Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная и функциональная организация плазмид чумного микроба и генно-инженерные разработки на этой модели

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурная и функциональная организация плазмид чумного микроба и генно-инженерные разработки на этой модели"

Га:СА!СТ[ИЙЛАЛ30!' KMCP

ВСЬШВКЫЯ ОРДВНА ТРУДОЮГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-Ki'CЛЕДОВИТКЛ1А!Ю1Й [ЦчЛИ'Ю'С/Ш'^'Я ИНСТИТУТ "ШШРОБ"

На правах рукописи

ПОПОН Ц|Ий Алексезвич

УДК 616.98J.452: 576.8: 675

СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПМЗШД ЧУЮ (ОГО ЙИКРОБА И ГШК>- ИНШ!Ш!ЫВ РАЗРАБОТКИ НА ЗТОЯ МОДЕЛИ

03.00. 07 микробиология Автореферат Диссертация иа соискание ученой степени докторя биологических наук

Ннучнип консультант доктор медицинских наук, профессор II И. Анисимов

Саратов, 1991

Ч v~ " ' \

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения СССР Научный консультант:

доктор медицинских нар:, профессор • П. Я Анисимов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А. Л Гинцбург

доктор биологических наук И. М. Климова

доктор медицинских наук, профессор Ы. К. Щеглова

Ведущая организация: Научно-исследовательский ордена Трудового Красного Знамени Институт эпидемиологии и микробиологии АМН СССР имени почетного Н. О. Гам ал а и ^

Занята состоится "¿¡О" ¡.¿¿й1092 в /3 часов на заседании специализированного совета по присуждению ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте "Шкроб" по адресу 410610 г. Саратов, ул. Университета-кш, 46 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БНИПЧИ "Микроб"

Авторе<£ерат разослан 199 /

Ученый секретарь

специализированного Совета, д. 6. н. Корнеев Г. А.

. '; иПЩЛЯ ХАРАКТЕРЖ!ТИ1-СЛ РАБОТЫ

территории России и ряда сопредельных республик функциони-доЙГММ природных очаги чуми, где постоянно протекают эпизоотии чумы у диких грипуноп и происходят спорадические случаи заболевания чумой людей и сельскохозяйственных яивотных, что представляет '¿обой реальна (¡«ктор поиникновения эпидемических осложнений. Методы диагностики чуми и вакцинные препараты, испольвуемь.е в настоящее ьромя, уступают по аффжтивности лучшим аналогам, разработанным на моделях других бактериальных инфекций и, поэтому, нуждаются н усовершенствовании.

13 настоящее время проводятся интенсивные исследования с целью рдаработки ¡фиицииигшмю ноких диагностических и профилактических препаратов для Оактеригшьных инфекций, основанные на технике молекулярного ¡слоим!/онания р!1зличнш генетических детерминант,в гом числе, плалмидных гении. 1'яд генон, иодирующих свойства, ассоциируемые с иромшчмем вирулентности и иммуногеншети чумного микроба, локализованы па трех основных пне хромосомных реплшео-|ах: рР:^ (VI,Ь КЬ), рГ-'гл (Ш Ш. р(Ли! (70 КР).

Акт" а л I, н о с т 1> и роялем и. Исследование

структур ной и функциональной организации пл;1змид чумного микрсЗа методами молекулярной генетики янляетен актуальным направлением, |ацеленпым на решение фундамент.'иышх проблем: (расшифровку меха-шамон регуляции пкенреесии отдельних генетических элементов юаоудителн и нпяснепие Оиодогического значения кодируемых ими родукто«. В оною очередь, знание молекулярных основ вирулент-оети и иммуногенноети ипзоудителя ■ необходимое условие успеш-ой реализации практических задач, обязанных с разраОоткой новых иалюетических и профилактических препаратои.

Подключение для решения этих проолем молекулярно генетической г> чю инженерной методологий открывает нопшхпост!) выделения енон, онроделншцих существенные ешйетва клетки, что помоет оценить патогенез инфекции о молекулярных позиций (Маеппз ., ¡маг. П^еИ I... :;|цр1еу I'.. шнп. с помощью этого подхода •)Ано не тольке ншеиить функциональное значение продуктов син-.'Ем известных генов, но и 1№ >1тифишп,||нат1| нопие иещеегш, не-

обходимые для обеспечения вирулентных и иммуногенных свойств, Вменение молекулярной организации плазмидных геномов позволяет конструировать рекомбннантные ыолекулы, кодирующие глмуногенные субстанции. Таким образцы, определяется конкретный подход к получению генно-инженерных вакцин и штаммов, продуцирующих б повышенных количествах биологически активные вещества, что облегчит их вцделеиие в препаративных масштабах. Это, в свою очередь, относится к белкам, перспективным в качестве компонентов диагностических препаратов. Конструирование колесулярных ДНК-зондов на основе клонированных участков плазмид приведет к разработке более совершенных приемов индикации и идентификации.

С конца 70 гг. проводятся интенсивные работы по изучению мо лекулярной организации внехромосомных репликонов Y. pest is. Получено большое количество фактических данных, полученных по картированию плазыид и изучению структуры различных генов (Можаров 0. Т., 1983; Ыишанькин Б. Е с соавт. , 1984; Portnoy D. A. et al., 1983; 1984; Sod&inde 0., Goguen J., 1988 и др.) . Однако, их гце недостаточно для того, чтобы не только получить полное представление о функционировании и роли плазмидных репликонов в жизнедеятельности возбудителя чумы, но и использовать отдельные элементы этих структур для гекно-иниенерных разработок с выходом в практику здравосхранения.

Основными объектами данного исследования являются плазмиды pPst и pFra, выбор которых обусловлен уникальностью этих структур для У.pestis, недостаточной изученностью их молекулярной организации, большой функциональной значимостью кодируемых ими продуктов синтеза. Плазмида pOad чумного микроба была использована для клонирования участка инициации автономной репликации, изуче низ структуры-этого района и конструирования на его основе генетического зонда. Экспериментал1"ые материалы, которые положены' в основу диссертации, получены как лично соискателем, так и в соавторстве с сотрудниками лаборатории молекулярной генетики ШИП-

I • J '

ЧИ "Микроб" в рамках плановых тем отдела генетики (1975-1990 гг.); часть результатов отражена в кандидатских диссертациях, выполненных под нашим руководством.

Цель исследования: изучение структурно-функциональной организации плазмидн чумного микроба, ответственной за синтез антигена фракция 1 и пл.шмиды пестициногенности; создание на основе клонированных нлаэмидиых генов диагностической тесг-систеи* к штаымоп продуцентоь биологически активных веществ Y.pestis.

'Задачи исследования

1. Провести анализ и дать характеристику основных свойств плазмид чумного микроба; изучить их влияние на некоторые биологические свойства возбудителя; определить еотествеииий фон активности ферментативных систем репарации повреждений ДНК и рестрикции модифи'тации, влияющих им Функционирование молекул ДНК

2. Изучить структурную организацию плаэмиди пестициногенности и плазмидн, ответственной за синтез антигена фракция 1. Осуществить клонирование отдельных генон, входящих в их состав. Совдать коллекцию штаммов, содержащих библиотеки генов указанных плазмид. Определить параметры зкопресеии ряда плазмидных генов в клетках чумного микроба, кишечной палочки, шникльтках Е. coli, системе бееклеточного синтеза.

Я. 1'азработать гонно инженерные подходи к зкепериментальному получению штаммов- продуцентов биологически активных веществ, кодируемых плазмидой неогициногенноети (Фибринолизин) и плазмидой, ответственной за синтез антигена фракция ) (капсулышй антиген).

4. Установить возможность использования клонировашшх генов плачмид pP-.jt . pf-Va, рСп<) н качестве специфических для чумного микроба генетических зондов.

5. Провести молекулярное зондирование музейных и свежевыделен-них природных штаммом возбудители чумы е помощью набора ДНК-зондов, созданных на основе трех типичных плазмид чумне •о микроба. Апробировать полученные ДШ зонды для детекции Y. pestis в органах биопробных животных и блохах, оценить перспективы использования метода генетического зондирования для изучения Y. per.tls.

- б -

Научная новизна

Представлены новые данные по физическому обнаружению, структурно-функциональной организации., уникальных для возбудителя чумы внехромосомных геномов pPst, pFra; впервые сконструированы гибридяие ДНК, экспрессиругадие отдельные генетичесгае детерминанты плазмад возбгдителя чумы в различных бактериальных хозяевах (У. pestís, Е.coli); дана дополнительная характеристика белковых продуктов, синтез которых кодируется генами плазмвд pPst, pFra; получены новые сведения о вкладе пдазмидных детерминант в обеспечение некоторых биологических свойств клетки.

Впервые определены к клонированы' специфические для чумного микроба нуклэотидкые последовательности, перспекгдаьле для иг- . пользования в качестве генетических бондов при идентификации и детекции штаммов возбудителя чумы.

Изложены оригинальные зксперилентальнйе схемы конструирования штглмов кишечной палочки - продуцентов плазмидкодируемых продуктов - фибринолизина и капсульного'антигена Y. pestis.

