Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Yersinia pestis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Yersinia pestis"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СШИТАРПО-ЗШЩШИОЛОГНЧЕСЖОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЦДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ НАУЧКО-ИССЛДП.ОВАТЕЛ ьский ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ 'МИКРОБ"

На праэах рукописи

ВИДЯЕВА Надежда Андреекма

УДК 616.931.452 + 57724

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ, КОДИРУЕМЫХ ПЛАЗМПДОЙ КАЛЪЦИЙЗАВИСИМОСТИ YERSINIA PESTIS

03.00.07 - микробиология

г

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации не соискание ученой степени кандидата биологических иаук

Саратов•1992

ГОСУДАРСТВРЧНЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНОЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИРОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ "Д'ИКРиБ*

На правах рукописи

ВИДЯЕВА Надежда Андреевна

УДК 616.981.452 1 57724

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ, КОДИРУЕМЫХ ПЛАЗМИДОЙ 1Ш1ЬЦИЙЗАВИС1ШОСТИ YERSINIA PESTIS

03.00.07-микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-1992

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском

противочумном институте Российской Федерации.

"Микроб"

Госкомсанэпаднадзора

Научные руководители:

доктор" биологических наук ьанди^т медицинских наук

Коннов Н.П. Кутырев В.В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Вейнблат В.И.

доктор биологических наук Панасенко В.И.

Ведущая организация:

Институт Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф.Гамалея РАШ.

л 30

Защита состоится * 25 " ноября 1892 г. в 3 часов на заседании Специализированного Совета Д 0743201 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Госкомсанэпиднадзора Российской Федерации (410071 "аратов. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб"

Автореферат разослан 1092 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук, Коркеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность пппблвим. Чумной микроб (Yersinia' pest is) является возбудителем одного из самых onaci^x инфекционных заболеваний человека и яивотных с природной очаговостью. Другие представители рода Yersinia - Y .pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. вызывают хронические кишечные инфекции, получившие в настоящее вредя кирокое распространенно. Совершенствование мер диагностики, профилактики и борьбы с этими заболевания!® тесно связано с изучением молекулярных основ вирулентности их возбудителей.

Известно, что ведущая роль в вирулентности иерс'ний, вызывающих различные по тяжести заболевания, принадлеяит продггктам плазмид кальцийзависимости - 45-47 ЦЦ (Gemski et al., 1980; Gemski, Lazere, Casey, 1880; Zaik et al., 1S80; Ferber, Brubaker, 1081; Portnoy, Falkow, 1681; Portnoy. et al., 1983). Эти гогазмиды кодируют свойство зависимости роста при 37°С от присутствия в среде ионов кальция, синтез V и И антигенов, а также ряда белков внешней мембраны (БВМ или Уорз - Yersinia Cuter membrane proteins). Последние Ехспрессируптся при 37°С культивирования бактерий в отсутствие в среде иоьов кальция (Portnoy, Moseley, Falkoi?, 1931; Bolín, Portnoy, Woif-Watz, 1685; Perry et al., 1986; Straley, Bowmer, 1087).- У возбудителя чумы, выращенного in vitro, Yops во внесшей мембране не обнаруживаются (Straley, Brubaker, 1081; Saidple, Brubake", 1987) в результате их быстрой посттрансляционной деградации протеолитическим ферментом - фибринолизином, кодируемым уникальной для У.pest is плазмидой пестициногенностк - б МД (Sodiende, Goguen, 1988; Sodiende et al,, 1988). Отсутствие экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых п.:азмвдой кальцийзависимости (pCad), у возбудителя чумы in vitro затрудняет их изучение. Вместе с тем, исследование этих

полипептидов <еат важное значение для установления их роли в г;грулентности чумного микроба и возможного их использования для создания диагностических и «рсфилактических препаратов. Сравнительное изучение кодируемых плазмчдами кальцийзависимости белков у трах близкородственных видов иерсиний может позволить установить причину различного течения заболеваний, вызываемых этики микроорганизмами.

Lia ль работы. Целью работы явилось изучение экспрессии

бет-сов, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Y. pest is.

«

Ос.нпвнш аялачи исследования.

1. Создать модель для изучения продуктов, кодируемых собственными плазмидаыи чумного микроба.

2. Определить оптимальные условия культивирования возбудителя чумы in vitro, обеспечивающие счспрессизо плазмкда кальцийзависимости.

3. Идентифицировать детерминируемые pCad полипеппда в клетках чумного микроба.

4. Иссльдовать деградацию БВЫ в клетках Y.pestia и Y pseudotuberculosis под влиянгэм шзазмида пестициногешгасти (pPst) и определить ее свяяь о вирулентностью.

5. Получить в чистой виде препараты белков внеанай мембраны и V-антигена.

