Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение поверхностных характеристик мембраны эритроцитов при встраивании липополисахаридов грамотрицательных бактерий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменение поверхностных характеристик мембраны эритроцитов при встраивании липополисахаридов грамотрицательных бактерий"

На правей рукописи

Кабанов Дмжтрий Серткап

ИЗМЕНЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ВСТРАИВАНИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЪНЫХ БАКТЕРИЙ

03.00.04 - бвохнют

А1торефер«т

жидсмшцуяииМяи кмщндата бкмогичсоснх наук

Пущнио - 2006

Работа выполнена в Институт« фундаментальных проблем биологии РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Прохоренко Изабелла Рувимовна

Официальны« оппоненты:

доктор биологических наук Малый Александр Нерсесович

кандидат биологических наук Агафонов Алексей Бапентиновнч

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН

Зашита диссертации состоятся "21" декабря 2006 года » 11м на заседании диссертационного совета Д 002.066.0] при Институте фундаментальных проблем бвологии РАН

по адресу: 142290, Московская область, г. Пушшо, ул. Институтская, д. 2, ИФПБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН (г. Пушнно Московской обл., ул. Илститутская, 2).

Автореферат разослан " ¿"ОЛ^Ъ^ 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Назарова ГЛ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Взаимодействие липополисахаридов (ЛПС, эндотоксинов) грамотрицательных бактерий с клетками млекопитающих приводит к, синтезу биологически активных соединений, избыточное высвобождение которых . является причиной эндотоксинового шока. Статистические данные свидетельствуют о том, что экдотокскиовый шох занимает 13 место в списке наиболее частых причин смертности людей. Высокий уровень смертности и развитие тяжелых осложнений при эндотоксиновом шоке связаны с отсутствием специфической терапии. Одним из перспективных направлений предупреждения эндотоксинового шока является применение ЛПС из Rhodobacter capsulatus FG (ЛПСла.еф,.), который способен блокировать сайты связывания эядотокснчески активных молекул ЛПС на поверхности мембраны клеток-мишеней, и тем самым проявлять антагонистическое действие.

Эритроциты представляют преобладающую популяцию клеток крови и, в первую очередь, подвергаются действию эндотоксинов в кровотоке. Вовлечение клеток крови, особенно эритроцитов, в процессы, связанные с патологией кровеносной системы, обусловлено влиянием ЛПС на морфологию и эластичность мембраны, а также на заряд поверхности этих клеток. В процессе жизнедеятельности клетки, а также при различных патологических состояниях мембрана эритроцитов претерпевает биохимические изменения (Рязанцева с соавт., 2003; Piagnerelli, 2003: Стеновая с соавт., 2004; Рязанцева с со авт., 2004), способные оказывать влияние на взаимодействие с ЛПС. В кровеносном русле эритроциты с встроенными в мембрану молекулами ЛПС способны взаимодействовать с нейтрофилами, приводя к их активации {Troelstra et al., 1999). Очевидно, что события, развивающиеся на поверхности мембраны клеток крови после взаимодействия с эндотоксинами, определяются составом и физико-химическими свойствами встроившихся молекул ЛПС.

ЛПС грамотрицательных бактерий различаются количеством остатков 2-кето-З-дезокси-Ц-манно-октулозоновой кислоты (КДО) и остатков фосфорной кислоты (Barclay et al., 1987; Ohno et al., 1989; MUller-Loennies et al., 2003), a также по катонному составу (Coughlin et al., 1983; 1983a), что отражается на общем заряде каждого ЛПС. Кроме того, ЛПС обладают разной длиной кора и полисахаридного фрагмента (Barclay et al., 1987; Ohno et al., 19S9). Способность эндотоксинов взаимодействовать с поверхностью клеток и вызывать большинство биологических ответов, связана с гидрофобной частью ЛПС -липндом А. Лнпиды А агоннсгических и антагонистических ЛПС различаются химическим составом и конформациеЯ молекул (Krauss 'et al., 1989; Brandenburg et al., 1993; Rielschel, 1994; Schromm et al., 2000). Влияние агонистических форм ЛПС на заряд поверхности эритроцитов описано в некоторых работах (Мирошников с соавт., 1986), тогда как данных об

эффекте антагонистических форм ЛПС в литературе нет. В связи с тем значением, которое играют эти формы ЛПС в новых лекарственных препаратах против эндотоксемин, представлялось актуальным и обоснованным сравнительное изучение влияния состава антагонистических и агонистических форы ЛПС на поверхностные свойства мембраны эритроцитов при ее взаимодействии с ЛПС.

В связи с вышесказанным, была сформулирована цель настоящего исследования. Цель и задачи исследования. Изучить изменение поверхностных характеристик мембраны эритроцитов человека после взаимодействия клеток с эндотоксинами разного состава.

Для достижения пели были поставлены следующие задачи:

1. Определить способвосгь различных до составу ЛПС го Rhodobacter capsulatum и Escherichia coli к встраиванию в мембраны эритроцитов человека.

2. Сравнить влияние встраивания ЛПС Rhodobacter сapsulatus и ЛПС Escherichia coli на электр офоретическую подвижность эритроцитов.

3. Изучить роль гидрофильного фрагмента ЛПС, встроившихся в мембрану эритроцитов, в изменении электроповерхностных характеристик клеток.

4. Оценить роль заряда и поверхностных белков мембраны эритроцитов на встраивание эндотоксина из Escherichia coli.

5. Выявить способность катнонных антибиотиков взаимодействовать с ЛПСиюч«., встроенными в мембрану эритроцитов.

Научная новизна н »тактическая значимость, В настоящей работе впервые С помощью методов конфокальной лазерной микроскопии и спекгрофотометрин показана способность ЛПСщсдо, к встраиванию в мембраны эритроцитов человека.

Впервые установлено, что в отличие от токсического высокоактивного S-ЛПС Escherichta coli (ЛПОе.^) насыщение мембраны исследуемых клеток ЛПСяьодо практически не влияет на заряд ее поверхности. Практическая значимость полученного результата заключается в том, что взаимодействие ЛПСи.^ с эритроцитами при его введении в кровоток не вызовет агрегацию клеток.

В экспериментах in vitro впервые обнаружено, что катнонный антибиотик полимнксин В взаимодействует с ЛПСц^.в^ встроенным в мембрану эритроцитов, вызывая высвобождение внутриклеточного гемоглобина. Полученные результаты имеют важное практическое значение в рекомендациях совместного применения антагонистов эндотоксинов и катвонных антибиотиков при лечении грамотридательного сепсиса.

Основные положения, выносимые ия защиту:

1. Степень насыщения мембран эритроцитов лткшояисахаридами из Rhödobacter capsulatum и Escherichia coli зависит от состава их лигшдов А.

2. Изменение поверхностных свойств эритроцитов зависит от длины коровой н полисахариддой составляющих ЛПС, встроившихся в мембрану клетки.

3. Белки поверхности мембраны являются определяющими факторами взаимодействия эритроцитов с эндотоксинами и их последующего встраивания.

4. Катяонный антибиотик - долим иксия В взаимодействует с ЛПСд,^», встроенным в мембраны эритроцитов, и вызывает частичное высвобождение внутриклеточного гемоглобина.

Адробаоия работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены и обсуждены на: научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000); VU Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003); XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биология я биотехнологии» (Москва, 2004); Третьем Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004); VHI международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пулшно, 2004); Ш конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); I международной конференции «Молекулярная медицина к бнобезопасносгь» (Москва, 2004); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); «The 2004 Younger European Chemists* Conference» (Italy, 2004); IX международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005); «International Sarcoma Meeting Stuttgart» (Germany, 2005),

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 1S печатных работ.

Объем и структура диссертация.

Диссертационная работа изложена на *Рстраницах машинописного текста, содержит таблиц и рисунков и состоит из разделов: введения, обзора

литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы 'ЛПС из непатогенной фототрофной бактерии Rhodobacter capsulatus PG (SR-структура), подученный в нашей лаборатории, а также коммерческие ЛПС фирмы "Sigma"sb E.coli 055:В5 (S-струстура ЛПС), E.coli EHIOO (Ra-) и E.coli J5 (Rc-) и флуоресцеин З-йзогиоцяанат-^еченный ЛПС E.coli 055:В5 (495/519) "Molccular Piobes", В

работе также использованы карбшдааннновый краситель "Sigma", полам иксии В "Fluka", трипсин из поджелудочной железы Быка (40 ед^г) "Serva", нейраминидаза из Clostridium perjríngens (4.7 ед/иг) "Sigma".

JlHCjrttopt получен методом экстракции фенолом по модифицированной методике Кулышша о со авт. (1987) и охарактеризован спектр офотометрически на возможное присутствие органических првмесей (Спирин, 1958; Bradford, 1976). SR-струотура ЛПС».^. установлена при сомощн электрофореза в ПЛАТ (Laemmli, 1970; Krauss et al., 1988; Tsai et al., 1982; Tan et al., 2002), а хемотин бактерий - агглютинацией в 4% NaCl (Lmdberg, 1980). Содержание КДО в ЛПС определяли спектрофотометрически по поглощению комплекса окисленной КДО н тнобарбитуровой кислоты при .длине волны 550нм (Osbom 1979).

Катионный состав исследуемых ЛПС определяли методом пламенной фотометрии на Flapho-4 фирмы "Carl Zeiss" (Германия) при суспендирован ии эндотоксинов в бидистиллированной воде (1мг/1мл).

Получение флуоресцентных форм эндотоксинов проводили инкубированием ЛПС с флуореспеином 5-изотяоцианатом в 0.1 М натрий-боратном буфере (рН 10.5) при температуре 37°С в темноте при постоянном перемешивании. Несвязанный флуорофор отделяли диализом против 0.15 М раствора хлорида нагрия. Полученные т.о. флуоресцентные формы ЛПС ляофилизировали.

Эритроциты получали яз венозной крови по стандартной методике без антикоагулянтов (1мл цельной крови; 9мл 0.9%NaCl).

Тени эритроцитов получали гипотоническим лизисом клеток в 0.0] 5М растворе хлорида натрия (Dodge et al,, 1963). Замыкание мембран происходило при выдерживании отмытых физиологическим раствором теней эритроцитов на водяной бане в ОЛн растворе КОН при 37*С в течение 40 мин (Bodemannet al„ 1972).

Встраивание эндотоксшюв проводили, инкубируя тени эритроцитов (5 * 106 теней/мл) с исследуемыми концентрациями ЛПС в эабуференном физиологическом растворе (ЗФР: 0.137 М NaCl, 1.5 мМ KHiPOj, 8.0 мМ NazHPO,», 3.0 мМ КС1; удельная электропроводность 5.6 х I0"1 См/м, рН 7.4) в течение 1 ч при 37'С. Насыщение мембран теней эритроцитов ЛПС определяли спектр офотометрически с помощью карбоциаиового красителя при длине волны 465 нм. Способность ЛПС встраиваться в модифицированные ферментами мембраны эритроцитов исследовала с помощью конфокальной лазерной микроскопии и проточной цитофлуоромстрии.

Электрофоретическую подвижность эритроцитов определяли по скорости перемещения клеток в электрическом поле с помощью микроскопа Paimoquant-2 фирмы "Cart Zeiss" (Германия) в ручном режиме (Шепяе с соавт., 1978). Встраивание ЛПС в

мембраны клеток проводили, как описано выше. В.каждой пробе измеряли перемещение 20 клеток при 20°С. Вычисляли среднее значение ЭФП, среднеарифметическую ошибку дня каждой пробы- Статистическую значимость результатов определяли при помощи t-критерня Стьюдента, Каждый эксперимент проводили в : день забора крови. Используемые концентрации эндотоксинов - 30 и 70 мкг/мл.

