Генетическая характеристика хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов возбудителя чумы

Зудина, Ирина Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическая характеристика хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов возбудителя чумы
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая характеристика хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов возбудителя чумы"

На правах рукописи

РГ5 ОД

' в ЛЛ

ЗУДИНА Ирина Витальевна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОМОСОМНОЙ ОБЛАСТИ ПИГМЕНТАЦИИ ШТАММОВ ПЯТИ ПОДВИДОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

03.00.07 - микробиология 03.00.15- генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2000

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, с.н.с. кандидат медицинских наук

В.В. Кутырев Е.Г. Булгакова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю.А. Попов

кандидат биологических наук Н.А. Шишкинская

Ведущая организация: НИИ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

Защита состоится 2000 г. в /Г часов на заседа-

нии диссертационного совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском институте "Микроб" Министерства здравоохранения Российской Федерации (410005, Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан "¿■3" НС. > //,л 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Г.А. Корнеев

Р264. 024 О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы в микробиологии интенсивно развивается научное направление, связанное с изучением строения, функционирования и распространенности в геномах бактерий так называемых "островов патогенности", или PAIs (pathogenicity islands) (Hacker et al., 1990; Blum et al., 1994; Hacker et al„ 1997; Buchrieser et al., 1998). У многих грамнегативных и грампозитивных патогенных микроорганизмов в PAIs сконцентрированы гены, кодирующие токсины, адгезины, ин-вазины и другие факторы вирулентности.

Патогенные для человека виды иерсиний Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica также обладают очень близкими по строению "островами высокой патогенности" - HPI (hight pathogenicity islands) (Buchrieser et al., 1998, 1998a; Rakin et al., 1999). Отличительной особенностью этих микроорганизмов является то, что в обнаруженных у них HPI находятся не гены патогенности как таковые, а оперон Ybt-зависимой (Ybt - yersiniabactin) системы ассимиляции железа. Гены HPI отвечают за чувствительность штамма к действию пестицина (Рзп+-фенотип определяют после удаления плазмиды pPst), его способность к росту в условиях дефицита ионов железа при 37 °С и, как следствие этого, вирулентность для биопробных животных (Perry, 1993; Rakin et al., 1994a).

У возбудителя чумы "остров высокой патогенности" расположен в пределах хромосомной области пигментации (pgm-область, ~ 102 т.п.н.) (Fetherston et al., 1992) в непосредственной близости от hmsFHRS оперона, гены которого обеспечивают экспрессию признака пигментации (Hms+-фенотип) (Lillard et al., 1997; Buchrieser et al., 1998). Последовательность HPI существенно отличается показателем ГЦ-пар нуклеиновых оснований (5659%) от ДНК hmsFHRS оперона и остальной хромосомы (49-50%) (Fetherston, Perry, 1994; Buchrieser et al., 1999). В связи с этим в пределах pgm-области выделяют два региона: Лш^-регион (регион пигментации) и ybt-регион, содержащий гены HPI.

Область пигментации нестабильна: обширные делеции этого участка хромосомы (Д/>£/и-мутации) (Fetherston et al., 1992) возникают с частотой 10"5 (Brubaker, 1969) в процессе гомологичной рекомбинации между двумя флан-

кирующими копиями IS/00 элементов (Portnoy, Falkow, 1981; Fetherston, Perry, 1994). В результате этого мутационного события клетки чумного микроба сочетанно утрачивают признак пигментации и все признаки, кодируемые генами "острова высокой патогенности". До недавнего времени считалось, что у возбудителя чумы обширная делеция области пигментации является едва ли не единственным типом мутации, приводящим к возникновению Hms'-штаммов.

В природных очагах чумы на территории России и сопредельных государств помимо штаммов основного подвида У. pestis циркулируют штаммы алтайского, гиссарского, кавказского и улэгейского подвидов (в соответствии с классификацией, принятой на Совещании по таксонамии и номенклатуре чумного микроба в Саратове в 1985 г.), для которых характерен целый ряд отличительных признаков, в числе которых - избирательная вирулентность и низкая эпидемическая значимость (Кокушкин, 1995). В отечественной литературе имеются отдельные сообщения, что у штаммов кавказского и алтайского подвидов утрата признака пигментации не сопровождается сочетанной потерей чувствительности к пестицину и вирулентности для белых мышей (Пак, Шашаев, 1971; Кутырев, 1992). Установлено также, что для штаммов кавказского подвида У. pestis свойственна более низкая, чем у штаммов основного подвида, частота возникновения непигментированных мутантов (Классовский, Пейсахис, 1974; Мартиневский, Павличенко, 1978; Мартинев-ский, 1988; Кутырев, 1992). Было высказано предположение, что разный характер изменчивости Hms- и Psn-признаков у штаммов этих подвидов обусловлен существованием отличий в генетической организации hms- и ybt-регионов хромосомной области пигментации (Кутырев, 1992). Выявление изменений в структуре этих участков хромосомы может позволить получить дополнительные сведения о роли отдельных генов hmsFHRS-оперона и HPI в проявлении патогенности возбудителем чумы. Кроме того, эти данные могут оказаться ценными для установления вертикальных и горизонтальных эволюционных связей не только между подвидами У. pestis, но и между другими видами рода Yersinia.

дели штаммов основного подвида. Информация об изменчивости признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации, у четырех неосновных подвидов У. резШ крайне ограничена. В частности, не известно, является ли необычный характер изменчивости Рбп- и НгпБ-признаков особенностью только штаммов алтайского и кавказского подвида, или он свойственен и для штаммов других неосновных подвидов. Не установлены типы мутаций, приводящие к утрате признака пигментации и вирулентности у штаммов пяти подвидов чумного микроба. Неизученным также остается один из интереснейших вопросов, касающийся характера взаимоотношений признаков пигментации, чувствительности к пестицину и способности к потреблению ионов железа при 37 °С с вирулентностью у штаммов пяти подвидов У. ревИь, циркулирующих в природных очагах на территории стран СНГ и Монголии.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ явилось проведение сравнительного изучения признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации, для получения генетической характеристики этого участка хромосомы у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Разработать питательную среду для проведения поклонального анализа штаммов пяти подвидов возбудителя чумы по признакам пигментации и способности к росту в условиях дефицита железа.

2. Охарактеризовать фенотипические признаки природных штаммов чумного микроба различного происхождения, кодируемые генами области пигментации.

3. Создать и охарактеризовать коллекцию изогенных спонтанных мутантов типовых и референтных штаммов пяти подвидов чумного микроба по признакам пигментации, чувствительности к пестицину, способности к росту в условиях дефицита железа при 37 °С и вирулентности.

4. Методом ПЦР-анапиза выявить у полученных мутантов чумного микроба возможные изменения в структуре области пигментации хромосомы.

5. Определить частоты возникновения и встречаемости спонтанных

мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы.

6. На основе полученных данных провести сравнительный анализ процессов популяционной изменчивости по признакам, кодируемым генами области пигментации, у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые с привлечением статистических методов проведены исследования изменчивости признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов чумного микроба. Установлены достоверные различия в частотах возникновения и встречаемости мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы. Показано, что у штаммов основного подвида наиболее часто происходят обширные делеции области пигментации и мутации в генах ^/-региона. У штаммов неосновных подвидов, наоборот, более часто возникают мутации в генах Итз-региона. Получены новые сведения о различном характере накопления мутантных клеток в популяциях штаммов разных подвидов в процессе хранения при пониженных температурах. На основании этих данных можно заключить, что штаммы основного и четырех неосновных подвидов представляют собой две обособленные группы в пределах вида У. реБЧБ.

Впервые создана коллекция изогенных мутантных по Ншб- и Рбп-признакам вариантов типичных штаммов пяти подвидов чумного микроба. В результате использования этой изогенной системы у штаммов неосновных подвидов возбудителя чумы был определен характер взаимоотношения признаков пигментации, чувствительности к пестицину и способности к росту при 37 °С на железо-хелатированных средах с вирулентностью для белых мышей. Показано, что у штаммов трех неосновных подвидов (гиссарского, алтайского и улэгейского), как и у штаммов основного подвида, вирулентность для белых мышей коррелирует с РБп-признаком и со способностью к росту на средах с дефицитом ионов железа при 37 "С. У отдельных штаммов кавказского подвида отсутствует четкая корреляция между экспрессией Рбп-признака и вирулентностью.

С помощью сравнительного ПЦР-анализа впервые показано, что у

штаммов, циркулирующих в природных очагах чумы на территории стран СНГ и Монголии, утрата одного из признаков (пигментации или чувствительности к пестицину), как правило, обусловлена не обширными делециями hms- или ^¿/-регионов, а более мелкими мутационными событиями, возникающими в генах HPI и hmsFHRS-опърона области пигментации. Новыми так же являются данные о возможности возникновения непигментированных пестицинрезистентных авирулентных мутантов чумного микроба в результате сочетания независимых мутаций в генах hms- или ^¿/-регионов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

В Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб" депонирована коллекция изогеиных спонтанных мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину, выделенных из популяций pPst'-клонов типовых и референтных штаммов пяти подвидов чумного микроба (20 штаммов).

По результатам работы составлены "Методические рекомендации по приготовлению и использованию полусинтетической среды для дифференциации колоний У. pestis по признаку пигментации", которые одобрены Ученым советом Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (протокол № 3 от 26 марта 1996 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб" [по учрежденческому уровню внедрения].

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации представлены и доложены на "Научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России" (Саратов, 1997), научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия,

1999), итоговой научной конференции Рос.НИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2000) и на международном конгрессе "Microbiology 2000" (Мюнхен, Германия,

2000).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в т.ч. одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 17 рисунками. Библиографический указатель содержит 106 отечественных и 110 зарубежных источников.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. У штаммов основного подвида чумного микроба в хромосомной области пигментации чаще всего происходят делеции всей области пигментации, что приводит к возникновению мутантов с непигментированным пести-цинрезистентным авирулентным фенотипом, и нарушения генов уЬ(-региона, проводящие к образованию мутантов с пигментированным пес-тицинрезистентным авирулентным фенотипом.

2. У штаммов алтайского, гиссарского, кавказского и улэгейского подвидов чаще мутируют гены Ишб-региона, что обусловливает возникновение не-пигментированных чувствительных к пестицину вирулентных мутантов.

3. У штаммов пяти подвидов возбудителя чумы возникновение непигмен-тированных пестицинрезистентных мутантов возможно в результате сочетания независимых мутаций в генах двух регионов области пигментации.

4. Хранение штаммов основного подвида чумного микроба на искусственных питательных средах в течение I года вызывает накопление в популяции непигментированных пестицинрезистентных клеток. В популяциях штаммов алтайского, гиссарского, улэгейского и кавказского подвидов в этих условиях увеличивается количество пигментированных пестицинрезистентных и непигментированных пестицинчувствительных клеток.

5. Утрата чувствительности к пестицину у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы, как правило, приводит к потере вирулентности; у пестицинрезистентных пигментированных мутантов отдельных штаммов кавказского подвида возможно сохранение вирулентности для белых мышей.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовано 42 штамма пяти подвидов У. pestis. Для работы отбирались типичные штаммы основного, алтайского, гиссарского, кавказского и улэгейского подвидов, которые были выделены на территориях соответствующих природных очагов чумы от типичных носителей или переносчиков. Бактерии культивировали в жидких и на плотных питательных средах LB (рН 7,2). Среду для получения пестицинрезистентных мутантов готовили на основе 1,5% LB-arapa, добавляя к нему (5:1) супернатант обработанной УФ-светом (45 мин) 48-часовой бульонной культуры EV НИИЭГ. В ходе проведенного исследования также были разработаны составы полусинтетических сред, на которых осуществляли определение признака пигментации и способности к росту в условиях дефицита ионов железа штаммов У. pestis.

Основные фенотипические характеристики штаммов определяли согласно "Руководству по профилактике чумы" (1992).

Элиминацию плазмиды pPst из клеток У. pestis вызывали частыми пассажами культур на косяках с LB-агаром при 4-8 "С с последующим отбором непродуцирующих пестицин клонов (Шведун, Проценко, 1983).

Скрининг штаммов У. pestis на присутствие плазмидных репликонов проводили по методу С. Kado, S.-T. Lui (1981).

ПЦР-реакцию осуществляли в объеме 25 мкл в микроцентрифужных пробирках (500 мкл) на амплификаторе фирмы "Биоком" (Россия). Для детекции гена hmsH были сконструированы праймеры YHMS1/YHMS2 (на основе нуклеотидной последовательности этого гена, опубликованной в GenBank, No.U22837). Праймеры для детекции генов hmsR, psn. irp2, уЫР и ybtQ были предоставлены А. Ракиным (Мюнхенский Институт медицинской микробиологии и гигиены, Германия).

Мутанты по Hms- и Psn-признакам получали путем отбора со среды с Конго красным и пестицином (соответственно). Частоту возникновения мутантов (1 мутация на клетку на генерацию) по признаку пигментации определяли методом, описанным В.Д. Тимаковым и Д.М. Гольдфарб (1958); частоту возникновения мутантов по признаку чувствительности к пестици-

ну определяли методом R Brubaker. (1969). Значения частот мутаций рассчитывали по формуле С. Луриа и М. Дельбрука (цит. по В. Брауну, 1968).

Частоту встречаемости мутантов определяли как соотношение количества мутантов к числу клеток родительского штамма. У выявленных Psn' и Hms'-мутантов устанавливали экспрессию признаков пигментации и чувствительности к пестицину (соответственно). Процедуру повторяли после 1 года хранения при 2-4 °С в 0,4 % агаре LB под минеральным маслом.

Вирулентность исследуемых штаммов определяли при подкожном способе заражения белых мышей по показателю LD50, для подсчета которого использовали формулу Г. Кербера в модификации И.П. Ашмарина и A.A. Воробьева (1962). При ориентировочном определении вирулентности животных заражали дозами 10 и 107 КОЕ (Кутырев, 1992).