Научная новизна. В результате выполнения работы получены следующие новые данные:

- создала удобная модель для исследования экспрессии антигенов, кодируемых собственными ппазмидаии чумного микроба, методом имиуЕоблоттинга, которая включает набор изогенных штаммов возбудителя чумы, состояпрй из моно- и биплазмидаых производных с различным сочетанием плазмид; модель позволяет

идентифицировать продукты отдельных плазмид, определять их топологии в клетке и выявлять взаимное влияние плазмидных генов;

- впервые установлено, что оптимальными условиями для экспрессии бет:оз внесшей мембраны, кодируемых pCad, адекватными условии! in vivo, являются температура 37°С и наличие с среде культивирования 20 нЫ ионов магния без ограничения ионов кальция; в этих условиях во внеиней ме»"5рано обнаруживаются полипептида с молекулярными массами 75, 40, 40, 32, 25 кД и ряд минорных белков, а в цитоплазме и кутьтуральной среде - V антиген;

- показано, что реакция на температуру культивирования и содержание ионов магния в среде у ионоплазмидных производных (вирулентного, авирулзнтчого, вакцинного) У.pest is имеет' штаммоЕыэ различия;

- выявлено, что деградация pCad-кодируемых белков "нешней мембраны Y.pestis и У.pseudotuberculosis, обусловленная плазмидой пестицзшогенности, не связана с их вирулентностью;

- впервые показано, что белок внешней мембраны возбудителя чумы 46 кД является антигеном, перекрестнореагирущим с клетками тканей человека.

'Практическая ценность. По результатам работа составлены методические рекомендации "Идентификация белков, кодируемых плазмидой Са2+ -зависимости возбудителя чумы, методом иммуноблота", которые одобреш Ученым Советом ВНИПЧИ "Микроб" (протокол N 12 от 20 июня 1089 г.) и утверждены ^-{ректором ВНИПЧИ "Микроб" по учрежденческому уровню внедрения. Методические рекомендации "Выявление белков, кодируемых собственными плазмидами чумного микроба, методом иммуноблоттинга" утверждены начальником главного эпидуправления Минздрава СССР от 25.7.90. по союзному уровню внедрения.

Разработанные метода лэские прие ¡и используются в ■ работе лаборатории РНИПЧИ "Микроб" и НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им. Н.Ф.Гамалея РАМН СССР.

Видвлеки препараты белков внешней мембраны и У-антигена, которые могут быть использованы для получеш..; моноспецифических антисывороток и моноклональных антител

Основша положения, вшоаша иа эаздвту-

1. Разработана модель для идентификации антигенов, кодируемых собственными плазмидами возбудителя чумы, которая включает ионо- и биплазмидные штаммы и антисыворотки к

г

продуктам отдельных плазмцд.

2. Наличие в питательной среде 20 мН конов магния без ограничения иоиов кальция при 37°С обеспечивает оптимальные условия, а^чкватные условиям для экспрессии белков внешней мембраны и V антигена.

3. Деградация белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависшости, происходит под влиянием плазмиды пестищшогенности в клетках К.рэй^я и l'.p.?oucíoíui)0^•ca^ зis, но не обеспечиваем высокий уровень вирулентности.

4. Бег чс внешней ыембраны возбудителя чуш с молекулярной кассой 46 кД киает общи© антигвшшо детерминанты с белками тканей человека.

Аппобягт р^ботц. Материалы диссертации долоясены и представлены на Всесоюзном семинаре колодах ученых противочумных учреэдеииЙ "Молекулярная биология и генетика возбудителей особо опасных инфекций" (Маркс, 1082); Всесоюзном рабочем совещании "Биохимия клеточной поверхности грамотрицательинч кикрооргаикзмав (Саратов, 1934); Всесоюзных конференциях "Иерсишгазы" (Владивосток, 1989), "Регуляция микробного метаболизма" (Пущжо-на-Она, 1959), "Плазшда-ХП"

(Нальчик, 1990); V международном симпозиума по нерсиЛлям (Токио, 1080); "Генетика а биохим, вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград,1692), ежегодных итоговых научных конференциях РНИПЧИ Микроб" (1660-1902).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том чиста одни методические рекомендации изданы 'брошюрой.

Структура диссертации. Диссертация изложена ка¿(Устраницах машинописи, состоит из оглавления, введения, двух глав обзора литературы, описания материалов я методоэ исследований, илти глав собственных исследовак Л, заключения, вызодов. С.лсок литературы включает работы 210 авторов. Текст иллюстрирован 5 таблицами и 24 рисунками. • '

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

15АТЕРКАШ и шщц.