Сформулированы перспективные направления, развитие которых обеспечит вьго^д в практику здравоохранения конкретных'методов и биопрепаратов, необходимых для диагностики и профилактики чумы и изучения молекулярных механизмов инфекционного процесса.

, Практическая значимость исследования определяется разработкой приемов молекуляр.чо- генетического анапиза и геняо-инданерного конструирования на модели Y. postis, которые оформлены в виде шести методических рекомендаций, три и? них - по союзному,уровню внедрения.

. Ш заявкам на четыре изобретения получены авторские свидетельства (а/с N 1680/68, а/с М 1685193, а/с N 1615181) и полою-тельное ржнке по заявке на изобретение N 4834179/13 (061S56).

Библиотеки генов плазмид pPst и pFra в составе штаммов Y. pestís и Е.coli .(всего 67 итамыов) депонированы в музее жвых культур (ЫЖК) ЧЗГОШЧИ "ЫикрсЗ" и рекомендованы для использования их в генетических и микробиологических экспериментах, а такав в опытах по определению детерминант, необходимых для обеспечения • вирулентных, иммушгеиннх или других свойств возбудителя чумы.

Депонированный в МЖК ВНШЧИ "Микроб" штамм кишечной палочки, продуцирующий кагсеульный антиген чумного микроба,является донором для его выделения в препаративных количествах.

Шгаш Е.coli, депонированный в MÜS ВНИПЧй "Микроб" и продуцирующий фибринодизии чумного микроба, используется для выделения этого вещества в препаративных количествах и конструирования на его основе дшгностикумов.

ДШ-зонды, созданные на базе различных реплиютюв возбудителя чумы и составляющие тест-систему для диагностики чумного микроба, использованы для идентификации широкого набора типичных и атипичных штаммов Y.pestis. . Показана воз!Лшгасть применения сконструированной тест-системы для характеристики свежевыделен-ных из природных очагов чумы штаммов У. pest, is, коллекционных штаммов чумного микроба различного происхождения и для детекции возбудители чумы в органах животных и блохах.

Результаты, полученные в ходе выполнения даняой диссертации, используются при подготовке лекций по генетике бактерий на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям при ЬНИП'Ш "Микроб" и для студентов,1/ курса биофака СГУ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Чумной микроб обладает тремя основными типами внехромосом-ных реп -пионов: рPst (9,5 kb), pCad (70 kb), pFra (99 kb) и является, таким образом, полшлазмиднш видом. Продукты, кодируемые плазмидныии генами не влияют на уровень мутагенеза У. pest i з.

2. Библиотека генов ллаамиди pPst, сконструированная на основе построенной генетической карты, содержит отдельные фрагменты этой плазмиды, стабильно реплицируется и фенотипически экспрзс-сиртется в iui-етках чумного микроба и кишечной палочки. В системе бесклеточного синтеза и в миниклетках Е. col s плавми, a pPst детерминирует продукцию 12 белков, среди которых идентифицированы пестицин 1 (43 кОа); Оелок, ответственный за фибринолитическую активность и взаимодействие с иммуноглобулинами диагностическими чумными люМинеецирующима (37 kDa); белок, определяющий коагулаз-

ную функцию (35 kDa); белок иммунности к пестицину 1 13 кОа).

3. Библиотеки генов плаз ми да pFra получены на базе плаэмидньх-векторов pBR322, pBR327 и фагорого вектора 1 EMBL3. Из их состава отобраны клоны, реагипуюдие в РПГЛ с коммерческим антительным и моноклонапилм на антиген фракция 1 чумного микроба эритровд-тарными диагиостикумами. В нуклеотидной последовательности одного из фрагментов ДНК, входящих в область плазмиды pFra, определявшую это свойство, имеется открытая рамка считывания в районе 1 ¡57-424 Ьр.

4. Созданные методами генной инжнерии штаммы Е. col i КМ9 (pEKS) и E.coli КШЗ (pAF10-23) является продуцентами фибрииоли-аияа и капсульного антигена чушого микроба соотвеп :венно.

5. Тест-система для генетического зондирования возбудителя чут включает ДЩ-зонды, сконструированные на базе трех основных п^ззмидных репликонов Y. pestis. Зонды PI и Fl являются видоспе-икфичными и выявляют штаммы чумного микроба, содержащие соответственно плазмиды pPst и pFra. Зонд С1 проявляет специфичность по отношении к двум видам иерсиний к реагирует с pCad-содержащи-ми штаммами Y. pestis и У. paeudotuberculosís. .

6. Метод генетического зондирования пригоден для идентифш а-ции кгк типичных штаммов чумного микроба, так и атипичных - дефектных по экспрессии отдельных генетических детерминант.

7. Использование - созданной тест-системы позволяет выявлять возбудителя чуады в тканях органов животных и эктопаразитах. Метод генетического зондирования с. помощью полученных ДНК-зондов делесообразио применять для характеристики коллекционных и све-явввдэленяюс жтаммов чумного микроба.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Молекулярная биология и генетика воэбу-дителей ООЯ" (Маркс,1982); Всесоюзной научно-практической конференции "Профилактика природно-очаговых инфекций" (Ставрополь, 1983); выездном, заседании счовной проблемной комиссии "Генетика бактерий" (Ставрополь, 1984); Всесоюзной конференции "Молекулярная-биология, генетика и иммунология возбудителей ООИ" (Ростов-на-Дону, 1Ö84); Всесоюзных/ конференциях "Новые направления биотехнологии"

(Пущино-на-Оке, 1984 и 1986); XIV теоретическом семинаре по молекулярной генетике (Пушино-на-Оке, 1985); рабочем совещании "Эпидэ-миология, молекулярная биология, генетика и иммунология возбудителя чумы" (Саратов, 1986); V съезде ВОГиС (Москва, 1938); научных конференциях ИМПЧИ "Микроб" (Саратов, 1977, 1978, 1983, 1984, 1986, 1988, 1990, 19И1); научной конференции "Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций" (Ростов- на- Дону, 1989); Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пущино-на-Оке,1989); Всесоюзной конференции "Разработка препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990); всесоюзной конференции "Бактериальные цлазмиды" (Нальчик, 1990); Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностигсумов" (Москва, 1990); Всесоюзной конференции "Достижения биотехгологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991); Всесоюзном семинаре "Препаративная масштабируемая хроматография биологически активных веществ и альтернативные методы" (Санкт-Петербург, 1991).

Публикации. Но теме диссертации опубликовано 4Ь статей; получено 3 авторских свидетельства и 1 положительное решение Государственной научно-технической экспертизы по заявке на изобретения. Список публикаций приводится в конце автореферата

Структура и объем диссертации. Диссерт ция включает введение; дне главы обзора литературы; шесть глав экспериментальных исследований, содержащих результаты и обсуждение. Последняя глава посвящена общему заключению. Отдельная глава содержит описание использованных методов. Диссертацию заключают выводи и список цитированной литературы. Работа изложена на 248 листах машинописного текста и иллюстрирована 29 рисунками и 11 таблицами. Описок литературы содержит 225 наименований.

С О £ С Т В Н Н II N Е ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ и . методу Работа выполнена на "30 штаммах чумного микроба, 30 штаммах возбудителя лсеидотуберкулеза, а такие штаммах других бактерий (большинство из коллекции МЖК ВШ1ЧИ "Микроб"). Бактерии виращи-

Еали на жидкой и твердой питател*>ных средах LB в ycJioi :ях роста, оптимальных для каждого вида Фибринолитическуга активность определяла ао Кутыреву В. Е (1980 ); рагулазяую - по модифицированной методике (Булгакова Е. Г., Попов Ю. А., 1937), антиген Ф1 - согласно "Руководству по профилактике чумы".

Скрииинг птамыов мерсиний на присутствие плазмид проводили по методу Kado С., L)u S. Т. (1981). ДНК плазмид выделяли по Birnboim И.О. , Poly J. (1979). Препаративное виделение фрагментов ДНК осуществляли экстракцией из легкоплавкой агарозы (Bio-Rad,США). Конструирование библиотеки геноз плазмид Y. pestis; основные этапы реакции гибридизации проводили по Т. Маниатису с соавт. (1984). Определение нуклеотидной последовательности ДНК осуществля в по Sanger F. et al. , 19S5. Яеренос ДНК из агарозных гелей на нейлоновые фильтры Hybond-N (Anwrsham, Англия ) • проводили с помощью прибора TraraVac ( Ko.efer, США ) в ацетат-аммонийном буфере. ■

ДНК метили ^S-dCTP или ^P-dCTP в реакции ник-трансляции,используя изотопы и набор фирмы Amersliam (Англия) Электрофорез вели в горнЕОэтазмом 0,8-1,02 агаровиом геле в трис-боратшм буфере при напряжении 9 ь/см 3 ч или в вертикальном градиентном геле 4-12 X ПААГ в трис-ацетатном буфере 12-14 ч при напряжении 5 в/см.

