Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние полипептида с молекулярной массой 22 КД на свойства клеточной поверхности штаммов возбудителя чумы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Заднова, Светлана Петровна, Саратов



МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИЙ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ "МИКРОБ"

к

Л

/ п /

.1

На правах рукописи

ЗАДНОВА СВЕТЛАНА ПЕТРОВНА

УДК 6-16.981.452+616-093/"098.

"ВЛИЯНИЕ ПОЛИПЕЙТЙДА С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ Ш КО НА СВОЙСТВА КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУШ"

03.00.О?. - микробиология 03.00.04. - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук, ст.н.с. Щербаков А.А. доктор биологических наук, ст.н.с. Коннов Н.П.

Саратов - 1998

СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

ЛИС - липополисахарид;

белок 22 kD (по- - зона на протеинограмме, соответствующая

липептид 22 kD) биополимеру с молекулярной массой 22 kD;

м.к. - микробные клетки;

11-ОКС -- 11 -оксикортикостероиды ;

ПААГ-SDS - полиакриламидный гель с додецилсульфатом

натрия;

п/к - подкожно;

ПАФ - полный адьювант Фрейнда;

РА - реакция агглютинации;

РНАТ - реакция нейтрализации антител;

РИГА - реакция непрямой гемагглютинации;

ЭБ - эритроциты барана;

ЭФП - злектрофоретическая подвижность;

BSA - бычий сывороточный альбумин;

kD - килодальтон;

2МЕ - 2- меркаптоэтанол;

MD ~ мегадальтон;

PBS - фосфатно-солевой буфер;

PBST - фосфатно- солевой буфер с добавлением

Tween-20;

SDS - натрия додецилсульфат;

TEMED - N,N,N,N,- тетраметилэтилендиамин,

- о

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.......................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................11

1.1. Белки клеточной поверхности грамотрицатель ных бактерий с адгезивной функцией как факторы патогенности...........................____.... 11

1.2. Свойства ахромогенных вариантов возбудителя чумы...........................................................29

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................... ...........37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...................37

2.1. Бактериальные штаммы.................................37

2.2. Питательные среды, реактивы, оборудование............38

2.3. Методы исследований.................................39

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АХРОМОГЕННЫХ ВАРИАНТОВ В03БУ-

3.1. Выяснение условий появления ахромогенных вариантов возбудителя чумы........................ 49

3.2. Культурально-морфологические свойства, ультраструктура колоний и чувствительность ахромогенных вариантов к чумным, псевдотуберкулезному, кишечным бактериофагам......................... 50

3.3. Плазмидный профиль и белковый спектр ахромогенных вариантов............................... 62

3.4. Определение электрокинетического потенциала кле-

ток ахромогенных вариантов.....................68

3.5. Изучение иммунобиологической активности ахромо-

генных вариантов............................... 73

ГЛАВА 4. РОЛЬ ПОЛИПЕПТИДА С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 22 кО В

АДГЕЗИВНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАШОВ ЧУМНОГО МИКРОБА.. 75

4.1. Гемагглютинирующая активность вакцинного штамма

Y. pest is EV и ахромогенных вариантов....,...... 75

4.2. Динамика фагоцитарных реакций с перитонеальными макрофагами культуры Y.pestis EV и вариантов, не содержащих полипептида с молекулярной массой KD *а »»«■»■»а»«»*««**«-»«»*««**«»»*''«

4.3. Электронно-микроскопическое изучение процесса фагоцитоза вакцинного штамма и ахромогенного варианта................................................85

ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА. СОДЕРЖАЩЕГО ПОЛИПЕПТИД С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 22 KD.. 91

5.1. Выделение белкового препарата из внешней мембраны штамма Y. pest is EV........................ 91

5.2. Физико-химическая и иммунохимическая характеристика полученного белкового препарата........ 95

5.3. Адгезивные свойства препарата, содержащего полипептид с молекулярной массой 22 kD.........100

5.4. Изучение иммунобиологических свойств препарата, содержащего полипептид с молекулярной массой