Внутренние органы беспородных белых мышей (лимфатические узлы, печень, легкие, почки, сердце) исследовали морфологическими методами. Изготовленные срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Статистическую обработку полученных результатов проводили согласно методикам, изложенным в монографиях "Статистические методы в микробиологических исследованиях" (Ашмарин, Воробьев, 1962), "Биологическая статистика" (Рокицкий, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Фенотипическая характеристика природных штаммов пяти подвидов Y. pestis

Первый этап настоящего исследования был посвящен тестированию природных штаммов пяти подвидов возбудителя чумы по признакам, кодируемым генами хромосомной области пигментации.

Для изучения признака пигментации нами была разработана полусинтетическая среда HMSD, которая характеризуется рядом несомненных преимуществ перед другими средами, используемыми для этой цели. Среда HMSD включает малое количество компонентов (0,75 % казаминовых кислот [Difco Laboratories, США], 0,15 % сульфита натрия, 1,35% агара-агара, 1 мкг бромида тиамина, 3 мг Конго красного), проста в приготовлении и обеспечи-

вает рост штаммов всех подвидов Y. pestis. Более ранний срок выявления признака пигментации (через 2-3 суток инкубации посевов вместо 4-5 суток на среде Дурихина и 4-10 суток на среде Джексона-Берроуза) в значительной мере ускоряет анализ больших выборок мутантных клонов при постановке генетических экспериментов.

При тестировании природных штаммов по признаку пигментации было установлено, что в популяциях большинства штаммов содержались не-пигментированные клетки, что, возможно, явилось результатом их длительного коллекционного хранения. Существенные колебания процентного содержания непигментированных клеток наблюдались в популяциях штаммов основного подвида: от 0 % до 82,4 %. Штаммы кавказского подвида, наоборот, продемонстрировали наибольшую однородность популяций по признаку пигментации (99,6% - 100%). Наибольшее количество непигментированных клеток содержалось в популяциях штаммов улэгейского подвида (от 42,2 % до 93,0 %). В то же время у штаммов алтайского подвида, которые циркулируют в том же природном очаге и на тех же носителях и блохах, что и удэгейские штаммы, содержание непигментированных клеток в популяциях не превышало 16 %.

Основа среды HMSD (без Конго красного) была использована при изучении способности штаммов пяти подвидов возбудителя чумы к росту в условиях дефицита свободных ионов железа. В связи с тем, что при приготовлении данной среды используются высокоочищенные реактивы, содержание железа в ней гораздо меньше (1 мг/л), чем в LB-arape (2 мг/л) или в агаре Хоттингера (3-4 мг/л). Это важное качество основы среды HMSD позволяет использовать более низкие концентрации дорогостоящих хелаторов. Для создания железодефицита к основе среды HMSD добавляли хелаторы, которые наиболее часто используются при изучении штаммов рода Yersinia, - бипири-дил [Serva, Германия], цитрат натрия или этилендиаминдиуксусную кислоту - ЭДДА [Serva, Германия] (Sikkema, Brubaker, 1987, 1989; Кутырев с соавт., 1989; Rakin et al., 1995, 1999). Тестирование природных штаммов Y. pestis, циркулирующих в очагах чумы на территории стран СНГ и Монголии, по способности к росту в условиях дефицита железа показало возможность использования в этих целях сред с 0,2 мМ ЭДДА или 0,1М цитратом натрия, но не с бипиридилом.

Изучение экспрессии Рэп-признака у природных штаммов пяти подвидов К рел/к показало, что большинство штаммов, за исключением штаммов кавказского подвида, иммунны к действию пестицина. Лишь отдельные штаммы гиссарского и удэгейского подвидов были чувствительны к пести-цинам штаммов других подвидов, но не к собственному. Все изученные штаммы алтайского подвида проявили чувствительность к собственному пес-тицину. Важен установленный нами факт, что после элиминации плазмиды рРБ1 штаммы алтайского подвида утрачивают способность угнетать рост собственной культуры. Следовательно, ген(ы) бактериоцина, вызывающего аномальную чувствительность штаммов алтайского подвида, расположен(ы) на плазмиде рРэ^

Таким образом, итогом нашей работы на данном этапе явилось создание питательной среды, позволяющей после добавления Конго красного или хелаторов ионов железа, определять у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы наличие признака пигментации и способности к росту в условиях дефицита ионов железа. Установлено, что подвиды возбудителя чумы различаются степенью накопления непигментированных клеток в популяциях штаммов при их хранении в лиофилизированном состоянии. Наличие у большинства природных штаммов чумного микроба иммунности к действию пестицина сделало невозможным выяснение у них характера изменчивости Рбп-признака. Поэтому для продолжения исследований нестабильности генов дат-области хромосомы перед нами встала необходимость получения чувствительных к пестицину рРБГ-клонов штаммов пяти подвидов К ре^й. Кроме того, после элиминации плазмиды рРв£ штаммы алтайского подвида утрачивают способность угнетать рост собственной культуры, и, таким образом, устраняется возможность ошибки при поиске и идентификации Рбп'-мутантов.

2. Создание коллекции и характеристика изогенных Нтэ"- и Рбп-мутантов штаммов пяти подвидов возбудителя чумы

Следующим этапом наших исследований было создание коллекции изогенных рРБГ-вариантов, несущих мутации в генах области пигментации хромосомы, и проведение на их основе сравнительного анализа изменения

экспрессии фенотипических признаков, кодируемых этими генами, в частности, признака пигментации, чувствительности к пестицину, способности к росту при 37 °С на железодефицитных средах и вирулентности для белых мышей при подкожном способе заражения.

В качестве модельных штаммов были взяты типичные представители пяти подвидов У. ре$И$ - типовые для природных очагов (Степанов с соавт., 1987; Иннокентьева, 1997) штаммы основного [231], гиссарского [А-1249] и алтайского подвидов [И-2359] и референтные (Тимофеева, Логачев, 1978; Кутырев, 1992) штаммы улэгейского [И-3069] и кавказского [6499] подвидов. После элиминации плазмиды рРБ1 из клеток природных штаммов были получены пигментированные, чувствительные к пестицину, вирулентные рРБг"-клоны. Из популяций рРБГ-клонов на средах с Конго красным и пестицином были выделены спонтанные Ншв"- и РБп'-мутанты.

Наиболее редко непигментированные мутанты встречались в популяции штамма 6499 кавказского подвида. В то же время, получение Нгш"-клонов из популяций штаммов других четырех подвидов возбудителя чумы (231 рРбГ, А-1249 рРБГ, И-2359 рРэГ, И-3069 рРБГ) не вызывало затруднений.

Все НгпБ'-мутанты, выделенные из популяции штамма основного подвида, как правило, были пестицинрезистентными. Несмотря на то, что было проверено более 100 непигментированных колоний клона 231 рРбГ, нам не удалось методом случайной выборки получить НтБ'Рзп^-мутант. Клон с таким фенотипом был выделен из отпечатка органов павшей белой мыши, зараженной культурой 231 рРБГ.

Абсолютное большинство непигментированных мутантов штаммов неосновных подвидов возбудителя чумы, полученных со среды с Конго красным, оказались чувствительными к действию пестицина.

Практически у всех штаммов пяти подвидов возбудителя чумы среди нечувствительных к пестицину мутантов преобладали пигментированные варианты. Этот факт расходится с данными, полученными Я. ВгиЬакег (1969) на модели штаммов А12, ОХЛ332 и ТБХ основного подвида, у которых все Рзп'-мутанты были непигментированными. Поэтому нами были исследованы популяции еще 43 рРзГ-клонов 15 штаммов пяти подвидов У. рея^. Оказалось, что большинство Рзп'-мутантов, выделенных из популяций этих штаммов, также имели пигментированный фенотип. Нтз'РБп'-варианты наиболее

сложно было выделить у штаммов кавказского подвида.

В результате проведенной работы из популяций рРБГ-вариантов типовых и референтных штаммов пяти подвидов К рея/и были получены спонтанные мутанты с различным сочетанием признаков пигментации и чувствительности к пестицину: Нп^Рэп* (№1), Нт5+Рзп"(№2), Ншз"Р5п+ (№3) и Нтэ" Рбп" (№4). На основе этих мутантных клонов были созданы изогенные системы штаммов 231 (№1-4), И-3069 (№1-4), И-2359 (№1-4), 6499 (№1-4) и А-1249 (№1-4).

С целью выявления структурных изменений в дам-области хромосомы мутантов был проведен сравнительный ПЦР-анализ с помощью 6 пар прай-меров на фрагменты генов _уЬ/-региона (/ми, ¿гр2, ybtQ,^л уЫР) и Л/и^-региона (ЛшЯ и ИтБК). Было установлено, что у всех Нп^РбгГ- и Нт5~Рзп+-мутантов, независимо от подвидовой принадлежности исходного штамма, в реакционных смесях присутствовали ПЦР-продукты ожидаемого размера. Следовательно, мутации, приведшие к утрате признака пигментации или чувствительности к пестицину у полученных нами мутантов, затронули другие гены ИтзНРЯБ-оперона и убг-региона хромосомной дал-области.

При ПЦР-анализе ДНК Ншз'Рбп'-клонов штаммов основного, алтайского, удэгейского и кавказского подвидов, а также штамма ЕУ НИИЭГ в реакционных смесях не были обнаружены специфические амплификаты. На основании этого факта можно заключить, что утрата Нтя- и Ряп-признаков у этих штаммов произошла в результате обширной делеции р^ш-обласги хромосомы, описанной ранее ,1. Ре^егБкт с соавт. (1992) на модели штамма К1М6+ основного подвида У. ре$№. Кроме того, с полученными нами данными согласуются результаты исследований отечественных ученых (Бобров, 1995; Бобров, Филиппов, 1997), показавших, что НгпБ'Рзп'-мутанты штамма 231 основного подвида возбудителя чумы имеют значительные по протяженности генетические повреждения области пигментации хромосомы.

Положительные результаты в ПЦР с праймерами для детекции 6 генов у клона А-1249 №4 позволили нам выявить существование еще одного механизма возникновения непигментированных, пестицинрезистентных мутантов - в результате сочетания двух независимых мутационных событий, произошедших в генах Ьт- и>6/-регионов области пигментации. Аналогичные мутанты были обнаружены также у ряда других штаммов основного, алтайско-

го, гиссарского и улэгейского подвидов У pestis.

Таким образом, сравнительный ПЦР-аюлш ДНК спонтанных мутантов на присутствие 6 фрагментов генов области пигментации показал, что у штаммов пяти подвидов У. pestis, циркулирующих в природных очагах на территории стран СНГ и Монголии, утрата Hms- и ftn-признаков происходит, либо в результате обширной делеции (^gw-мутации) области пигментации, либо в результате небольших мутаций в генах hms- и >>6/-регионов. Ни в одном случае у штаммов возбудителя чумы не была зафиксирована независимая утрата одного из регионов р^п-области. Эти данные имеют важное теоретическое значение. Известно, что точная эксцизия "острова высокой патоген-ности" у штаммов У. pseudotuberculosis происходит с частотой 10~4 (Buhcrieser et al., 1998А). Аналогичная мутация, как оказалось, не возникает у штаммов основного подвида У. pestis, циркулирующих в природных очагах на территории стран Азии, Америки и Африки (Iteman et al, 1993; Buhcrieser etaL, 1998) и, по нашим данным, у штаммов пяти подвидов, циркулирующих на территории стран СНГи Монголии. Эти факты позволяют говорить о том, что стабилизация НИ у возбудителя чумы произошла, скорее всего, после отделения вида У. pestis от общего с видом У. pseudotuberculosis предшественника, но до дифференциации на подвиды. Кроме того, известно, что у штаммов У. pestis, циркулирующих в природных очагах Кении, Заира и Турции, утрата признака пигментации, как правило, происходит в результате обширных делеции /г/и^-региона, вызванных рекомбинациями дополнительных копий IS/00-элементов (Buhcrieser et al., 1998). В нашем же случае установить тип мутации, вызвавшей утрату признака пигментации у HmsTW-мутантов штаммов пяти подвидов У. pestis, можно будет только после секвенирования последовательности их hmsHFRSkmepoHOB.

Известно, что пестицинрезистентность штаммов чумного микроба может быть обусловлена мутациями, как в гене psn, кодирующем рецептор пес-тицина, так и в регуляторном генeybtA и в генах, отвечающих за продукцию иерсиниабактина (Fetherston et al., 1996). S. Bearden с соавторами (1997) опубликовали результаты заражения белых мышей Psn'-клонами штамма основного подвида У. pestis KIM5, сконструированными с помощью молеку-лярно-генетических методов. Оказалось, что делеция гена psn, повышала значение LD50 штамма более чем в 2200 раз; а делеция в области гена irp2 - в

10000 раз, что делало штамм практически авирулентным при подкожном способе заражения. В этой связи, для уточнения характера изменений в генах _у6/-региона у полученных нами Нтэ^п'-мутантов необходимо было изучить их способность к росту в условиях дефицита ионов железа при 37 °С, а также вызывать гибель белых мышей при подкожном способе заражения.

Природные штаммы и их изогенные мутантные клоны высевались на среды, содержащие в качестве хелатора ионов железа цитрат натрия или ЭДДА. Было установлено, что все штаммы пяти подвидов У. рюШ и их мутанты на среде с цитратом натрия при 37 °С росли гораздо хуже, чем при 28 °С. Кроме того, Др^-мутанты штаммов И-2359, И-3069 и 6499 на этой среде проявили способность к росту при 28 °С и 37 °С. Эти факты позволяют предположить существование у возбудителя чумы системы ассимиляции ионов железа из хелатов с цитратом натрия, гены которой расположены вне р£/я-области. Не исключено также, что штаммы основного и неосновных подвидов в этих условиях используют разные системы потребления железа.

Использование ЭДДА в качестве хелатора ионов железа позволило выявить у штаммов возбудителя чумы тесную корреляцию между способностью к росту в железодефицитных условиях при 37 °С и наличием Рэп-признака (табл. 1). Исключение составил только чувствительный к пестицину мутант И-3069 №3, который при 37 °С рос на этой среде, а также на среде с цитратом натрия хуже, чем РэгГ-клон И-3069 №2. Возможно, у этого мутанта произошли дополнительные генетические изменения, сделавшие его неспособным к росту на хелатированных средах.