Обработку клеток трипсином проводили инкубированием нативных эритроцитов (5 * 10е клеток/мл) в буфере для трипсинолиза (0.2 М Na2HP04, 0.2 М NaHiPOjj рН 8.5) с концентрацией фермента 1 мг/мл в течение 1 ч при 37*С.

Удаление ситовых кислот эритроцитов осуществляли с помощью нейраминкдазы в концентрации 3.5 мкг/мл ЗФР в течение 15 мин инкубации клеток при 37*С.

Взаимодействие палимиксша В с ЛПСцьячя., встроенным в мембрану эритроцитов, определяли спектро фотометрически по поглощению высвобождающегося в супернатант гемоглобина (J.=540 нм).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнительная характеристика ЛПС из Rhodobader capsulatus PG и Escherichia coli

Важная роль катионного состава ЛПС в проявлении их свойств показана в работах Сейдела с соавт. (Seydel et al., 2000). Катионы, входящие в состав эндотоксинов, способны в целом влиять на заряд молекул ЛПС » тем самым на их взаимодействие с клетками. Катиоивый состав исследуемых ЛПС был охарактеризован методом пламенной фотометрии. Полученные данные (табл. 1) показывают, что в состав ЛПСдг,1ЧИ. входит большее количество ионов Саг+, тогда как ЛПСяюЯ - ионов Na+,

Таблица I. Содержание катионов в препаратах эндотоксинов

Проба Содержание катиона, мкг/мл

КГ ' NaT Са

ЛПСдьлпи, 2.194 2.379 13.624

ЛПСг:ы(055:В5 7.026 0.543

Контроль 0.2 0.2 0.0

Влияние катионов на компенсацию отрицательного заряда ЛПС показано в работе Коуглин (Сои^Ыш е1 а1., 1983). Учитывая его данные, а также результаты полученные нами, можно заключить, что общий Отрицательный заряд молекул ЛПСяьа^ ниже, чем молекул ЛПС^мл.

■ ■■. Известно, что ЛПС грамотриц отельных бактерий обладают разным количеством 2-кето-3-дезокси-О-манно-октуяоюновой кислоты (КДО) (Barclay et al., 1987; Ohno et al,, 1989; MQiler-Loennies et al, 2003). В состав КДО входит карбоксильная группа, обусловливающая отрицательный заряд молекулы. Таким образом, содержание КДО в ЛПС вносит вклад в суммарный заряд молекулы эндотоксина, который способен оказывать влияние на взаимодействие и последующее встраивание ЛПС. Содержание КДО в ЛПСдьв^ представлено в табл. 2.

Таблица 2. Количество КДО в ЛПСм

Проба Навеска, Объем, Ал» Количество КДО в навеске

мг мл MKT %

ЛПСль.ии 2 3.4 0,53 0.0025 1.15

Из литературных данных известно, что наивысшее содержание КДО в ЛПС Shigella dysenteriae Rc-хемопша составляет 2.72% (Chosh et al., 1999), что обусловлено содержанием 3-х остатков КДО в молекуле ЛПС. Сравнение полученных нами данных с литературными обнаруживает повышенное содержание КДО в препаратах ЛПС энтеробахтеркй, что говорит об их большей электроотршщгельности (Barclay et al., 1987; Weckesser et al.t 1983; Ohno et al., 1989, Mailer-Locnnies et al., 2003).

Использование метода электрофореза в ПЛАТ позволяет наиболее полно охарактеризовать полнсахаридный состав ЛПС. Электрофоретнческие профили исследуемых ЛПСздсдо и ЛЛС^«« представлены на рис 1. Наличие дискретных хорошо окрашенных серебром зон в высокомолекулярной области геля характеризует ЛПСг„/; как Б-структуру эндотоксина. Незначительное окрашивание геля в высокомолекулярной области электрофореграммы ЛПСж,.«^ выявляет меньшее количество структурных звеньев полисахарида в исследуемом ЛПС и обнаруживает его ЗЯ-структуру.

I 2

-40 кДа

-12,5 кД»

JPiï

.... ш

Рнс.1. Элекгрофоретические

профили ЛПСп,.«рт. (1) и ЛПС&6011 (2).

2. Исследование способности ЛПСш.<цн и ЛПСе«1/ к насыщению мембран эритроцитов человека

Целью данного раздела работы являлось сравнение способности ЛПСдь«^ и ЛПСг.„в к встраиванию в мембраны эритроцитов. В качестве модели цитоплазмзтической мембраны выбраны тени эритроцитов человека, поскольку фосфолипидный состав их мембран близок фосфолипидному составу мембран миелоидных клеток (моноцитов, макрофагов) - основных клеток-мишеней эндотоксинов (Черницкий, 1981; Кгбпег, 1981).

Содержание ЛПС№ир1 и ЛПСе„к, встроившихся в мембрану теней эритроцитов, определяли спектрально с использованием карбоцианииового красителя. Однако, из-за неспецифического взаимодействия

карбоцианина с белками и липндамн мембраны эритроцитов определить

эритроцитов количественное . содержание ЛПС в

< 0,в g 0,5 Е 0,4

S

| 0,2 I o.i

Ш

0 20 30 40 50 «0 70 80 »0

КешценЕряюш ЛПС в среде инкубирования, мкг/мл

Рис. 2. Насыщение мембран теней эритроцитов человека ЛПСе.ин (А) и ЛПСш,.^! (Б). Количество теней 5 * 106 в мл.

мембранах достаточно достоверно оказалось невозможным. В связи с этим, нами был определен порог насыщения мембран ■ эритроцитов исследуемыми эндотоксинами. Из графика зависимости спектра поглощения (X ■> 465 нм) встроенного в мембрану комплекса ЛПС-карбоцианин от

концентрации ЛПС в среде инкубации теней

видно, что порог насыщения для ЛПСгл>я вмше более чем в 2 раза по сравнению с ЛПС#*11ЦЦ. (рис. 2).

Значительная разница в порогах насыщения мембран указывает на более высокую способность липиза А ЛПСг.мд к встраиванию в фосфолнпндные мембраны эритроцитов в сравнении с липидом А ЛПСдьмр,, Объяснением этого являются как заряд молекул, так и химический состав исследуемых ЛПС. Лииид А ЛПСг.сой обладает повышенной, гндрофобностъю вследствие присутствия пяти Сц- н одной Си-жирных кислот (LQderitz et al., 1973; Galanos et al., 1977). Данный химический состав обусловливает сниженную подвижность жирных кислот липида А ЛПСе.иЛ и способствует встраиванию в более текучий фосфолилидный слой мембраны клетки (Черницкий, 1981). Ляпид А ЛПСм.с^ образован пятью менее длинными жирными кислотами, среди которых одна неиасыщениа (Krauss et al., 1989). Последняя обеспечивает высокую подвижность жирных кислот в липнде

А ЛПСRb.capt п, по-видимому, влияет на способность к встраиванию {Gutsmann et al., 20QCI). Кроме того, ненасыщенная связь в додекановой кислоте липида А ЛПСмшрх вызывает значительную деформацию углеводородной цепи, что может затруднять встраивание ЛПС в плотно упакованный бислой мембраны. Однако, обнаруженное нами в ЛПСю,«^ значительное содержание катионов Са'*, присутствие которого в препаратах ЛПС снижает подвижность жирных кислот липида А, возможно играет роль во взаимодействии и встраивании ЛПСм,.^ в мембраны теней эритроцитов (Van Alphen et al, 1980; Seydel et al., 2000).

Рис. 3. Конфокальная микроскопия теней эритроцитов человека после инкубации с меченными флуоресцеином ЛПС^т/л (а) и ЛПС£сад (в), б — фазовый контраст. Масштабная линейка - 10 мкм (а, 65, 20 мкм (в).

Дальнейшее подтверждение встраивания ЛПСе«л и ЛПСдг,«^ было получено с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии теней эритроцитов человека, инкубированных с эндотоксинами, меченными флуоресцеином (рис. 3).

Таким образом, ЛПОшозм. встраивается в мембраны теней эритроцитов человека, причем насыщение мембран эритроцитов ЛПСздедо наблюдается при концентрациях более низких, чем в случае ЛПС^^. Полученный результат объясняет использование более высоких доз антагониста по сравнению с агонистом для достижения защитных эффектов от токсического действия эндотоксина (Ьупп « а1,2004).

'3. Исследование влияния ЛПСк»^» и ЛПС&»н на заряд клеточной поверхности эритроцитов

Форменные элементы крови человека обладают отрицательным зарядом клеточной поверхности, который обеспечтает электростатическое отталкивание клеток и их физиологическое состояние в кровотоке (Маркосян с соавт., 1977; Козинец с соавт., 1986).

Фосфорилэтаноламнн и значительное содержание Саг+ в составе ЛПСльсдо снижают общий

ЭФП, мкм * с1» В * см

ЭФП, мкм • г1, в * см

-1,1* -1д« -\зл -и) .1,12 -им -м» эфп, ш .с1в'.«1

Рис. 4. Распределение значений ЭФП в измеряемых популяциях теней эритроцитов (А) н интактных клеток (Б).

отрицательный заряд молекулы, что при

встраивании ЛПС может влиять на

электроповерхностные свойства мембран клеток-мишеней.

Инкубация теней' эритроцитов с ЛПСлб.одо. при концентрации, близкой к пороуу насыщения мембраны, вызывала снижение ЭФП теней на 4%, тогда как инкубация с ЛПСеы! - на 11% в сравнении с контролем. Однако, значительная гетерогенность значений ЭФП в популяции контрольных теней эритроцитов (рис. 4А) существенно затрудняла интерпретацию результатов по изменению электроповерхностных свойств мембран после встраивания эндотоксинов. В связи с этим, исследования влияния ЛПСздсдо. н ЛПС^лп на эдектрофоретическую подвижность (ЭФП) клеток в дальнейшем проводили на интактных эритроцитах, значения ЭФП которых колеблются г более узком диапазоне (рис. 4Б),

На рис. 5 представлены значения ЭФП контрольных эритроцитов и эритроцитов после инкубации с исследуемыми ЛПС. Из рис. 5А видно, что контрольные клетки включают

-1,1* .1^4 .ц1 -1,31 -м* -1 -I ЭФП, нх.с.В.си

а

-1,1« -1,18 -ц« -1,12 -],н -1,4*

Л -1

мп. ш. е * в * «■ Рис. 5. Распределение значений ЭФП в популяции эритроцитов. А - контроль; Б — после встраивания ЛПСд&.вул; В — после встраивания ЛПС£лИ. Концентрация ЛПС в среде инкубации 30 мкт/мл, 1 ч, 37 С.

несколько популяций, различающихся по

значениям ЭФП. Это указывает на существование в контрольной пробе клеток, различающихся содержанием сиаловых кислот мембраны и изменением состояния белковых молекул. Из литературных данных известно, что данные изменение на мембране эритроцитов обусловлены возрастом клетки (Kay 1985; Hadengue et al., 1998). Инкубация эндотоксинов с эритроцитами вызывала увеличение гетерогенности значений ЭФП в популяции контрольных клеток как в случае с ЛПС^«^, так и с ЛПСи,.сацг, что связано с встраиванием исследуемых ЛПС в мембраны клеток (рис. 5). Наблюдаемая гетерогенность значений ЭФП внутри популяции клеток, инкубированных с разными ЛПС, предполагает встраивание различного количества ЛПС в мембраны эритроцитов. Причиной этого являются различия по биохимического состава плазматических мембран между эритроцитами (Васильева с соавт., 2001).

Данные до влиянию концентрации ЛПСмиф». и ЛПС&с« иа ЭФП эритроцитов суммированы в табл. 3.

