введение БТШ70, выделенного из мышцы быка, за 10 минут до эндотоксинов из Е. coli и S. typhimurium может снижать их физиологические эффекты.

Так, в наших экспериментах предварительное введение БТШ70 снижало смертность животных от эндотоксинов. Характерно, что последующее введение БТШ70 после эндотоксинов было эффективным в снижении смертности только в случае применения эндотоксина из S. typhimurium, тогда как применение БТШ70 после ЛПС Е. coli даже немного увеличивало этот параметр. Подобные эффекты можно объяснить тем, что БТШ70 вероятно блокирует механизмы, которые впоследствии приводят к развитию воспалительного сигнала, на ранних этапах. Из литературных данных известно, что БТШ70 способен подавлять развитие воспаления путем блокирования передачи сигнала от ЛПС в ядро (Shi et al., 2006). БТШ70, введенный экзогенно, способен препятствовать реакции фосфорилирования фактора NFkB, что в итоге приводит к торможению передачи сигнала. В результате не начинает нарабатываться основной цитокин ФНО-а, и в итоге воспалительный процесс не развивается в полном объеме. Кроме того, в литературе имеются доказательства того, что БТШ70 имеет ингибиторный эффект на высвобождение цитокинов (Ding et al., 2001; Suganuma et al., 2002; Nakada et al., 2005).

Известно, что введение эндотоксина животным вызывает каскад событий, инициированных секрецией известных цитокинов, которые изменяют экспрессию генов и индуцируют лихорадку, вызывает увеличение сердечного выброса, изменения в работе сердечно-сосудистой системы, нарушения в работе печени и почек (Pajkrt et al 1997; Karima et al., 1999). Согласно литературным данным, БТШ70 модулирует фибринолитическую и свёртывающую системы во время эндотоксемии (Ding et al., 2001; Suganuma et al., 2002; Nakada et al., 2005). В некотором отношении наши данные подтвердили это предположение, поскольку предварительное введение БТШ70 значимо изменяло наблюдаемое увеличение всех параметров гемостаза (Рис III. 1.2.1.).

При эндотоксиновом шоке происходят нарушения в работе свертывающей, фибринолитической и противосвертывающей систем. В результате чего развивается синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) - дисбаланс в работе этих трех систем. В наших экспериментах при введении эндотоксина Е. coli наблюдалось увеличение изучаемых параметров гемостаза. Увеличение времени свертывания как тромбопластинового, так и протромбинового свидетельствует о наступлении эндотоксин-индуцибельной фазы гипокоагуляции (или переходной) стадии ДВС-синдрома, когда на фоне гиперколичеств циркулирующего в крови тромбопластина активируется и противосвертывающая система - активность факторов как внешнего, так и внутреннего пути свертывания крови замедляется, время свертывания удлиняется. Вследствие гипокоагуляции фибриноген не трансформируется в фибрин, концентрация его в крови увеличивается, кроме того, фибриноген как белок острой фазы начинает активно синтезироваться в печени (Сидоркина и др., 2003). При эндотоксиновом шоке в патогенезе тяжелых нарушений коагуляции играет роль ещё один механизм - увеличение ингибитора активации фибринолитической системы (в частности, ингибитора активации плазминогена), что способствует неадекватному удалению сгустков фибрина из сосудистого русла (Грачев и др., 2003). В результате время лизиса сгустка (время фибринолиза) удлиняется. Известно, что ключевым активатором нарушений при ДВС-синдроме является IL-6, а TNF-a опосредованно влияет на этот процесс за счет воздействия на IL-6 (Esmon, 2001).

В наших экспериментах было отмечено, что эндотоксин вызывает нарушения в работе системы гемостаза, а именно - увеличивает протромбиновое и тромбопластиновое время свертывания крови, концентрацию фибриногена и время фибринолиза. Предварительное введение БТШ70 полностью блокировало эндотоксин-индуцированное (как эндотоксином из Е. coli, так и из S. typhimurium) увеличение всех этих параметров гемостаза. Эффекты эндотоксинов из Е. coli и S. typhimurium, направленные на повышение параметров гемостаза, полностью предотвращались с помощью предварительного введения БТШ70. Можно полагать, что предварительное введение БТШ70 снижало или предотвращало эндотоксин-индуцированную выработку цитокина, обусловливающего эти изменения.

При введении БТШ70 после эндотоксинов также наблюдалась нормализация изучаемых параметров гемостаза за исключением тромбопластинового времени свертывания крови. Увеличение только тромбопластинового времени говорит о нарушениях в работе именно внутреннего пути свертывания крови - пути контактной активации, когда механизм запускается вследствие контакта фактора XII с поврежденной эндотелиальной поверхностью, с измененными клеточными мембранами (Сидоркина и др., 2003). Вероятно, именно этот механизм не предотвращается при последующем введении БТШ70 после эндотоксинов.

Ранее было показано, что ЛПС-индуцибельное увеличение продукции ФНО-а, IL-1(3, IL-10 и IL12b клетках значительно ингибировалось экспрессией БТШ70 (Ding et al., 2001). Более того, было продемонстрировано, что врожденный иммунитет использует по крайней мере три клеточных рецептора, CD 14, TLR4, MD-2 во время распознавания ЛПС на клеточном уровне. БТШ могут взаимодействовать с формальными рецепторами ЛПС, таким как CD 14, изменяя при этом ответ на ЛПС на всех клеточных уровнях (Triantafilou and Triantafilou. 2004).

Необходимо подчеркнуть, что имеется масса доказательств, предполагающих, что при различных условиях БТШ высвобождаются из периферических моноцитов крови, несмотря на отсутствие пептидных последовательностей - мишеней секреции белка (Guzhova et al., 2001; Walsh et al., 2001; Hunter-Lavin et al., 2004; Johnson and Fleshner 2006). Поэтому, БТШ являются важными в иммунном ответе, и клетки могут абсорбировать и утилизировать БТШ из клеточных культур (Guzhova et al., 2001; Wallin et al., 2002; Johnson and Fleshner 2006, Campisi et al., 2003).

Хорошо известно, что эндотоксин может индуцировать гипотензию и тахикардию (Lin et al., 1999; Van Amersfoort et al., 2003). В наших экспериментах гемодинамическая реакция крыс на ЛПС разных бактерий не была идентичной. Так, инъекция ЛПС из Е. coli приводила к гипотензии и тахикардии, тогда как введение ЛПС из S. typhimurium приводило к развитию гипертензии с последующей гипотензией и тахикардии. Известно, что эффекты эндотоксинов различны и это различие может быть обусловлено дозой, схемой введения или структурой липида А. Так, мы видим, что эффект эндотоксина из S. typhimurium отличен от эффектов эндотоксина из Е. coli. Вероятной причиной этого может быть и различие в структуре липида А этих эндотоксинов - так, было показано, что самый сильный и токсичный липид А обусловлен наличием в его структуре шести жирнокислотных остатков -именно такое строение имеет липид А эндотоксина из Е. coli. Если же в структуре липида А меньше или больше чем 6 жирнокислотных остатков -это свидетельствует о менее токсичных свойствах эндотоксина (Rietschel et al., 1994).