Тот факт, что Д/?£/и-мутанты штаммов пяти подвидов У. резйз не росли на этой среде при 37 °С, позволил нам заключить, что на этой среде штаммы чумного микроба, относящиеся к разным подвидам, используют одну и ту же систему ассимиляции железа, гены которой расположены в пределах хромосомной области пигментации.

Установлено, что Нп^Рбп'-клоны штаммов всех пяти подвидов У. резв отличие от Д/?£/и-мутантов, сохраняли частичную способность к росту при 37 °С на среде с пониженным содержанием железа. Этот факт можно объяснить разными молекулярными механизмами возникновения Рбп"- мутаций. Протяженная делеция р^/и-области хромосомы у НгпБ'Рзп'-мутантов приводит к потере генов УЫ-зависимой системы железопотребления, что

Таблица 1. Способность к росту на среде с 0,2 мМ ЭДДА при 37 °С и вирулентность изогенных мутантных рРБГ-вариантов штаммов пяти подвидов У. ре^С/.?

ч Рост в условиях Вирулентность

я m Штамм, Фенотип дефицита для белых мышей,

Ч о № клона ионов железа (КОЕ)

С при 37 °С 10J 10'

pestis 231 №1 Hms+Psn+ +++* 3/3** 3/3

231 №2 Hms^sn" + 0/3 0/3

231 №3 Hms"Psn+ +++ 3/3 3/3

231 №4 HmsTsn' - 0/3 0/3

I А-1249 № 1 Hms+Psn+ +++ 2/3 ' 3/3

А-1249 №2 Hms+Psn" + 0/3 0/3

А-1249 №3 Hms*Psn+ +++ 3/3 3/3

А-1249 №4 Hms'Psn" - 0/3 0/3

altaica И-2359 №1 Hms+Psn+ +++ 3/3 2/3

И-2359 №2 Hms'Psn" + 0/3 0/3

И-2359 №3 Hms'Psn+ +++ 3/3 3/3

И-2359 №4 Hms'Psn" - 0/3 0/3

1 И-3069 №1 Hms+Psn+ +++ 2/3 3/3

И-3069 №2 Hms+Psn" ++ 0/3 0/3

И-3069 №3 Hms"Psn+ + 2/3 3/3

И-3069 №4 Hms'Psn" - 0/3 0/3

1 6499№1 Hms+Psn+ ++ 3/3 3/3

6499№2 Hms+Psn" + 1 /3 3/3

6499№3 Hms"Psn+ ++ 3/3 3/3

6499№4 Hms'Psn" - 0/3 0/3

*В таблице приводятся данные о росте мутантов на железодефицитной среде по сравнению со средой без ЭДОА с одинаковой эффективностью "+++"; более слабый сплошной "++"; в виде единичных, очень мелких колоний "+"; отсутствие роста "-".

**Числитель - количество павших, знаменатель - количество зараженных биопроб.

обусловливает прекращение продукции рецептора и сидерофоров. В результате штамм утрачивает пестицинчувствительность и способность ассимилировать ионы железа из хелатов с ЭДДА при 37 °С. У Ншб^Рзп'-клонов гены УЫ-зависимой системы, как правило, сохраняются, а чувствительность к пес-

тицину у них утрачивается в результате более мелких мутаций в генах уЫ-региона. Судя по тому, что мутанты хотя и слабо, но все-таки растут при 37 "С в условиях железодефицита, мутации в генах ^¿/-региона приводят не к прекращению, как у Ддои-мутантов, а только к снижению продукции элементов УЬс-зависимой системы. По всей видимости, невысокое содержание белка-рецептора в клеточной стенке способно поддерживать слабый рост штамма на железодефицитной среде, но оказывается недостаточным для выявления у штамма чувствительности к пестицину.

Заражение белых мышей мутантными клонами чумного микроба показало, что вирулентность коррелирует только с наличием у клона чувствительности к пестицину, но не признака пигментации (табл. 1). Все пигментированные и непигментированные РзгГ-клоны, независимо от их подвидовой принадлежности, проявили способность вызывать гибель белых мышей. Ншз^Рбп'-ююны штаммов основного, алтайского, гиссарского и удэгейского подвидов оказались авирулентными несмотря на то, что они демонстрировали слабый рост на железодефицитной среде с ЭДДА при 37 °С.

Заражение белых мышей Нп^Рэп'-клоном 6499 №2 штамма кавказского подвида характеризовалось, по сравнению с исходным вирулентным (Щи=1.3х10' КОЕ) штаммом 6499, заметным снижением вирулентности (1X^=1,4Х104 КОЕ) Морфологическими методами установлено, что у белых мышей, зараженных этим мутантом, происходят более глубокие воспалительные, дистрофические и некротические изменения в органах, возможно, ю-за затяжного характера течения инфекционного процесса (в среднем 7-8 суток). По всей видимости, у Нп^Рбп'-клонов штаммов кавказского подвида и штаммов других четырех подвидов У. реэЧз утрата чувствительности к пестицину вызвана мутациями в разных генах ^¿¿-региона, что позволяет предположить существование отличий в организации их "островов высокой пато-генности".

Таким образом, на данном этапе работы было установлено, что большинство сходных по фенотипу спонтанных мутантов рРэГ-клонов типовых и референтных штаммов пяти подвидов У реьиь имели идентичный ПЦР-профиль и проявили одинаковый характер роста на среде с ЭДДА при 37 °С, что говорит о несомненной филогенетической близости штаммов пяти подвидов возбудителя чумы. Изучение вирулентности мутантов для белых мы-

шей при подкожном способе заражения показало возможность возникновения у возбудителя чумы спонтанных пигментированных пестицинрезистент-ных клонов, проявляющих среднюю по классификации ЛА Тимофеевой и ГЛ. Апарина (1969) вирулентность.

3. Сравнительное изучение нестабильности ^«-области хромосомы у рРБГ-клонов штаммов пяти подвидов У. рет/и

Количественно выраженной величиной, характеризующей нестабильность гена или целого участка ДНК, является частота возникновения в них мутации. В задачу данного раздела работы входило определение значений частот возникновения мутаций в генах Ат5///г/?5-оперона и убг-региона хромосомной области пигментации у типовых и референтных штаммов пяти подвидов У. резНь и изучение их популяционного состава после хранения в лабораторных условиях.

В результате проведенных исследований нам удалось установить, что значения частот возникновения НтБ'-клеток в популяциях рРБ^клонов штаммов пяти подвидов У. ре$ш довольно близки и колеблются в пределах З^хЮ"4- 8,53><10"6 (табл.2). Как оказалось, наиболее редко непигментиро-ванные мутанты возникают в популяции штамма 6499 (7,65± 0,89x10"6) кавказского подвида, тогда как, штамм улэгейского подвида продемонстрировал наименьшую стабильность Ншз-признака (4,14±0,25 хЮ"4). У штаммов основного, алтайского и гиссарского подвидов различия в значениях частот возникновения НтБ'-мутантов оказались статистически недостоверны. Однако тестирование непигментированных мутантов на чувствительность к действию пестицина выявило существенные различия между подвидами чумного микроба. Оказалось, что утрата признака пигментации у штаммов неосновных подвидов, как правило, не сопровождается сочетанной потерей чувствительности к пестицину, тогда как все отобранные с цветной среды Нгт-мутанты штаммов основного подвида были пестицинрезистентными.

Значение частоты возникновения Рэт-мутации у штамма 231 №1 основного подвида (1,10± 0,70x10'5), установленное в наших экспериментах, и значение, вычисленное ранее Л ВгиЬакег (1969) на модели другого штамма основного подвида - А-12(1,06х10"5), оказались очень близки. Вто же время час-

Таблица 2. Изменчивость признаков пигментации и чувствительности к пестицину у рРвГ - клонов штаммов пяти подвидов У. рез)1$

Подвид У. Штамм Изменчивость Нт5+-признака Изменчивость Рбп* -признака

Частота возникновения Нгпз'-мутации Содержание Рэп'-мутантов среди Ншз'-клонов, (%) Частота возникновения Рзп'-мутации Содержание НтБ'-мутантов среди Рзп'-клонов, (%)

резНл 231 №1 7,31 ± 0,50 х 10° 100 1,10 ± 0,70 х 10° 19,20

ulegeica И-3069 №1 4,14 ±0,25 х Ю"' 0 4,22 ±0,51 х 10"' 3,00

а1Ю1са И-2359№1 7,81 ±0,«9 х 10° 0 2,04 ± 0,53 х 10" 2,65

¡115хаг1са А-1249 №1 7,07 ± 0,10 х 10° 0 3,38 ± 1,03 х 10"' 0,40

саисазгса 6499 №1 7,65 ± 0,89 х Ю"ь 0 8,77 ± 2,79 х Ю'в 7,50

ю о

тоты возникновения РБП'-мутангов у штаммов четырех неосновных подвидов были на 2-3 порядка ниже (табл. 2). Доверительные интервалы частот возникновения Рзп'-мутантов у штамма основного подвида 231 №1 и всей группы штаммов неосновных подвидов не трансгрессируют, следовательно, выявленные различия можно считать статистически достоверными с вероятностно не менее 0,95. В группе штаммов неосновных подвидов наибольшую стабильность РБП-признака проявил кавказский штамм 6499 (8,77± 2,79* 10'8).

У остальных штаммов значения частот колебались в пределах от 1,51><10"7 до 4,73 ><10"7. У штаммов всех пяти подвидов возбудителя чумы среди спонтанно возникших РБП'-мутантов непигментированные клоны составляли не более 20 %.

Хранение в 0,4 % ЬВ-агаре при 2-4°С в течение года вызывало существенное изменение популяционного состава у штаммов всех пяти подвидов. Так, мы наблюдали значительное увеличение количества Ншз'РБп'-клеток в популяции штамма 231 №1, тогда как содержание Нт5+Рзп"-клеток возрастало незначительно (табл. 3). В популяциях штаммов алтайского, гиссарского и удэгейского подвидов резко увеличилось количество непигментированных чувствительных к пестицину клеток, тогда как число Нгп5+Р5п"-мутантов почти не изменилось. В то же время, в популяции штамма кавказского подвида количество Нгпб* Реп'-мутантов возросло более чем в 4 тыс. раз, а количество Нтз"Р5п+-мутантов - только на порядок. Характерно, что увеличение содержания Ншз'РБп'-мутантов не наблюдалось в популяциях всех штаммов неосновных подвидов.

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что процессы изменчивости признаков пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов основного и четырех неосновных подвидов возбудителя чумы имеют разнонаправленный характер. Преобладание того или иного типа мутантов в популяции штамма зависит от происхождения штамма и от условий его культивирования. Так, у штаммов основного подвида наиболее часто возникают мутации в генах ^¿г-региона и Д/?£/я-делеции, а у штаммов четырех неосновных подвидов наибольшую нестабильность проявляют гены Лот^-региона. Этот факт является еще одним подтверждением обоснованности разделения вида У. рвьУи на подвиды. Кроме того, полученные нами данные свидетельствуют в пользу существования у штаммов ос-

Таблица 3. Изменение популяционного состава рРзГ клонов штаммов пяти подвидов У. резШ по признакам пигментации и чувствительности к пестицину после 1 года хранения

Подвид, штамм Популяционный состав культур

по Psn-признаку по Hms-признаку

до хранения после 1 года хранения до хранения после 1 года хранения

Встречаемость Рзп" -мутантов, (КОЕ) Содержание Нтв'-мутантов среди Рбп' -клонов, (%) Встречаемость Рбп" -мутантов, (КОЕ) Содержание Ншб'-мутантов среди Рбп' -клонов, (%) Встречаемость Ник" -мутантов, (КОЕ) Содержание Psn'-мугашов среди Hms-кпонов, (%) Встречаемость Нггй-мутангов, (КОЕ) Содержание Рвп-мутантов среди Нтга-клонов, (%)

pestis 231 №1 1,52*0,69хЮ"4 19,20 3,93±1,39хЮ'3 99,00 1,02*0,20x10' 100 3,89*1,51хЮ'2 100

ulegeica И-3069 №1 4,64*0,90x10'' 3,00 6,85*2,85x10'6 1,00 5,34*0,25x10* 0 3,05*0,54x10"' 0

altaica И-2359 №1 1,69*1,20*10' 2,65 6,62*4.55« 10* 2,00 1,13*0,18x1а4 0 8,21*0,74хю"г 0

hissarica А-1249 №1 4,63*1,25*10* 0,40 8,43*5.96x10"6 0,00 1,97*0,20x10* 0 4,43*0,18хЮ: 0

caucasica 6499 №1 9,82*0,30x10' 7,55 4,39*0,75x10'" 0,00 1,12±0,19х1О5 0 6,68*0,90х1О4 0

[О

новного и четырех неосновных подвидов отличий в генетической организации pgw-области хромосомы. Тот факт, что у штаммов неосновных подвидов возникновение Др^от-мутантов происходит на 2-3 порядка реже, чем у штаммов основного подвида, и разница в значениях частот возникновения этих мутаций статистически достоверна, говорит о том, что делеция области пигментации у штаммов неосновных подвидов, скорее всего, обусловлена не гомологичной рекомбинацией фланкирующих IS 100 элементов, а другими молекулярными механизмами. Причиной данного явления может быть, например, отсутствие у штаммов неосновных подвидов одного из фланкирующих IS 100 элементов, как у штаммов У. pseudotuberculosis (Buchrieser et al., 1998A), или его инактивация. Выявление и детальное изучение таких измененных последовательностей ДНК может быть полезно для определения филогенетических связей возбудителя чумы с другими видами бактерий, а также при создании различных зондов и тест-систем молекулярно-эпидемиологического мониторинга. В этой связи, дальнейшие исследования, направленные на изучение структуры pgm-области и "острова высокой пато-генности" у штаммов пяти подвидов У. pestis, являются весьма перспективными.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что процессы изменчивости признаков пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов основного и четырех неосновных подвидов У. pestis имеют разнонаправленный характер. Преобладание того или иного типа мутантов в популяции штамма зависит от происхождения штамма и от условий его культивирования.

2. Созданная на модели типовых и референтных штаммов пяти подвидов Y. pestis коллекция изогенных мутантов, имеющих мутации в различных генах хромосомной области пигментации, и разработанная на основе казами-новых кислот полусинтетическая среда с Конго красным или ЭДДА могут быть использованы при проведении генетического анализа pgm-области возбудителя чумы.