Таблица 3. ЭФП контрольных эритроцитов и эритроцитов, обработанных ЛПС (1 ч, 37 С)

Эритроциты ЭФП, мкм • с"' * В'1 * см Относительное изменение ЭФП, %

Контроль -1.32 ± O.OOS

+30 мкг/мл ЛПСмйрт. -1.28 ±0.01 1X0,01 3%

+30 мкг/мл ЛПС£еок -1.24 ±0.01 JK0.001 6%

+70 мкг/мл ЛПСи,,Я(М, -1.27 ±0.01 1X10.01 4%

+70 мкг/мл ЛПСс.ии -1.17 ±0.01 1X0.001 11%

В таблице представлены усредненные результаты из пяти независимых экспериментов

Из полученных данных видно, что насыщение мембраны эритроцитов ЯПС«».^. достигается при концентрации эндотоксина 30 мкг/мл и незначительно влияет на электроповерхностеые свойства мембраны в сравнении с ЛПС,Е.гал. Увеличение времени инкубации до 4-х часов оказывало существенное влияния на значения ЭФП только эритроцитов, обработанных ЛПСег«!,. При концентрации ЛПСе«д 30 мкг/мл (4 ч, 37 С) ЭФП эритроцитов снижалась на 10% (-1.16 ± 0.01; р<0,001), при концентрации 70 мкг/мл - 16% (-1.08 ± 0.01; р«0.001) в сравнении с контролем (-1.29 ± 0.006). Повышение концентрации ЛПСг.мд и времени инкубации, по-видимому, приводит к встраиванию в мембраны дополнительного количества этого эндотоксина, что сказывается на значениях ЭФП,

4. Исследование роли гидрофильного фрагмента ЛПС в изменении ЭФП эритроцитов при встраивании эндотоксинов

ЛПСж.,^ и ЛПСг.«п отличаются не только по составу липида А, но и структурой кора и полисахаридного фрагмента ЛПС {Barclay et al, 1987; Cttrno et al., 1989) (Рис. 6). С целью исследования влияния этих составляющих молекул ЛПС были использованы коммерческие Rc-, Ra- и S-структуры эндотоксинов из E.coli. Данные структуры отличаются составом кора и полисахарида ЛПС, но обладают идентичной структурой липида А, что позволяет исключить влияние последнего на взаимодействие и последующее встраивание ЛПС в мембрану эритроцитов. Влияние внутреннего кора на ЭФП плеток может быть обусловлено его заряженными группами, тогда как внешнего кора и полисахаридного фрагмента, вследствие их размера - экранированием поверхностного заржца клеток.

О-якппи

1 Вивший кар 11 ВкртренниА одр

[Ott

ал-

Р —-ОЕШН J

I

гаю®

OleNAe QlcNAe od Н«р ¿о® рв

t II I I

OnWAc - QiMAC--Gfc— <W—Ok—H^p—Hip— KDO—nnuA

I в i® ' о

p ? p

Is

p-OBMJ,

-S-ЛПС-

Olc 1

chcnac 1

Glc—Hip

I-

Pe io® ио® f

Ucp — iA>0—Л11ПНД A

I-

-Rc-ЛПС-

Рис. б. Структуры эндотоксинов: S- и Ra-структуры ЛПС из Escherichia coli Olli :В4 (по Otrno et al., 1989) и Rc-структура ЛПС из Escherichia coli J5 (по Barclay et al., 1987).

Gal - галактоза; GalNAc — N-ацетилгалактазамин; Glc — глюкоза; GlcNAc - N-ацетилглюкозамин; Hep - гепгоза; XDO - 3-дезокси-D-манно-октулозоиовая кислота; OetNHj - этаноламин; P -фосфатный остаток; n — число олигосахаршшых единиц;

Таблица 4. ЭФП эритроцитов человека с встроенными в мембрану эндотоксинами из E.coli

Контроль Структура ЛПС

S- Ra- Rc-

ЭФП, мкм • с"1 • В"1 • см s4-1 ■. -,-. ■ -1:30 ±0.007 —1.16 ± 0.012 tXÜ.OÖl -1.30 ±0.007 -1.30 ±0.006

Ошоентельное изменение ЭФП, % - - 11 0 0

В таблице представлены усредненные результаты аз трех независимых экспериментов

Инкубацию Rc~, Ra- и S-форм ЛПС£а>л с эритроцитами проводили аналогично экспериментам с ЛПСкьср,,. Из данных, представленных в табл. 4, видно, что только взаимодействие S-ЛПСсс«« с эритроцитами достоверно уменьшает значение ЭФП клеток в сравнении с контролем, тогда как инкубация клеток с Не- и Па-структурами ЛПС не влияет на электроповерхностные характеристики эритроцитов.

Отсутствие влияния Rc- и Ra-ЛПС, в отличие от S-ЛПС, на ЭФП эритроцитов при их встраивании в мембрану, по-видимому, связано с отношением толщины гликокалнкса (5,9 нм) мембраны эритроцита к протяженности фрагмента кора и/или О-полисахарнда исследуемых ЛПС (Linns et al., 1991). По Касювскому с соавт. (Kastowsky et al., 1992) длина полисахаридного остатка эндотоксина Salmonella составляет 1.1 нм для Rd-, 2 нм для Ra- и 3.1 нм для S-ЛПС (п = 4). Методом электронной микроскопии бактериальных клеток с помощью антител к полисахаридам показано, что длина молекулы S-ЛПС может достигать 20 нм в зависимости от числа структурных единиц (п) и максимального вытягивания О-сдецифнческой цепи (Shands et al, 1967). Для ЛПСкшв штамма 055:В5, используемого в настоящей работе, показано, что О-зншген может включать до 23-х повторяющихся структурных единиц (Petersen et al., I9S5). Исходя из этих данных, мы полагаем, что олигосахаридныс фрагменты Rc- я Ra-ЛПС при встраивании располагаются в глубине гликокалнкса мембраны и, благодаря жесткости конформацни молекулы, не оказывают существенного влияния на ЭФП эритроцитов. О-полисахаридная цепь, существенно выступая над поверхностью гликокалнкса клеток, не только маскирует отрицательные заряды мембраны" эритроцитов, но также способна перемещать электрокинетическую плоскость скольжения, вызывая снижение ЭФП (Мирошников с соавт., 1986).

5. Влияние поверхностных белков и заряда мембраны эритроцитов на взаимодействие с эидотокснпаМн

Взаимодействие между ЛПС и эритроцитами зависит не только от свойств молекулы ЛПС, но и от характеристик поверхности клетки. Для мембраны эритроцитов характерно

наличие ■: большого количества белков, а также наличие отрицательного заряда, обусловленного сиаловымн кислотами, входящими в состав гликофорннов поверхности клеток - (МигрЬу е( а!., 2004). В настоящее время стало известно, что при различных патологических Г процессах в организме наблюдаются физико-химические изменения мембраны эритроцитов, которые способны оказывать влияние на взаимодействие клеток с эндотоксинами (Рязанцева с соавт., 2003; Стеновая с соавг., 2004; Рязанцева с соавт., 2004). В частности, установлено снижение содержания сиаловых кислот на поверхности эритроцитов пациентов с сепсисом (Р1аепегеШ, 2003).

Для исследования влияния стереохимических факторов и заряда поверхности клетки на взаимодействие ЛПС с мембраной эритроцитов мы использовали прием обработки клеток ферментами: нейраминидазой или трипсином. Нейраминидаза специфически гидролизует связь между ы-ацетил-нейраминиковой (сиаловон) кислотой и галактозой гликофорннов, приводя к снижению заряда поверхности клетки н ЭФП, тогда как обработка трипсином гидролизует пептиды, тем самым, уменьшая как отрицательный заряд, так и влияние стереохимического фактора на взаимодействие с ЛПС. Роль стереохимических факторов н заряда поверхности клетки при взаимодействии ЛПСг«я с эритроцитами исследовали с помощью методов конфокальной лазерной микроскопии и проточной цитофлуориметрии.

Ш_т 1ш

Рис. 7, Конфокальная микроскопия контрольных эритроцитов человека (а), обработанных нейраминидазой. (б) и трипсином (в) после их инкубации с ЛПСг„;гА1еха меченным флуоресцеином Масштабная линейка — 50 мкм (а).

Данные конфокальной микроскопии для единичных клеток, представленные на рис. 7, показывают, что эритроциты, прединкубироеанные с ЛПСг-™л-А1еха, флуоресцируют при Х=519 нм. Это подтверждает встраивание ЛПС£„« в мембраны контрольных эритроцитов и эритроцитов, подвергнутых действию трипсина и нейраминидазы. Собственная флуоресценция единичных контрольных клеток не зарегистрирована. Из рис. 7 также видно.

что инкубация эритроцитов с ЛПСемл вызывает изменение формы как кативных, так и обработанных ферментами клеток. В случае клеток, обработанных трипсином (рис. 7в), изменение формы эритроцитов вызвано как влиянием встроенного ЛПС, так и воздействием высокого значения рН при обработке клеток ферментом (Оей<1е М а1, 1995). Аналогичные изменения формы иитакгных эритроцитов наблюдаемые нами (рис. 7а) подтверждают влияние

встраивания ЛИС в изменение формы клеток.

Изменение формы

клеток связано с насыщением комплементарно сформированного внешнего слоя мембраны эритроцитов . липидом А ЛПСсмв " обладающим конической конформацней, а также вЬэможкым кросс-связыванием трансмембранных белков эритроцитов,

прикрепленных к цитоскелету клетки при их взаимодействии с полисахаридом ЛПС.

Спектры флуоресценции единичных клеток: интактной и обработанной трипсином или нейраминидазой показывают,

Рис. & Уровень флуоресценция единичной клетки нативных эритроцитов человека (а), обработанных трипсином (б), и нейрамнкидазой (в) после инкубации с ЛПС^™1гА1еха меченного флуоресцендам.

что уровень флуоресценции у последней значительно ниже (рис. 8), Это предполагает, что встраивание ЛПС£„л в мембрану клетки, обработанную нейрамннидазой, меньше в сравнении с мембраной иитактного или обработанного трипсином эритроцита. Однако, заключения о влиянии ферментов на встраивание ЛПС сделать нельзя, поскольку нами показано, что уровень встраивания ЛПС различен (рис. 5). В связи с этим мы исследовали встраивание ЛПСе.мА в популяции клеток (10! клеток), обработанных трипсином или нейрамннидазой, методом проточной цитофлуориметрни.

При анализе клеток данным методом было выявлено собственное свечение контрольных клеток при Х=5)9 км, которое учитывалось при оценке интенсивности флуоресценции всей популяции после введения ПТС-меченного ЛПСг.ии. Результаты, полученные с помощью проточной цитофлуореметрии, представлены на рис. 9. Анализ полученных данных показывает, что при мягкой обработке эритроцитов трипсином уже наблюдается увеличение флуоресценции иа 16%. Это указывает на значимость стереохимических факторов во взаимодействии и встраивании эндотоксинов в мембрану. Такое заключение представляется обоснованным в связи с тем, что снятие отрицательного заряда с поверхности эритроцитов с помощью нейраминидазы ие столь значительно влияло на встраивание ЛПС (3%), как снятие стереохимических факторов.

а б в

Рнс. 9. Интенсивность флуоресценции эритроцитов 105, со встроенными ИГТС- ЛПС£„л, определенная методом проточной цитофлуориметрни. а — нативные эритроциты, б — обработанные трипсином, в - нейрамннидазой.

6. Исследование способности ЛПСм.«,*, встроенного в мембрану эритроцитов, взаимодействовать с катноппыми антибиотиками

Катионвые антибиотики, такие как полнмиксин В, взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными и карбоксильными группами эндотоксинов (Carr et al., 19S5). Эффективность лизиса клеток полимнксином В наблюдается только при его взаимодействии с Re -*■ Ra-структурами ЛПС, тогда как О-антиген S-структуры J111С стерически препятствует связыванию антибиотика с акцепторными сайтами ЛПС и лизису клетки. Эффект полимиксина В на гемолиз эритроцитов кролика, несущих на своей поверхности агонистические молекулы ЛПС, показан ранее Карром и Моррисоном (Сагг & Morrison, 1985). Поскольку нами показано встраивание в мембраны эритроцитов человека антагонистического ЛПСльв^,., который обладает SR-структурой и сниженным отрицательным зарядом, была исследована способность связывания полимиксина В с данным антагонистом.

