Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация плазмиды пестициногенности чумного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фурсов, Василий Викторович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. ПЛАЗМИДА ПЕСТИЦИНОГЕННОСТИ ЧУМНОГО МИКРОБА

И ПРИЗНАКИ, ДЕТЕРМИНИРУЕМЫЕ ЕЮ.

1. Молекулярно-биологические характеристики плазмиды пестициногенности

2. Пестициногенность чумного микроба . . • •

3. Фибринолитическая и плазмокоагулазная активности возбудителя чумы.

ГЛАВА П. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПЛАЗМИД.

1. Методы обнаружения и препаративного ввделения экстрахромосомальной ДНК.

2. Методы физического картирования плазмид

3. Методы изучения структурной организации плазмид.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Штаммы и препараты.

2. Методы

ГЛАВА 1У. СКРИНИНГ И ПРЕПАРАТИВНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИД

ЧУМНОГО МИКРОБА

ГЛАВА У. ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ Тп-ПРОИЗВОДНЫХ ПЛАЗМИДЫ

ПЕСТИЦИНОГЕННОСТИ.

ГЛАВА У1. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПЛАЗМИДЫ ПЕСТИЦИНОГЕННОСТИ ЧУМНОГО МИКРОБА

I. Локализация генов, детерминирующихнтез пестицина I и фибринолизина, на физической карте плазмиды пестициногенности. помощью, рекомбинантной плазмиды рУР-Ч

2. Локализация участка инициации репликации плазмиды пестициногенности с помощью плазмиды р7Р-1 . . *

3. Локализация гена, определяющего устойчивость клеток к пестицину I, на физической карте плазмиды пестициногенности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная организация плазмиды пестициногенности чумного микроба"

Актуальность проблемы. В клетках чумного микроба обнаружено три типа собственных плазмид (Попов с со-авт., 1980; Perber, ВгиЪакег, 1981). Показано, что плазмида pFral/Tox (мол.масса 65 Md) детерминирует синтез антигенов фракции I и"мышиного токсина" (Проценко с соавт.,1981,1983); pCad (мол.масса 45 Md) определяет свойство зависимости роста клеток при 37°С от ионов Са^+ и синтез антигенов V, W (Perber, Brubaker, 1981; Ben-Gurion, Shaffexman, 1981 ); а pPstl (мол.масса 6,3 Md) - продукцию пестицина, фибринолизина и плазмокоагулазы (Попов с соавт., 1980; Проценко с соавт.,1983).

Ранее было начато изучение структуры и функций плазмвд возбудителя чумы. Построены физические карты по нескольким рестрикта-зам для плазмид pCad и pPstl (Portnoy et al., 1984; Можа-ров, 1982). Локализован ген, детерминирующий синтез белка I, на репликоне pCad Y.pseudotuberculoeis (Bolin, Wolf-Watz, 1984). На основе полных репликонов плазмид pPstl и pBR-322 создана гибридная молекула pGM-б (Можаров, 1982), клонированы гены, ответственные за синтез пестицина I и иммунность клеток к этому бактериоцину (Гончаров, 1983). Получены производные плазмиды пестициногенности, маркированные транспозонами ТпА (Гончаров, Мишанькин, 1982), Тп1 и Тп9 (Кутырев и др., 1984). Значительный интерес представляет локализация сайтов посадки транспозона Тп1 на молекуле плазмиды пестициногенности, так как на основе Тп -меченых производных плазмид возможно конструирование делеционных плазмвд ( Ohtsubo, 1982), что является одним из подходов картирования плазмидных репликонов.

Изучение плазмид чумного микроба методами генетики и молекулярной биологии представляет интерес, поскольку признаки, детерминируемые генами этих плазмид, относят к факторам вирулентности возбудителя чумы ( ВгиЪакег, 1972 ). Объектом настоящего исследования является плазмида пестициногенности чумного микроба. Выяснение структурной организации плазмиды рРв1;1 актуально, так как является необходимым этапом на пути определения роли отдельных генов в формировании фенотипа возбудителя чумы, в том числе свойств, ассоциированных с проявлением вирулентности. Под термином "структурная организация" подразумевается совмещенная физическая и генетическая карты плазмиды. Решение этой проблемы открывает перспективу расшифровки механизмов регуляции синтеза пестицина I и фибринолизина, а также создания штаммов-продуцентов этих субстанций.

Цель работы. Целью данного исследования являлось изучение структурной организации плазмиды пестициногенности чумного микроба.

Задачи исследования:

1. Разработка оптимального метода скрининга и препаративного вццеления плазмид из клеток чумного микроба различного происхождения.

2. Локализация сайтов интеграции и определение ориентации транспозонов на Тп-меченых производных плазмиды пестициногенности рРв-Ы чумного микроба.

3. Конструирование гибридных молекул на основе вектора рВЕ-325 и Тп -меченых производных плазмиды пестициногенности. Получение делеционных плазмид на основе Тп -производных плазмиды рРв«:. Изучение экспрессии полученных плазмид в клетках кишечной палочки и чумного микроба.

4. Локализация генов, детерминирующих синтез пестицина I и фибринолизина, а также области инициации репликации плазмиды пестициногенности на ее физической карте.