Известно, что в ответ на введение эндотоксина повышается активность симпатических нервов и зон центрального сердечно-сосудистого контроля. Гипертензивная фаза при введении S. typhimurium обусловлена стимуляцией адренорецепторов, поскольку блокада адренорецепторов подавляет гипертензивную фазу, обусловленную эндотоксином S. typhimurium в такой же дозе (Гражданкин и др., 2003).

В отношении ЧСС, превентивное введение препарата БТШ70 имело некоторые эффекты относительно частичной нормализации этих параметров, в частности, снижало уровень тахикардии, обусловленной эндотоксином из S. typhimurium. С другой стороны, последующее за эндотоксином применение БТШ70 в случае эндотоксина из Е. coli приводило даже к значимому увеличению уровня тахикардии (Рис III. 1.3.2., В).

Основными показателями, характеризующими работу печени и почек при стрессовых и патологических состояниях, являются такие биохимические показатели как глюкоза, белки, триглицериды, билирубин, креатинин. Введение эндотоксинов вызывало первоначальную гипергликемию (через 20 минут) с выраженной гипогликемией к 5-му часу от начала введения эндотоксинов. Снижение уровня глюкозы в крови по крайней мере частично связано с подавлением эндотоксинами экспрессии фосфоенолпируват карбоксилазы (РЕРСК) (Granner et al., 1990). Введение БТШ70 до эндотоксина в наших экспериментах восстанавливало исходный уровень глюкозы, что указывает на восстановление глюконеогенеза. Наблюдаемые нами эффекты экзогенного БТШ70 аналогичны защитным эффектам, вызываемых тепловым шоком в работе Paidas с соавторами, которые показали, что уровни РЕРСК mRNA снижались у мышей после введения ЛПС, тогда как у мышей, предварительно подвергнутых тепловому шоку, экспрессия РЕРСК mRNA не менялась (Paidas et al., 2002).

Известно, что при эндотоксиновом шоке происходит снижение экстракции аминокислот и снижается синтез белков (Karima et al., 1999). Кроме того, при эндотоксиновом шоке увеличивается в плазме уровень азота мочевины и, как следствие, наблюдается увеличение концентрации креатинина в крови, из-за увеличения в печени липопротеинов очень низкой плотности снижается также уровень периферических триглицеридов в крови; кроме того, в печени прогрессирует увеличение уровня билирубина (Karima et al., 1999). Данные наших исследований подтвердили эти литературные данные относительно изменений этих биохимических параметров. В литературе описанные эффекты эндотоксина связывают с влиянием на печень и почки основного паракринного и аутокринного цитокина при эндотоксиновом шоке - TNF-a. Тот факт, что лишь предварительное введение БТШ70 до эндотоксина на пятом часе достоверно подавляло эти изменения параметров говорит о том, что БТШ70 вероятно блокирует механизмы, которые впоследствии приводят к развитию воспалительного сигнала, на ранних этапах. Из литературных данных известно, что БТШ70 способен подавлять развитие воспаления путем блокирования передачи сигнала от ЛПС в ядро (Shi et al., 2006).

2. Влияние липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксина из Salmonella typhimurium

Одним из направлений предотвращения токсичности эндотоксинов является исследование возможности создания антагонистов к рецепторам, способным блокировать активацию клеток, индуцированную эндотоксинами. Липид А является уникальной частью всех ЛПС большинства патогенных бактерий, их главным «токсикофором» (Galanos et al., 1985; Takada and Kotani, 1989). Создание антагонистов, препятствующих взаимодействию липида А с клетками-мишенями является заманчивой перспективой для лечения сепсиса, бактериемии, септического шока и других индикаций. В настоящее время создана серия синтетических аналогов липида А. Среди них Е5531 (Crist et al., 1999), исследования которого показали некоторое снижение его антагонистической активности при введении в кровь (Wasan et al., 1999). Синтетический липополисахарид второго поколения Е5564, также антагониста эндотоксина, имеет преимущество перед Е5531, выражающееся в более длительной циркуляции в крови (Rossignol et al., 2004).

Очевидно, антагонисты ЛПС блокируют эффекты эндотоксинов в модели клинического сепсиса и потенциально могут использоваться в лечении или предотвращении сепсиса.

Из Rhodobacter capsulatus был получен низкотоксичный липополисахарид, для которого была показана способность защитного действия от ряда эффектов эндотоксинов. Так, проведенные ранее исследования показали, что липополисахарид из Rhodobacter capsulatus на нейтрофилах подавляет кальциевый ответ клеток, вызываемых разными эндотоксинами, подавляет экспрессию Р-интегринов и снижает адгезивную активность клеток, индуцированную эндотоксинами (Асташкин и др., 1999; Винокуров и др., 2003), на нейтрофилах и моноцитах человека подавляет эндотоксин-индуцибельный дыхательный взрыв, ингибирует замедление апоптоза индуцированное эндотоксином (Винокуров и др., 2000; Винокуров и др., 2003), ЛПС Rhodobacter capsulatus сохраняет активность нейтрофилов к фагоцитозу, не активируя дыхательный взрыв (Винокуров и др., 2003).

На основании этих данных, демонстрирующих защитные эффекты ЛПС из Rhodobacter capsulatus в экспериментах in vitro, нами было сделано предположение о том, что ЛПС Rhodobacter capsulatus способен проявлять защитные эффекты при эндотоксиновом шоке in vivo.

Наши исследования, проведенные на бодрствующих животных, показали, что при предварительном введении низкотоксичного липополисахирида до эндотоксина снижается смертность животных и составляет 46 % в отличие от 80 % в группе животных, которым вводили эндотоксин из Salmonella typhimurium. Следует отметить, что такой результат показывает более высокий потенциал изучаемого препарата как снижающего эффекты эндотоксина, чем показанный для Е5531 (Kawata et al., 1999).