При используемой концентрации ЛПСм.а^ 10 мкг/мл, которая значительно ниже доз, предложенных для лечения эндотоксинового шока (Lynn et al., 2004), высвобождение гемоглобина (0.65% р < 0.05) индуцированное полимиксином В наблюдалось через 1 ч инкубирования эритроцитов с ЛПС^н^.. Повышение концентрации ЛПС.и.г^ в среде до профилактической дозы 30 мкг/мл (Lynn et aL, 2004), соответствующей концентрации насыщения мембран эритроцитов, существенно усиливало эффект полимиксина В на высвобождение гемоглобина эритроцитами со встроенными ЛПСм.ы^., что представлено в табл. 5.

Таблица 5, Высвобождение гемоглобина под действием полимиксина В в зависимости

. - ■- - Время инкубации

5 мин. _ .1,5 мин. i 1 ч.

Адо контроль 0.022 ±0.002 1 0.021 ± 0.002 0.022 ±0.003

Амо Пробы 0.043 ± 0.003' 0.064 ±0.006 0.067 ±0.004

% высвободившегося гемоглобина от его общего количества 1.13 Р<0.01 2.3 Р <0.001 2.4 Р< 0.001

В таблице представлены усредненные результаты из семи независимых экспериментов

Анализ данных (табл. 5) показывает, что максимальное высвобождение гемоглобина наблюдается при 15 мин инкубации клеток с ЛПСздодо и сохраняется при более длительной

инкубации вплоть до 1ч. Способность пояимиксина В взаимодействовать с ЛПСлкс«и. на поверхности эритроцитов предполагает наличие доступных отрицательных зарядов, расположенных в области КДО и диглкжозамвна липида А исследуемого антагониста. Поскольку эффективность проникновения а^-диаминомасляной кислоты пояимиксина В в фосфолипидный бнслоО и связанный с этим лизис клеток определяются непосредственной близостью расположения КДО и фосфатных остатков лнппда А эндотоксинов к фосфолнпндпому бислою мембраны, то полученные нами данные подтверждают встраивание ЛПСД4 счв. в мембраны эритроцитов человека.

Несмотря на использование антагониста в концентрации, близкой к порогу насыщения мембраны, в наших экспериментах не наблюдался полный лизис эритроцитов со встроенным ЛПСл&ьр!., индуцированный полнмиксином В. Это, по-видимому, объясняется тем, что полимиксин В индуцирует кратковременные (до 100 миллисекунд), достаточно большие флуктуирующие поры (2.4 нм) в мембранах, сформированных из фосфолипндов и ЛПС (Schroder et al., 1992; Falla et al,, 1996; Halevy et al., 2003). В эритроцитах, мембраны которых обладают цтоскелетом, деструкция бислоя может быть локальной и сопровождаться процессом репарации (Miller et al., 197S). Исходя из этого, мы предполагаем, что высвобождение гемоглобина (эффективный радиус диффузии 32,5 A; Mr 6S кДа) из эритроцитов, несущих на своей поверхности ЛПСад.мрк под действием полимиксина В происходит по описанному механизму (Pappenheimer, 1955). Однако, возможность полного разрушения отдельных клеток эритроцитов вследствие значительного нарушения целостности мембраны не исключена.

Показанное нами частичное высвобождения гемоглобина из эритроцитов со встроенным ЛПСздоф!. под действием пояимиксина В предполагает необходимость контроля за свободным гемоглобином в крови при лечении эндотоксинового шока катнонпыми антибиотиками на фоне антагонистов эндотоксинов.

В заключение необходимо отметить, что исследования влияния ЛПС на элехтрофоретическую подвижность клеток н взаимодействие с полнмиксином В изучались ранее на примере эритроцитов баранов или кроликов; экспериментальные данные, полученные на эритроцитах человека, представлены впервые.

ВЫВОДЫ

1. Состав липида А липополисахарндов Khodobacler capsulatum PC н Escherichia coli 055:B5 определяет степень насыщения мембран при их встраивании.

2. S-форма липополисахарида Escherichia coli 055iB5 при встраивании в мембрану вызывает более выраженные изменения электроповерхностных свойств эритроцитов, чем SR-форма липополисахарида Rhodobacter capsulatum PG.

3. Значительное снижение ЭФП эритроцитов при встраивании липополисахаридов обусловлено полисахаршгаым фрагментом маскирующим собственный отрицательный заряд клетки.

4. Определяющую роль во взаимодействии липополисахарнда Escherichia coli Oi5:B5 с эрнтродатами гчрают поверхностные белки клетки, тогда как роль сиаловых кислот не столь значительна.

Впервые установлено, что катнонный антибиотик - лолнмикснн В взаимодействует с липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG, встроенным в мембраны эритроцитов, я вызывает частичное высвобождение внутриклеточного гемоглобина, что важно в связи с комбинированным лечением сепсиса антагонистами эндотоксинов и антибиотиками.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кабанов Д.С., Прохоренко И.Р., Грачев C.B., Косякова Н.И. Исследование влияния

структуры эндотоксинов на встраивание в тени эритроцитов. Аллергология и Иммунология. 2003. Т. 4, Mi 2, с. 71.

2. Прохоренко И.Р., Кустанова Г.А., Гражданкин Е.Б., Кабанов Д.С., Мурашов АЛ.,

Прохоренко C.B., Грачев C.B. Влияние липополисахаридов разной структуры на сердечно-сосудистую систему крыс mstar. Доклады РАН 2005. Т. 402, № 6, с. 838-840.

3. Кабанов Д.С., Иванов А.Ю., Мельцер М., Прохоренко И.Р. Влияние встраивания

липополисахаридов в мембрану эритроцитов человека на электрофорехяческую подвижность. Биологические мембраны 2005, Т. 22, № 5, с. 401-407.

4. Кабанов Д.С., Иванов А.Ю., Грачев C.B., Прохоренко И.Р, Влияние структуры

липополисакарида на алектроповерхностные характеристики эритроцитов человека при встраивании эндотоксина в мембраны клеток. Биологические мембраны 2006. Т. 23, №3. с. 243-247.

5. Прохоренко И.Р., Сахно И.В., Косякова Н.И., Хундерякова Н.В., Мурашев А.Н.,

Гражданкин ES., Грачев C.B. Исследование взаимосвязи между биологической активностью эндотоксинов и их структурой. Материалы научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» 2000 г Москва с. 22-23.

6. Зубова C.B., Кабанов Д.С., Дряглева И.Д., Прохоренко И.Р., Грачев C.B.

Лштополисахариды из фотосшггезирующнх бактерий — потенциальные антагонисты эндотоксинов. Материалы международной научной конференции «Биология на рубеже двух тысячелетий» 2001 г. Саранск с. 181-182.

7. Кабанов Д.С., Прохоренко И.Р. Изучение возможности встраивания эндотоксина В

мембраны теней эритроцитов. «Биология-наука XXI века» 2003 г. Пущино с. 25.

8. Кабанов Д.С., Иванов А.Ю., Прохоренко И.Р., Грачев C.B. Исследование влияния

липополисахарида из Rhodobacter capsulatus на электрофоретическую подвижность эритроцитов человека. XVI зимняя молоджная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» 2004 г. Москва с. 73.

9. Прохоренко И.Р., Гражданкин Е.Б., Кустанова ГЛ., Кабанов Д.С., Мурашев А.Н., Грачев

СВ. Блокада Р-адренорецепторов снижает защитные эффекты нетоксичных

липополисахаридов при развитии эндотоксичсского шока у крыс. «Третий Российский конгресс по патофизиологии» 2004 г. Москва с. 203.

10. Кабанов Д.С., Иванов А.Ю., Прохоренко И.Р., Грачев C.B. Исследование влияния

структуры липополисахаридов па электрофоретаческую подвижность эритроцитов человека. «Биология-наука XXI века» 2004 г. Пущине с. 114,

11. Кабанов Д.С., Волошина Е.В., Иванов А.Ю.Влняние встраивания липополисахаридов на

электрофоретическую подвижность эритроцитов и их теней. IX Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» 2004 г. Казань с. 38.

12. Грачев C.B., Прохоренко HJ*., Винокуров М.Г., Гражланкин Е.Б., Зубова С.ВЧ Кабанов

Д.С., Курганова Г.А., Прохоренко C.B. Исследование антагонистических активностей лнпополисахаряда из Rhodobacier capsulatus в целях создания препаратов для лечения эндотоксннового шока, «Фундаментальные науки-медициие» 2004 г, Москва с. 172-

13. Прохоренко И.Р., Винокуров . М.Г., Юринская М.М., Кабанов Д.С., Гражданкин Е.Б.,

Кустанова Г.А., Зубова С.В., Прохоренко С.В;, Волошина Е.В., Грачев С.В. Изучение защитного действия нетоксичных липополисахаридов от эффектов эндотоксинов в экспериментах in vivo и in vitro. 1 Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность» 2004 г, Москва с. 159.

14. Кабанов Д.С. Исследование сродства липополисахаридов из Rhodobaeter capsulatus к

липкдам теней эритроцитов человека. Ш конференция молодых ученых России «Фундаментальные науки н прогресс клинической медицины» с международным участием 2004 г. Москва с,248-249.

15. Kabanov D. Role of Lipopolysacchaiide's structures in their intercalation capacity «The 2004

Younger European Chemists' Conference» 2004 P. 36, Torino Italy.

16. Кабаков Д.С., Прохоренко И.Р., Грачев СЛ. Влияние встраивания эндотоксинов в

мембрану эритроцитов на гемолиз клеток. Сборник материалов «Физиология и медицина» всероссийской конференции молодых исследователей. 2005 г. Санкт-Петербург с. 144.

17. Кабанов Д.С., Тарасович НЮ., Прохоренко И.Р. Роль заряда цитоплазматической

мембраны клеток во взаимодействии с лнпопол&сахаридами, «Биология-наука XXI века» 2005 г, Пущино с. 147. IE. Kabanov D., Prokhorenko S,, Prokhorenko I. Cell surface charge modification by 1 ¡^polysaccharides from Rhodobaeter capsulatus. «International Sarcoma Meeting Stuttgart» 2005 P. 33. Stuttgart, Germany.

173.

Принято к исполнению 13/11/2006 Исполнено 14/11/2006

Заказ №919 Тираж: 100 экз.

Типография «11 -в ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское т., 36 (495) 975-78-56 «гпто.эдПогеГедо.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кабанов, Дмитрий Сергеевич

Список условных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.Физико-химическая характеристика липополисахаридов грам отрицательных бактерий.

1.1.1. О-специфическая цепь (О-антиген).

1.1.2. Состав и структура кора.

1.1.3. ЛипидА.

1.1.4. Конформация мономеров эндотоксинов.

1.1.5. Роль температуры, катионов и рН среды в р а фазовом переходе липида А.

1.2. Химический состав и заряд мембраны эритроцитов

1.2.1. Молекулярная организация мембраны эритроцитов человека.

1.2.2. Заряд поверхности эритроцитов.

1.3. Роль белков, фосфолипидов мембраны и заряда поверхности клетки при взаимодействии с ЛПС.

1.3.1. Специфическое взаимодействие ЛПС с мембраной эритроцитов.

1.3.2. Липиды как рецепторы эндотоксинов.

1.4. Влияние встраивания ЛПС на физико-химические свойства мембраны эритроцитов человека.

1.4.1. Эластичность мембраны клеток при встраивании липида А.

1.4.2. Влияние эндотоксинов на текучесть мембраны.

1.4.3. Эффекты ЛПС на морфологию мембраны эритроцитов.

1.4.4. Модификация заряда клеточной мембраны эндотоксинами.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объекты и методы исследования.