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................112

ВЫВОДЫ.................................................... 120

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................121

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. Изучение биологических свойств возбудителя чумы в плане выяснения основ его патогенного действия, иммуно-генной активности является одной из актуальных задач, связанных с диагностикой и специфической профилактикой чумы. Многие исследователи при этом отводят важную роль изучению поверхностных компонентов бактериальной клетки, ее мембранных структур (липополисаха-рид-белковые комплексы, белки). Такое внимание обусловлено высокой функциональной значимостью этих структур в процессах взаимодействия патогенных бактерий с клетками и тканями макроорганизма (Smith,1977;Голубинский с соавт.,1987; Соловьева,1990; Щербаков, 1991;Анисимов,Можаров,1992). Поэтому проведение исследований по обнаружению в мембранных структурах клетки иммунохимически активных макромолекул является важной задачей при исследовании процессов патогенеза и иммуногенеза этой инфекции,

У возбудителя чумы имеется ряд факторов как хромосомной, так и плазмидной детерминированности, связанных с клеточной поверхностью, определяющих его патогенные свойства. К ним относятся: антиген рНб, обладающий адгезивной активностью (Lindler et al.,1990; Водопьянов, 1995) ; капсульный антиген, рассматриваемый как аналог бактериальных адгезинов и фактор, препятствующий фагоцитозу (Сердобинцев с соавт.,1989; Куклева,1996); секретируемые белки Yops (Yersinia outer membrane proteins), которые способствуют диссеминации возбудителя и оказывают антифагоцитарное действие (Leung,Stralеу,1989; Straley, Cibui1,1989); белки, принимающие участие в метаболизме железа (Perry et al. /1990; Sikkema, Brubaker,1989).

В последнее время появились сведения, которые можно рассматри-

с

- о -

вать как указание на существование еще одного белка, играющего определенную роль в проявлении патогенности возбудителя чумы. Так,при исследовании клеточных оболочек двух штаммов возбудителя чумы Y.pestis EV, Y.pestis TWJ и их ахромогенных вариантов, получены важные данные об отсутствии полипептида с молекулярной массой 22 kD в ахромогенных вариантах (Дробышева с соавт., 1990). Из литературных источников известно, что ахромогенные варианты, выделенные из вакцинных штаммов Y.pestis EV и К-1, отличаясь морфологией колоний, проявляли значительное снижение иммуногенности для лабораторных животных (Покровская, 1934; Муравьева, 1969-, Чернова с соавт. ,1974). Имеются сведения об ахромогенном варианте, полученном из вирулентного штамма, который, сохраняя все свойства исходного штамма, в том числе и известные детерминанты патогенности, отличался ослабленной вирулентностью (Классовский с соавт.,1971). Корреляция утраты вирулентности и снижения иммуногенности отмечена у ряда аргининзависи-мых мутантов возбудителя чумы, при этом было показано, что в клетках происходит нарушение синтеза белка с молекулярной массой 23 kD (Гуревич с соавт., 1993; Гуревич и Некляев,1994,).

Можно предположить, что свойства патогенности и иммуногенной активности возбудителя чумы, наряду с другими известными генетически детерминированными продуктами, участвующими в экспрессии этих важных биологических признаков, связаны с наличием полипептида с молекулярной массой 22 (23) kD. Поэтому исследования, направленные на получение сведений о белке с молекулярной массой 22 kD Y.pestis EV являются, несомненно, актуальными.

В связи с этим необходимо проведение комплексных исследований, включающих изучение плазмидного состава, иммуногенных свойств, ге-магглютинирующей активности, белкового спектра, свойств поверхности

(взаимодействия с фагами, измерение поверхностного заряда) культур возбудителя чумы У.реэ1лз ЕУ и его ахромогенных вариантов, отличающихся по функционально-морфологическим признакам.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Изучить влияние полипептида с молекулярной массой 22 kD на свойства клеточной поверхности штаммов возбудителя чумы.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

- получить набор ахромогенных вариантов штаммов чумного микроба, выяснив условия их появления в популяциях культур;

- изучить культурально-морфологические свойства ахромогенных вариантов, ультраструктуру их колоний и чувствительность к чумному, Л-413 С, псевдотуберкулезному, кишечным бактериофагам;

- определить плазмидный состав ахромогенных вариантов, провести сравнительный анализ белковых спектров типичных культур и их ахромогенных вариантов, с одинаковым плазмидным профилем;