Как известно, ответ организма на грамотрицательные бактерии запускается по крайней мере, частично распознаванием и ответом клеток-хозяина на эндотоксин, который является главной составляющей внешней мембраны грамотрицательных бактерий (Ulmer, 2002). ЛПС распознаётся разными путями - в одном пути (гуморальном) участвуют собственные антитела и липопротеины, чтобы нейтрализовать и очистить кровь от ЛПС; второй путь запускает мощный комплексный воспалительный ответ, включающий активацию клеток с участием LBP-белка, CD-14 рецептора и толл-подобиых рецепторов, в частности TLR4 (Diks et al., 2001). В ответе на инфекцию липополисахариды в крови детектируются такими клетками, как моноциты, макрофаги, Купферовы клетки печени, запуская их к продукции большого разнообразия цитокинов и других клеточных медиаторов (Burrel, 1994, Fiuza and Suffredini, 2001), которые могут защищать хозяина. Однако во время или после киллинга бактерий свободные ЛПС могут индуцировать недопустимо высокие уровни клеточных медиаторов, которые запускают различные патофизиологические процессы (Bone, 1991; Norimatsu and Morrison, 1998; Suffredini and O'Grady, 1999), приводящие к мультиорганному воспалению и смерти (Brandtzaeg et al., 2001).

Прежде всего, в наших экспериментах было отмечено снижение смертности при предварительном введении ЛПС Rhodobacter capsulatus. Вероятно, этот защитный эффект ЛПС Rhodobacter capsulatus обусловлен его способностью прочно связываться с рецепторами к эндотоксинам, блокируя тем самым активацию клеток к синтезу провоспалительных цитокинов.

Известно, что при сепсисе происходят нарушения в системе работы крови. Так, эндотоксины стимулируют макрофаги, моноциты, эндотелиальные клетки, что приводит к секреции растворимых медиаторов (ФНО-б, ИЛ-1, ИЛ-6, оксида азота, метаболитов арахидоновой кислоты, интерферона-у и других). Свободные цитокины активизируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме (Rigato et al., 2001; Грачёв и др., 2003). Установлена зависимость между уровнями цитокинов и выраженностью катаболизма, расстройствами кислородного транспорта, функциональными нарушениями в жизненно важных органах, в частности, в печени, почках (Karima et al., 1999).

В наших экспериментах липополисахарид из Rhodobacter capsulatus отменял нарушения в работе системы коагуляции - отменял увеличение параметров гемостаза, вызванное эндотоксином из Salmonella typhimurium.

Известно, что эффекты эндотоксина, оказываемые на систему гемостаза, вторичны и опосредованы высокими концентрациями в крови провоспалительного медиатора - IL-6 (Karima et al., 1999). Вероятно, липополисахарид из Rhodobacter capsulatus подавляет продукцию IL-6, в результате в системе не развивается воспаление и связанные с этим нарушения в крови.

При предварительном введении липополисахарид из Rhodobacter capsulatus до эндотоксина в наших экспериментах не развивалась гипертензивная фаза и гипотензия полностью подавлялась.

Ранее в острых опытах на мышах линии С57В1/6 было установлено, что внутрибрюшинное введение ЛПС Rhodobacter capsulatus за 10-15 минут до эндотоксина Salmonella typhimurium подавляло его летальное действие. Предварительное введение ЛПС Rhodobacter capsulatus снижало летальность на 56 % (Асташкин, 1998).

В литературе имеются предположения, что эндотоксины и индуцируемые ими цитокины влияют на основную систему детоксикации ксенобиотиков в печени - цитохром Р-450. Оказалось, что и эндотоксин, и цитокины способны резко снижать ферментативную активность различных изоформ цитохрома Р-450 (Nadin et al., 1995). В тесте гексеналового сна было установлено, что введение ЛПС Rhodobacter capsulatus укорачивало продолжительность гексеналового сна, индуцированного эндотоксином, т.е. при введении ЛПС Rhodobacter capsulatus показатели продолжительности гексеналового сна приближались к контрольным цифрам. Эти данные подтверждают сделанное ранее предположение об антагонистическом действии ЛПС Rhodobacter capsulatus в отношении эндотоксина с клетками-мишенями. В то же время ЛПС Rhodobacter capsulatus не предупреждает влияние оксида азота, освободившегося из препарата донора N0, в качестве которого использовали нитропруссид натрия. В тесте гексеналового сна было выявлено, что ЛПС Rhodobacter capsulatus эффективно подавляет действие эндотоксина на систему цитохрома Р-450. Если мышам одновременно с эндотоксином вводили нитропруссид, гексеналовый сон становился короче. Это позволяет предположить, что ингибиторное действие эндотоксина на систему цитохрома Р-450 опосредуется оксидом азота. Таким образом, гемодинамические эффекты липополисахарида из Rhodobacter capsulatus опосредуются влиянием его на работу фермента NO-синтазы. Липополисахарид из Rhodobacter capsulatus блокирует действие эндотоксина на систему цитохрома Р-450 в результате подавления его связывания с клетками-мишенями на уровне взаимодействия со специфическими рецепторами.

Введение как БТШ70, так и ЛПС Rb. capsulatus наблюдали сходные эффекты в подавлении физиологических эффектов эндотоксинов. Этот факт дает основание предположить, что два этих препарата в итоге приводят к одинаковому результату, но опираясь на литературные данные, можно сделать предположение о разных механизмах действия БТШ70 и ЛПС Rb. capsulatus. Два этих агента действуют на разных этапах (разных участках) развития эндотоксинового шока.

БТШ70 работает на уровне передачи сигнала в ядро клетки. Механизм действия БТШ70 связан с активацией NFkB фактора. При развитии сепсиса для встраивания в ядро и соответственно для запуска реакции выработки цитокинов необходимо, чтобы произошла реакция фосфорилирования NFkB. В отсутствии БТШ70 это происходит. БТШ70 же, введенный экзогенно, препятствует реакции фосфорилирования NFkB и не происходит встраивания его в ядро. В результате не начинает нарабатываться ФНО-а - основной аутокринный и паракринный цитокин - и в итоге воспалительный процесс не развивается в полном объеме.

ЛПС Rb. capsulatus действует на более позднем участке - на стадии передачи сигнала в цитоплазму. ЛПС Rb. capsulatus прерывает передачу сигнала на стадии рецептор/лиганд. ЛПС Rb.capsulatus связывается с рецептором эндотоксинов, что препятствует связыванию последних и передачи сигнала в цитоплазму. Однако, через некоторое время может произойти интернализация, сигнал будет передаваться в ядро, что может быть связано с тем, что появляются новые рецепторы, которые могут взаимодействовать с циркулирующими эндотоксинами, если их большой избыток и в результате вызывать эффекты.

