Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пилеобразование у микроорганизмов рода YERSINIAE

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Пилеобразование у микроорганизмов рода YERSINIAE"

р Г Б ОД

с /

I. V;! •, .

На правах рукописи

ВОДОПЬЯНОВ Сергей Олегович

ПИЛЕОБРАЭОВАНИЕ У МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА УЕК31Ы1АЕ. /у.

Оа 00.07. -микробиология

Автореферат диссертации на соискание'ученой степени доктора медицинских наук.

г.Ростов-на-Дону 1995 г.

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону государственном научно-исследобательском противочумном институте

Научный консультант : доктор медицинских наук,

профессор МИШЛНЬКИН Б. Е

Официальные опоненты : доктор медицинских наук, профессор Васильева Л. И. доктор медицинских наук, профессор Макаровская да доктор медицинских наук Соболева С. Я

Ведущая органишцил : Волгоградский научнее

исследовательский противочумный институт

• г

Защита состоится "24 " ноября 1995 г. в "10 "часов на заседании диссертационного совета Д 084.53.01. при Ростовском государственном медицинском университете (344022,г. Ростов-на-Дону, пер. Наяичеванский,29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан "24 " октября 1995 г.

Ученый секретарь . какорганов

диссертационного совета

к

ВВЕДЕНИЯ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОЕЛйШ. Агрессивность чумного микроба издавна привлекла вникание исследователей, сломившихся понять Гфичшш.сбусловливаюшие высокую вирулентность возбудителя (И, В.Лсм'_раликий 196Г>,1993,Г. П. Руднев 1933,1?.!? ВгиЬаскег 1У72,1985,Т.ВиШг 1983).В начале 60-х годов,суммировав результаты многочисленных исследований по сравнительному изучению свойств разлитых штаммов возбудителя чумы Т. V. Вигточз (1963) сформулировал положение о комплексном характере вирулентности,заключающееся в том,что вирулентные штаммы чумного микроба должны обладать набором определенных признаков, обозначенных как детерминанты вирулентности. В последующем это положение было подвергнуто всесторонней экспериментальной проверке,в ходе которой было установлено, ото эти признаки недостаточно полно отражают такое свойство как ьируле.чт-ность. Например,были выделены штаммы возбудителя чумы не укладывающиеся в известную формулу вирулентности (11 Я. Анискмов и.др., 1976, Е В. Нутырев, 19У2, Т. V. Виг г оиз 1063).

Логическим завершением усилий,направленных на углубленное изучение детерминант вирулентности.явилось положение об иятугративном характере вирулентности чумного микроба (Б. Е Кишенькип 1967). Суть концепции заклктетоя в предположении автора о существовании у шлпоцоаних штаммов возбудителя чумы как детерминант вирулет'ности. оказывающих прямое деструктивнее действие на чувствительны* мишеии и тканях восприимчивого ханииа.так и марке1лв пц-гигишоети - ф&к-гогев.евягактж с вирулентностью, но лцик-ннхх яшой деструктивной Функция, Экспрессия ука^ншх 4йп"'огов сашси г

от функционирования аппарата управления,обеспечивающего их ■ координированную экспрессию в пространстве и во вымени в ответ на соответствующие внешние стимулы. Концепция указывает направление поиска и изучения новых детермйианг и макеров вирулентности.

Развитию большинства инфекционных заболеваний предшествует этап адгезии возбудителя на тканях восприимчивого хозяина,в результате чего из немногих инфицирующих макрооргаиизм бактерий образуется значительное число потомков.доетагочное для проявления факторов патогеиности и развития инфекционного процесса (R.J.Gibbons 1977,h.W.Smith 1977).Адгезивные свойства бактерий обусловлены наличием на поверхности орга-нелл,обозначенных как пили или фимбрии (Ю. В. Езепчук 1985, j. D. Arbuthrtott 1979.Е. II. Beachey 1981, J- W„ Jones 1983). Очень редко функцию адгезинов выполняют макромолекулы неидентичные нилям (М. В. Далин, Н. Г. $мп! 1985,Ю. В. Езепчук 1385, B.B.Finlay 1989). Пили (фимбрии) обнаружены у большинства грамотрицатель-них и у многих гра?,(положительных бактерий (K1R Езепчук 1985). Роль пклей, как факторов .способствующих развитию инфекционных заболеваний,установлена для гонококков,протея,кишечной палочки, клебсиелл, коринебакторий .сальмонелл, шигелл, холерного вибриона,геликобактеров,псевдомонад (М.аДалин,ЕГ.Фиш 1985/ KXR Езепчук 19&5J.D. Arbutnnott 1979,E.H.Beachey 1981, J.J.Mokalanos 1992,0.A.Mims 1983, J.W.Jones 1983).Этот список продолжает расширяться.

' -ь-

Вопросы адгезии у представителей рода Yersinia и,особенно, у воэудителя чумы изучены крайне недостаточно.

Имеются отдельные сообщения о способности возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза продуцировать несколько типов нилей.но их наличие не коррелировало с адгезией к клеткам эукарнотов (А. Farns 1983). В тоже время у этих возбудителей обнаружены специфические макромолекулы, построенные из белка Уор 1 .весьма перспективные в плане выполне -пия адгезивных функций (G.Kapperud 1985).

Вопросы адгезии у возбудителя чу»,ы, опосредованной наличием специализированных органелл,практически не изучены. По мнению А. И. Дятлова (1986) "чумной микроб не имеет приспособ лений для адгезии к клеточным мембранам-хозяина". Другие авторы при изучении адгезии на первый план выдвигают энергию электростатического и гидрофобного взаимодействия (А. И. Дятлов 1991). При специальном изучении клеток чумного микроба методом электронной микроскопии пилеподобных структур не выявлено (ILA. Черепанов 1991).

Таким образом,на основании имеющихся данных невозможно судить о наличии у возбудителя чумы и других иерсиний специ -авизированного аппарата адгезии ,а тем более о роли феномена адгезии в патогенезе чумной инфекции.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Заключалась в обнаружении и изучении роли и значения феномена пилеобранования у возбудителя чумы и других иерсиний.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Поставленная цель была достигнута решением следующих задач : . ' ■ ■ 1. Изучения принципиальной возможности пилеобразования клетками чумного микроба на модели гетерологичных пилей антигена К 88 кишечной палочки. . .; . .

Поиска и выявления собствешшых пилей и нилеподобных структур возбудителя чумы.

3. Селекции итамшв-продуцентов,разработки способов получения гомогенньи и высокоактивных препаратов пилей адгезии.

4. Разработки способов выявления различных форм пилей и опре- ■ деления степени их нативности. ;

Б. Изучения закономерностей пилеобразования,идентификации факторов.пришмащих участие в экспрессии шлей. 6.0цешш возможности экспрессии пилей адгезии в условиях макроорганизма. ..

7. Изучения биологических свойств пилей,их патогенетического действия и возможной роли в экспрессии вирулентности.

8. Определения места пилей адгезии чумного микроба в ряду известных антигенов чумного микроба.' • •

9. Изучения распространения феномена пилеобразования у представителей рода Yersinia ;. •

10. Изучения рецепторов дня связывания -пилей адгезии. ' НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ ; / "S '

1. Установлена способность, возбудителя чумы продуцировать как пили адгезии,так и новый тип поверхностных структур -

курлинов. " ;< : ■ ; v - - ' - .

2. Установлена тождестве>шость шлей адгезии одному из

' антигенов.чумного, микроба,описанному под названием рН 6,4,1.