Исследования били проведены на 31 штамма У.post is различного происгсяденкя, 5 втамках У.pseudotuberculosis, 2 штаммах У.enterocolitica, ' 2 нтакмах Escherichia coli и одном штамме Salmonella typhimriua. ^

Бактерю! выравнивали in vitro в течение б часов при 28°С и 18 часов - при 37°С, либо в течение суток - при 28°С. В качестве сред культивирования использозали бульон Хоттжгера: без добавок - БХ, обработаз-шй Na-оксалатом и дополнегчый 20 нМ Mg2+ - MgOBX, и С добавлением 20 мЫ Mg2+ - MgB.X. Для вырандавания возбудителя чумы в условиях in vivo использовали метод В.И.Илюхина с соавг. (1978).

Бактериальные клетки фракционировали ■ по M.Achtisan et al. (1078). Для электрофоретического анализа белков, использовали

методики 'т.К.1аевшЦ (1070) и В.Гл^епЬегд а1. (1075). Изучение белк в методом иммунобллттинга проводили по Н.ТоиЫп et Л. (1«79) . и И.Н.Вигпеие (1981) с собственными модификациями.

Для получения .антисывороток использовали моноплазмидные впамиы чукнзг > микроба 358/24 (рГай358), КЫ217 (рСасЮТ), КМ225 (рГгаЕУ), КМ216 (рРв1Е\0. Абсорбцию полученных антисывороток осуществляли бесилазмидшми производными этих же штаммов.

Ант: гены тканей человека и антисыворотки к ним были любезно предоставлены нам доктором медицинских наук Л.Н.Шаниной.

Экспрессию гибридных плазмид изу-али в миниклетках (Булгакова и соавт , 1987).

Определение пестициногенной активности штаммов чумного микроба проводили в соответствии с "Руководством по профилактике чумы" под ред. проф. Н.И.Николаева (1972).

Фибршолитическую активность выявляли на плотной питательной ~реде с фибрином, предложенной В.В.Кутыревым (1980).

Вирулентность определяли при подкожном заражении белых мышей н морских свинок по показателю Ы50. (Ашарин, Воробьев, 1962)

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

экспрессия ашигейоь, кодируемых пяа?шщаш! возбудителя

. чущ. '■ . '

Идентификаодя белков возбудителя чума, содержащего три характерна для пего пяазмзда (рРай, рСай и рРга) методами электрофореза в полиакрилашздком "геле- и иммуноблотткнга ослоааяется тем, что кодируемые этими'.плазмадами продукты находятся во взаимодействии друг с другом и с продуктами

некоторых .фомосокных генов (Brubaker, 1969; "Sample, Flower, Brubaker, 1037; Socioinde et al., 1988), Кроме чого, необходимые для иммуноблоттинга антисыворотки, которые получены иммунизацией животных штаммами Y.pertis, несущими три собствеюше плазмиды, содержат антитела ко всем плазмидным продуктам что затрудняет их идентификацию. Эти обстоятельства привел!, нас к необходимости поиска оптимальной модели длг. изучения экспрессии антигенов собственных плазмид чумного микроба и их производных.

Модель была разработана* на основе авторской коллекции изогенных производных вакцинного штамма Y.pestis EV (pPst+ pCad+ pFra+ Pgm"), полученной в лаборатории профессора О.А.Проценко. Эта коллекция cocto.it из исходного штамма EV, бесплазмидного, трёх мопо- и трех биплазмидных производных с различным сочетанием собственных плазмид. Моноплажмидные производные и исходный штамм EV использовали для получения антисывороток, которые мы обозначили анти-pPst, анти-pCad, анти-pFra, анти-EV. Методом иммуноблоттинга показано, что антисыворотки, полученные иммунизацией кроликов моноплазмидными штаммами, были более эффективны, чем анти-EV. Они обладали специфичностью, поскольку содержали антитела только к продуктам, кодируемым соответствуюпщ.д плазмвдаыи, и имели более высокий рабочий титр.

С помоцыэ анти-pPst выявляли два белка во внешней мембране моноплазмидного штамма, содержащего плазмиду пестщпногенности, которые являются фибринолизином (37 кД) и пла^мокоагучазой (35 кД), связанными, как известно, с внешней мембраной (Straley, Brubaker, 1982; Sodiende, Goguen, 1B88). В цитоплазме этого же штамма обнаруживались два полипептида, один из которых по молекулярной масса соответствовал пестацину - 45 кД (Ни et al., 1972; Ни, Brubaker, 1974), второй - фибринолизину. Наличие фибринолиэина в цитоплазме было под' юрадеио методом анализа

клеточных фракций на плотной питательной средо с фибрг"'ом. В отличие от моноплазмидного штамма, в исходном ЕУ и в штаммах, которые поми.о рРа1 несли ррга или рСа<1, наблюдалась твмпьратурозечисимая регуляция биосинтеза одного или обоих полипептидоз. Это свидетельствует о тог что эксгрессия плазмиды пзстициногенности зависит от влияния других решшконов, ■ что необходимо учитывать при изучении детерминируемых ею продуктов.