Таким образом, защитное действие экзогенного БТШ70 и ЛПС Rb. capsulatus могут реализовываться разными путями, но в результате приводить к сходным эффектам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кустанова, Гульсара Амангалиевна, Пущино

1. Асташкин Е.И., Прохоренко И.Р., Егорова Н.Д. Липополисахарид из фотосинтезирующих бактерий подавляет ингибиторное действие эндотоксинов на систему цитохрома Р450 мышей С57В1/6 in vivo. Доклады Академии Наук. 1998; 362: 277-280.

2. Асташкин Е.И., Прохоренко И.Р., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев С.В. Подавление Са ответа нейтрофилов человека, вызываемого эндотоксинами, с помощью липополисахарида фотосинтезирующих бактерий. Доклады Академии Наук. 1999; 364(5): 700-2.

3. Белобородое В.Б. Сепсис современная проблема клинической медицины. Российский Медицинский Журнал. 1997; Т.5; № 24; 326338.

4. Варбанец Л.Д. Эндотоксины грамотрицательных бактерий: структура и биологическая роль. Микробиол. журн. 1994; 56(3): 7697.

5. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В. Липополисахарид Rhodobacter caplulatus нейтрализует эндотоксин-индуцированные ответы нейтрофилов и моноцитов периферической крови человека. Доклады Академии Наук. 2006; 406: 19-22.

6. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В. Эффект липополисахаридов разной структуры на адгезию и генерацию активных форм кислорода человеческими нейтрофилами. Доклады Академии Наук. 2003; 393: 485-7.

7. Винокуров М.Г., Прохоренко И.Р., Юринская М.М., Грачев С.В. Действие липополисахаридов и ультрафиолета С на регуляцию апоптоза нейтрофилов человека. Иммунология. 2000; 6: 23-27.

8. Грачёв С.В., Пак С.Г., Малов В.А., Городнова Е.А. Текущие аспекты патогенеза сепсиса. Терапевтический архив. 2003; 11: 84-89.

9. Ю.Гужова И.В., Маргулис М.А. Индукция и аккумуляция HSP70 приводит к формированию комплекса с другими клеточными белками. Цитология. 2001; 42(7): 647-52.

10. П.Лейдерман И.Н. Синдром полиорганной недостаточности (ПОН). Метаболические основы. Вестник интенсивной терапии. 1999; 2: 813; 3: 13-17.

11. Ломакина Е.Д., Свечкарев В.Г. Результаты исследования образа жизни студентов начальных курсов некоторых вузов. Физическое воспитание студентов творческих специальностей. ХГАДИ. Харьков. 2002; 8: 86-91.

12. Маргулис М.А., Гужова И.В. Стресс-белки в эукариотических клетках. Цитология. 2000; 42(4): 323-42.

13. М.Мокрушин А.А., Плеханов А. Иммунологическая идентификация эндогенных пептидов на срезах обонятельной коры. Доклады Академии Наук. 2001; 378: 227-9.

14. Мурашев А.Н., Медведев О.С., Давыдова С.А. Руководство по экспериментальной физиологии кровообращения. Саратов: Изд-во Саратов, ун та, 1992. С. 42.1 б.Мюлленайзен Б. Синдром стресса. Изд-во Казанского университета, 1993. 135 с.

15. Николаев А. Ю., Милованов Ю. С. Лечение почечной недостаточности М: ООО "Медицинское информационное агентство". 1999; ISBN 5-89481-023-Х.

16. Пак С.В., Малов М.Ф., Горобченко А.Н. Инфекционные заболевания: расширение традиционных точек зрения. Терапевтическмй Архив. 2003; 75(11): 5-10.

17. Пастухов Ю.Ф., Екимова И.В., Худик К.А., Гужова И.В. Свободный от липополисахарида белок теплового шока БТШ70 имеет гипотермный и сомногенный эффекты. Доклады Академии Наук. 2005; 402: 167-170.

18. Ломакина Т.Л. Программированная гибель клеток. С.-Пб. 1996. 286 с.

19. Румянцев Д.О., Кабанова И.Н., Петровский В.К., Метелица В.И., Кокурина Е.В. Воспалительная активность и снижение в плазме белков при неспецифических воспалительных заболеваниях. Фармацевтическая. Токсикология. 1988; (4): 15-7.

20. Сидоркина А.Н, Сидоркин В.Г., Преснякова М.В. Биохимические основы системы гемостаза и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови. Н.Новгород: ННИИТО. 2003. 100 с.

21. Antal-Szalmas Р, Poppelier MJ, Broekhuizen R, Verhoef J, van Strijp JA, van Kessel KP. Diverging pathways for lipopolysaccharide and CD 14 in human monocytes. Cytometry. 2000; 41(4): 279-88.

22. Angus D.C., Wax R.C. Epidemiology of sepsis: an update. Crit. Care. Med. 2001; 29: 109-116.

23. Bachetti T, Pasini E, Suzuki H, Ferrari RSpccies-specific modulation of the nitric oxide pathway after acute experimentally induced endotoxemia. Crit Care Med. 2003 May; 31(5): 1509-14.

24. Badr K.F., Murray J.J., Breyer M.D. et al. Mesangial cell, glomerular and renal vascular responses to endothelin in the rat kidney. J. Clin. Invest. 1989; 83: 336-342.

25. Beno W.A. and Kimura R.H. Nonstressed rat model of acute endotoxemia. Am. Physiol. J. 19r 9; 276 (45): 671-678.

26. Bernard Catherine; Regine Merval; Bruno Esposito; Alain Tedgui. Resistance to Endotoxin Shock in Spontaneously Hypertensive Rats. Hypertension. 1998; 31: 1350-13.^6.

27. Bhagat K., Collier J. et al. Lo.ul Venous Responses to Endotoxin in Humans. Circulation. 1996; 94: 490-497.

28. Bone R.C. The pathogenesis of sepsis. Ann. Intern. Med. 1991; 115: 457469.

29. Brand K., Fowler B.J., Edgingion T.S. et al. Tissue factor mRNA in THP-1 monocytic cells is regulated at both transcriptional and posttranscriptional levels in response to LPS. Mol. Cell Biol. 1991; 11: 4732-4738.

30. Brandtzaeg P, Bjerre A, Ovste^o R, Brusletto B, Joo GB, luerulf P. Neisseria meningitidis lipopolysaccharides in human pathology. J Endotoxin Res. 2001; 7(6): 401-2n.

31. Brown AR, Fishman M. Tumor necrosis factor-alpha analyzed within individual macrophages by ombined immunocytochemlslry and computer-aided image analysis. Cell Immunol. 1990 Oct 15; 1Л 0(2): 35263.