2.1. Определение хемотипа бактерий методом агглютинации клеток клеток по Линдбергу.

2.2. Получение ЛПС из Rb. capsulatus.

2.3. Определение чистоты препарата ЛПС.

2.4. Определение содержания КДО в препаратах ЛПС по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Karkhanis et al., 1978; Osborn et al. 1979).

2.5. Определение качественного состава ЛПС методом электрофореза по Крауссе (Krauss et al., 1988).

2.6. Определение содержания катионов металлов в ЛПС.

2.7. Получение флуоресцентных форм эндотоксинов.

2.8. Встраивание ЛПС в мембраны теней эритроцитов и нативных клеток.

2.9. Исследование содержания ЛПСи,.ся/„. и ЛПС£.сой.в мембранах теней эритроцитов с помощью карбоцианового красителя.

2.10. Определение электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФП).

2.11. Модификация мембраны эритроцитов ферментами.

2.12. Исследование способности полимиксина В взаимодействовать с ЛПСДЙ. caps.> встроенным в мембрану эритроцитов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сравнительная характеристика ЛПС из Rhodobacter capsulatus PG и из Escherichia coli.

3.2. Исследование способности ЛПСдй.ся/и. и ЛПСe.coU к насыщению мембран эритроцитов человека.

3.3. Влияние ЛПС на электроповерхностные характеристики эритроцитов.

3.3.1. Исследование влияния ЛПСд/,.ст/„, и ШЮе.соИ на заряд клеточной поверхности.

3.3.2. Исследование роли гидрофильного фрагмента ЛПС в изменении ЭФП эритроцитов при встраивании эндотоксинов.

3.4. Влияние поверхностных белков и заряда мембраны эритроцитов на взаимодействие с эндотоксинами.

3.5. Исследование способности полимиксина взаимодействовать с ЛПСяь.сар^ встроенными в мембрану эритроцитов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение поверхностных характеристик мембраны эритроцитов при встраивании липополисахаридов грамотрицательных бактерий"

Актуальность проблемы. Взаимодействие липополисахаридов (ЛПС, эндотоксинов) грамотрицательных бактерий с клетками млекопитающих приводит к синтезу биологически активных соединений, избыточное высвобождение которых является причиной эндотоксинового шока. Статистические данные свидетельствуют о том, что эндотоксиновый шок занимает 13 место в списке наиболее частых причин смертности людей. Высокий уровень смертности и развитие тяжелых осложнений при эндотоксиновом шоке связаны с отсутствием специфической терапии. Одним из перспективных направлений предупреждения эндотоксинового шока является применение ЛПС из Rhodobacter capsulatus PG (Ш\£вь.сарв), который способен блокировать сайты связывания эндотоксически активных молекул ЛПС на поверхности мембраны клеток-мишеней, и тем самым проявлять антагонистическое действие.

Эритроциты представляют преобладающую популяцию клеток крови и, в первую очередь, подвергаются действию эндотоксинов в кровотоке. Вовлечение клеток крови, особенно эритроцитов, в процессы, связанные с патологией кровеносной системы, обусловлено влиянием ЛПС на морфологию и эластичность мембраны, а также на заряд поверхности этих клеток. В процессе жизнедеятельности клетки, а также при различных патологических состояниях мембрана эритроцитов претерпевает биохимические изменения, способные оказывать влияние на взаимодействие с ЛПС (Рязанцева с соавт., 2003; Piagnerelli, 2003; Степовая с соавт., 2004; Рязанцева с соавт., 2004). В кровеносном русле эритроциты с встроенными в мембрану молекулами ЛПС способны взаимодействовать с нейтрофилами, приводя к их активации (Troelstra et al., 1999). Очевидно, что события, развивающиеся на поверхности мембраны клеток крови после взаимодействия с эндотоксинами, определяются составом и физико-химическими свойствами встроившихся молекул ЛПС.

ЛПС грамотрицательных бактерий различаются количеством остатков 2-кето-З-дезокси-Б-манно-октулозоновой кислоты (КДО) и остатков фосфорной кислоты (Barclay et al., 1987; Ohno et al., 1989; Muller-Loennies et al., 2003), а также по катионному составу (Coughlin et al., 1983; 1983a), что отражается на общем заряде каждого ЛПС. Кроме того, ЛПС обладают разной длиной кора и полисахаридного фрагмента (Barclay et al., 1987; Ohno et al., 1989). Способность эндотоксинов взаимодействовать с поверхностью клеток и вызывать большинство биологических ответов связана с гидрофобной частью ЛПС -липидом А. Липиды А агонистических и антагонистических ЛПС различаются химическим составом и конформацией молекул. Влияние агонистических форм ЛПС на заряд поверхности эритроцитов описано в некоторых работах (Мирошников с соавт., 1986), тогда как данных об эффекте антагонистических форм ЛПС в литературе нет. В связи с тем значением, которое играют рассматриваемые формы ЛПС в новых лекарственных препаратах против эндотоксемии, представлялось актуальным и обоснованным сравнительное изучение влияния состава антагонистических и агонистических форм ЛПС на поверхностные свойства мембраны эритроцитов при ее взаимодействии с ЛПС.

В связи с вышесказанным, была сформулирована цель настоящего исследования. Цель и задачи исследования. Изучить изменение поверхностных характеристик мембраны эритроцитов человека после взаимодействия клеток с эндотоксинами разного состава.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить способность различных по составу ЛПС из Rhodobacter capsulatus и Escherichia coli к встраиванию в мембраны эритроцитов человека.

2. Сравнить влияние встраивания ЛПС Rhodobacter capsulatus и ЛПС Escherichia coli на электрофоретическую подвижность эритроцитов.

3. Изучить роль гидрофильного фрагмента ЛПС, встроившихся в мембрану эритроцитов, в изменении электроповерхностных характеристик клеток.

4. Оценить роль заряда и поверхностных белков мембраны эритроцитов на встраивание эндотоксина из Escherichia coli.

5. Выявить способность катионных антибиотиков взаимодействовать с ЛПСм.сд/м., встроенными в мембрану эритроцитов.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе впервые с помощью методов конфокальной лазерной микроскопии и спектрофотометрии показана способность JlllCnb.caps. к встраиванию в мембраны эритроцитов человека.

Впервые установлено, что в отличие от токсического высокоактивного S-ЛПС Escherichia coli (ЛПС£.со;;) насыщение мембраны исследуемых клеток ЛПСяь.СЯ/и. практически не влияет на заряд ее поверхности. Практическая значимость полученного результата заключается в том, что взаимодействие JlTiCRb.caps. при его введении в кровоток с эритроцитами не будет являться причиной агрегации клеток, вызванной изменением заряда поверхности мембраны.

В экспериментах in vitro впервые обнаружено, что катионный антибиотик полимиксин В взаимодействует с ЛПСдй.с„рл„ встроенным в мембрану эритроцитов, вызывая высвобождение внутриклеточного гемоглобина. Полученные результаты имеют важное практическое значение в рекомендациях совместного применения антагонистов эндотоксинов и катионных антибиотиков при лечении грамотрицательного сепсиса.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Степень насыщения мембран эритроцитов липополисахаридами из Rhodobacter capsulatus и Escherichia coli зависит от состава их липидов А.

2. Изменение поверхностных свойств эритроцитов зависит от длины коровой и полисахаридной составляющих ЛПС, встроившихся в мембрану клетки.

3. Белки поверхности мембраны являются определяющими факторами взаимодействия эритроцитов с эндотоксинами и их последующего встраивания.

4. Катионный антибиотик - полимиксин В взаимодействует с ЯИСяь.сарз., встроенным в мембраны эритроцитов, и вызывает частичное высвобождение внутриклеточного гемоглобина.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены и обсуждены на: научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000); VII Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003); XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004); Третьем Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004); VIII международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2004); III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); «The 2004 Younger European Chemists' Conference» (Italy, 2004); IX международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005); «International Sarcoma Meeting Stuttgart» (Germany, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на84страницах машинописного текста, содержит18таблиц и22рисунка и состоит из5разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 187 источника.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кабанов, Дмитрий Сергеевич

выводы

1. Состав липида А липополисахаридов из Rhodobacter capsulatus PG и Escherichia coli 055:B5 определяет степень насыщения мембран при их встраивании.

2. S-форма липополисахарида из Escherichia coli 055:В5 при встраивании в мембрану вызывает более выраженные изменения электроповерхностных свойств эритроцитов, чем SR-форма липополисахарида из Rhodobacter capsulatus PG.

3. Значительное снижение ЭФП эритроцитов при встраивании липополисахаридов обусловлено полисахаридным фрагментом, маскирующим собственный отрицательный заряд клетки.

4. Определяющую роль во взаимодействии липополисахарида из Escherichia coli 055:В5 с эритроцитами играют поверхностные белки клетки, тогда как роль сиаловых кислот - не столь значительна.

5. Впервые установлено, что катионный антибиотик - полимиксин В взаимодействует с липополисахаридом из Rhodobacter capsulatus PG, встроенным в мембраны эритроцитов, и вызывает частичное высвобождение внутриклеточного гемоглобина. Этот результат важен в связи с комбинированным лечением сепсиса антагонистами эндотоксинов и антибиотиками.

В течение жизни каждый взаимодействует с людьми, мировоззрение и жизненный опыт которых оказывает влияние на формирование личности человека. Эти люди объединяются под общим понятием - учитель. Человеку, испытывающему недостаток в учителях, и, следовательно, в знаниях, трудно найти верный и достойный путь в жизни. В этом отношении мне очень повезло. Представляемая к защите диссертация является этому доказательством. В связи с этим мне хочется выразить благодарность и назвать имена тех людей, которые оказывали помощь и поддержку в процессе выполнения и оформления этой работы.

Выражаю глубочайшую благодарность моему научному руководителю - доктору биологических наук Изабелле Рувимовне Прохоренко за большое внимание и всестороннюю помощь в работе, которая не только организовывала и направляла мою работу, но и ободряла меня в моменты неудач и сомнений. Я благодарен Изабелле Рувимовне за чуткое отношение и корректировку моих научно-философских взглядов на изучаемую проблему, за результаты экспериментов, специально поставленных ею в Институте генетики культурных растений (Германия), которые являются частью настоящей работы. Я искренне признателен Изабелле Рувимовне за то, что она открыла для меня мир настоящей фундаментальной науки и является для меня истинным учителем.

Сердечно благодарю Александра Юсуповича Иванова за предоставленную возможность совместного исследования влияния эндотоксинов на заряд поверхности клеток, за интерпретацию и обсуждение полученных результатов, за под держку и содействие в работе, за научные идеи, за помощь в написании статей и настоящей диссертации.

Я глубоко признателен рецензентам моей диссертационной работы: доктору биологических наук, профессору Юрию Евдокимовичу Ерохину и доктору физико-математических наук Ивану Игоревичу Проскурякову за внимательное рассмотрение работы и проявленный интерес к решаемым в ней вопросам, а также за доброжелательность, отзывчивость, ценные критические замечания и помощь автору.

Отдельное спасибо доктору биологических наук Вере Константиновне Опанасенко, которая первая ознакомилась с представляемой к защите работой, оценила ее уровень и дала ей право на существование.

Искренне благодарю Татьяну Викторовну Русанову за привитые эстетические и стилистические навыки в оформлении статей и презентации, за чуткое отношение к научной работе автора, за неоценимую помощь в написании диссертации.

Глубоко признателен доктору медицинских наук Нелли Ивановне Косяковой за активное участие и помощь нашей лаборатории, и, в частности, диссертанту.

От всей души признателен всем сотрудникам лаборатории «Молекулярной биомедицины» за сотрудничество, помощь и поддержку.