.нтигены, кодируемые плазмидой рРга, регистрировались при Э7°С вымащивания в цитоплазме и в культуральной. среде. Полипептид с молекулярной массой 18-20 кД являлся субъединицей антигена "Суакция 1", так как мигрировал на одном уровне с очищенным препаратом этого антигена. Помимо него, в цитоплазма выявлялся полипопт: д с моле^лярной массой около 63 кД, который соответствовал "мышиному" токсину (Черепанов с соавт., 1091) -второму известному антигену, структурный ген которого находится на фракционной плазниде (Процонко и соавт., 1883). Существенного влияния рСай и рРзЬ на экспрессию антигенов, кодируемых шк-лидой рГга, на обнаружено.

Анти-рСа<1 выявляла белки, детерминируемые плазмидой кальцайзависиыости, в моноплазмидком (рСа<1+) и биллазмидном (рСай+ рРга+) производных, но по обнаруживала их в итакие, содерваацем две плазмэды ' рСас! рРеЬ, что свидетельствует о влиянии рРеЬ на окспресскю генов плазищы кальцийзавискдасти. 5га рос,льтаты находятся в соответствии с данными ряда авторов

о деградадирувдем влиянии продукта плазиида рРе1 ■ <

.фибринолизк.а, на болхи внекией ыембршы, кодирускко рСа:1 (Баср1о, ВгиЬакег, 1Ш7; 5аЕр1е, ¥1опег. ВгиЪакег. 1037; 8ос1е1ш}е оЬ а1., 1938). 'Однако, прккзкшюз анти-рСай давало возможность, ваявлять следы Са^-зависиках белков в неходкой игаьага ЕУ, у которого- присутствие плазмэд: постицииогенности приводило к еначительиому 'сняжокгао экспрессии ВВМ. что но

позволяло регистрировать их с помочью анТя-ЕУ. Это также свидетельствует о больше!! эффективности антн-рОас! по сравнешаз с анти-ЕУ.

Таким образом, нами покаьано, что с помощью моноплазмидных штаммов и антисывороток к ним можно идентифицировать продукты, детерминируемые собственными плазмидами возбудителя чумы, что позволь зт избегать опибок, которые могут возникнут:. ь результате взаимного влияния плазмидаых и хромосомных генов на экспресс;» кодируемых ими белков. С другой стороны сочетание этих антксывороток и штаммов о различным набором плазмил дает возможность исследовать регуляцию экспрессии антигенов, детерминируемых плазмидиыми и хромосомный! генами. По результатам этого раздела работы были составлены методические рекомендации "Выявление белков, кодируемых собственными плазмидами чумного микроба, методом ши-суноблотткнга".

экспрессия и локализация ашигигов ИЕРСИНИЙ, К0ДИРУШ1Х шхазудцой Са2+ -зависимости. .

Белки внешней мембраны,и V антиген синтезируются в клетках возбудителя чумы в условиях клето'шого стаза, который наступает при 37°С культивирования в отсутствие а среде выращивания ионов кальция. Однако, на примера возбурпаля псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоэа было показано, что в зависимости от применения бедных или богатых сред, эти белки .могут синтезироваться, но не включаться во фракцию внешней мембраны, а локализоваться в цитоплазме, либо выделяться в куль-уральную среду (ВоПп, Рогйпоу, ИоП-Шг, 1085; Неевевапп еЬ а1, 1080).

Следующим этапом нашзй работы было определение оптимальных условий экспрессии и локализации рСа<1-кодируемых белков. В экспериментах использовались моноплазмндныа (рСа<1+) штаммы чумного микроба с различными исходными характеристиками: 358/24 - производный вирулентного штамма 358, КМ217 получен Но

вакцинного ЕУ, РКР133/5 - трансформакт авирулгчтного бесплазмидього штамма PKR133 и их бесплазмидные варианты.- Для идентификации полипептидов í"\ иммуноблоте применяли антиоыворотк' полученную иммунизацией кроликов штаммом Y. pest is 358/24 (p"ad358) и абсорбированную его бесплас «адным производным.