3. У штаммов основного подвида У. pestis с высокой частотой (п*10"5)

образуются непигментированные пестицинрезистентные авирулентные мутанты; у штаммов алтайского, гиссарского, кавказского и улэгейского подвидов частота возникновения таких мутантов на 2-3 порядка ниже. В популяци-' ях штаммов основного подвида возникновение непигментированных чувствительных к пестицину вирулентных мутантов является чрезвычайно редким событием, тогда как в популяциях штаммов неосновных подвидов мутанты с таким фенотипом образуются наиболее часто (п* 10"4 - пх 10~6).

4. Хранение штаммов основного подвида У. pestis на искусственных питательных средах в течение 1 года вызывает накопление в популяции непигментированных, пестицинрезистентных клеток. В популяциях штаммов алтайского, гиссарского, улэгейского и кавказского подвидов в этих условиях увеличивается количество пигментированных, пестицинрезистентных и непигментированных, пестицинчувствительных мутантов.

5. С помощью сравнительного ПЦР-анализа 6 парами праймеров для детекции генов, находящихся в разных регионах /jg/и-области хромосомы, установлено, что пигментированные пестицинрезистентные и непигментированные чувствительные к пестицину мутанты штаммов пяти подвидов У. pestis, по всей видимости, образуются в результате локальных нарушений генов pgm-области. Непигментированные пестицинрезистентные мутанты возникают, как правило, в результате обширной делеции pgm-области у штаммов основного подвида возбудителя чумы с частотой nxlO"5, у штаммов четырех неосновных подвидов - с частотой nxlO'7 - пхЮ"8. Возможно возникновение мутантов с таким фенотипом в результате сочетания мутаций в генах двух регионов этого участка хромосомы.

6. Способность пестицинрезистентных мутантов У. pestis к росту при 37 "С на среде с 0,2 мМ ЭДДА зависит от характера генетических изменений в pgm-области. Рост пестицинрезистентных пигментированных мутантов, имеющих локальные мутации в генах ^/-региона, в этих условиях ухудшается, а рост пестицинрезистентных непигментированных мутантов, возникших в результате делеции всей области пигментации, подавляется полностью.

7. Утрата чувствительности к пестицину у штаммов пяти подвидов У. pestis, как правило, приводит к потере вирулентности. У пестицинрезистентных пигментированных мутантов отдельных штаммов кавказского подвида возможно сохранение вирулентности для белых мышей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зудина И.В., Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. Изучение взаимосвязи мутаций по Hms- и Psn-признакам у штаммов Yersinia pestis пяти подвидов// Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образов, противочум. службы России (16-18 сент. 1997). - Т.2. - Саратов, 1997. - С.53-54.

2. Зудина И.В., Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. Создание коллекции отличающихся по плазмидному составу изогенных вариантов штаммов пяти подвидов Yersinia pestis И Там же. - Т.2. - Саратов, 1997. - С.54-55.

3. Зудина И.В., Булгакова Е.Г., Проценко O.A., Кутырев В.В. Генетическая природа чувствительности к пестицину 1 штаммов алтайского подвида возбудителя чумы // Пробл. особо опасных инф.- Саратов, 1998. - С. 129132.

4. Кутырев В.В., Булгакова Е.Г., Филиппов A.A., Бобров А.Г., Зудина И.В., Проценко O.A. Современные представления о молекулярной организации генома возбудителя чумы // Пробл. сан. эпид. охраны территории стран Содружества Независ. Госуд.: Тез. докл. межд. Науч.-практ. конф. 15-17 сент. 1998. - Саратов: изд-во Сарат. ун-та, 1998.- С. 139-140.

5. Бобров А.Г., Зудина И.В., Булгакова Е.Г. Аномальная чувствительность к пестицину I штаммов Yersinia pestis алтайского подвида определяется собственной плазмидой пестициногенности // Scient. J. - 1999. - №7. - P. 231-232.

6. Зудина И.В., Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. Изучение роста Psn-мутантов чумного микроба на средах с различными хелаторами ионов железа // Там же. - Р. 243-244.

7. Зудина И.В., Булгакова Е.Г., Видяева H.A., Кутырев В.В. Изучение роста Psn' и Hms' мутантов чумного микроба на средах с различными хелаторами ионов железа // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1999. - С. 162168.

8. Boolgakowa Е., Pelludat С., Zoodina 1., Rakin A., Kutyrev V., Heesemann J. Complementation of Yersinia pestis EV76 with the yersiniabactin "core" of Yersinia enterocolitica H Abstr. Gemeinsamer Kongreß "Microbiology 2000". - München, Germany, 2000. - P. 178.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зудина, Ирина Витальевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональная организация области пигментации иерсиний.

1.1.1. Область пигментации хромосомы Y. pestis.

1.1.2. Область пигментации хромосомы энтеропатогенных иерсиний.

1.1.3. Нестабильность "островов высокой патогенности" возбудителя чумы и энтеропатогенных иерсиний.

1.2. Фенотипическое проявление признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации, у природных штаммов пяти подвидов Y. pestis.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Питательные среды, препараты и реактивы.

2.3. Методы исследований.

Глава 3. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНЫХ

ШТАММОВ ПЯТИ ПОДВИДОВ Y. PESTIS.

3.1. Конструирование полу синтетической среды для определения признака пигментации у штаммов пяти подвидов Y. pestis.

3.2. Изучение состава клеточной популяции природных штаммов Y. pestis по признаку пигментации.

3.3. Рост природных штаммов пяти подвидов Y. pestis на питательных средах с дефицитом свободных ионов железа.

3.4. Проявление признака чувствительности к пестицину у природных штаммов пяти подвидов чумного микроба.

Глава 4. СОЗДАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ И ХАРАКТЕРИСТИКА

ИЗОГЕННЫХ HMS"- И Р SN'-МУТАНТОВ ШТАММОВ ПЯТИ ПОДВИДОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.

4.1. Получение pPst"-вариантов типовых и референтных штаммов пяти подвидов Y. pestis.

4.2. Создание коллекции изогенных клонов штаммов пяти подвидов Y. pestis, мутантных по признакам пигментации и чувствительности к пестицину.

4.3. Выявление структурных изменений в pgm-области хромосомы мутантных клонов штаммов Y. pestis.

4.4. Рост мутантных клонов штаммов возбудителя чумы на питательных средах с пониженным содержанием свободных ионов железа.

4.5. Определение вирулентности изогенных мутантных клонов штаммов чумного микроба.

Глава 5. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕСТАБИЛЬНОСТИ PGM-ОБЛАСТИ ХРОМОСОМЫ У pPST-КЛОНОВ ШТАММОВ ПЯТИ ПОДВИДОВ К PESTIS.

5.1. Определение частоты возникновения мутаций по признаку пигментации.

5.2. Определение частоты возникновения мутаций по признаку чувствительности к пестицину.

5.3. Определение частоты встречаемости Hms"- и Psn'-мутантов в популяциях pPsf-клонов штаммов пяти подвидов чумного микроба в процессе хранения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая характеристика хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов возбудителя чумы"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы в микробиологии интенсивно развивается научное направление, связанное с изучением строения, функционирования и распространенности в геномах бактерий так называемых "островов па-тогенности", или PAIs (pathogenicity islands) (Hacker et al., 1990; Blum et al., 1994; Hacker et al., 1997; Buchrieser et al., 1998). У многих грамнегативных и грампозитив-ных патогенных микроорганизмов в PAIs сконцентрированы гены, кодирующие токсины, адгезины, инвазины и другие факторы вирулентности.

У возбудителя чумы "остров высокой патогенности" расположен в пределах хромосомной области пигментации (pgm-область, -102 т.п.н.) (Fetherston et al., 1992) в непосредственной близости от hmsFHRS оперона, гены которого обеспечивают экспрессию признака пигментации (Нш8+-фенотип) (Lillard et al., 1997; Buchrieser et al., 1998). Последовательность HPI существенно отличается показателем ГЦ-пар нуклеиновых оснований (56 % - 59%) от ДНК hmsFHRS оперона и остальной хромосомы (49 % - 50 %) (Fetherston, Perry, 1994; Buchrieser et al., 1999). В связи с этим в пределах pgm-области выделяют два региона: hms-регион (регион пигментации) и ybt-регион, содержащий гены HPI.

Область пигментации нестабильна: обширные делеции этого участка хромосомы (Адат-мутации) (Fetherston et al., 1992) возникают с частотой 10"5 (Brubaker, 1969) в процессе гомологичной рекомбинации между двумя фланкирующими копиями ISI00 элементов (Portnoy, Falkow, 1981; Fetherston, Perry, 1994). В результате этого 6 мутационного события клетки чумного микроба сочетанно утрачивают признак пигментации и все признаки, кодируемые генами "острова высокой патогенности". До недавнего времени считалось, что у возбудителя чумы обширная делеция области пигментации является едва ли не единственным типом мутации, приводящим к возникновению Hms'-штаммов.

В природных очагах чумы на территории России и сопредельных государств помимо штаммов основного подвида Y. pestis циркулируют штаммы алтайского, гис-сарского, кавказского и удэгейского подвидов (в соответствии с классификацией, принятой на Совещании по таксонамии и номенклатуре чумного микроба в Саратове в 1985 г.), для которых характерен целый ряд отличительных признаков, в числе которых - избирательная вирулентность и низкая эпидемическая значимость (Кокуш-кин, 1995). В отечественной литературе имеются отдельные сообщения, что у штаммов кавказского и алтайского подвидов утрата признака пигментации не сопровождается сочетанной потерей чувствительности к пестицину и вирулентности для белых мышей (Пак, Шашаев, 1971; Кутырев, 1992). Установлено также, что для штаммов кавказского подвида Y. pestis свойственна более низкая, чем у штаммов основного подвида, частота возникновения непигментированных мутантов (Классовский, Пей-сахис, 1974; Мартиневский, Павличенко, 1978; Мартиневский, 1988; Кутырев, 1992). Было высказано предположение, что разный характер изменчивости Hms- и Psn-признаков у штаммов этих подвидов обусловлен существованием отличий в генетической организации hms- и у/^-регионов хромосомной области пигментации (Кутырев, 1992). Выявление изменений в структуре этих участков хромосомы может позволить получить дополнительные сведения о роли отдельных генов hmsFHRS-оперона и HPI в проявлении патогенности возбудителем чумы. Кроме того, эти данные могут оказаться ценными для установления вертикальных и горизонтальных эволюционных связей не только между подвидами Y. pestis, но и между другими видами рода Yersinia.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучения организации pgm-области хромосомы возбудителя чумы. Однако до настоящего времени большинство исследований в этом направлении проводилось на модели штаммов основного подвида. Информация об изменчивости признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации, у четырех неосновных подвидов Y. pestis крайне ограничена. В частности, не известно, является ли необычный характер изменчивости Psn7 и Hms-признаков особенностью только штаммов алтайского и кавказского подвида, или он свойственен и для штаммов других неосновных подвидов. Не установлены типы мутаций, приводящие к утрате признака пигментации и вирулентности у штаммов пяти подвидов чумного микроба. Неизученным также остается один из интереснейших вопросов, касающийся характера взаимоотношений признаков пигментации, чувствительности к пестицину и способности к потреблению ионов железа при 37 °С с вирулентностью у штаммов пяти подвидов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах на территории стран СНГ и Монголии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

4. Методом ПЦР-анализа выявить у полученных мутантов чумного микроба возможные изменения в структуре области пигментации хромосомы.

5. Определить частоты возникновения и встречаемости спонтанных мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые с привлечением статистических методов проведены исследования изменчивости признаков, кодируемых генами хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов чумного микроба. Установлены достоверные различия в частотах возникновения и встречаемости мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы. Показано, что у штаммов основного подвида наиболее часто происходят обширные делеции области пигментации и мутации в генах ^/-региона. У штаммов неосновных подвидов, наоборот, более часто возникают мутации в генах /шя-региона. Получены новые сведения о различном характере накопления мутантных клеток в популяциях штаммов разных подвидов в процессе хранения при пониженных температурах. На основании этих данных можно заключить, что штаммы основного и четырех неосновных подвидов представляют собой две обособленные группы в пределах вида Y. pestis.

Впервые создана коллекция изогенных мутантных по Hms- и Psn-признакам вариантов типичных штаммов пяти подвидов чумного микроба. В результате использования этой изогенной системы у штаммов неосновных подвидов возбудителя чумы был определен характер взаимоотношения признаков пигментации, чувствительности к пестицину и способности к росту при 37 °С на железо-хелатированных средах с вирулентностью для белых мышей. Показано, что у штаммов трех неосновных подвидов (гиссарского, алтайского и удэгейского), как и у штаммов основного подвида, вирулентность для белых мышей коррелирует с Psn-признаком и со способностью к росту на средах с дефицитом ионов железа при 37 °С. У отдельных штаммов кавказского подвида отсутствует четкая корреляция между экспрессией Psn-признака и вирулентностью.

С помощью сравнительного ПЦР-анализа впервые показано, что у штаммов, циркулирующих в природных очагах чумы на территории стран СНГ и Монголии, утрата одного из признаков (пигментации или чувствительности к пестицину), как правило, обусловлена не обширными делениями hms- или ^-регионов, а более мелкими мутационными событиями, возникающими в генах HPI и hmsFHRS-оиероиа. области пигментации. Новыми также являются данные о возможности возникновения непиг-ментированных пестицинрезистентных авирулентных мутантов чумного микроба в 9 результате сочетания независимых мутаций в генах hms- или ^-регионов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

В Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб" депонирована коллекция изогенных спонтанных мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину, выделенных из популяций pPsf-клонов типовых и референтных штаммов пяти подвидов чумного микроба (20 штаммов).

По результатам работы составлены "Методические рекомендации по приготовлению и использованию полусинтетической среды для дифференциации колоний Y. pestis по признаку пигментации", которые одобрены Ученым советом Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (протокол № 3 от 26 марта 1996 г.) и утверждены директором РосНИПЧИ "Микроб" [по учрежденческому уровню внедрения].