32. Bruneteau M, Minka S. Lipopoly iccharides of bacterial path о n ens from the genus Yersinia: a mini-revie . Biochemist. 2003 Jan; 85 (1-2): 14552.

33. Burrell R. Human responses to i acterial endotoxin. Circ Shock. 1994; 43(3): 137-53.

34. Campbell M-A. and Sefton B.l\f. Protein tyrosine phosphorylation is indused in murine В lymphocytes in response to stimulation with antiimmunoglobulin. EMBO J. 1990; 9: 2125-2131.

35. Campisi J., Leem Т.Е., Fleshner M. Stress-induced extracellular Hsp72 is a functionally significant danger: Ignal to the immune system. Cell Stress & Chaperones. 2003; 8: 272-286.

36. Chaby R., Strategies for the control of LPS-mediated pathophysiological disorders. Drug Discov Today. 1 °09; 4(5): 209-221.

37. Chan EL, Murphy JT. React!' oxygen species mediate rudotoxin-induced human dermal endothelial NF-kappaB activation. J Surg Res. 2003 May 1; 111(1): 120-6.

38. Chen D., Pan J., Du В., Sun D. I .duction of the heat shock i ponse in vivo inhibits NF-kappaB acti iy and protects murine H/er from endotoxemia-induced injury. J С in Immunol. 2005; 25(5): 452 61.

39. Chen T-Y, Bright S.W., Pace et al., Induction of macrophage -mediated tumor cytotoxicity by :; hamster monoclonal anti >dy with specifity for LPS-receptor. J. Im: mol. 1990; 113: 8-12.

40. Cristian L, Lear JD, DeGrado \ Determination of membn.ne protein stability via thermodynamic с ipling of folding to thirl-disulfide interchange. Protein Sci. 2002; 1 ,•;): 1732-40.

41. Crist P. Career transition from cl ,eian to academician: respon Abilities and reflections Am J Occup The, 1999; 53(1): 14-9.

42. Dal Nogare. Septic shock. Am J ' Vd Sci. 1991; 302(1): 50-6:', lleview.

43. Diks SH, van Deventer SJ, V ppelenbosch MP. Lipopol v.saccharide recognition, internalisation, si ailing and other cellular effects. J Endotoxin Res. 2001; 7(5): 335-'' .

44. Diks SH, van Deventer SJ, Г ppelenbosch MP. Lipopol у saccharide recognition, internalisation, si' 11 ling and other cellular cffects. J Endotoxin Res. 2001; 7(5): 335- :.

45. Dillmann WH, Mestril R. Heat ock proteins in myocardial stress. J. Cardiol. 1995; 84(4): 87-90.

46. Ding XZ, Fernandez-Prada С ! , Bhattacharjee A.K, 1! over D.L. Over-expression of hsp-70 ihibits bacterial lipopol; accharide production of cytokines in h ,an monocyte-derived m:: rophages. Cytokine. 2001; 16(6): 210-219.

47. Esmon CT. Role of coagulali inhibitors in inflammati i. Thromb Haemost. 2001; 86(1): 51-6. Re\' \v.

48. Feinstein D.L, Reis D.J, Regun: , an. Ingibition of astroglial , лпс oxide synthase type 2 expression by i uzoxan. J. Molecular. Pharmacology, 2001;55:304-308.

49. Feinstein DL, Galea E, Aquino XA. Heat shock protein 70 uppresses astroglial-inducible nitric oxide . thase expression by decrc !ng NFJB activation. J Biol Chem. 1996; 27 : 17724 -17732.

50. Fenton MJ, Golenbock DT. ! S-binding proteins and r ceptors. J Leukoc Biol. 1998; 64(1): 25-32.

51. Fiuza C, Suffredini AF. Human ,iodels of innate immunit; : local and systemic Fleming I, Grey G.A , Schott C. el al. Inducible but not constitutive production of nitric xidc by vascular smooth m scle cells. Eur. J. Pharmacol. 2001; 20: 37>3''6.

52. Galanos С, Luderitz 0, Rietsclicl ET, Westphal 0, Brade II, Brade L, Freudenberg M, Schade U, Imc i M, Yoshimura H, et al. Synthetic and natural Escherichia coli free lipid Л express identical endotoxic activities Eur J Biochem. 1985; 148(1): 1-5.

53. Gangloff SC, Hijiya N, Hazoi Л, Goyert SM. Lipopol у saccharide structure influences the macrop! <ic response via CD14-independent and CD 14-dependent pathways. Clin InfcctDis. 1999; 28(3): 491-6.

54. Gerard C. Complement C5a in the Sepsis Syndrome — Too Much of a Good Thing? Clinical implica1! ns of basic research N. Engl J Med. 2003; 348: 2.

55. Grinnel BW, Joyce D. Recoaibi.iant human activated protein С: A system modulator function for treatment of severe sepsis. Grit. Care. Med. 2001; 29 (7): 53-61.

56. Guidon PT Jr, Hightower LE. The 73 kilodalton heat shock cognate protein purified from rat brain coniiins nonesteriiied palmitic and stearic acids. J Cell Physiol. 1986; 12,S'2 : 239-45.

57. Guzhova IV, Kislyakova KA, Г ,'^skalinova (X. l iidlanskaya II, Tytell M, Cheetham M, Margulis BA. vitro studies .,how that Hsp70 can be released by glia and that exoy :s Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res. 2001; 914: o6-73.

58. Haas I.G., Meo T. cDNA clone1" of the imnvn м-lobulin heavy chain binding protein. Proc. Natl. Ac." ci. USA. 19o. ; 85: 2250.

59. Hauser GJ, Dayao EK, Wasse:! ,, i\, et al. HS'} 'ncluction inl.ibits iNOS mRNA expression and attenn;. . i hypotension in endotoxin-challenged rats. Am J Physiol. 1996; 271:: -2535.

60. Held HD, Uhlig S. Median! of endoto pulmonary vascular hyperreactу in mice. Ani 2000 Oct; 162(4 Pt 1): 1547-52

61. Henderson В., Poole S., Wilso: \!. Bacterial m virulence factors which causc !. tissue patho! synthesis. Microbiol. Rev. 19^6; J: 316-341.

62. Hinshaw, L.B. Pathophysiology of endotoxin ac Nowotny, J. J. Spitzer, and E. .' ' jgler (ed.), ! Cellular and molecular aspect, endotoxin i\ 1990; 1:419-426.

63. Hitchcock P.J., Leive L., M. •': H. et al. I.: present and future. J. Bacterid. 6; 166: 699

64. Hoffmann H., Siebeck M., lag! M. et ; hirudin, a specific inhibitor )f thrombin, intravascular coagulation and :.'•" lung injury ' Dis. 1990; 142: 782-788.