- измерить величину поверхностного заряда клеток ахромогенных вариантов в сравнении с Y.pestis EV;

- изучить влияние белка 22 kD на гемагглютинирующую активность культур возбудителя чумы;

- выяснить особенности взаимодействия культур, утративших полипептид с молекулярной массой 22 kD, с перитонеальными макрофагами животных;

- получить из внешней мембраны Y.pestis EV белковый препарат, содержащий полипептид с молекулярной массой 22 kD, изучить его физико-химические и иммунобиологические свойства.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые на семи штаммах чумного микроба показана корреляция ахромогеннос-ти колоний с утратой бактериями полипептида с молекулярной массой 22 kD.

В результате проведенных исследований получены сведения о белке с молекулярной массой 22 kD, принимающем участие в формировании поверхностного заряда клетки, проявлении адгезивных свойств.

Впервые выделен и изучен белковый препарат из внешней мембраны вакцинного штамма возбудителя чумы, содержащий полипептид с молекулярной массой 22 kD, который обладает свойствами бактериального лектина (адгезина).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

- составлены и утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб" "Методические рекомендации по выделению ахромогенных вариантов возбудителя чумы" и "Методические рекомендации по выделению белка молекулярной массы 22 kD из вакцинного штамма возбудителя чумы" (протокол N 10 от 30 декабря 1997 г.);

- штамм У.pestis EV К-8 депонирован в РКПБ ин-та "Микроб" как ахромогенный вариант Y.pestis EV;

- составлена и одобрена Ученым Советом ВНИПЧИ "Микроб" Временная фармокопейная статья на диагностикум эритроци-тарный чумной антигенный (на основе мембранных белков) сухой и жидкий (от 20 марта 1990 г.).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены и представлены на Всесоюзном семинаре молодых ученых противочумных учреждений "Эпидемиология, молекулярная биология, генетика и иммунология возбудителя чумы" (Саратов, 1986) ; ежегодных итоговых научных конференциях РосНМПЧИ "Микроб"; 1-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС) (Саратов,1994); 3 Международной конференции молодых ученых "Актуальные вопросы современной медицины" (Бишкек, 1996 г); молодежной школе по оптике, лазерной физике и оптоэлектронике (Саратов,1997).

1ШЕШШШЦШ.

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения и пяти глав, содержащих обзор литературы, описание материалов и методов исследований, результаты собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками. Список литературы содержит 144 источника, из них 72 зарубежных.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ШНОШШ НА ЗАЩИТУ.

1. Ахромогенность колоний возбудителя чумы коррелирует с отсутствием полипептида молекулярной массы 22 к.О во внешней мембране и не связана с плазмидным составом штаммов возбудителя чумы.

3. Белок внешней мембраны возбудителя чумы с молекулярной массой 22 КБ, обеспечивает его адгезивные свойства (гемагглютинирующую

активность, прикрепление к поверхности макрофагов) и принимает участие в формировании поверхностного заряда клеток,

4. Гель-фильтрация на сефадексе 6-100 позволяет проводить выделение белкового препарата, содержащего полипептид с молекулярной массой 22 кБ, из внешней мембраны вакцинного штамма.

5. Белковый препарат, содержащий полипептид с молекулярной массой 22 кО, является биологически активным веществом со свойствами лектина, обладает гемагглютинирующей активностью и способен вызывать протективный эффект у иммунизированных животных.

ГЛАВА 1, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:

1.1. Белки клеточной поверхности грамотрицательных бактерий с адгезивной функцией как факторы патогенности.

Исследование молекулярной организации и функции поверхностных структур микроорганизмов является важным направлением выяснения основ их биологического действия, вопросов клеточной рецепции и иммуногенеза (Соловьева, 1990).

Мембранные структуры бактерий имеют большую функциональную значимость, поскольку участвуют во многих процессах в клетке среди которых поступление питательных веществ, деление и перенос генетического материала, рецепция бактериофагов и бактериоцинов; они определяют наличие и величину заряда клеточной поверхности, адгезивные свойства и т.д.(Стейниер с соавт.,1979).

При взаимодействии с иммунной системой макроорганизма белки, входящие в состав внешней и цитоплазматической мембран бактерий, вызывают значительные изменения в иммунном статусе животных, поскольку являются одними из главных антигенов на поверхности.