Отдельное спасибо - моей маме Валентине Михайловне Кабановой и бабушке Зинаиде Ивановне Нарыковой, которые на протяжении всего моего жизненного пути верили в меня и способствовали моим успехам, без которых и не было бы как меня, так и настоящей диссертации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кабанов, Дмитрий Сергеевич, Пущино

1. Васильева Е.М, Баканов М.И, Гордеева Г.Ф, Поддубная А.Е, Шор Т.А.

2. Фосфолипидный состав эритроцитов при неврологических нарушениях у детей; влияние сопутствующей патологии. Медицинский научный и учебно-методический журнал. 2001; № 2, С. 92-109.

3. Винокуров М.Г, Прохоренко И.Р, Юринская М.М, Прохоренко C.B., Грачев C.B.

4. Влияние липополисахаридов разной структуры на адгезию и генерацию активных форм кислорода нейтрофилами человека. Доклады академии наук 2003; Т. 393 №2, С. 273-275.

5. Владимиров Ю.А, Добрецов Г.Е. // Флуоресцентные зонды в исследованияхбиологических мембран. М, 1980. - 197 с.

6. Горошинская И.А, Голотина Л.Ю, Горло Е.И, Ровда Т.А, Бордюшков Ю.Н.

7. Изменение микровязкости мембран лимфоцитов и эритроцитов крови у онкологических больных. Вопросы медицинской химии. 1999; № 1, С. 4-9.

8. Дятловицкая Э.В. Сфинголипиды и злокачественный рост. Биохимия 1995; № 60,1. С. 843-850.

9. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы. Изд-во «Медицина», Москва,1976.

10. Книрель Ю.А, Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательныхбактерий. Биохимия. 1993; Т. 63, вып. 2, С. 166-181.

11. Козинец Г.И, Зоделава М.М, Борзова Л.В, Кульман P.A. Электрофорез клетокгемопоэтической ткани. Изд-во «Сабчота Сакартвело» Тбилиси 1986; 52 е.

12. Кулыпин В.А, Яковлев А.П, Аваева С.Н, Дмитриев Б.А. Улучшенный методвыделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий. Мол. Генетика 1987; № 5, С. 44-46.

13. Львов Д.К, Забережный А.Д, Алипер Т.И. Вирусы гриппа: события и прогнозы.

14. Преображенская Т.А., Корепанова Е.А., Куликова Н.С., Владимиров Ю.А.

15. Потенцирование действия полимиксина на ионную проницаемость эритроцитов и БЛМ из липидов эритроцитов. Биофизика 1994; Т. 39, вып. 6, С. 1025-1028.

16. Прохоренко И.Р. Особенности биологической активности липополисахарида изфотосинтезирующей бактерии Rhodobacter capsulatus: Дисс. д-ра биол. Наук. -М., 1999.

17. Прохоренко И.Р., Кустанова Г.А., Гражданкин Е.Б., Кабанов Д.С., Мурашев А.Н.,

18. Прохоренко C.B., Грачев C.B. Влияние липополисахаридов разной структуры на сердечно-сосудистую систему крыс Wistar. Доклады академии наук 2005; Т. 402, № б, С. 838-840.

19. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Взгляд на закономерности изменениймолекулярной организации мембраны и функциональных свойств эритроцитов при невротических расстройствах. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2003; № 2, С. 129-138.

20. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В„ Степовая Е.А., Ткаченко С.Б. Эритроцит припатологии: размышления у электронного микроскопа. Архив патологии. 2004; № 3,С. 53-61.

21. Степовая Е.А., Новицкий В.В., Гольдберг В.Е., Рязанцева Н.В., Ткаченко С.Б.,

22. Колосова М.В. Особенности состояния мембран и метаболизма эритроцитов у больных раком легкого. Вопросы онкологии 2004; Т. 50, № 1, С. 63-67.

23. Степовая Е.А., Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Ткаченко С.Б., Гольдберг В.Е.,

24. Колосова М.В. Белковый состав мембран эритроцитов у больных раком желудка, толстой и прямой кишки. Клиническая лабораторная диагностика 2004; № 5, С. 50-53.

25. Спирин A.C. Спектрофотометрическое определение суммарного количествануклеиновых кислот. Биохимия 1958; Т. 23. № 5, С. 656-662. 21.Черницкий Е.А., Воробей A.B. Структура и функции эритроцитарных мембран. Изд-во «Наука и техника», Минск, 1981,15 с.

26. Шеппе Г., Шютт В., Унгер Р. Результаты использования автоматизированногомикроскопа для электрофореза частиц «Пармоквант». Йенское обозрение. 1978; 5: 232-235.

27. AndersonR.A, LovrienR.E. Erythrocyte membrane sidedness in lectin control of the

28. Ca2+-A23187-mediated discocyte echinocyte conversion. Nature (London) 1981; 292: 158-161.

29. Avruch J, Fairbanks G. Demonstration of a phosphopeptide intermediate in the Mg++dependent, Na+- and K+-stimulated adenosine triphosphatase reaction of the erythrocyte membrane. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1972; 69: 1216-1220.

30. Barclay G.R, Scott B.B. Serological relationships between Escherichia coli and

31. Salmonella smooth- and rough-mutant lipopolysaccharides as revealed by enzyme-linked immunosorbent assay for human immunoglobulin G antiendotoxin antibodies. Infection and Immunity 1987; 55: 2706-2714.

32. Basse F, Stout J.G, Sims P.J, Wiedmer T. Isolation of an erythrocyte membrane proteinthat mediates Ca2+-dependent transbilayer movement of phospholipid. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. 1996; 271: 1720517210.

33. Bellhorn M.B, Blumenfeld O.O, Gallop P.M. Acetylcholinesterase of the humanerythrocyte membrane. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970; 39: 267-273.

34. Besancon F, Ankel H. Binding of interferon to gangliosides. Nature (London) 1974; 252:478.480.

35. Blunck R, Seydel U. New insights into endotoxin-induced activation of macrophages:involvement of a K+ channel in transmembrane signaling. J. of Immunol. 2001; 166: 1009-1015.

36. Bodemann H, Passow H. Factors controlling the resealing of the membrane of humanerythrocyte ghosts after hemolysis. J. Membr. Biol. 1972; 8:1-26.

37. Brandenburg K, Seydel U. Investigation into the fluidity of lipopolysaccharide and freelipid A membrane systems by Fourier-transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry. Eur. J. Biochem. 1990; 191: 229-236.

38. Brandenburg K, Mayer H, Koch M.N.J. Influence of the supramolecular structure offree lipid A on its biological activity. Eur. J. Biochem. 1993; 218: 555-563.

39. Brandenburg K, Seydel U, Schramm A.B, Loppnow H, Koch M.N.J, Rietschel E.T.

40. Conformation of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharide. J. Endotoxin Research 1996; 3: 173-178.

41. Brandenburg K., Kusumoto S., Seydel U. Conformational studies of synthetic lipid Aanalogues and p artial s tructures b y infrared spectroscopy. BBA 1 997; 1329: 193201.

42. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantitiesof protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254.

43. Bratosin D., Tissier J.P., Estaquier J., Huart J.J., Ameisen J.S., Aminoff D., Montreuil J.

44. Cellular and molecular mechanisms of senescent erythrocyte phagocytosis by macrophages. A review. Biochemie. 1998; 80: 173-195.

45. Brown D.A., Rose J.K, Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enrichedmembrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell 1992; 68: 533-544.

46. Brown D.A., London E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev.

47. Cell. Dev. Biol. 1998; 14: 111-136.

48. Brown P.A., Fainstein M.B., Sha'afi R.I. Membrane proteins related to water transport inhuman erythrocytes. Nature 1975; 254: 523-525.

49. Brzeszczynska J., Gwozdzinski K. Erythrocyte membrane damage induced by tbutylhydroperoxide. Curr. Top. Biophys. 1998; 22: 27-32.

50. Brzeszczynska J., Gwozdzinski K. /-butylhydroperoxide-induced alterations inerythrocyte components. Curr. Top, Biophys. 1999; 23: 113-118.

51. Bufler P., Stiegler G., Schuchmann M., Hess S., Kruger C., Stelter F. Solublelipopolysaccharide receptor (CD 14) is released via two different mechanisms from human monocytes and CD14 transfectants. Eur. J. Immunol. 1995; 25:604-610.

52. Butterfield D.A., Sun B., Bellary S., Arden W.A., Anderson K.W. Effect of endotoxin onlipid order and motion in erythrocyte membranes. BBA 1994; 1225: 231-234.

53. Cabantchik Z.J., Rothstein A. Membrane proteins related to anion permeability of humanred blood cells. I. Localization of disulfonic stilbene binding sites in proteins involved in permeation. J. Membr. Biol. 1974; 15: 207-226.

54. Carr C., Morrison D.C. Lipopolysaccharide interaction with rabbit erythrocytemembranes. Infection and Immunity 1984; 43: 600-606.

55. Carr C., Morrison D.C., Mechanism of polymyxin B-mediated lysis of LPS-treatederythrocytes. Infection and Immunity 1985; 49: 84-89.

56. Cartron J.P., Colin Y. Structural and functional diversity of blood group antigens.

57. Transfus. Clin. Biol. 2001; 8:163-199.

58. Cavaillon J.-M., Marie C., Caroff M. CD14/LPS receptor exhibits lectin-like properties.

59. J. Endotoxin Res. 1996; 3: 471-480.

60. Chaby R., Morelec M.-J., Ensergueix D., Girard R. Membrane glycolipid andphospholipid composition of lipopolysaccharide-responsive and -nonresponsive murine B limphocytes. Infection and Immunity 1986; 52: 777-785.

61. Chosh A.S., Kar A.K., Kundu M. Impaired imipenem uptake associated with alterationsin outer membrane proteins and lipopolysaccharides in imipenem-resistant Shigella dysenteriae. J. of Antimicrobial Chemotherapy 1999; 43: 195-201.

62. Christ W.J., Osamu Asano, Robidoux A.L.C., Perez M., Yuan Wang, Dubuc G.R., Gavin

63. Ciznar I., Shands J.W.JR. Effect of alkali-treated lipopolysaccharide on erythrocytemembrane stability. Infection and Immunity 1971; 4: 362-367.

64. Colin Y. Gerbich blood groups and minor glycophorins of human erythrocytes. Transfus.

65. Clin. Biol. 1995;2:259-268.

66. Corfield T. Bacterial sialidases roles in pathogeniciy and nutrition. Glycobiology 1992;2: 509-521.

67. Coughlin R.T., Haug A., McGroarty E.J. Physical properties of definedlipopolysaccharide salts. Biochemistry 1983; 22: 2007-2013.

68. Coughlin R.T., Tonsager S., McGroarty E.J. Quantitation of metal cations bound tomembranes and extracted lipopolysaccharide of Escherichia coli. Biochemistry 1983; 22: 2002-2007.

69. Cross G.A.M. Glycolipid anchoring of plasma membrane proteins. Ann. Rev. Cell. Biol.1990; 6: 1-39.

70. Da Silva P.P., Nicolson G.L. Freeze-etch localization of concanavalin A receptors to themembrane intercalated particles of human erythrocyte ghost membranes. BBA 1974; 363: 311-319.

71. Dierich M.P., Bitter-Suermann D., Koning W. Analysis of bypass activation of C3 byendotoxic LPS and loss of this potency. Immunology 1973; 24: 721-733.

72. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J. The preparation and chemical characteristics ofhemoglobin-free ghosts of human erythrocytes. Arch. Biochem. Biophys. 1963; 100: 119-130.

73. Dumont F. Effect of stimulation with bacterial lipopolysaccharide on the surface-chargeof mouse B-lymphocytes. Ann. Immunol. (Paris) 1975; 126: 453-459.

74. El-Mashak E.M., Tocanne J.F. Polymyxin B-phosphatidylglycerol interactions. BBA1980; 596: 165-179.

75. Emmerling G., Henning U., Gulik-Krzywicki T. Order-disorder conformational transitionof hydrocarbon chains in lipopolysaccharides. Eur. J. Biochem. 1977; 78: 503.