65. Hotchkiss R, Nunnally I, Li: ot S, Taulic Hyperthermia protects mice a;\ii i the lethal c! Physiol. 1993; 265(6 Pt 2): M .

66. Perdrizct G, Karl I. ts of endotoxin. Am Jill MJ, Andrew SM, >d mononuclear cells.of a selective PAF linated i intravascular

67. Biphasic changes in idotoxen^a. Am. J.

68. Icnk JG Bilo, Felix a!., Glucose-insulinpotassium infusion in sepsis and septic shock: no hard evidence yet. Crit Care. 2003; 7(1): 13-15.

69. Jakobovits A, Sharon N, Zan-Bar I. Acquisition of mitogenic responsiveness by nonresponding lymphocytes upon insertion of appropriate membrane components J Exp Med. 1982 Oct 1;156(4):1274-9.

70. Jesmok G, Lindsey C, Duerr M, Fournel M, Emerson T Jr. Efficacy of monoclonal antibody against human recombinant tumor necrosis factor in E. coli-challenged swine. Am J Pathol. 1992 Nov; 141(5): 1197-207.

71. Johnson JD, Fleshner M. Releasing signals, secretory pathways, and immune function of endogenous extracellular heat shock protein 72. J Leukoc Biol. 2006; 79(3): 425-34.

72. Julou-Schaeffer G., Gray G.A., Fleming I. et al. Loss of vascular responsiveness indused by endotoxin involves L-arginine pathway. Am. J.Physiol. 1990; 259: 1038-1043.

73. Karima R, Matsumoto S, Higashi H, Matsushima K. The molecularpathogenesis of endogenous shock and organ failure. Mol Med Today. 1999; 5(3): 123-32.

74. Kaufmann S.H., Vath U., Thole J.E. et al. Enumeration of T cells reactive with Mycobacterium tuberculosis organisms and specific for the recombinant mycobacterial 65-kDa protein. Eur. J. Immunol. 1987; 17: 351.

75. Kaufmann S.H.E. Heat shock proteins and the immune response. Immunol. Today. 1990; 11: 129.

76. Kennedy MN, Mullen GED, Leifer CA, Lee CW, Mazzoni A, Dileepan KN, and Segal DM. A Complex of Soluble MD-2 and1.popolysaccharide Serves as an Activating Ligand for Toll-like Receptor 4. JBC Papers in Press. 2004; 10: 1074.

77. Kimoto M, Nagasawa K, Miyake K. Role of TLR4/MD-2 and RP105/MD-1 in innate recognition of lipopolysaccharide. Scand J Infect Dis. 2003; 35(9): 568-72.

78. Kitchens RL, Thompson PA. Modulatory effects of sCD14 and LBP on LPS-host cell interactions. J Endotoxin Res. 2005; 11(4): 225-9.

79. Klabunde Richard E. Species in Septic Shock. Associate Professor of Physiology OUTCOM. 2002; 179(6): 1419-27.

80. Klosterhalfen B, Horstmann-Jugemann K., Vogel P. et al. Time course of inflammatory mediators during recurrent endotoxemia. Biochem. Pharmacol., 1992; 43(10): 2103-9.

81. Koh Y., Lim C., kim M., Shim Т., Lee S., Kim W., Kim D., Kim W.D. Heat shock response decreased endotoxin-induced acute lung injury in rats. Respirology. 1999; 4(4): 325-330.

82. Kondakova AN, Fudala R, Senchenkova SN, Shashkov AS, Knirel YA, Kaca W. Structural and serological studies of the O-antigen of Proteus mirabilis 0-9. Carbohydr Res. 2003 May 23; 338(11): 1191-6.

83. Kono Hiroshi, Hideki Fujii, Masami Asakawa, Masayuki Yamamoto, Masanori Matsuda, Akira Maki, and Yoshiro Matsumoto. Protective Effects of Medium-Chain Triglycerides on the Liver and Gut in Rats Administered Endotoxin Ann Surg. 2003; 237(2): 246-255.

84. Kotanidou A., Choi A.M., Winchurch RA, Otterbein L, Fessler HE. Urethan anesthesia protects rats against lethal endotoxemia and reduces TNF-alpha release. J Appl Physiol. 1996 Nov; 81(5): 2305-11.

85. Krauss H. Clinical aspects and prevention of Q fever in animals. Eur J Epidemiol. 1989; 5(4): 454-5.

86. Kuhn H.-M., Meier-Dieter U., Meier H. ECA, the enterobacterial common antigen. FEMS Microbiol. Rev. 1988; 3: 195-222.

87. Kumor LW, Olkowski AA, Gomis SM, Allan В J. Cellulitis in broiler chickens: epidemiological trends, meat hygiene, and possible human health implications. Avian Dis. 1998 Apr-Jun; 42(2): 285-91.

88. Lane T.A., Lamkin G.E., Wancewicz E.V. Protein kinase С ingibitors block the enhanced expression of intercellular adhesion molecule-1 on endothelial cells activated by interleukin-1, LPS and TNF-a. Biochem.Biophys. Res. Common. 1990; 172: 1273-1281.

89. Lappas GD, Karl IE, Hotchkiss RS. Effect of ethanol and sodium arsenite on HSP-72 formation and on survival in a murine endotoxin model. Shock. 1994; 2(1): 34-9.

90. Lau SS, Griffin TM, Mestril R. Protection against endotoxemia by HSP70 in rodent cardiomyocytes. Am J Physiol. 2000; 278: 1439-1445.

91. Laubach V.E., Foley P.L., Shockey K.S. et al Protective roles of nitric oxide and testosterone in endotoxemia: evidence from NOS-2-deficient mice. Am. J. Physiol. 1998; 275(44): 2211-2218.

92. Lei MG, Morrison DC. Differential expression of caveolin-1 in lipopolysaccharide-activated murine macrophages. Infect Immun. 2000 Sep; 68(9): 5084-9.

93. Li G.C. Heat shock proteins: role in thermotolerance, drug resistance, and relationship to DNA topoisomerases. Nat. Cancer Inst. Monogr. 1987;4:99-103.

94. Lin HC, Wan FJ, Kang BH, Wu CC, Tseng С J Systemic administration of lipopolysaccharide induces release of nitric oxide and glutamate and c-fos expression in the nucleus tractus solitarii of rats. Hypertension. 1999; 33(5): 1218-24.

95. Lindquist S. The heat-shock response. Ann. Rev. Biochem. 1986; 55:

96. Lush C.W, Cepinskas G, Kvietys P.R. LPS tolerance in human endothelial cells: reduced PMN adhesion, E-selectin expression, and NF-kB mobilization. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000; 287: 853861.