.Миниклзтки получали из иггамма Е.coli xS25; для получения экстракта системы бесклеточного синтеза использовали штамм Е. coli 013. Электр0(}орез бел!Сов проводили в ИХ ПААГ с bt)S. Гели прокрашивали и фиксировали в кипящей 3,5 7. Ш10 4 с 0,052 кумасси (СЕВ С-2130) 10 шн, отмывали водой, импрегнировали РРО в диметилсуль-фоксэде и высушивали. -

В опытах по ДНК-зондированию материала, полученного от бисп-роб, белых мысей заражали подкожно 'штаммом Y.pestis 629М (pPst, pCad.pFra). Влох С. laeviceps заражали тем же штаммом путем кормления на агонирующих яаралвнных чумой белых мышах. Затем, после подкармливания на вдеровых 'животных, отбирали блох с блоком пред-желудка и неблокированных; гс овили из них суспензии и наносили ка нитроцелшолознь'е фильтры. • Фильтры о нанесенными образцами или ис-пользоьали з реакции гибридизации непосредственно или подращивали при 28°С 16-18 ч.

1. ОБНАРУЖЕНИЕ ПЛАЗМИД ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУШ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ВЛИЯНИЯ НА НЕКОТОРЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Y. pest:г

В экспериментах, проведенных нами в 1976-77 гг. впеоаые погагчч-но присутствие в клетках ряда штаммов возбудителя чумы плазмид с молекулярными массами 6,0 Ша (pPst), • 45 Ша (pCad), 65 Ша (pFra). С целью изучения плазмидного профиля штаммов Y. pesUs различного происхоздения, был проведен электрофорез клеточных лиг^гов 24 штаммов Y. pestis, полученных с территории, курируемой Ельстичс-кой ПЧС и 12 штаммов, выделенных в 1ЭЭ1 году во Вьетнаме. Установлено, что во всех перечисленных штаммах присутствуют три типичные плазмиды. Скрининг штаммов чумного микроба, исследованиях на этапах генного зондирования, подтверждает установленную закономерность. В то ке время, с помощью модифицированной нами методики скрининг-элегтрофореза (Фурсов ЕВ., Попов Ю.А., 1983) показано, что в клетках 25 штаммов чумного микроба, выделенных от полевок t Закавказском высокогорном очаге, которые отличаются рядом биологических особенностей, имеются только две плазмиды - pCact и pFra Следовательно, гены, кодирующие синтез пестицина IJJ, продуцлруе мого "полевочьими" штаммами, локализованы на хромосом или на этих плавмидах, тем более, что репликон рРга у них часто имеет увеличенную молекулярную мэссу (Заренков М. И., Лебедева С. А., 1065).

Таким образом, большинство штаммов Y.pestis, выделяемых в природных лчагах имеют стандартный нлалмидный профиль. Сб этом же свидетельствуют данные, полученные Филипповым A.A. с соавт. (1989). Стабильность поддержания плазмид pPst, pCad, pFra в штаммах Y.post is, активно функционирующих в эндемичных очагах чумы, свидетельствует о важности продуктов, кодируемых генами плазмид, в обеспечении жизнедеятельности клетки возбудителя, в его адаптации к условиям окружающей среды, к организму млекопитающих и блох-пе-peir счиков.

[7ри этом, функционирование репликонов в клетках '.'.pestis происходит на фоне активных ферментативных систем рестрикции-модификации и репарации повреждений ДНК.

Полученные нами более 4ГЮ УФ-чувствительных мутантов Y.pestis

PKR133 и EV на основе критерия корреляции между типо мутации в генах системы репарации и чувствительностью клеток к действию УЯО и ряда ДШ-тропных агентов (Moun* et al., 1972) были разделены на группы uvr, гее, pol. lex. Б экспериментах с бесклеточными экстрактами роЬд^иваюв, обнаружен пониженный уровень включения %-дззокситишдйнтрчфосфата Но вновь синтезируемую ДНК у мутантов, что свидетельствует о дефектности у них ДНК-полимеразы 1. Мутанты, отнесенные к uvr-тилу, дефектны по одному из звеньев ЭРПД, что показано по кинетике репараций УСУ индуцированных повреждений ДНК. Результаты изучения влияния плазмид N-группы несовместимости на выживаемость после У1>-о6дучевия клеток мутантов чумного микроба, кишечной палочки и сальшаелд дают основание говорить о сходстве структур систем репарации повреждений ДНК этих бактерий.

Нами установлено, что помимо активности неспецифических нукле-аз, которая была обнаружена В. И. Ыарченковым с соавт. (1977) и И. Д.. Куекиченко (1979), чумкой микроб обладает также специфическими нуклеааами, входяиши в состав систем рестрикции-модификации. Показано, что из восьми исследованных штаммов Y.pestis два - 465 и Harbin - ограничивают размножение бактериофагов при попеременном пассировании на несколько порядков, что свидетельствует о существовании у них активных ферментов РМ системы. При этом, штаммы отличаются один га другого уровнем, спектром ограничения и тем, что бактериофаги, модифицированные одним из штаммоа, не ааавадены от действия РМ системы другого. По нашему мнению, продолжение исследований в области генетической энвимодогии pestis представляет большой интерес, поскольку уровень активности ферментов, субстратом действия которых являются молекулы ДНК, является фактором, влияющим i.a структуру генома и, следовательно, на стабильность детерминант вирулентности возбудителя чума

Известно, что ялазмиды разных функциональных групп влияют на чувствительность клеток бактерий к летальному и мутагенному действию химических агентов и УФ эбдучения. Наш показано, что присутствие собственных плазмид не оказывает влияния на уровень ыута-генааа и выживаемость УФ-облученных клеток Y.pestis. Не обнаружено рааницы ь выживаемости Плеток, обработанных нитрозогуанидином, и в

- :з -

частоте мутаций, индуцированиих им. Следовательно, продукты, iro.\¡i руемые этими реплнконами, не обладают ни протектлвяш, ни сенсибилизирующим действием но отношению к мутагенным (ракторам. В г( время, плазмида pKMIOl повышала на 1-2 порядка частоту спонтанного мутагенеза и увеличивала в 1,6-10 раз выживаемость клеток по^лс УФ -облучения. Эти результаты согласуются с закономерностями, установленными на других моделях (Чэрнин Л. С., 19Б5). Получений: /,_!>-ные дали возможность предположить, что в составе плазмид Y. ре: ; s нет mucAB генов, аналогичных тем. которые имеются в плазмте pKMlOl и определяют ее протекгивные и мутагенные свойстпа. Де^.с ■ твительно, в опытах по блот-гибридизации ДНК-зонда, приготоь.иеьы,-го на основе генов mucAB плазмиды рЮ>1101, с ДНК плазмид чумного микроба показано отсутствие гибридизациониого сигнала.

Таким образом, установленное нами отсутствие генов rruc/.fi ^а плазмидних репликонах, и предполагаемая (Заренков М.И. е io-авт.,1986) дефектность возбудителя чумы но имеодимхромосомаленую локализацию umuCD генам, объясняют пониженную эффективность УФ-индуцированного мутагенеза (Домарадский И. В. ,1974) и уве-мпенчуи чувствительность клеток этого микроорганизма к УФ-облучению i домарадский И. R .1974; Виноградова H. А., 19В8).

Продукты плазмидних генов могут оказывать влияние на структуру и функции клеточной поверхности ( Ivel- R. et al. , 1978; Taylor P. . Hughes , 1978), что, в свою очередь, сопровождается изменением таких важных характеристик, как фагочувствительность, серотип и пр. Одним из "маркеров" структурных модификаций клеточной поверхности ¡.шляется злектрофоретическая подвижность клеток (ЭФП). ■ В опытах по оценке роли плазмидних генов в определении свойств кле-то»ной поверхности возбудителя чумы показано, что ЭФП клеток бесп-лазмидного штамма Y. pestis PKR1ЛЗ выше, чем у любого из трех мо-'ноптазмидных дериватов. При включении в клетки Y. pestis TWJ psb+ плазмиды pFra, их подвижность значительно понижае^я. Плазмида pCad также понижает Mil клеток У. pe:-t is ЗЬН/12 psb+. Таким образом, очевидно, что плизмидные рспликоны У. pest is влияют на структуру клеточной поверхности. Тест определения ЗФП ¡теток, па наш взгляд, целесообразно применять в качестве одного из этапсв отбора

тех генетических структур, которые кодируют синтез поверхностно- локализованных веществ, необходимых для адаптации и важных для реализации вирулентных свойств патогенных микробов. Развитие этого а':спериыенталыюго направления перспективно на модельной системе изогенных штаммов, содержащих рекоыбинантиые-^НК.

2. СТРУКТУРНОЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ НЛАЗЩЫ ПЕСТШШШГЕННОСТИ Y. pest is Изучение структурно-функциональной организации плазмиды pPst проводили по следующей схеме: картирование ДНК; конструирование рэкомбинантных ДНК, содержащих отдельные фрагменты плазмиды-, определение спектра кодируемых белков; идентификация функциональной активности ряда полядептидов; изучение экспрессии некоторых генетических детерминант.

В результате экспериментов но расщеплению ДНК плазмиды pPst разными рестрйктазами, Сыда построена физическая карта этого реп-ликояа (рис.1). В основных чертах,' она идентична картам, которые получили Гончаров Е.К. С1986) и Sodeinde О. et al. (1988) в работах, проводимых параллельно с 'нашей.

