Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование биопленки штаммами Yersinia pestis разных подвидов и их взаимодействие с членами почвенных биоценозов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Образование биопленки штаммами Yersinia pestis разных подвидов и их взаимодействие с членами почвенных биоценозов"

На правах рукописи

КОШЕЛЬ Елена Ивановна

ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНКИ ШТАММАМИ Yersinia pestis РАЗНЫХ ПОДВИДОВ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ЧЛЕНАМИ ПОЧВЕННЫХ

БИОЦЕНОЗОВ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

23 ОКТ 2014

Саратов - 2014

005553766

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Ерошенко Галина Александровна

Официальные оппоненты:

Смирнов Георгий Борисович - член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, ФГБУН «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства», главный научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов

Шелудько Андрей Вячеславович - доктор биологических наук, ФГБУН «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генетики микроорганизмов

Ведущая организация:

ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия чело-

Защита состоится «16» декабря 2014 г. в 13.00 на заседании

диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и на сайте http://www.microbe.ru/main/disser/dissert/ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб»

Автореферат разослан « » ^О 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, старший научный сотрудник,

века

доктор биологических наук

Слудский А. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большинство видов бактерий существует в природе в виде биопленок — сообществ клеток, окруженных внеклеточным полимерным матрик-сом [Ильина Т.С. и др., 2004; Романова Ю.М. и др., 2006; Costerton J.W. et al., 1999; Hall-Stoodley L., Stoodley P., 2009; Flemming H.S., Wingender J., 2010]. Биопленки обеспечивают бактериальным клеткам защиту от неблагоприятных факторов внешней среды, а мнопам патогенным бактериям - защиту от действия иммунной системы хозяина. Возбудитель чумы Yersinia pestis также способен формировать биопленку на различных типах поверхностей, в том числе в пищеварительном тракте переносчика чумы -блохи. Формирование чумного блока - массивной биопленки в преджелудке блохи значительно повышает эффективность трансмиссии чумы с помощью блох и необходимо для поддержания эпизоотического процесса во время эпизоотий чумы в природных очагах. В связи с этим очевидна актуальность изучения биопленки Y. pestis, играющей важную роль в сохранении возбудителя вне организма теплокровного хозяина и в развитии эпизоотий чумы в природных очагах.

До сих пор особенности процесса образования биопленки изучались у возбудителя чумы на ограниченном числе штаммов, в основном на лабораторном штамме Y.pestis KIM6 и его производных [Darby С. et al., 2005; Forman S.et al., 2006; Bobrov A.G et al., 2008; Zhou D., Yang R., 2011]. Установлено, что оптимальной для формирования биопленки у возбудителя чумы является не температура организма теплокровных животных (37°С), а температура окружающей среды и тела блохи 26-28°С. Показано, что основу матрикса биопленки Y.pestis составляет экзополисахарид - поли-N-ацетилглюкозамин (PNAG). Образование биопленки коррелирует с признаком пигмен-тсорбции, а также с формированием чумного блока в пищеварительном тракте блохи. Однако исследование этих процессов только на авирулентном штамме Y.pestis KIM6, лишенном плазмиды вирулентности pCad, не может быть достаточным для понимания механизмов формирования биопленки у возбудителя чумы разных подвидов и био-варов. Справедливость сложившихся традиционных представлений о биопленкообра-зовании у возбудителя чумы недавно поставлена под сомнение в работе P.Yoong et al. [2012]. Ввиду этого для выяснения основных закономерностей формирования биопленки необходимо провести изучение этого свойства у большого числа природных штаммов, относящихся к различным подвидам и биоварам Y.pestis.

Одной из важнейших и до сих пор нерешенных проблем в сложной экологии возбудителя чумы остается механизм его сохранения во внешней среде вне организма теплокровного хозяина. Все большое распространение получает предположение о возможности сохранения возбудителя чумы в массовых членах почвенных биоценозов, в том числе и в виде биопленки [Литвин В.Ю., 2003; Попов Н.В.и др., 2008, Кутырев В.В.

и др., 2009]. Однако видовой состав членов почвенных биоценозов природных очагов чумы мало исследован, не изучено взаимодействие возбудителя чумы с доминирующими в этих биоценозах видами амеб и круглых червей. Без выяснения особенностей взаимодействия возбудителя чумы с членами экосистемы природных очагов невозможно установление основных закономерностей инициации и развитая эпизоотического процесса, механизмов сохранения возбудителя в периоды между эпизоотиями. Эш знания необходимы для повышения эффективности проводимого эпизоотологического мониторинга в природных очагах чумы

Цель работы. Анализ особенностей образования биопленки штаммами Yersinia pestis основного и неосновных подвидов и их взаимодействия с членами почвенных биоценозов природных очагов чумы—простейшими и нематодами. Задачи исследования:

1. Сравнить эффективность образования биопленки штаммами Y.pestis основного и неосновных подвидов на различных типах абиотических и биотических поверхностей.

2.Провести сравнительный количественный анализ образования поли-N-ацетилглюкозамина у штаммов Y.pestis при температурах 28°С и 37°С, а также оценку числа копий мРНК генов hms оперона в ПЦР с обратной транскрипцией.

3. Исследовать состав генов, участвующих в образовании биопленки, у природных штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов методом ПЦР и на основе данных полногеномного секвенирования.

4. Идентифицировать спонтанные мутации хромосомной области пигментации и других участков генома у беспигментных природных штаммов Y.pestis и у мутантов, дефектных по формированию биопленки,

5. Определить систематическую принадлежность почвенных амеб и нематод из почвы нор грызунов в природных очагах чумы.

6. Провести анализ фагоцитической активности почвенных амеб в отношении штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов. Исследовать возможность сохранения возбудителя чумы в ассоциации с амебами Acanthamoeba sp. и Dictyostelium discoideum.

7. Определить особенности образования биопленки штаммами Y.pestis на поверхности различных видов почвенных нематод.

Научная новизна работы. Показано, что штаммы Y.pestis всех подвидов и био-варов способны образовывать биопленку на различных типах абиотических (стекло, пластик) и биотических (кутикула нематоды C.elegans) поверхностях. В реакции с лек-танами проростков пшеницы доказано, что у природных штаммов Y.pestis разных подвидов количество образуемого поли-Ы-ацетилглюкозамина существенно выше при температуре 28°С по сравнению с 37°С и связано с экспрессией генов hms оперона, а также с количеством образуемых штаммами пигментированных колоний на среде с

Конго красным. Установлено, что у штаммов Y.pestis всех подвидов присутствуют основные структурные гены, транскрипционные и пост-транскрипционные регуляторы образования биопленки. Определены полные нуклеотидные последовательности этих генов. У штаммов основного подвида в отличие от штаммов всех неосновных подвидов выявлено наличие мутаций - единичных нуклеотидных замен в генах waaA, hmsT, rcsC и phoP, которые могут отвечать за различия у них в регуляции этого свойства. У беспигментных природных штаммов Y.pestis и у мутантов, дефектных по формированию биопленки, идентифицированы новые типы мутаций, такие как делеция единичного нуклеотида (-А) в гене hmsH, вставка четырех нукпеотидов (+ATGA) в гене hmsS, протяженная делеция участка ypoj 969 -уро1926, охватывающая ast, hms и прилегающие к ним гены tehB,ypol943, уро193б тлуро1933 хромосомной области пигментации.

Впервые установлено систематическое положение почвенных доминант нор грызунов очагов чумы Прикаспия - Прикаспийского Северо-Западного степного, Прикаспийского песчаного и Волго-Уральского степного очагов чумы. Выявлено присутствие в почве этих очагов амеб родов Acanthamoeba, Willaertia, Hartmanella, миксомицет Dictyostelium. Доминирующим родом амеб во всех трех очагах является Acanthamoeba, а доминирующим видом амеб в Волго-Уральском степном очаге - A.castellam. Количество акантамеб может достигать от нескольких десятков до нескольких сотен тысяч клеток в одном грамме почвы. Показана фагоцитическая активность акантамеб и мик-сомицегов в отношении Y.pestis. Впервые установлено, что штаммы неосновных подвидов возбудителя чумы менее устойчивы к фагоцитозу амебами Acanthamoeba sp. и D. discoideum, чем штаммы основного подвида. Доказана возможность длительного сохранения штаммов основного подвида в ассоциации с Acanthamoeba sp. и D.discoideum. Впервые выявлена способность Y.pestis формировать биопленку на почвенных нематодах отрядов Tylenchida и Rhabditida, которые могут участвовать в распространении возбудителя во внешней среде. Выделенные в зоне очагов Прикаспия энтомопаразитиче-ские нематоды - паразиты блох отнесены к видам Rubzovinema sp., Spilotylenchus sp. и Psyllotylenchus sp. Впервые описан вид энтомопаразитической нематоды с широким спектром гостальной специфичности, который предложено назвать Rubzovinema polyxenica sp.n. Впервые определены нуклеотидные последовательности участков рибо-сомного оперона амеб из почв очагов чумы Прикаспия: Acanthamoeba castellani, Acanthamoeba sp., Willaertia sp.; участков генов 18S и 28S pPHK нематод-паразитов блох и 3 полные последовательности рибосомного оперона трех изолятов нематоды Rubzovinema sp. .Также определены фрагменты рибосомного оперона блох Neopsylla setosa, Mesopsylla hebes, Amphipsylla rossica, Ctenophthalmus secundus и нового изолята Citellophilus tesquorum, из которых выделены энтомопаразитические нематоды.

Практическая значимость работы. Разработаны методические рекомендации: «Выделение свободноживущих амеб го почв природных очагов чумы, их родовая идентификация и получение совместных культур с Yersinia pestis» (утверждены директором института 24 июня 2014 г., протокол № 5); «Выделение и определение систематической принадлежности энтомопаразитических нематод из блох в условиях природного очага чумы» (утверждены директором института 24 июня 2014 г., протокол № 5). Материалы рекомендаций использованы при проведении эпизоотологаческого обследования в условиях эгшдотряда Астраханской противочумной станции в Прикаспийском природном очаге чумы весной 2014 г. В международной базе данных NCBI GenBank депонированы фрагменты рибосомного оперона амеб Acanthamoeba castellani, Acanthamoeba sp., Willaertia sp. В NCBI GenBank также депонировано 13 нукпеотидных последовательностей рибосомного оперона нематод-паразитов блох и фрагменты этого оперона 5 видов блох - хозяев выделенных паразитических нематод.

Положения, выносимые иа защиту:

1. Природные штаммы возбудителя чумы всех подвидов и биоваров формируют in vitro биопленку на различных типах абиотических и биотических поверхностей. Количество образуемого ими основного компонента биопленки - поли-N-ацетилглюкозамина, значительно выше при 28°С, чем при 37°С и коррелирует с уровнем экспрессии генов hms оперона и формированием пигментированных колоний на среде с красителем Конго красным.

2. Состав основных структурных генов, транскрипционных и посттранскрипционных регуляторов образования биопленки у штаммов возбудителя чумы разных подвидов и биоваров одинаков, однако, имеются отличия в последовательности генов waaA, hmsT, rcsC и phoP между штаммами основного и неосновных подвидов. Выявлены новые типы мутаций хромосомной области пигментации - протяженная де-леция участка уро1969-уро1926 с генами hms оперона, делеция единичного нуклеотида (—А) в гене hmsH, вставка четырех нуклеотидов (+ATGA) в гене hmsS, приводящие к отсутствию образования биопленки у штаммов Y.pestis.

3. Возбудитель чумы способен вступать во взаимодействие с массовыми членами почвенных биоценозов природных очагов чумы - простейшими и нематодами. Штаммы Y.pestis могут длительно сохраняться в ассоциации с доминирующими в почвах очагов Прикаспия амебами Acanthamoeba sp., а также с миксамицетами D.discoideum, и образовывать биопленку на кутикуле почвенных нематод отрядов Rhabditida и Tylenchida.

Апробация работы. Материалы работы обсуждены на: научно-практической конференции с международным участием «Проблемы иерсиниозов», 12-14 окг. 2011 г., г. Санкт-Петербург; IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным бо-

лезням, 26-28 марта 2012 г., г. Москва; Второй ежегодной заочной научно-практической конференции «Микробиология в современной медицине», 26 апр.2014 г., г. Казань; VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины», Ставрополь 2014 г., на итоговых ежегодных конференциях Рос-БИПЧИ «Микроб», 2012,2013 и 2014 гт.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 - в периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России», в том числе одна - в зарубежном издании.

Структура и объём диссертации. Диссертация представлена на 218 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 38 рисунками. Библиографический указатель содержит 200 отечественных и зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использовано 80 штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов и 4 штамма Y.dpseudotuberculosis, выделенных в России, ближнем и дальнем зарубежье. Штаммы выращивали при 28°С или 37°С на агаре или в бульоне LB (pH 7,2).Культивирование нематод проводили на агаре NGM, а амеб - на среде SM/10. Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов Y.pestis и Y.pseudotuberculosis, выявление признака пигментации выполняли в соответствии с практическим руководством «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» [2013 г.]. Выявление образования биопленки на абиотических (пластик, стекло) поверхностях проводили методом окрашивания их кристаллическим фиолетовым [ O'Toole G.A., Kolter R. 1998]. Образование биопленки штаммами Y. pestis на биотических поверхностях изучали на модели штамма нематоды С. elegans N2 Bristol, полученного из «Caenorhabditis Genetics Center», Университет Миннесоты США. Для определения продукции поли-Ы-ацетштглюкозамина (PNAG) применяли реакцию с лектинами проростков пшеницы (WGA) в планшетах [McCoy J.P. et al., 1983]. Изучение экспрессии hms генов у штаммов Y.pestis проводили путем определения количества копий мРНК в ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Выделение аксени-ческих культур почвенных амеб проводили из образцов почв, собранных в Волго-Уральском степном, Прикаспийском песчаном и Северо-Западном степном природных очагах чумы. Выделение из почв почвенных нематод выполняли традиционными методами [Brenner S., 1974; Zorffla R.A., 2003]. Изготовление постоянных препаратов нематод для их морфологического анализа осуществляли по методу А.Т. De Grisse [1969].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Сравнительный анализ образования биопленки штаммами основного и

неосновных подвидов

Изучение формирования биопленки штаммами У-рея^ и У.ряеийошЪегсиШ'к на различных типах абиотических поверхностей. Образование биопленки на абиотических поверхностях было исследовано у 46 штаммов Храйи, в том числе у 22 штаммов основного и 24 штаммов неосновных подвидов. Из 22 штаммов основного подвида 8 штаммов относились к античному, 8 — к средневековому, 6 - к восточному биоварам. Штаммы неосновных подвидов включали 6 штаммов кавказского, 5 алтайского, 6 гиссарского и 5 штаммов улегейского подвидов, а также 2 штамма из Таласского высокогорного очага У всех этих штаммов была изучена их способность к формированию пигментированных колоний на среде с Конго красным. Исследованные штаммы оказались неоднородными по признаку пигментации. Их можно было разделить на 4 основные группы. Первую большую группу составили штаммы Хрез'йз, стабильно образующие более 50% пигментированных (красных) колоний. В эту группу вошли 2 штамма основного подвида и большая часть штаммов (21) неосновных подвидов. Вторая немногочисленная группа была представлена одним штаммом гиссарского подвида, который образовывал менее 50% пигментированных красных колоний, а остальные колонии имели слабопигментированную (розовую) окраску. Третью группу составили 9 штаммов основного подвида, которые формировали только слабопигментированные розовые колонии. И, наконец, в четвертую группу вошли 13 штаммов, не образующих пигментированных колоний, из которых 11 были основного и 2 неосновных подвидов. Ни один из 4-х использованных штаммов У.р$еиЛоЫЬегси1ов1в не образовывал пигментированных колоний на среде с Конго красным. У охарактеризованных по Р§т фенотипу штаммов была исследована их способность формировать биопленку на различных видах абиотических поверхностей - пластик (полисгироловые чашки), стекло (покровные стекла, помещенные в пластиковые чашки) и боросиликатные стекло (пробирки). На эти поверхности наносили суспензии штаммов в бульоне ЬВ, которые культивировали при 28°С в течение 24-48 часов, затем бульон сливали, а прикрепившиеся к поверхностям биопленки, окрашивали 0,01% фиолетовым кристаллическим. Для получения достоверных результатов эксперименты для каждого штамма повторяли три раза. Штаммы У.резИв, формирующие более 50% пигментированных колоний образовывали выраженную биопленку на всех трех типах биотических поверхностей, как и 9 штаммов основного подвида, образующие только слабопигментированные розовые колонии и один штамм гиссарского подвида, дающий менее 50% красных колоний. Беспигментные штаммы Хрейк не образовывали биопленку, в отличие от беспигментных штаммов У.рЕеш1ошЬегси1о$1$, которые формировали биопленку на абиотических поверхно-

сгях. На этом этапе работы впервые показано, что Pgm" штаммы Y.pestis всех неосновных подвидов способны обр&збйывать биопленку на а&огических поверзшостях. Получены также количественные показатели образования биопленки штаммами Y.pestis основного и неосновных подвидов на поверхности боросшшкатного стекла при 28°С. Образованную в боросиликатных пробирках биопленку окрашивали фиолетовым кристаллическим, а затем растворяли смесью этанола и ацетона для измерения количества (по интенсивности окрашивания раствора) образованной биопленки. В результате подтверждено наличие связи биопленкообразования со способностью штаммов Y.pestis образовывать пигментированные колонии. Штаммы с Pgm+ фенотипом, стабильно образующие красные колонии, давали в среднем существенно большие количественные показатели образования биопленки, чем слабопигментированные штаммы. Наиболее массивные биопленки образовывали штаммы неосновных подвидов, усредненные показатели оптического поглощения которых при А504 составили 3,15, в то время как у штаммов основного подвида этот показатель в среднем равнялся 2,44. Слабопигментированные штаммы, растущие в основном в виде розовых колоний, имели более низкий уровень образования биопленки, показатель которого составил у них 1,47. У беспигментных штаммов показатели поглощения не превышали фоновый уровень.

Анализ эффективности образования биопленки штаммами возбудителями чумы и псевдотуберкулеза на биотической поверхности на модели нематоды Celegans. Закономерность эффективности образования биопленки в зависимости от процента пигментированных красных колоний у штаммов Y.pestis была подтверждена и на биотической поверхности, в качестве модели которой использована кутикула нематоды C.elegans. Ранее изучение эффективности образования биопленки на кутикуле нематод у штаммов Y.pestis разных подвидов не проводилось. Образование биопленки исследовано на 35 штаммах основного и неосновных подвидов. Изучено 15 штаммов основного подвида (10 античного, 2 средневекового и 3 восточного биоваров) и 18 штаммов неосновных подвидов (4 кавказского, 4 алтайского, 4 улегейского и 6 гиссар-ского, а также 2 штамма из Таласского высокогорного очага) и 4 штамма Y. pseudotuberculosis. На газон суточной 28°С культуры исследуемого штамма помещали по 10 личинок нематод третьей стадии развития и инкубировали в течение суток при температуре 20°С. Через сутки проводили учет свободно передвигающихся и «блокированных» биопленкой нематод. Эффективность образования биопленки оценивали по количеству «блокированных» червей на чашках в трех повторах. Весь эксперимент повторяли 3 раза для каждого штамма «Блокированные» нематоды характеризовались наличием массивного скопления биопленки на головной части, препятствующего их передвижению по газону Эффективность формирования биопленки на кутикуле C.elegans имела четкую связь с образованием пигментированных колоний на среде с

Конго красным. 26 штаммов (8 основного и 18 неосновных подвидов), формировавшие более 50% пигментированных красных колоний, блокировали большую часть (более 50%) нематод. Вторая и третья группы штаммов (1 штамм основного, 1 алтайского и 1 гиссарского подвидов) с преимущественно или только со слабопигментированными розовыми колониями с меньшей эффективностью образовывала биопленку на биотической поверхности, блокируя менее 50% нематод, в то время как большая часть нематод могла свободно передвигаться по их газону. Беспигменгные штаммы У.ретй« и 4 штамма У.рвегиЬыЪегсиЬж не блокировали нематод.

Сравнительный анализ продукции экзополисахарида штаммами Xреяйя основного и неосновного подвидов при 28°С и 37°С. Для сравнения эффективности образования биопленки у природных штаммов основного и неосновных подвидов при температурах 28°С и 37°С проведены эксперименты по определению продукции ими основного компонента биопленки—поли-Ы-ацетилглюкозамина. Для этого использована реакция с лектинами проростков пшеницы (ЪЮК), которые специфически связываются с субъединицами РЫАО. Реакцию проводили в микропланшетах, где продукцию РИАв оценивали по титру цветной реакции и по количеству единиц оптической плотности поглощения раствора меченного пероксидазой лекпзна, связавшегося с РЫАО. Для каждого штамма проводили 12 повторов, которые включали по два выращивания при температурах 28°С и 37°С (по три повторности на каждом планшете). Всего в исследовании использовано 23 штамма Хрел'й.?. Среди них - 14 штаммов основного подвида, из которых 9 штаммов относились к античному биовару, 4 - к средневековому, а вакцинный штамм ЕУНИИЭГ - к восточному биовару. Неосновные подвиды были представлены 9 штаммами, в том числе двумя штаммами кавказского, двумя штаммами улегейского, двумя штаммами гиссарского и тремя штаммами алтайского подвидов. По признаку пигментации 12 из 23 использованных штаммов относились к первой группе, стабильно образующей пигментированные красные колонии. Они включали 5 штаммов основного (4 античных и 1 средневековый) и 7 штаммов неосновных (2 штамма кавказского, 1 гиссарского, 2 улегейского подвида и 2 алтайского) подвидов. Среди остальных 11 штаммов три штамма (античного, средневекового биоваров и гиссарского подвида) образовывали менее 50%, пигментированные (красных) колоний, а два штамма античного и средневекового биоваров росли исключительно в виде слабопигментированных (розовых) колоний. Еще 5 штаммов античного, средневекового и восточного биоваров и 1 штамм алтайского подвида формировали непигментиро-ванные колонии.

Определение продукции РИАв у 28°С культур штаммов Хрезги в реакции с WGA показало, что все образующие пигментированные красные колонии штаммы основного и неосновных подвидов давали высокие значения оптической плотности по-

глощения, свидетельствовавшие о высокой продукции у них PNAG. У штаммов основного подвида при 504 нм (А.50а) эти значения составляли 0,259 - 0,797 (рис.1), а титры цветной реакции равнялись 1/4 - 1/32. Схожие результаты при 28°С в реакции с WGA показали штаммы неосновных подвидов. Семь штаммов неосновных подвидом с высоким процентом пигментированных колоний давали А504 равные 0,231 - 0,486, которые были несколько ниже, чем у пигментированных штаммов основного подвида. У бес-пигментньк штаммов степень поглощения была на уровне фоновых значений. Такие же показатели имели два штамма античного и средневекового биоваров, которые росли исключительно в виде слабопигментированных розовых колоний, что свидетельствовало об отсутствии у них продукции PNAG. Три слабопигментированных штамма основного подвида с небольшим (менее 50%) количеством пигментированных колоний образовывали незначительное количество PNAG, о чем можно было судить по титру цветной реакции с WGA, равным 1/2 и показателю А504, который составил у них 0,108-0,126.

В целом средний показатель А504 штаммов Y.pestis основного подвида с высоким процентом пигментированных красных колоний почти в 4 раза превышал таковой штаммов с низким процентом красных колоний и более чем в 46 раз - штаммов со сла-бопигментированными и непигментированными колониями. Таким образом, еще раз показана однозначная связь между способностью штаммов Y.pestis формировать пигментированные колонии и количеством образуемого при температуре 28°С экзополиса-харида. Неожиданный результат показали штаммы, образующие только слабопигмен-тированные колонии. Эта штаммы формируют биопленку на абиотических и биотических поверхностях, однако, они не показали продукции PNAG, что позволяет высказать предположение о том, что матрикс их биопленки имеет состав, отличный от PNAG.

1 г *

а 1

а ■ 1 1 - 1 || .EZ 1 1 d ни м

1 2 3 4 5 6 7 S 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

еж культуры, выращенные при 28 градусах ■ культуры, выращенные при 37 градусах

Рисунок 1. Количественные показатели продукции поли-М-ацетилглюкозамина в реакции с лектинами проростков пшеницы (\¥вА) у культур штаммов У.реЛй разных подвидов, выращенных при 28°С и 37°С. По горизонтали: штаммы основного подвида - 1. 231(708), 2. КМ-260(5), 3. КМ-130, 4. КМ-130(2), 5.231/3,6. 680,7. КМ-932, 8. А-1691, 9. А-1836,10. А-1824,11. М-956 12. С-528, 13.139(259), 14. ЕУ НИИЭГ, неосновных подвидов - 15. С-534,16. 376,17. А-1726,18. А-1633,19. И-2422, 20. И-3130, 21. И-3000,22. И-2998, 23. 6209. По вертикали - количество единиц оптической плотности поглощения меченного пероксидазой лектина, связавшегося с Р1ЧА(3 (А504).

Аналогичные эксперименты по количественной оценке продукции РИАО у 37°С культур штаммов основного подвида показали, что штаммы, образующих высо-

кий процент пигментированных колоний, не продуцируют РИАв при этой температуре. Их показатели поглощения А504 были близки к фоновому свечению

(0,00 - 0,015), что в среднем было в 76 раз ниже, чем у этих культур, выращенных при температуре 28°С. Эта данные согласуются с традиционными представлениями о формирования биопленки у возбудителя чумы при температуре тела блохи, но не теплокровного организма. При выращивании при 37°С большинство штаммов неосновных подвидов также не показало наличия РИАв в образцах, выращенных при этой температуре за исключением нескольких штаммов, у которых при этой температуре зарегистрирован относительно высокий уровень продукции экзополисахарида, который был все же в 2 раза ниже, чем при 28°С. Образующие только слабопигментированные розовые колонии штаммы при 37°С не показали в реакции с продукции экзополисахарида.

Определение экспрессии генов Игт оперона у штаммов возбудителя чумы разных подвидов при температурах 28°С и 37°С. Был проведен анализ уровня экспрессии при 28°С и 37°С одного из ключевых генов А/да оперона - НтяН, который обеспечивает транспорт экзополисахарида из клетки. Для этого использован метод ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ), который позволяет определять уровень экспрессии исследуемых генов на основе оценки количества копий образуемой ими мРНК (рис.2).

18000.00 16000,00 14000,00

«количество копни ш РНК прп 28 градусах «количество копий/нг РНК при 37 градусах

Рисунок 2. Количество копий мРНК гена ЬпяН в 1нг РНК при 28°С и 37°С у исследованных штаммов У!реяй: основной подвид-1.231(708), 2. КМ-260(5), Э.КМ-130,4.934, 5. КМ-932, 6. А-1792, 7. М956, неосновные подвиды - 8. С-534, 9. И-3000,10. И-2422,11. А-1726, основной подвид-12. А-1824.

Всего изучено 12 штаммов У.реЛй, в том числе 8 штаммов основного подвида (5 античного и 3 средневекового биоваров) и 4 штаммов неосновных подвидов (по одному каждого подвида). Три штамма основного подвида и все 4 штамма неосновных подвидов образовывали более 50% пигментированных колоний. 4 штамма основного подвида образовывали только розовые колонии и один штамм - беспигментные колонии. В результате установлено, что у большинства Pgm+штаммов уровень экспрессии при 28°С, выше,

чем при 37°С. Количество копий мРНК в 1 нг РНК при 28°С у них в среднем в 3 раз больше, чем при 37°С. Средняя копийность гена Ит&Н при 28°С у штаммов основного и неосновных подвидов составила 10 097,52 копий/нг, а при 37°С - 3 477,19 ко-пий/нг. Таким образом, уровень экспрессии гена кпяН гораздо ниже при выращивании при 37°С, чем при 28°С. У штаммов, образующих только слабопигментированные розовые колонии экспрессия гена ИпкН отсутствовала при обеих температурах, что означает отсутствие экспорта экзополисахарида на поверхность клетки. Это согласуется с отсутствием продукции у таких штаммов поли->5-ацетилглюкозамина при обеих температурах выращивания, выявленное в реакции с пектинами проростков пшеницы. В то же время эти штаммы образовывали биопленку на различных абиотических и биотических поверхностях, сопоставимую с биопленкой Р§т+ штаммов, что дает основание для предположения о том, что эти штаммы образуют отличающуюся по составу матрикса биопленку, не кодируемую генами /тау оперона.

В целом подтверждено наличие взаимосвязи между формированием биопленки на абиотических и биотических поверхностях, уровнем продукции экзополисахарида, экспрессией генов Итй оперона и образованием пигментированных колоний, а также подтверждено преимущественное проявление всех этих признаков при сниженной (28°С) температуре. Выявлены отличия в проявлении биопленкообразования у штаммов Креяй^ основного и неосновных подвидов и У.рзеисЬшЬегсиЛо&ъ.

2. Анализ участков генома, связанных с образованием биопленки у штаммов Крейи основного и неосновных подвидов

Анализ состава генов образования биопленки у штаммов Хрегйу методом ПЦР и на основе данных полногеномного секвенирования. Проведен анализ присутствия основных генов биопленкообразования у большого числа природных штаммов возбудителя чумы разных подвидов. До сих пор изучение генетических основ формирования биопленки проводили на лабораторном мутантном штамме У.резйя К1М6 и его производных, но не изучали у штаммов неосновных подвидов. Детекцию генов, участвующих в образовании биопленки осуществляли с помощью метода ПЦР, а также на основе данных по полногеномному секвенированию. При помощи ПЦР проведен анализ наличия основных генов биопленкообразования у 48 штаммов У.райгз, в том числе у 30 природных штаммов основного подвида (11 античного, 16 средневекового и 3 восточного биоваров) и 18 штаммов неосновных подвидов (по 5 штаммов кавказского и алтайского подвидов, по 3 штамма гиссарского и улегейского подвидов, 2 штамма Таласской группы), а также у 4 штаммов У.рхеисЬшЪегайож . Для этого использован комплект праймеров, большая часть из которых сконструирована в рамках этой работы. Проведенный анализ показал, что все способные к формированию биопленки и пиг-ментсорбции штаммы основного и неосновных подвидов (41 из 48 штаммов) имели

полный набор основных генов: hmsHFRS, hmsT, hmsP, gmhA, speA, speC, rcsA, phoP, phoQ, ассоциируемых с биопленкообразованием. В гене rcsA у всех штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов выявлена вставка в 30 п.н. в отличие от Y. pseudotuberculosis, которая приводит к нарушению функциональности этого гена — отрицательного регулятора образования биопленки в блохах, что свидетельствует о важности его выключения для Y.pestis. Других определяемых _в ПЦР отличий в структуре проанализированных генов у Pgm+ штаммов не выявлено. У пяти Pgm" штаммов основного подвида (2 — античного и два - средневекового биоваров, а также штамм ЕУНИИЭГ восточного биовара) в ПЦР не детектировались гены hmsHFRS оперона, что наряду с их авирулентносгью свидетельствовало о потере ими всей хромосомной pgm области. В отличие от них у двух Pgm" штаммов алтайского и улегейского подвидов присутствовал весь набор основных генов биопленкообразования, включая hmsHFRS оперон, и, по-видимому, отсутствие биопленкообразования связано у них с отличиями в регуляции этого признака.

Полученные в ПЦР данные были расширены при анализе полногеномных последовательностей 10 штаммов Y.pestis основного (6 штаммов: 2 античного и 4 средневекового биоваров) и неосновных (4 штамма: по одному кавказского, алтайского, гис-сарского и улегейского) подвидов из природных очагов России и стран ближнего зарубежья [Одиноков Г.Н. и др., 2013]. Проведенное исследование наличия структурных генов биопленкообразования - hmsHFRS, gmhA, waaA; генов пост-транскрипционных регуляторов hmsP,hmsT, speC; регуляторов транскрипции nghA, rcsC,phoP,phoQ у 10 штаммов основного и неосновных подвидов показало, что гены присутствовали у всех этих штаммов (табл.1).

Однако в некоторых из них выявлены мутации - замены единичных нуклеотидов, которые отличают штаммы основного подвида от штаммов неосновных подвидов. В гене waaA у всех штаммов основного подвида относительно неосновных подвидов и Y.pseudotuberculosis содержится замена единичного нуклеотида А—>С в позиции 1169 от начала гена, которая приводит к замене аминокислоты цистеина на фениланин. В ре-гуляторном гене hmsT в позиции 938 у основного подвида присутствует замена G—>А (аспарагин—> серии), в регуляторном гене rscC выявлена замена С—>Т в позиции 935 (лейцин —»серии). Еще одна миссенс-мутация (G—>А, глицин —» серин) присутствует у штаммов основного подвида в глобальном регуляторном гене phoP в позиции 643. Возможно, что все эти мутации, выявленные преимущественно в регуляторных генах, являются причиной отличий в регуляции биопленкообразования у штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов. Эти отличия заключаются в том, что штаммы неосновных подвидов образуют более массивную биопленку на абиотических поверхностях, но продуцируют меньшее количество PNAG, чем штаммы основного подвида.

Штаммы неосновных подвидов также менее эффективно образуют биопленку на кути-кулеC.elegans. ' .•• ' Л

Таблица 1. Анализ генов образования биопленки у штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов на основе их полногеномных последовательностей_

Штамм, очаг Структурные гены Посттранскрипционные регуляторы Регуляторы транскрипции

hmsH hmsF hmsR gmhA waaA 1169* hmsT 938* hmsP speC nghA rcsC 935* phoP 643* phoQ

Основной подвид

С092 (GenBank), референтный штамм + + + + +, с +, А + + + +, т +, А +

И-1996,1454, С-791, А-1809, М-1773, М-1864 + + + + +, с +, А + + + +, т +, А +

Неосновные подвиды

91001 Microtus (GenBank) + + + + +, А +, G + + + +, с +, G +

С-741 кавказский п/в, М-1948 алтайский п/в, А-1249 гиссарский п/в, И-2422 улегейский п/в + + + + +, А +, G + + + +, С +, G +

* — Указано положение мутации (номер нуклеотида) от начала гена

Идентификация спонтанных мутаций хромосомной области пигментации и других участков генома у мутантов Y.pestis, дефектных по формированию биопленки, и у беспигментных природных штаммов. Проведена идентификация спонтанных мутаций хромосомной области пигментации и других участков генома у беспигментных природных штаммов Y.pestis и у мутантов, дефектных по формированию биопленки. В том числе, исследован набор изогенных мутантов, производных высоковирулентного штамма античного биовара Y.pestis 231(708) [Kutyrev V.V.et al., 1992], не образующих пигментированные колонии, отличающихся по вирулентности, и, как установлено нами, не формирующих биопленку на абиотических и биотических поверхностях. Для выяснения причин отсутствия у них биопленкообразования сконструирован набор из 18 пар праймеров на гены хромосомной области пигментации такие, как astE, argD, phoH, hmsHFRS, tehB,ypol943,ypol936,ypol933,ypol926,ypol919, int, irp8, irp2, psn фи), ypol902. С их помощью установлено, что причиной отсутствия образования пигментированных колоний и биопленкообразования у одного из изогенных спонтанных мутантов высоковирулентного штамма 231(708) - Y.pestis 231/3 является наиболее часто встречаемая мутация — делеция всей хромосомной области пигментации, приведшая также к авирулентносга этого мутанта. У двух других изогенных мутантов

штамма 231(708) - Y.pestis KM-130 и его производного КМ-130/2 (без плазмиды pPst), утративших способность к пигментсорбции, но сохранивших вирулентность [Kutyrev V.V. et al., 1992], все гены хромосомной области пигментации были в наличии. При се-квенировании полной последовательности hms оперона с помощью 10 пар праймеров установлено, что эти мутанты содержат делецию единичного нуклеотида (-А) в позиции 1314 от начала гена hmsH. Эта мутация со сдвигом рамки считывания вызвала изменение последовательности белка HmsH после 437 а.о. и терминацию трансляции после 451 а.о. из-за возникновения стоп-кодона в последовательности гена hmsH. Обнаруженная мутация приводит к полной потере домена белка во внешней мембране, и, как следствие, к нарушению порообразования и прекращению экспорта экзополисахарида из клетки.

Идентифицированы мутации, приводящие к отсутствию формирования пигментированных колоний и образования биопленки, у ряда природных беспигментных штаммов Y.pestis восточного и средневекового биоваров. В ПЦР с использованием набора из 18 пар праймеров установлено, что у одного из штаммов средневекового биовара — Y.pestis КМ-214 утрачен значительный участок хромосомной области пигментации, включавший así оперон, hms оперон и прилегающие к ним гены tehB, уро1943, уро1936 и уро1933. Однако у этого штамма сохранились гены уро1926, уро1919, гены острова высокой патогенности HPI - int, irp8, irp2, fyuA (psn), ypol902. Такая мутация описана впервые. При секвенировании генов hms оперона у другого беспигмешного штамма восточного биовара - Y.pestis R.ex 490 выявлено наличие еще одной мутации -вставки четырех нуклеотидов (+ATGA) в гене hmsS после 389 н., включающей стоп-кодон TGA. Вследствие этой мутации происходит укорочение последовательности HmsS и вместо белка в 155 а.о. образуется мутантный размером в 130 а.о. с нарушенной структурой активного центра, что и является причиной неспособности этого штамма и к образованию пигментированных колоний и формированию биопленки. Таким образом, выявлено несколько новых типов мутаций у беспигментных природных штаммов Y.pestis и у спонтанных лабораторных мутантов, дефектных по формированию биопленки. Охарактеризованный набор мутантов может быть использован для дальнейшего уточнения /гик-зависимого механизма образования биопленки.

3. Исследование взаимодействия возбудителя чумы с членами почвенных биоценозов природных очагов чумы

Анализ взаимоотношений штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов с простейшими. В последнее время высказываются предположения о возможности сохранении возбудителя чумы в членах почвенных биоценозов очагов, в том числе в виде биопленки [Попов Н.В. и др., 2006; Попов Н.В. и др., 2008, Кутырев В.В. и др., 2009]. Однако практически не изучен состав доминирующих видов почвенных биоце-

нозов очагов чумы, и не исследовано взаимодействие с ними возбудителя чумы. Нами проведен анализ образцов почв из нор грызунов, собранных в Волго-Уральском степном, Прикаспийском песчаном и Прикаспийском Северо-Западном степном очагах. В них выявлены преимущественно цисгообразующие амебы, хотя присутствовали также миксомицеты (слизевики) рода Dictiostelium, но в значительно меньших количествах. Численность цисгообразующих амеб в почвах всех трех очагов была очень велика и колебалась от 27 до 300 тысяч клеток в одном грамме почвы. После выделения ДНК амеб в ПЦР с помощью двух пар праймеров JDP1/ JDP2 и ITS1/ ITS2 на участки рибосомно-го оперона [Pelandakis М., Pernin Р., 2002; Schroeder J.M. et al., 2001] по размерам образуемых амплификатов установлена систематическая принадлежность выделенных амеб к родам Acanthamoeba (ПЦР фрагмент размером 450 п.н.), Willaertia (500 п.н.) и Hartmanella (800 п.н.). Амебы рода Acanthamoeba присутствовали в почвах всех трех очагов в очень больших количествах, в то время как другие амебы имели гораздо более низкую численность. Полученные в ПЦР фрагменты гена 18S рРНК амеб были секве-нированы. С использованием базы данных NCBI GenBank установлено, что акантамебы из Волго-Уральского степного очага принадлежат к виду A. castellani (процент гомологии с амебами этого вида составил 99,3% при совпадении длины последовательности фрагмента гена 18S рРНК на 99%). Акантамебы из двух других очагов Прикаспия идентифицированы по базе данных как Acanthamoeba sp. Известно, что амебы рода Acanthamoeba в природе являются резервуарами многих патогенных бактерий, таких родов как Francisella, Vibrio, Legionella, Burkholderia, Listeria, Mycobacterium и других [Greub G., Raoult D., 2004]. Высокая численность акантамеб может обеспечить их тесное взаимодействие с возбудителем чумы в почвенном биоценозе природных очагов.

Впервые исследована фагоцитическая активность выделенных из почв очагов Прикаспия амеб Acanthamoeba sp. и D. discoideum в отношении штаммов Y.pestis основного и неосновного подвидов. На наборе из 13 штаммов Y.pestis, включавшем 7 штаммов основного (4 античного, 3 средневекового биоваров) и 6 штаммов неосновных подвидов (по два штамма кавказского и алтайского, и по одному штамму гиссарского и улегейского подвидов) методом совместных культур Y.pestis и акантамеб выявлена выраженная фагоцитическая активность последних в отношении клеток возбудителя чумы. При этом акантамебы активнее размножались в совместной культуре со штаммами неосновных подвидов, на которых отчетливые бляшки формировались уже через 24 часа, в то время как на газоне штаммов основного подвида они появлялись через 36-48 часов. Другой вид амеб D. discoideum образовывал бляшки в более поздние сроки: через 24-36 часов на газоне штаммов неосновных подвидов и не ранее, чем через 48 часов на газоне штаммов основного подвида. Таким образом, впервые установлено, что штаммы неосновных подвидов возбудителя чумы менее устойчивы к фагоцитозу амебами

Acanthamoeba sp. и D. discoideum, чем штаммы основного подвида. Мы предполагаем, что отличия могут быть связаны с различным уровнем экспрессии у них системы секреции третьего типа.

Проведено моделирование длительного выживания штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов в ассоциации с амебами Acanthamoeba sp. и D. discoideum. На стерильные полоски фильтровальной бумаги наносили отмытые культуры амеб Acanthamoeba sp., предварительно в течение нескольких суток культивированных на штаммах Y.pestis до полного «выедания» бактериального газона Параллельно в качестве контроля на полоски фильтровальной бумаги наносили чистые культуры штаммов Y.pestis, выращенных при температуре образования биопленки - 28°С. Посевы хранили при температуре 26°С и относительной влажности воздуха 20% в течение 4 месяцев в климатической камере KBF 720 (Binder, Германия) для моделирования условий сохранения в засушливые климатические периоды в отсутствие питательных веществ и влаги. Всего исследовано 7 штаммов Y.pestis, из них 3 штамма античного и 2 штамма средневекового биоваров и по одному штамму кавказского и алтайского подвидов. Высевы из пробирок проводили через 2,4, 6,14,21, 28, 60, 90 и 120 суток. По результатам проведенного эксперимента установлено, что в чистой культуре возбудитель не сохранялся дольше двух недель. Самым нежизнеспособным оказался беспигментный мутант Y.pestis КМ-130, который не высевался уже на вторые сутки эксперимента. Это может быть связано с его неспособностью формировать биопленку, которая могла защитить его клетки от высыхания и недостатка питательных веществ. Штаммы кавказского — С-534 и алтайского - И-3000 подвидов, напротив, показали наибольшую жизнеспособность в чистой культуре и высевались в течение 2 недель. По-видимому, штаммы с выраженным биопленкообразованием дольше сохраняются в отсутствие питательных веществ и влаги во внешней среде. В ассоциации с амебами Acanthamoeba sp. в тех же условиях эксперимента большинство исследованных штаммов Y.pestis сохранялось значительно дольше, чем в чистой культуре. Два штамма античного и средневекового биовара, образующие слабопигментированные розовые колонии, выжили в ассоциации с амебами в течение 2 месяцев - в 10 раз дольше, чем в чистой культуре. Штамм 231(708) с высоким процентом образования пигментированных красных колоний удалось выделить спустя 4 месяца от начала эксперимента, то есть он сохранялся в 20 раз дольше, чем в чистой культуре. Таким образом, у большинства штаммов основного подвида отмечается повышение длительности выживания в 6-20 раз в ассоциации с амебами. Штаммы неосновных подвидов С-534 и И-3000, напротив, не показали увеличения длительности выживания в ассоциации с амебами, и высевались в те же или даже меньшие сроки, чем в чистой культуре (не более 2 недель). Это еще раз подтверждает меньшую устойчивость неосновных подвидов к фагоцитозу амебами по сравнению с

основным подвидом. Также проведенные модельные эксперименты с другой амебой О сНясоМеит показали, что штамм У.реяНя 231(708) основного подвида способен выживать и в ее спорах.

Методом иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием коммерческого набора «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие чумные адсорбированные лошадиные» удалось выяснить, что клетки возбудителя чумы присутствуют в цитоплазме амеб (в индивидуальных вакуолях), о чем можно было судить по их специфическому желто-зеленому свечению (рис.3). Локализация клеток Хре^/и в вакуолях в амебах подтверждена и с помощью электронной микроскопии, которая показала, что эти вакуоли окружены эндоплазматическим ретикулумом клеток амеб. По-видимому, часть клеток ХреЛм сохраняется и воспроизводится в амебах, а при наступлении благоприятных условий начинает активно размножаться и разрушает хозяйскую клетку подобно другим бактериям.

трофо-юиты амеб

цисты амеб

Рисунок 3. Иммунофлуоресцентный анализ амеб Acanthamoeba sp. после их выращивания в совместной культуре со штаммом У. pestis 231(708). Специфическое желто-зеленое свечение указывает на внутриклеточную локализацию клеток возбудителя чумы в трофозоитах и цистах амеб.

Анализ взаимодействия возбудителя чумы с нематодами из нор грызунов природных очагов чумы. Проведены исследования по изучению взаимодействия Y.pestis и почвенных нематод, выделенных из почвы нор грызунов в Прикаспийском песчаном, Волго-Уральском степном и Прикаспийском Северо-Западном степном очагах. Из почвенного субстрата дна камер различных грызунов выделены нематоды отрядов Tylenchida (4 вида) и Rhabditida (7 видов). Их систематическая принадлежность к этим отрядам установлена по их морфологическим характеристикам и на основе определенной нами последовательности генов 18S рРНК.

В экспериментах со штаммом 231(708) и его беспигментным мутантом КМ-130 установлено, что первый способен образовывать биопленку на кутикуле выделенных нематод Tylenchida и Rhabditida. При этом биопленка вначале образовывалась на голов-

ной части, а затем и по всей поверхности тела нематод. У некоторых видов Rhabditida скопление биопленки отмечалась у женских особей в области вульвы, а у мужских - в районе спикул (рис.4).

Киопленка пи головной части Биопленка па вульве самки Виоплсика в области спикул

нематолы отр. Tylettchitla нематоды «тр. Rhabditida самца нематоды отр. Rhabditida

Бпоплснка на вульве самки Биопленка в области спикул самца

нематоды отр. Rhabditida: ув. xlOOO нематоды отр. Rhabditida: ув. xltllKl

Рисунок 4. Скопление биопленки на поверхности нематод отрядов Ту1епсЫ(к и

ШюЫШа.

Отмечено, что скопление биопленки в области половых органов почвенных КЬаЬсИ1!с1а не приводило к снижению их жизнеспособности и способности к размножению. Можно сделать предположение, что почвенные нематоды вносят свой вклад в сохранение и рассеивание культур К.рейй.

Недавно сформулирована гипотеза «вертикальной трансмиссии» чумы, в соответствие с которой важную роль в выносе возбудителя чумы из почвенных в наземные биоценозы играют энтомопаразитические нематоды [Кутырев В.В. и др., 2009]. Нами изучены энтомопаразитические нематоды из блох мелких грызунов, собранных на территории Саратовской области на границе с Волго-Уральским степным очагом. Всего исследовано 807 экземпляров блох, представлявших виды: C.tesquorum, Л'.яего.яг, М.ЬеЬеэ Р.ьетига, А.гозвюа, Ct.secund.us. собранных с четырех видов грызунов. Процент зараженных нематодами насекомых варьировал от 0% до 21%. В полости тела зараженных блох обычно обнаруживалось от 1 до 4 паразитических самок и от 10 до 1000 личинок. Выделенные энтомопаразитические нематоды отнесены к трем видам -ЯиЬло\чпета эр., 8рИо1у1епсИт эр. и ер. Вид 8рИо1у1епс1тв эр. был выде-

лен только из блох МЛеЬех, вид Лу//о(у/еис/г«.у ер. из блох Д^егом и Рлетига, а вид ЯиЬгоутета Бр. из блох С. 1е5циогит1 А. С1 secundus, N. яе^а и Р. 5етжа. Счи-

тается, что нематоды-паразиты блох паразитируют на ограниченном круге хозяев. Однако выделенный нами вид зр. паразитировал одновременно в пяти видах блох, что свидетельствует об отсутствии у него строгой специфичности к хозяину. Мы предлагаем выделить обнаруженную нами нематоду в отдельный вид Я. ро1ухетса эр.п.

Полученные последовательности генов рибосомного оперона энтомопаразитических нематод Rubzovinema sp., Spilotylenchus sp. и Psyllotylenchus sp. и хозяев - 5 блох депонированы в базе NCBI GenBank. Нуклеотидные последовательности нематод - паразитов блох депонированы в NCBI GenBank впервые. Проведенный филогенетический анализ выделенных нематод-паразитов блох на основе последовательностей их рибосомного оперона позволил установить их монофилетическое происхождение и обосновать необходимость их объединения в общий таксон.

На основе выполненного в рамках этой работы комплексного исследования свойств возбудителя чумы, его генетической организации и особенностей социального поведения впервые получены экспериментальные доказательства того, что он способен вступать во взаимодействие с массовыми членами природных экосистем очагов чумы -простейшими и нематодами, которые могут участвовать в сохранении и распространении возбудителя чумы в почвенных биоценозах. Полученные данные будут способствовать повышению эффективности эпизоотологического мониторинга в природных очагах чумы и оптимизации комплекса профилактических мер по контролю за чумой на очаговых территориях.

ВЫВОДЫ

1. Штаммы Y.pestis всех подвидов и биоваров образуют in vitro биопленку на абиотических (стекло, пластик) и биотических (кутикула нематоды C.elegans) поверхностях.

2. Количество образуемого штаммами Y.pestis экзополисахарида поли-N-ацетилглюкозамина значительно выше при 28°С, чем при 37°С, и коррелирует с уровнем экспрессии генов hms оперона и формированием пигментированных колоний на среде с красителем Конго красным.

3. На основе ПЦР анализа и полногеномного секвенирования установлено, что состав основных генов образования биопленки у штаммов Y.pestis всех подвидов и биоваров одинаков. Однако имеются отличия в нуклеотидных последовательностях генов waaA, hmsT, rcsC и phoP между штаммами основного и неосновных подвидов.

4. Выявлены новые типы мутаций, приводящие к отсутствию образования биопленки у штаммов Y.pestis, такие как деления единичного нуклеотида (-А) в гене hmsH, вставка четырех нуклеотидов (+ATGA) в гене hmsS, протяженная делеция участка уро1969 - уро1926, охватывающая ast, hms и другие регионы хромосомной области пигментации.

5. Установлено присутствие в почвах очагов чумы Прикаспия амеб родов Acanthamoeba, Dictyostelium, Willaertia, Hartmanella. Доминирующими видами являются виды Acanthamoeba sp. и Acanthamoeba castellani. Показана фагоцигическая активность амеб Acanthamoeba sp. и D.discoideum в отношении Y.pestis, и установлена возможность длительного сохранения (до 4 месяцев) возбудителя в ассоциации с ними

6. Выявлена способность Y.pestis формировать биопленку на кутикуле и органах почвенных нематод Tylenchida и Rhabditida, которые могут участвовать в сохранении и распространении возбуд ителя во внешней среде. Впервые выделен вид нематод - паразитов блох с отсутствием строгой специфичности к хозяину.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Попов КВ., Кошель ЕЛ, Ерошенко ГА., Кутырев В.В. Формирование современных представлений о механизме энзоотии чумы // Проблемы особо опасных ииф. -2011.-ВЫП. № 3(109). - С. 5«. (Журнал из перечня ВАК)

2. Ерошенко Г.А, Кошель ЕЛ, Одинокое ГЛ, Шавина Н.Ю., Краснов Я.М., Гусева Hit, Кутырев В.В. Вариабельность нуклеощдных последовательностей генов phoP/phoQ и rovA — глобальных регуляторов жизненного цикла возбудителя чумы // Проблемы особо опасных инф. - 2012.- Вып. 112.- С. 25-28. (Журнал из перечня ВАК)

3. Ерошенко ГА, Видяева H.A., Куклева Л.М., Кошель ЕЛ, Одиноков ГЛ, Шавина Н.Ю., Князева Т.В., Мокроусова Т.В., Краснов Я.М., Анисимова JIB., Новичкова JLA, Ерохин П.С., Бойко AB., Кутырев В.В. Изучение образования биопленки у бее-пигментных и бесплазмцгщых мутантов штамма Yersinia pestis на биотических поверхностях в условиях in vitro и in vivo II Проблемы особо опасных инф. -2012.- Вып. №3 (113),- С.45-49. (Журнал из перечня ВАК)

4. Koshel Е. L, Aleshin V. V., Eroshenko G. A, Kutyrev V. V. Phylogenetic analysis of entomoparasitic nematodes, potential control agents of flea populations in natural foci of plague // BioMed. Research Int - 2014.- V.2014, Article Ш 135218.- 26 pages. (Журнал представлен в базе Web of Science)

5. Ерошенко ГА., Кошель ЕЛ, Видяева НА., Одиноков ГЛ., Куклева JIM Анисимова JIB., Новичкова JIA, Кутырев ВВ.. Влияние различных галов мутаций на образование биопленки штаммами Yersinia pestis на модели нематоды Caenorhabditis elegans //Материалы научно-практической конференции «Проблемы иерсиниозов», 12-14 окт. , 2011 г., г. Санкт-Петербург. СПб, 2011.

6. Кошель ЕЛ, Ерошенко ГА., Видяева НА., Анисимова JIB., Новичкова JIA.. Кутырев ВВ. Особенности образования биопленки у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов // Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, 26-28 марта 2012 г.. Москва -М., 2012- С. 201.

7. Кошель ЕЛ, Видяева НА, Анисимова JIB., Новичкова JIA., Ерошенко ГА. Сравнительный анализ образования №адегил-Е>-глюкозамина у штаммов возбудителя чумы при температурах 28°С и 37°С // Материалы Второй ежегодной заочной научно-практической конференции, приуроченной к 200-летию Казанского государственного медищшского университета, «Микробиология в современной медицине», 26 апр. 2014 г., г. Казань — Казань, 2014,- С. 39-40.

8. Кошель ЕЛ, Куклев В.Е., Анисимова JIB., Новичкова ЛА. Определение экспрессии генов hms оперона для анализа эффективности образования биопленки у штаммов Yersinia pestis методом ОТ-ПЦР-РВ оценки количества мРНК // VI Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины».—Ставрополь, 2014 г.

Подписано к печати 20.09.2014 Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46