Методом иммуноблоттинга у всех трех штаммов идентифицированы 5 мажор.¿к белков с молекулярными массами 74, 46, •'.J, 32 и 25 кД, отсутствутадиз у их бесплазмидаых вариантов. Эти белКд. были обозначены БВМ 1-5, соответственно. По величине молекулярных масс полипептиды БВМ 2-5 были аналогичны описанным в литератур» белкам внешней мембраны Yops 2-5 (Bolin et al., 1085, 1088), а БШ 1 - Yop F (Straley, tíovmer, 1986). Кроме указанных белков во внешней мембране изучаемых штаммов выявлялись следы V антигена и около 12 минорных полипептидов, что соответствует литературным данным {Straley, 1988; Brubalcer, 1091). Основная масса V антигена локализовалась в цитоплазма и культуральной среде. Это согласуется с полученными ранее рядом уторов результатами о локализации V ант'тена в цитоплазматиче~кой фракции и его активной секреции в среду выраидаванир (Lawton et al., 1934; Straley, Brubaker, 1981; Sugiyasa et al., 1987). БЕМ 1-5 также идентифицировались в цитоплазме и культуральной среде. Ранее рядом исследователей было показано, что у возбудителей кшочного иэрсиниоза н псевдо1/беркулеза БШ обнаруживаются в цитоплазме, а псе три вида иерсиний способны секретировать их в культуральную среду (Heesemarai ot al., 198S'; Yíolf-Watz, 1937; Bolín et al.,1988). Наш данные показали, что. у чумного микроба белки, детерминируемые pCad, та»;® выявляются в цитоплазме. Таим образом, установлено, что у У.post is, та:ко как и у дзух других видов Yersinia, БВМ локализуются во фракция.: вившей мембраны, цитоплазма и культуральной среда.

Для изучения влияния условий культивирования на экспрессию белков внешней мембраны рСа<1+ штаммы чумного микооба и их бесплазмидные варианты выращивали на трех различных средах, приготовленных на основе бульона Хоттингера: БХ, М^БХ и М®БХ. Было показано, что оптимальным условием -для синтеза рСай-завискмых белков является культи^лрование бактерий при 37°С в бульоне Хоттингера с добавлением 20 иМ Мз2'1'. Эта среда содержит Са2+ в количестве, достаточном для обеспечения умеренного роста кальцийзависимых штаммов при 37°С. Наши даккьгз показызают, что синтез белков внеиней мембраны происходит в условиях, когда не .прекращается, но значительно замедляется вегетативный рост бактерий,. и для ия экспрессии нет необходимости создавать дефицитную . по ионам кальция сре/7 культивирования, так как присутствие в ней 20 мМ обеспечивает биосинтез

кальцийзаЕисимых белков внешней мембраны возбудителя чумы.

В результате проведенных исследований были обнаружены штакмовыо различия в экспрессии белков, детерминируемых рСай, в зависимости от температуры выразцивания и содержания ионов кальция и магния в среде. Наиболее чувствительным к изменениям условий культивирования был штамм У .¡лзИ а 358/24, у которого в культуральной среде,, цитоплазме и внешней мембране эти бе^ки выявлялись только при 37°С культивирования и только на среде МдБХ. У штамма !Ш217 тапература выращивания и содержание ионов магния в среде оказывали скорее количественное, чс-м качественное влияние на экспрессию рСас!-зависимых бе.^ов. У штамма РЖ 133/5 температура культивирования влияла только на белковый спектр цитоплазмы н культуральной среда (некоторые белки не экспрессироваяиоь при 28°С выращивания). Во внешней мзмбраке ©того штамма БВМ обнаруяивались при обоих температурах культивирования, но добавление в среду выращивания 20 мМ при 37°С усиливало их экспрессию. Различия а реакции на тегпгературу и среду инкубации у итаммсз 1Ш217 и 358/24 могут быть результатом того, что плазкида Са2+-зависимости из этих двух штаммов, по данным рестрикционного картирования, несколько

отличаются друг от дгуга (Кутырев и соавт., 1Q88). й:ое объяснение может быть для обнаруженных различий в экспрессии детерминируемых pCad белков у штаммов 358/24 и PKR133/5, так как последний содержит плазмиду кальцийзавйсимости, которая была выделена из -штамма 358/24. Изменение в реакции на температуру и содержание ионов магния в среде у шта: да PKR133/5 может быть следствием гнедрения Тп5, которым была маркирована плазмцда для удобства отбора трансформантов, или результатом влияния хромосомных гонов нового хозяина на биосинтез белков, кодируемых плазмидой Са"*+-зависимость. .

. • Анализ белков внешней мембраны Y.pseudotuberculosis 65 и Y.enterocolitlea КМЗЗ, проводили с помощью антисыворотки, полу ганкой имыушгаацией кроликов моноплазмидаь-^ штаммом У. post is 358/24. В наших экспериментах не было обнаружено значительных отличий от экспрессии кодируемых pCad белков чумного микроба.

Таким ' образом, существенную роль в экспрессии pCad- ' оаЕкскшх балков внешней мембраны иеосшшй, также как ' V-антигена, играют температура 37°С и наличие в среде выращивания 20 мМ Mg2+ (или соотнопеиие ионов Са2+ и . Эти данные были подтверждена при исследовании двух штаммов Y.pestis 358/24 и PKR133/5 в условиях культивирования и? in vivo. Такой способ был избран в связи с тем, что, по данным R.Brubaker (1972), концентрации ионоз кальция к магния во внеклеточном содержимом макроорганизма составляют 2,5 иЫ и 20 мМ, соответственно. С этой целью, в бршную полость кроликов помещали полупроницаемые камеры, заполненные бактериальной суспензией. Методом . шеукоблоттиига во внешней мембране этих штаммов обнаруживались ' те же пять белков с молекулярными массами 75. 46, 40, 32 и 25 кД, что и 'при культивировании in vitro. V антиген выявлялся в . V экссудате катодом иммукодиффузии по Ухтерлони с коммерческий лошадиной V-антисывороткой.