Методы генной ишвзнерии были использованы нами для локализаций детерминант, входящих в репликой pPst и конструирования гибридных ДНК с включением известных генов. Получена де-летировашая производная плазмиды пестивдногениостй - плазмида pVFl, которая детерминирует синтез пеетшдана 1 и содержит Участок инициации репликации. На основе данных по физическому картированию сконструированы рекэмбинантние ДНК серии рЕК,' содер-зщие различные фрагменты ДНК плазмиды пестициногенности, перекрывающие весь ее геном. Анализ экспрессии этих. плаз мил, а так® дедевдонвых производных, полученных с помощь» различных рее'триктаз, . дал возможность локализовать детерминанты синтеза пеетишша 1, фибршолтадаа, плазмокаагуляции, белка иммунности к пестшшну 1, участок автономной репликации.

Каучекда параметров ' биосинтеза в миниклетках кишечной палочки и сопряженной системе транскрипции-трансляции на матрицах интактной плазмиды pPst, рекомбянантных и деле штанных вариантов, позволило определить, что згой пдазшдой детерминируется синтез 12 белков с

молшссами от 13 до 45 kDa Среди них идентифицированы пестицин 1 (43 kDa) и белок иммунности к пестицину 1 (13 kDa).

Показано, что гибридная плазмида рЕК4 (рис. 2) придает клеткам V.pestis и Е.coli способность к синтезу фибринолизина и плазмокоа-гулазы. Определены оптимальные условия для осуществления этих процессов. На основании данных по влиянии температуры инкубации на и-., вый синтез в миниклетках, происходящий на матрицах плазмид рЕК4 и pPst, бил сделан вывод (подтверждаемый в работе 1990 г. К. McDonough, S.Falko») о том, что фибринолитическая активность, интенсивно выраженная при температуре 37~42°С, связана с белком молмассой 37 kDa, а. активность коагулази, проявляемая при более низких тешературах, определяется - белком молмассой 35 kDa

Еысокая фибринолитическая активйость Y.pestis при 37-42°С, делающая практически невозможным проявление коагулазной функции в в организме теплокровного животного и человека, обуславливает возможность инвазии возбудителя в ткани макроорганизма. При температуре ниже 28°С , когда активность фибринолизина снижена, проявляется коагулазная шсгивность. Поскольку тага: ■ условия наиболее вероятны в переносчике возбудителя чумы - блохе, продукция коагу-лазы способствует, наряду с другими факторами, блокообразовании.

Результаты изучения экспрессии гибридной плаз мзды рш в клетках чумного микроба и кишечной палочки свидетельствуют о корреляции фибринолитической активности и способности клеток реагировать с иммуноглобулинами чумными диагностическими люминесцируюцими. Температурная зависимость,обнаруженная для фибринолитической активности и проявления антигенных свойств характеризует и процесс синтеза полиж птида 37 kDa. Таким образом, свойство клеток Y. pestis взаимодействовал г ЯДЧЛ связано с белком-фибринолизином.

Все полученные дш'ие по структурно-функциональному картированию пл-ьэмиды pPst д*шг возможность, с одной стороны, -достаточно полно п^-дгтасить молекулярную структуру этого репликона, и с другой, стим/лирушт проведение ак( перимонтов по клонированию генсн и выяснении мичения н> идентифицированных пока продуктов, кодируемых ими. в Снятии т,мш,го микроба.

Ркс. 1 Рестрикцчонная и генетическая карта плазмиды • пестиадмогенности чумного микроба.

а МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГО1АЗЩЩЫ, ОТВЕТСТВЕННОЕ ЗА СЮГГЕЗ КАПСУЛЫЮГО АНТИГЕНА ЧУШОГО МИКРОБА Конструирование» библиотек генов плазмиды pF^a в плазмидных и фаговом векторах осуществляли на основании данных по рестрикцион-Ному анализу ее ДНК.

Клонирование Pst1 рестриктсв проводили в .вектор pBR322. Отобран 31 ,1.->н с р«.-комбинантними плазмидами, включающими 13 из 20 Pstl -рсотриктов плазмиды pFi a Величина полученного банка генов сос тавляет Ь8Х этого репликона. SalG1-фрагменты ДНК плазмиды pFra клонировали в векторе pBR327. Среди трансформантов были идентифицировано 12 клонов, несущих рекомбинантные плазмиды с SalG1-вставками плазмиды pFra, размерами от 1,2 до 17. kb. Величина этого банка генов равна 751. В РИГА с коммерческим эритроцитарнш чумным и мо-ноклональным антифракционным диагностикумом отобран клон, содержащий плазмиду pBol/l со вставкой ДНК плазмиды pFra около 2 kb (рис. 3), который проявлял положительную реакцию в титре 1: 64 - 1:132, вызывал образование полосы преципитации с сывороткой, содержащей антитела к антигену Ф! и приводил к специфическому свечению при окрашивании клеток рекомбинантного клона лшшесцентной монокло-нальной к антигену фракция 1 сывороткой.

Один из субфрагментов клонированного участка, а именно - SalGl-BspRl-.рестрикт.Оыл переклонирован в вектор pER322. Среди трансформантов Y. pest is PKRl33 отобран клон с рекомбинантной плазмидой рВ52 (рис. 4). Била определена первичная последовательность куклео-тидов, входящих в состав ДНК-вставки из плазмиды pFra ( 400 bp).

С помощью компьютерной обработки мнных секвенирования лострее на рестрикци^нная карта и проанализированы особенности структуры фрагмента, Is райот- от v."f до 424 нуклеотида обнаружена открытая рг\мка считш атм С№.»1 Ь Ь' концевой области на расстоянии в bp от ATQ- код| на располагайся l;d последовательность AAGGA. идентичная таковой на, локализованного на плаэмиде pPüt iSodeink- п.,

üug'ieii i . r.ifCji. pj^'i'Tií e ATD кодовом, пта последовательность

SalGI

Y

BspRI

,0,5 =fa

Said BspRÍ BspRI

1.0

rrrr

1,5 .

.тгг hrr л-тга

УаиЗЛ

Sau3A

Fno. ■<, Sal ОI - фрагмент пдаамиды pfra

Fkc. 4 fekomfluhähthaa плазмида pBS2 - донор аонда Fl.

0

обеспечивает инициацию трансляции соответствующего полипептида. В то m время, перед открытой рамкой считывания нет послвдое -тель-костей, гомологичных каноническим промоторам (Harley С., Reynolds В., 1987) . Транскрипция с фрагмента находятся под контролем промотора гена Тсг.

Полную библиотеку генов плазмиды pFra в фаговом векторе Л ЕМК '1 проводили на основе ДНК неполного гидролиза плазмиды pFra эндонуклеавой Sau3A. Полученная библиотека генов содержала 100 клоноа рекоыбинантных фагов; последовательности ДНК плазмиды pFra представлены в ней более, чей о трехкратным перекрыванием. Отобрал ряд фаговых клонов, которые реагировали в РИГА о коммерческим зритроцитарцыы и ыоноклональныы антифракционным диагностикушми.

С помощь» блот-гиОрвдиаации с антителами гипериммунной кроличьей антикапсулыюй сывороткой установлено, что в фагошаатах клонов, положительно реагирующих в РПГА.- выявляются белки, которые отсутствуй" в клонах, не продуцирующих антигенные детерминанты. В области ДНК плазмиды pFra, которая в составе одного из рекомби-иантных фагов обеспечиыет синтез антигенных дгтерминант, взаимодействуй «цих в РПГА с иончклональным аятифракционным диагностикуиом в титре 1:16 - 1:32. локализованы сайты гидролиза BawHl, Hindi ! I. Smal (рис. 6). Субклонирование этой вставки проводили в вектор рАТ 153 по сайту рестрикции SalGl. Отобрал клон-трансформант Е. coli КВ02, который проявлял стабильную положительную реакцию в РПГА с моноклонгш.ным антифракционныы диагностикумом. Он был использован далее для конструирования птамма-продуцента антигена фракция 1.

4. КИЮТГУИРОРАНИЕ ¡¡ГГАММОВ ПРОДУЦЕНТОВ БИОЛОГИЧЕПШ АКТИВНЫХ ндагти ПА <ntOBK КЛОНИИВАШШХ ГЕНОВ ПЛАЗиад ЧУМНОГО ММКРОПА 1^ювсд.'нны-' нами эксперименты по экспрессии генов плшмид У. pest f. Ü клетках кищрчной палочки позволили сделать выг-од о том. что ДНК чумного микроба мям'Т служить полноценной матрицей р. гете-рологичя. м >-нутГ'ИК-Л1лтпчж>м OKI у а нии, что дает возможность игполь-зоыт f»itt-rr«'|'HM f- ».-я 1 и качестве базовых штаммов в отлча Ни геннь инлен> рному конструированию продуцентов веществ, колируемых ген;ши • hoaf удит»'ля чумы.

- го -

а) Шгачм Е. со И - продуцент '*апсульного антигена У. pest is Антиген Фракция 1, который имеет широкое применение в качестве компонента диагностических препаратов, а также как протективный анти.ен, выделяется непосредственно из клеток Y. pest is или из куяьтуральной жидкости. .

Щгамм Е. col i, продуцирующий антиген Ф1, создан введением в клетки штамма Е. соМ «Я02 рекомбинантной плазмиды pAFlO-23, которая состоит из векторной молекулы рАТ153 и 5,4 Kb фрагмента ГОШ плаа-миды pFra, содержащего гей синтеза капсульного антигена (рис. б).