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Зудина, Ирина Витальевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что процессы изменчивости признаков пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов основного и четырех неосновных подвидов Y. pestis имеют разнонаправленный характер. Преобладание того или иного типа мутантов в популяции штамма зависит от происхождения штамма и от условий его культивирования.

2. Созданная на модели типовых и референтных штаммов пяти подвидов Y. pestis коллекция изогенных мутантов, имеющих мутации в различных генах хромосомной области пигментации, и разработанная на основе казаминовых кислот полусинтетическая среда с Конго красным или ЭДДА могут быть использованы при проведении генетического анализадат-области возбудителя чумы.

3. У штаммов основного подвида Y. pestis с высокой частотой (n х 10"5) образуются непигментированные пестицинрезистентные авирулентные мутанты; у штаммов алтайского, гиссарского, кавказского и улэгейского подвидов частота возникновения таких мутантов на 2-3 порядка ниже. В популяциях штаммов основного подвида возникновение непигментированных чувствительных к пестицину вирулентных мутантов является чрезвычайно редким событием, тогда как в популяциях штаммов неосновных подвидов мутанты с таким фенотипом образуются наиболее часто (пх Ю"4- их 10"6).

4. Хранение штаммов основного подвида Y. pestis на искусственных питательных средах в течение 1 года вызывает накопление в популяции непигментированных, пестицинрезистентных клеток. В популяциях штаммов алтайского, гиссарского, улэгейского и кавказского подвидов в этих условиях увеличивается количество пигментированных пестицинрезистентных и непигментированных пестицинчувстви-тельных мутантов.

5. С помощью сравнительного ПЦР-анализа 6 парами праймеров для детекции генов, находящихся в разных регионах /^m-области хромосомы, установлено, что пигментированные пестицинрезистентные и непигментированные чувствительные к пестицину мутанты штаммов пяти подвидов Y. pestis, по всей видимости, образуются в результате локальных нарушений генов pgm-области. Непигментированные пести

96 цинрезистентные мутанты возникают, как правило, в результате обширной делении д^т-области у штаммов основного подвида возбудителя чумы с частотой nx 10"5, у штаммов четырех неосновных подвидов - с частотой n х 10"7 - n х Ю"8. Возможно возникновение мутантов с таким фенотипом в результате сочетания мутаций в генах двух регионов этого участка хромосомы.

6. Способность пестицинрезистентных мутантов Y. pestis к росту при 37 °С на среде с 0,2 мМ ЭДДА зависит от характера генетических изменений в pgm-области. Рост пестицинрезистентных пигментированных мутантов, имеющих локальные мутации в генах ybt-региона, в этих условиях ухудшается, а рост пестицинрезистентных непигментированных мутантов, возникших в результате делеции всей области пигментации, подавляется полностью.

7. Утрата чувствительности к пестицину у штаммов пяти подвидов Y. pestis, как правило, приводит к потере вирулентности. У пестицинрезистентных пигментированных мутантов отдельных штаммов кавказского подвида возможно сохранение вирулентности для белых мышей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что у большинства вирулентных микроорганизмов "острова патогенности" нестабильны: точная эксцизия PAIs происходит с частотой 1(Г - 10° (Fetherston et al., 1992; Blum et al., 1994, 1995; Carniel et al., 1996; Censini et al., 1997; Buchrieser et al., 1998). Предполагается, что благодаря этому свойству "острова патогенности", подобно фагам и плазмидам, могут принимать участие в рекомбинацион-ном процессе бактерий (Arber, 1993) и тем самым способствовать образованию новых патотипов (Rajahumar et al., 1996; Hacker et al., 1997; Hacker, Kaper, 1999).

В последние годы было установлено, что у штаммов возбудителя чумы в процессе эволюции "остров высокой патогенности" утерял подвижность (Buchrieser et al., 1998, 1998а; Bach etal., 1999). Тем не менее, его последовательность может утрачивается штаммами Y. pestis с частотой ~Ю"5 (Brubaker, 1969) в результате обширной (102 т.п.н.) делеции хромосомной области пигментации (Fetherston et al, 1992). Клетки чумного микроба при этом становятся непигментированными, нечувствительными к пестицину, неспособными к росту на хелатированных средах при 37 °С и авирулент-ными для биопробных животных при подкожном способе заражения (Perry, 1993). В отечественной литературе имеются отдельные сообщения, что для штаммов ряда неосновных подвидов Y. pestis свойственен иной характер изменчивости признаков, детерминируемых генами дат-области (Гольдфарб, 1968; Классовский, Пейсахис, 1974; Мартиневский, Павличенко, 1978; Кутырев, 1992).

Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение изменчивости признаков, кодируемых генами дат-области, для получения генетической характеристики этого участка хромосомы у штаммов пяти подвидов Y. pestis.

Первый этап настоящего исследования был посвящен проведению скрининга природных штаммов пяти подвидов возбудителя чумы по признакам, кодируемым генами хромосомной д§тя-области. Свои исследования мы начали с разработки рецептуры сред для изучения Hms-признака и способности к росту в условиях дефицита железа. Необходимость такой работы была обусловлена тем, что изучение способности к росту на железохелатированных средах у штаммов четырех неосновных подвидов Y. pestis до настоящего момента не проводилось, а недостатками сред, которые обычно используются для определения признака пигментации, является длительный (4-10 суток) срок формирования пигментированных колоний.

В результате проведенных экспериментов была разработана полусинтетическая среда, которая включает малое количество компонентов (0,75% казаминовых кислот [Difco Laboratories, США], 0,15% сульфита натрия, 1,35% агар-агара, 1 мкг бромида тиамина), проста в приготовлении и обеспечивает рост штаммов всех подвидов Y. pestis. После добавления к этой среде хелаторов ЭДДА (0,2 мМ) или цитрата натрия (0,1 М) она может быть использована для изучения способности к росту в условиях дефицита ионов железа. После введения в рецептуру данной среды 0,03 г/л Конго красного получается среда HMSD, которая позволяет определить признак пигментации у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы через 2-3 суток инкубации посевов. что дает возможность быстрого и массового скрининга популяций природных штаммов Y. pestis, а также в значительной мере ускоряет анализ больших по объему выборок мутантных клонов при постановке генетических экспериментов.

Исследование на среде HMSD изменчивости признака пигментации у природных штаммов чумного микроба, полученных из ГКПБ "Микроб", выявило существование различий между подвидами возбудителя чумы по степени накопления Hms"-клеток в популяциях культур после хранения в лиофилизированном состоянии. Так, например, содержание непигментированных клеток в популяциях штаммов улэгей-ского подвида было очень высоким (от 42,2 % до 93,0 %), тогда как в популяциях штаммов кавказского подвида, наоборот, очень низким (99,4 % - 100 %).

Изучение изменчивости другого признака, кодируемого генами хромосомной pgm-области, - признака чувствительности к пестицину у большинства природных штаммов возбудителя чумы оказалось невозможным из-за иммунности к действию пестицина. Исключение составляли штаммов кавказского подвида, у которых конституционно отсутствует плазмида pPst (Филиппов с соавт, 1989, 1992), и штаммы алтайского подвида, которые проявляют чувствительность к собственному пестицину и к пестицинам штаммов других подвидов при наличии плазмиды pPst (Тимофеева с соавт., 1966; Логачев, 1979; Филиппов с соавт, 1989, 1992). Перед нами встала задача получения чувствительные к пестицину клонов всех пяти подвидов возбудителя чумы путем удаления из генома природных штаммов плазмиды pPst.

Следующим этапом наших исследований было получение pPst'-клонов штаммов пяти подвидов возбудителя чумы; создание на их основе коллекции изогенных мутантов по признакам пигментации и чувствительности к пестицину; и проведение сравнительного анализа изменения у полученных мутантов экспрессии других при

91 знаков, кодируемых генами хромосомной ддш-области, в частности, способности к росту при 37 °С на железодефицитных средах и вирулентности для белых мышей при подкожном способе заражения.

В качестве модельных штаммов были взяты типичные представители пяти подвидов Y. pestis - штаммы основного (231), гиссарского (А-1249), алтайского (И-2359), улэгейского (И-3069) и кавказского (6499) подвидов. После элиминации плазмиды pPst у этих штаммов, нами были получены пигментированные, чувствительные к пестицину, вирулентные pPst'-клоны. В дальнейшем из pPst'-клоны популяций pPstf-клонов на соответствующих селективных средах были выделены спонтанные мутантов с разным сочетанием признаков пигментации и чувствительности к пестицину: Hms+Psn+(№1), Hms+Psn" (№2), Hms"Psn+ (№3) и Hms'Psn" (№4), на основе которых были созданы изогенные системы штаммов 231(№1-4), И-3069 (№1-4), И-2359 (№14), 6499 (№1-4) и А-1249 (№1-4).

При ПЦР-анализе ДНК полученных мутантов с помощью 6 пар праймеров (на гены уЫ - региона: psn, irpl, ybtQ,aybtP, и на гены hms HFRS - оперона: hmsH и hmsR области пигментации) не было зафиксировано ни в одного случая независимой утраты одного из регионов pgm-области. Так, у всех Hms+Psn"-MyTaHTOB, независимо от подвидовой принадлежности исходного штамма, в реакционных смесях присутствовали ПЦР-продукты ожидаемого размера. По всей видимости, у штаммов чумного микроба, циркулирующих в природных очагах на территории России и сопредельных государств, утрата признака чувствительности к пестицину при сохранении признака пигментации происходит не в результате точной эксцизии HPI, а благодаря более мелким мутациям в генах v/tf-региона. Следует отметить, что американским исследователям I. Iteman с сотр. (1993) и С. Buhcrieser с сотр. (1998) также не удалось обнаружить ни одного AHPI-мутанта в популяциях штаммов Y. pestis, циркулирующих на территории стран Азии, Америки и Африки. Сам факт отсутствия случаев эксцизии HPI у штаммов основного и четырех неосновных подвидов, выделенных из разных природных очагов чумы, говорит о том, что стабилизация ^/-региона у возбудителя чумы произошла, скорее всего, после отделения вида Y. pestis от общего с Y. pseudotuberculosis предшественника, но до дифференциации вида Y. pestis на подвиды.

Известно, что основными механизмами образования мутантов с Hms"Psn+-фенотипом у штаммов из Заира, Турции и Кении являются делеции фрагментов pgm

92 области хромосомы в районе hmsHFRS-оперона, размеры которых колеблются от 38 т.п.н. до 70 т.п.н. и более (Buchrieser et al., 1998а). В наших экспериментах при ПЦР-анализе ДНК Hms'Psn+-MyTaHTOB штаммов пяти подвидов возбудителя чумы, циркулирующих в природных очагах чумы на территории стран СНГ и Монголии, не было обнаружено ни одного случая утраты hms-региона. По всей видимости, утрата признака пигментации у этих штаммов происходит в результате более мелких мутационных событий в генах hmsHFRS-оперош.

При ПЦР-анализе ДНК вакцинного штамма EV НИИЭГ и Hms'Psn'-клонов большинства штаммов чумного микроба в реакционных смесях не были обнаружены специфические амплификаты. На основании этого факта мы пришли к выводу, что сочетанная утрата Hms- и Psn-признаков у этих мутантов произошла в результате обширной делеции pgm- области хромосомы, описанной ранее J. Fetherston с соавт. (1992) на модели штамма KIM6+ Y. pestis. В пользу этого вывода также говорят данные, полученные группой отечественных исследователей (Бобров, 1995; Бобров, Филиппов, 1997),что Hms'Psn'-варианты штаммов 231 и 358 основного подвида возбудителя чумы имеют значительные по протяженности генетические повреждения хромосомной области пигментации. Нами впервые показана возможность возникновения Дд^га-мутантов у штаммов четырех неосновных подвидов Y. pestis.

Положительные результаты в ПЦР с ДНК клона А-1249 №4 гиссарского подвида позволили нам выявить существование еще одного, не описанного в литературе, механизма возникновения HmsTsn'-мутантов - в результате сочетания двух независимых мутационных событий, произошедших в генах ybt- и /гиад-регионов области пигментации. Аналогичные мутанты были обнаружены у ряда других штаммов основного, алтайского, улэгейского и гиссарского подвидов Y. pestis.

Таким образом, сравнительный ПЦР-анализ ДНК спонтанных мутантов на присутствие 6 фрагментов генов области пигментации показал, что у штаммов пяти подвидов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах на территории стран СНГ и Монголии, утрата Hms- и Psn-признаков происходит либо в результате обширной делеции области пигментации, либо в результате небольших мутаций в генах ybt- и Айм-регионов.

Выращивание природных штаммов возбудителя чумы и их мутантных вариантов на среде с ЭДДА позволило установить, что у нечувствительные к пестицину клоны различаются по способности к росту при 37 °С в условиях дефицита железа. В

93 частности, оказалось, что Hms+Psn"-ioioHbi, в отличие от Дд^/и-мутантов, сохраняют частичную способность к росту при 37 °С на среде с пониженным содержанием железа. Этот факт можно объяснить разными молекулярными механизмами возникновения Psn'-мутаций. Так, делеция да/и-области хромосомы у HmsTsn'-мутантов приводит к полной утрате генов Ybt-зависимой системы железопотребления, что обусловливает прекращение продукции рецептора и сидерофоров. В результате штамм утрачивает пестицинчувствительность и способность ассимилировать ионы железа из хелатов с ЭДДА при 37 °С. У Hms+Psn~-Kri0H0B чувствительность к пестицину утрачивается в результате мелких мутаций в отдельных генах yfo-региона. Судя по тому, что мутанты хотя и слабо, но все-таки растут при 37 °С в условиях железодефицита, эти мутации в генах ^-региона приводят не к прекращению, как у Apgw-мутантов, а только к снижению продукции элементов Ybt-зависимой системы до уровня, способного поддерживать слабый рост штамма на железодефицитной среде, но недостаточного для проявления Psn-признака.

Заражение белых мышей мутантными клонами чумного микроба показало, что вирулентность коррелирует только с наличием у клона чувствительности к пестицину, но не признака пигментации. Все пигментированные и непигментированные Psn+-bdioHbi, независимо от их подвидовой принадлежности, проявили способность вызывать гибель белых мышей. Hms+Psn"-boioHbi штаммов основного, алтайского, гиссарского и улэгейского подвидов оказались авирулентными несмотря на то, что они демонстрировали слабый рост на железодефицитной среде с ЭДДА при 37 °С.