Научная новизна. В результате выполнения работы получены следующие новые данные:

- Разработана модификация метода, позволяющая сократить время, затрачиваемое на обнаружение плазмид в штаммах чумного микроба, до 4 часов, и время, необходимое для препаративного ввделения ДНК плазмид, - до 48 часов.

- Локализовано положение транспозонов Тп1 и ад в Тп-меченых производных плазмиды пестициногенности чумного микроба. Определена ориентация транепозона Тп1 в плазмидах рТК-1 и pVK-2.

- На основе вектора pBR -325 создана рекомбинантная молекула pVP-4, детерминирующая синтез фибринолизина и пестицина I. Показано, что экспрессия генов гибридной плазмиды в клетках чумного микроба и кишечной палочки различна.

- Получена делеционная производная плазмиды pVK-1 детерминирующая синтез пестицина I. Установлено, что выражение генов этой плазмццы одинаково в клетках В.coli и Y.pestis.

- Определена структурная организация плазмиды пестициногенности. На физической карте локализованы гены пестицина I, фибринолизина, иммунности к пестицину I, а также область инициации репликации orí.

Практическая ценность. На основе результатов проведенной работы составлены методические рекомендации "Простой и эффективный метод обнаружения и ввделения плазмид из клеток чумного микроба", одобренные Ученым Советом (протокол 10 от б июня 1984 года) и утвержденные директором Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института "Микроб".

Оформлено рационализаторское предложение "Модификация метода тестирования штаммов чумного микроба на наличие фибринолитиче-ской активности", принятое Советом БРИЗ ВНИПЧИ "Микроб" за № 549, протокол № 3 от 25 июня 1984 года.

Депонированы в музее живых культур института "Микроб" штаммы чумного микроба, содержащие рекомбинантную плазмиду рУР-4, и штаммы, содержащие плазмиду рУР-1, являющуюся делеционной производной плазмиды рТК-1•

Эти штаммы могут быть использованы в качестве продуцентов антигенов для иммунизации и адсорбента при получении моноспецифических сывороток к пестицину I и фибринолизину.

- ю

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Фурсов, Василий Викторович

вывода

1. Разработана и внедрена в практику модификация метода скри-нирования и препаративного ввделения плазмидной ДНК из клеток чумного микроба,

2. На физической карте плазмиды пестициногенности локализованы сайты узнавания рестриктазы Hinc П.

3. Локализовано положение транспозонов Тп1 и Тп9 на Тп -меченых производных плазмиды пестициногенности: pVK-1, pVK-2, pVK-3, pVK-9. Установлена ориентация транспозона Tn1 в составе плазмид pVK-1, pVK-2 и pVK-3.

4. На основе вектора PBR-325 получена рекомбинантная плазми-да pVF-4 (6,4 Md), содержащая 2,8 Md-фрагмент плазмиды pVK-2. Установлено, что на этом фрагменте локализованы гены, детерминирующие синтез пестицина X и фибринолизина. Показано, что экспрессия генов pstl и fb в клетках различных штаммов E.coli и Y.pestis неодинакова.

5. Получена делеционная производная плазмиды pVK-1-pVF-1 (3,65 Md), содержащая детерминанту пестициногенности. Экспрессия данной плазмиды в клетках использованных штаммов E.coli и Y.pestis идентична.

6. Построена функциональная карта плазмиды пестициногенности чумного микроба, на которой локализованы гены, детерминирующие синтез пестицина I (pstl), фибринолизина (fb), иммунность к пестицину I (imm), а также участок инициации репликации ori.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Длазмида пестициногенности рРв1;1 является наименьшей среди трех плазмид чумного микроба. Ее молекулярная масса составляет 6,3 М<1. На этом плазмидном репликоне локализованы гены, детерминирующие синтез некоторых факторов вирулентности возбудителя чумы.

Основной целью данной работы было изучение структурной организации плазмиды пестициногенности, то есть определение мест и порядка расположения генов на ней.

Предварительным этапом работы явилась разработка модификации методов выявления и препаративного ввделения плазмидной ДНК из клеток чумного микроба, удовлетворяющей нашим требованиям. В основу модификации были положены методы, разработанные В.В.С1е*е11, В.В.НеНпвк! (1969), У.Е.Кирегз*оск-РогЬпчу(1974)С^щественными моментами модификации являются повышение концентрации детергента тритон Х-ЮО и Иа2- ЭДТА до конечной концентрации 9% и 0,15 М соответственно в лизирующей смеси, а также увеличение времени инкубации клеток в 25% трис-сахарозе в присутствии лизоцима до I часа. Введение указанных модификаций обеспечивало эффективное действие детергента на мембранные структуры и нуклеопротеидные комплексы. При этом наблюдался полный лизис клеток и максимальная де-протеинизация ДНК, вследствие чего не происходило потери плазмидной ДНК в комплексе с хромосомой при осветлении лизата. В результате значительно увеличивался выход плазмидной ДНК из клеток. Он составлял от 600 до 1000 мкг на один литр бульонной культуры.

Разработанная модификация метода С1фининга и препаративного выделения ДНК плазмид удовлетворяет требованиям работы с возбудителями особо опасных инфекций, а также экономична по времени. По данным электрофореза ДНК плазмид, выделенных этим методом, является гомогенной, интактной; трансформацией доказана ее биологическая активность.