Эффективность продукции антигена фракция 1 штаммом Е.coll К802 рAFI0-23 демонстрируется тем, что в условиях роста на полноценной питательной среде, с аэрацией и оптимальной для синтеза антигена ■И температуре 37°С штамм Е.coli КМ13 pAFlO-í» обладает значитель ной скоростью роста, в процессе которого капсульный антиген синтезируется и секретируегся в культуральную среду. 1^тамы Y. р-.".:.из F.Y линии 1МИЭГ имеет значительно более низкую скорость роста при 37°с и уровень синтеза антигена Ф1 у него в 8-16 раз меньше, чем у штамма Е. col i КМ13 pAFlO-23. При выращивании штаммов в других условиях опыта - в бульоне L8 42 часа при 37°С с аэрацией - концентрация клеток Y. pestis EV возрастает с 4x10s м.к./мд до

•у

3,6x10 м.к./ un-, концентрация клеток кишечной палочки - с исходного уровня до 2,8x10s ы. к. /мл. При этом, в РПГА с монокло-кадьиым на антиген Ф1 диагностикумом супернатвнт штамма Е. col i ИЗ pAFio-23 реагирует до титра Iii32?"^2;. супернотант итамш Y.pestts EV - до титра!;2048. Следовательно, клетки E.coti ШЗ pAF'lü-23 продуцируют и секретируюг антиген Ф1 внеклеточно в 64 pasa больше. чем клетки Y. pestis EV.

Из приведенных примеров видно, что генно-инженерный штамм Е. coi i ШЗ р AFI о-23 более эффективно синтезирует антиген фракция 1, чем штамм Y.pestis EV и налет бить с успехом использован в качестве продуцента при этого вещества. Непатогеность. хорошие рос товые качества, сверхпродукция целевого антигена, отсутствие i препаратах антигена Ф1 балластных примесей, обладающих реактоген

Hinri in

Srtia I

0

Hind 01

If

A

3=1

Sma I

Hind HI

6

xzt

8

10 =b?

12

| Bam HI Sal GI

Sal Gl

lw.h tyamtht pFra, wohkpobuhkuA b (jiitokom Betsrtope, coflt-pKimurt r» hu KancyjibHoro aHTVtreiia

i

¡'lie 6 PeK0M>inn »HfHAH luiiawHAa pAF10-23,

;i>iiei>MH:i.ii'yi.unii npoflyKUMn «ancyjii-noro aHTHivHa.

ным или токсическим действием, является достоинствами вггамма Б. coli КШЗ pAFlö-23, которые могут быть реализованы при его использовании в качестве донора антигена Ф1 при конструировании хи-ми зсксй чумной вакцины. При этом отпадает необходимость организации режима специальной защиты в технологическом процессе по накоплении бактериальной массы продуцента.

б) Получение штамма кишечной палочки, продуцирующего фибринолизин чумного микроба В настоящее время большинство серологических реакций, направленных на обнаружение Y.pestis основано На использовании капсульного антигена. Поэтому, штаммы, дефектные по продукции этого вещества, могут уклоняться от диагностики. Это обстоятельство вынуждает исследователей .заниматься разработкой 1:овых препаратов основанных на других иммуиохимкчески активных компонентах Y. -p«tis для усп-'иного проведений экспресс-диагностки возбудителя чума

Яибрннолизин, в силу поверхностной локалиаации и кзд'-гитутив-иости синтеза является очевидным претендентом на эту {«эль. Выделить его в очищенном виде, без примесей других антигенов, трудно. Эю связано с гидрофобностыо компонентов клеточной стенки и чувствительностью фибринолизина к действии солюбилизкрующих ведаств.

а цель») конструирования штамма £.coli, продуцирующего фибринолизин чумного микроба. Hind 111-5mal фрагмент ДНК плазмилы pPst размером 1,4 kb, встраивали в вектор pBR322 . Полученная плазмида рЕК4 содержит во вставке детерминанты синтеза фибринолизина Среди испытанных пяти штаммов кишечной палочки, наиболее активно синтез этого вещества происходил в штамме Е.. oolt К 802. Затем ДНК плаз-илли рЕК4 расцепляли ферменташ EcóRl и Pst 5 и лигировали фрагмент величиной 4,9 kb с 1,3 kb фрагментом {содержащим Р-1 промотор фага Л), образовавшимся при расщеплении ДНК векторной плаамлды pLC24 теми же рестриктазами. Полученной рекомбинантной плазмидой рЕК8 трансформировали клетки Е. .coli К802. лизогенные по Фагу Л с1857 S7: Ст. Экспрессия структурного гена фибринолизина в этой плазмиде находится под контролем сильного промоторз Фага Л.

При тестировании фибринолитической активности в суг.ернатанте бульонной культуры штамма Е. col i.К802 А с185? S7; Cm pEBS было уста-

новлено, что уровень продукции фиОринолиаина был равен 20-50 мг/л. При электрофорезе в полиакриламидном гела препаратов, фраки гширо-ванных осаждением сульфатом аммония и последующей очисткой с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, обнаружив&отся белки с молекулярными кассами 38 kDa, 37.кОа и 35 kDa.

Таким образом, полученный штамм кишечной палочки, несущий плаз ми." ■ pF.Kti является эффективным продуцентом Фибринолизина чумного микроба, секретирумцим его в среду культивирования в водорастворимой фор«. Это обстоятельство суяественно облегчает этапы выделения и очистки фибринолизина в препаративных количествах. Яибринолизик. полученный из продуцента Ь'.coli, используется для создания на его основе диагностикумов и применения их ß комплексе серологических методов анализа возбудителя чумы для исследовательских целей и эпидобсл<-дования природных очагов чума

Помимо практической важности. полученных штаммов, результаты атих разработок имепг и более общую значимость, свидетельствуя о принципиальной возможности достижения эффективной экспрессии генетических детерминант i pestts в клетках Е. col'.

б. КОНСТРУИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЗОНДОВ

ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧУИЮГО МИКРОБА Существующая в настоящее время система эпидемиологического надзора в природных очагах чумы базируется на комплексе микробиологических. биохимических и серологических методов. Методы генной инженерии дают возможность создания принципиально новых диагностических препаратов для идентификации ^гаммой возбудителя чумы.

В ншпей работ»' проведано конструирование геьети'юсгмх зондов на основе нуклестидных последовательностей различны* репликонон У. p«:;ti:3 и создана диагностическая тест-систем;! для идентификации итаммог чумного микроба. 1'пенифичноеть зондов определяли на отроком iiaf': !■>• микроорганизмов разных видов: Y. pr.^udo t übe reu l о:-, i s, 1. iw.t i •• У. mit <«.: >111, ioa, других представителях рода Yersinia, саягм. ш-лл и, ши'ел.-;:«, протее, клебенеллах, кишечных полочках, стафилококках, еткптт^кках, Сруж-ллах, пас те роллах.

.-i! Конструирование п-нстичеекпго зонда на основе плазмиды pi ra

При гибридизации с колониям' штаммов разных бактерий и гибридизации о рестриктами их ДШ найдено, что клонированный SalGl-фрагмент ДНК плазмиды pFra, реагирующий в РПГА с моноклональныы на ан-тиг н Ф1 диагностикумом и один из его субфрагментов SalQl-Sau3A не обладает видовой специфичностью. Другой субфрагмент - SalGl BspM (424 bp) в реакции бдот-гибридизации реагируют только с ДНК плазмиды pFra Лри гибридизации in si tu он избирательно детектирует штаммы чушого микроба , несущие 09 kb плазмиду. б) Видоспецифичеекий ДНК-зонд для идентификации Y.pest is,

полученный на основе плазмиды пестициногенности Поиск видоспецифических участков в составе репликона pFst прово-дчли. тестируя в реакции блот-гибридизации ряд ДНК-р^стриктов. Оказалось, что только фрагмент Bglll-UaniU t4f.O bp). который в своем составе часть гена, кодирующего синтез фибринолизина коа гулазы Y. [vestís (Sodeinde O.A., Goguen j. . 1988), проявляет гомологии иоключительно с ДНК плазмиды pPst. В реакции гибридизации • :угот фрагмент идентифицировал только штаммы Y.pest is, несущие ллагмиду пестивдкогенности, каковыми является большинство природных штаммов чумного микроба. При этом важно тс, что этот фрагмент ке гибридиэуется с колониями фибринолизин-продуцирующих стафилококков и стрептококков.