76. Evans D.G., Kaqalainen T.K., Evans D.J.Jr., Graham D.Y., Lee C.H. Cloning, nucleotidesequence, and expression of a gene encoding an adhesion subunit protein of Helicobacter pylori. J. Bacteriol. 1993; 175: 674-683.

77. Falla T.J., Karunaratne D.N., Hancock R.E.W. Mode of antimicrobial peptide indolicidin.

78. J. Biol. Chem. 1996; 271: 19298-19303.

79. Fra A.M., Williamson E., Simons K., Parton R.G. De novo formation of caveolae inlymphocytes by expression of VTP21-caveolin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 8655-8659.

80. Fukuoka S., Brandenburg K., Mtiller M., Lindner B., Koch M.H.J., Seydel U. Physicochemical analysis of lipid A fractions of lipopolysaccharide from Erwinia carotovora in relation to bioactivity. BBA 2001; 1510: 185-197.

81. Fumarola D., Jirillo E., Monno R, Monno I., De Santis A. Effect of some bacterialproducts on platelet electrophoretic mobility. Boll. 1st. Sieroter. Milan 1977; 56: 391-396.

82. Furthmayr H. Glycophorins A, B and C are a family of syaloglycoproteins. Isolation andpreliminary characterization of trypsin derived peptides. J. Supramol. Struct. 1978; 9: 79-95.

83. Galanos C., Luderitz O. Lipopolysaccharide: properties of an amphipathic molecule, in

84. Handbook of Endotoxin, V. 1, Rietschel E.T., Ed., Elsevier, Amsterdam, 1984, 46 p.

85. Glaser M. Lipid domains in biological membranes. Curr. Opin. Struct. Biol. 1993; 3:475.481.

86. Gedde M.M., Yang E., Huestis W.H. Shape response of human erythrocyte to altered cellpH. Blood 1995; 86: 1595-1599.

87. Godin D.V., Tucker J.M., Garnett M.E. Studies on the interaction of Escherichia coliendotoxin with erythrocyte membranes. Can. J. Pharmacol. 1982; 60: 977-984.

88. Golenbock D.T., Qureshi N., Raetz C.R.H. Lipid A-like molecules that antagonize theeffects of endotoxins on human monocytes. J. of Biol. Chem. 1 991; 266: 1 949019496.

89. Gutsmann T., Schromm A.B., Koch M.H.J., Kusumoto S., Fukase K., Oikawa M., Seydel

90. U., Brandenburg K. Lipopolysaccharide-binding protein-mediated interaction of lipid A from different origin with phospholipid membranes. Phys. Chem. Chem. Phys. 2000; 2: 4521-4528.

91. Gutsmann T., Seydel U. Dual role of LPS-binding protein in neutralization of LPS andenhancement of LPS-indused activation of mononuclear cells. Infection and Immunity 2001; 69: 6942-6950.

92. Gwozdzinski K., Pieniazek A., Sudak B., Kaca W. Alterations in human red blood cellmembrane properties induced by the lipopolysaccharide from Proteus mirabilis SI959. Chemico-Biological Interactions 2003; 146: 73-80.

93. Hadengue A.L., Del-Pino M., Simon A., Levenson J. Erythrocyte disaggregation shearstress, sialic acid, and cell aging in humans. Hypertension 1998; 32: 324-330.

94. Halevy R., Rozek A., Kolusheva S., Hancock R.E.W., Jelinek R. Membrane binding andpermeation by indolicidin analogs studied by a biomimetic lipid/polydiacetylene vesicle assay. Peptides 2003; 24: 1753-1761.

95. Haywood A.M. Characteristics of Sendai virus receptors in a model membrane. J. Mol.1. Biol. 1974; 83: 427-436.

96. Hino Y., Kumashiro R., Sata M., Nihi J., Ogura R., Tanikawa K. Hydroxyl radicalgeneration and membrane fluidity of erythrocytes treated with lipopolysaccharide. Free Radical Res. Commun. 1993; 19: 177-184.

97. Janda J., Work E. A colorimetric estimation of lipopolysaccharides. FEBS Lett. 1971; 4:343.345.

98. Kabir S., Rosenstreich D.L. Binding of bacterial endotoxin to murine spleenlymphocytes. Infection and Immunity 1977; 15: 156-164.

99. Kastowsky M., Gutberlet T., Bradaczek H. Molecular modelling of the three-dimensionalstructure and conformational flexibility of bacterial lipopolysaccharide. J. Bacteriol. 1992; 174: 4798-4806.

100. Kay M.M.B. Aging of cell membrane molecules leads to appearance of an aging antigenand removal of senescent cells. Gerontology 1985; 31: 215-219.

101. Kirikae T., S chade F.U., Zahringer U., Brade HKusumoto SKusama TRietschel

102. E.T. The significance of the hydrophilic backbone and the hydrophobic fatty acid regions of lipid A for macrophage binding and cytokine induction. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1994; 8: 13-26.

103. Kohn L. Relationship in the structure and function of cell surface receptors for glycoprotein hormones, bacterial toxins and interferon, p. 221-222; In Clarke F.H., Annual reports in Medicinal chemistry 1977, vol. 12, Academic Press, Inc., New York.

104. Krauss J.H., Weckesser J., Mayer H. Electrophoretic analysis of lipopolysaccharides ofpurple nonsulfur bacteria. Intern. J. Systematic. Bacteriol. 1988; 38: 157-163.

105. Krauss J.H., Seydel U., Weckesser J., Mayer H. Structural analisis of the nontoxic lipid Aof Rhodobacter capsulatus 37b4. Eur. J. Biochem. 1989; 180: 519-526.

106. Kroner E.E., Peskar B.F., Fischer H., Ferber E. Control of arachidonic acid accumulationin bone marrow-derived macrophages by acyltransferases. J. Biol. Chem. 1981; 256: 3690-3697.

107. Kusumoto S., Fukase K., Kataoka M., Yoshizaki H., Sato K., Oikawa M., Suda Y.

108. Structural b asis for endotoxic and antagonistic activities: investigation with novel synthetic lipid A analogs. J. Endotoxin Res. 2003; 9: 361-366.

109. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature (London) 1970; 227: 680-685.

110. Laude-Sharp M., Haeffher-Cavaillon N., Caroff M. Dissociation between the interleukin1 inducing capacity and limulus reactivity of lipopolysaccharides from gramnegative bacteria. Cytokine 1990; 2: 253-258.

111. Lee A.G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective.1. BBA2003; 1612: 1-40.

112. Leffler H., Svanborg-Eden C. Chemical identification of glycosphingolipid receptor for

113. Escherichia coli attaching to human urinary tract epithelial cells and agglutinating human erythrocytes. FEMS Microbiol. Lett. 1980; 8: 127-134.

114. Leffler H., Svanborg-Eden C. Glycolipid receptors for uropathogenic Escherichia colion human erythrocytes and uroepithelial cells. Infection and Immunity 1981; 34: 920-929.

115. Lentschat A., Ulmer A.J. The internalization time course of a given lipopolysaccharidechemotype does not correspond to its activation kinetics in monocytes. Infection and Immunity 1999; 67: 2515-2521.

116. Lindahl M., Brossmer R., Wadstrom T. Sialic acid and N-acetylgalactosamine specificbacterial lectins of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Adv. Exp. Med. Biol. 1988; 228:123-152.

117. Lindberg A.A. Rought mutants of Salmonella typhimurium immunochemical andstructural analysis of lipopolysaccharides from rfa H mutants. J. Gen. Microbiol. 1980; 116: 25-32.

118. Linns W., Pilgrim C., Feuerstein H. How thick is the glycocalyx of human erythrocytes?

119. ActaHistochem. 1991; 91: 101-104.

120. Lisowska E., Duk M., Dahr W. Comparison of alkali-labile oligosaccharide chains of Mand N blood-group glycopeptides from human erythrocyte membrane. Carbohydr. Res. 1980; 79: 103-113.

121. Liu M.-S., Onji T., Snelgnove N.E. Changes in phase transition temperature ofphospholipids induced by endotoxin. BBA 1982; 710: 248-251.

122. Lynn M., Wong Y.N., Wheeler J.L., Kao R.J., Perdomo C.A., Noveck R., Vargas R.,

123. DAngelo T., Gotzkowsky S., McMahon F.G., Wasan K.M., Rossignol D.P. Extended in vivo pharmacodynamic activity of E5564 in normal volunteers with experemental endotoxemia. J. ofPharmacol. Exp. Ther. Fast Forward 2004; 308: 175-181.

124. Marchesi V.T., Furthmayr H. The red cell membrane. Annual Review of Biochemistry1976; 45:667-698.

125. Masoud H., Lindner B., Weckesser J., Mayer H. The structure of the lipid A componentof Rhodocyclus gelatinosus Dr2 lipopolysaccharide. Syst. Appl. Microbiol. 1990; 13: 227-233.

126. Mayer H., Krauss J.H., Yokota A., Weckesser J. (1990) Endotoxin (Friedman H., Klein

127. T.W., Nakano M., Nowotny A.) pp. 45-70, Plenum Press New York and London.

128. Miller I.R., Bach D., Teuber M. Effect of polymyxin B on the structure and the stabilityof lipid layers. J. Membrane Biol. 1978; 39: 49-56.

129. Momoi T., Tokunaga T., Nagai Y. Specific interaction of peanut agglutinin with theglycolipid asialo GMi- FEBS Lett. 1982; 141: 6-10.

130. Mori A., Okubo K., Kang D., Hamasaki N. A structural study of the carboxyl terminalregion of the human erythrocyte band 3 protein. J. Biochem. (Tokyo) 1995; 118: 1192-1198.

131. Morrison D.C., Oades Z.G., DiPietro D. Endotoxin-initiated membrane changes inrabbit platelets. P. 47-64. In Majde J.A. and Person R.J. Pathophysiological effects of endotoxins at the cellular level. Alan R. Liss, Inc., New York 1981.

132. Mueller M., Schramm A.B., Seydel U. Aggregates are the biologically active units ofendotoxin. J. Biol. Chem. 2004; 279: 26307-26313.

133. Mueller M., Brandenburg K., Dedrick R., Schromm A.B., Seydel U. Phospholipidsinhibit lipopolysaccharide (LPS)-induced cell activation: a role for LPS-binding protein. J. Immunol. 2005; 174: 1091-1096.

134. Murata M., Peranen J., Schreiner R., Wieland F., Kurzchalia T.V., Simons K.

135. VIP21/caveolin is a cholesterol-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 1995; 92: 10339-10343.

136. Murphy S.C., Samuel B.U., Harrison T., Speicher K.D., Speicher D.W., Reid M.E.,

137. Prohaska R., Low P.S., Tanner M.J., Mohandas N., Haldar K. Erythrocytedetergent-resistant membrane proteins: their characterization and selective uptake during malarial infection. Blood 2004; 103: 1920-1928.

138. Nickells M.W, Seya T, Holers V.M, Atkinson J.P. Analysis of C3b/C4b receptor

139. CR1) polymorphic variants by tryptic peptide mapping. Mol. Immunol. 1986; 23: 661-668. J. Biochem. (Tokyo) 1995; 118: 1192-1198.

140. Nikaido H, Takeuchi Y, Ohnishi S.-I, Nakae T. Outer membrane of Salmonellatyphimurium. Electron spin resonance studies. BBA 1977; 465: 152-164.

141. Ohno N, Morrison D.C. Lipopolysaccharide interactions with lysozyme. J. Biol. Chem.1989; 264:4434-4441.

142. OKeefe E, Cuastecasas P. Cholera toxin and membrane gangliosides: binding andadenylate ceclase activation in normal and transformed cells. J. Membr. Biol. 1978; 42:61-79.