Первым этапом изучения структурной организации плазмиды пести-циногенности возбудителя чумы явилось построение физических карт Тп -меченых производных плазмиды pPstl, с последующей локализацией сайтов посадки транспозонов на молекуле плазмиды pPstl.

Путем суммирования молекулярных масс рестриктов определено, что моле!сулярная масса плазмид pYK-1, pVK-2, pVK-З равна 9,3 Md, плазмиды pVK-9 - 10 Md. Вычисленные размеры вставок в ДНК плазмиды pPstl равны 3,0 для pVK-1,2,3 и 3,7 Md -для pVK-9. Размер вставки в Тп1- производные плазмиды pPstl соответствует молекулярной массе транспозона Тп1 (Хесин, 1984). Превышение размера вставки в Тп9 -производную плазмиды пестицино-генности над величиной самого транспозона Тп9, по нашему мнению, может быть объяснено захватом части материала ДНК из векторной плазмиды Р*1ас, использованной для введения транспозона. На основании рестрикционного анализа локализованы сайты посадки транспозонов Тп1 и Тп9 на физической карте плазмиды пестициноген-ности.

Плазмида pVK-1 были использована в качестве исходной ДНК для конструирования делетированной плазмиды pVF-1. Молекула pVF-1 (молекулярная масса 3,65 Md ) является автономно реплицирующимся участком плазмиды pVK-1, заключенным между двумя сайтами рестрикции эндонуклеазы Ват HI. На этом основании мы утверждаем, что на указанном фрагменте исходной плазмиды локализован участок инициации репликации о ri. Фенотипическое проявление плазмиды pVP-1 сводится к обеспечению клеток устойчивостью к ампициллину и способностью к продукции пестицина I. Выражение гена pstl в гетерологичных системах E.ooli и Y.pestis было идентичным.

Плазмида pYK-2 была использована в качестве донора фрагментов ДНК при создании рекомбинантной плазмиды, "сшитой" по сайтам рестрикции Е*ВашН1 с вектором pBR-325« В состав полученной рекомбинантной плазмиды pVP-4 (молекулярная масса 6,4 Md ) входит полный репликон вектора pBR-325 и 2,8 Md -фрагмент плазмиды pVK-2. Этот фрагмент не способен к образованию автономно реплицирующейся in vivo плазмиды, следовательно, в его состав не входит участок ori репликации. Таким образом, область инициации репликации ori плазмиды pPstl находится на участке физической карты, расположенном между двумя сайтами включения транспозона Тп1 в случае плазмид pVK-1 и pVK-2. Экспрессия плазмвды pVP-4 различна в клетках штаммов E.coli С-600 и <Р, Y.pestis Java и 1146. В кишечной палочке, а также в клетках чумного микроба штамма 1146 присутствие плазмида pVP-4 обеспечивает фенотип АргСтгШо8, в то время как в клетках штамма Y.pestis Java - фенотип AprCmrTcsPstI+Pb+. Получение штамма возбудителя чумы, проявляющего фибринолитическую активность, но лишенного плазмокоагулазной, ранее не описано. Этот факт подтверждает предположение о детерминированности этих признаков различными генами.

Таким образом, полученные данные позволили локализовать на физической карте плазмиды pPstl генетические детерминанты синтеза пестицина I и фибринолизина, а также участка ori. Помимо этого решен вопрос об ориентации транспозона Тп1 в плазмидах рУК-1, pVK-2 и pVK-3»

Сопоставление наших результатов с литературными данными позволило локализовать ген, детерминирующий устойчивость клеток чумного микроба к действию пестицина I (±шт). Установленное расположение генов рв-Ы, л>, Лшп и участка ог1 на фрагменте, ограниченном сайтами рестрикции Е*ВашН1 и Е*Есо ЕЕ, согласуется с данными по обнаружению четырех промоторов в этой области плазмиды рРв« (Гончаров, 1983).

Изучение фенотипического выражения плазмид рУК-2,рУР-1 и рУР-4 выявило интересную особенность влияния транспозона Тп1 на экспрессию генов, удаленных от него на расстояние, равное 1,5Ш физической карты. Наблюдаемый в данном случае эффект прямо зависит от ориентации транспозона, что согласуется с общепринятыми взглядами на активность транспозонов группы А (Хесин,1984). Возможность влияния на генную активность некоторых последовательностей ДНК (модуляторов, селекторов), удаленных от генов на 0,91 ма. и 1,95 М<1 описана у эукариот (Рубцов, 1984). В связи с вышеизложенным нами была предпринята попытка интерпретации результатов, полученных Е.К.Гончаровым и Б.Н.Мишанькиным (1982). Этим авторам, с помощью транслокации транспозона ТпА с плазмиды рЕО-1 на плазмиду рРв-Ы, удалось получить серию плазмид рУР 01-07, которые обеспечивали клеткам устойчивость к ампициллину и пестицину I, а также способность синтезировать пестицин I. По сообщению авторов "при транслокации происходила утрата фибриноли-тической и плазмокоагулазной активностей, что, видимо, можно объяснить "полярным" эффектом интегрированного ТяА (Гончаров, Мишанькин, 1982; Гончаров, 1983). Встраивание транспозона ТпА произошло в участок 2,5-3,4 Мб. физической карты плазмиды рРв1;1 (Гончаров, личное сообщение), что соответствует положению структурного гена £Ъ (рис. 20). Учитывая полярность действия транспозона на экспрессию генов, удаленных от него на расстояние, равное 1,5на представляется возможным предположить локализацию гена со^ приблизительно на 0,5-1,5ма участке физической карты плазмиды рРв-Ы (рис. 17).