Результаты наших экспериментов показали возможность возникновения у возбудителя чумы спонтанных нечувствительных к действию пестицина и слабо растущих при 37 °С в условиях дефицита железа мутантов, проявляющих среднюю по классификации J1.A. Тимофеевой и Т.П. Апарина (1969) вирулентность для белых мышей (LD5o = 1,4 х ю4 КОЕ). По сравнению с исходным вирулентным штаммом 6499 кавказского подвида возбудителя чумы заражение белых мышей его Hms+Psn"-клоном 6499 №2 характеризовалось не только заметным снижением вирулентности и отдалением срока гибели, но и существенными изменениями в патогенезе наблюдаемых форм чумы.

В 1997 году S. Bearden с соавт. опубликовали результаты заражения белых мышей Psn'-клонами штамма Y. pestis KIM5, сконструированными с помощью моле-кулярно-генетических методов. Оказалось, что делеция гена psn, повышала значение

LD5o штамма только в 2200 раз; а делеция гена irpl - в 10000 раз, что делало этот штамм практически авирулентным при подкожном способе заражения. На основании этих данных можно предположить, что у штамма 6499 №2, в отличие от авирулент-ных Hms+Psn"-igiohob штаммов других подвидов, произошло нарушение целостности гена psn или гена уЫА, являющегося регулятором транскрипции гена psn, которое не повлекло за собой утрату вирулентности. Мы исключаем участие дополнительного фрагмента гена уЫР, выявленного у штамма 6499 в ПЦР, в проявлении аномальной вирулентности его клона 6499 №2, поскольку при ПЦР-анализе ДНК другого вирулентного Hms+Psn"-MyTaHTa С-526, также принадлежащего к кавказскому подвиду (депонирован Л.И. Грамотиной в 1986 году), аналогичный фрагмент тошуЫР отсутствовал. Выяснение механизма возникновения Hms+Psn"-MyTaHTOB у штаммов кавказского подвида, на наш взгляд, является весьма перспективным, так как это позволит уточнить роль отдельных продуктов иерсиниабактинзависимой системы в вирулентности возбудителя чумы.

Заключительным этапом наших исследований было определение значений частот возникновения и встречаемости мутантов у штаммов пяти подвидов Y. pestis. Установлено, что процессы изменчивости признаков пигментации и чувствительности к пестицину у штаммов основного и четырех неосновных подвидов имеют разнонаправленный характер. Преобладание того или иного типа мутантов в популяции штамма зависит от происхождения штамма и от условий его культивирования. Так, у штамма основного подвида в фазу экспоненциального роста наиболее часто возникают мутации в генах ^/-региона и обширные делеции области пигментации хромосомы, которые приводят к образованию Hms+Psn'- и Hms'Psn'-мутантов. После годового хранения в популяции этого штамма происходит существенное возрастание количества Hms'Psn'-мутантов. У штаммов алтайского, гиссарского и удэгейского подвидов в фазу экспоненциального роста и при хранении в лабораторных условиях наименее стабильны гены /г/ж-региона, поэтому в их популяциях обнаруживаются, как правило, Hms'Ps^-мутанты. Особое положение в группе штаммов неосновных подвидов занимают штаммы кавказского подвида, для которых в фазу экспоненциального роста характерна очень высокая стабильность, как самой области пигментации, так генов ее отдельных регионов. В то же время, после годового хранения при пониженных температурах в популяциях этих штаммов происходит резкое увеличение количества Hms+Psn"- мутантов, что не наблюдается у штаммов других подвидов.

Тот факт, что у штаммов неосновных подвидов возникновение Адат-мутантов происходит на 2-3 порядка реже, чем у штаммов основного подвида, и разница в значениях частот возникновения этих мутаций статистически достоверна, говорит о возможности существования разных механизмов образования обширных делеций. Возможно, делеции, которые приводят к утрате области пигментации, у штаммов неосновных подвидов имеют более протяженные размеры, как это наблюдается у ряда патогенных для человека штаммов Y. enterocolitica (Bach et al., 1999). В этом случае механизм возникновения Ддат-мутантов носит характер, не обусловленный рекомбинацией IS 100 элементов, что может происходить, например, из-за отсутствия или инактивации одного из фланкирующих область ZS100 элементов. В этой связи несомненный теоретический интерес представляют исследования, направленные на уточнение размеров делеций и их локализации на хромосоме.

Таким образом, проведенные нами исследования изменчивости признаков, кодируемых генами хромосомной дат-области, позволили установить, что спонтанно возникающие мутанты со сходным сочетанием Hms- и Psn-признаков, как правило, имеют идентичный ПЦР-профиль, проявляют одинаковый характер роста на среде с ЭДДА при 37 °С и вирулентность для белых мышей при подкожном способе заражения. Этот факт говорит о несомненной филогенетической близости пяти подвидов возбудителя чумы. В то же время, установленные нами у штаммов основного и четырех неосновных подвидов различия в характере изменчивости признаков, кодируемых генами области пигментации, свидетельствуют в пользу существования у них генетических отличий в структуре этого участка хромосомы. Выявление и детальное исследование таких измененных последовательностей может быть полезно для дальнейшего изучения факторов патогенности возбудителя чумы, для определения его филогенетических связей с другими видами бактерий, а также при создании различных зондов и тест-систем молекулярно-эпидемиологического мониторинга. В этой связи дальнейшие исследования, направленные на изучение структуры дат-области и HPI у штаммов пяти подвидов Y. pestis, являются весьма перспективными.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зудина, Ирина Витальевна, Саратов

1. Аванян ЛА, Губина НЕ., Иванова В.Ф. Влияние железа на вируленгаость и имму-ногенность авирулентных штаммов чумного микроба // Там же. 1963. - №5 - С. 17 - 23.

2. Аванян Л.А., Иванова В.Ф., Губина Н.Е. Влияние железа на вирулентность штаммов чумного микроба // Вопр. микробиол. и лаб. диагн. особо опасных инф. -Саратов, 1965. С. 66 - 70.

3. Авдеева Н.Г., Карасева З.Н., Солодовников Н.С. Характеристика природного штамма чумного микроба М-777 по признаку пигментсорбции // Микробиол., лаб. диагн. и специф. профилакт. карантин, инф. Саратов, 1989. - С. 18-21.

4. Анискина ГЛ. К вопросу пестициногенности и чувствительности к пестицину I штаммов возбудителя чумы // Диагн. и профилакт. особо опасных инф. Саратов, 1983.-С. 22-24.

5. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы: Руководство. Иркутск: Изд - во Иркут. ун - та, 1989. - 90 с.98

6. Аракелян И.С. Получение и свойства мутантов с пониженными потребностями в факторах роста из Гиссарских штаммов чумного микроба //11 межреспубл. науч.-практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. по профилакт. чумы. Алма-Ата, 1981. - С. 13 -15.

7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: Медгиз.,1962. - 180 с.

8. Балахонов С.В. Результаты скрининга плазмид штаммов Yersinia pestis из разных очагов центрально-азиатской зоны природной очаговости чумы // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1989. - №4. - С. 39 - 42.

9. Бибикова В.А., Классовский JI.H., Мельников И.Ф. К вопросу об эпизоотологи-ческом значении штаммов возбудителя чумы с ослабленной вирулентностью // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1968. - Вып. 4. - С. 180 - 186.

10. Бобров А Г. Изучение распространенности и локализации мобильных элементов IS2&5 и IS100 в геномах иерсиний: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1995.- 18с.

11. Бобров А. Г., Филиппов А.А. Распространенность IS285 и IS 100 в геномах Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis II Мол. ген. 1997. - № 2. - С. 36 - 40.

12. Браун В. Генетика бактерий. М.: Наука, 1968. - 447 с.

13. Булгакова Е.Г. Функциональное картирование плазмиды пестициногенности чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1991. -24 с.

14. Быков JT.T., Кукин В.М., Онищенко JUL, Трофименко ИТ. Особенности течения эпизоотии чумы на Северо-Востоке Причуйских Муюнкумов в 1971 -1972 г.г. // Матер. УШнауч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахсг. Алма-Ата, 1974. - С. 154-156.

15. Быков JI.T., Пошевина Г.О., Красникова JI.B. Характеристика штаммов микроба чумы из Юго-Восточных Кызылкумов // Матер. VII науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. - С. 4 - 5.

16. Вершинина Т.И. О популяционной изменчивости возбудителя чумы из природных очагов Горного Алтая и Северо-Западной Монголии: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1986. - 16 с.

17. Воротников И.А., Толмачева JI.P. К характеристике штаммов чумного микроба, изолированных в период оздоровления Тянь-Шаньского природного очага // Актуал. вопр. эпиднадзора в природных очагах чумы. Ставрополь, 1985. - С. 174 - 176.

18. Головко Э.Н., Гуляко Л.Ф., Дегтярева В.И. Некоторые особенности штаммов возбудителя чумы, выделенных в Гиссарском очаге в 1970 -1987 гг. // Тез. XIII конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1990. - С. 62 - 65.99

19. Головко Э.Н., Пейсахис JI.A., Дерлятко К.И., Юсупов А.К., Сагимбеков У.А. Характеристика штаммов микроба чумы, выделенных в Гиссаре летом 1970 года // Матер. VH науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахсг.-Алма-Ата, 1971. С. 6-7.

20. Гольдфарб JI.M. Некоторые особенности чувствительных к пестицину I культур возбудителей чумы и псевдотуберкулеза и их диагностическое значение // Пробл. особо опасных инф. 1968. - №1. - С. 86 - 88.

21. Гольдфарб JI.M., Дальвадянц С.М., Земцова И.Н., Пономарев И.Г. Некоторые особенности культур, выделенных на территории Северо-Западного Прикаспия в 1972 г. // Профилакт. особо опасных инф. Саратов, 1977. - Вып. 3. - С. 46 - 50.

22. Гольдфарб J1M, Шанина JLH. О связи между пестициногенностью, фибриноли-тической активностью и плазмокоагулирующей способностью возбудителя чумы // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасных инф.-Росг. ун-т, 1967.- Вып. 1.- С. 10 -12.

23. Джафаров Н.И., Юндин Е.В. Характеристика штаммов чумного микроба из Терско-Сунженского природного очага чумы // Особо опасные инф. на Кавказе. -Ставрополь, 1974. Вып.1. - С. 36 - 37.

24. Дробышева Т.М. Повышение вирулентности у штамма чумного микроба ЕВ-5пг/443 в организме крольчонка и изучение его свойств // Пробл. особо опасных инф. -1971.-Вып. 1 (17). С. 71 - 74.

25. Елкин Ю.М., Михайлова Р.С., Розанова Г.Н., Тарасова В.Е., Лалазарова И.Г., Грамотина Л.И., Осипова С.П., Быкова З.А., Калмыкова Л.И. Возбудитель чумы очага Центрального Кавказа // Пробл. особо опасных инф. 1977.- Вып. 3 (55). - С. 9 - 12.

26. Захаров А.И. Изучение биологии возбудителя чумы из Урало-Эмбенского автономного очага: Дис. канд. мед. наук. Саратов, 1988. - 163 с.

27. Захаров А.И. Основные свойства штаммов возбудителя чумы, выделенных в Урало-Эмбенском автономном очаге в 1973 1983 гг. // XII Межреспубл. науч.-практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. - Алма-Ата, 1985. - С. 16-18.

28. Зундуй Чимит, Апарин Г.П., Головачева В.Я., Тимофеева Л.А., Васюхина Л.В. О биологических свойствах культур чумного микроба, выделенных в МНР // Особо опасные инф. в Сибири и на Дальн. Востоке. Кызыл, 1966.- Вып. 7. - С. 103 - 106.100

29. Иванова B.C. Характеристика пестицина I и изучение механизма его действия: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1981. - 23 с.

30. Иннокентьева Т.И. Особенности экологии Yersinia pestis altaica: Автореф. дис. в виде науч. докл. . мед. наук. Саратов, 1997.- 59 с.

31. Классовский JI.H., Мельников И.Ф., Терентьева Л.И. К изучению динамики изменений клеточного состава популяций возбудителя чумы на искусственных питательных средах // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1971. - Вып. 5 (21).- С. 71 - 73.

32. Классовский Л.Н., Пак Г.Ю., Осадчая Л.М. К вопросу о связи вирулентности возбудителя чумы с пестициногенностью. // Матер. VI науч. конф. противочум. уч-режд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1969. - Вып.1. - С. 39 - 41.

33. Классовский Л.Н., Пейсахис Л.А. О некоторых особенностях пигментации колоний возбудителя чумы на среде с гемином // Пробл. особо опасных инф. 1974. -Вып. 5 (39). -С. 12- 77.

34. Кокушкин A.M.: Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Автореф. дис. . д-ра. мед. наук. Саратов, 1995. - 46 с.

35. Кондрашкова ТВ., Донская ТД, Зимарина Л.С., Ведяпина ВД Влияние солей железа на рост чумного микроба. Саратов, 1983,- 12с. Д. во ВНИИМИ МЗ СССР№6275-83.

36. КошеновУА О свойствах возбудителя чумы из Зааральского автономного очага // Тез.ХШ конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст.- Алма-Ата, 1990.- С. 72-74.

37. Кошенов У.А. Свойства штаммов возбудителя чумы, выделенных в Заараль-ском автономном очаге в 1982 1983 гг. // XII Межреспубл. науч. - практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. - Алма-Ата, 1985. - С. 18-20.

38. Кудинова ТЛ. Свойства штаммов чумного микроба, выделенных осенью 1963 года в Или-Каратальском Междуречье: Автореф.дис. .д-ра мед. наук-Алма-Ата, 1968. 17с.

39. Кудинова Т.П., Архангельская Н.П., Гражданов А.К. О вирулентности микробов чумы, не пигментирующихся на среде с гемином // Матер. VII науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971.-С. 130 - 131.

40. Куличенко А.Н. Генетические исследования возбудителя чумы с использованием индуцированного мутагенеза: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1983.-20 с.101

41. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы: Автореф. дис. д-ра мед. наук. Саратов, 1992. - 16 с.

42. Кутырев В.В., Куличенко А.Н., Проценко О.А. Вирулентные Pgm" мутанты чумного микроба//Профилакт. природноочаг. инф. Ставрополь, 1983. - С. 304.

43. Кутырев В.В., Проценко О.А. Классификация и молекулярно-генетические исследования Yersinia pestis II Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1998. - С. 11 - 22.

44. Кутырев ВВ., Проценко OA, Синичкина АА Чувствительность к пестицинам полевочьего штамма чумного микроба 1146 (409) // Там же. Саратов, 1977. - Вып.4 (56). - С. 16 - 19.

45. Кутырев В.В., Филиппов А.А., Проценко О.А. Изучение плазмидного состава донорного штамма возбудителя чумы // Вопр. генетики, молекул, биол. и микробиол. чумы и холеры. Саратов, 1985. - С. 15 - 21.

46. Логачев А.И. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1979. - 17 с.

47. Логачев Л.И, Ивженко Н.И. Характеристика штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае в 1972 году // Докл. Иркут. противочумн. ин-та. Чита, 1974. -Вып. 10.-С. 113-115.

48. Логачев Л.И., Михайлов Е.П. К характеристике вирулентности штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае // Совр. аспекты профилакт. зоонозных инф. Иркутск, 1984. - Ч. 2. - С. 50.

49. Логачев Л.И., Тимофеева Л.А. О пестицинах культур чумного микроба // Докл. Иркут. противочумн. ин-та. Чита, 1966. - Вып. 7. - С. 123 - 126.

50. Лясоцкий ЛЛ., Васюхина ЛВ. Пигментсорбция и потребность в ионах кальция тесты, характеризующие состояние вирулентности коллекционных штаммов возбудителя чумы У/ Эпид. и профилакт. особо опасных инф. в МНР и СССР.- Улан-Батор, 1978.-С. 74 -75.102

51. Маевский М.П. Экспериментальное изучение возможного эпизоотологического значения атипичных штаммов чумного микроба в Сайлюгемском очаге: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1981.- 23 с.

52. Маевский М.П., Иннокентьева Т.И., Калиновский А.И. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных из почвы в Сайлюгемском очаге // Совр. аспекты профилакт. зоонозных инф. Иркутск, 1984. - С. 58 - 59.

53. Малинина З.Е. Изучение возбудителя чумы с различным набором детерминант вирулентности в организме белых мышей, обработанных сернокислым закисным железом// Там же. Саратов, 1972. - №3. - С. 99-103.

54. Малинина З.Е. Изучение стойкости утраты вирулентности у измененных в эксперименте штаммов чумного микроба // Микробиол. и иммунол. особо опасных инф. Саратов, 1968. - Вып. 3. - С. 123 -132.

55. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 479 с.

56. Мартиневский И.Л. Пигментсорбция у возбудителя чумы и ее роль в проявлении вирулентности. Обзор. Среднеаз. ПЧИ. Алма-Ата, 1988. - 26 с. - Деп. во ВИНИТИ 13.10.88. №7376-В88.

57. Мартиневский И.Л., Кенжебаев А.Я., Асенов Г.А. Устюртский очаг чумы (эпи-зоотологические аспекты и лейцинзависимость возбудителя). Нукус: Каракалпака-стан, 1987.-С. 61-62.

58. Мартиневский И.Л., Павличенко Л.Ф. Влияние температурных и некоторых других условий на количество Pgm+ клеток у различных штаммов чумного микроба // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1978. - №1. - С. 5 - 8.

59. Мартиневский И.Л., Степанов В.М., Кенжебаев А.Я. Таксономия, мутация и генетика патогенности чумного и родственных ему микробов. Нукус: Каракалпака-стан, 1990. - С. 89 - 91.

60. Мельников И.Ф., Никитина Т.А., Бочкарев В.М. О возможности восстановления признака Р+ у чумного микроба в организме больших песчанок и блох // Пробл. особо опасных инф. 1971. - Вып. 3 (19) - С. 73 - 77.

61. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.:Мир. - 1976. - 440 с.

62. Михайлова Р.С., Юндин Е.В. Характеристика штаммов чумого микроба, выделенных в Приэльбрусье// Пробл. особо опасных инф.-1973.-Вып.5(33) С. 14-19.

63. Нейландс Дж. Б. Транспорт соединений железа микробами (сидерохромы)// Неорганическая биохимия/ Под ред. Эйхгорна Г. Л.-М.:Мир, 1978. Т.1. - С. 205 - 243.

64. Никитина Г.П. Изучение вирулентности штамма чумного микроба № 586 с неоднородным клеточным составом // Микробиол. и иммунол. особо опасных инф. -Саратов, 1968. Вып. 3. - С. 139 - 143.

65. Осадчая Л.М., Мисалева О.С., Алексеева О.Е., Егорова Р.П., Чернова В.А. К характеристике возбудителя чумы из Северного Приаралья // Матер. VII науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. - С. 39 - 40.

66. Пак Г.Ю. Пестицин-фибринолизин-коагулазная система у чумного и родственных ему микробов: Автореф. дис. канд. мед. наук. Алма-Ата, 1969. - 20 с.

67. Пак Г.Ю., Мартиневский И.Л., Качурина А.Г., Осадчая Л.М. Изучение пести-циногенности и чувствительности к пестицинам штаммов чумного микроба // Матер. VI науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1969а. - Вып.1. - С.78 - 79.

68. Пак ГД, Шашаев МА Пестицинчувствительные Р" варианты возбудителя чумы //Матер. W науч. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. -Алма-Ата, 1971.-С. 41- 43.104

69. Петров В.Н. Физиология и патология обмена железа JL: Наука, 1982. -224 с.

70. Пошевина Г.О., Пейсахис JI.A., Степанов В.М. О вирулентности и ее детерминантах у штаммов возбудителя чумы из Муюнкумов и Зачуйской саксауловой дачи // Матер. УП науч. конф. противочумн. учрежд- Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971.-С.46 - 48.

71. Пунский ЕЕ., Адаменко НИ., Меницкая JIE. Изучение штаммов чумного микроба, выделенных в Туркмении в 1976 -1980 г.г. // Межреспубл. науч.-практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. по профилакт. чумы. Алма-Ата, 1981.- С. 89- 93.

72. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск, 1973. - 320 с.

73. Сагимбеков У.А., Пошевина Г.О., Асылбекова Н.Н., Степанов В.М. Изучение особенностей штаммов чумного микроба, выделенных весной 1976 года в Восточных и Западных Причуйских муюнкумах// Пробл. особо опасных инф. 1979. - Вып. 1 (65). - С. 61 - 63.

74. Сагимбеков УА, Пошевина Г.О., Рапопорт ЛИ О соотношении Р+ и F клеток в штаммах чумного микроба в разные фазы эпизоотического процесса// ХИ Межреспубл. науч-практ. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1985.- С. 35-37.

75. Сагимбеков У.А., Рапопорт Л.П. Об особенностях штаммов возбудителя чумы, выделенных в различных популяциях больших песчанок в Муюнкумах // Микробиол., генетика и иммунол. чумы и холеры. Саратов, 1983.- С. 11 - 13.

76. Самойлова С.В. Влияние условий культивирования на популяционный состав штаммов чумного микроба, обладающих различным плазмидным профилем.: Дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1991. - 157с.

77. Соорбеков О.С., Тюлембаев МА, Мартиневский ИЛ., Классовский ЛИ, Атчаба-ров Б.Б. Свойства штаммов чумного микроба, выделенных в 1979-1980 гг. в Таласском Алатау // Микробиол., генетика и иммунол. чумы и холеры. Саратов, 1983.-С.8 -11.

78. Тарасова В.Е., Иннокентьева Т.И., Трофименко Н.З. Пигментообразование, кальцийзависимость, отношение к глицерину и рамнозе слабовирулентных штаммов105чумного микроба, пассированных на монгольских пищухах // Пробл. особо опасных инф.-1969. №4.-С. 19-23.

79. Тарасова В.Е., Петров С.П. Пестициногенность и чувствительность штаммов к пестицинам чумного микроба из Горного Алтая// ЖМЭИ. -1982. №2.- С. 56 - 59.

80. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. М.: Медгиз, 1958. - 348 с.

81. Тимофеева JI.A., Апарин Г.П. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в 1961 1966 г.г. в чумных очагах Сибири и Монголии // Пробл. особо опасных инф. -1969. - №4 . - С. 13 - 18.

82. Тимофеева Л.А., Жамьян Сурен, Сотникова А.Н., Логачев А.И., Саран Манда-лин Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Монголии в 1969 1971 гг. // Пробл. особо опасных инф. - 1974. - №3 (37). - С. 37 - 42.

83. Тимофеева Л.А., Логачев А.И. Новый подвид чумного микроба, выявленный в МНР // Эпидемиол. и профилакт. особо опасных инф. в МНР и СССР. ГОСИЗДАТ. -Улан-Батор, 1978. - С. 64 - 67.

84. Фердман Д.Л., Сопин Е.Ф. Практикум по биологической химии. М.: Сов. наука, 1957. - 293 с.

85. Филиппов А.А., Солодовников Н.С., Куклева Л.М., Проценко О.А. Изучение плазмидного состава штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов // ЖМЭИ. 1992. - №3 - С. 10 - 13.

86. Фурсов В.В., Попов Ю.А. Исследование штаммов микроба чумы полевочьей разновидности методом электрофореза в агарозном геле // Профилакт. природнооча-говых инф. Ставрополь, 1983. - С. 326 - 327.

87. Хайдаров Т.Б., Хакимов М.М., Мартиневский И.Л. О первых случаях выделения штаммов чумного микроба в Каршинской степи и их свойствах // Эпизоотол. и профилакт. природноочаг. инф. Саратов, 1982.- С. 37-39.

88. Шведун Г.П., Проценко О.А. Получение клонов чумного микроба, утративших плазмиду пестициногенности // Информ. бюл. изобретения, рац. предложения и метод. рекомендации. Саратов, 1983,- №18.

89. Aasa R., Malmstrom B.G., Saltman P., Vanngard J. // Biochim. Biophys. Acta. -1963.-V.75.-P. 203-222.

90. Arber W. Evolution of prokaryotic genomes // Gene. 1993. - V. 135. - P.49-53.

91. Archibald F.S., De Voe I.W. Removal of iron from human trasferrin by Neisseria meningitidis IIFEMS Microbiol. Lett. 1979. - V.6. - P. 159 - 162.

92. Baggs A., Neilands J.B. Ferric uptake regulation protein acts as a repressor, employing iron (II) as a cofactor to bind the operator of an iron transport operon in Escherichia coli II Biochem. 1987. - V. 26. - P. 5471 - 5477.

93. Bearden S.W., Fetherston J.D., Perry R.D. Genetic organization of the yersiniabactin biosynthetic region and construction of avirulent mutants in Yersinia pestis II Infect. Immun. 1997. - V. 65, № 5. - P. 1659 - 1668.

94. Bearden S.W., Perry RD. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague// Mol. Microbiol.-1999.-V. 32, №2.-P. 403-414.

95. Bearden S.W., Staggs T.M., Perry R.D. An ABC transporter system of Yersinia pes-feallows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB 11// J. Bacteriol. 1998. - V. 180, №5,- P. 1135- 1147.107

96. Brubaker R.R. Mutation rate to nonpigmentation in Ppestis II J. Bacteriol. 1969. -V. 98, N3.-P. 1404- 1406.

97. Brubaker R.R., Beesley E.D., Surgalla M.J. Pasteurella pestis: Role of pesticin I and iron in experimental plague // Science. 1965. - V. 149. - P. 422 - 424.

98. Brubaker R.R., Surgalla MJ. Pesticins. I. Pesticin-bacterium interrelationships and environmental factors influencing activity. // J. Bacteriol. 1961. -V. 82, №6.- P. 940-949.

99. Buchrieser C., Brosch R., Bach S., Guiyoule A., Carniel E. The high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis can be inserted into any of the three chromosomal asn mNA genes // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 965 - 978.

100. Bullen J. The significance of iron in infection // Rev. Infect. Dis. 1981. - V.3. - P. 1127-1138.

101. Bullen J., Rogers H.J., Griffiths E. Role of iron in bacterial infections // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1978. - V. 80. - P. 1 - 35.

102. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis and immunity to plague // Ergebn. Microbiol. Immunitatsforschung und exp. Therapie. 1963. - V. 37. - P. 59 - 106.

103. Carniel E., Guiyoule A., Prentice M. Characterization of a large chromosomal "high-pathogenicity island" in biotype IB Yersinia enterocolitica II J. Bacteriol. 1996. - V. 178. -P. 6743 -6751.

104. Carniel E., Mazigh D., Mollaret H.H. Expression of iron-regulated proteins in Yersinia species and their relation to virulence // Infect. Immun.-1987. V. 55.- P.277- 280.

105. Cavalieri S., Bohach G., Snyder G., Snyder L. Escherihia coli a-hemolysin: Characteristics and probable role in pathogenicity// Microbiol. Rev. -1984.-V. 48.-P. 326 343.

106. Cheetham B.F., Katz M.E. A role for bacteriophages in the evolution and transfer of bacterial virulence determinants // Mol. Microbiol. 1995. - V. 18. - P. 201 - 208.

107. Cowan R, Foster B. Differential effects of iron the growth of L. monocytogenes: minimum requirements and mechanism of acquisition 11 J. Infect Dis.-1985.-V. 151.- P. 721-730.

108. Crosa J.H. Signal transduction and transcriptional and posttranscriptional control of iron-regulated genes in bacteriaII Microbiol. Mol. Biol. Rev.-1997.-V.61,№3.-P.319-336.

109. Crosa J.H. The relationship of plasmid-mediated iron transport and bacterial virulence // Ann Rev. Microbiol. 1984. - V. 38. - P. 69 - 89.

110. Escolar L., Perez-Martin J., Lorenzo de V. Opening the iron box: transcriptional met-alloregulation by the Fur protein // Ibid. 1999. - V. 181, №20. - P. 6223 - 6229.

111. Fetherston J., Bearden S., Perry R. YbtA, an AraC type regulator of the Yersinia pestis pesticin/yersiniabactin receptor//Mol. Microbiol.- 1996. V. 22. - P. 315 - 325.