97. Macarthur H, Westfall T.C. Riley D.P. et al. Inactivation of catecholamines by superoxide gives new insights on the pathogenesis of septic shock. PNAS. 2000; 97(17): 9753-9758.

98. Marshall J.C. Inflammation, coagulopathy, and the pathogenesis of multiple organ dysfunction syndrome. Crit. Care Med. 2001; 29 (7): 99106.

99. Martin G.S, Mannino D.M, Eaton S, and Moss M. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N. Engl. J. Med. 2003; 348: 1546-1554.

100. Mastronardi C.A, Yu W.H., Srivastava V.K. et al. LPS-indused leptin release is neurally controlled. PNAS. 2001; 98(5): 14720-14725.

101. Mayeux PR. Pathobiology of lipopolysaccharide. J Toxicol Environ Health. 1997; 51(5): 415-35.

102. McKenna T.M. Prolonged exposure of rat aorta to low levels of endotoxin in vitro results in impaired contractility. Association with vascular cytokine release. J. Clin. Invest. 1990; 86: 160-168.

103. McMillan J. Competence to Consent, by Becky Cox White. Theor MedBioeth. 1998; 19(2): 161-6.

104. Meldrum DR, Meng X, Shames BD, Pomerantz B, Donnahoo KK, Banerjee A, Harken AN. Liposomal delivery of heat-shock protein 72into the heart prevents endotoxin-induced myocardial contractile dysfunction. Surgery. 1999; 126: 135-141.

105. Miyake K. Endotoxin recognition molecules MD-2 and toll-like receptor 4 as potential targets for therapeutic intervention of endotoxin shock. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2004; 3(3): 291-7.

106. Mohri M., Spriggs .R., Kufe D. Effects of LPS on phospholipase a2 activity and TNF-a expression in HL-60 cells. J. Immunol. 1990; 144: 2678-2682.

107. Mokrushin AA, Tokarev AV. Endogenous regulators of long-term potentiation and depression in rat olfactory cortex slices. Neurosci Behav Physiol. 1997 May-Jun; 27(3): 229-33.

108. Morimoto Y, Hayashi E, Ohno T, Kawata A, Horikoshi Y, Kanzaki H. Quality control of human IVF/ICSI program using endotoxin measurement and sperm survival test. Hum Cell. 1997; 10(4): 271-6.

109. Mullarkey M, Rose JR, Bristol J, Kawata T, Kimura A, Kobayashi S. Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 304(3): 1093-102.

110. Mulleneisen NK Management of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 1993 Apr 8; 328(14): 1017-22.

111. Murray DR, Freeman GL. Tumor necrosis factor-alpha induces a biphasic effect on myocardial contractility in conscious dogs. Circ Res 1996 Jan; 78(1): 154-60.

112. Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 1986; 74(5): 1124-36.

113. Nadin L, Butler AM, Farrell GC, Murray M. Pretranslational down-regulation of cytochromes P450 2C11 and 3A2 in male rat liver by tumor necrosis factor alpha. Gastroenterology. 1995; 109(1): 198-205.

114. Nasraway SA. The problems and challenges of immunotherapy in sepsis. Chest. 2003 May; 123(5 Suppl): 451-9. Review.

115. Negulyaev YA, Vedernikova EA, Kinev AV, Voronin AP. Exogenous heat shock protein hsp70 activates potassium channels in U937 cells. Biochim Biophys Acta. 1996; 1282(1): 156-62.

116. Norimatsu M. and Morrison DC. Correlation of antibiotic-induced endotoxin release and cytokine production in Escherichia coli-inoculated mouse whole blood ex vivo. J Infect Dis. 1998; 177(5): 1302-7.

117. Nowak TS, JrOsborne, OCSuga S. Stress protein and proto-oncogene expression as indicators of neuronal pathophysiology after ischemia. Prog Brain Res. 1993; 96: 195-208.

118. O'Leary, Koll MFerguson, CNCoakley, JHHinds, CJPreedy, VRGarlick PJ. Liver albumin synthesis in sepsis in the rat: influence of parenteral nutrition, glutamine and growth hormone. Clin Sci. 2003; 105(6): 691-8.

119. Olson N.C., Joyce P.B., Fleisher I.N. Role of platelet-activating factor and eicosanoids during endotoxin-induced lung injuri in pigs. Am. J. Physiol. 1990; 258: 1674-1686.

120. Paidas CN, Mooney ML, Nicholas GT, De Maio A. Accelerated recovery after endotoxic challenge in heat shock-pretreated mice. Am J Physiol. 2002; 282: 1374-1381.

121. Palsson-McDermott EM, O'Neill LA. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology. 2004; 113(2): 153-62.

122. Polla B.S. A role for heat shock proteins in inflammation? Immunol. Today. 1988; 9: 134.

123. Polla BS, Cossarizza A. Stress proteins in inflammation EXS. 1996; 77: 375-91.

124. Qureshi N, Honovich JP, Нага H, Cotter RJ, Takayama K. Location of fatty acids in lipid A obtained from lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 17023. J Biol Chem. 1988; 263(12): 5502-4.

125. Ramadori G, Meyer zum Buschenfelde KH, Tobias PS, Mathison JC, Ulevitch RJ. Biosynthesis of lipopolysaccharide-binding protein in rabbit hepatocytes. Pathobiology. 1990; 58 (2): 89-94.

126. Rees D.D., Cellex S., Palmer R.M. et al. Dexamethasone prevents the induction by endotoxin of a nitric oxide synthase and the associated effects on vascular tone: an insight into endotoxin shock. Biochem. Byophys. Res. Commun. 1990; 173: 541-547.

127. Riedemann N.C., Guo R.F., Ward P.A. The enigma of sepsis. J. Clin. Invest. 2003; 112(4): 460-467.

128. Rietschel ET, Kirikae T, Schade FU, Mamat U, Schmidt G, Loppnow H, Ulmer AJ, Zahringer U, Seydel U, Di Padova F, et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB J. 1994; 8(2): 217-25.

129. Rigato 0, Silva E, Kallas EG, Brunialti MK, Martins PS, Salomao R. Pathogenetic aspects of sepsis and possible targets for adjunctive therapy Curr. Drug. Targets. Immune Endocr Metabol Disord. 2001; 1(1): 13-30.

130. Rooney J.V., Emery D.W., Sibley C.H. Slow response variant of the В lymphoma 707/3 defective in in LPS activation of NF-kB. Immunogenetics. 1990; 31: 65-78.