Однако,данное предположение нуждается в дополнительном экспериментальном подтверждении.

Полученные в процессе выполнения диссертационной работы результаты могут быть использованы и используются в ряде аспектов микробиологической практики. Так, метод обнаружения плазмид приложим для анализа штаммов возбудителя чумы, циркулирующих в различных природных очагах. Применение модификации метода определения фибринолитической активности бактерий позволяет экономить время проведения экспериментов. Штаммы чумного микроба, содержащие сконструированные плазмиды, включающие в себя определенные гены плазмиды рРэ-Ы -ответственные за синтез фибринолизина и пестицина 1-, рекомендуются в качестве исходных для получения мо-но-специфических сывороток к этим продуктам. Подобные моно-сыво-ротки могут быть использованы в перспективе практической разработки диагностических препаратов с улучшенными характеристиками, прежде всего высокой специфичностью. Другой важный аспект применения этих штаммов, который уже реализуется в настоящее время,~ использование их в экспериментах, направленных на выяснение материальных основ специфичности действия препарата иммуноглобулинов диагностических чумных люминесцентных (ВДШ. Анализ результатов этих экспериментов позволит найти конкретные подходы к улучшению качества препарата ВДЧЛ, выпускаемого институтом "Микроб".

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фурсов, Василий Викторович, Саратов

1. Абалакина Е.Г., Якубов Л.Г., Степанов А.И. Локализация генов типа tras, fino и участка oriT плазмиды R6K. ~ Генетика, 1982, т.18, № I, с. 1263-1270.

2. Гольдфарб Л.М. Некоторые данные о бактериоциноподобных веществах микробов чумы. В кн.: Вопр. микробиол. и лабор.диагн. особо опасных инф., Саратов, 1965, с. 91-94.

3. Гольдфарб Л.М. О феномене бактериоциногенности микробов чумы. В кн.: Матер, к конф., поев. 50-летию ин-та "Микроб", Саратов, 1968, с. 68-69.

4. Гончаров Е.К. Характеристика плазмиды пестициногенности из штамма ЕВ чумного микроба. В кн.: Профилакт. природноочаговых инф., Ставрополь, 1983, с. 286-287.

5. Гончаров Е.К., Мишанькин Б.Н. Транслокация ТпА в плазми-ду, детерминирующую образование пестицина I, штамма ЕВ чумного микроба. В кн.: Молекул, биол. и генетика возбудителей особо опасных инф. Саратов, 1982, ч. 2, с. 22-24.

6. Гончаров Е.К., Сучков И.Ю. Свойства пестицина I из клеток штамма ЕВ чумного микроба. В кн.: Молекул, биол. и генетика возбудителей особо опасных инф., Саратов, 1982, ч. 2, с. 20-22.

7. Гончаров Е.К., Сучков И.Ю., Мишанькин Б.Н. Ввделение, очистка и некоторые физико-химические свойства пестицина I из клеток штамма ЕВ. Журн. микробиол., эпид., иммунол., 1984; № 6, с. 4144.

8. Грамотина Л.И. Ццентификация пестицинов штаммов чумного микроба из Закавказского Нагорья. Сообщение I. Спектр антибактериальной активности и морфология зон ингибиции. В кн.: Особо опасные инф. на Кавказе, Ставрополь, 1974а, вып. I, с. 26-28.

9. Домарадский И.В. Возбудители пастерилезов и близких к ним заболеваний. М.: Медицина, 1971. - 258 с.

10. Ильина Т.С. Механизм генетической транспозиции.- Генетика, 1981, т. 17, № I, с. 7-32.

11. Кокушкин A.M. Трансформация чумного микроба ДНК собственных плазмид. В кн.: Молекул, биол. и генетика возбудителей особо опасных инф., Саратов, 1982, с. 34-41.

12. Кольцова Е.Г. Некоторые свойства пестицина I и передача пестициногенного фактора in vitro.: Дис. . канд.мед.наук.-Ростов-н/Д, 1971.

13. Кольцова Е.Г., Сучков Ю.Г., Лебедева С.А. Передача фактора бактериоциногенности у чумного микроба. Генетика, 1971, т. 7, № 4, с. I18-123.

14. Кутырев В.В. Мобилизующая активность коньюгативных плазмид R в отношении фактора пестициногенности чумного микроба.: Дис. . канд.мед.наук. Саратов, 1979.

15. Кутырев В.В. Выражение признаков фибринолитической и плазмокоагулазной активностей в трансконъюгантах штаммов поле-вочьей разновидности чумного микроба и кишечной палочки. В кн.: Генетика и биохимия особо опасных инф., Саратов, 1980, с. 3-И.

16. Кутырев В.В., Можаров О.Т., Кокушкин A.M., Ляпин М.Н., Проценко О.А. Использование транспозона ТШ для генетическойхарактеристики плазмиды пестициногенности чумного микроба. -Молекул, генетика, микробиол. и вирусология, 1984, № 2, с.11-14.

17. Кутырев В.В., Проценко O.A., Синичкина A.A. Чувствительность к пестицинам полевочьего штамма чумного микроба 1146(409).-Пробл.особо опасных инф., Саратов, 1977, № 4, с. 16-19.