Следовательно, мы показали, что при культивировании in vitro температура 37°С и содержание 20 мМ в среде

выращивания обеспечивают условия, адекватные условиям in vivo.

IS

При этом кодируемые плазмидсй кальцийзависимости белки детектировались во внешней мембране у всех трех видов иерскний в условиях культивирования in vitro через 18 часов после переноса культур с 28°С на 37°С. Эти результаты расходятся с данными Н.Wolf-Wats (1087) о невозможности детектировать ^Cad-зависииые белки во внешней мембрЕ-.ie Y. pest is при длительном выращивании бактерий при 37°С. Вероятно, это связано с тем, что мы использовали моноплаэмидныэ итаммы чумного микроба, в то время как штамм Y.pestis ЕV, с которым работал H.Vfolf-Vía.z, содержит все характерные для возбудителя чумы., плазмиди. Присутствие pPst, по данным А.К Saaple и R.R.Brubaker (1987). оказывает деградирухгцзе влияние на БВМ. По мнению этих авторов протеолиз белков внешней мембргчы и появление их в культуральной среде может играть важную роль В патогенеза чумной инфекции. Поэтому, было интересна установить, будет ли деградация БВМ, вызванная передачей плазмида пестицаногенностк в ытамм возбудителя псевдотуберкулеза сопровождаться повышением его вирулентности, а тягает изменится ля белковый спектр внешних мембран и В1фулз1шгоста диких ктаммов Y. pest is, которые исходно кэ содержат pPst. Эта работа Сила проведена ira двух штаммат Y.pseudotuberculosis (С5 и 831), двух дихлх. ктаммах Y.pestj<¡ (А250 я 6499), экспериментальна тщчешазм птаиме КМ219 и их трансформаитах .

Raroi зкеперимзята показали, что в птаммах возбудителя псевдотуберкулеза з присутствии плазз-зда нествцщюгентс-г! ко обнаруживаются бетзеа, кодяруежэ плазкядоЗ кальцийзавискшста. Однако, деградация белкоэ кз только па вркводаяа к поежекш вирулентности коуч"?2Î7SS втаккоз. по дагэ называла значительною еЭ снижение.

Данине, волучеидоэ при изучают штаммов возбудителя чуш, также СЕИдвтельстсрот о пгльэу отсутатЕия связи протеолпэа БЕИ с высокой Еяруяватпостиэ. В птакм-s КМ219 и 6499, трансформированных pPst, pCad-кодируе».г.гэ йолкя внешней кекбрага но выявлялись. При.этом у птамка 1Z'2W/Í (pCsâ pPst) отмечено

повышение вирулентности в 5,8 раз для белых мышей и морских свинок. Но в штамме А250/1 присутствие pPst ле оказывало двградшэущего влияния на БВМ, а вирулентность этого штамма возросла в 1,5 раза для белых мышей и в 32 раза для морских свинок. Отсутствие связи между деградацией БВМ в присутствии фибринолизина и вирулентностью свидетельствует в пользу с. дествукмго предположрчия о том, что протеолиз белков внешней мембраны является результатом культивирования возбудителя чумы in vitro (Sodiende et al., 1988).

ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ГИБРДЦШШ Ш1АЗЩДАЩ, СОДЕРЯАЩМ ФРАГМЕНТЫ pCad ЧУШОГО МИКРОБА.

Для выяснения функциональной роли отдельных белков, кодируемых плазмидой кальцийзависимости, было проведено-изучение экспрессии зонированных фрагментов этой плазмиды. В работе использовали гибридные плазмиды с клонированными 5-ым и' 7-ым Hindlll фрагментами pCad358 (Н5 и Н7, соответственно) в составе вектора pER322 (Кутырев и соавт.,1988; Филиппов и соавт.,1691). Идентификацию белков проводили в системе минлклеток с использованием [^^lS-метиошша в качестве метки. Анализ полученных радиоавтографов показал, что 7-ой Hindlll фрагмент кодирует синтез 4-х полипептидов - БВМ 3, V-антигена к белков с молекулярными массами 18 и 13 кД, которые, по-видимому, являются цитоплазматичесними регуляторными белками LcrG v LcrH (Perry et al., 1989). Н5-фрагмент содержит структурные гены трех белков - ЕВМ 2, и полипептидов с молекулярными массами 31 и 28 кД. Белок 31 кД идентифицирован нами как YopJ (Straley, 1988). Полученные данные были использованы для уточнения положения фрагмента Н5 на генетической карте pCad358, создания молекулярного зонда на основе клонированного Н7-фрагмента для идентификации возбудите..ей чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсшшоза (Кутырев и соавт., 1989), а также для изучения роли БВМ 2, структурный ген которого входит в состав Н5-локуса, в

устойчивости чумного микроба к фагоцитозу перитонеалыь»мн макрофагами (Филиппов и соавт., 1691).

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ.

Важной практической задачей настоящего исследования было получение чистых препаратов бе"ков внешней мембраны и V антигена. Выбор моноплазмидных штаммов для изучения экспрессии белков Са2+-зависимости и подбор оптимальных условий для их экспрессии позволил нам регистрировать эти белки so внешней мембране методом электрофореза в подиакриламидном геле с последующей окраской белков кумасси R-250. Это дало нам .возможность успешно использовать окрашенные гели для получения чистых препаратов БВМ и V антигена. Экстракцию белков проводили путем электроэлшии на приборе Extraphor 2014 (LKB, Швеция). Для выделения белков а препаративных количествах использовали электрофоретическую камеру для ф^р^за в трубках (LKB 2001, Ьвеция) с небольшими модификациями. Этим способом из фракции внешней мембраны были наделены БВМ 1-5, а из цитоплазмы - V антиген. Из 1 литра бактериальной культуры было получено по 12 нг каждого белка. Элвированныэ пч/липептвды обладают достаточной степенью чистота, сохраняют. свои антигенные свойства и могут быть использованы для получения., моноспецифических антисывороток и моноклог1льных антител.

ПЕРЕКРЕСТНО - РЕАГИРУЮЩИЕ АНТИГЕНЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУШ И ЧЕЛОВЕКА.-

В 1945 году H.H.Куков-Вережников высказал предположение о низкой степени чужеродксстн возбудителя чумы для организма человека, которая может быть обусловлена существованием антигенов, общих для Y.psctis и человека. Слабое антигенное раздражение монет.способствовать неуязвимости возбудителя чумы для защитных механизмов хозяина и дава-ь ему возможность бес-препятствеино размножаться в организме последнего ( H.H.Жуков-Березников, 1945; Нукоэ-Взрежглкса и соавт., 1972) С другой стороны, присутствие общих антигенных детерминант у возбудителя

чуш zt в клетках тсаней человека ответственно за образование в организме хозяина аутоанител, которые играют зна-ительную роль в развитии многих аутоиммунных заболеваний и поствакцинальных осложнений. "

Учитывая существенную роль продуктов плазмиды кальцийзависимости в вирулентности yersinias, мы поставили перед соб:й цель изучить методом иммуноблоттинга белки внешней мембраны, кодируемые pCad Y.past is, с точки зрения их возможного антигенного сходства с тканями человека. Кроличьи антисыворотки, полученные к тканям печени и селезерки человека, а также анти-рСас! содержали антитела к белку внешней мембраны чумного мшсроба с молекулярной массой 46 кД.

ДЕа антигена в клетках тимуса и один в селезенке с молекулярными массами около 14 кД "узнавались" всеми изученными антисыворотками, в том числе и анти-рСай.

Антисыворотка к клеткам печени человека реагировала (помимо перечисленных) с низкомолекулярными антигенами внешней мембраны Y. pest is, аналогов которым среди изученных антигенов человека нами не обнаружено. В то та время, положение этих антигенов на имгуноблоте было характерным для электорофорети-ческой картины разделения лило полис ахарида возбудителя чумы.

Наш данные, полученные с помощью молекулярных методов исследований, позволили не только подтвердить выявленное ранее существование гетерогенных антигенов, общих для возбудителя чумы и клеток тканей человека (Гончарова и соавт., 1В77; Бочко, Некляев, 1979), но и идентифицировать их. Это открывает пепспективу выяснения роли конкретных перекрестнореагирухяцих антигенов • во взаимоотношениях возбудителя чумы с макроорганизмом.

Чаким образом, в результате проведенных исследований бь"ш определены оптимальные параметры экспрессии продуктов плазмидь кальцийэечисимости, создана система для их изучения, а также получе ш новые сведения о .полипептидах, детерминируемых это? плаамидой.

ВЫВОДЫ

1. Moho- и биплазмидныэ штаммы У.post is и антисыворотки, содержащие антитела к продуктам отдельных плазмид, составляют удобную систему для исследования экспрессии и взаимного влияния плазмидных генов методом имчуноблоттинга.

2. остановлено, что добавление в питательную среду 20 мМ ионоз магния создает оптимальные условия для экспрессии продуктов плазмида кальцийзавнсимости при 37°С, адекзатныз условиям in vivo.