Интерес к поверхностным белкам определяется также их высокой функциональной значимостью при взаимодействии с клетками и тканями макроорганизма, поскольку большинству инфекционных заболеваний предшествует этап адгезии возбудителя на тканях хозяина.

Адгезия или способность прикрепляться к различным поверхностям широко распространена среди микроорганизмов. Для многих бактерий прикрепление - необходимое условие для размножения и увеличения численности популяции. В бактериальной клетке функцию прикрепления

несут субстанции, названные адгезинами (Езепчук,1985).

Адгезины взаимодействуют с поверхностью клетки по типу взаимодействия растительных лектинов, осуществляющих углевод-белковое узнавание. Лектины - белки и гликопротеины, способные к специфическому узнаванию гликоконьюгатов или полисахаридов и обратимому связыванию с ними, без нарушения ковалентной структуры связываемых углеводов (Лахтин,1989). Поскольку, в основе взаимодействия с клеточной поверхностью и у лектинов, и у адгезинов лежит принцип углевод-белкового узнавания, то, с этой точки зрения, адгезины могут рассматриваться как бактериальные лектины. В последнее время исследователи применяют термин "лектины" в широком смысле, используя его как групповое название для белков и гликопротеинов любого происхождения, у которых проявляется специфичность по отношению к углеводным рецепторам поверхности клеток (Линевич, 1979). Одним из ярких представителей энтеропатогенных бактерий, продуцирующих лектины различного вида, является кишечная палочка.

Бактериальные адгезины - компоненты бактериальной поверхности, взаимодействующие с моносахаридами и остатками углеводов в гликоп-ротеидах, полисахаридах на поверхности животных клеток, часто входят в состав органелл - фимбрий или пилей (Езепчук,1985).

Было показано, что фимбрии - это выросты нитевидной формы, отходящие от клеточной поверхности и достигающие размера 4.0-10.0 нм в ширину и 0.5-4.0 мкм в длину. Они обнаружены, в основном, у гра-мотрицательных бактерий, из числа грамположительных найдены только у видов СогупеЬас1ег1а (Реагсе,1978).

Фимбрии классифицируют по морфологии, причастности к гемагглю-тинации, специфичности к определенному виду клеток хозяина, зависимости адгезивной функции от различных углеводов, особенно содержа-

щих D-маннозу.

У некоторых бактерий функцию прикрепления выполняют не фимб-рии, а специализированные фибриллы - адгезины, которые обнаружены у штаммов E.coli , патогенных для человека и животых, а также у некоторых сероваров Salmonella. Фибриллы» выполняющие адгезивную функцию у указанных выше микроорганизмов, не имеют четко выраженной морфологии, а их адгезины вызывают маннозонезависимую гемагглютина-цию (Duguid,1968). Кроме выраженных морфологических структур у некоторых бактериальных клеток, например,микоплазм, в адгезии участвуют специальные образования, не имеющие определенной морфологии (Wilson, Collier,1976).

В основе специфического прикрепления бактерий к клеткам определенных тканей в макроорганизме лежит сродство соответствующих фимбриальных адгезинов к структурам, выполняющим функцию рецепторов. Однако, помимо комплементарного взаимодействия, в адгезии участвуют гидрофобные, электростатические силы, обусловливающее неспецифическое прикрепление бактерий, то есть эффект бактериальной адгезии детерминируется химической природой и молекулярной структурой органелл адгезии (Езепчук,1985).

Пили бактерий часто построены из лектиноподобных белков, которые по специфике реагирования с углеводами, напоминают действие растительного лектина - конканавалина А, рецептируя Д-маннозу либо ее радикалы в составе гликопротеидов. Будучи структурами белковой природы пили имееют выраженные гидрофобные свойства, чувствительны к изменениям температуры, pH, ионной силы, легко разрушаются под воздействием детергентов и протеолитических ферментов (Маянс-кий с соавт.,1986).

Помимо специальных органелл, бактериальная клетка может прик-

реплятся к поверхности животной клетки и с помощью белков наружной мембраны (Овод,Вершигора,1982).

Один ив видов адгезинов - гемагглютинины - субстанции, опосредующие прикрепление к поверхности эритроцитов и �