в) Разработка ДНК-зонда на основе плазмиды pCad Y. pestjs fio данным О. A. Portnoy, S. Falko« (1981), структура участка, ответственного за автономную репликацию плазмиды pCad у разных ви-поб яерсиний, вариабельна, в отличие от консервативных областей, детерминирующих свойство кадьшйзав-симости. Учитывая,что этот участок является неотъемлемым атрибутом плазмиды, было решено кс-полмовата его в качестве основы ДЛЯ конструирования генетического1 зонда. В серии экспериментов показано, что клонированный Bajrül-б-Фрагмент pCad-EV, включающий область автономной репликации,. гибридизовался лишь с колониями возбудителей чумы и псевдотуберкулеза содерюкдми плазмиду pCad. В экспериментах по блот-гибридизации этого фрагмента с BamHI-фрагментами плаамид калъцияэависимости Y. pestís EV и штаммов возбудителя псевдотуберкулеза установлено, что на этих репликонах присутствует повторяю-

- Zb -

паяся последовательность, представленная тремя копиями. В результате, нами сконструированы рекомбинантные ДНК; -pBTS со вставкой Sal Gl-BspRl- фрагмента (424 bp) плазмилы pFra, являющаяся источником зонд* Ft (рис. 4)

- рЕК7 со вставкой рестрикта ДНК плазмиды пестиш1н0гсннссти. Belli В,will ( 460 bp) источник Pi-зоила (рис. 7) ■ - рс'1.1, содержащая BamHt-6 фрагмент (около 5 кЬ) плазмиди рCad из штамма Y. pest is EV - Cl-эонд (рис. 8). г) Определение методических подходов к получению генетических зондов для детекции птоммов чумного микроба, дефектных по плаэиилному составу Окп1':труиров,чтше нами ЛЛК зонды на оеноье трех типичных плач мид чумного микроба при их комплексном лрш^жчши позволяют дет»'!: тировать штаммы возбудителя чумы как со стандартным, так и с гемле кеннш плгамилным профилем. Это дает возможности рассматривать полученные ДНК-зонды как тест-систему для идентификации штаммов Y. pest и с широким диапазоном изменчивости. В то же время, конструирование ДНК-зондов на основе плазмидних решгек.онов не исключает необходимость получения ген°тического зонда иа основе хромосомы Y. pest is и включения его в данную диагностическую тест-систему.

Для определения оптимального пути создания такого зонда втчале был апробирован подход, направленный на синтез кДНН соответствующей последовательностям хромосомы, кодирующем рРНК. В результате оказалось, что зонды, полученные таким образом, характеризовались отсутствием видовой специфичности. Удачным оказался другой методический подход, который заключался в клонировании EcoRl-фрагментов ДНК хромосомы Y, pest is TWJ и скрининге ДНН-встагок в реакции гибридизации колонии при разных температурах. В результате, найден фрагмент ДНК (около 12 kb), который гибркдизовался при ?6° С с Y.pestís и Y. pseudotuberculosis. В дальнейшем, было установлено, что его субфрагмент (1 Kb), фланкированный сайтами EcoW и Rcr 1 П при 78° С гибрщшзуется только со штаммами У. pest is. ДднкыЯ Фрагмент переклонирован в вектор pUClQ и также представляет соСсй аи-

"В5Я

fue. V Кекнмбининтноя пдаашди pLK/ доьор И йонда. Рис. В Рекомбинантная плааиида уШ донор CJ »онда.

1\\ и*

- 27 - .

доспецифический ДНК-зонд для идентификации возбудителя чумы.

Использование полученных ДНК-зондов открывает возможность детекции и идентификации штаммов возбудителя как типичных (по набору плазмид, фенотп/.ическим свойствам и пр.). так и атипичных (отсутствие одного из плазмидных репликоиов, делении в них, нарушение экспрессии отдельних детерминант) и получение информации о наличии в клетках данного штамма генетических детерминант, связанных с проявлением вирулентности У. pest is.

Важная особенность тест-системы для детекции иггаммов Y. pest is - независимость ее регистрирующей эффективности от функционального состояния клетки. При использовании ЛНК-эондов, меченых ^P-diTTP. детектигуится n х 106 клеток о пробе, ' что соответствует уровню, достигнутому на других бактериальных моделях микобактериих. ло-гионеллах и пр. (Cart, ha М. et al. , 1987-, Pozzi Q. el л1., ШЯ; Razin S. et. al. , 1987; Malonin P.. Bryan R.', 1988)

6. ИСПОЛЬЗОВАШЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЗОНДОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ

ЧУМНОГО МИКРОБА В ОРГАНАХ ЖИВОТНЫХ И БЛОХАХ И ИЗУЧЕНИЯ CBFJKEBbtZIEJIFHHbiX И ЫУЗЕЯНЫХ ШТАММОВ Y. pest is ' • На заключительном этапе работы проведено исследование методом генетического зондирования широкого набора типичных и атипичных иггаммов чумного микроба, хранящихся в коллекциях живых культур; свеяевыделенных из природных очагов чумы; а так»? для детский возбудителя в биотическом материала.

а) Применение метода генетического Зондирования для анализа штаммов Y. pest is, выделенных в различных природных очагах Ыэтод генетического зондирования открывает новые возможности при исследовании патогенных бактерий, позволяя выявлять гшшчньи и атипичные пггаммы, обнаруживать интегрированные в хромосому плаз-мидные репликоны и выявлять "молчание" генк До последнего времени эти возможности на модели чумного («икроба не были реализованы, поскольку отсутствовали специфичные для Y. pestic'генетические зоидь.

Мы использовали ДНК-зонды, сконструированные на ссное«, трет, плазмид чумного микроба, для характеристики 37 пгаммоз Y. pestis. различного происхождения. Анализ полученных результатов ! рис. Я)

S в»

Sî SQ»*

<л© -о H® NG 5®

•ч « * he 5 -ЛЭ tO^ÏO 3S> ^"a© ÏÏO S '

ЙО

4®

о

u. ч

S

¿osos a© §

«

U 'It

-» о

§ M

v» 5 О

, . . AI

vi

^ ® «î$>20-0 ÎT ' ^ . 2 0

i # I

4 6

«Ol -

n, • S®-©5

4 0 n

\ £.

U о

A 1 a.

rt J

0

■i.

У

о

«

i

л »

. H

CX

приводит к выводу о том, что ДНК-зондирование позволяет не только идентифицировать У. pestis, но и определять особенности плазмидного профиля штаммов. Так, по данным электрофореза, в клетках штамма 98 /145 Colomto п -г плазмиды pFra, но есть ДНК с нестандартной мол массой около 13 mDa Высокомолекулярные плазмиды. с нестандартными размерами, имеются и в клетках штаммов С533 (более 65 Ша) и Morsel Ff id (менее 65 MDa). Постольку все эти плазмиды обеспечивают положительную реакцию клеток при гибридизации с зондом F1, очевидно, что они несут в своей основе репликон pFra. В то ке время, 15 mDa плазмида из птамма Y. pestis Senegal Dion является, очевидно, "дополнительным" репликоном, а не укороченным дериватом плазмиды рГгр, так как Fl-зонд не гибридизуется с ДНК этого лтамма. Штамм Y. pestis 819 не имеет автономного р^пликона pFra, однгкю, по результатам зондирования, этот репликон (или его часть) интегрирован в хромосому. Наличие гибридизационного сигнала при взаимодействии зонда С1 с ДНК колоний Y. pestis А143 и А394 (нет Ррн ДНК плазмиды pCad на электрофореграмме) является свидетельством того, что, пс крайней мере, часть нуклеотидных последовательностей плазмиды pCad интегрированы в хромосому. Опыты по блот-гибридизааии с фрагментами ДНК исследуемых штаммов используются для прямых доказательств этих предположений.

Принципиальный В1люд по сумме проведенных экспериментов заключается в том, что паспортные данные штаммов чумного микроба, хранящихся в коллекции живых культур и, в первую очередь, типовых для каддого природного очага, должны быть "дополнены обязательными данными по плаэмидиому профилю (с рестрикционныч анализом ДНК) и генетическому зондированию. На наш взгляд, без этих критериев таксономическая характеристика штамма (ограниченная уровнем фенотипа) не является достаточно полной.

б) Генетическое зондирование свеяевыделенних ятаммов Y.pestis из Бояго-Уральского природного очага чумн

Анализ свежевьик ленных пггаммов Y.pestis методом ДКК-зондирования представляет несомненный интерес, поскольку полученные таким образом сведения о диапазоне изменчивости возбудителя вадно учитывать при прогнозировании эпизоотической активности природных оч1-

гов чумы.

В наших опытах использованы 38 вирулентных штаммов, выделенных в Волго-Уральском междуречье в 19B9-10UÛ гг. Излученные результаты свидетельствуют о следующем. h Большинство штаммов Y. рези-з, циркулирующих в этом природном очаге имеют типичный профиль плазмид. 2. Использованные ДЩ-зонды да и, в основном, адекватный отвит при наличии соответствующего реиликона имед место гиоридиэационный стнал. Однако, у штаммов pst-,1490 pst-

автономкий репликон pFra отсутствует; тем не менее наблюдали сигнал при гибридизации с зондом Fl. Вероитно, в клетках этих штаммов плаэмида pl i a интегрирована в хромосому. а. Отбор "дефектных" Y. Pestis по фенотипу (здесь: пестициногенность) не всегда сопровождается элиминацией ре; ликона, детерминирушего признак, поскольку и электрофоретичееким скринингом и ДНК-зондами присутствие в клетке Нуклеотидных последовательностей зтой пл.чзмиды выявляется, в) Тестирование атипичных штаммов Y. per.tis методом генетического зондировании Харакгерной особенность» генетического зондирования как метода идекгификшши является независимость результатов анализа от экспрессии различных детерминант, что позволяет выявлять измененные штаммы, у которых основной видовой признак не проявляется вследствие репрессии генов или находится на уровне нижа чувствительности применяемых методой. Как известно, не только в лабораторных условиях, но и & природных очагах существуют атипичные штаммы возбудителя чуми, ди.и'ностика которых затруднена, например, не синтезирующие антиген 'И, Фигоустойчивые мутанты, штаммы которые при наличии иестициногснности, лишены сопряженшй активностей - фибри-нотичог'кой и п.ши.м ■кшгулируюцрй и пр.