131. Sandset PM, Warn-Cramer В J, Maki SL, Rapaport SI. Immunodepletion of extrinsic pathway inhibitor sensitizes rabbits to endotoxin-induced intravascular coagulation and the generalized Shwartzman reaction. Blood. 1991; 78(6): 1496-502.

132. Schmidt J.A., Abdulla E. Down regulation of IL-1 beta biosynthesis by inducers of the heat-shock response. J. Immunol. 1988; 141: 2027.

133. Shankavaram UT, DeWitt DL, Wahl LM. Lipopolysaccharide induction of monocyte matrix metalloproteinases is regulated by the tyrosine phosphorylation of cytosolic phospholipase A2. J Leukoc Biol. 1998; 64(2): 221-7.

134. Shi Y, Tu Z, Tang D, Zhang H, Liu M, Wang K, Calderwood SK, Xiao X. The inhibition of LPS-induced production of inflammatorycytokines by HSP70 involves inactivation of the NF-kappaB pathway but not the МАРК pathways. Shock. 2006; 26(3): 277-284.

135. Silva MF, Silva CL. The role of somatic structure of the fungus Paracoccidioides brasiliensis upon В cell activation in experimental paracoccidioidomycosis. Clin Exp Immunol. 1995; 101(2): 321-7.

136. Suffredini AF, Fantuzzi G, Badolato R, Oppenheim JJ, O'Grady NP. New insights into the biology of the acute phase response. J Clin Immunol. 1999; 19(4): 203-14.

137. Suganuma T, Irie K, Fujii E, Yoshioka T, Muraki T. Effect of heat stress on lipopolysaccharide-induced vascular permeability change in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002; 303(2): 656-63.

138. Sun D, Chen D, Du B, Pan J. Heat shock response inhibits NF-kappaB activation and cytokine production in murine Kupffer cells. J Surg. Res. 2005; 129(1): 114-21.

139. Szabo C. Alterations in nitric oxide production in various forms of circulatory shock. New horiz. 1995; 3(1): 2-32.

140. Takada H, Kotani S. Structural requirements of lipid A for endotoxicity and other biological activities. Crit Rev Microbiol. 1989; 16(6): 477-523.

141. Takeuchi O, Hoshino K, Kawai T, Sanjo H, Takada H, Ogawa T, Takeda K, Akira S. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components. Immunity. 1999; 11(4): 443-51.

142. Triantafilou M, Triantafilou K. Sepsis: molecular mechanisms underlying lipopolysaccharide recognition. Molecular Medicine. 2004; 6: 1-18.

143. Tsan MF, Gao B. Cytokine function of heat shock proteins. Am. J Physiol Cell Physiol. 2004; 286(4): 739-44.

144. Ulevitch RJ, Tobias PS Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Curr Opin Immunol. 1999; 11(1): 19-22.

145. Ulmer A.J., Rietschel E.Th., Zahringer U., Heine H. Lipopolysaccharide: Structure, Bioactivity, Receptors, and Signal Transduction. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 2002; V.14; № 76: 53-68

146. Van Amersfoort E.S., Van Berkel T.J.C., and Kuiper J. Receptors, Mediators, and Mechanisms Involved in Bacterial Sepsis and Septic Shock. Clin Micr Rewviews. 2003; 3: 379-414.

147. Van der Horst 1С, Ligtenberg JJ, Bilo HJ, Zijlstra F, Gans RO. Glucose-insulin-potassium infusion in sepsis and septic shock: no hard evidence yet. Crit Care. 2003; 7(1): 13-5.

148. Van der Poll, Susette M. Coyle, Karen Barbosa, Carla C. Braxton and Stephen F. Lowry. Epinephrine inhibits Tumor Necrosis Factor-a and Potentiates Interleukin 10 production during human endotoxemia. J.Clin Invest. 1999; 97(3): 713-719.

149. Van Eden W. and Young, D. Heat shock protein 60 and the regulation of autoimmunity. Stress Proteins in Medicine 1996; 14: 93-102.

150. Vandbuskirk A., Crump B.L., Margolash E., Pierce S.K A peptide binding protein having a role in antigen presentation is a member of the HSP70 heat shock family. J. Exp. Med. 1989; 170: 1799.

151. Vega VL, De Maio A. Geldanamycin treatment ameliorates the response to LPS in murine macrophages by decreasing CD 14 surface expression. Mol Biol Cell. 2003; 14: 764-773.

152. Visintin A, Iliev DB, Monks BG, Halmen KA, Golenbock DT. MD-2. Immunobiology. 2006; 211(6-8): 437-47.

153. Vissers YL, von Meyenfeldt MF, Braulio VB, Luiking YC, Deutz NE. Measuring whole-body actin/myosin protein breakdown in mice using a primed constant stable isotope-infusion protocol. Clin Sci. 2003; 104(6): 585-90.

154. Wallin R.P., Lundqvist A., More S.H., Von Bonin A., Kiessling R., Ljunggren H.G. Heat-shock proteins as activators of the immune system. Trends Immunol. 2002; 23(3): 130-135.

155. Walsh RC, Koukoulas I, Garnham A, Moseley PL, Hargreaves M, Febbraio MA. Exercise increases serum Hsp72 in humans. Cell Stress Chaperones. 2001; 6: 386-393.

156. Weinstein S.L., Gold M.R., De Franko A.L. Bacterial LPS stimulated protein tyrosine phosphorylation in macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990; 88:4148-4152.

157. Welch W.J., Mizzen L.A., Arrigo A.P. Stress-induced proteins. USLA Symposia Mol. Cell. Biol. 1989; 96: 187.

158. Winfield J., Jarjour W. Do stress proteins play a role in arthritis and autoimmunity? Immunological reviews. 1991; 121: 193-220.

159. Wong HR, Ryan M, Wispe JR. The heat shock response inhibits inducible nitric oxide synthase gene expression by blocking Ik-Bdegradation and NF-kB nuclear translocation. Biochem Biophys Res Commun. 1997; 231:257-263.

160. Wy CA, Goto M, Young RI, Myers TF, Muraskas J. Prophylactic treatment of endotoxic shock with monophosphoryl lipid A in newborn rats. Biol Neonate. 2000 Mar; 77(3): 191-5.

161. Xigris // Data on www.lilly.com. 2002

162. Young R.A. Stress proteins and immunology. Ann. Rev. Immunol. 1990; 8: 401.

Информация о работе

Кустанова, Гульсара Амангалиевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.13

Диссертация

Влияние белка теплового шока 70 КДА и липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние белка теплового шока 70 КДА и липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на физиологические эффекты эндотоксинов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы