Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Филогенетическая принадлежность штаммов Yersinia pestis основного подвида из природных очагов России и сопредельных государств

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Филогенетическая принадлежность штаммов Yersinia pestis основного подвида из природных очагов России и сопредельных государств"

На правах рукописи

Di^Jh.

ОГЛОДИН Евгений Геннадьевич

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬ ШТАММОВ Yersiniapestis ОСНОВНОГО ПОДВИДА ИЗ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ РОССИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ

ГОСУДАРСТВ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации па соискаиие ученой степени кандидата биологических паук

3 ИЮН 2015

005569695

Саратов - 2015

005569695

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Рос-потребнадзора)

Научный руководитель: Ерошенко Галина Александровна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лаборатория молекулярной микробиологии, главный научный сотрудник Официальные оппоненты: Кацы Елена Ильинична

доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биохимии и физиологии растений и

микроорганизмов Российской академии наук,

лаборатория генетики микроорганизмов,

заведующая лабораторией

Викторов Дмитрий Викторович

доктор биологических наук, доцент

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заместитель директора по научно-экспериментальной работе Ведущая организация: Федеральное казенное учреждение здравоохранения

«Ставропольский научно-исследовательский

противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г. Ставрополь

Защита состоится « 24 » июня 2015 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.146.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) по адресу: 410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Тел./факс(8452) 97-03-83

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ. Диссертация и диссертация размещены на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnw-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан » 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.002.146.01 л

доктор биологических наук Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Чума представляет серьезную проблему для здравоохранения и в XXI веке, постоянно проявляя себя по всему миру в виде отдельных случаев или вспышек болезни с высоким уровнем летальности. В Российской Федерации и других странах СНГ расположено 45 природных очагов чумы, многие из которых являются действующими. На территории России в 2013-2014 гг. отмечена высокая эпизоотическая активность части природных очагов Прикаспия и Сибири (Попов и др., 2013; 2014; 2015; Кутырев и др., 2014).

Штаммы возбудителя чумы Yersinia pestis неодинаковы по вирулентности и эпидемической значимости. Наибольшую опасность представляют собой штаммы основного подвида, обладающие высокой и универсальной вирулентностью и циркулирующие на территории большинства континентов. Штаммы основного подвида широко распространены и в очагах чумы в России и циркулируют в 10 из 11 расположенных здесь очагов. В 2013-2014 гг. впервые выявлена постоянная циркуляция основного подвида в Горно-Алтайском высокогорном очаге чумы, где ранее выделялись только штаммы неосновного (алтайского) подвида (Балахонов и др., 2013, Кутырев и др., 2014). В 2014 г. здесь впервые произошло заражение чумой человека. Случаи чумы регистрируются и в сопредельных с Россией государствах - Монголии, Китае, Киргизии, Казахстане, где распространены штаммы основного подвида. Наличие протяженных границ, активные экономические связи и миграция населения из сопредельных стран создают серьезные предпосылки для заноса эпидемически опасных штаммов возбудителя чумы в Российскую Федерацию. Все это требует разработки высокоэффективных средств диагностики и идентификации штаммов возбудителя чумы. В настоящее время для исследований в области микробиологии становятся доступными современные технологии и высокоразрешающее оборудование. В том числе рутинным методом лабораторных исследований становится ПЦР в реальном времени. Эта технология обеспечивает получение быстрых и надежных результатов, однако, до сих пор она применялась для видоспецифической детекции возбудителя чумы (Куклев, 2007), но не для молекулярного типирования штаммов У. pestis по их происхождению и внутривидовой принадлежности. В то же время разработка способов внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis с установлением их природно-очаговой и географической принадлежности, важна для определения происхождения вспышечных штаммов и возможных путей заноса и распространения инфекции.

В процессе внутривидовой эволюции возбудителя чумы сформировалось несколько филогенетических линий основного подвида, соответствующих трем биоварам этого подвида -античному, средневековому и восточному (Павлова и др., 2012; Одиноков и др. 2013; Devignut et al., 1950; Achtman et al., 1999; 2004; Morelli et al., 2010; Cui et al., 2013). Штаммы средневекового биовара относятся к филогенетической линии 2.MED. Штаммы восточного биовара отно-

сятся к филогенетической линии — 1.0RI. Наибольшим разнообразием отличаются штаммы античного биовара. Они делятся на несколько филогенетических линий: O.ANT, 1.ANT, 2.ANT. 3.ANT, 4.ANT, штаммы которых циркулируют в различных регионах мира. Филогенетическая принадлежность штаммов Y. pestis из природных очагов России и сопредельных стран остается мало исследованной. В то же время определение принадлежности штаммов Y. pestis из очагов России и сопредельных стран к определенным филогенетическим линиям является насущной проблемой и необходимо для выявления источника и региона происхождения вновь выделяемых штаммов Y. pestis. Оно имеет и значительный теоретический интерес, поскольку важно для установления основных путей формирования современных границ ареала возбудителя чумы, имевших место в период образования вида Y. pestis.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Разработка способа и определение с его помощью филогенетической принадлежности штаммов возбудителя чумы основного подвида из природных очагов России и сопредельных государств на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

ЗАДАЧИ:

1. Выбор ДНК мишеней для определения принадлежности штаммов У. pestis основного подвида к античному, средневековому и восточному биоварам методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Расчет праймеров, зондов, оптимизация условий проведения ПЦР.

2. Определение полной нуклеотидной последовательности плазмиды pCKF. Выбор на ее основе ДНК мишени и разработка способа дифференциации типичных и атипичных штаммов средневекового биовара.

3. Разработка способа установления принадлежности штаммов Y. pestis к основным филогенетическим линиям античного биовара O.ANT, 1.ANT и 2.ANT методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

4. Определение полной нуклеотидной последовательности плазмиды рТРЗЗ и выбор на ее основе ДНК мишени для детекции в ПЦР штаммов античного биовара филогенетической линии 4.ANT. Выявление маркерной замены единичного нуклеотида для детекции штаммов античного биовара линии 3.ANT методом фрагментного секвениро-вания.

5. Определение филогенетической принадлежности штаммов Y.pestis основного подвида из природных очагов чумы России и сопредельных государств методами ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов и выявления маркерной замены единичного нуклеотида с помощью фрагментного секвенирования.

Научная новпзна работы. Для дифференциации штаммов У. реяги основного подвида античного, средневекового и восточного биоваров с помощью ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов выбраны ДНК мишени - «Меё24» и «§1рВ», рассчитаны праймеры и зонды в формате TaqMan.

Разработан способ дифференциации типичных и атипичных штаммов средневекового биовара на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Проведено определение полной нуклеотидной последовательности плазмиды рСКР размером 5,4 т.п.и., характерной для атипичных штаммов средневекового биовара из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы, и выполнен ее структурно-функциональный анализ. Показано наличие в составе плазмиды 8 кодирующих последовательностей, связанных с процессами транспорта и секреции и, в частности, с системой секреции IV типа. Участок плазмиды рСКР, богатый Г+Ц парами (координаты 3205-3332 и.), использован для детекции атипичных штаммов средневекового биовара. На разработанный способ дифференциации типичных и атипичных штаммов средневекового биовара методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов подана заявка на изобретение № 2014114712 от 14.04.2014 г., и получено положительное решение о выдаче патента от 02.02 2015 г. Полная последовательность плазмиды рСКБ депонирована в базе данных N001 вепБапк с номером доступа КМ112087.

Разработан способ определения принадлежности штаммов У.резиз к основным филогенетическим линиям античного биовара О.АЫТ, 1.АЫТ и 2.АЫТ на основе ПЦР с гибридизаци-онно-флуоресцентным учетом результатов. Выбраны мишени «сшф» и «70», рассчитаны праймеры и зонды в формате TaqMan.

Определена полная нуклеотидная последовательность плазмиды рТРЗЗ размером 33,4 т.п.н., характерной для штаммов У. ре^и из Тувинского горного очага чумы филогенетической линии 4.АЫТ. Установлено наличие 52 кодирующих последовательностей, большинство из которых идентифицировано как фаговые белки, что свидетельствует о том, что эта плазмида является кольцевым геномом фага В состав рТРЗЗ также входят гены двухкомпонентной системы белков токсин-антитоксин УоеВ/УеОЛ, которая нарушает репликацию ДНК бактерий. Для детекции штаммов линии 4.АЫТ выбран участок плазмиды с координатами 3153-3312 н., расположенный в области гена рагА. С использованием мишени «ТЦУ» разработан способ детекции штаммов линии 4.АЫТ в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

Впервые разработан способ определения штаммов античного биовара филогенетической линии З.АЫТ на основе выявления маркерной замены единичного нуклеотида С—»А в гене УР02499 в позиции 139 от начала гена с помощью фрагментного секвенирования. На разработанный способ определения филогенетической принадлежности штаммов У.реБШ на основе вы-

явления маркерных единичных нуклеотидов методом фрагментного секвенирования подана заявка на изобретение № 2014127788 от 08.07.2014.

С помощью разработанного способа проведен филогенетический анализ штаммов У. pestis основного подвида из очагов чумы России и сопредельных государств. Показано, что на территории России циркулируют штаммы преимущественно линии 2.MED, а также линии 2.ANT и 4.ANT. В очагах сопредельного государства - Монголии распространены в основном штаммы античного биовара линий 2.ANT, 3.ANT и 4.ANT. Не выявлено штаммов Y. pestis античного биовара древней линии 0.ANT, что свидетельствует против широко распространенного мнения о том, что «сурчиная» (античная) чума произошла в Монголии.

Циркуляция штаммов древней линии 0.ANT установлена в 4-х высокогорных очагах Киргизии - трех Тянь-Шаньских высокогорных очагах - Сарыджазском, Верхненарынском и Аксайском, а также в Алайском высокогорном очаге.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанные ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов и выбранные ДНК мишени обеспечивают дифференциацию штаммов Yersinia pestis основного подвида по их принадлежности к античному, средневековому и восточному биоварам, а также к основным филогенетическим линиям O.ANT, l.ANT, 2.ANT, 2.MED, l.ORI возбудителя чумы.

2. На основе определения полных нуклеотидных последовательностей плазмид pCKF штаммов Y.pestis из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы и рТРЗЗ - из Тувинского горного очага чумы установлено, что в первой из них содержатся гены системы секреции IV типа, а вторая представлена геномом фага, включающего гены двухкомпонентной системы белков токсин-антитоксин YoeB/YefM. Участки плазмид pCKF и рТРЗЗ использованы для детекции филогенетических линий 2.MED0 и 4.ANT возбудителя чумы в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

3. С применением разработанного способа филогенетического анализа на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов установлено, что очагах Российской Федерации циркулируют штаммы античного биовара линий 2.ANT и 4.ANT, средневекового биовара линий 2.MED и 2.MED0. В очагах Монголии распространены штаммы Y.pestis линий 2.ANT, 3.ANT и 4.ANT, а в четырех высокогорных очагах Киргизии - штаммы древней линии 0.ANT.

Методология и методы исследования. Методологической основой являлись отечественные и зарубежные литературные источники, в которых отражены проблемы филогенетического анализа штаммов Y. pestis, использование ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов для детекции искомой нуклеотидной последовательности, а также вопросы, связанные с применением технологий секвенирования и обработки полученных данных при

молекулярном типировании возбудителя чумы. В исследовании использовался комплексный анализ и системный подход при изучении данной темы. В процессе подготовки исследования и описания материала применялись различные научные методы: методологический анализ научных трудов, эмпирическое исследование в виде наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительного анализа. С помощью перечисленных методов, в совокупности с анализом фактического материала была обеспечена достоверность и объективность полученных результатов и выводов.

Теоретическая и практическая значимость. Разработан способ определения биоварной и филогенетической принадлежности штаммов возбудителя чумы на основе ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. С его помощью проведен филогенетический анализ штаммов К pesIv; из всех природных очагов России и части очагов сопредельных государств. Полученные данные пополнят знания по глобальному разнообразию возбудителя чумы, а также по основным путям формирования современных границ распространения вида Y. pestis. Разработанный способ может быть использован для повышения эффективности проводимого эпидемиологического мониторинга природных очагов чумы.

По материалам исследования разработаны методические рекомендации: «Детекция типичных и атипичных штаммов Yersinia pestis средневекового биовара методом ПЦР с гибриди-зационно-флуоресцентным учетом результатов (Утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» 24 июня 2014 г.); «Определение геновариантов штаммов возбудителя чумы методом муль-типокусного секвенирования» (Утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» 11 сентября 2014 г.). Разработанные методические приемы использованы для проведения молекулярной идентификации штаммов Y. pestis основного подвида, выделенных в Горно-Алтайском высокогорном и Прикаспийском песчаном очагах чумы в 2014 г. (Попова и др., 2014).

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в отделе микробиологии ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзо-ра в рамках плановых научно-исследовательских тем: «Создание системы молекулярного типи-рования штаммов Yersinia pestis» 2009-2013 гг. (шифр темы 42-3-09, № гос. регистрации 0120.0853926), «Комплексный эколого-эволюционный анализ штаммов Yersinia pestis из природных очагов Российской Федерации и сопредельных стран» 2014-2016 гг. (шифр темы 50-314, № гос. регистрации 0120.1450347). Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в получении и обработке экспериментальных данных. Лично автором проведен анализ литературы, выполнены исследования по выбору оптимальных ДНК мишеней для определения биоварной принадлежности штаммов Y. pestis, а также поиск и выявление ДНК мишеней для установления их филогенетической принадлежности, по разработке способа филогенетического анализа на основе ПЦР с регистрацией результатов в режиме реального времени и выявления

маркерной замены единичного нуклеотида с помощью фрагментного секвенирования, по установлению филогенетической принадлежности штаммов возбудителя чумы из природных очагов России и части очагов сопредельных стран. Совместно с сотрудниками лаборатории геномного и протеомного анализа ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» проведено определение полной нуклео-тцдной последовательности двух критических плазмид pCKF и рТРЗЗ из штаммов возбудителя чумы, и лично автором выполнен структурно-функциональный анализ этих плазмид с использованием ресурсов международных баз данных.