18. Кудлай Д.Г. Внехромосомные факторы наследственности бактерий и их значение в инфекционной патологии. М.: Медицина, 1977. - 224 с.

19. Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г. Бактериоциногения. Л.: Медицина, 1966. - 203 с.

20. Ларионов O.A., Никифоров В.Г. Направленный мутагенез. -Генетика, 1982, т. 18, № 3, с. 349-352.

21. Ляпин М.Н., Можаров О.Т., Олейников П.Н., Коннов Н.П., Проценко O.A. Изучение плазмиды пестициногенности методом гете-родуплексного анализа. В кн.: Природная очаговость и эпаде-миол. особо опасных инф., Саратов, 1983, с.87-92.

22. Мартиневский И.Л. К вопросу о природе штаммов бактерий, вццеленных от полевок и от блох в нагорной части Закавказья. -В кн.: Микробиол. и иммунол. особо опасных инф., Саратов, 1964, с. 26-28.

23. Мартиневский И.Л. 0 пестицинах чумных бактерий, вццеленных в различных очагах чумы. В кн.: Вопр. микробиол. и лабор.диагн. особо опасных инф., Саратов, 1965, с. 94-99.

24. Машко C.B., Розинов М.Н., Козлов Ю.И. Исследование кинетики реакции воссоединения фрагментов ДНК, катализируемой ДНК-лигазой. Случай гомологичных молекул. Молекул, биол., 1980, т. 14, вып. 5, с. I023-1038.

25. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике (под ред. С.И.Алиханяна). М.: Мир, 1976, с. 393-396.

26. Можаров О.Т. Оптимизация выделения собственных плазмид чумного микроба. В кн.: Молекул, биол. и генетика возбудителей особо опасных инф. Саратов, 1982, ч. I, с. 48-52.

27. Можаров О.Т. Рестрикционное картирование плазмиды pPstl. В кн.: Молекул, биол. и генетика возбудителей особо опасных инф., Саратов, 1982, ч. 2, с. 43-46.

28. Можаров О.Т. Молекулярно-биологичеекая характеристика плазмиды пестициногенности чумного микроба: Дис. . кавд.биол. наук. Саратов, 1983.

29. Можаров О.Т., Кокушкин A.M., Анисимов П.И. Конструирование гибридной плазмиды на основе репликонов pPstl и pBR-322. В кн.: Селекция и генетика возбудителей особо опасных инф., Саратов, 1982, с. 11-15.

30. Пак Г.Ю. Пестицин-фибринолизин-коагулазная система у чумного микроба и родственных ему микробов: Автореф. дис. . канд.мед.наук. Алма-Ата, 1969.

31. Полянский О.Л., Носиков В.В. Рестрикционные эццонуклеазы в генетической инженерии. Итоги науки и техники. Сер. Биол. химия./АН СССР, ВИНИТИ М., 1978, т. 14, с. 191.

32. Попов Ю.А., Проценко O.A., Анисимов П.И., Кокушкин A.M., Можаров О.Т. Обнаружение плазмид пестициногенности чумного микроба методом электрофореза в агарозном геле. В кн.: Профилакт. особо опасных инф., Саратов, 1980, с. 20-25.

33. Проценко O.A. Значение R-эписомы в мобилизации переноса хромосомальных и эписомных признаков у чумного микроба. В кн.: Тез. Всесоюз. конф. "Химиотерапия инф. и лек. устойчивость патогенных микроорганизмов". М., 1973, с. 287.

34. Проценко O.A., Анисимов П.И., Гольдфарб Л.М. Сравнительная эффективность плазмид и F'lac в мобилизации фактора пес-тициногенности чумного микроба. В кн.: Профилакт. особо опасных инф. Саратов, 1981, с. 77-81.

35. Роберте Р. Роль рестрикционных эндонуклеаз в генной инженерии. В кн.: Рекомбинантные молекулы: значение для науки и практики, М., 1980, с. 35-48.

36. Рубцов П.М. Успехи в изучении транскрипции генов у эука-риот. Журн. Всесоюз.хим.об-ва им. Д.И.Менделеева, 1984, т. 29, № 2, с. 28-32.

37. Руководство по профилактике чумы. Саратов, 1972, с.138-140.

38. Сорокин В.М., Гончаров Е.К., Мишанькин Б.Н. Картирование промоторов исходной ДНК pBR-322 и ее рекомбинантного варианта методом электронной микроскопии. В кн.: Молекул, биол. и генетика возбудителей особо опасных инф., Саратов, 1982, с. 67-68.

39. Тарасова В.Е., Петров С.П. Пестициногенность и чувствительность штаммов к пестицинам чумного микроба из Горного Алтая. -Журн. микробиол., эпид., иммунол., 1982, № 2, с. 56-59.

40. Чепурная Л.И. Пестициногенность штаммов чумного микроба полевочьей разновидности. Сообщение I. Журн. микробиол., эпид., иммунол., 1970, № 4, с. 33-36.

41. Чепурная Л.И. Пестициногенность штаммов чумного микроба полевочьей разновидности. Сообщение 2. В кн.: Микробиол., эпид.и профилакт. инф. забол. Ставрополь, 1971, ч. I, с. 61-66.

42. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М.: Наука, 1984, с.57.

43. Янулайтис А.А. Рестрикционные эндонуклеазы. Журн. Все-союз. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева, 1984, т. 29, № 2, с. 13-18.

44. Banke О., Freek S., van Tiel-Menkveld G.J., De Graaf F.К. Protein H encoded Ъу plasmid CloDF13 is involved in excretion of cloaoin DF13. J. Bacterid., 1982, v.150, IT 3, p.1115-1121.

45. Bastia D., Geimino J., Grossa J.H., Hale P. Molecular cloning of the replication terminus of the plasmid НбК. Gene,1981, v. 14, Я 1-2, p. 81-89.

46. Beesley E.D., Brubaker R.R., Janssen E.A., Surgalla M.J. Pesticins. 3. Expression of coagulase and mechanism of fibrinolysis. J. Bacteriol., 1967, v. 94, N 1, p. 19-26.

47. Ben-Gurion R., Hertman J. Bactericin-like material produced by Pasteurella pestis. J.Gen. Microbiol., 1958, v. 19,p. 289-297.

48. Ben-Gurion R., Shaffeiman A. Essential virulence determinants of different Yersinia species are carried on a common plasr mid. Plasmid, 1981, v. 5, H" 2, p. 183-187.

49. Binns M.M., Davies D.L., Hardy K.G. Cloned fragments of the plasmid GolV, I-K94 specifying virulence and serum resistance. Nature, 1979, v. 279, IT 5716, p. 778-781.

50. Bimboim H.C., Dole J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DHA. Uucl. Acids Res., 1979, v.7, p. 1513-1523.

51. Blin П., Gabain A., Bujard H. Isolation of large molecular weight DNA from agarose gels for further digestion by restriction enzymes. FEBS Lett., 1975, v. 53, p. 84-86.

52. Bolin I., Wolf-Watz H. Molecular cloning of the tempera-ture-inducible membrane protein 1 of Yersinia pseudotuberculosis, Infect. Immun., 1984, v. 43, H 1, p. 72-78.

53. BRL 81/82 Catalog Bethesda Research Laboratories Inc. -USA-PRG, 1981.

54. Brubaker R.R., Beesley E.D., Surgalla M.J. Pasteurella pestis: Role of pesticin 1 and iron in experimental plague. -Science, 1965, v. 149, p. 422-424.1. CC

55. Brubaker R.R., Surgalla M.J. Pesticins. 1. Pesticin-bacte-rium interrelation- ships and environmental factors influencing activity. J. Bacteriol., 1961, v. 82, H 6, p. 940-949.

56. Brubaker R.R., Surgalla M.J., Beesley E.D. Pesticinigeny and bacterial virulence. Zentralbl. Bacteriol., 1 Abt. Orig., 1965, B. 196, S. 302-315.

57. Campbel S.U. Episomes. Adv. Genet., 1962, v. 11, I 1, p. 101-145.

58. Chouikh J., Volovitch M., Yot B. A simple and fast elect-rophoretic method for elution of nucleic acids from gels. Mol. Biol. Rep., 1979, v. 5, U 5, p. 237-239.

59. Currier T.C., Nester E.W. Isolation of covalenty closed circular DNA of hight molecular weight from bacteria. Anal. Biochem., 1976, v. 76, p. 431-441.

60. Demereo M., Adelberg E.A., Clark A.I., Hartman P.E. A proposal for a uniform nomenclature in bacterial genetic. Genetics, 1966, v. 51» p. 61-76.

61. Eckhardt Т. A rapid method for the identification of Plasmid DNA in bacteria. Plasmid, 1978, v. 1, p. 584-588.

62. Eisenberg A.J., Holmes D.S. A note on the use of CsCl centrifugation to purify bacterial Plasmids prepared by the rapid boiling method. Anal. Biochem., 1982, v. 127» N 2, p. 434-436.

63. Elder J.K,, Amos A., Southern E.M., Shippley P. Measurement of DNA length by gel electroforesis. 1. Improved accuracy of mobility measurements using a digital microdensitometer and computer processing. Anal. Biochem., 1983, v. 128, N 1, p.223-226.

64. Ferber D.M., Brubaker R.R. Mode of action of pesticins: N-acetylglucosaminidase activity. J.Bacterid., 1979a, v.139, N 2, p. 495-501.

65. Perber D.M., Brubaker R.R. The effects of pesticin on Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis. Contrite, Microbiol. Immunol., 1979b, v. 5» p. 366-371.

66. Perber D.M., Brubaker R.R. Plasmids in Yersinia pestis. -Infect. Immun., 1981, v. 31, N 2, p. 839.

67. Ferretti I»., Sgaramella V. Specific and reversible inhibition of the blunt and Joining activity of the T4 DNA ligaee. -Nucl. Acids Res., 1981, v. 9, N 15, p. 3695-3705.

68. Fitch W.M., Smith T.F., Ralph W.W. Mapping the order of DNA restriction fragments. Gene, 1983, v. 22, N 1, p. 19-29.

69. Prick K.K., Quackenbush R.L., Konisky J. Cloning of immunity and structural genes for Colicin V. J. Bacteriol., 1981,v. 148, N 2, p. 498-507.

70. Garaev M.M., Bobkov A.P., Bobkova A.F. , Kalinin V.N., Smir-nov V.D., Khudakov Iu.E., Tikchonenko T.I. The site-specific deletion in Plasmids pBR-322. Gene, 1982, v. 18, N 1, p. 21-28.

71. Gawetz E., Meyer K.F. Studies on plaque immunity in experimental animals. 2. Some factors of the immunity mechanism in bubonic plaque. J. Immunol., 1944, v. 49, p. 15-30.

72. Green C., Tibbets G. Targeted deletions of sequences from Closed circular DNA. Proc. Natl. Acad. Soi. USA, 1980, v.77,1. N 5, p. 2455-2459.

73. Guerry P., Leblanc D.J., Palkow S. General method for the isolation of plasmid deoxyribonucleic acid. J.Bac teriol.,1973» v. 116, N 2, p. 1064-1066.

74. Hansen J.B., Olsen R.H. Isolation of large plasmids and characterization of the P2 incompability group plasmids pMGI and pMG5. J.Bacteriol., 1978, v. 135, p. 227-234.

75. Hardy K.G. Colicinogeny and related phenomena. Bacterid. Rev., 1975, v. 39, N 4, p. 464-515.

76. Hertman J., Ben-Gurion R. A study on pesticin biosynthesis. J. Gen. Microbiol., 1959, v. 21, N 1, p. 135-143.

77. Hiroshi U., Kigoshi M. Genetic and physical characterization of the Col lb plasmid using Col Ib-R-222 hybrids. -Mol. Gen. Genet., 1982, v. 185, N 1, p. 1-12.

78. Holmes D.S., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial Plasmids. Anal. Biochem., 1981, v.114, p. 113-115.

79. Hu P.C., Brubaker R.R. Characterization of pesticin. Separation of antibacterial activities. J.Biol. Chem., 1974,v. 249, N 15, p. 4749-4753.

80. Inselburg I. R factor deoxyribonucleic acid in chromosomale ss pregeny of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1971, v.105,1. N 2, p. 620-628.

81. Inselburg I., Applebaum B. Proteins synthesized in mini-cells containing plasmid ColE1 and its mutants. J.Bacteriol., 1978, v. 133, IT 3, p. 1444-1451.

82. Inselburg J., Fuke M. Replicating DNA! structure of coli-cin factor E1. Science, 1970, v. 196, p. 590-592.

83. Jackson W.J. , Summers A.O. Polypeptides, encoded by the mer operon. J. Bacteriol., 1982, v. 149, N 2, p. 479-487.

84. Jewely E.L., Jlelling K.B. Preparative separation of DNA ethidium bromide complex in zonal density gradient centrifuga-tion. Anal. Biochem., 1980, v. 102, N 2, p. 423-428.

85. Kado C.I., Idu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J.Bacteriol., 1981, v. 145, N 3, P. 1365-1373.

86. KLeeberger A., Klingmuller W. Plasmid-mediated transfer of the nitrogen-fixing capability to bacteria from the rhizosphe-re of grasses. Mol. Gen. Genet., 1980, v. 180, N 3, p. 621-627.

87. Kozlov Iu.I., Gening L.V., Strongin A.Ia., Debabov V.G. A simple method for fhage or plasmid DUAs isolation suitable as a "screening test" after molecular cloning. Anal. Biochem., 1978, v. 86, p. 316-319.

88. Kupersztoch-Portnoy Y.M., Lovett M.A., Helinski D.R. Strand and site specificity of the relaxation event for the relaxation complex of the antibiotic resistance plasmid R6K. -Biochemistry, 1974, v. 13, N 27, p. 5484-5490.

89. Madison R.R. Fibrinolytic specificity of Bacillus pestis.-Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1936, v.34, p. 301-302.

90. MoEntee G., Weinstook G.M., Lenman J.R. Initiation of general reoombinantion catalyzed in vitro by the rec A protein of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Soi. USA, 1979, v. 76, N 6, p. 2615-2619.

91. Meyers J.A., Sanchez D., Elwell B.P. Falkow S. Simple agarose gel electrophoretic method for the identification and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid. J.Bacterid., 1976, v. 127, N 3, p. 1529-1537.

92. Mikesell P., Ezzell J.W., Knudson G.B. Isolation of plas-mids in Legionella pneumophilla and legionellalike organisms•-J.Bacteriol., 1981, v. 31, N 3, p. 1270-1272.

93. Morion J., Gavard D., Lazdunski 0. Physical map of pColA-CA31> an amplifiable, and location of colioin A structural gene. Gene, 1982, v. 17, N 3» p. 317-321.

94. Murray K. Restriction enzymes and their uses in genetic engineering. In: Genet. Eng., Boca Raton, Fla, 1979, p. 113-122.

95. Nathans D., Smith H.O. Restriction endonucleases in analysis and restrictioning of DNA molecules. Ann. Rev. Biochem.,1975, v. 44, p. 273-293.

96. Nilsson S.V., Magnusson G. Sealing of gaps in duplex DNA by T4 DNA ligase. Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, N 5, p.1425-1437.

97. Noviok R.R., Clowes R., Cohen S.R., Curtiss HI R. Uniform nomenclature for bacterial plasmids: a proposal. Bacterid. Rev.1976, v.40, N 1, p. 168-189.

98. Novel L. Restriction enzymes and techniques for gene analyses and synthesis. In: Cell Differ: Mol. Basis and Probl., Berlin e.a., 1982, p. 75-87.

99. Ohtsubo E., Rosenbloom M., Schrempf H., Goebel W., Rosen J. Site-specific recombination involved in the generation of small plasmids, Mol. Gen. Genet., 1978, v. 159, p. 131-141.

100. Patton J.R., Chae Chi-Bom. A method for isolation of a large amount of single stranded DNA fragment. Anal. Biochem., 1982, v. 126, N 1, p. 231-234.

101. Petti^ohn D.E., Pfenninger 0. Supercoils in prokaryotic DNA restrained in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, N 3, P. 1331-1335.

102. Plasmids, a course in advanced techniques: EMBO cource.-Nurnberg Germany: Institut fur microbiologie und biochemic uni-versitut erlangeu, 1979. 489 p.

103. Pollitzer R. Plaque: Monograph series 22. Geneva: World Health organization, 1954. - 698 p.

104. Portnoy D.A., Wolf-Watz H., Bolin I., Beeder A.B., Fal-kow S. Characterization of common virulence plasmids in Yersinia species and their role in the expression of outer membrane proteins. Infect. Immun., 1984, v. 43, N 1, p. 108-114.

105. Radloff R., Bauer W., Vinograd J. A day-buoyant density method the detection and isolation of closed circular duplex DNA: the closed circular DNA in Hela cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1967, v. 57, N 3, p. 1514-1521.

106. Ramsden M., Strike P. A restriction map of the Inc 11 plasmid TP110. Plasmid 1982, v. 8, N 1, p. 83-85.

107. Roberts R.J. Restriction and modification enzymes andtheir recognition sequences. Nucl. Acids Res., 1984, v.12, sup., p. 167-204.

108. Rodriquez R.L., Bolivar B., Goodman H.M., Boyer H.W., Betlach M.C. Construction and characterization of cloning vehicles. In: Molecular mechanisms in control of gene expression, New York, Academic Press, 1976, p. 471-477.

109. RushM.G., Warner R.C. Alkali denaturation of covalently-closed circular duplex DNA. J. Biol. Chem., 1970, v.245, p.2704-2708.

110. Schaffer H.E., Sederoff R.R. Improved estimation of DNA fragment lengths from agarose gels. Anal. Biochem., 1981, v*115,p. 113-122.

111. Shaffermati A., Cohen S.N., Plasner J. A DM segment within the colicin E1 structural on Col E1 affecting immunity to co-licin. Mol. Gen. Genet., 1978, v. 164, N 3, p. 259-264.

112. Smith M. Site-directed mutagenesis. Trends Biochem. Sci., 1982, v. 7, N 2, p. 440-442.

113. Smith D.A., Burrows T.W. Plage and bacteriocin investigations with Pasteurella pestis and other bacteria. Nature, 1962, v. 193, p. 397-398.

114. Smith H.O., Bemsiel M.L. A simple method for DNA restriction site mapping. Nucl. Acids Res, 1976, v. 3, p.2387-2390.

115. Timmis K., Cabello P., Cohen S.N. Cloning, isolation and characterization of replication region of complex plasmid genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, v. 72, p. 2442-2446.

116. Thuring R-W., Sanders J.P.M., Borst D. A freeze-squeeze method for recovering long DNA from agarose gels. Anal. Biochem., 1975, v. 66, p. 213-220.

117. Vacek A.T., Bourque D.P., Hewlett N.G. An ethidium-acry-lamide affinity medium for recovery of nucleic acids from free solution and from polyacrylamide and agarose gels. Anal. Biochem. , 1982, v. 124, N 2, p. 414-420.

118. Vinograd J., Lebovitz J., Radloff R., Watson R., Lai-pis P. The twisted circular form of polyoma viral DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1965, v. 55, N 3, p. 1104-1111.

119. Waalwijk C., Graaff J., MacLaren D.M. Physical mapping of hemolysis plasmid pCW2, which codes for virulence of a neph-ropathogenic Escherichia coli strain. J. Bacteriol., 1984,v. 159, N 1, p. 424-426.

120. Watson R., Konorska-Kozlowska M., Iyer V.ÏT., Yaguchi M.,. Visentin L.P. Comparison of plasmids Col E2-P9 and Col E2-CA42 and their immunity proteins. J.Bacteriol., v. 153, U 3, p.1552-1557.

121. Watson R., Visentin L.P. Restriction endonuclease mapping of C01E2-P9 and ColE2-CA38 plasmids. Gene, 1980, v. 10, p. 307-318.

122. Weiher H., Schaller H. Segment-specific mutagenesis: extensive mutagenesis of a lac promoter operator element. Proc. Hat1. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, U 5, p. 1408-1412.

123. Womble D.D., Taylor ,D.P., Rownd R.H. Method for obtaining more-accurate covalently closed circular plasmid to chromosome rations from bacterial lysates by dyebuoyant density centrifugation. - J.Bacteriol., 1977, v. 130, p. 148-153.

124. Zasloff M., Ginder G.D., Felsenfeld G. A new method for the purification and identification of covalently closed circular DNA molecular. -Hucl. Acids Res., 1978, v. 5, H 4, p.1139-1151.

125. Zassenhaus H.P., Butov R.A., Hannon Y.P. Rapid electro-elution of nucleic acids from agarose and acrylamide gels. -Anal Biochem., 1982, v. 125, N 1, p. 125-130.