Установлено, что экспрессия'пилей в клетках возбудите-тиы и псевдотуберкулеза скоординировано регулируется ютвием трех внешних сигналов : температуры культивиро-37-43° .низкого рН и присутствием катионов. Показано,что экспрессия пилей адгезии является частью лы стрессового ответа возбуде:теля чумы. Показано, что пили адгезии являются высокоактивным лек, способным связываться со многими гликопротеинами : юзидом, муцином, фибронектином, коллагеном. Показана возможность экспрессии пилей •адгезии при кон-шшлированных клеток чумного микроба с макрофагами,при шил возбудителя в мочу и при нахождении в подкожно именованных диффузионных камерах. Установлена связь между функциональной активностью пи-хгезйи я степенью их поликерности (нативности). Изучение биологической активности пилей адгевии на мых моделях показало влияние этого поверхностного ан-1 возбудителя чумы на все этапы инфекционного процесса. Изучено распространение феномена пилеобразования у ;авителей рода Уегэша,предложена схема классификации иерсиний.

¡.Установлена возможная биологическая роль пилей 1 се-1 воэбудителя кишечного иерсиниога.как способствующих 1нию микроорганизма во внешней среде. . Селекционировал пгга.ш возбудителя чумы,дефектный по сции натииных.ко не субъединичных форм пилей адгевии.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. Показано, что в качестве индугагора факторов виру.' ности у во&будителя чумы выступает сигнал "низкого рР лизуемый через изменение цитоплазматического рН.

2. Предложена гипотетическая схема реализации сигк "низкого рН" в ответ на изменение трансд??мбранного грз протонов, включающая участие системы циклических нукл< и ДШ-вависимой РНК-полимеразы.

3. Про ддожна моде ль, повышения бактерицидной актив хлорактивних соединений при низком рН Сформулирована за, показывающая биологический смысл закисления фагсш макрофагов.

4. Пределен оригинальный механизм участия пи лей ад в антигенной мимикрии возбудителя и развитии аутоимму

процессов.

Б. Установлена возмогшая роль пилей как фактора км ции при инфицировании возбудителем мочевьшодящих путе!

6. Показано существование системы стрессового ответе возбудителя чумы,в которой поверхностные антигены пиле: гезии и фракции 1 являются стрессовыми белками.

7. Пили адгезии возбудителя чумы можно рассматрпват: ноеый фактор вирулентности.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

1. Разработан способ обнаружения пилей у микрооргаю рода Уегз1гаа (Авт.свид. N 1074204).

2. Селекционировано четыре штамма-продуцента пилей : дай,защищенных авторскими свидетельствами ( NN 1115' 1103555,1211921,1632034).

3. Разработан способ получения гомологичных апилирован-ных юриантов из шта'(мов-продуцентов (Авт.спид. N 1302699), чго позволяет пользуясь неелсгашм методом абсорбции,сравнительно легко получать специфические агглютинирующие сыворотки.

4 Разработан простой и эффективный способ получения высокоактивного лсктина возбудителя чуш, использование которого расширяет возможности экспериментаторов.

5. Разработан способ идентификации возбудителя псевдотуберкулеза (Авт. свид. N 1193170 ). -

6. Получена рекомбинантная плазмидная ДНК pRD 65, обладающая удобным селективным маркером и способная отметать или существенно снижать взаимодействие бактериальных клеток с фагоцитами (Авт.сйид. N 1652627).

• 7. Разработанная теоретическая модель повышения бактерицидной активности хлорактивных соединений при imatoM рН' обеспечивает основу для более широкого использования продук тов здеотролиза (анолит) в целях обеззараживания и дезинфекции. .

. 8. Разработанный способ обнаружения ' фибронектииа с ira -мощью ИФА может быть использован для выявления итого вчж-лого lueTQ'Qroro компонента в биологических жидкостях.

9. Подокна иммобилииированная форма нилй адгезии (заявка H 630G2425 or 21.06.93. ), кото/ум может быть иепольишана для идентификации рецгпто!>ов пилей адгееии.

Jia основании полученных результатов разработаны : •

"Методические рекомендации.Обнаружение пилей адгезии у возбудителей чумы и псевдагуберкулеза",1Ьсква.1985

. "Методические рекомендации .Способ быстрой дифферента-, ции Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica".

ОСШВННВ НАУЧНЫЕ ПСШЖШШ.МШШсЕ RA ЗАЩИТУ.

1. Возбудитель чумы способен к экспрессии пидей адгезии и поверхностных структур,подобных ФН-связывающим курлинзм ки-ше'шой палочки. ..

2. Возбудитель ггревдотуберкулеза продуцирует пили адгезии, идентичные по свойствам пмлям возбудителя чумы. У некоторых штаммов возбудителя кишечного иерсинкоза имеется два серологически отличных типа пилей.

а Экспрессия пилей адгезии скоординировано регулируется со'юуакнш гозДей'г-свиеы на клетки чумного микроба трех факторов : повышенной температуры, низкого pH и наличием в среде '.культивирования катионов и реализуется через.изменение величины pH цитошазмы возбудителя. \ ..■••'...

' 4L Экспрессия шглей адгезии у клеток возбудителя чумы ре- ; I истрируется в усзоьиях восприимчивого макроорганизма при . контакт*? с ш1ф0&«гтш,лспадании возбудителя в мочу и в яод-- кош> имялсшгкрзваннь«. диффузионных камерах. . '.

' 5. Шли адгезии ъиобудителя чумы являются высокоактивным дектином,способным фиксироваться на ряде макромолекул макро-оргашизма : фибгюнектиноиюллагене.мущ.не.г^и'лиозиде.кото-Püe обладапг.нгатралксуюцюй активностью.

. Б. Пили одгсяии в нативной полимерной форме являются вы-ссг/катги.чиы» биаяоги';.>г>к:ш ¿ешрствсм.сблздаищш споснхшзтыо. етикулиговать взхъат пилировтшых клеток,оказывать янрсшои-

ное цитотоксическоо действие,угнетать процесс фагоцитоза. способствуя его незавершенности,вызывать внраяениое мято-генное и кожнореактиигае действие. Совокупность выявленных свойств пилей объясняет механизм их функционирования в качестве фактора вирулентности.

7. Восбудитель чуыы способен к индукции стрессового ответа,при этом пили адгезии и капсулышй антиген фракции 1 являются стрессовыми белками возбудителя.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на :

-Всесоюзной ожоле-секинаре молодых ученых противочумных учереддений ИЗ СССР (Саратов, 1982).

-Всесоюзной конференции "Молекулярная биология,гекетака и иммунология возбудителей особо опасных инфекцИй"( Ростов , 1984).

-Рабочем совещании молодых ученых и специалистов : "Эпидемиология, молекулярная биология .генетика и и иммунология возбудителя чумы" (Саратов,1986).

-Всесоюзном симпозиуме "Ионный транспорт и регуляция функций клетки. "(Ленинград. 1900).

'.' -Российской научной конференции "Холера. Вопросы эпидемиологии, микробиологии и лабораторной диагностики"(РосгсБ.1993)

-Научных конференциях Ростовского отделения Всесоюзного микробиологического общества. .

-Научных конференциях Ростовского научно-исследовательского противочумного института.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Основное содержание дис-сертациошюй работы отражено в 55 опубликованных работах,а также в 2 отчетах по научно-исследовательским разработкам.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Монография изложена на 244 страницах машинописного текста,отражавших обсуждение проблемы с использованием собственных материалов и специальной литературы, заключения и выводов,содержит 39 таблиц и 35 рисунков. Библиографий представлена 95 отечественными и 155 8а-рубелными работами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использовано 420 штаммов Yersinia pestls, 184 штамма Y. pseudotuberculosis и 53 штамма Y.enterocolitica находящихся в музеях живых культур РПЧИ,Элистинской,Туркменской и Араломорской ПЧС.