143. Onji T, Liu M.-S. Changes in surface charge density on liposomes induced by

144. Escherichia coli endotoxin. BBA 1979; 558: 320-324.

145. Onji T, Liu M. Effect of Escherichia coli endotoxin on the leakage of 14C-sucrose fromphosphatidylcholine liposomes. Circ. Shock 1981; 8:403-410.

146. Osborn M.J. Biosynthesis and assembly of lipopolysaccharide of the outer membrane.1.: «Bacterial outer membranes, biogenesis and functions» (El. Inouye M.), John Willey and Sons, New York 1979; p. 15-34.

147. Pappenheimer J.R. Uber die permeabilitat der glomerulummembranen in der niere.

148. Klin. Wschr. 1955; 33: 362.

149. Peterson A.A, McGroarty E.J. High-molecular-weight components inlipopolysaccharides of Salmonella typhimurium, Salmonella minnesota, and Escherichia coli. J. Bacteriol. 1985; 162: 738-745.

150. Petrova R, Stoev S, Vassileva A, Doukova P, Nicolov N. Surface electric charge oferythrocytes in rebbits during endotoxin shock. Agressologie 1982; 23: 105-108.

151. Piagnerelli M. Alterations of red blood cell shape and sialic acid membrane content inseptic patients. Crit. Care Med. 2003; 31: 2156-2162.

152. Poschl J.M.B, Linderkamp O. Effect of lipid A on the deformability, membrane rigidityand geometry of human adult red blood cells. Eur. J. Clin. Invest. 1992; 22: 625629.

153. Poschl J.M.B, Ruef P, Schnauffer M, Linderkamp O. The effect of different

154. Escherichia coli endotoxins on red blood cell deformability. Clinical Hemorheology 1995; 15: 749-753.

155. Poschl J.M.B, Leray C, Ruef P, Cazenave J.P, Linderkamp O. Endotoxin binding toerythrocyte membrane and erythrocyte deformability in human sepsis and in vitro. Crit. Care Med. 2003; 31: 924-928.

156. Prinetti A, Chigorno V, Tettamanti G, Sonnino S. Sphingolipid-enriched membranedomains from rat cerebellar granule cells differentiated in culture, a compositional study. J. Biol. Chem. 2000; 275:11658-11665.

157. Pugin J, Lee J.-D, Ulevitch R.J, Tobias P.S. Cell activation mediated byglycosylphosphatidylinositol-anchored or transmembrane forms of CD 14. Infection and Immunity 1988; 66: 1174-1180.

158. Qureshi N, Honovich J.P, Hara H, Cotter R.J, Takayama K. Location of fatty acids inlipid A obtained from lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 17023. J. Biol. Chem. 1988; 263: 5502-5504.

159. Raetz C.R.H. Bacterial endotoxins: Extraordinary lipids that activate eucaryotic signaltransduction. J. Bacteriol. 1993; 175: 5745-5753.

160. Rau H, Seydel U, Freudenberg M, Weckesser J, Mayer H. Lipopolysaccharide of thephototrophic bacterium Rhodospirillum fulvum. System. Appl. Microbiol. 1995; 18: 154-163.

161. Rietschel E.T, Sidorczyk Z, Zahringer U, Wollenweber H.-W, Liideritz O. Analysisof the primary structure of lipid A. ACS Symp. Ser. 1983; 231: 214.

162. Rietschel E.T, Brade H, Brade L, Brandenburg K. et al. Lipid A, the endotoxic centerof bacterial lipopolysaccharides: relation of chemical structure to biological activity. Prog. Clin. Biol. Res. 1987; 231:25.

163. Rietschel E.T. Bacterial endotoxins: molecular relationships of structure to activity andfunction. FASEB J 1994; 8: 217-225.

164. Rietschel E.T, Brade L, Shade U. Surface structures of microorganisms and theirinteractions with the mammalian hosts. Weinheim: Verlag chemie, 1998; p.1-41.

165. Rodgers W , Glaser M. Characterization of 1 ipid domains in erythrocyte membranes.

166. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88: 1364-1368.

167. Roth R.I, Levin F.C, Levin J. Distribution of bacterial endotoxin in human and rabbitblood and effect of stroma-free hemoglobin. Infection and Immunity 1993; 61: 3209-3215.

168. Rottem S. The effect of lipid A on the fluidity and permeability properties ofphospholipid dispersions. FEBS Lett. 1978; 95: 121-124.

169. Salzer U., Prohaska R. Stomatin, flotillin-1 and flotillin-2 are major integral proteins oferythrocyte lipid rafts. Blood 2001; 97: 1141-1143.

170. Schromm A.B., Brandenburg K., Rietschel E.T., SeydelU. Do endotoxin aggregatesintercalate into phospholipid membranes in a nonspecific, hydrophobic manner? J. Endotoxin Research 1995; 2: 313-323.

171. Schromm A.B., Brandenburg K., Rietschel E.Th. Lipopolysaccharide-bindingproteinmediates CD14-independent intercalation of LPS into phospholipid membranes. FEBS Letters 1996; 399: 267-271.

172. Schromm A.B., Brandenburg K. The charge of endotoxin m olecules influences theirconformation and IL-6-inducing capacity. J. Immunol. 1998; 161: 5464-5471.

173. Schromm A.B., Brandenburg K., Rietschel E.T. Biological activities of LPSs aredetermined by the shape of their lipid A portion. Eur. J Biochem 2000; 267:20082013.

174. Schroder G., Brandenburg K., Seydel U. Polymyxin B induces transient permeabilityfluctuations in asymmetric planar lipopolysaccharide/phospholipid bilayers. Biochemistry 1992; 31: 631-638.

175. Seamann G.V.F., Cook G.M.W. Modification of the electrophoretic behaviour of theerythrocyte by chemical and enzymatic methods. Cell electrophoresis 1965; N.Y. Ambrose E.I.

176. Seamann G.V.F. Electrokinetic behavior of red cells. In The red blood cell. Surgenor

177. D.M. editor. Academic Press, New York. 1975; p. 1135-1229.

178. Serhan Sakarya, SalahaldinRifat, JieZhou,BannermanD.D., StamatosN.M., Cross

179. A.S., Goldblum S. E. Mobilization of neutrophil sialidase activity desialylates the pulmonary vascular endothelial surface and increases resting neutrophil adhesion to and migration across the endothelium. Glycobiology 2004; 14: 481-494.

180. Seydel U., Brandenburg K. Conformations of endotoxin and their relationship tobiological activity. In: Novotny A., Spitzer J.J., Ziegler E. J. Eds. Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions. Amsterdam: Elsevier, 1990; p. 61-71.

181. Seydel U., Brandenburg K. Supramolecular structure of lipopolysaccharides and lipid

182. A. In: Morrison D.C., Ryan J. Eds. Bacterial Endotoxic Lipipolysaccharides. Bota Racon: CRC Press, 1992; p. 225-250.

183. Seydel U., Labischinski H., Kastowsky M., Brandenburg K. Phase behaviour,supramolecular structure, and molecular conformation of lipopolysaccharide. Immunobiology 1993; 187: 191-211.

184. Seydel U., Oikawa M., Fukase K. Intrinsic conformation of lipid A is responsible foragonistic and antagonistic activity. Eur. J. Biochem 2000; 267: 3032-3039.

185. Seydel U. Chemical structure, molecular conformation and bioactivity of endotoxins.

186. Chem. Immunol. 2000; 74: 5-24.

187. Shands J.W., Graham J.A., Nath KJ. The morphologic structure of isolated bacteriallipopolysaccharide. J. Mol. Biol. 1967; 25: 15-21.

188. Sheetz M.P., Singer S.J. Biological membranes as bilayer couples. A molecularmechanism of drug-erythrocyte interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1974; 71: 4457-4461.

189. Sheetz M.P., Painter R.G., Singer S.J. Biological membranes as bilayer couples. III.

190. Compensatory shape changes induced in membranes. J. Cell Biol. 1976; 70: 193203.

191. Sidorczyk Z., Zahringer U., Rietschel E.T. Chemical structure of the lipid A componentof the lipopolysaccharide from a Proteus mirabilis Re-mutant. Eur. J. Biochem. 1983; 137: 15-22.

192. Spiegel S., Kassis S., Wilchek M., Fishman P. Direct visualization of tedistribution andcapping of fluorescent gangliosides on lymphocytes. J. Cell. Biol. 1984: 99: 15751581.

193. Springer G.F., Adye J.C., Bezkorovainy A., Jirgensons B. Properties and activity of thelipopolysaccharide-receptor from human erythrocytes. Biochemistry 1974; 13: 1379-1389.

194. Tan L., Grewal P.S. Comparison of two silver staining techniques for detectinglipopolysaccharides in polyacrylamide gels. J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 43724374.

195. Tanner M.J. The structure and function of band 3 (AE1): recent developments (review).

196. Mol. Membr. Biol. 1997; 14: 155-165.

197. Teuber M., Miller I.R. Selective binding of polymyxin B to negatively charged lipidmonolayers. BBA 1977; 467: 280-289.

198. Thieblemont N., Thieringer R., Wright S.D. Innate immune recognition of bacteriallipopolysaccharide: dependence on interactions with membrane lipids and endocytic movement. Immunity 1998; 8: 771-777.

199. Thomas D.B. Structural studies on human erythrocyte glycoproteins: alkali-labileoligosaccharides. J. Biol. Chem. 1969; 244: 5943-5946.

200. Troelstra A., Lia A.M. de Graaf-Miltenburg LPS-coated erythrocytes activate humanneutrophils via CD14 while subsequent binding is through CDlllyCD18. J. Immunol. 1999; 162: 4220-4225.

201. Tsai C.-M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in

202. Polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 1982; 119:115-119. • • ^ 1

203. Van Alphen L., Verkleij A. P Nuclear magnetic resonance and freeze-fracture electronmicroscopy studies of Escherichia coli (LPS and LPS-phospholipid complexes). BBA 1980; 597: 502-517.

204. Van Lenten B.J., Fogelmann A.M., Haberland M.E. The role of lipoproteins andreceptor-mediated endocytosis in the transport of bacterial lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1986; 83: 2704-2708.

205. Vaz W.L.C., Almeida P.F.F. Phase topology and percolation in multi-phase lipidbilayers: is the biological membrane a domain mosaic? Curr. Opin. Struct. Biol. 1993; 3:482-488.

206. Warren J.R., Kowalski M.M., Wallas C.H. Effect of alkali-treated lipopolysaccharide onthe intracellular cations of human erythrocytes. Infection and Immunity 1977; 17: 389-394.

207. Warren J.R., Harris A.S., Wallas C.H. Transformation of human erythrocyte shape byendotoxic lipopolysaccharide. Infection and Immunity 1983; 39: 431-434.

208. Weckesser J., Mayer H. Different lipid A types in lipopolysaccharides of photo trophicand related non-phototrophic bacteria. FEMS Microbiology 1988; 54: 143-154.

209. Westphal O., Lüderitz O., Bister F. Über die Extraktion von Bakterien mit

210. Phenol/Wasser. Z. Naturforsch. 1952; 7B: 148-155.

211. Woese C.R. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 1987; 51: 221-271.

212. Wright S.D., Tobias P.S., Ulevitch R.J., Ramos R.A. Lipopolysaccharide (LPS) bindingprotein opsonizes LPS-bearing particles for recognition by a novel receptor on macrophages. J. Expert. Med. 1989; 170: 1231-1241.

213. Yamakawa T., Nagai Y. Glycolipids at the cell surface and their biological functions.

214. Trends. Biochem. Sci. 1978; 3: 128-131.

215. Yoshima H., Furthmayr H., Kobata A. Structures of the osparagine-linked sugar chainsof glycophorin A. J. Biol. Chem. 1980; 255: 9713-9718.

216. Yuan F.F., Bryant J.A., Fletcher A. Protease-modified erythrocytes: CD55 and CD59deficient PNH-like cells. Immunol. Cell. Biol. 1995; 73: 66-72.