Апробация работы. Материалы работы представлены на научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014», Москва 18-20 марта 2014 г.; на VI Всероссийской научно-практической конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины», Ставрополь, 22-24 октября, 2014 г.; XI Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении», Киров, 22-23 мая 2014г.; на VII ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 30 марта-1 апреля 2015 г.; на итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» 2014, 2015 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 в периодических изданиях из «Перечня российских рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием объектов, материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 13 рисунками. Библиографический указатель содержит 168 отечественных и зарубежных источников.

Объекты, материалы и методы исследования. В работе использовано 162 штамма Y. pestis различного происхождения. Штаммы выращивали при 28сС или 37°С в течение 24-48 часов в бульоне LB (рН 7,2) и на агаре LB (рН 7,2). Для определения дифференциальных биохимических признаков штаммов Y. pestis устанавливали их ферментативную активность по отношению к сахарам (рамнозе, мелибиозе) и глицерину, а также способность к нитрификации и де-нитрификации (Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней», 2013 г.). Выделение бактериальной ДНК осуществляли с помощью набора для выделения ДНК AxyPrep Bacterial Genomic Miniprep Kit (производство AXYGEN Biosciences). ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов проводили с праймерами и зондами в формате TaqMan с применением флуоресцентных красителей FAM и ROX, гасителей флуоресценции - BHQ1 и BHQ2 (производство «Синтол», Россия). Учет флуоресценции проводили на

этапе отжига праймеров, уровень порога равнялся 0,05. Наличие положительного сигнала пробы учитывалось значением Ct графика кривой флуоресценции менее 31. Для секвенирования участков генома штаммов Y. pestis использовали автоматический генетический анализатор ABI 3500x1 Genetic Analyzer (Life technologies, США). Анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью сервера аннотирования микробных геномов с использованием технологии подсистем (RAST) (Aziz et al., 2008), а аминокислотных последовательностей с помощью алгоритма Psi-BLAST и баз данных NCBI GenBank, PATRIC, Uniprot, RAST, Pfam, FIGfams и EMBL.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Разработка способа определения биоварной принадлежности штаммов Y. pestis методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

Выбор ДНК мишеней для определения биоваров штаммов Y.pestis основного подвида методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Для определения принадлежности штаммов Y. pestis основного подвида к одному из трех биоваров - античному, средневековому или восточному методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов выбраны две ДНК мишени - «glpD» и «med24». Первая из них является участком гена glpD глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы, который у штаммов восточного биовара содержит делецию в 93 п.н. (Motin et al., 2002). Вторая мишень «med24» расположена в межгенном пространстве между генами gcuT и visC и содержит у штаммов средневекового биовара делецию размером в 24 п.н. (Одиноков и др., 2013). На обе ДНК мишени рассчитаны праймеры и зонды в формате TaqMan, комплементарные участкам делеций, определены оптимальные условия проведения реакции. Эффективность разработанных ПЦР проверена на 48 штаммах Y. pestis основного подвида, в том числе на 16 штаммах античного, 21 штамме средневекового и 11 штаммах восточного биоваров. Установлено, что в ПЦР с праймерами на мишень «glpD» флуоресцентный сигнал выявлялся у штаммов античного и средневекового биоваров и отсутствовал у штаммов восточного биовара, а в ПЦР на мишень «Med24» выявлялся у штаммов античного и восточного биоваров, но не штаммов средневекового биовара. Таким образом, впервые разработаны две ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, которые позволяют быстро и эффективно определять принадлежность исследуемых штаммов Y. pestis основного подвида к одному из трех его биоваров - античному, средневековому или восточному.

Разделение в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов типичных и атипичных штаммов средневекового биовара. Определение полной нуклеотидной последовательности криптической плазмидыpCKF. Штаммы средневекового биовара широко распространены в природных очагах России и циркулируют в 7 из этих 11 очагов. Они также распространены в большинстве очагов стран СНГ. Это высоковирулентные

штаммы, которые, как правило, обладают типичными свойствами. Однако в некоторых участках Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы выделяются атипичные штаммы этого биовара, которые имеют сниженную вирулентность, уникальную для штаммов чумного микроба питательную потребность в аминокислоте пролине и которые содержат критическую плаз-миду размером ЗМДа (Проценте и др., 1987; Жаринова и др., 2004). На основе полногеномного секвенирования одного из таких штаммов установлено, что они представляют древнюю филогенетическую линию средневекового биовара, которая обозначена как 2.MED0 (Одинокой и др., 2013). В геноме этих штаммов нами не выявлена деления размером 24 п.н., и, следовательно, разработанный выше способ выявления штаммов средневекового биовара, не обеспечивает детекции атипичных средневековых штаммов. В связи с этим возникла необходимость выявления еще одной ДНК мишени для детекции атипичных средневековых штаммов. С этой целью была использована последовательность ЗМДа криптической плазмиды, маркерной для этих штаммов. Для выбора ДНК мишени для детекции в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом атипичных штаммов средневекового биовара нами впервые определена полная нуклеотидная последовательность критической 3 МДа плазмиды, которую мы обозначили pCKF по названию Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы. Для получения ДНК применяли набор AxyPrep Bacterial Genomic Miniprep Kit», a «Ion Xpress Library Kit» - для подготовки библиотек размером 200 п.н. Секвенирование выполняли в системе Ion PGM (Life technologies, США) и с помощью генетического анализатора ABI 3500x1 Genetic Analyzer (Life technologies, США). Обработку первичных данных по секвенированию осуществляли посредством комплекта программ Ion Torrent Suite software (версия 3.4.2). Затем контиги собирались de novo из единичных чтений (ридов) с помощью npoipaMM Newbler gsAssembler, 2.6. В дальнейшем учитывались контиги, включавшие не менее 100 единичных прочтений. Кратность покрытия каждого нуклеотида составила около 2000.

Для замыкания pCKF в кольцевой репликон на краевые участки контигов плазмиды были сконструированы праймеры. Образованные в ПЦР краевые фрагменты секвенировали на капиллярном генетическом анализаторе ABI 3500x1 Genetic Analyzer, а затем их последовательности объединяли с полученными нуклеотидными последовательностями фрагментов pCKF в кольцевой репликои. Для финализации полной последовательности pCKF применяли программу UGENE (версия 1.12.2). Размер собранного кольцевого репликона составил 5,4 т.п.н. Его карта приведена на рисунке 1.

Состав Г+Ц пар у плазмиды pCKF равен 38,4%, в то время как Г+Ц состав хромосомы штаммов Y. pestis равен 47,6%, что свидетельствует о получении плазмиды pCKF от микроорганизма, филогенетически удаленного как от бактерий рода Yersinia, так и других бактерий семейства Enterobacteriaceae. При дальнейшем анализе нуклеотидной последовательности pCKF

использовали сервер RAST и алгоритм NCBI GenBank glimmer3. Анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых плазмидой, проводили по данным баз PATRIC, NCBI GenBank, RAST, Uniprot, Pfam и EMBL с применением алгоритма Psi-BLAST. Установлено, что в плаз-миде pCKF содержится 8 отбытых рамок считывания. Они включают несколько идентифицированных генов: rep (белок репликации), virB6 (белок канала внутренней мембраны IV типа секреции), virBS (минорный пилин IV типа секреции).

COSJ

Рисунок 1 - Карта плазмиды pCKF штамма Y.pestis С-627 из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы. Открытые рамки считывания обозначены стрелками. Предполагаемая точка начала репликации плазмиды отмечена белым треугольником

Эти гены считаются идентифицированными на основании того, что их гомология с выявленными близкими нуклеотидными последовательностями из баз генетических данных составляет не менее 70%. В частности, кодирующая последовательность CDS1 плазмиды pCKF (1-693 н.) имеет высокий процент (89%) гомологии с геном белка репликации ORF1 критической плазмиды pYC (6 т.п.н), входящей в геном штаммов возбудителя чумы из провинции Яньнань в Китае (Song et al., 2004). CDS3 (1175-2218 н.) показала более 70% гомологии с vir В 6 геном Proteus mirabilis, который кодирует VirB6 белок внутренней мембраны системы секреции IV типа (СС4Т) и участвует в формировании канала во внутренней мембране для экспорта бактериальных белков из клетки во внешнее окружение или в клетки мишени макроорганизма. Аминокислотная последовательность продукта CDS3 гомологична на 45% белку СС4Т Y. enterocolitica TriE, который кодируется плазмидой р29930 и который, как и белок VirB6, выполняет функции по секреции белков. Последовательность CDS7 (3903-4619 и.) более чем на 70% гомологична virBS гену Campylobacter upsaliensis. Белок VirB5 является минорным пили-ном и принимает участие в построении периплазматического канала СС4Т. Аминокислотная последовательность белка CDS7 показала 55% сходства с еще одним белком СС4Т Y. enterocolitica — TriD, также кодируемым плазмидой р29930.

Функции пяти других кодирующих последовательностей плазмиды pCKF предположительно идентифицированы по аминокислотным последовательностям кодируемых ими белков с использованием баз данных PATRIC, Pfam, NCBI GenBank, EMBL и Uniprot. Как оказалось, белок, кодируемый CDS6 (3271-3906 н.), на 30% гомологичен белку СС4Т Y. enterocolitica - TriL, ген которого расположен на плазмиде р29930. Продукт CDS8 (5204-5088 н.) показал 43% гомологии с ABC транспортным белком пермеазы Bacillus anthracis, который принимает участие в транспорте большого набора веществ разного размера во внешнюю среду. Белки, кодируемые CDS2 (765-980 н.), CDS4 (2220-2414 н.) и CDS5 (2404-2691н.), имеют гомологию около 40% с гипотетическими белками Escherichia coli, Streptococcus parasanguinis и Clostridium sp., соответственно.

В позиции 5219-5308 н. последовательности плазмиды pCKF присутствует уникальный участок с богатым содержанием (65,9%) А+Т пар, который состоит из двух повторов по 44 нук-леотида. Каждый повтор, в свою очередь, состоит из двух более коротких повторов по 22 п.н., которые включают 3 уникальные замены нуклеотидов. Этот обогащенный А+Т парами участок находится перед геном гер бежа репликации и, по-видимому, является точкой начала репликации плазмиды pCKF (Рисунок 1). В целом полученные данные доказывают связь продуктов генов плазмиды pCKF с процессами транспорта и секреции, и в частности с системой секреции IV типа. Близкие функции описаны ранее для генов плазмиды pCRY штамма microtus Y.pestis 91001 (Song etal., 2004). Возможно, что кодируемые плазмидой pCKF белки СС4Т могут играть определенную роль в сохранении штаммов этой древней ветви возбудителя чумы средневекового биовара в условиях ландшафтно-географической зоны Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы. В мировых информационных ресурсах сведения об этой плазмиде отсутствуют. Плазмида pCKF депонирована в базе данных NCBI GenBank с номером доступа КМ112087.

Для выявления в ПЦР атипичных штаммов средневекового биовара из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы выбран участок плазмиды в позиции 3205-3332 н., который обозначен нами как мишень «pCKF». Эта мишень расположена в начале гена CDS6 и представляет собой участок, богатый Г+Ц парами. На мишень «pCKF» рассчитаны праймеры и зонд в формате TaqMan, определены условия проведения ПЦР. Эффективность разработанной ПЦР проверена на 72 штаммах Y. pestis разных подвидов, в том числе на 21 типичном и 12 атипичных штаммах средневекового биовара (Рисунок 2).

В результате проведенного анализа различных штаммов Y. pestis установлено, что сигнал флуоресценции с праймерами и зондом на мишень «pCKF» наблюдался только у атипичных штаммов средневекового биовара линии 2.MED0 из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы и отсутствовал у других штаммов Y. pestis. Таким образом, разработана ПЦР с гибриди-

зационно-флуоресцентным учетом результатов для детекции атипичных штаммов средневекового биовара из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы и их дифференциации от типичных штаммов этого биовара и штаммов других биоваров и подвидов.

Использование трех разработанных монолокусных ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на мишени «Мес124», «рСКР» и <^1рВ» обеспечивает разделение штаммов У. ре.$й.5 всех трех биоваров, включая и атипичные штаммы средневекового биовара.

Штаммы Y. pestis: 1. С-627 - положительный контроль. Атипичные штаммы средневекового б/в: 2. С-630, 3. С-765. Типичный штамм средневекового б/в: 4. А-161. 5. Отрицательный контроль.

Рисунок 2 - Выявление атипичных штаммов средневекового биовара методом ПЦР с гиб-ридизационно-флуоресценгным учетом результатов на мишень «pCKF»

2. Разработка способа определения принадлежности штаммов К pestis к основным филогенетическим линиям с помощью ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

Выше описан способ детекции типичных (линия 2.MED) и атипичных (линия 2.MED0) штаммов средневекового биовара, а также штаммов восточного биовара (линия l.ORI) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Следующей задачей была разработка способа определения с помощью ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов основных филогенетических линий античного биовара - 0.ANT1, 1.ANT и 2.ANT.

Дифференциация в ПЦР штаммов античного биовара филогенетических линий O.ANT, 1.ANT и 2.ANT. В качестве ДНК мишени для линии 1 .ANT выбран участок генома, содержащий у штаммов этой линии филаментозный фаг cusp. У штамма У. pestis С092 (NCBI GenBank) геном фага локализован в позиции 2554179-2562920 н. На этот участок нами рассчитаны праймеры и зонд в формате TaqMan, комплементарный последовательности фага cusp, которые обеспечивают получение флуоресцентного сигнала в ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени у штаммов линии 1 .ANT. Филаментозный фаг cusp также содержится в ге-

J

I

номе всех штаммов восточного биовара 1 .ORI, однако, линия античного биовара 1 .ANT отделяется от линии l.ORI по наличию сигнала с праймерами и зондом на ДНК мишень «glpD». У штаммов восточного биовара этот сигнал отсутствует.

Для дифференциации штаммов другой филогенетической линии античного биовара -2.ANT выбрана мишень «70», которая представляет участок генау1694, содержащий у штаммов этой линии делецию размером 70 п.н. после 811 н. от начала гена. Нами рассчитаны праймеры на участки гена у1694, фланкирующие делецию, и зонд в формате TaqMan, комплементарный самому участку делеции. В ПЦР у штаммов линии 2.ANT сигнал флуоресценции на мишень «70» отсутствует. Делеция размером в 70 п.н. в гене у1694 присутствует также и у штаммов средневекового биовара линии 2.MED, однако, линия 2.ANT отделяется от них по наличию положительного сшпала по мишени «Med24». У штаммов линии 2.MED этот сигнал отсутствует. Амплификацию ДНК с праймерами и зондами на мишени «Cusip» и «70» осуществляли в отдельных реакциях. У штаммов античного биовара линии 0.ANT в ПЦР с праймерами на мишень «Cuscp» флуоресцентный сигнал отсутствует, а на мишень «70» выявляется. Эффективность двух разработанных ПЦР подтверждена на 34 штаммах античного биовара, включая 22 штамма античного биовара из высокогорных очагов Киргизии, 4 штамма из Африки и 8 штаммов из Забайкальского степного очага. Все штаммы из высокогорных очагов Киргизии относились к линии 0.ANT, 4 штамма из Африки к линии 1 .ANT и штаммы из Забайкальского степного очага к линии 2.ANT. Таким образом, впервые разработаны две ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов для дифференциации трех основных филогенетических линий античного биовара 0.ANT, 1.ANT и 2.ANT.

Детекция в ПЦР штаммов Y. pestis античного биовара линии 4.ANT. Определение полной пуклеотидной последовательности криптической плазмиды рТРЗЗ. Выполненное недавно полногеиомное секвенирование штамма У. pestis из Тувинского горного очага, расположенного в России, позволило выделить еще одну филогенетическую линию античного биовара - 4.ANT (Одиноков и др, 2013). Штаммы линии 4.ANT античного биовара выявлены и на территории Монголии (Cui et al., 2013). Для детекции штаммов 4.ANT необходимо было найти эффективную ДНК мишень, дифференцирующую штаммы этой линии от других линий античного биовара. Отличительной особенностью штаммов из Тувинского горного очага является наличие у них криптической плазмиды рТРЗЗ размером около 34 т.п.н., которая отсутствует у других штаммов Y. pestis (Балахонов, 2000; Балахонов и др., 2013). Для выбора ДНК мишени для линии 4.ANT нами впервые проведено определение полной нуклеотидной последовательности плазмиды рТРЗЗ. Секвенирование плазмиды и замыкание ее в кольцевой геном, а также анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили также, как это описано выше для плазмиды pCKF. Установлено, что состав Г+Ц пар плазмиды рТРЗЗ равен 50,3%

относительно 47,6% хромосомы возбудителя чумы, что не исключает возможности приобретения рТРЗЗ от других бактерий семейства Enterobacteriaceae. Размер плазмиды составляет 33829 п.н. Ее карта приведена на рисунке 3. С помощью сервера поиска открытых рамок считывания RAST и алгоритма NCBI GenBank glimmer3 установлено, что в плазмиде рТРЗЗ содержится 52 открытые рамки считывания. Большинство генов рТРЗЗ идентифицировано как фаговые белки. В частности CDS19, CDS27, CDS28, CDS30, CDS31, CDS33, CDS36, CDS37, CDS38, CDS41, CDS45, CDS46, CDS47, CDS48, CDS51, CDS52 кодируют, по данным RAST, фаговые или фаг-связанные белки. Продукты генов CDS2, CDS25 и CDS26 участвуют в образовании структур хвоста фага. Ген CDS21 кодирует рекомбинационный белок RecT фага, CDS24 - белок ExoZ продукции экзополисахарида, CDS51 - большую субъединицу фаговой терминазы. Белки, кодируемые CDS1, CDS3, CDS4, CDS6, CDS 11, CDS 12, CDS 16 и CDS20, принимают участие в процессе репликации ДНК, а также в лизисе бактериальной стенки. В частности, CDS1 кодирует интегразу, нарушающую присоединение ферментов к ДНК.

Рисунок 3 - Карта плазмиды рТРЗЗ из штамма Y.pest is KM 932 из Тувинского горного очага чумы. Стрелками отмечены открытые рамки считывания, определенные с помощью сервера RAST и алгоритма NCBI GenBank glimmer3. Белым треугольником указана предполагаемая точка начала репликации плазмиды

Продукт CDS3 является лизоцимом, который при 96% покрытии аминокислотной последовательности имеет 100% идентичности с лизоцимом Y. pestis. Продукт CDS4 имеет 100% покрытие и 100% идентичности холину (предположительно II семейства) Г. pestis. Продукт CDS6 является белком репликации РагА, который имеет 100% идентичности с Par А, кодируемым участком генома Y. pestis. Последний принадлежит к семейству бактериальных белков, участвующих в разделении хромосом в процессе репликации. CDS 10, CDS 11 и CDS20 имеют 100% покрытие и 99% идентичности с белком Y. pestis, который является экзорибонуклеазой VIII (по классификации ферментов - ЕС 3.1.11.).

CDS12 имеет 97% покрытие и 73% сходство с белком YoeB суперсемейства токсин-антитоксин YoeB/YefM регулирующей системы, локализованной в основном на плазмидах семейства Enterobacteriaceae. Белок YoeB является токсином, действующим на репликативный аппарат бактерий (Aziz, 2008). Он связывается с ДНК акцептора и препятствует расхождению хромосом во время деления клетки. CDS13 имеет 100% покрытие и 69% идентичности с белком YefM суперсемейства токсин-антитоксин YoeB/Y efM регулирующей системы. YefM является антитоксином и связывается в комплекс токсин-антитоксин, препятствуя действию токсина на ДНК собственной клетки.

CDS16 имеет 100% гомологии с белком У. pestis, участвующим в инициации репликации. Еще два гена CDS46 и CDS50 кодируют по данным RAST плазмидный белок и белок мобильного генетического элемента. Функции продуктов генов CDS5, CDS7, CDS8, CDS9, CDS14, CDS15, CDS17, CDS18, CDS22, CDS23, CDS32, CDS35, CDS39, CDS40, CDS42, CDS43, CDS44, CDS49 с помощью сервера RAST, а также с помощью алгоритма Psi-BLAST с использованием данных баз NCBI GenBank, PATRIC, Uniprot, RAST, Pfam и EMBL установить не удалось. Они определены как гипотетические белки с неустановленными функциями. Таким образом, по совокупности полученных данных можно сделать заключение о том, что плазмида рТРЗЗ является кольцевым геномом фага, который содержит в основном гены собственного морфогенеза, а также гены двухкомпонентной системы токсин-антитоксин YoeB/YefM, действующей на репликативный аппарат бактерий. По данным баз NCBI GenBank, PATRIC, Uniprot, RAST, Pfam и EMBL в них отсутствуют бактериофаги, высоко гомологичные (более 70% гомологии) рТРЗЗ. Наибольшее сходство рТРЗЗ имеет с бактериофагом из бактерии Photorhabdus asymhiotica subsp. asymhiotica, с фагом Aggregatibacter S1249, с почвенным бактериофагом Aaphi23, с фагом Xylella fastidiosa 9а5с, с фагом Sodalis glossinidius str. morsitans. Бактерии, содержащие эти фаги, являются почвенными бактериями. Штаммы У. pestis также циркулируют в почвенных биоценозах нор грызунов в природных очагах чумы, где они должны выживать в условиях взаимодействия с многочисленными членами этих биоценозов - простейшими, нематодами, другими микроорганизмами. Стабильное сохранение плазмиды рТРЗЗ в штаммах античного биовара линии 4.ANT в Тувинском горном очаге доказывает наличие селективных преимуществ придаваемых этим штаммам белками рТРЗЗ. Значительную роль в выживании в почвенных биоценозах штаммов У. pestis может играть двухкомпонентная система токсин/антитоксин YoeB/YefM, которая нарушает репликацию ДНК бактерий.

Для детекции штаммов античного биовара филогенетической линии 4.ANT, в качестве ДНК мишени, обозначенной нами как «TUV», выбран участок плазмиды с координатами 31533312 п., расположенный в области гена рагА. На выбранный участок рассчитаны праймеры и зонд TaqMan, определены условия проведения ПЦР. В ПЦР на мишень «TUV» у штаммов ли-

ний О.АЫТ1, 1.АК(Т и 2.АЫТ сигнал флуоресценции отсутствовал, поскольку у них отсутствует плазмида рТРЗЗ. Положительный сигнал проявлялся только у 9 взятых в эксперимент штаммов из Тувинского горного очага (Рисунок 4).

Таким образом, впервые разработан способ детекции штаммов античного биовара линии 4.АЫТ и их дифференциации от штаммов древней линии античного биовара О.АЭТ в ПЦР с

Штаммы У.ревНз: 1. КМ 932 - положительный контроль. Тувинский горный очаг: 2. И-2638. 3 -отрицательный контроль.

Рисунок 4 - Выявление штаммов У.резИз античного биовара филогенетической линии 4.А>1Т методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов на мишень «Т11У»

Разработка способа детекции штаммов К рс'яШ античного биовара филогенетической линии З.ANT. Недавно были выявлены также штаммы античного биовара филогенетической линии З.А>1Т (Сш е( а1., 2013). Проведенный нами анализ нуклеотидных последовательностей штаммов линии З.АЫТ (ЫСВ1 ОепВапк) не позволил выявить эффективной ДНК мишени для детекции штаммов линии З.АИТ в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Поэтому для их детекции нами разработан другой способ, основанный на выявлении маркерной замены единичных нуклеотидов методом фрагментного секвенирования. Известно, что абсолютное большинство замен единичных нуклеотидов произошло в истории эволюции возбудителя чумы лишь однажды за исключением нескольких зон гомоплазий, локализация которых в геноме хорошо известна (Одиноков и др., 2013; Ас1Итап е/ а/., 1999; 2004; МогеШ е? а/., 2010; Сш <?/ а/., 2013). Ввиду этого детекция отдельных филогенетических линий У. резНз возможна путем выявления единичных нуклеотидных замен, маркерных для этих линий. На основе сравнения геномов штаммов У. линии З.АИТ (ЫСВ1 ОепВапк) с геномами других филогенетических линий была выявлена единичная замена нуклеотида, перспективная для выявления штаммов линии З.АИТ. Замена единичного нуклеотида С—>А находилась в гене УР02499 в позиции 139 от начала гена. На вариабельный участок были рассчитаны праймеры,

определены оптимальные условия проведения ПЦР. На наличие маркерной замены в гене YP02499 проверены штаммы античного биовара, в том числе 22 штамма линии 0.ANT из высокогорных очагов Тянь-Шаня, 4 штамма линии 1.ANT из Африки, 8 штаммов линии 2.ANT из Забайкальского степного очага, 9 штаммов из Тувинского горного очага. У всех этих штаммов маркерная замена в гене YP02499 отсутствовала. Она выявлялась только у нескольких взятых в эксперимент штаммов из Монголии, что позволило предположить их принадлежность к линии 3.ANT.

Таким образом, впервые разработаны способы определения принадлежности штаммов античного биовара к филогенетическим линиям O.ANT, l.ANT, 2.ANT, 4.ANT с помощью ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов и к линии 3.ANT на основе выявления маркерной нуклеотидной замены с помощью фрагментного секвенирования. 3. Определение филогенетической принадлежности штаммов возбудителя чумы из природных очагов России и сопредельных государств

Разработанный способ использован для филогенетического анализа штаммов У. pestis основного подвида из природных очагов России и части очагов сопредельных стран. Всего исследовано 113 штаммов Y. pestis основного подвида, в том числе 49 штаммов основного подвида из очагов России, 24 штамма основного подвида из очагов Монголии и 40 из высокогорных очагов Киргизии.

Филогенетическая принадлежность штаммов Y. pestis основного подвида из природных очагов чумы в России. В ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов с праймерами и зондами на ДНК мишени «med24», «pCKF», «uscp», «70», «Tuv» и «glpD» изучено 47 штаммов Y. pestis из 9 природных очагов России. Штаммы из Центрально-Кавказского высокогорного очага разделились на две группы 2.MED и 2.MED0, как это и было показано выше. Все штаммы из Терско-Сунженского низкогорного, Дагестанского равнинно-предгорного, Прикаспийского Северо-Западного степного, Волго-Уральского степного, Волго-Уральского песчаного, Прикаспийского песчаного очагов относятся к основной филогенетической линии средневекового биовара 2.MED (Рисунок 5).

У штаммов античного биовара из Забайкальского степного очага отсутствовал положительный сигнал с праймерами и зондом на мишень «70» и, следовательно, они относятся к линии 2.ANT. У штаммов из Тувинского горного очага выявлялся положительный сигнал флуоресценции с праймерами и зондом на ДНК мишень «TUV». Они относятся к линии 4.ANT. Ни в одном из исследованных очагов России у штаммов не выявлено наличия маркерной для линии 3.ANT замены С—»А в гене YP02499, и, следовательно, штаммы этой линии в очагах России не встречаются. В этих очагах также отсутствуют штаммы линий O.ANT, l.ANT, 1.0R1.

Филогенетический анализ штаммов К реъ<и основного подвида, выделенных в Горно-Алтайском высокогорном очаге в 2012 и 2014 гг. Горно-Алтайский высокогорный очаг чумы является северной частью Сашпогемского природного очага чумы, действующего на территории Монгольской Народной Республики. В 2012 г на территории Республики Алтай в долине реки Уландрык впервые выявлен штамм основного подвида У. релги 1454, полученный от трупа длиннохвостого суслика (Балахонов и др., 2013). В сентябре 2014 г. в ГорноАлтайском высокогорном природном очаге, зарегистрирован первый случай заражения чумой человека.

4?* 4»* 54* 60*

2.АЫТ античный б/в: Забайкальский степной очаг чумы (38).

- 4.А1МТ античный б/в: Тувинский горный очаг чумы (37).

А - 2.МЕО средневековый б/в: Центрально-Кавказский высокогорный (1), Терско-Сунженский низкогорный (2), Дагестанский равнинно-предгорный (3), Прикаспийский Северо-Западный степной (14), Волго-Уральский степной (15), Волго-Уральский песчаный (16) и Прикаспийский песчаный (43) очаги чумы.

/К -2.МЕР0 средневековый б/в: Центрально-Кавказский высокогорный очаг чумы (1).

Рисунок 5 - Филогенетическая принадлежность штаммов У. ре^ги основного подвида из

природных очагов России

После выделения от больного чистой культуры штамма У. рея/л? на основе дифференциальных биохимических признаков (не ферментировал рамнозу и мелибиозу) он был отнесен к основному подвиду возбудителя чумы (Кутырев и др., 2014). Для установления филогенетической принадлежности штаммов У. ре«/« основного подвида, выделенных в этом очаге, мы провели их анализ с помощью разработанного способа на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Исследуемые штаммы давали флуоресцентный сигнал с праймерами и зон-

дами на мишени «тес!24», «§1рО», «70»; и «Тиу» и не давали сигнала на мишени «сшф2 и «рСКР». По комплексу этих признаков штаммы, выделенные к 2012 г. и 2014 г. в ГорноАлтайском высокогорном очаге отнесены к филогенетической линии античного биовара 4.АКТ.

Разработанный способ использован также для филогенетического анализа штаммов У. реъШ из очагов чумы сопредельных с Российской Федерации государств.

Анализ штаммов основного подвида из очагов чумы в Монголии. Многие из расположенных в Монголии очагов находятся в активном состоянии, что является причиной частых случаев заболевания здесь чумой человека. Филогенетическая принадлежность штаммов У. реБНз из очагов Монголии остается малоисследованной. В то же время необходимо иметь полное представление о свойствах циркулирующих здесь штаммов с тем, чтобы вовремя идентифицировать их, определить источник и возможные пути заноса инфекции. Всего исследовано 24 штамма У. реягю основного подвида, выделенных в различных районах Монголии. Только один из исследованных штаммов относился к средневековому биовару (линия 2.МЕО), что говорит об ограниченном распространении штаммов этого биовара в Монголии. Один из исследованных штаммов принадлежал к линии 4.АЫТ (Рисунок 6). Он выделен в Баян-Улегейском аймаке, пограничном с Горно-Алтайским высокогорным очагом чумы в России.

Из 24 штаммов 9 штаммов относились к филогенетической линии 2.АШ\ Они выделены в восточном Хэнтэйском аймаке Монголии. К этому району Монголии с севера примыкает Забайкальский степной очаг, в котором также циркулируют штаммы линии 2.А>ПГ (Рисунок 6). Это означает, что оба очага представляют единую природно-очаговую территорию, где распространены штаммы античного биовара линии 2.АЫТ.

ТувМНСКХЙ СМИ чумы Х"

Забайкальский очаг чумы

Восточный V—^ч/ V

К" К }

| V V Сухэ-Баторскчв /

/ дЗмнсккй Ч Г" ♦ ♦

^^-Хангайс*ий\ ^ а , у >Г Хэнтэйсккй~Д Гоби-Алтдйский ^ ^Срсдксгобкйский I

X г '^//С, .г

2.А>ГГ античный б/в. - З.А>ГГ античный б/в. И- 4.АШ" античный б/в. ▲- 2.МЕВ средневековый б/в.

Рисунок 6 - Филогенетический анализ штаммов У. резШ основного подвида из природных

очагов Монголии

Больше половины изученных штаммов (13 из 24) относились к линии 3.ANT ангишого биовара Эти штаммы выделялись в западных (Убсунурский, Дзабханский) и центральных (Бо-ян-Хонторский, Центральный) аймаках. На "других сопредельных территориях штаммы этой линии выделяются лишь в некоторых районах Китая. Штаммы линии 3.ANT являются эндемичными для очагов Монголии и Китая. Важно отметить, что ни один из изученных штаммов не относился к древней линии античного биовара 0.ANT, что противоречит широко распространенному мнению о том, что древняя сурчиная раса (античный биовар) возбудителя чумы произошла на территории Монголии.

Филогенетическая принадлежность штаммов Y.pestis основного подвида из высокогорных очагов в Киргизии. В Киргизии расположен Тянь-Шаньский высокогорный очаг чумы, включающий в себя три автономных очага - Сарыджазский высокогорный (№ 31), Верх-ненарынский высокогорный (№ 32) и Аксайский высокогорный (№ 33) очаги, а также Алайский высокогорный очаг (№ 35). Все 4 очага относятся к очагам сурочьего типа, в которых циркулируют штаммы У. pestis основного подвида античного биовара Филогенетическая принадлежность штаммов из этих очагов остается малоисследованным, поэтому нами изучено 40 штаммов Y. pestis, в том числе 19 штаммов из Сарыджазского высокогорного, 3 - из Верхненарынского высокогорного, 16 — из Аксайского высокогорного и 2 — из Алайского высокогорного очагов чумы. Все эти штаммы давали флуоресцентный сигнал в ПЦР с праймерами и зондами на ДНК мишени «Med24»,«glpD», «70» и не давали положительного сигнала в ПЦР на мишени «pCKF», «custp» и «Tuv». По комплексу этих признаков они могли относиться либо к филогенетической линии 0.ANT античного биовара, либо к линии 3.ANT этого биовара. Однако по данным проведенного нами секвенирования участка гена YP02499 у всех 40 штаммов отсутствовала маркерная для линии 3.ANT мутации - замена единичного нуклеотида (С—»A) в позиции 139 от начала этого гена. Это доказывает принадлежность исследованных штаммов к линии 0. ANT, что совпадает с данными полногеномного секвенирования штамма Y. pestis 231 (708) из Аксайского высокогорного очага чумы, который был также отнесен к филогенетической линии 0.ANT (Одиноков и др., 2013). Циркуляция штаммов античного биовара линии 0.ANT выявлена только в высокогорных очагах Киргизии и пограничном районе Китая, что позволяет сделать предположение о том, что штаммы античного биовара («сурчиная раса») могли возникнуть именно в этих природных очагах.

Заключение. Таким образом, впервые разработан способ определения филогенетической принадлежности штаммов Y. pestis на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Показано, что этот способ обеспечивает быстрое и надежное установление биоварной и филогенетической принадлежности штаммов возбудителя чумы. С его помощью определена филогенетическая принадлежность штаммов У. pestis основного подвида из при-

родных очагов чумы Российской Федерации и части сопредельных государств. Разработанный способ и данные по филогенетическому анализу могут быть использованы для повышения эффективности проводимого эпидемиологического мониторинга возбудителя чумы и для молекулярной экспертизы вспышек или отдельных случаев заболеваний.

Полученные результаты важны и с фундаментальной точки зрения, поскольку данные по филогенетической принадлежности штаммов У. pestis из природных очагов России и сопредельных стран необходимы для расширения сведений о глобальном генетическом разнообразии возбудителя чумы, а также для установления основных путей формирования современных границ распространения вида Y. pestis.

Выводы

1. Разработанные ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов и выбранные ДНК мишени обеспечивают дифференциацию штаммов Yersinia pestis основного подвида по их принадлежности к античному, средневековому и восточному биоварам.

2. Впервые по данным проведенного полногеномного секвенирования криптической плазмиды pCKF штаммов из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы установлено, что ее последовательность включает гены системы секреции IV типа. Разработан способ дифференциации типичных и атипичных штаммов средневекового биовара с использованием участка pCKF.

3. Разработан способ определения принадлежности штаммов У. pestis к основным филогенетическим линиям античного биовара O.ANT, 1.ANT и 2.ANT методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

4. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность критической плазмиды рТРЗЗ штаммов У. pestis из Тувинского горного очага чумы, и выбрана на ее основе ДНК мишень для детекции в ПЦР штаммов филогенетической линии 4.ANT. Установлено, что плаз-мида рТРЗЗ является геномом фага, в составе которого присутствуют гены двухкомпонентной системы белков токсин-антитоксин YoeB / YefM.

5. Разработан способ детекции штаммов античного биовара линии 3.ANT на основе выявления маркерной замены единичного нуклеотида С—>А в гене YP02499 методом фрагментно-го секвенирования.

6. Установлено, что в очагах России циркулируют штаммы основного подвида филогенетических линий 2.MED, 2.MED0, 2.ANT и 4.ANT. В природных очагах Монголии распространены штаммы линий 2.ANT, 3.ANT, встречаются штаммы линий 4.ANT и 2.MED. В высокогорных очагах Киргизии циркулируют штаммы древней филогенетической линии 0.ANT.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Оглодин, Е.Г. Определение геновариантов штаммов Yersinia pestis основного подвида методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов / Е.Г. Оглодин, Г.Н. Одино-ков, К.А. Никифоров, Л.М. Куклева, Г.А. Ерошенко // Проблемы особо опасных инфекций. -2014,- Вып.4. - С. 52-55.

2. Кутырев, В.В. Заболевание человека чумой в Горно-Алтайском высокогорном природном очаге в 2014 г. Сообщение 2. Особенности лабораторной диагностики и молекулярно-генетическая характеристика выделенных штаммов / В.В. Кутырев, АЛО. Попова, Е.Б. Ежлова, Ю.В. Демина, Н.Д. Пакскина, И.Н. Шарова, А.И. Мищенко, E.H. Рождественский, Г.Х. Базарова, Е. П. Михайлов, Г.А. Ерошенко, ЯМ. Краснов, Л.М. Куклева, A.B. Черкасов, Е.Г. Оглодин,

B.Е. Куклев, Г.Н. Одинокое, С.А. Щербакова, С.В. Балахонов, М.В. Афанасьев, С.А. Витязева, М.Ю. Шестопалов, В.Т. Климов // Проблемы особо опасных иифекций. - 2014. - Вып.4. -

C.43-51.

3. Куклева, Л.М. Анализ разнообразия и определение геновариантов штаммов возбудителя чумы из очагов Монголии / Л.М. Куклева, Н.Ю. Шавина, Г.Н. Одиноков, Е.Г. Оглодин, Н.Ю. Носов, H.A. Виноградова, Н.П. Гусева, Г.А. Ерошенко, В.В. Кутырев // Генетика. - 2015. - Т.51. -С. 298-305.

Публикации в сборниках научных и научно-практических конференций:

5. Оглодин, Е.Г. Детекция и дифференциация штаммов Yersinia pestis средневекового биовара с помощью гибридизационно-флуоресцентного метода в режиме реального времени / Е.Г. Оглодин, К.А Никифоров, Г.Н. Одиноков, Л.М. Куклева, Г.А. Ерошенко, В.В. Кутырев // Материалы VIII научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014», Москва, 18-20 марта 2014. - С. 448.

6. Оглодин, Е.Г. Молекулярное типирование штаммов возбудителя чумы методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов / Е.Г. Оглодин, Г.Н. Одиноков, К-А. Никифоров, Г.А. Ерошенко // Материалы XI Всероссийской научно-практической конференции на тему: «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении», Киров, 22-23 мая 2014. — С. 96.

7. Оглодин, Е.Г. Структурный анализ криптической плазмиды и ПЦР детекция содержащих ее штаммов Yersinia pestis из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы. / Е.Г. Оглодин, A.B. Черкасов, Л.А. Новичкова, Г.А. Ерошенко // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины», Ставрополь, 22-24 октября 2014. -С. 95-96.

8. Оглодин, Е.Г. Филогенетическая принадлежность штаммов Yersinia pestis из очагов России и сопредельных стран / Е.Г. Оглодин, К.А. Никифоров, Г.А. Ерошенко // Материалы VII ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням, Москва, 30 марта - 1 апреля 2015г. -С. 68.

Подписано к печати 22.04.2015 Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46