112. Fetherston J.D., Lillard J.W., Jr., Perry R.D. Analisis of the pesticin receptor from Yersinia pestis: role in iron-deficient growth and possible regulation by its siderophore // J. Bacteriol. 1995. - V.177. - P. 1824 - 1833.

113. Fetherston J.D., Perry R.D. The pigmentation locus of Yersinia pestis KIM6+ is flanked by an insertion sequence and includes the structural genes for pesticin sensitivity and HMWP2 // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13, №4. - P. 697 - 708.

114. Fetherston J.D., Schuetze P., Perry R.D. Loss of the pigmentation phenotype in Yersinia pestis is due to spontaneous deletion of 102 kb of chromosomal DNA which is flanked by a repetitive element // Ibid. V. 6. - 1992. - P. 2693 - 2704.

115. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kookleva L.M., Protsenko O.A. Plasmid content in Yersinia pestis strains of different origin // FEMS Microbiol. Lett -1990.-V. 67.- P. 45 48.109

116. Finkelstein R.A., Sciorlino C.V., Mcintosh M.A. Role of iron in microbe-host interactions // Rew. Infect. Dis. 1983. - V.5. - P. 759 - 777.

117. Ford A., Hayhoe J. An invastigation of alternatives to hog gastric mucin as virulence-enhancing agents in cholera vaccine potency assay // J. Biol. Stand. -1976. -V. 4. -P. 353 366.

118. FredericqP. // Soc. Biol. 1960. - V. 154, № 11.-P. 2150.

119. Gehring A., DeMolI E., Fetherston J., Mori I., Mayhew G., Blattner F., Walsh C., Perry R. Iron acquisition in plague: modular logic in enzymatic biogenesis of yersiniabactin by Yersinia pestis II Chem. Biol. 1998. -V. 5. - P. 573 - 586.

120. Goebel W., Kathariou S., Kuhn M., Sokovich Z., Kreft J., Kohler S., Funke D., Leimeister-Wachter M. Hemolysin from Listeria biochemistry, genetics and function in pathogenesis//Infect. - 1988.-V. 16.-P. 149- 156.

121. Haag H., Hanke K., Drechsel H., Stojiljkovic I., Jung G., Zahner H. Purification of yersiniabactin: a siderophore and possible virulence factor of Yersinia enterocolitica // Gen. Microbiol. 1993,-V. 139.-P. 2159-2165.

122. Hacker J., Blum-Oehler G., Mtthldorfer I., Tschape H. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution // Mol. Microbiol. -1997.-V. 23.-P. 1089- 1097.

123. Hacker J., Kaper J.B. The concept of pathogenicity islands // Pathogenicity islands and other mobile virulence elements. American Society for Microbiol., 1999. - P. 1-11.

124. Hare J.M., McDonough K.A. High frequency RecA-dependent and - independent mechanisms of Congo red binding mutation in Yersinia pestis II J. Bacteriol. - 1999. - V. 181, № 16.-P.4896- 4904.

125. Heesemann J., Schubert S., Rakin A. Ecological aspects of evolutionary development of bacterial pathogens// Nova Acta Leopoldina NF. -1999. V. 78,№307. - P. 23 - 38.

126. Higuchi K., Smith J.L. Studies on the nutrition and physiology of Pasteurella pestis. IV. A different plating medium for the estimation of the nutrition rate to avirulence // J. Bacteriol. 1961. - V. 81, №4. - P. 605 - 608.

127. Hinnebush В., Perry R., Schwan T. Role of the hemin storage (hms) locus of Yersinia pestis in the transmission of plague by fleas // Science. 1995. - V. 273. - P. 367 - 370.

128. Holbien B.F., Jerico K.W.F., Likes G.C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains and pathology // Infect. Immun. -1979.-V. 24.-P. 545 -551.

129. Hornung J., Jones H., Perry R. The hmu locus of Yersinia pestis is essential for utilization of free haemin and haem-protein complexes as iron sources // Mol. Microbiol. -1996.-V. 20.-P. 725-739.

130. Jackson S., Burrows T. The virulence-enhancing effect of iron on non-pigmented mutants of virulent strains of Pasteurella pestis // Br. J. Exp. Pathol. -1956. -V. 37. P. 577 - 583.

131. Kado C., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteriol. 1981. - V. 145, №3. - P. 1365 - 1373.

132. Jones H., Lillard J., Perry R. HmsT, a protein essential for expression of the haemin storage (Hms4) phenotype of Yersinia pestis!I Microbiology.- 1999. V. 145.- P. 2117-2128.о

133. Kojima N., Bales G. The reduction and release of iron from Fe transferrin - C03 // J. Biol. Chem. - 1979. - V. 254. - P. 8847 - 8854.

134. Kovach M.E., Shaffer M.D., Peterson K.M. A putative integrase gene defines the distal en of a large cluster of ToxR-regulated colonization genes in Vibrio cholerae II Microbiol. 1996. - V. 142. - P. 2165 - 2174.

135. McDaniel Т.К., Jarvis K.G., Donnenberg M.S., Kaper J.B. A genetic locus of entero-cyte effacement conserved among diverse enterobacterial pathogens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995.-P. 1667-1668.

136. McDaniel Т.К., Ying Kang, Kaper J.B. The EPEC locus of enterocyte effacement:five more sep genes and genetic reconstruction of the attaching and effacing phenotype inth

137. E.coli K-12 // Abstracts of the 96 General Meeting of the American Society for Microbiology. Washington, DC: American Soc. Microbiol. - 1996. - P. 170.

138. Mickelsen P.A., Blackman E., Sparling P.F. Ability of Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis and commensal Neisseria species to obtain iron from lactoferrin // Infect. Immun. 1982. - V. 35. - P. 915 - 920.

139. Mickelsen P.A., Sparling P.F. Ability of Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, and commensal Neisseria species to obtain iron from transferrin and iron compounds // Ibid. 1981. - V. 33. - P. 555 - 564.

140. Miles A. A., Khimji P.L., Maskell J. The variable response of bacteria to excess ferric iron in host tissues // J. Med. Microbiol. 1979. - V. 12. - P. 17 - 28.

141. Mills D.M., Bajaj V., Lee C.A. A 40kb chromosomal fragment encoding Salmonella typhimurium invasion genes is absent from the corresponding region of the Escherichia coli K-12 chromosome // Mol. Microbiol. 1995. - V. 15. - P. 749 - 759.

142. Nassif X., Mazert M., Mounier J., Sansonetti P.J. Evoluation with an iuc: TnlO mutant of role of aerobactin production in virulence of Shigella Jlexneri II Infect. Immun. -1987.-V. 55.-P. 1963- 1969.112

143. Neilands J. Iron absorption and transport in microorganisms // Annu. Rev. Nutr. -1981.-V.l.-P. 27-46.

144. Neilands J. Molecular aspects of regulation of high affinity iron absorption in microorganisms I I Adv. Inorg. Biochem. 1990. - V.8. - P. 63 - 90.

145. Payne S.M. Iron and virulence in the family Enterobacteriaceae II C.R.C. Crit. Rev. Microbiol.- 1988.-V. 16.-P. 81-111.

146. Pelludat C., Rakin A., Jacobi C.A., Schubert S., Heesemann J. The yersiniabactin biosynthetic gene cluster of Yersinia enterocolitica: organization and siderophore-dependent regulation // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 538 - 546.

147. Pendrak M.L., Perry R.D. Characterization of a hemin-storage locus of Yersinia pestis /I Biol. Metals 1991. - V. 4. - P. 41 - 47.

148. Pendrak M.L., Perry R.D. Proteins essential for expression of the Hms+ phenotype of Yersinia pestis II Mol. Microbiol. 1993. - V.8. - P. 857 - 864.

149. Perry R. Acquisition and storage of inorganic iron and hemin by the Yersiniae II Trends Microbiol. 1993. - V.l. - P. 142 - 147.

150. Perry R., Balbo P., Jones H., Fetherston J., DeMoll E. Yersiniabactin from Yersinia pestis: biochemical characterization of the siderophore and its role in the transport and regulation //Microbiol. 1999.-V. 145 - P. 1181 - 1190.

151. Perry R., Brubaker R. Accumulation of iron by yersiniae // J. Bacteriol. 1979. - V. 137.-P. 1290- 1298.

152. Perry R., Pendrak M., Schuetze P. Identification and cloning of a hemin storage locus involved in the pigmentation phenotype of Yersinia pestis II Ibid. 1990. - V. 172. - P. 5929 -5937.

153. Portnoy D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1981. - V. 148. - P. 877 - 883.

154. Rajahumar K., Sasakawa C., Alder B. A spontaneous 99kb chromosomal deletion results in multi-antibiotic susceptibility and an attenuation of contact hemolysis in Shigella flexneri 2a // J. Med. Microbiol. 1996. - V. 45. - P. 64 - 75.

155. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Structural and functional organization of the Yersinia pestis bacteriocin pesticin gene cluster //J. Microbiol.-1996.-V. 142.-P. 3415 -3424.

156. Rakin A., Heesemann J. Virulence-associated fyuA/irp2 gene cluster of Yersinia enterocolitica biotype IB carries a novel insertion sequence IS 1328 // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V.129. - P. 287 - 292.113

157. Rakin A., Heesemann J. Yersiniabactin / pesticin receptor a component of an irontbuptake system of highly pathogenic yersiniae // 6 International symposium on yersinia, 2628 sept., 1994, Rome, Italy.

158. Rakin A., Saken E., Harmsen D., Heesemann J. The pesticin receptor of Yersinia enteroco-litica: a novel virulence factor with dual function // Mol. Microbiol. 1994a-V. 13.-R253 -263.

159. Rakin A., Schubert S., Pelludat C., Brem D., Heesemann J. The high-pathogenicity island of Yersiniae II Pathogenicity islands and other mobile virulence elements. Amer. Soc. Microbiol., 1999. - P. 77 - 90.

160. Robins-Browne R.M., Prpic J.K. Effect of iron and desferoxamine on infections with Yersinia enterocolitica//Infect. Immun. 1985. - V. 47. - P. 774 - 779.

161. Scarlato V., Arico В., Prugnola A., Rappuoli R. Sequential activation and enviromental regulation of virulence genes in Bordetella pertussis IIEMBO J.-1991.-V. 10.-P. 3971-3975.

162. Schubert S., Fischer D., Heesemann J. Ferric enterochelin transport in Yersinia enterocolitica: molecular and evolutionary aspects // J. Bacteriol. -1999.-V. 181, № 20. P. 6387 - 6395.

163. Shea J.E., Hesel M., Gleeson C., Holder D.W. Identification of a virulence locus encoding a second type III secretion system in Salmonella typhimurium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 2593 - 2597.

164. Sikkema D.J., Brubaker R.R. Outer membrane peptides of Yersinia pestis mediating siderophore-independent assimilation of iron // Biol. Metals. 1989. - V. 2. - P. 174 - 184.

165. Sikkema D.J., Brubaker R.R. Resistance to pesticin, storage of iron, and invasion of HeLa cells by Yersiniae 11 Infect. Immun. 1987. - V.55. - P. 572 - 578.

166. Simonson C., Brener D., De Voe I.W. Expression of a high-affinity mechanism for acquisition of transferrin iron by Neisseria meningitidis II Ibid. -1982. V. 36. - P. 107 -113.

167. Smith L.D.S. Virulence factors of Clostridium perfringens II Rev. Infect. Dis. -1979.-V. l.-P. 254-260.

168. Sodeinde O.A., Goguen J.D. Genetic analysis of the 9,5-kilobase virulence plasmid of Yersinia pestis И Infect. Immun. 1988. - V. 56. - P. 2743 - 2748.

169. Staggs T.M., Fetherston J.D., Perry R.D. Pleiotropic effects of a Yersinia pestis fur mutation II J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 7614 - 7624.

170. Staggs T.M., Perry R.D. Fur regulation in Yersinia species // Mol. Microbiol. 1992.- V.6. P. 2507 - 2516.

171. Stibitz S., Aaronson W., Monak D., Falkow S. Phase variation in Bordetella pertussis by frameshift mutation in a gene for a novel two-component system // Nature. 1989.- V. 38. P. 266 - 269.114

172. Stoebner J.A, Payne S.M. Iron-regulated hemolysin production, and utilization of heme and hemoglobin by Vibrio cholerae // J. Bacteriol. 1988. - V. 56. - P. 2891 - 2895.

173. Stojiljkovic I., Hantke K. Hemin uptake system of Yersinia enterocolitica: similarities with other Ton B-dependent systems in Gram-negative bacteria // EMBO J. 1992. - V. 11.-P. 4359-4367.

174. Stojiljkovic I., Hantke K. Transport of haemin across the cytoplasmic membrane through a heamin-specific periplasmic binding-protein-dependent transport system in Yersinia enterocolitica II Mol. Microbiol. 1994. - V. 13. - P. 719 - 732.

175. Sword C.P. Mechanism of pathogenesis in Listeria monocytogenes infection. I. influence of iron // J. Bacteriol. 1966. - V. 92. - P. 536 - 542.

176. Theil B. Ferritin. Structure, gene regulation and cellular function in animal, plant and microorganisms // Ann. Rev. Biochem. 1987. - V. 56. - P. 289 - 315.

177. Thompson J.M., Hearther A.J., Perry R.D. Molecular characterization of the hemin uptake locus (hmu) from Yersinia pestis and analysis of hmu mutants for hemin and hemo-protein utilization // Infect. Immun. 1999. - V. 67, № 8. - P. 3879 - 3892.

178. Une Т., Brubaker R.R. In vivo comparison of avirulent Vwa" and Pgm" or Pstr phe-notypes of yersiniae // Ibid. 1984. - V.133. - P. 2226 - 2230.

179. Ward C.G., Hammond J.S., Bullen J.J. Effect of iron compounds on antibacterial function of human polymorphs and plasma // Ibid. 1986. - V. 51. - P. 723 - 730.

Информация о работе

Зудина, Ирина Витальевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2000
ВАК 03.00.07

Диссертация

Генетическая характеристика хромосомной области пигментации штаммов пяти подвидов возбудителя чумы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы