Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микроорганизмы вулканогенных многолетнемерзлых отложений

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микроорганизмы вулканогенных многолетнемерзлых отложений"

На правах рукописи

МИРОНОВ Василий Андреевич

МИКРООРГАНИЗМЫ ВУЛКАНОГЕННЫХ МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ ОТЛОЖЕНИЙ

03.02.03 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2013

005535295

Работа выполнена в лаборатории Криологии почв Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук (ИФХиБПП РАН), г. Пущино.

Научный руководитель:

Гиличинский Давид Абрамович доктор геолого-минералогических наук, зав. лабораторией криологии почв Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН

Научный консультант: Щербакова Виктория Артуровна,

кандидат биологических наук, зав. лабораторией анаэробных микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Официальные оппоненты: Бонч-Осмоловская Елизавета Александровна

доктор биологических наук, зав. лабораторией гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Ананьева Надежда Дмитриевна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории почвенных циклов азота и углерода Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова", факультет Почвоведения

Защита состоится «Х& ъСеМТлЛ[А. 2013 г. на заседании диссертационного совета Д 002.121.01 при ИБФМ РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, пр. Науки, 5, ИБФМ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФМ РАН. Автореферат диссертации разослан « июля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

гт

Н.В. Васильева

Актуальность проблемы. Последние несколько десятилетий ведутся работы по изучению сообществ микроорганизмов мерзлых осадочных отложений. Многими исследователями получены убедительные доказательства сохранения жизнеспособных микроорганизмов в вечной мерзлоте в течение геологического времени (Звягинцев и др. 1985; Vorobyova et al. 1997; Gilichinsky, Wilson et al. 2007; Gilichinsky, Rivkina 2011). Из проб многолетнемерзлых грунтов были выделены чистые культуры актиномицетов (Карасев и др. 1998; Kochkina et al. 2001), нитрифицирующих бактерий (Соина и др. 1991), метанотрофов (Хмеленина и др. 2002), сульфатредукторов (Vatsurina et al. 2008), зеленых одноклеточных водорослей и цианобактерий (Vishnivetskaya et al. 2005), метаногенных архей (Rivkina et al. 2007; Krivushin et al. 2010; Shcherbakova et al. 2011). Эукариоты, обнаруженные в многолетнемерзлых отложениях Арктики и Антарктиды, представлены дрожжами (Дмитриев и др. 1997; Faizutdinova et al. 2005) мицелиальными грибами (Кочкина и др. 2001; Lydolph et al. 2005), зелеными водорослями (Vishnivetskaya et al. 2005) и простейшими (Шатилович и др. 2005; Шатилович и др. 2010). Несмотря на то, что эти микроорганизмы находятся при отрицательных температурах в мерзлых породах на протяжении длительного времени от нескольких тысяч до нескольких миллионов лет (Gilichinsky et al. 2007), они сохраняют метаболическую активность, обеспечивающую их жизнеспособность (Rivkina et al. 2000; Ривкина 2002; Хмеленина и др. 2002). Многие изоляты и смешанные популяции проявляли метаболическую активность при отрицательных температурах (Ривкина 2002; Хмеленина и др. 2002; Bakermans et al. 2003; Gilichinsky et al. 2003).

В последнее десятилетие внимание исследователей привлекает высокогорная мерзлота (Zhang et al. 2007; Yang et al. 2008), в том числе и вулканического происхождения, как место сохранения экстремофильных микроорганизмов. Многие активные вулканы расположены в зоне распространения вечномерзлых пород. Многолетнемерзлые породы

обнаружены на вулканах Камчатки, Россия (Абрамов, Гиличинский 2008), Исландии (Kellerer-Pirklbauer et al. 2007), на вулканах Десепшен и Эребус на Антарктическом континенте и прилегающих островах, а также на вулканах Гавайских о-вов (США) (Woodcock 1974) и Японии (Higuchi, Fujii 1971).

Микробиологические исследования ассоциированных с вулканами термальных мест обитания, таких как фумаролы, горячие источники, гейзеры и сольфатары (Bonch-Osmolovskaya 1994; Stetter 2006; Bonch-Osmolovskaya et al. 2011) показали, что сообщества термальных мест обитания могут существовать автономно и не зависеть от внешней среды. Некоторые микроорганизмы, обитающие в подобных экосистемах, способны питаться автотрофно и получать энергию за счет окисления неорганических источников энергии (Stetter et al 2006) при высоких температурах, до 122°С (Takai et aL 2008).

В тех регионах, где активный вулканизм и геотермальная активность проявляются в зоне распространения мерзлоты, образуются условия для консервации микроорганизмов из термальных источников и фумарол в окружающих мерзлых породах. Такие условия должны возникать либо при прекращении геотермальной активности и переходе геотермальных экосистем в многолетнемерзлое состояние, либо если микроорганизмы попадают за пределы геотермальных оазисов в ходе извержений и фумарольной активности.

В ходе исследований мерзлых пород Арктики и Антарктиды, не ассоциированных с вулканизмом, гипертермофильные микроорганизмы в них не обнаруживались, а термофильные обнаруживались только как минорная составляющая сообществ (Steven et al. 2006; Rodrigues, Tiedje 2008). При этом систематических исследований многолетнемерзлых пород вулканического происхождения не проводилось. А именно они могут представлять наиболее древние хранилища законсервированных в мерзлом состоянии термофильных микроорганизмов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было изучение жизнеспособных микроорганизмов, сохранившихся в

многолетнемерзлых вулканогенных отложениях п-ова Камчатка и острова Десепшен, Антарктида.

Основные задачи исследования состояли в следующем:

1. Определение общей численности микроорганизмов и численности представителей различных температурных групп, сохранивших жизнеспособность в многолетнемерзлых вулканогенных породах (ММВП).

2. Выделение чистых культур аэробных и анаэробных микроорганизмов из ММВП, изучение их физиолого-биохимических свойств, определение таксономического положения.

3. Выявление в многолетнемерзлых вулканогенных породах жизнеспособных термофильных микроорганизмов.

4. Сравнительный анализ состава микроорганизмов, сохранившихся в многолетнемерзлых вулканогенных породах и окружающих экосистемах.

Научная новизиа и значимость работы. В работе впервые исследованы микроорганизмы многолетнемерзлых вулканических отложений п-ова Камчатка и о. Десепшен. Показано, что изученные мерзлые породы содержат жизнеспособные микроорганизмы, среди которых преобладают бактерии с повышенной оптимальной температурой роста, не способные расти при комнатной температуре. Из многолетнемерзлых вулканических пород острова Десепшен выделены и исследованы чистые культуры психрофильной, субтермофильной, и термофильной групп микроорганизмов, представляющие роды Bacillus, Paenibacillus, Geobacülus, Sporosarcina, Rhodoglobus (Leifsonia) и Clostridium.

Впервые в вулканических мерзлых породах наблюдался процесс микробиологической сероредукции при температурах выше 80°С.

Практическая значимость. Обнаруженное в настоящей работе явление - сохранение термофильных и гипертермофильных микроорганизмов в мёрзлых породах, может быть использовано для усовершенствования методик криоконсервации культур таких микроорганизмов в коллекциях.

Данная работа является первым этапом изучения вулканогенных термальных сообществ в исторической ретроспективе, горизонты которой определяются временем непрерывного существования вечной мерзлоты (до 3035 млн. лет). Многолетнемерзлые породы Земли с законсервированными в них термофильными и гипертермофильными микроорганизмами являются астробиологической моделью планет и спутников криогенного типа с вулканической активностью в настоящем или прошлом, например Марса.

Большое значение имеет биотехнологический потенциал обнаруженных в мерзлых породах микроорганизмов. Термофильные микроорганизмы могут являться продуцентами уникальных термостабильных ферментов, используемых в промышленности и медицине. Выделенные культуры помещены в Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) и доступны для дальнейших исследований разными специалистами.

Усовершенствованная методика отбора проб для микробиологического анализа может быть использована для работы с мерзлыми породами или льдами, характеризующимися крайне низкой численностью микроорганизмов.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международных конференциях «Astrobiology Science Confrence 2010»; «Young Systematists' Forum 2010»; «38,h COSPAR Scientific Assembly 2011»; «JIomohocob-201 1»; Астробиологическая школа в Сан Пауло (SPASA 2011) и 1-ой Всероссийской научной школе-конференции «Астробиология: от происхождения жизни на Земле к жизни во Вселенной -2012».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, десяти глав и заключения. Она изложена на 132 страницах текста, сопровождается 30 иллюстрациями и 9 таблицами. Список литературы включает 191 наименование, из которых 161 - на иностранных языках.

Место проведения работы и благодарности. Работа выполнялась в лаборатории криологии почв Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (ИФХиБПП РАН), и в лаборатории анаэробных микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ РАН). Автор выражает благодарность к.г-м.н Ривкиной Е.М и к.б.н Щербаковой В.А. за плодотворное сотрудничество, за конструктивную критику и за помощь в планировании экспериментов. Особую благодарность автор выражает к.б.н. Сузиной Н.Е. (ИБФМ РАН); к.б.н. Переваловой А.А. (ИНМИ им. С.Н. Виноградского); к.б.н. Арискиной Е.В. (ИБФМ РАН); к.б.н. Булату С.А. (ПИЯФ им. Б.П.Константинова, Санкт-Петербург), к.б.н. Вишневецкой Т.А. (Центр микробной экологии Мичигана, США), Гусеву О.А. (Университет Цукубы, Япония) за помощь в проведении ряда анализов и исследований. Автор признателен исследователям гипертермофильных микроорганизмов Штеттеру К.О. (Университет Регенсбурга, Германия) и Блэмэй Д. («Fundación Biociencia» Сантьяго, Чили) за полезные рекомендации и критику. Спасибо сотрудникам лаборатории Криологии почв ИФХиБПП РАН и лаборатории Анаэробных микроорганизмов ИБФМ РАН за плодотворные и интересные дискуссии, помощь в освоении новых методов, получении и интерпретации результатов экспериментов.

Я выражаю искреннюю благодарность безвременно ушедшему научному руководителю и идейному вдохновителю Давиду Абрамовичу Гиличинскому.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись многолетнемерзлые вулканические породы двух регионов: п-ова Камчатка в пределах Ключевской группы вулканов (56°00' с.ш. 160°30' в.д.) и вулканического острова Десепшен (Deception) (62°57' ю.ш., 60°38' з.д.), расположенного в проливе Брансфилда в южной части Южных Шетландских островов, вблизи северо-западного побережья Антарктического п-ова.

Образцы мерзлых отложений вулканов п-ова Камчатка для

микробиологических исследований были отобраны из скважины 7/02 на склоне вулкана Плоский Толбачик (1400 м над уровнем моря), из скважины 10/04 у подножья вулкана «Безымянный» и заложенных рядом почвенных разрезов. Для микробиологических исследований отобрано 19 образцов мерзлых пород и 4 почвенных образца. Отложения, вскрытые в скважине 7/02, представлены в основном пирокластическим материалом (вулканические шлаки, песок и пепел), сформировавшимся за последние 3-6 тыс. лет. Отложения из скважины 10/04, представлены сильно выветренными лавами.

Образцы мерзлых вулканических отложений острова Десепшен были отобраны в ходе экспедиции РАЭ54 в 2009 году при участии автора. Исследуемые отложения представлены мерзлыми вулканическими пеплами и более грубым пирокластическим материалом, сцементированными льдом. Мерзлые породы имеют возраст не менее 180 лет. Для микробиологических исследований было отобрано 4 пробы мерзлых вулканических пород.

Объектами исследования также служили чистые и накопительные культуры микроорганизмов, выделенные из вулканических мерзлых отложений острова Десепшен и Камчатских вулканов. Для сравнительных экспериментов использовали штамм Geobacillus stearothermophilus ВКМ В-510т, полученный из ВКМ.

Отбор образцов мерзлых пород проводился методом колонкового бурения при помощи установки УКБ-12/25 с колонковым снарядом с соблюдением мер асептики (Гиличинский и др. 1989).

Измерение содержания метана проводили при помощи хроматографа ХПМ4. Пробы газовой фазы получали в поле методом «head space» (Alperin et aL 1985) путем дегазации монолитов мерзлых пород в насыщенном растворе NaCl.

Учет общей численности микроорганизмов проводили по методике с окрашиванием препаратов красителем Е>АР1. Для наблюдения клеток использовали люминесцентный микроскоп Zeiss Axiostar plus с 1000* увеличением.

Учет численности культивируемых микроорганизмов и выделение чистых культур проводили при спектре температур (от 4 до 85°С) на специфических для каждой группы микроорганизмов питательных средах.

Культуральные свойства и физиологические особенности новых изолятов изучали по общепринятым методикам (Герхард и др. 1984).

Морфологию клеток определяли при помощи светового микроскопа Zeiss Axiostar plus, а так же на ультратонких срезах, полученных при помощи ультратома LKB3, на микроскопе JEM 100.

Геномную ДНК выделяли по Мармуру (Marmur 1961) с необходимыми модификациями; также с использованием наборов UltraClean® Soil DNA Isolation Kit и UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit.

Нуклеотидный состав исследовали методом термической денатурации ДНК на спектрофотометре Beckman Coulter DU800 (Великобритания).

Амплификацию гена 16S рРНК проводили при помощи набора реактивов Encyclo PCR kit (Евроген, Россия) с универсальными бактериальными (27F и 1492R) и архейными (21F и 1492R) праймерами. Для отдельных бактериальных штаммов использовали разработанные автором праймеры Decl6SF 5' -TGGCGGCGTGCCTAATAC АТ-3' и DeclöSR 5'-CTCTCAGGTCGGCTACGCATC-3', специфичные к уникальному участку гена 16S рРНК этих штаммов.

Секвенирование гена 16S рРНК проводили в компании Evrogen (Россия) на секвенаторе Applied Biosystem 3730 XL DNA Analyzer.

Конструирование библиотеки клонов гена 16S рРНК проводили при помощи клонирования амплифицированных с универсальными праймерами фрагментов гена 16S рРНК в вектор PAL-TA (Евроген, Россия) согласно рекомендациям производителя.

Анализ полученных последовательностей и построение дендрограмм проводили с использованием пакета программ MEGA5 (Tamura et al. 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованные многолетнемерзлые породы возраста от 180 до 6000 лет (Таблица 1) представлены вулканическими пеплами и шлаком, сцементированными льдом. Для сравнения изучались также современные вулканические почвы Камчатки.

Таблица 1. Краткая характеристика исследованных мерзлых пород.

объект место отбора проб возраст температура пород, °С Сорг» рН

ММВП Камчатки Вулканы «Безымянный» и Толбачик, п-ов Камчатка З-б тыс. лег. -1...-3 0.01-0.3 6.5-8.0

Вулканические почвы, Камчатка Вулкан «Безымянный» и Толбачик, п-ов Камчатка современные -28...+25 0.5-1.0 7.0-7.2

ММВП о.Десепшен о. Десепешен, Антарктика 180-1000 лет -1...-3 0.02-0.04 7.2-9.3

1. Микробиологический анализ многолетнемерзлых вулканических пород

п-ова Камчатка.

Общая численность микроорганизмов в исследованных мерзлых породах составляла менее 5* 104 кл/г, а в образцах почв - 106 - 107 кл/г.

Численность культивируемых аэробных микроорганизмов значительно варьировалась от образца к образцу и составляла < 50 - 104 КОЕ/г в мерзлых породах и 105- 106 КОЕ/г в образцах современной почвы.

Следует отметить, что наиболее многочисленной группой жизнеспособных микроорганизмов в мерзлых породах скважины 10/04 (Рисунок 1 а,б) и в почвах являлись мезофильные микроорганизмы, что хорошо согласуется со многими исследованиям невулканогенных многолетнемерзлых пород (С^сЫгвку е1 а!. 1995; ОШсЫгеку, ЯМала 2011) Термофильные представители встречались только до глубины 7.2 м и в значительно меньших количествах.

Распределение численности выявленных микроорганизмов в образцах из скважины 7/02 (Рисунок 2 а,б) характеризовалось Тем, что мезофильные бактерии не являлись наиболее многочисленной группой. В этих образцах преобладали психрофильные или субтермофильные бактерии, т.е. бактерии с повышенной температурой роста, не растущие при 20°С, а в образце с глубины 7.2 м преобладали термофильные микроорганизмы.

I 0.

ь.

численность. КОЕ/г 1 10

10'

10'

10

10'

10"

10!

41% 3.4%

3 4°С 120°С 3 37°С |55°С

б)

КОЕ/г 10

103

. 0 05 1 0.20 ~ 0.50 1.80 2.90 4.40 6.10

720 1

-

8.55 I 9.60

-

10.75 11.65 12.40 14 50

1-2.6%

:4°с |20°С 137°С 155°С

Рисунок 1. Численность микроорганизмов мерзлых пород, вскрытых в скважине 10/04, имеющих различные температурные преференции, определенная культивированием на средах Я2А (а) и ТБА (б). Показана доля каждой группы микроорганизмов.

а)

численность, КОЕ/г

10

ю2

10

10

10

10°

10'

б)

0.1

4.2

5.0

5 72

га

X 5 7.8

ю

Ц Н 1

9.6

11.0

12.0

10

численность, КОЕ/г

10

ю'

10

103

10°

ю7

12.5%

0.1% (■)

□ 4°С ■ 20°С

□ 37°С @55°С

Рисунок 2. Численность микроорганизмов мерзлых пород, вскрытых в скважине 7/02, имеющих различные температурные преференции, определенная культивированием на средах Я2А (а) и ТЭА (б). Показана доля каждой группы микроорганизмов.

В пробах из скважины 7/02 была определена численность представителей различных физиологических групп анаэробных микроорганизмов при температуре 4 и 75°С. Количество жизнеспособных органотрофов, метаногенов и сульфатредукторов, способных расти при 4°С, в целом превышало количество микроорганизмов, растущих при 75°С (Таблица 2). Среди культивируемых психрофильных микроорганизмов преобладали органотрофные бактерии. Численность психрофильных сульфатредукторов и метаногенов составляла от десятков до сотен клеток в 1 г образца. При 75°С в образце с глубины 8.5 м были выявлены ацетогенные бактерии и метаногены (десятки клеток на г образца), органотрофы (от десятков до сотен клеток) и заметное количество сульфатредукторов. Во всех исследованных образцах были обнаружены десятки кл/г жизнеспособных психрофильных железоредукторов, в то время как термофильные железоредукторы обнаружены лишь в горизонтах на глубине 9.3 и 10.5 м.

Таблица 2. Численность психрофильных и термофильных анаэробных бактерий в мерзлых

Глубина Численность, КОЕ/г

отбора, м Гетеротрофы Железо- Ацетогены Метаногены Сульфат-

редукторы редукторы

4°С 75°С 4°С 75°С 4°С 75°С 4°С 75°С 4°С 75°С

0.45 (почва) 0 0 но. н.о. 0 0 0 0 0 0

5.5 10 20 10 0 0 0 20 10 0 0

6.3-6.5 6800 20 10 0 0 0 310 10 10 0

7.5 6300 20 10 0 0 140 150 0 0 10

8.5 6800 200 100 0 0 145 20 0 10 1205

9.3 7200 0 10 10 0 110 10 0 10 10

10.4-10.5 630 200 10 10 0 10 15 0 140 20

11.0-11.1 6700 200 10 0 0 0 10 0 0 0

12.2 10 0 10 0 0 0 290 20 20 0

В связи с тем, что образцах скважины 7/02 был обнаружен метан в концентрации до 1100 - 1900 мкл/кг, были проведены исследования метанобразующих архей. Такие микроорганизмы были обнаружены в метансодержащих горизонтах (Таблица 2.). Образец вулканической мерзлой породы с глубины 12.2 м был использован в качестве посевного материала для накопительных культур метаногенов, растущих на смеси Н2 и СО?. При

инкубации накопительных культур в течение 170 дней (Рисунок 3, а) наибольшее количество метана образовалось в психрофильных условиях, тогда как в мезофильных продукция метана детектировалась на минимальном уровне. При 55 и 75°С скорость образования метана была приблизительно равной и значительно выше, чем в мезофильных условиях. Таким образом, в ММВП камчатских вулканов нами обнаружено присутствие психрофильных и термофильных анаэробных микроорганизмов, участвующих в образовании метана.

Посев образцов грунта скважины 7/02 с глубины 8.5 и 10.5 м на селективную среду для СВБ позволил получить накопительные культуры КТ72 и КТ74, продуцирующие сульфид при 75°С. Их рассев на различные температуры (50, 55, 65, 75 и 80°С) показал, что оптимальной температурой для сульфидогенеза этими культурами является 65°С. Основную часть сульфатредуцирующего ассоциата КТ72 составляли грамотрицательные неспорообразующие палочки, а КТ74 - грамотрицательные клетки коккоидного типа, вероятно, сульфатвосстанавливающие археи.

Посев образцов грунта скважины 7/02 с глубины 6.3-6.5 и 8.5 м на селективную среду для сульфатвосстанавливающих бактерий позволил получить накопительные культуры К71 и К72, образующие сульфид при 5°С. Подбор оптимальной температуры показал, что штаммы образуют сульфид с максимальной скоростью при 20°С. В накопительной культуре К71 доминировали грамотрицательные подвижные вибрионы, а в К72 -грамотрицательные кокки. Таким образом, образцы мерзлоты с глубины 8.5 м содержали как термофильных, так и мезофильных представителей сульфатвосстанавливающих бактерий. На рисунке 3(6) представлена динамика образования сульфида психрофильной и термофильной накопительными культурами из этого образца.

Рисунок 3. Образование метана при различных температурах в накопительных культурах М726, М7237, М7255, и М7275 из образца 7/02-12.2м (а); образование сульфида психрофильной К72 (20°С) (•) и термофильной КТ72 (75°С) (■) накопительными культурами СВБ, выделенными из образца с глубины 8.5 м (б).

2. Микробиологический анализ мерзлых вулканических пород о. Десепшен

В исследуемых мерзлых породах о. Десепшен

численность

культивируемых микроорганизмов варьировала от < 50 до 10 КОЕ/г. Аэробные мезофильные бактерии в исследуемых образцах не были выявлены, за исключением единичных колоний (а образцах с глубин 1.0 и 2.1 м) при посеве на среду ТвА. Наиболее многочисленными были психрофильные (до 103 КОЕ/г), субтермофильные (до 104 КОЕ/г), а также термофильные (до 60 КОЕ/г) бактерии (Рисунок 4).

Среди исследованных групп анаэробных микроорганизмов были обнаружены только органотрофные бактерии, способные сбраживать сахара и

пептиды, либо окислять эти

численность, КОЕ/г

Рисунок 4. Численность микроорганизмов мерзлых пород в скважине CLS09, имеющих различные температурные преференции, и доля каждой группы микроорганизмов при культивировании на средах R2A и TSA.

соединения с использованием серы в качестве акцептора электронов. Культивируемые психрофильные анаэробные органотрофы

обнаружены в трех исследованных образцах на глубине 1.5, 1.7 и 2.1 м (Рисунок 5). Их максимальная численность (около 300 кл/г) зафиксирована на глубине 2.1 м.

Культивируемые мезофильные анаэробы присутствовали во всех четырех образцах. Субтермофильные микроорганизмы присутствовали также во всех исследованных образцах, их максимальная численность обнаружена на глубинах 1.0 и 2.1 метра. Численность термофильных бактерий составляет около 50 КОЕ/г во всех образцах. Аэробные термофильные бактерии, выделенные из этих образцов, оказались факультативными анаэробами, поэтому в тесте на анаэробов были обнаружены они же.

Во всех четырех образцах нами были обнаружены гипертермофильные микроорганизмы, восстанавливающие элементную серу. В качестве донора электрона в среде присутствовал пептон, а в газовой фазе молекулярный водород. Согласно данным, полученным при помощи метода предельных разведений, численность сероредукторов составляла от 2.5* 102 до 1 .Зх 103 КОЕ/г (Рисунок 6).

•мсланносгь. КОЕ/г

10 10г

2.1 г

И4°С

П20 °С □ 40 °С Я55°С ■ 75 °С

■с 3

I

Рисунок 5. Распределение анаэробных гетеротрофных микроорганизмов по глубине в скважине СЬБ-09 на острове Десепшен.

Рисунок 6. Распределение численности гипертермофильных микроорганизмов, восстанавливающих серу при температуре 85°С по исследуемой толще мерзлых пород с острова Десепшен.

3. Характеристика выделенных чистых культур микроорганизмов, выделенных из ММВЇ1

В результате проведенных исследований в чистые культуры было выделено 29 штаммов бактерий: 20 штаммов с оптимальной температурой роста 35-40°С, 4 штамма - 65...68°С и 5 штаммов - 15°С. Было определено филогенетическое положение представителей рабочей коллекции с использованием анализа генов 168 рРНК (Таблица 3).

Таблица 3. Культивируемые бактерии, выделенные из мерзлых вулканических пород _острова Десепшен_____

Глубина*, Штамм T0pt ТщІП Tmax Длина**, Таксономическое Сходство,

м п.н. положение *** 16S pPHK%

1.0 D2318 35 25 47 ген 1: 1659 Bacillus cohnii 95.5

ген 2: 1554 Bacillus cohnii 95.3

1.0 D2340R13 37 25 47 1208 Paenibacillus 95.2

pocheonensis

1.0 D2355 68 40 78 1422 Geobacillus 99.2

stearothermophil us

1.5 D4355 68 40 78 1426 Geobacillus 99.2

stearothermophil us

1.7 D444T11 15 0 18 1434 Sporosarcina antarctica 99.6

1.7 G4 5 -5 18 1491 Clostridium bowmanii 99.5

1.7 D4455 65 40 75 1425 Geobacillus 99.9

thermoleovorans

2.1 D634R33 15 4 20 572 Leifsonia rubra 99.4

«Rhodoglobus ruber»

2.1 D6337R13 35 27 47 438 Paenibacillus larvae 82.7

2.1 D6340R123 40 27 47 179 Paenibacillus larvae 74.1

2.1 D6340R127 40 27 47 473 Paenibacillus larvae 82.5

* глубина отбора образца, из которого выделена культура; ** длина секвенированного

фрагмента гена 16S рРНК;

*** ближайшие родственные виды.

3.1 Субтермофильные бактерии.

Исследования микроорганизмов, растущих в диапазоне температур 2547°С, затруднялось нестабильным ростом чистых культур. Для дальнейшей работы были выбраны хорошо растущие штаммы D2318 и D6337R13, с оптимальными температурой роста 35°С и значением pH среды 8.2. Анализ последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК выявил чрезвычайно низкое родство этих штаммов с ближайшими описанными видами Bacillus cohnii и Paenibacillus larvae - 95.5% и 82.7%, соответственно, и, таким образом,

выделенные нами субтермофильные штаммы являются представителями новых таксонов порядка ВасНЫеэ. Помимо того, у штамма Э2318 были обнаружены по 2 различающихся гена 168 рРНК. При этом первая копия гена имела инсерцию длиной примерно в 100 п.н., которая являлась частью I домена 16Б субъединицы. Анализ этой инсерции на вторичные структуры с использованием ресурса Г^АБэШ (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi) показал, что данная вставка образует шпильки, что характерно для фрагментов молекулы рРНК. Вторая копия гена полностью (за исключением одного нуклеотида) была идентична первой, однако имела еще одну инсерцию в 100 п.н. в IV домене 168 субъединицы рРНК. Ген 168 рРНК штамма D6337R13 также содержал инсерцию диной в 25 п.н. в 1 домене, но на другом участке гена. 3.2. Термофильные бактерии рода СеоЬасШт.

Штаммы 02355 и 04455 демонстрировали устойчивый рост при 55-60°С.

Культуры образовывали мелкие непигментированные колонии на поверхности

агара. Клетки штаммов были представлены слабо подвижными палочками с

закругленными концами (Рисунок 7, а) и образовывали споры овальной формы.

Микроскопия ультратонких срезов показала,

что клетки штамма 02355 имеют

грамположительный тип клеточной стенки и на

внешней поверхности клеточной стенки

имеется 8-слой (Рисунок 7 б, в).

Филогенетический анализ

• последовательностей генов 168 рРНК показал,

что выделенные бактерии являются

б цй ¿с к ЖЯКЗЙЗЖ: представителями рода ОеоЬасШгштамм

Рисунок: 7. Ультратонкий срез (а) и

фрагменты ультратонких срезов (б, в) Э2355 наиболее близок к С. клеток штамма ОеоЬасШш эр. 02355.

Обозначения: ЦМ - ягеаготегторпИш (99.2% сходства), а штамм

цитоплазматическая мембрана; КС - ¡34455 клеточная стенка; К - микрокапсула; П

- перегородка в зоне деления клетки. сходства) (Рисунок 8).

к С. (Иегто1еоуогап5 (99.9%

561 Ceobaciilus thermoleovorans DSM 5066T (Z26923) 6eJ Geobacillus sp. D4455 (JQ917459)

Geobacillus kaustophilus DSM 7263т (X60618) I Geobacillus lituanicus DSM 15325T (AY044055) " Geobacillus vulcani OSM 13174T (AJ293805)

i— Geobacillus staarothermophilus DSM 22т (AB021196) Geobacillus sp. D43S5 Geobacillus sp. D2355 (JQ743052)

_Г Geobacillus gargensis DSM 15378T (FR749979)

Ю01 Geobacillus thermocatenulatus DSM 730T (AY60S935)

i— Geobacillus jurassicus DSM 15726T (AY312404) 93 Geobacillus uzenensis DSM 13551T (AF276304)

I-Geobacillus thermodenitrificans DSM 465T (AY608961)

¡5 Geobacillus subterraneus DSM 13552T (AF276306)

I-Gei

•Ч1Г

74 1-t

• Geobacillus pallidus DSM 3670T (Z26930) Geobacillus tepidamans DSM 16325T (AY563003) Geobacillus caldoxylolyiicus DSM 12041T (AF067651) Geobacillus toebii DSM 14590T (AF326278) Geobacillus thermoglucosldasius DSM 2542T (AY60в981) Geobacillus debilis DSM 16016T (AJ564616)

-Caldalhalibacillus thermarum Ha6T (AY753654)

Bacillus sp. D2318.2 (JQ743051) Bacillus sp. D2318.1 (Jq743050)

Bacillus sp. D2340R13

-Bacillus cohnii DSM 6307т (X76437)

-Bacillus horikoshii DSM 8719T (AB043865)

- Bacillus pocheonensis DSM 18135T (NR 041377)

-Paraliobacillus ryukyuensis DSM 15140т (AB087828)

-Paraliobacillus sp. RKVR31 (JX317716)

7вг- Paenibeclllu* ep. D6337R13

_TL Paenibaclllus sp. D6340R123

621— t

£

Paenlbaclllua sp. D6340R127

- Paenibacillus antarcticus LMG 22078T (AJ605292)

- Paenibacillus amylotyticus DSM 11730T (D85396)

— Paenibacillus poiymyxe DSM 36T (016276)

-Paenibacillus lentimorbus ATCCT (AB073199)

-Paenibacillus alkaliterrae DSM 17040T (AY960748)

— Paenibacillus larvae DSM 7030T (AY530294) Paenibacillus aestuarii Cj25T (EU570250) Paenibacillus pocheonensis LMG 23404т (AB245386)

-Paenibacillus ehimensis KCTC3748T (AY116665)

-Paenibacillus koreensis KCTC 2393T (AF130254)

-Escherichia coll DSM 30083т (X80725)

Рисунок 8. Укорененное филогенетическое дерево, показывающее положение термофильных штаммов D2355, D4355, D4455 и субтермофильных D2318, D2340R13, D6337R13, D6340R123, D6340R127 среди представителей порядка Bacillales, полученное с помощью метода «neibour-joining» (Tamura et al. 2011). Для филогенетического анализа использованы типовые штаммы родов Geobacillus, Bacillus, Paenibacillus, Caldalkalibacillus. В скобках показаны номера последовательностей в GenBank. Указаны значения достоверности ветвления (bootstrap test) более 50%. В качестве «внешней группы» использован штамм Е. coli.

Исследование влияния температуры на рост штаммов D2355 и D4455 показало, что бактерии растут в диапазоне температур от 40 до 78°С с оптимумами при 68 и 65°С, соответственно. Сравнение некоторых физиолого-биохимических характеристик антарктических изолятов и представителей ближайших видов выявило, что выделенные штаммы имели одинаковый состав Г+Ц пар в ДНК (51.9 мол.%) с G. thermoleovorans DSM 5366т, но по некоторым фенотипическим свойствам отличались как между собой, так и с близкородственными видами.

Выделенные штаммы D2355 и D4455 термофильных бактерий Geobacillus sp. помещены во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов под номерами ВКМ В-2785 и ВКМ В-2786, соответственно.

3.3 Психрофильные бактерии.

Clostridium sp. G4 Клетки штамма G4, выделенного из проб вулканических мерзлых отложений острова Десепшен (глубина 1.7 м), представляли собой грамположительные подвижные палочки с закругленными концами размером 1.4-1.6x4-8 мкм, часто находящиеся в парах или в цепочках. Штамм рос в диапазоне температур от -5 до +18°С, оптимальной для роста была температура +5°С. Некоторые физиологические характеристики представлены в таблице 4. Выделенный психрофильный штамм G4 Clostridium sp. помещен во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов под номером ВКМ В-2784.

Анализ последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК показал, что данный штамм имеет наибольшее сходство с представителями вида Clostridium bowmanii — 99.5%. С. bowmanii принадлежит кластеру антарктических клостридиальных видов, выделенных из озерных осадков оз. Фрикселл (Рисунок 9) со сходством последовательностей 16S рРНК 98.7-99.5% внутри кластера и близких по составу Г+Ц пар в ДНК (Spring et al. 2003). Различия в фенотипических свойствах нового штамма Clostridium sp. и близкородственных видов (Таблица 4) позволяет предположить, что штамм G4 является представителем нового вида истинных психрофипов, впервые выделенных из ММВП.

99 r Clostridium estertheticum subsp. eslgrthetrcum DSM 8809T (S46734) Clostridium esteriheticum subsp. laramiansa DSM 14864T (AJ506115) - Clostridium lacus/ryxellense DSM 14205' (AJ506118) " Clostridium frigorls DSM 14204T (AJ50S116)

I-Clostridium tagluansa DSM 17763T (DQ296031)

7fl| r Clostridium «p. G4

m'— Clostridium bowmanii DSM 14206r ¡AJ506120)

-Clostridium psychrophllum DSM 14207' (AJ297443)

-Clostridium vincerttli DSM 10228' (X97432)

Рисунок 9. Бескорневое филогенетическое дерево, показывающее положение психрофильного штамма G4 среди представителей рода Clostridium, полученное с помощью метода «neibour-joining» (Tamura et al. 2011). Для филогенетического анализа использованы наиболее близкие типовые штаммы видов данного рода. В скобках показаны номера последовательностей в GenBank. Указаны значения достоверности ветвления (bootstrap test) более 50%.

Таблица 4. Сравнительная характеристика штамма G4 Clostridium sp. и типовых штаммов ближайших видов рода Clostridium.

Clostridium sp. Clostridium Clostridium Clostridium

Характеристика G4 bowmanii estertheticum tagluense

ВКМ В-2784 DSM 14206т* DSM 8809т* DSM 17763т*

Форма и сферические, сферические, эллипсоидные, сферические,

положение споры Т или ST Т или ST Т или С ST

Оптимум рН 6.8-7.2 6.6-7.2 6.5-7.2 6.5-7.2

Оптимум

температуры, °С 5 12-16 6-8 15

Субстраты:

арабиноза - - + -

целлобиоза + - + -

галактоза + + + -

инозитол - - + -

мальтоза + + + +

маннитол - - + -

манноза + + + -

раффиноза - - + -

крахмал + - - +

трегалоза - + + +

ксилан - н.о. + -

Содержание Г+Ц в 32.2 32.0 33.9 31.5

ДНК, мол.%

Обозначения расположения спор: Т - терминальное, ST субтерминальное и С -центральное * (Collins et al. 1992; Spring et al. 2003; Suetin et al. 2009)

Sporosarcina sp. D444T11. Клетки штамма представлены палочками правильной формы, около 0.8-1.0 мкм в ширину и 2.0-4.0 мкм в длину. В старой культуре клетки образовывали сферические эндоспоры (Рисунок 10), расположенные терминально или субтерминально. Оптимальная температура роста составляла 15°С, рост наблюдался в диапазоне от 0 до 18°С. Филогенетический анализ полученной последовательности гена 16S рРНК показал (Рисунок 11), что ближайшими родственниками выделенного штамма являются палочковидные психрофильные спорообразующие бактерии

Sporosarcina antarctica (99.6% сходства) и S. macmurdoensis (98.2% сходства), выделенные из экосистем Антарктиды (Yu et а). 2008; Reddy et al. 2003).

Рисунок 10. Микрофотографии клеток штамма D444T11 Sporosarcina sp., фазовый контраст.

931-Sporosarcina contaminans DSM 22204т (FN298444)

'-Sporosarcina koreensis DSM 16921T (DQ073393)

_j-Sporosarcina thermotolerans DSM 22203T (FN298445)

69'-Sporosarcina saromensis JCM 23205т (AB243859)

-Sporosarcina aquimarina JCM 10887T (AF202056)

-Sporosarcina ureae DSM 2281T (AF202057)

-Sporosarcina psychrophiia DSM 3 15381т (AB680853)

-Sporosarcina macmurdoensis DSM 15428T (AJ514408)

100_|-Sporosarcina sp. D444T11

1МГ- Sporosarcina antarctica JCM 14646T (EF154512)

0,005

Рисунок 11. Бескорневое филогенетическое дерево, показывающее положение психрофильного штамма 0444Т11 среди представителей рода Зрогозагста, полученное с помощью метода «пеЛоиг-ршищ» (Татига е! а1. 2011). Для филогенетического анализа использованы типовые штаммы видов, относящихся к роду 8рогозагс1па.

Rhodoglobus (Leifsonia) sp. D634R33. Клетки штамма D634R33 представлены слегка искривленными палочками размером 0.8 мкм в толщину и 1.0-2.0 мкм в длину. Оптимальная температура роста штамма составляла 15°С, а диапазон роста от 4 до 20°С. По последовательности гена 16S рРНК штамм имел максимальное сходство с видом актинобактерий Leifsonia rubra, описанного ранее (Reddy et al. 2003). Типовой штамм этого вида (штамм CMS 76гт), как и L. аигеа (штамм CMS 81ут), предложенного теми же авторами, был выделен из озерного цианобактериального мата в Сухих Долинах Антарктиды. Позднее вид L. аигеа был реклассифицирован как Rhodoglobus aureus (An et al., 2010, 2011). Уровень сходства генов 16S рРНК штамма D634R33 с типовым штаммом типового вида рода Rhodoglobus (R. vestalii) - 99.0%. Хотя вид L. rubra не был валидно переописан как Rhodoglobus ruber (типовой штамм считался утерянным на момент проведения исследований), очевидно, что вид входит в состав рода Rhodoglobus (Рисунок 13)-также, как и наш штамм D634R33.

Полученный в ходе настоящего исследования штамм имеет максимальное сходство с видами Rhodoglobus aureus - 98.2%, Leifsonia rubra - 99.4% и Rhodoglobus vestalii - 99.0% (Рисунок 13). Являются ли штамм D634R33 представителем нового вида или относится к «Rhodoglobus ruber» покажут дальнейшие таксономические исследования.

ggj Leifsonia naganoensis DSM 15166T (DQ232612)

-Leifsonia aquatica DSM 20146T (D45057)

-Leifsonia xyli subsp. cynodonlis DSM46306T (AB016985)

- Leifsonia poae DSM 15202T (AF116342)

- Leifsonia bigeumensis DSM 19322T (EF466124)

-Leifsonia anlarctica JCM 17020т (AM931710)

-Salinibaclerium xinjiangense JCM 13926T (DQ515964)

- Salinibacferium amurskyense JCM 12362T (AF539697)

-Rhodoglobus(Leifsonia) aureus DSM 15303T (AJ43fi586)

Rhodoglobus sp. D634R33 Leifsonia rubra DSM15304T (AJ438585) -Rhodoglobus vestalii JCM 12695T (AJ459101)

Рисунок 12. Бескорневое филогенетическое дерево (метод «neibour-joining» Tamura et al. 2011), показывающее положение психрофильного штамма D634T33 среди наиболее близких представителей родов Leifsonia, Salinibacterium и Rhodoglobus. В скобках показаны номера последовательностей в GenBank. Указаны значения достоверности ветвления (bootstrap test) более 50%.

3.4 Восстановление серы при высоких температурах

В накопительных культурах сероредуцирующих микроорганизмов (СР) из всех четырех образцов ММВП острова Десепшен при температуре 85°С шло интенсивное восстановление серы, не наблюдавшееся при температурах 50, 60 и 75°С. В результате статистической обработки данных были получены распределения средних значений со стандартной ошибкой для опытов и для отрицательных контрольных экспериментов. Динамика процесса восстановления серы без добавления посевного материала и с добавлением стерильной породы значимо не отличалась. Однако полученные результаты показывали заметное различие скорости образования сульфида в опытах и в контролях (Рисунок 13).

При исследовании культур с Р15Н-зондами было получено подтверждение присутствия

нуклеиновых кислот, меченных РНК зондами. Для определения

филогенетического положения СР была предпринята попытка выделить ДНК из этих микроорганизмов и получить последовательности нуклеотидов гена 16Б рРНК. Приведенные в главе

Динамика образования н;3 при 35 "С

16

§

5 "

-»- Опыты при 85'С ■ о Холостые опыты

54 60 66 72

0 6 12 18 24 30 36 42 Время, часы

Рисунок 13. Образование сульфида в сероредуцирующих накопительных «Методы» способы экстрагирования

культурах при 85°С

нуклеиновых кислот результата не дали, тогда как контрольные эксперименты с культурами бактерий и архей, в том числе и гипертермофильных, проходили без затруднений. Не смотря на то, что с использованием известных методов нам не удалось выделить ДНК и идентифицировать микроорганизмы, проведенные эксперименты дают основания считать, что обнаруженный процесс имеет биологическую природу.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе было проведено исследование микроорганизмов двух схожих по происхождению экосистем. Исследованные породы камчатских вулканов, так же как и породы о. Десепшен, имеют вулканическое происхождение и в настоящий момент находятся в мерзлом состоянии.

Проведенные исследования показали, что общая численность микроорганизмов, населяющих мерзлые вулканические породы, крайне низка и составляет не более 8.3х104кл/г породы, а численность культивируемых бактерий достигает 4.3x104 КОЕ/г. Таким образом, доля культивируемых бактерий в некоторых образцах составляла около 50% от общей численности, что не типично для природных образцов, в которых численность культивируемых микроорганизмов обычно не превышает 1% (УогоЬуоуа е1 а1 1997).

По всей толще мерзлых пород в скважине 10/04 (вулкан Безымянный, Камчатка) доминировали психрофильные и мезофильные микроорганизмы, а термофильные представители встречались только в верхней половине исследованной толщи мерзлых пород. Почти во всех исследованных образцах скважины 7/02 (вулкан Толбачик, Камчатка) преобладали психрофильные бактерии, но также присутствовали термофильные и субтермофильные.

Во всех исследованных образцах острова Десепшен была обнаружена лишь незначительная численность мезофильных аэробных бактерий, в то время как субтермофильные бактерии, имеющие оптимум роста около 35-37°С и не растущие при температуре ниже 25°С, являлись доминирующими микроорганизмами в двух из четырех исследованных образцах. Следует отметить, что во всех исследованных образцах были обнаружены истинные термофильные бактерии, растущие в диапазоне температур 45-75°С. Помимо этого значительную часть культивируемой части аэробного микробного сообщества в образцах, отобранных с глубин 1.7 и 2.1 м, составляют психрофильные бактерии. В некоторых образцах истинно термофильные

бактерии являются доминирующей группой (до 100%), хотя общая численность культивируемых бактерий в них крайне низка. Это может свидетельствовать о том, что микробное сообщество представлено исключительно микроорганизмами, занесенными из воздуха в процессе выпадения пеплов и пирокластического материала, а также с атмосферными осадками.

Тот факт, что не наблюдалась активность аэробных бактерий при температуре 20-25°С, может объясняться участием в формировании микробного сообщества ММВП двух источников, характеризующихся высоким биоразнообразием: морской воды, окружающей остров, где температура колеблется от -3 до +5°С и геотермальных систем о. Десепшен. Бактерии Sporosarclna sp. и Leifsonia sp. ранее были обнаружены в озёрной воде и в почвах на островах в полярных широтах (Reddy, Prakash et al. 2003; Yu, Xin et al. 2008). С другой стороны, термофильные представители родов Geobacillus, Bacillus и Brevibacterium ранее были обнаружены в фумаролах острова Десепшен (Muñoz et al. 2011).

Другим возможным объяснением этого явления может служить особенности криоконсервации каждой из этих групп микроорганизмов и их физиологическим статусов в мерзлых породах. Так психрофильные микроорганизмы могут сохранять некоторую физиологическую активность при отрицательной температуре, достаточную для поддержания жизнеспособности. В то же время термофильные и субтермофильные не проявляют никакой активности. Чрезвычайно низкая численность мезофильных бактерий, возможно, связана с тем, что температура мерзлых пород недостаточно низкая для полной остановки биохимических реакция в клетках, но и недостаточна для поддержания жизнеспособности. То есть в клетках накапливаются промежуточные продукты реакций, что приводит к нарушению баланса веществ и смерти клеток. Среди термотолерантных бактерий, обнаруженных в исследуемых породах, были выделены и частично охарактеризованы представители семейств Bacillaceae и Paenibacillaceae.

Выделенные штаммы D6337R13, D6340R123 и D6340R127 имели невысокий уровень сходства последовательностей 16S рРНК с ближайшим описанным видом Paembacillus larvae (около 85%} Исходя из этого, все выделенные нами штаммы Paenibacillus sp. будут, вероятно, описаны как таксоны надвидового уровня.

В вулканических породах Камчатских вулканов выявлены термофильные органотрофные, сульфат- и железовосстанавливающие анаэробные бактерии и метанобразующие археи. Анализ метаногенных накопительных культур из образца 7/02-12.2 показал, что эти культуры способны образовывать метан при температурах 6, 55 и 75°С, в то время как при температуре 37°С метан практически не образовывался. При исследовании анаэробных микробных сообществ в образцах ММВП о. Десепшен было установлено, что их численность сопоставима с численностью анаэробов в камчатских образцах. Однако, анаэробные микроорганизмы, способные расти на среде для гетеротрофных бродилыциков при температуре 75°С, обнаружены не были.

В ходе настоящего исследования обнаружены свидетельства естественной криоконсервации термофильных и гипертермофильных микроорганизмов. Однако, описанные в литературе и применяющиеся в международных коллекциях микроорганизмов методы криоконсервации культур таких микроорганизмов (Connaris et al. 1991; Sakane et al. 1992; Halik 1999; Spring 2006}, показывают снижение титра жизнеспособных клеток при хранении в замороженном состоянии. Отчасти это происходит из-за повреждений, вызванных ростом кристаллов льда внутри клеток микроорганизмов в процессе замораживания или со временем при перекристаллизации льда. Наиболее эффективно хранение таких микроорганизмов в лаборатории при температуре -80°С, что, возможно, связано с высокой скоростью замерзания цитоплазмы. Это снижает вероятность образования в цитоплазме клеток крупных кристаллов льда, способных повредить клеточные структуры.

Явление естественной криокоисервации в исследованных мерзлых породах, возможно, связано с относительно высокой температурой мерзлых пород (-7...-ГС) тогда как кристаллизация льда внутри цитоплазмы происходит при значительно более низкой температуре: -18°С (Russell et al. 1990). Однако это только одно из возможных объяснений явления сохранения термофильных микроорганизмов в многолетнемерзлых породах и исследование более широкого спектра таких пород значительно более холодных территорий Антарктиды должно прояснить этот вопрос.

Вопрос о возможности обнаружения жизни на Марсе давно интригует ученых. Сегодня поверхность Марса подвергается воздействию столь жестких условий, что существование живых организмов на поверхности планеты маловероятно. Геологическая история Марса свидетельствует о процессах активного вулканизма в прошлом. Отдельные группы полярных марсианских вулканов по оценкам могут иметь возраст всего 1-20 млн. лет. Продукты извержения таких вулканов находятся в мерзлом состоянии и могут являться местами обитания, аналогичными многолетнемерзлым породам Земли. Возраст самых молодых мерзлых отложений Марса сравним с возрастом самых древних мерзлых пород Антарктиды (до 30 -35 млн. лет).

Данная работа является первым микробиологическим исследованием ММВП и рассматривает более молодые мерзлые отложения возрастом от нескольких десятков и сотен до тысяч лет. Обнаружение термофильных микроорганизмов в этих мерзлых породах является первым шагом на пути исследования более древних мерзлых вулканических пород Земли.

ВЫВОДЫ

1) Впервые исследованы культивируемые микроорганизмы многолетнемерзлых вулканогенных пород (ММВП) возрастом до нескольких тысяч лет. Установлено, что в таких породах микроорганизмы всех исследованных температурных групп способны сохранять жизнеспособность.

2) Результаты изучения и анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК генов и фенотипических характеристик у бактерий из многолетнемерзлых вулканогенных пород острова Десепшен, показали, что:

отдельные выделенные субтермофильные штаммы являются представителями двух новых родов семейства Bacillaceae, наиболее близких к Paenibacillus sp. (штаммы D2340R13, D6337R13, D6340R123 и D6340R127) и Bacillus sp. (штамм D2318);

- другие изученные спорообразующие штаммы входят в состав родов Geobacillus (термофильные штаммы), а также Sporosarcina и Clostridium (психрофильные), и, вероятно, могут быть отнесены к новым видам.

- психрофильный штамм D634R33 (Actinobacteria, сем. Microbacteraceae) филогенетически близок к видам рода Rhodoglobus, впервые обнаруженным в Антарктиде, и может относиться к «Rhodoglobus ruber» или новому виду этого рода.

3) Получены и исследованы накопительные культуры анаэробных гипертермофильных микроорганизмов из ММВП камчатских вулканов, осуществляющие сульфатредукцию, метаногенез или ацетогенез при температуре 75°С. Из ММВП острова Десепшен получены накопительные культуры, восстанавливающие серу при температуре выше 80°С.

4) Впервые показано, что в мерзлых вулканических отложениях термофильные микроорганизмы сохраняются длительное время, от нескольких десятков и сотен до нескольких тысяч лет. Проведенные исследования позволили разработать методические подходы для дальнейшего изучения подобных экосистем различной географической локализации и возраста.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Миронов В.А., Щербакова В.А., Ривкина Е.М., Гиличинский Д.А. Термофильные бактерии рода Geobacillus из многолетнемерзлых вулканических отложений. //Микробиология, 2013, Т.82 №3 С. 372-375.

2. Демидов Н.Э., Гиличинский ДА., Миронов В.А., Шмакова Л.А. Криобиосфера Земли и поиск жизни на Марсе. // Криосфера Земли, 2012, Т. 16 №4 С. 67-82.

3. Абрамов А.А., Слеттен Р.С., Ривкина Е.М., Миронов В.А., Гиличинский Д.А. Геокриологические условия Антарктиды. // Криосфера Земли, 2011, Т15 №3 С. 3-19.

4. Абрамов А.А., Миронов В.А., Лупачев А.В., Федоров-Давыдов Д.Г., Горячкин С.В., Мергелов Н.С., Иващенко А.И., Лукин В.В., Гиличинский Д.А. Геокриологические условия Антарктических оазисов. Полярная криосфера и воды суши, М.: Paulsen, 2011, с. 233-241.

5. Миронов В.А. Термофильные микроорганизмы в мерзлых вулканических породах и перспективы поиска жизни на Марсе. // I Всероссийская Школа-Конференция по Астробиологии «Астробиология: от Происхождения Жизни на Земле к Жизни во Вселенной», Пущино, 2012.

6. Федоров-Давыдов Д.Г., Зазовская Э.П., Седов С.Н., Дергачева М.И., Кривушин К.В., Миронов В.А. Условия почвообразования и разнообразие почв в оазисе Ширмахера (Восточная Антарктида). // Материалы докладов VI съезда Общества почвоведов им. В.В. Докучаева, всероссийской с международным участием научной конференции "Почвы России: современное состояние, перспективы изучения и использования". Петрозаводск, 2012. т. 1, с.224-225.

7. Mironov, V.A. Thermophilic microbial communities in volcanic permafrost // Sao Paulo Advanced School of Astrobiology - SPAS A 2011, San Paulo, Brazil, 2011

8. Миронов В.А. Биоразнообразие микроорганизмов многолетнемерзлых вулканических отложений острова Десепшн (Антарктида). // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2011», Москва, МГУ, 2011.

9. Gilichinsky D.A., Rivkina Е.М., Vishnivetskaya T.V., Felipe G., Mironov V.A., Blarney J., Ramos M., de Pablo M.A., Castro M., Boehmwald F. Habitability of Mars: hyperthermophiles in permafrost. // 38th COSPAR Scientific Assembly. Held 18-15 July 2010, Bremen, Germany. 2010.

10.Kurapova A.I., Zenova G.M., Mironov V.A. Periodically warmed up soils of Mongolia and Russia as a bank of thermophilic and thermotolerant actinomycetes. // Young Systematists' Forum, London, UK. 2010.

11.Mironov V.A., Rivkina E.M., Vishnivetskaya T.A., Shcherbakova V.A., Gilichinsky D.A. Thermophilic Life Inside the Permafrost. // LPI Contributions, V.1538 p.5507, AbSciCon 2010, Legue City, TX, USA, 2010.

Подписано в печать:

05.07.2013

Заказ № 8619 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Объем: 1,5усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Миронов, Василий Андреевич, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ

ПОЧВОВЕДЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИФХиБПП РАН)

На правах рукописи

04201361051

МИРОНОВ Василий Андреевич

Микроорганизмы вулканогенных многолетнемёрзлых отложений

03.02.03 - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: д.г-м.н.

Давид Абрамович Гиличинский

научный консультант: к.б.н. Виктория Артуровна Щербакова

Пущине - 2013

Оглавление

Список сокращений........................................................................................................................................................................5

Введение................................................................................................................................................................................................................6

Обзор литературы..............................................................................................................................................................................11

Глава 1. Криосфера Земли. Вулканы в криолитозоне............................................................11

Глава 2. Криобиосфера Земли..........................................................................................................................................15

2.1 Микроорганизмы в ледниках........................................................................................................................15

2.2 Микроорганизмы в многолетнемёрзлых породах........................... 16

Глава 3. Микробные сообщества геотермальных экосистем....................................22

Глава 4. Первичное заселение вулканических отложений............................................27

Глава 5. Геотермальные экосистемы и криобиосфера Земли.

Астробиологический аспект..................................................................................................................31

Глава 6. Объекты и методы исследований................................................................................................34

6.1 Характеристика районов исследования......................................................................................34

6.1.1 Вулканы полуострова Камчатка....................................................................................................34

6.1.2 Остров Десепшен, Антарктида........................................................................................................36

6.2. Характеристика объектов исследования................................................................................38

6.2.1 Мёрзлые отложения вулканов п-ова Камчатка....................................................38

6.2.2 Мёрзлые вулканические отложения острова Десепшен, Антарктида................................................................................................................................................................................39

6.2.3 Чистые и накопительные культуры микроорганизмов..........................40

6.3 Аналитические методы исследования..........................................................................................40

6.3.1 Измерение содержания метана........................................................................................................40

6.3.2.Определение содержания углерода........................................................................................41

6.3.3 Определение содержания органического углерода....................................41

6.3.4 Определение содержания сульфида......................................................................................41

6.3.5 Определение содержания Бе2+..........................................................................................................42

6.3.6 Изучение ионного состава водной вытяжки............................................................42

6.3.7 Мониторинг температуры мёрзлых пород..................................................................42

6.4 Микробиологические методы......................................................................................................................43

6.4.1 Среды и условия культивирования................................................................................43

6.4.2 Учет численности микроорганизмов....................................................................................45

6.4.3 Микроскопические методы исследования..................................................................47

6.4.4 Определение параметров роста......................................................................................................47

6.4.5 Изучение культуральных и физиолого-биохимических

свойств....................................................................................................................................................................................48

6.5 Молекулярно-генетические методы..................................................................................................48

6.5.1 Выделение ДНК........................................................................................................................................................48

6.5.2 Определение Г+Ц состава ДНК....................................................................................................50

6.5.3 ПЦР................................................................................................................................................................................................50

6.5.4 Конструирование библиотеки клонов гена 16S рРНК............................50

6.5.5 Метод ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction

Analysis)................................................................................................................................................................................51

6.5.6 Филогенетический анализ......................................................................................................................51

6.5.7 Метод FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)....................................................52

Результаты........................................................................................................................................................................................................53

Глава 7. Микробиологический анализ мёрзлых вулканических пород

Камчатки..................................................................................................................................................................................53

7.1 Физико-химические характеристики исследуемых образцов..............53

7.2 Анализ культивируемых микроорганизмов сообщества мёрзлых вулканических отложений Ключевской группы вулканов........................55

Глава 8. Микробиологический анализ мёрзлых вулканических пород

острова Десепшен....................................................................................................................................................62

8.1 Физико-химические характеристики исследуемых мёрзлых

пород....................................................................................................................................................................................................62

8.1.1 Методика стерильного отбора мёрзлых пород в

лаборатории..................................................................................................................................................................64

8.2 Анализ культивируемых микроорганизмов сообщества мёрзлых

вулканических пород острова Десепшен....................................................................................66

Глава 9. Характеристика микроорганизмов, выделенных из

многолетнемёрзлых вулканических пород..................................................................71

9.1 Культивируемые бактерии................................................................................................................................71

9.1.1 Субтермофильные бактерии................................................................................................................73

9.1.2 Термофильные бактерии рода Geobacillus..................................................................76

9.1.3 Психрофильные бактерии........................................................................................................................81

9.2 Сероредуцирующие микроорганизмы. Восстановление серы

при сверхвысоких температурах..............................................................................................................87

Глава 10. Обсуждение..................................................................................................................................................................92

Выводы..................................................................................................................................................................................................................108

Список литературы........................................................................................................................................................................109

Список сокращений

ММП - многолетнемёрзлые породы

ММВП - многолетнемёрзлые вулканические породы

в.д. - восточной долготы

з.д. - западной долготы

с.ш. - северной широты

ю.ш. - южной широты

тыс. лет - тысяч лет

млн. лет - миллионов лет

млрд. лет - миллиардов лет

кл./г. - клеток на грамм

КОЕ/г - колоний образующих единиц на грамм

УКБ - установка колонкового бурения

ВКМ - Всероссийская коллекция микроорганизмов

TSA - Tryptic soy agar

R2A - Reasoner's 2A agar (ангар Ризонера)

атм. - атмосфера

FISH - fluorescent in situ hybridization

SDS (ДСН) - Додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate)

EDTA - Этилендиаминтетрауксусная кислота (EthyleneDiamineTetraacetic Acid)

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis

CP - серо-редукторы

«Берегите себя»

(Гиличинский Д. А.)

Введение

Актуальность проблемы. Последние несколько десятилетий ведутся работы по изучению сообществ микроорганизмов мёрзлых осадочных отложений. Многими исследователями получены убедительные доказательства сохранения жизнеспособных микроорганизмов в вечной мерзлоте в течение геологического времени [1-4]. Из проб вечномёрзлых грунтов были выделены чистые культуры актиномицетов [5, 6], нитрифицирующих бактерий [7], метанотрофов [8], сульфатредукторов [9], зелёных одноклеточных водорослей и цианобактерий [10], метаногенных архей [11-13]. Эукариоты, обнаруженные в многолетнемёрзлых отложениях Арктики и Антарктиды, представлены дрожжами [14, 15], мицелиальными грибами [16, 17], зелёными водорослями [10] и простейшими [18, 19]. Хотя такие микроорганизмы находятся в мёрзлых породах в условиях, не предполагающих активного метаболизма и размножения на протяжении промежутков времени до нескольких миллионов лет [4], многие изоляты и смешанные популяции в лабораторных условиях проявляли метаболическую активность при отрицательных температурах [8, 20-22].

В последнее десятилетие внимание исследователей привлекает высокогорная мерзлота [23, 24], в том числе и вулканического происхождения, как место обитания экстремофильных микроорганизмов. Многие активные вулканы расположены в зоне распространения вечномёрзлых пород. Многолетнемёрзлые породы обнаружены на вулканах Камчатки (Россия) [25], Исландии [26], на вулканах Десепшен и Эребус на Антарктическом континенте и прилегающих островах, а также на вулканах Гавайских о-вов (США) [27] и Японии [28].

Микробиологические исследования ассоциированных с вулканами термальных мест обитания, таких как фумаролы, горячие источники, гейзеры и

сольфатары [29-31] показали, что сообщества термальных мест обитания могут быть изолированы от внешней среды и существовать автономно. Некоторые микроорганизмы, обитающие в подобных экосистемах, способны питаться автотрофно и получать энергию за счет окислительно-восстановительных реакций [32] при температуре до 122°С [33].

В тех регионах, где активный вулканизм и геотермальная активность проявляются в зоне распространения многолетней мерзлоты, образуются условия для консервации микроорганизмов термальных источников и фумарол в окружающих мёрзлых породах. Такие условия должны возникать либо при прекращении геотермальной активности и переходе геотермальных экосистем в многолетнемёрзлое состояние, либо, если микроорганизмы попадают за пределы геотермальных оазисов, в ходе извержений или фумарольной активности. Систематических исследований биоразнообразия микроорганизмов в таких зонах не проводилось.

На протяжении десятилетий в ходе многочисленных исследований мёрзлых пород Арктики и Антарктиды, не ассоциированных с вулканизмом, гипертермофильные микроорганизмы в них не обнаруживались, а термофильные обнаруживались только как минорная составляющая сообществ [34, 35].

Остается открытым вопрос о возможности и длительности сохранения термофильных и гипертермофильных микроорганизмов в мерзлоте, а также о механизмах их переноса в мёрзлые породы.

Этот вопрос имеет большое значение как с точки зрения изучения вулканогенных термофильных сообществ в исторической ретроспективе, так и для астробиологических исследований. Можно предположить, что, если живые организмы за счет вулканической активности могут быть транспортированы из недр на поверхность и сохраняться геологически значимое время, то следы живых организмов на Марсе и других планетах криогенного типа также следует искать в мёрзлых вулканических отложениях.

Цель работы. Целью настоящего исследования было изучение жизнеспособных микроорганизмов, сохранившихся в многолетнемерзлых вулканогенных отложениях п-ова Камчатка и острова Десепшен, Антарктида. Задачи:

1. Определение общей численности микроорганизмов и численности представителей различных температурных групп, сохранивших жизнеспособность в многолетнемерзлых вулканогенных породах (ММВП).

2. Выделение чистых культур аэробных и анаэробных микроорганизмов из ММВП, изучение их физиолого-биохимических свойств, определение таксономического положения.

3. Выявление в многолетнемерзлых вулканогенных породах жизнеспособных термофильных микроорганизмов.

4. Сравнительный анализ состава микроорганизмов, сохранившихся в многолетнемерзлых вулканогенных породах и окружающих экосистемах.

Научная новизна. В работе впервые исследованы микроорганизмы многолетнемерзлых вулканических отложений п-ова Камчатка и о. Десепшен. Показано, что изученные мерзлые породы содержат жизнеспособные микроорганизмы, среди которых преобладают бактерии с повышенной оптимальной температурой роста, не способные расти при комнатной температуре. Из многолетнемерзлых вулканических пород острова Десепшен выделены и исследованы чистые культуры психрофильной, субтермофильной, и термофильной групп микроорганизмов, представляющие роды Bacillus, Paenibacillus, Geobacillus, Sporosarcina, Rhodoglobus (Leifsonia) и Clostridium.

Впервые в вулканических мерзлых породах наблюдался процесс микробиологической сероредукции при температурах выше 80°С.

Результаты настоящей работы дают основания предполагать, что явление сохранения термофильных и гипертермофильных микроорганизмов в мёрзлых породах имеет закономерный характер.

Практическая значимость. Обнаруженное в настоящей работе явление -сохранение термофильных и гипертермофильных микроорганизмов в мёрзлых породах, может быть использовано для усовершенствования методик криоконсервации культур таких микроорганизмов в коллекциях.

Данная работа является первым этапом изучения вулканогенных термальных сообществ в исторической ретроспективе, горизонты которой определяются временем непрерывного существования вечной мерзлоты (до 30-35 млн. лет).

Многолетнемёрзлые породы Земли с законсервированными в них термофильными и гипертермофильными микроорганизмами являются астробиологической моделью планет и спутников криогенного типа с вулканической активностью в настоящем или прошлом, например, таких как Марс.

Большое значение имеет также биотехнологический потенциал обнаруженных в мёрзлых породах микроорганизмов. Термофильные микроорганизмы могут являться продуцентами термостабильных ферментов, используемых в промышленности и медицине. Выделенные культуры помещены в Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) и доступны для дальнейших исследований разными специалистами.

Усовершенствованная методика отбора проб для микробиологического анализа может быть использована для работы с мерзлыми породами или льдами, характеризующимися крайне низкой численностью микроорганизмов.

Апробация работы. Результаты исследований, полученные в ходе работы, были доложены на нескольких Российских и международных конференциях: Astrobiology Science Conference 2010 (AbSciCon2010), Хьюстон, США; Young Systematists' Forum 2010 Лондон, Великобритания; 38л COSPAR Scientific Assembly 2011, Бремен, Германия; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2011», Москва, Россия; Астробиологическая школа в Сан Пауло (SPASA 2011), Бразилия; 1-я Всероссийская научная школа-конференция по астробиологии «Астробиология: от происхождения жизни на Земле к жизни во Вселенной», Пущино, Россия, 2012.

Место выполнения работы и благодарность

Работа выполнялась в лаборатории криологии почв Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (ИФХиБПП РАН), и в лаборатории анаэробных микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ РАН). Автор выражает искреннюю благодарность зав. лаб. Криологии почв ИФХиБПП РАН к.г-м.н Ривкиной Елизавете Михайловне и зав. лаб. Анаэробных микроорганизмов ИБФМ им. Скрябина к.б.н. Щербаковой Виктории Артуровне за помощь в планировании экспериментов, за плодотворное сотрудничество и за конструктивную критику при написании диссертации. Отдельную благодарность хотелось бы выразить тем, кто помогал проводить ряд анализов, без которых диссертация была бы не полной: к.б.н. Сузиной Наталье Егоровне (ИБФМ им. Г.К. Скрябина, г. Пущино) - за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований; к.б.н. Переваловой Анне Александровне (ИНМИ им. С.Н. Виноградского) - за помощь в проведении микроскопии с FISH-зондами; к.б.н. Арискиной Елене Викторовне (ИБФМ им. Г.К. Скрябина, г. Пущино) за помощь в определении Г+Ц состава в ДНК; к.б.н. Булату Сергею Алексеевичу (ПИЯФ им. Б.П.Константинова, Санкт-Петербург), к.б.н. Вишневецкой Татьяне Александровне (Центр микробной экологии Мичигана, США), Гусеву Олегу Александровичу (Университет Цукубы, Япония) за помощь в выделении ДНК гипертермофильного сероредуцирующего микроорганизма. Автор признателен исследователям гипертермофильных микроорганизмов Карлу Отто Штеттеру (Karl Otto Stetter, Университет Регенсбурга, Германия) и Дженни Блэмэй (Jenny М. Blamey, «Fundación Biociencia» Сантьяго, Чили) за полезные рекомендации и критику. Спасибо сотрудникам лабораторий Криологии почв ИФХиБПП РАН и лаборатории Анаэробных микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина за плодотворные и интересные дискуссии, помощь в освоении новых методов, получении и интерпретации результатов экспериментов. Автор выражает благодарность Зое Цыганковой, приложившей немало сил в получении первых результатов по образцам ММВП камчатских вулканов.

Автор выражает искреннюю благодарность безвременно ушедшему научному руководителю и ид