3. Идентифицирован ряд антнгеков, кодируема плазмидой кальцийзависиыости возбудителя чумы: белки внешней мембраны с молекулярными массами 74, 46, 40, 32 и 25 кД (БВМ 1-5, соответственно) и цитоплазматиче^кий белок с молекулярной массой 38 кД (V-антиген)-.

4. Показано, что деградация БВМ, обусловленная присутствием плазмида пестициногенноста, происходит не только в клетках Y.pestis но и трансформантах Y,pseudotuberculosis. При этом установлено, что явление деградации БВМ не является атрибутом высокой вирулентности.

5. Идентифицированы белки, детерминируемые гибридными плазмвдаки, нэсупа&й клонированные 5 и 7 HindiII-фрагменты плазмида pCad358. Определено, что Н5-$рагиент содержит структурные гены полипептвдов с молекулярными массами 46 (БВМ 2), 31 (YopJ) и 28 кД, а Н7-фрагмент - 42 (БВМ 3), 38 (V-антиген), 17 к 14 кД.

0. Впервые установлено, что белок с молекулярной массой 46 кД, кодируемый плазмидой кальцийзависиности возбудителя чумы, является гетерогенными антигеном, обща! для Y.pestis и клеток тканей человека.

7. Методой электроэляции получены препараты белков внешней мембраны БВМ 1-5 и V антиген.

СПИСОК РАБОТ, f; ^ЯККОВАННЫХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кутарев В,В., Филиппов A.A., Дроздов A.B., Ввдя-ева H.A., Еавина Н.Ю., Олейников П.Н.Проценко O.A. Клонирование локуса, ответственного за синтез У-антит.а, ч его использование для характеристики делеционкых производных плазмид-' pCad возбудителя чумы//Никробиол. и биохимия особо опасных инф. - Саратов, 1988. - С.3-11,

2. Зидяэва Н.А , Кутырев .В.В., Проценко O.A., Олейников П.Н., Анисимов П.И. Экспрессия и локализация антигенов Yersinia врр., кодируемых плазмидой Са++-зависимости/УИерсиниозы (Микробиол., " эпид^миол., клиника, патогенез, лаб.диагн.): Теь. Всесоюзн. науч.-практ. 'конф. (1213 сент. 1989г.). - Владивосток, 1S89. - 4.1. - С.14-15.

3. Видяева H.A., Кутырев В.В., Проценко O.A., Агисдаов П.И. Экспрессия белков, кодируемь-x плазмидой Са*4"-. зависимости чумного микроба// Всесоюзн. конф. "Регуляция никробиол. метаболизма".-Пущино, 12-14 июня 1989г. - Пущшю, 1989. - С.77-78.

4. Видяева H.A., Кутырев В.В., Проценко O.A., . Олейников П.Н. Выявление белков, кодируемых собственными плазыидами чумного микроба, методом иммуноблоттинга. (Методические рекомендации). - Саратов, 1990. - 16 с.

5. Ввдяе1д H.A., Филиппов A.A., Кутырев В.В., Олейников П.Н., Проценко O.A. Экспрессия белков гибридными плазмидаш, содержащими фрагменты pCad чумного никроба//Лаб. диагн. и генетика вирулентности возбудителей особо опасных инф. - Саратов, 1990. - С.84-92.

6. Филиппов A.A., Кутырев В.В., Видяева H.A., Олейников П.Н., Куклева Л.11., Проценко O.A. Физическое и функциональное картирование плазмиды кальцайзависимости Yersinia pe*cia 358//Бахтериальные плазмиды ".Тез. докл. "Плазмида XII". - Нальчик, 1690. - C.Ö-10.

7. Ввдяева H.A., Кутырев В.В. ,., Проценко O.A., Оле& жов П.Н,, Анисимов П.И. Экспрессия антигенов чумного микроба, кодируемых плазмидой Са"н"-зависимости//Иолек^л. генетика.-1990,-Н6.-С.17-21.

8. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Vldyaeva .H.A., Kookl^va L.U., Protsenko O.A. Genetic analyais and modelling of virulence in Yersinia pestis//bth International Syaposium on

Yersinia, Mt.Fuji, Japan, 24-26 September i960. Abstracfs, 1960. - P.79.

9. Филиппов П.П., Видяева H.A., Кутьгрев В.В., Олейников П.Н., Куклева Л.М., Проценко O.A. Клонирование локуса плазмиды кальцийзависимосги Y.pastis (LehKann. Heuaaim), кодирующего синтез белка внешней мембраны (БВМ2)/Теш.тика. -1991. - Т.27, N4. - ".568-606.

10. Кутырев В.В., Видяева H.A., Шанина Л.И., Проценко O.A. Гетерогенные антигены возбудителей чумы, общие с тканями человзка//Генетика и биохга«. вирулентности возб. особо опасных шф. :Тез.докл. конф. - Волгоград, 1992. - С.37.