Для демош.-тр'4ши if .зможиостей метода аудирования на модели ьопоудителк чумы мы панели эксперименты с использованием зонда Fl на набок из !' Tiiim umx и 16 атипичных штаммов. Их результаты сви-,l-.-TMteTbyw о том, что а.,нд Fl выявляет все штаммы ï.pbstia, со-^ерлгщлй п.-.^миду lJ'J КЬ, ь гом числе. отличающиеся но ф'нотипу де-1'. рмини;«у^»*)и:у этс й пл-ишидой.и именно. - дефектные но продукции .й'твг.-нч 41 кли мышит г.л тоглина. Таким олр.-^ом. к текши ltummob

- Kl -

Y. pestis. содержащих pFra репликон, неаавискмо от уровня синтеза кодируемых им продуктов дает возможность идентифицировать атипичные штаммы возбудителя, уклонявшиеся от диагностики иммунологическими методами, основанными на выявлении видоспецифических гнтиге-нов микроба. В данном случае речь идет о конкретном антигене -фракция 1, поскольку все иммунохимическне диагностикумы, применяемые при эпилобслсдовании природных очагов, нацелены яа обнаружение итого суСстгата. однако, это положение справедливо и в отношении любых других антигенов, контролируемых ценами плазмид.

г) Детекция возбудителя чумы в органах животных методом генетического зондирования Опыти пи д^тг-г.пии чумного микроба в орган;« зпражчипм »'.г.отпых проводили на белых мышах, зараженных итаммоы Y. per.t is №'¡1 . В качестве контроля тестировали незаряженные кнтакткые биопгобы и незараженные загнившие. Образцы (отпечатки органеч) наносили на иитроцеллюлонный фильтр и в ряде случаев подращивали. •

Установлено, что ДНК-зонды в варианте опыта без подравдавания материала обнаруживают клетки чумного микроба, ь основном, в селезенке и реже в печени (таблица 1). В случае предварительного подращивания материала, взятого от Сиопроб, уровень детекции клеток Y. pestis существенно повышается, причем и в этом случае возбудитель чумы также чаще всего обнаруживается в печени и селезенке.

Таким образом, в опытах по детекции г.'pestis в биопробных животных порог чувствительности метода генетического зондирования обуславливает необходимость работы с наиболее обсемененным органом исследуемых биопроб, каковыми являются селезенка и печень. К аналогичному выводу приводят данные работы R. Е. Thomas et al. ' С1989), которые детектировали с помощью ДНК-зондов возбудитель чумы з Я из 10 зараженных проб печени и селезенки мышей. Эти данные совпалахт также с богатейшим опьтом микробиологической практик.

Ни в одном из вдриинтов эксперимента - с подрагиванием материала или без подрадилакия - не сило получено лолнополохигелышх результатов, в том числе, и в случае загнившей бюпробы. Таким образом, ни содержащийся па Фильтре после отпечатка материал ергаяев биопробноп животного (белой мыши), ни 'гнилостная микроО/пра

Таблица 1

Результаты гибридизации ДНК-вондов с материалом,

полученном от биопробных животных

,-----,--,--г

т

~г

Т

n

био-

про

бы*

336 33'/

339

340

341 1

3

1

N ОС- | раяца**|

----f-r-r-

30НДА**|Т(С|Р ---1—1—<—

i ~

i*

I * - ♦

—I—г-

FICIP _1_

;_1_j_1_L_|—I_L. j

а) без подращивания

б + +

♦ + ♦

3 I 4 1 Б ! 6 | 7 I в

i

HI P

1 I

+-Г-Т i

i

TT

F|CfP|F|C»PfF|C|P|J-|r|PjF|C|P|F|C|P

4-

-h

-i* i*

•i-h-и-

■i-

i-

i-

после подращивания

i'

+ +! • +

+ +и ♦

- -i"

♦ -f| + + ♦ |-

- -I-

-1+ -1 + ♦ 1 +

t H-♦

+ -i-

i-

•I-

i-

i-

аж xv 329 MO 'Ml 1 2 3

Примечании к таблиц** - зс</, 340, 341 - белые мыши, зараженные ютаммом Y. pest Iи (NAi? зараженная. вагнившая); 1,2,3 - незаражениье белые шш <N;-t - неапршшиная, загнившая).

** образцы: 1 - паховый лимфузел; 2 - паратрохеальный димфуьел: 3 печень; 4 селезенка; Ь - легкое; 6 - кровь; 7 -тонкий кишечник; В толстый кишечник.

- обозначения: К - Зонд Ft; Р - ЗОНД Р1; С - ВОНД 01

ги и соотнести одну из существенных функций, обеспечивающих вирулентность возбудителя с продуктами конкретных генов. Совместные исследования t этом направлен^: узге начаты 1.ами с сотрудниками лаб. клеточной иммунологии ВЮШЧИ "Микроб".

Особый интерес представляет использование клонированных генов плазмид возбудителя чумы в системе гетерологичного обмена Изучение экспрессии рекомбинантных молекул фрагментами ДНК Y. pest is в клетках других бактериальных видов даст уникальную информацию о механизмах .экспрессии и регуляции генов вирулентности.

Помимо моделирования' вирулентности очевидный интерес представляет определение влияния сверхпродукции отдельных антигенов на

о

индукцию и уровень иммунного ответа у лабораторных животных. Кроме штаммов, содержащих клонированный ген-детерминант синтеза капсуль-ного антигена, в схему тестирования целесообразно включить и другие клонированные гены. На основе библиотек генов конструируются штаммы возбудителя чумы, г ^сущие амплифицировышые в составе векторных молекул плазмидные гены (и, вследствие этого иьеюсдае повышенный уровень синтеза детерминируемого прдукта). Создание штам-мов-сверхпродуиентов биологически активные веществ, кодируемых плазмидными генами, облегчает выделение их з препаративных целях. Это, в первую очередь, относится к белкам, перспективш-м в качестве компонентов вакцинных или диагностических препаратов.

Выбор генетических детерминант в опытах по генно-инженерному конструировании штаммов-продуцентов Е. col i был обусловлен тем, что антиген фрагадая 1 является основным иМмуногеном при чумной инфекции, а фибринолчзин относится к факторам инвазии возбудителя и постулирован (Титенко М.М. с соавт., 1084J р. качестве материального субстрата , отвечающего за взаимодействие с иммуноглобулинами (умными диагностическими дкмииесцирующими. Коммерческий препарат ОТЛ готовят в настоящее время многолетней иммунизацией лошадей вдвыми клетками У. pestis с це^ю получения гипериммунной сыворот-да. Причем, не во всех случаях имму шзиооЕанная лошадь становится эффективным продуцентом. Поэтому, практически значимой перспекти-юй использования штамма Е.coll - продуцента фибринолизика чумного откроба является.применение очищенного препарата Зибринолизина для

получения ыоноююнальных антител и конструирования диагностикумов. Этот штамм поитеняотса в научно-исследовательской работе других подразделений ВШШЧИ "Микроб" (отдел биохимии).

Преимущества использования сконструированных штаммов-продуцентов - их нелатогенность, высокий уровень синтеза целевого антигена. хорошие ростовые качества Таким образом, при разрабо~че этого направления реализуется перспектива практического использования покомбкиантных штаммов в качестве источника капсульного антигена (для создания химических вакцин) и фибринолизина (для конструирования диагностнкумов).

Очевидно, что методы идентификации и индикации чумного микроба нувдаотся в усовершенствовании. Анализ лггаммов, выделяем в природных очагах чумы, основан на комплексе бактериологических и серологических- методов. Это приводит к тому, что штаммы возбудителя, проя&лякздие изменчивость, ьыходящую за рамки чувствкетлыгости применяемых методов диагностики , ускользают от внимания исследователей и ке дают возможности установить истинный диапазон вариабельности; свойств вида Y. pest is. В то же время, без этой информации трудно резшть такую важную задачу, как сохранение возбудителя в мекэпиооотичеокий период.

Нами разработаны эксперимента. )НЫе подходы к конструированию новых препэратгв - ДНК-зондов, результаты использования которых не зависят от уровня я стабильности экспрессии генетических детерминант специфичность которых продемонстрирована на большом наборе различных видов бактерии. Конструирование генетических зондов для Y. ps'stis ьа базе различных решшкоиов дает возможность детектиро-EfkTb штаммы козбудителя, с разной степенью изменчивости, изучать ме.хрегликошше взаимодействия, исследовать материалы из природных объектов. Нами проведено тестирование полученных зондов на широком наборе мтаммов возбудителя, отличающихся по свойствам. Б конечном итоге, разработана тест-система для идентификации и индикации типичных и атипичных пггаммов Y. pert.is.

Результаты зтепериментов свидетельствуют о том. что созданная тест-система молот .\спешцс применяться для целей диагностики ти-ничьнх штампе Y. pe.stn; и идентифицировать уклоняющиеся от диаг-

ностики дефектные или феиотипически измененные варианты. Экспериментальные испытания ДНК-зондов показали возможность их использования для детелции возбудителя чук.1 в органах животньх (белые мы-ии) и блохах (С. 1аеу1серз).

Предложенные видо- и родоспецифические ЛНК-зонды являются принципиально новыми диагностическими препаратами. Очезидно, основные перспективы реализации их возмолгюстеД, помимо исследовательской работы, буд.ут направлены'на адаптацию метода генетического зондирования к практике работы в полевых условиях. Для этого требуется решить несколько проблем: повышение ч'-чстЕИтельности метода (реально - до 103 -ю4 м. кл.), оптимизация условий проведения реакции гибридизации (сокращение времени до 2-3 часов), разработка методов нерадиоактивного мечепия, не уступающих по чувствительности радиоактивному. Успешное завершение этих разработок, уже начатых в нашей лаборатории, - позволит ввести метод генетического зондирования в практику противочу ¡ной работы как один из методов в комплексном исследовании возбудителей особо опасных инфекций.

Использование молекулярного зондирован-'Я позволит преодолеть многие трудности, существующие в диагностике и эпидемиологическом анализе чумной инфекции. Таким образом, развитие результатов наиих ииследований и внедрение их в практику поможет модернизировать систему эпидобследования, давая объективную оценку эпидемиологической значимости выделяемых культур возбудителя чумы. • Естественно, что это направление токе мотет быть резвито в плане конструирования ДНК-зондов на другие детерминанты У. розЫз.

Становится очевидным, что адаптация метода генетического зондирования к модели возбудителя чумы открывает еще две шох'ообешаищие перспективы, связанные во-первых, с геномной дактилоскопией и во вторых - с реакцией полимеразного копирования, которая позволяет детектировать 10-100 м. кл. в пробе (За4К1 е1 а1. , 1985). Экспериментальные работы в этих направлениях также начаты а нашей лаборатории. Кроме того, эти зонды можно п ривлечь для экспе риментально* проверки гипотез по природной очагсгости чумы, в частности, такого существенного элемента как сохранение возбудителя в межзпигости-ческий период. ДНК-зонды, реагируя и с "нежпвкм" (иерастугам иа-

териалом, например, с клетками. Находящимися в состоянии анабиоза, дают возможность обнаружить в обгектах внешней среды, почве нор, экскрементах и пр. измененные формы возбудителя при сохранении у них видовых генетических детерминант.

Таким образом, результаты проведенной нами работы показывают, что с помотдью гекно-инженерна методологии можно получит: существенную информацию по широкому кругу вопросов, имеющих непосредственное отношение к микробиологии, биохимии, эпизоотологии, эпидемиологии чумы.

ВЫВОДЫ

г. Возбудитель чумы является представителем полип/, змидиых видов бактерий, содержащим три основные типа внехромосомных репли-коноа: pPst (9,5 kb), pCad (70 kb), pFra i98 kb), функционирование которых происходит на фоне активных ферментативных систем рестрикции-модификации и репарации повреждений ДНК., Продукты, кодируемые плазмидными генами не влияет на уровень спонтанного и индуцированного мутагенеза Y. pestis, но участвуют в определении свойств клеточной поверхности.

г. На основании результатов физического и функционального картирования установлена локализация га плазмиде pPst чумного 1..лкр9ба генов, ответстпенных за синтез бактериоцина лестицина 1, фиСрииолизина и плавмокоагулааы, белка иммунности к пестицину 1 , области автономной репликации.

3. .-'конструирована библиотека генов плазмиды pPst, содержащая различные фрагменты этого репликона в векторе pUR322, стабильно pf плицируюагыся и фенотипически зкелрессирущаяея в клетках чумного микроба и кишечнсй палочки. Штаммы бактерий, содержащих библиотеку генов плазмзды pPst, депонированы в коллекции музея живых культур ВНШЧИ "Микроб". По данным экспрессии в системе бесклеточного синтеза и в миниклетках Е. coli интактной плаэмиды pPst, ре-комбинантных молекул со вставками ДНК этой плазмиды, а также делегированных вариантов определен спектр белков, кодируемых плаэмидой пестии.ичогекностп U2 . полипептидов с молекулярными массами от 13 дэ 15 КП-.О. Среди них идентифицированы иеотицин 1 143 KOaj; белки,

32. Перелектimune метили регистрации реакции молекулярной гиб р..дизации нуклеиновых кислот//Сб. "Пробил, карант. инф. ". -19U0. •■ Саратов. - С. 129-136 (соавт.: Ленюв А. И. .teaiioB Ю. В. .йоровкин С. А. ).

33. Конструирование генетического зонда для идеитифи.лиии штаммов возбудителя чумы, содержащих нлагмнду пестициногенности//Сб. тез. Все союз н. конф. "Сое р. направл. созд. мед. диагностику-иоп. ".-К 10. - Москва. - С. 64 (соавт.: Булгакова Е. Г.).

34. Быстрый метол получения очищение»! плазмидной ДНК чумного микроба//Сб. "Лао. диагн. и генетика вирулентности возб. особо эпасн. инф.".- НЫО. - Саратов. - С. 95-9d ( соавт.: Федотов Э. А. , Куличе нко А. II j.

35. Рекомбинантная п.чазмкдная ДНК рЕК8, кодирующая фибринолизин Yersinia post.is, способ ее конструирования и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент фибринслиз! 'a Yersinia pestts// Поло-кит. решение от ХЛ. 04.1991 г. Гос. научно-техч. экспертизы изобретений по заявке N4834179/13 (061956: Дата приоритета Ol. 05. IfeÖO.

. Соавтор: Булгакова Е. Г.).

36. Выделение и очистка фибринолизина возбудителя чумц//0б. "Микробиол., биохин. и специф. профил. гарант, инф.".- 1990.- Саратов.- С. 44-49 (соавт.: Вейнблат В. И.. Палатин А. Ю., Булгакова Е. Г.).

37. Очистка препаратов фибринолизина - методом проточного электрофореза// Материалы семинара "Препарати! .ая маептгабируемая крелатография биологически активных веществ'и альтернативные Мато-цы". - 1991. -Санкт-Петербург. - С. 77 (соавт.: Лупиксва HL И. , Ермакова Г. а , Вейнблат а И. ).

38. Выделение и очистка фибринолизина чумного микроба из штамма -продуцента киивч..ой палочки//Сб. тезисов Всесоюзн. конф. "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу". - 1991. - Черновцы. - Т. 1. - С. 183 (соавт.: Булгакова Е.Г., Федотов Э.А.).

39. Конструирование видоспецифического jpi-гюнда на основе 1J!азмиды pFra чумного микроба//}^п. генетика, микребиол. и виру-:ол.-1991.-N 10. -С. 35-43 (соавт.: Шишкина О. Р., Кириллина X А. , Машке С. а , Лебедева М. И.)

40. Исследован"е влияния собственных плаг мд на уровень мутаге-1ева чумного микроба// Сб. 'Тенет. , мик.робиол. и созерш. методов наб. диагн. особо опаси. инф. ".-1991. - Саратов. - С. б2-б& (со-1вт.: Виноградова II А., Хуличенко А. Я ).

41. Зибринолизин - антиген, способный специфически реагировать с соммерческиик чумными люминесцентными и 'муноглсбудинами//Сс>. 'Те-¡ет. . микроб, и соверш. мет. лаб. диагн. особо опасн. инф.". -199!. - Саратов. - С. 25-29 (соавт.: Булгакова Е. Г. , ЧиженькоЕ А. И. ).

42. Конструирование видоспецифического ДЖ-зонда на основе хромо-:омгюЯ ДНК чумного микроба//Сб. "Тэнэт., микробиол. и с - верш, методов лаб. диагн. особо опасн. инф.". - 1991. - Саратов.- 0.86-88 соавт.: Куличенко A. К . Норкина О. К , Дроздов И. Г.).

43. Специфичность гибридизации и структурная организация фраг-ие- га, содержащего область начала репликации плазмид^ кальщйгашт ¡имости X. pestis EV//"Akt. пробл. и задачи биохим. , дизгн. и им •учопроф. особо опасн. ш&". -1001. -Саратов. - с. 3"-44

- 40 -

( соаэт.: Леднев А. И. , Хуличеико А. И. , Коровкин 0. а. )

44. Конструирование и использование ДНК-зондов на представителях рода Yersinia/ZCS. "Генет. . микро^иол. и еогл'рш. методов лаб. ди-агн. особо опасн. инф.". - lUiil. - Саратов. - С. 3-13.

4Ь. Конструирование тест-системы на основе генетических зондов для идентификации ч/много м хроба/ХРенетнка. -1991.- Т. 27. С. 2063 - "071 (соавт.: Булгакова Е. Р.. Куличенио A. IL , Шишкина О Г., Леж-' нев А. И. , Фгдогс-Е 3. А. , Кири.-чина О. А. ).

---JLZZS.

Типография Na в г,-о „ГЬлиграфис!"