Определение машшозорезистентной гемагглютинирукйцей активности (МРГА) проводили на стекле,используя либо нативкые аритроциты.либо форшлиниокрованяые эритроциты барана (Ф35).

■ Изоэдектрическое фокусироваше, хроматографию,электрофорез и иммуноблоттинг проводили,используя комплект приборов и оборудования фирмы "LKB" (Швеция).ультрацентрифугироваьие 4 осуществляли на ультрацентрифуге "Beet man L5-65B" (США). Величину радиоактивности и хемилюмшюеценции определяли ка счетчике 'Шгк 11 " (США),электронную микроскопию проводили на микроскопе "JEM 100В" (Япония). Вое измерительные приборы прошли метрологический контроль и были признаны соответствующими госстандарту. .

С'одержаиие циклических нуклеотидов определяли с помощью соответствующих наборов фирмы "АтегзЬатЛ Англия).

Препараты нейраминидазы чумного и холерного ыикг'обов, претеазк холерного вибриона были любезно предоставлены Е Я йиианкк.ДНК-зависимая РШ-полимераза была выделена и любезно предоставлена И. И. Куренной.

Величину цитсыазыатичег-кого рН чумного микроба определяли методом равновесного распределения проникающего аниона бензойной кислоты (Ю. А. Николаев с соавт. ,1987 .Н.ЯоПепЬегц 1979) и титриметрическим методом (МХ-СаскИск е1 а1. ,1986).

Электрофорез растворов хлористого натрия проводили используя платиновые электроды при напряженности электрического поля 13 в/см. Содержание активного хлора игре деля ли методом иодометрического титрования в кислой среде.

Для получения специфических сывороток кроликов калифорнийской породы многократно иммунизировали препаратами очищенных антигенов в смеси с равным объемом полного адъшаьта Фрейндэ. Из полученных сывороток -выделяли Фракцию иммуноглобулинов, кагору» использовали для получения иммуноглобулина» -го зритроцитарного диагностику).® и иммуноферментнсгэ ксю>ю-гата .меченного пероксидаэой хрена. .

Диффузионные камеры готовили с использованием нитроцел-лю-тозннх мембран с диамет$ш пор 0,45 мкм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБОУВДЕШ1Е

2. ПОИОК ¡1 ОБНАРУЖЕНИЕ 1ЫЛЕЙ АДГЕЗИИ.

Учитывая отсутствие сведений о способности возбудителя чуш экспрессировать пили (фимбршО.мы предприняли изучение принципиальной возможности экспрессии пилей клетками чумного микроба на модели пилей антигена К 88 кишечной палочки.

Наличие удобного селективного маркера (утилизация триса-харида рафшю^ы) на конъюгативной плазмиде, детерминирующей образование пилей К 88,способствовало быстрому получению траксконъюгантов чумного микроба. Все трансксьтьюганть! приобрели способность агглютинироваться в специфической сыворотке к пилям К 88 и дополнительные адгезивные свойства о чем суди.«! по появлении МРГА активности и по повышению эффективности адгезии к "слизистой тонкого кишечника крольчат. Эти - -данные-свидетельствовали,что клетки возбудителя чумы способны продуцировать гегерологичные пили К 88 кишечной палочки, полностью сохраняющие сшю биологическую активность..

При изучении фагоцитарной активности исходного шташа чумного микроба и его К 88+ варианта были полуиены косвенные данные,сБидстельсгйу^дие о существовании у возбудителя ч>*мн собственного темпсратурояувствительного кюханизма,обуславливающего его поглощение макрофагами, и некоторой конкуренции последнего о гетерологичнь&ш пиляыи К 88.. ' : :

■ Поэтому мы предприняли углубленное исследование коллекции штаммов чумного микроба с цель» выявления адгезивных свойств. В ходе изучения типичные штамш выращивали на самых различных пит-угельних средах при различных условиях культивирования.

Возможкьв адгезивные свойства игучалн в реа:щии геыаггдоти-нации с 4 типами нативних эритроцитов.

Было сбнарьтаю.чго глотки чумного микроба ЕВ 75 и Огтен после культивировния на агаре L или Т при о?°С давали МРГА со всеми исследованными видами эритроцитов, включая формзли-низированные. При электронно-микроскопическом изучении клеток установлено.что появление МРГА активности обусловлено наличием длинных тонких (диаметр 10-15 :ш) филаментосных образований, густо покрывающих поверхность клетки. Эти структуры были обозначены нами как пили адгезии. По данным электронной микроскопии пили адгезии характеризовались непрочной связью с поверхностью клетки и сравнительно легко отделялись от бактерий. Все 420 штаммов чумного микроба образовывали пили адгезии в соответствую^« условиях.

Пили адгезии были не единственной филаментозной структурой на поверхности клеток возбудителя чумы. При детальном электронно-микроскопическом исследовании! удалось визуализировать ¡сак в межклеточном веществе,так и на поверхности клеток более тонкие (диаметр 2-3 нм),гибкие фибриллы,подобные курлинам кишечной палочки. КурлиноподоОнке структуры чумного микроба были склонны к агрегации и морфологически четко отличались от более толстых и ригидных пилей адгезии. Интересно отметить, что одновременной продукции пилей адгезии и курли-ноподобных структур ^регистрировать не удалось. Как пили адгезии, так и кэдушноподснЗные. структуры чумного микроба синтезировались и бесплазмидными штаммами чумного микроба, чго свидетельствовало об хромооомальной природе детерминированности указанных структур. В отличие от пилей адгезии:,синтези-

руемых клетками чумного микроба только при зт'на специальных питательных средах .продукцию курлинов регистрировали как при .так и при 28" .

3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ШЛЕЙ АДГЕЗИИ. Следующем этапом работы была разработка способа выделения пилей адгезии возбудителя чумы з гомогенном состоянии. Дня этой цели из популяции клеток чумного микроба Оттен нами был селекционирован штамм-продуцент 556-Р .характеризовавшийся хорошей скоростью роста при повышенной температуре, более высоким уровнем продукции пилей адгезии, ¡игамм ССО-Р не синтезировал поверхностью антигены Ф 1 "мышиный" токсин, что собственно облегчило дольнейшую препаративную работу.

Учитывая установленный нами фага непрочной связи пилей адгезии с поверхностью клетки,грубый препарат получали мягкой обработкой суспензии МРГДь бактерий в гомогенизаторе. Подобранный режим не приводил не разрушению бактериальных клеток, что позволило свести к минимуму количество балластных примесей. Присутствие пилей на всех этапах очистки контролировали методом МРГА с ®ЭБ. ' ..'"•'

■Для дальнейшей очистки мы воспользовались рядом традиционных приемов : дифференциальным ультрацентрифугированием,электрофокусированием на амфолинах, кислотным переосажде- 1> нием, гель-фильтрацией на Сефарозо С1.-6В в присутствии б М мочевины. Однако указанные' методы не обеспечивали получение гомогенного препарата пилей, были весьма трудоемки и не давали достаточного выхода препарата.

Учитывая,что пилеподобные факторы колонизации характеризуются высокой пздрофобкостью.мч попытались воспользоваться приёмом осаждения сульфатом аммония. Обнаружено полное осаж-

дение шлей в диапазоне 15-25 % насыщения. В подобранш« нами условиях эксперимента трех последовательных циклов осаждения сульфатом аммония миазапось достаточно для получения гомогенного препарата пилей адгезии.

Разработка способа получения гомогенного препарата пи-лей ндгеэии возбудителя чуш в препаративном количестве позволила приступить к анализу их свойств. Шли адгезии возбудителя чумы были построены из белковых оубъедиииц массой 15 килодальтон,имели иэоионную точку при 4,65 - 4,70. МРГА активность палей по зависела ни от температуры, ни от величины рН в физиологических пределах,однако полностью ингибирова-лась в присутствии 5 мМ ЭДТА.но не ЭГТА или 2'2-дкнириди-да, что мохет отзывать на наличие в активном центре ионов магния или марганца. .

Для проявления МРГА активности пилей адгезии было необходимо наличие одновалентных катионов (50 мМ натрия или 150 мМ ¡салил). Учитывая, что каглоны ¡натрия, в основном содержатся в межклеточной среде макроорганизма,а для катионов калия ха-р&:етрна внутриклеточная локализация (В.ИСкулачевДЭбв), факт предпочтительности катионов натрия но сравнению с кати-ош,ш калия может указывать на внеклеточную локализацию '»точки приложения" активности пилей адгезии. Предварительная десиаливация 1<ЭЕ нейраминидазой возбудителя чумы в 2-4 раза увеличивала эффгктшостъ адгезии, что uomjt взывать на синергизм действия указанных компонентов возбудителя чумы г условиях макрсрганивма.

В составе препарата долей адгезии осшруж/На примесь фосфатов, этридеммх лри длительном доима* без утраты jflTA ак-

.тивности и примесь углеводов.

Таким образом, по основным изученным физико-химическим -свойствам,за исключением необычно широкого спектра агглютинируемых эритроцитов, пили адгезии возбудителя чумы подобны пилеподобным Факторам колонизации (Ю. В.Езепчук,1985). .

Полученную при иммунизации кроликов гомогенным препара- • Том пилей адгезии сыворотку использовали для создания имму-ноглобуллнового эритроцитарного и иммунофермснтного диагнос-тикумов.РШ'А и ИФА характеризовались высокой чувствитель- • ностью и специфичностью,выявляя как нативные, пили адгезии, : •так и субъединичные формы,утрачивающие МРГА активность. Это' наблюдение позволило разработать способ оценки степени поли-меряости (нативности) пилей по уровню утраты МРГА активности при сохранении активности в ИФА или РИГА. ,

Располагая методами определения функциональной активности и структурной нативности пилей адгезии мы предприняли , -изучение 'стабильности этого антигена к воздействию фиаико-_ химических -факторов. Установлено, что пили адгезии являются внеокостабильной макромолекулой, сохраняющей серологическую активность при длительном кипячении .обработке ультразвуком, протеолитивескими ферментами.^лительюм хранении в вод-• нш растюрах. Продукция пилей всеми штаммами,включая бес- - . плазмидные.в сочетании с серологической стабильностью,может указывать на перспективность этого антигена чумного микроба в диагностическом плане. "_. ...''.•'

Сопоставление изученных свойств пилей адгезии с литера- V; турными данными позволило нам предположить тождествешость . (1 илий одному т известных антигенов чумного микроба,описан-¡шм. тремя независимыми группами авторов под обовначднием ан-

тиген рН 6 (Ben-Efraim S. ,1961),ï (Lawtcn V.D. ,1960) или 4 (Crurnpton M. J. .1956). Для окончательного ответа на этот вопрос нами- была проведена совместная работа с доктором L.'E. Lidler (США) .клонировавшем и сек.ьенировавшим гены биосинтеза антигена ри 6. Результаты эксперимента показали полное тождество пилей адгезии и антигена рН б (Lidler L. £., Tall B.D. ,1993).

' 4. ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ШЛЕЯ АДГЕЗИИ.

Следующий этап работы был направлен на изучение закономерности экспрессии пилей адгезии в клет!сах чумного мккрэ-ба.Было установлено, что пилеобразование у (слеток чу^юго микроба регистрируется при воздействии на бактериальную клетку трех внеаних сигналов : температуры кульхиьирставп не ниже 37°С,"яркого рН (5,0-5,5) и наличия в составе окру- , дающей среды ютиопов. Резкое стимулирование пилеобразовззшя было обнаружено при введении в состав плотной питательной среды ЭДТА (в этом случае образование пилей регистрировали дазке при рН 6,0-,62).На основании полученных дашгнх нами Сули разработаны простые и. эффективные питательные среды, обеспечивающие быстрое и надежное выявление пилей адгезии.

, Образовать пилей адгезии приюдило к существеном;/ изменению спектра секретируемых белков и белков наружных мембран возбудителя чумы. При этом в составе белков наружных менбрап методом кммуноблоттинга идентифицирован пидин.что позволяет .рассмотривать субъединицу пилей адгезии в качестве б-j^ita наружных мембран. Это вполне согласуется с высокой гидрофоб-нсстью пилина.

При изучении динамики синтеза пилей адгезии на модели апилированных клеток ЕВ 76 чумного микроба установлено появление пилина уз® через 90 минут после воздействия комплекса соответствующих внешних факторов. Через 4 часа инкубации зарегистрировано наличие высокополимерных нклеи, обладающих ' МРГА активностью. При этом количество пилина существенно превышало количество синтезируемого в этих условиях белка кап-сулыюго антигена фракции 1 чумкого микроба. Методом иммуно-бдаттинга установлено,что незначительная часть клеточного пилина характеризуется меньшей подвижностью в ЙСН~ПААГ,это указывало на первоначальный синтез пилей в виде более крупного предшественника, который подвергается процессированию. Позднее этот феномен был продемонстрирован (ЫгхЦег Ь.Е., 1993).

При изучении соотношения относительного содержания различных форм пилей в клетках чумного микроба было установлено, что лишь около 20 % тотального пилина находится в составе вассконодимерцых нативных пи лей, обладающих МРГА активностью. Подавляющее большинство пилина находится в виде субьединичных форм.

Учитывая существенную роль,которую играет система стрессового ответа в выживании микроорганизмов в неблагоприятных1* условиях, в ток числе и в условиях макроорганизма (КаиШпап

Б. И. Е. ,1990) мы предприняли изучение роли этой системы при

о

воздействии на бактериальную клетку сигнала "37 -низкий рН". Путем введения в белки чумного микроба радиоактивной метки установлено,что при вакислении питательной среды возбудитель индуцирует типичный стрессовый ответ, проявляющийся как в об-

¡а.ем иш«ении синтеза бел да, так м в увеличении продукции ряда стрессовых белков. Кроме того,об! аружепо.что оптимальная температура для экспрессии пилеобразования в метках штаммов чумного микроба ЕВ 76 и Оттея составляет 43°С.что совпадает с температурным оптимумом ицдукцки стрессового ответа.

Клетки возбудителя чумы,находящиеся в условиях комбинированного стресса,вызванного закислением питательной среды -при повышенной температуре.находились в состоянии стаза и активно продуцировали поверхностные антигены пилей адгезии и фракции 1. Помимо пилей адгезии и антигена фракции 1 у чумного микроба идентифицировано по-меньшей мере 8 стрессовых бешзв.ири этом полипептиды с массой 65 и то ки-лодальтон.очевидко,являются аналогами стрессовых белков Бго ЕЬ и Опа К кишечной палочки (ИвкЯтагЬ КС. ,Уоп Воде1еп ад. ,2987).В последнее время к такой трактовке роли стрессового ответа у возбудителя чумы склоняются и другие исследователи ОМНеИ !?.Х .ВгиЬакег !?.Я. ,1993).

При изучении механизма,обеспечивающего экспрессию пилеобразования в клетках чумного микроба,нами установлен факт стабильного й длительного снижения величины рН цитоплазмы с 7,8 (интактные клетки) до величины 5,8-6,0. Путем культивиро-ваша возбудителя-на питательных средах с различным рН в присутствии набора протокофоров и проникающих анионов слабых кислот, установлено»что минимальное переносимое клетками значение рН цитопллнмы составляет 5,8 единицы рН.

Снижение величины рН цитоплазмы,связанное с продукцией пилей адгезии .сопровождалось повышением внутриклеточной

концентрации цАМФ и цГШ> в клетках чумного микроба,причем кривая, описывающая содержание каждого из циклических нуклео: тидов,имела два характерных, пика.-. ■ " ■'•••..-.

Для изучения возможной взаимосвязи между экспрессией пи-' леобразования и активностью генов фосфотрансферазной системы углеводов,был проакализироЕан набор мутантов,несущих повреждения в генах ФТС. Установлено,что в ответ на закисдение питательной среды при повышенной температуре,все мутантные штаммы стабильно синтезировали пили адгезии. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии прямой связи между активностью генов ФТС и экспрессией нилей адгезии в клетках чумного микроба.

Одним из путей реализации срочных реакций клетки на изменение внешних условий является явление фосфорилирования-дефоефорилирования белков, недавно ьыяпленное в клетках чумного микроба (Б. ЕЕшанькин,Л.А. .Шевченко, 1990).При изучении картииы фсефорллирования белков нами установлено,что в ответ на воздействие вакисления фосфорилированию подвергался белок с массой около 70 килодальтон, идентифицированный нами как возможный аналог стрессового белка Опа К кишечной палоч-ки.При нейтральном рН этот протеин бил дефосфоршшрован. Полученные данные свидетельствуют о вовлеченности феномена фосфорилироэажл белков'в реализацию ответа [теток, приводящего к экспресии феномена пилеобразования.

Важным кошюнентом тонкого механизма регуляции уровня ькспрессии различных- генов является ДЖ-вависимая РНК-полимероза. Имеются экспериментальные данные о существовании ряда различий между образцами фермента, выделенными из клеток

• возбудителя чумы-выыращенных при различной температуре

,Ыи.-Куренная,аКМишанькин, 1985,1988),что позволило предположить участие этого энзима в реализации 1слеточного ответа (Б.ЕИитаньгаш, 1987).Используя образцы РШ-полимеразы из клеток штамма £В 76,нами было установлено угнетение активности -.ьгрмента при снижении рН. среды инкубации с 7,9 до 6,0,которое имитировало динамику изменения показателя рН цитоплазмы в ходе индукции пилеобразования. При этом,степень ингибиции транскрипции была обусловлена типом используемой матрицы. Так,наибольшей "рН-резистентноетью" обладала гомоло-

• гичная ДНК из клеток чумного микроба. Синтетическая матрица поли с)Т обеспечивала более эффективную транскрипцию по сравнению с матрицей поли ¿А. Эти данные, на наш взгляд,позволяют предположить существование особых "рН-резистентных" промоторов в хромосоме возбудителя чумы у генов, транскрибируемых при ответе на закиеление-цитоплазмы.

Представленные данные позволили в общих чертах представить гипотетическую схему реализации экеп^есии пилеобразования в клетках, чумного микроба. В ответ на закисление внешней среда происходит быстрое снижение величины рЯ цитоплазмы, которое сопровождается активацией систем '.поддержания го-меостаза рН (прсгон-транслоцирующцх АТФ- аз и .возложно,систем специа,чизироЕанных"цитоплазм.нтических буф^оь).В результате их функционирования величина рН-¡штоплл'-мы стабилизируется и подаерхигается на более низком, но все.- ещр пер-миссивном для 'клетки уровне. Стабильное закиеление цитопл-ш-ш, в свою очередь, модифицирует ряд важных клеточных функций изменяет текучесть биологически к мембран, дкОДдот ;иро • вано изменяет активность клеточки/ чнгичпв.ппк'гза-? содержа-

иие циклических нумеотидов, изменяет способность РНК-полиме-оаеы к узнавании промоторов. Сочетание указанных Факторов включает механизм комбинированного стрессового ответа и продукцию шлей адгезии.

Разработанная нами теория о ключевом значении величины -рН цитоплазмы в реализации ответа. клетки на воздействие внешних факторов позволяет предложить простое объяснение известного факта повнаения Зактерацидности зслорактивньи соединений при низком рН. Этот эффект ,по нашему мнению, обусловлен тем, что молекулы хлорноватистой кислоты в слабокислой среде находятся ь виде нротонированной проникающей формы,способной ' активно проникать внутрь клетки по трансмембранному градиенту прогонов. В результате этого процесса концентрация гипо-хлорита а цитоплазме кгает на порядок превышать его концентрацию во Енеаней преде. Иными словами,бактериальная клетка активно "закачиве?" смертельный для себя дезинфектант. Указанная теория объясняет высокую бактерицидную активность продуктов электролиза хлористого натрия в кислой среде и ыо-ftbi быть использована для поиска новых препаратов да дезинфекции, а такие объясняет необходимость зачисления фаголизо-ом макрофагов для обеспечения максимального бактерицидного действия. „V ' ■ - •. V .; ' ' ■ ;

5. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПИЛЕ? АДГЕЗИИ.

; Первым этапом изучения возможного биологического действия пилей адгезии явилось доказательство их экспрессии в ус- , ловиях in vivo. При анализе набора коммерческих чумных аггл»-тмнируицихх сывороток мы обнаружили наличие в них антител к ■ -«шяы адгезии. Поскольку клетки чушюго микроба,йспохьзуеше . да доштпщш,выращивают ин ос^ш 'питательных средах,не ■

обеспечивакэдх пилеобразования,то,наличие антител г. пилям в сыворотках указывает на приживление ¡{леток возбудителя чумы в организме животного и на продукцию пилей адгезии.

В процессе анализа органов павших ст чумной инфекции экспериментальных животных методом ША аитиген пилей адгезии не обнаруживался. Результаты экспериментов с добавлением к суспензии органов иктактных животных пилей адгезии и их субгединиц показали быстрое "исчезновение" пилей из суспеь-зии. Учитывая факт высокой стабильности серологической активности пилей, полученный результат указывает на суцестг-о-ванке большого числа рецепторов на клетках-мишенях,с которыми прочно связываются пили адгезии.

Неудача выявить образование пилей в органах павиих от чумной инфекции экспериментальных животных серологическими методами способствовала разработке альтернативных методов решения этой задачи. Нами был установлен факт гпдухции пилей адгезии при контакте апилировашмх клеток чумного микроба Оттен,ЕВ 76 и 231 с перитонеальными и альвеолярными макрофагами экспериментальных животных.

■ Вторым экспериментальным подходом,позволившем нам ползать экспрессию пилей. адгезии ir¡ vivo явился метод диффуузи-онных камер. При подкожной имплантации морским свинкам диффузионных камер, заполненных взвесью апилированкых г-дето:;, чумного микроба,в содержимом всех шести камер через .3-14 суток был обнаружь антиген пилей адгезии.

Установленный нами феномен "исчезновения" пилей адгезии при их добавлении к суспензии органов экспериментальных животных свидетельствовал о существовании большого числа рецепторов на самых различных клетках макрооргаюша. В ходе

-£6r

идентификаци рецепторов связывания установлено, что натившэ пили прочно фиксируются на коллагене 1У типа, фкбронектине , гаиглиозиде, муцине. Так как коллаген 1У типа входит в состаз базальиых мембран клеток зукариотов.то обнаруженное сродство позволяет объяснить причину необычно широкого спектра агглютинируемых эритроцитов и свидетельствует об уникальности лектика чумного микроба,поскольку коллаген не входит в число рецепторов для известных лектинов (В.М.Лахтин, 1992). Для исследования рецепторов связывания была получена иммобилизиро-шппап форма пилей адгезии,активность которых составляла 35-45 мкг бел)са рецептора на грамм сорбента.

Установление широкого круга рецепторов пилей адгезии позволило под иным углом таг ля нить на известную проблему антигенной мимикрии возбудителя чумы (Н. R Жуков-Вережников, 1972). Возможное участие пилей адгезии в этом процессе может заключаться в следующем : находясь на поверхности бактериальной плетки или в составе наружной мембраны,пилин связывается с растворимыми углеводсодержащкми макромолекулами. Таким образом, микроб покрывается нативным макромолекулами хозяйка, не вызывающими его опсонизации.и приобретает способность ускользать от воздействия защитных факторов.

i

Поскольку пили адгезии экспрессируюгся при контакте с макрофагами,первоначально их биологическое действие и8учали на модели этих клеток. Препараты нативных пилей адгезии in vitro и in vivo оказывали выраженное цитотоксическое действие на макрофаги белых мышей и морских свинок и на культуры перевиваемых клеток. В то же время, на полиморфнонуклеарные ■ лейкоциты цитотоксическое воздействие регистрировалось в гораздо меньшей' степег-;. Это наблюдение позволяет рассматривать

-ку-

пили адгезии как антимакрофагалышй '¿актор чумного микроба.

Пили адгезии в результате лектино^гоцитоса резко увеличивали способность возбудителя чумы захватываться макрофагами, а воздействие пилой существенно угнетало переваривающую активность макрофагов,способствуя незавершенности процесса фагоцитоза.

Нативяые пили адгезии обладали выраженной митогешюй активностью, стимулируя все ;.иды исследованию лимфоцитов, а таклае Т и Б клетки В малых дезах пили стимулировали окоида-тивный взрыв,а в больших- угнетали этот процесс. Пили оказывали четкое колнореактивное действие«вызывая отек ланок бели мышей. При внутрикожном введении кроликам зарегистрирован отек и некроз,а предварительная инкубация нилей с их рецепторами (ганглиозидом,муцином),специфическими антителами частично блокировала коииореактивность. Субъединичные !•<<! мч пилей адгезии биологической активностш не обладали.

Имеются многочисленные сведения о выделении из мочи возбудителя чумы. Учитывая .что моча имеет слабокислую (.иакиию , благоприятную дли пилеобразования.мы предприняли изучение возможного значений пилеобразования при инфицировании моче-выводящих путей.

Результаты предварительных экспериментов позволили установить, что образование пилей адгезии клетками чумного микроба происходит в условиях кислого рН при повышенной температуре в присутствии катионов одно- или двухвалентных металлов даме в случае отсутствия экаоодпт источником углерод*, и энергии. Поэтому, во всех последующих экспериментах при ин; кубящл в моче апилиремшных клеток к/буди IV ля чу.&| ми г*-:*, гистрирэвали обраяовзиио пилей адгезии. Полу*ш1№ дакт-л <•-?

полюляют предлсш»аш,, что, инфицируя шчевиьодящие нуги, возбудитель чумы образует пили адгезии и тем самым колонизирует слиоистие. Таким образом, патоген получает ■ возможнойь заселить еще одну экологическую ниау в восприимчивом макроорга-киаме. ,

Пили адгезии не обладали протективным действием при одьо-или двухкратной иммунизации и не оказывали заметного влияния на формирование иммунитета ъ ответ на введение капсульного антигена фракции 1. ■

,. Совокупность изученных свойств пилей адгезии позволяет,в общих чертах, представить этапа . инфекционного процесса на которые оказывает влияние это биологически активное вещество. Образуясь при контакте с макрофагами (по-видимому,в фаголи-аосомах) или в очаге воспаления пилированные клетки активно захватываются -макрофагами ,а изолированные пили адгезии нарушают их функцию. В результате этого воздействия и влияния ряда других факторов.« наблюдается столь характерный для чумной инфекции Феномен незавершенности фагоцитоза. Кроме тога, пили могут участвовать в антишшой мимикрии Еозоудителя и способствовать развитию аутоиммунных нарушений.,

Полученные даы&э позволяют отнести пили адгезии возбудителя чумы к числу .важных детерминант вирулентности и ооъ- • яснить механизм наблюдаемого снижения вирулентности при их утрате ,(ЦЕ.ипс11ег; а!. ,1990,П. А. Черепанов и др. ,1991). .•"е.'ПИЛЙ У V.РШЖГШВЖи/Б¡3 и У.ЕОТЕКОСОЬШСА. При анализе пилеобрагювания у У. рзсис!о1иЬвгси 1оз > б установлено,что во-« 134 изученных штамма образовывали пили ло всс-м свойствам соикадавшими с таковыми'у возбудителя '¡уш. : ' Ото поаьоляет рассматривать фжмек пилеобрааования кг« ВИ-Дошй нриэниг: воейуди'телей чуш и пеевди'уберкулееи.

■ Штаммы У.епЬегосоНИса не щюдуциросали пилей адгезии. Однако, у них было па^азано наличие двух серологически отличающихся типов пилсй,обозначенных ними серотип 1 и 2.

Пили серотипа 1 детерминировались плазмидой,образовывались конститутивно и сообщали МРГА активность только в отно-иении формалинизиговакшх, но ке нативных эритроцитов. Пялиро-ванные пилями серотипа 1,штаммы характеризовались повышенной-гидрофобностью.адгезировали к стеклу, образовывали характерную пленку на поверхности бульона и практически не фагоцито-ровались макрофагами. Нами показана способность пилированных этими гашш клеток У. еп1егосоПЬ1са вытеснять апилироваяякэ при длительно:.!! ¿культивировании в статическом бульоне дз;те при избытка последних в 10 ООО ООО раз. Это свойство,по-видимому, имеет значение для длятельного выживания возбудителя з воде стоявдк ЕОДОЭМОВ.

. Ка'.С! была сконструирована рекомбинаитная плазмида рК065, детерминирующая образование пилей серотипа 1 и несущая удобный маркер сэлекщга (устойчивость к1 ампициллину). Введение рРС65 в ¡слетки возбудителя чумы приводило к резкому иягкби-рованию фагоцитоза макрофагами морских свинок и особенно Гв-лых .мышей, что, иа паи взгляд, дает в руки исследователей способ изменять взаимодействие с макрофагами.

Пили серотипа 2 У.егЛегоосоПиса детерминировались хро-мосомальнкми генами ; образовывались только при пониженной температуре культивирования,утрачиваясь при 37°С.

Таким образом у иерсиний показано образование га.чей трех типов : шлей адгезии, образуемыми всеми штаммами чумного и псевдотуберкулезного микробов, и пидей серотипов 1 и 2 .свойственных штаммам возбудителя гапзэчного иерсиниоза.

-эо

выводн

1. Возбудитель чумы способен к экспрессии пилей адгезии, совпадавших по основным свойствам с пилями факторов колонизации грамотрицателышх бактерий, и тонких филамептоеньк структур, подобных курлинам кишечной палочки. Установлена тождественность пилей адгезии одному из известных антигенов чумного микроба рН 6,4,1.

2. Возбудитель пссвдотуборкулеза продуцирует пили алге-ши.иденгичние пплям чумного микроба.!' некоторых штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза имеются два типа серологи- 1 чески и функциональна отличающихся пилей.

3. Экспрессия пилей адгезии скоординировано регулируется сочетшшым воздействием на клетки чумного микроба трех внешних стимулов : повышенной температуры культивирования (37-43 ),ниокого рН и наличием катионов в среде культивирования. Указанный феномен реализуется через изменение величины рН цитоплазмы возбудителя.

. 4. Селекционированы штаммы-продуценты пилей адгезии, разработаны способы получения гомогенных .высокополимерных пре- .. кагатов пилей адгезии. Разработаны способы выявления различ-11 ных форм пилей и степени их нативности.

5. Пили адгезии возбудителей чумы и псевдотуберкулеза являются лектином с широким спектром активности : они фиксируются на Фибронектине,коллагено. муцине, ганглиозиде.

6. Экспрессия пилей адгезии у клеток возбудителя чуш регистрируется в условиях восприимчивого макроорганизма в случае взаымодейтсриа с макрофагами.вдпадания в мочу и пребывания в подкожно имплантированных диффузионных камерах.

7. Пили адгезии в нативной форме является высокоактивным биологическим веществом,способным за счет изменения функций клеток влиять на все этапы взаимодействия хогмин--паразит. Совокупность выявленных свойств пилей адгезии объясняет механизм их функционирования в качестве фактора вирулент нести.

8. Возбудитель чумы способен к экспрессии етг*?осового ответа,при этом пили адгезии и капсульннй антиген фракции 1 являются стрессовыми белками возбудителя.

СПИСОК РАЮТ.ОПУКШСВАЮМХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Виделани» и характеристика детерминированного плазмидой антигена К 88 киазечнои палочки. (Алексеева Л Г1 .Мишанькин RIL)//«ypH. микроб, .опидем. иммун. -1981. -N 11.- С. 31-36.

2. Исследование пилей адгезия на модели антигена К 88 (сишеч-ной палочки. //Мэлскул. биология и генетика возбудителей

ООМ: ч. 1, Научно- тем. сборн. Саратов Д&82. С. 16-18.

3. Способ обнаружения пилей адгезии у микроорганизмов рода Yersinia. (Мишанькин Б. Н. , Павлович ИВ.)// Авт. свидет. N

1074904 от 23. '0. 198з! ■, , . '

4.Адгезивные свойства псевдотуберкулеэного микроба 3 сарова-ра. (Мишанькин Б. Н.)//Профилактика природноочш'оекх инфек- ' uiul: Тез. докл. Всесоюзн. н-прак. конф. Ставрополь, 1983. С. 285-286.

5. Пилеобразозание у иерсиний. (Родионова А. Е ) //Молекул, биология, генетика и иммуиол. возбудителей ООН: Тез. докл. Всес. конф. Гостов /Д, 1984. С. 8-10. ■ . ■ . .'

6.. Выделение и очистка пилей адгезии псевдотуберкулевногоJ микроба. (Мишанькин Б. Я) //Соврем, аспекты профилактики воо-нозн. инфекций, ч. 3: Tee. докл. Всес. конф. Иркутск, 1984. С. 34-35.

7. Адгезия у yersinia pseudotuberculosis серотипа 3./Мишань-кин Б. Н. , Кирдеев Е К. /- //Курн. микроб, .эпидем. им- . : мун. -1984. -N 1Q. -С. 36-40. .

8. Н/гамм Y. pseudotuberculosis 1985-Р - продуцент .пилей адгезии, (Мишанькин Б. Н.) //Авт. свидет. N 1115460 от

. 22.05.1984. '

9. Штамм Y. pest.is 556-Р -продуцент пилей адгезии. (Мишанькин Б. Я) //Авт. свидет. N 1103555 от 15.03.1984.

10. Пили адгезии у возбудителя чумы. (Мтаанькин Б. it-)' //Журн. микроб. , эпидем. иммун. -1985.-N 6. -С. 13-17. И. Изучение роли циклических нуклеотидов в экспрессии признаков существенных для выражения вирулентности. (Шевченко Л. А. .Мишанькин Б. Н.) //Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментных реакций: Тез. докл. Всес. Симп. Рязань, 1985. " С. 127-128.

12. Штамм Y. enterocolitica 122, используемый для получения пилей адгезии. (Родионова А. В. .Мишанькин Б. Е ) //Авт. свидет. N 12111921 от 15.10.1985.

13. Способ идентификации '/.pseudotuberculosis .(Родионова А.Е .Мишанькин ЕЕ) //Авт. свидет. N 1193170 от 22.07.1985.

14. Способ получения апилированных мутантов. (Мишанькин ЕЕ) //Авт.свидет. N 1302699 от 8,12.1986.

15. Феномен пилеобразования у Y. enterocolitica.(Родионова А. Е ,Шжанькии. Е Е .Кирдеев Е К.) •// Журн. микроб, .эпидем.

• иммун.-1986.-М а-С. 30-33.

16. Пяазшдная локализация генов пилеобразования у Y. ente-rocollittca(Мишанькин ЕЕ .Родионова А.Е ) //Иерсинио-

вы. Микроб, .зяияем. .патогенез,клиника: Тез. докл. Всес. н-прагег. конф. Владивосток, 1985. С. 25-26.

17. Плазмидоопосредованное селективное преимущество у Y. enterocolitica при.культивировании б жидкой среде! (Родионова

А. Е ) // Там же. С. 26-28.

18. Штамм холерного вибриона КМ 55.используемый для получения фимОрий. (Либензон А. Е.', Кирдеев Е К. .Гамлешко. И. X)

//Авт. свидет. N 1369281 от 22.09.1987. '

19. Способ идентификадии Y. pseudotuberculosis. (Родионова

А. Е , Миаанькин Б. Е) //Изобретательство и рационализация в медицине: Ilecn. сб. "М.. 1987.0.91-92.

20. Сравнительное изучение пилеобразования у представителей рода Yersinia. ( Попова Г.О. .Родионова А. Е ) Деп. ВИНИТИ

2. 02. 1983. N 882-В88. •

21. Пили адгезии возбудителей чумы и псевдотуберку.« за: обнаружение в реакции гемагглютинации.пассивной гемаггдатинации и в системе иммуноферментного анализа. (Рыбкин В.С. , одионо-ьа А. В. .Яковлев А. Т.) //Журн. микроб, .эпидем. иммун. -'088. -N 8.-С. 7-10.

22. Влияние хлорамфеникола.гентамицина и рифампицикз на образование пилей адгезии. //Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты: Тез. докл. Всесоюзн. Семинара М. , 1988. С. 167-168.

23. Двойной контроль пилеобразования у Y. pestis.//Микроби-ол. журн. -1388.-т. 50, N 6.-С. 40-45.

24. Образование пплей адгезии клотгамк чумного и псевдотубе-ркудезного микробов регулируется температурой и рН среды культивирования. //Механизмы интеграции биологических систем. Проблемы адаптации: Тез. докл. Ростов к/Д ,1988.0.110-111.

25. Штамм бактерий Е. coli ВКМ CH-308D -продуцент пилей адгезии Y. enterocclltiea. (Родионова А. К ) //Авт. свидет.

N 1552627 от 4. Об. 1988.'

26. Бласттрансформируюшая активность пилей адгезии керси-ний. (Демидова Г. В., Ермоленко Т. Д.) //Иерсиниозы/Микробкол., зпидем., клиника, патогенез и лаб. диагностика: Тез. докл. Всесоюзн. научн. конф. Владивосток, 1989

ч. 1.С. 16-17.

27. Случаи обнаружения Y. pseudotuberculosis и Y. enteroco-litica в изолятах больных псевдотуберкулезом. ( Гурлева Г. Г., Смоликова JL М., Подладчикова О. Е , Диханов Г. Г. , ¡^ Родионова A. R , Мишанькин R Е , Андреева Г. 0.) //Там же.

С. 22-23.

28. Изучение градиента рН в клетках чумного микроба //Механизмы интеграции биологических систем. Проблема адаптации. : Тез. докл. научно-практ. конф. Ставропс^, 1989.0.154-155.

29. Образование пилей адгезии клетками чумного микроба с мутациями в генах фосфотрансферазной системы углеводов. (Ва-леицев В. Е.) //Регуляция микробного метаболизма Тез. докл. Всесоюзн. конф.: Пугано, 1089. С. 24-25.

30. Влияние сигнала "37 - низкий рН" на рН цитоплазмы и систем циклических иуклеотидов в клетках чумного микроба (Шевченко Л.А.) // Эпидемиол. .микробиол. и иммунол. бактериальных и вирусных инфекций. : Тез. докл. Ростов н/Д, 1У69. С. 16-17.

31. Серологический ответ кюликов на антигены г-гзбудителей ООИ. ( Некляев В. H .Анисимов В. IL .Гамлешко X П. .Веркииа JL М., Славянская Т. А. .Мареев В. к1. .Титенко M. М., Тынкевич 1L К. ,Че-репахина И.Я. )//Экология животных : Пущино, 1989. С. 78.

32. Штамм бактерий Y. enterocolitica 152 - продуцент пилей адгезии Y. enterccolitlca типа 2. (Су^пгав И. Ю. .Мишанькин R IL ) //Авт. свидет. N 1632034 от 1.11.1990.

33. Влияние сигнала "37 -низкий pli" на клетки

чумного микроба.// Микробиол.журн.-1990.-т.52,N 5.-0.8)3-92.

34. Феномен пилеобразования при взаимодействии Y. pestis с макрофагами экспериментальных животных. (Васильева Г. И.,Мишанькин

Б.IL) // Журн. микроб., эпидем. иммун.-1990.-N 3.-С.3-6.

35. Влияние пилей адгезии на физиологическую активность лейкоцитов и макрофагов экспериментальных животных. (Асеева JLE., Мишанькин Б.Н. ,и др.) // Там. же.- N-8.- С.5-9.

36.. Питательные среды для изучения воздействия сигнала "37 -низкий рН" на клетки чумного микроба. (Олс-йншспв И. П. ) //Разработка препаратов медицинской биотехнологии, ч. 2,: Тез. докл; научн. конф. Махачкала ,1990. С. 20.

27. Образование пилей адгезии клетками возбудителя чумы при воздействии сигнала "37 -низкий рН" зависит от присутствия -катионов. (Олейников И. IL )//Цитология. -1990. - N 9. -С. 923-924.

38. Рекомбинантная плазмидоая ДНК pRD65, детерминирующая образование пилей. (Сучков И. КХ .Романова Л. В. ,Мишанькин В.Е) //Бактериальные плазмиды.: Тез. докл. Нальчик,1990.С.39-40.

39. Воздействие сигнала "37 -низкий рН" на трансмембраншй градиент протонов и систему цинических нуклеотидов в клетках ч/много микроба. (Шевченко Л. А. .Мишанькин Б. Я) //Биологические мембраны.-1991.-т. 8. N 2.-С. 140-145.

40. Образование пилей адгезии при контакте чумного микроба с макрофагами экспериментальных животных. ( Веркина Л.Ы. .Васильева Г. И. .Мишанькин Б. Н. ) // Актуальн. вопросы профил. опасных инфекционных заболеваний: Матер, межвед. сов. Киров, 1991. С. 170- 171:

41. Курлиноподобные экстрацеллюлярные структуры чумного микроба. ( Саямов С. Р. .Мишанькин Б. Е )//Областная научно-практическая конф. посвященная дню Радио: Ростов н/Д, 1991. С.40-41. :

42. Возможная роль преобразования при инфицировании моче-выводяцих путей.(Романова Л.Е .Олейников И.Е .Мишанькин ЕЕ) //Нурн. микроб, .эпидемиол. и иммун. -1692. -N 2,- С. 72-73.

4а Синергидное действи;; на Fr. tular^nsis перекиси водорода и гипохлорита при низшм рЕ (Павлович-Е Е ) //Актуальные ; пробл. профилактики туляремии: Тез. докл. Всес. конф. Симферополь, 1991.0.143-145. '

44 Идентифшкщия рецепторов лилей адгезии чумного микроба. ■ (Атарова Г. Т. .Олейников lifl.,Горкина JLM.) // Тез. док. 1 съезда иммунологов России: Новосибирск, 1992. С.85.

45. Низкий рН потенцирует дейстгие перекиси годорода и ги-похлсрита на клетки возбудителя чумы. (Олейников IL П. ) //Там же. С. S5.

46. Чувствительность к низким значениям рН штаммов чумного микроба с мутационным повреждением аденилатцйклазы. (Вален-цев В.Е. .Шевченко Л.А.) //Генетика и биохимия возбудителей 00И: Матер. Российской н. конф. Волгоград,19Р2.С.76.

4?. Возможная роль трансмембранного градиента протонов с формировании повышенной чувствительности Y. pest is к бактерицидному действию хлорактивных соединений при низком pIL (Павлович Е В. .Олейников И. П. .Мишанькин Б. Н. ) // Биология мембр. -1992. - т. 9, Н б. -С. 581-587.

48. Разработка способа получения пилей адгезии (лектина) чумного микроба (Мишанькин Б. Е .Олейников И. П., и др.) //Биотехнология.-1992.-N 4.-С. 18-21.

49. Фибронегаинсвязываюшая способность Yersinia pestis. (Атарова Г.Т. .Олейников И.П. и др.) //Журн.микроб, .зпидем. иммун. -1993-N 3. -С. 6-12:

50. Участие нейраминидазы чумного микроба в передаче трансмембранного сигнала на модели перитонеальных лейкоцитов белых мышей. ( Асеева Л. Е. .Мишанькин Б. Н. .Шиманюк Н. Я. .Рублев В. Д. ) // Микробиол. журн. -1993. -т. 55.N 4- С. 59-64.

51. Влияние антигенов чумного микроба на формирование иммунного ответа в культуре иммунокоынетентных клеток человека. (Ермолеш-ю Т.Д.) //Иммунология и профилактика 00К :Мат.Роо.

научн. конф. Саратоь, 199а С. 30-3!.

52. Стрессовый ответ у воиУ/дителя чумы. (Олейников И. (L , Млшаныын Е. Н. )//Био'1\?хнология.-lftfü - N 11-12. -С. 26-28.

53. The possible role of - transmarobr-ei» proton gradient- in foriruri¿ Yftisiriia post is hiyh susceptibility to the baclyrioi'inl activity of chicractive agent at lor, pH.

(SIlevohtiiiko LA. .Mishankin B.N.} //Biol, tetrads.-1993.-V'.6,N 6. -Р.741-УЫ.

5-1 Стрессовые белки возбудителя холеры. ( Олейников И. II, Шшинынш L'. ÍL ) // Холера. Вопросы элидемиол. микробиол. и лсб. диагностики: Матер. Рос. н. конф. Ростов н/Д.ЮУЗ. С. 1Й1 -122.

55. Феномен пилеооразования при инкубации клеток чумною мшуоба в подкожно имплаигироьашш диффуаиошпк клморах. f Олейников IÍ. П. .Саямоь С. Р. ДШшанькин Б. IL ) //Актуальные пробл. ирофилакт. особо опасных и природно-очаговых инфекций: Иркутск, 1 'Ж. С. 27.