Горизонтальный перенос генов устойчивости к соединениям ртути и антибиотикам в природных популяциях палеобактерий

Петрова, Майя Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Горизонтальный перенос генов устойчивости к соединениям ртути и антибиотикам в природных популяциях палеобактерий
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Горизонтальный перенос генов устойчивости к соединениям ртути и антибиотикам в природных популяциях палеобактерий"

На правах рукописи

005051944

ПЕТРОВА МАЙЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К СОЕДИНЕНИЯМ РТУТИ И АНТИБИОТИКАМ В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ПАЛЕОБАКТЕРИЙ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

18 АПР 2013

Москва - 2013

005051944

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук, г. Москва.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор биологических наук Миндлин Софья Захаровна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Смирнов Георгий Борисович д.б.н., чл.-корр. РАМН; профессор,

главный научный сотрудник ФГБУ Институт физико-химической медицины ФМБА

Прозоров Александр Александрович д.б.н., профессор,

главный научный сотрудник ФГБУ науки Институт общей генетики им..Н.И. Вавилова РАН

Хмель Инесса Александровна д.б.н., профессор,

зав. лабораторией ' ' ФГБУ науки Институт молекулярной генетики РАН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится "14" марта 2013 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан "/У" 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совет; кандидат биологических наук I

Т. А. Синельщикова

Посвящается светлой памяти Д.А. Гияичинского

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Результаты многочисленных исследований полных геномов прокариот и эукариот свидетельствуют о существовании горизонтального переноса генов между разными видами и даже царствами живых организмов, В . связи с этим механизмы эволюции предстают в совершенно ином свете. Биосфера теперь представляется единой информационной средой, в которой вирусы и другие мобильные элементы распространяют генетическую информацию. Особенно активно горизонтальный перенос происходит у прокариот. Получается, что любое "удачное изобретение" одного из видов бактерий становится доступным и может быть заимствовано всеми остальными, что позволяет им быстро адаптироваться к самым различным изменениям и неблагоприятным воздействиям внешней среды. Неприятными для человека последствиями такой способности бактерий являются возникновение новых патогенных штаммов у ранее непатогенных бактерий, а также быстрое распространение множественной устойчивости к антибиотикам среди клинических штаммов, что создает проблемы для медицины и вызывает уже сильную тревогу в связи с неэффективностью дальнейшего использования антибиотиков в лечебных целях (Gillings & Stokes, 2012; Millar, 2012).

Исследования механизмов горизонтального переноса и, в частности, механизмов возникновения и распространения множественной лекарственной устойчивости активно ведутся во многих лабораториях мира. Вопрос о масштабах и механизмах горизонтального переноса генов в природных популяциях представляет не только большой научный интерес с точки зрения исследования механизмов эволюции геномов бактерий, но имеет и прикладное значение в связи с необходимостью оценки риска интродукции бактерий, созданных методами генной инженерии, в природные экосистемы. Несмотря на огромное количество работ, выполненных по этой теме, интерес к таким исследованиям не снижается. Следует отметить, что все современные теории, касающиеся происхождения как самих генов устойчивости к антибиотикам, так и мобильных элементов, участвующих в их горизонтальном переносе, в основном базируются на изучении клинических бактерий, которые живут в условиях сильного искусственного селективного давления, вызванного применением лекарственных препаратов. Несомненно, что для их подтверждения необходимо изучение природных бактерий. Но таких работ крайне мало. К тому же, по мнению самих исследователей, в этих случаях нельзя исключить возможности вторичного занесения детерминант устойчивости, например из больниц или фермерских хозяйств, что не позволяет делать однозначных выводов из этих исследований (D'Costa et al., 2006). Очевидно одно, что проблема антибиотикорезистентности среди клинически значимых микроорганизмов уходит своими корнями в сложные экологические и эволюционные отношения между самими микроорганизмами, сложившиеся задолго до появления человека как биологического вида.

обнаруживается сравнительно небольшое число одних и тех же типов ртутных транспозонов и тег-оперонов, составляющих общин генофонд различных групп грамотрицательных бактерий на всей планете. В связи с этими данными возник вопрос: не является ли такое доминирование небольшого числа детерминант устойчивости в природных микробоценозах следствием антропогенного загрязнения биосферы. С другой стороны, гены устойчивости к ртути и антибиотикам часто входят в состав одних и тех же R-плазмид и транспозонов, преимущественно из подгруппы Тп21 (Liebert et а!., 1999), причем такие транспозоны обнаруживаются не только в клинике, но и в природе. Из всего вышесказанного становится очевидным, что для разрешения всех вопросов, связанных с возникновением, эволюцией и распространением детерминант устойчивости как к ртути, так и к антибиотикам, необходимо исследовать бактерии из экосистем, никогда не подвергавшиеся антропогенному воздействию. Уникальную возможность для изучения всего комплекса проблем, связанных с происхождением детерминант устойчивости и механизмами их переноса у природных штаммов, предоставляют бактериальные сообщества из многолетнемерзлых отложений. К настоящему времени показано, что микробные сообщества, законсервированные естественным путем в толще мерзлых пород, способны сохранять жизнеспособность в течение тысяч и даже миллионов лет (Vorobyova et al., 1997). Часто в многолетнемерзлых грунтах содержание жизнеспособных бактерий не намного меньше, чем в современных тундровых почвах. Однако, несмотря на принципиальную значимость исследований устойчивых штаммов микроорганизмов из мерзлоты, до самого последнего времени их изучению почти не уделяли внимания. Были опубликованы только отдельные работы, свидетельствующие о присутствии устойчивых к антибиотикам штаммов среди бактерий, выделенных из мерзлых осадков (Tiedje et al., 1994; Ponder et al., 2005). Однако каких-либо систематических исследований с целью сравнительного изучения детерминант устойчивости древних и современных бактерий до последнего времени не проводилось.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было сравнительное изучение детерминант устойчивости к ртути и антибиотикам древних (выделенных из многолетнемерзлых грунтов) и современных бактерий. В задачи данного исследования входило:

1. Выделить устойчивые к ртути и антибиотикам древние бактерии из образцов многолетнемерзлых отложений, дать их первичную характеристику и создать коллекцию штаммов палеобактерий.

2. Идентифицировать у штаммов из мерзлотной коллекции известные гены устойчивости к ртути и антибиотикам и несущие их транспозоны.

3. Выявить плазмиды, содержащие гены устойчивости к ртути и антибиотикам у штаммов палеобактерий.

4. Выделить активные транспозоны, содержащие гены устойчивости к ртути и антибиотикам из штаммов древних бактерий и охарактеризовать их.

5. Определить молекулярно-генетическую структуру ранее неизвестных транспозонов, обнаруженных у древних бактерий, и изучить их распространение.

6. Провести сравй^тельный анализ молекулярно-генетической структуры транспозонов древних й современных бактерий.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые была создана и охарактеризована коллекция устойчивых к ртути и антибиотикам бактерий из многолетнемерзлых отложений. Штаммы из созданной коллекции используются в фундаментальных научных исследованиях не только в нашей лаборатории, но и в других российских' и зарубежных научных коллективах (например ММоск й а1., 2001; АгЬа1Бку е1 а1., 2010 и др.). В настоящей работе показано значительное разнообразие1 детерминант устойчивости, содержащихся у штаммов этой коллекции. У древних бактерий обнаружены транспозоны, в'ысокогомологичные широко распространённым современным природным транспозонам. В то же время у древних бактерий выявлены ранее неизвестные мобильные элементы. Так, впервые обнаружен и исследован простой транспозон, содержащий тег-оперон, названный ' 7п5060, близкородственный гипотетическому предку сложного транспозона множественной лекарственной устойчивости Тп21, широко распространенного среди современных, в том числе и клинических, штаммов бактерий. Одновременно с ним в мерзлоте в составе ранее неизвестного комплексного транспозона Тп5045 обнаружен интегрон 1пС*, родственный1 гипотетическому предшественнику подгруппы современных интегронов 1п2-1п5, активно участвующих в распространении множественной лекарственной устойчивости. Транспозон Тп5060 и интегрон 1пС* явиляются недостающими до этого звеньями в схемах происхождения и эволюции комплексных транспозонов множественной лекарственной устойчивости и содержащихся у них интегронов. Также нами обнаружен и охарактеризован ранее неизвестный ртутный транспозон Тп5042, транспозиционный модуль которого принадлежит к 1Б элементам. Показано, что Тп5042 является еще одним, ранее неизвестным, типом ртутных транспозонов, активно участвующих в горизонтальном переносе генов шег-оперона как среди древних, так и среди современных штаммов природных бактерий. В мерзлоте также обнаружен необычный по ряду свойств 18-элемент, \SPpyl, обладающий способностью к мобилизации- с высокой частотой прилежащих к нему генов устойчивости к антибиотикам' посредством одноконцевой транспозиции или путем формирования новых составных транспозонов. Результаты изучения Тп5042 и \SPpyl вносят существенный вклад в понимание роли ^-элементов в распространении различных детерминант устойчивости. Полученные данные свидетельствуют 'о том, * Что широко распространенные среди современных природных штаммов бактерий детерминанты устойчивости возникли и перемещались задолго до начала антропогенного загрязнения биосферы.

В целом полученные ¿-ходе данного исследования новые научные данные значительно- дополняют'' и уточняют существующие представления о происхождении и эволюции различных типов детерминант устойчивости и путях их распространения. Результаты работы могут быть использованы при составлении курсов лекций для студентов высших ' учебных заведений, обучающихся по' специальностям в области общей генетики, молекулярной генетики и медицины. '

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 3 и 5 съездах ВОГиС (Москва, 2004 г. и 2009 г.); VI Международной научной конференции «Экология человека и природа» (Москва-Плес, 2004 г.); Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию, со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва-Пущино, 2006 г.); II Международной конференции «Биосфера: присхождение и эволюция (Греция, 2007 г.); II Международной конференции BioMicroWorld2007 (Испания, 2007 г.); XX. Международном генетическом конгрессе (Германия, 2008 г.); двустороннем франко-российском семинаре «Транскрипция - от основных механизмов к разработке лекарств" (Франция, 2009 г.); X европейском конгрессе по астробиологии (Пущино, 2010 г.).

Публикации. По результатам работы было опубликовано 16 статей в рецензируемых научных изданиях, 4 главы в тематических сборниках и 10 тезисов международных и всероссийских конференций.

Декларация личного участия автора в получении научных результатов.

Автор участвовала в экспедициях по отбору образцов многолетнемерзлых отложений. Автором спланировано и выполнено большинство (80%) экспериментов, проведена обработка и анализ результатов и их подготовка к публикации. Основная часть исследований выполнена в руководимом автором Секторе анализа и хранения микроорганизмов (ЛМГМ ОМГК) ИМГ РАН в соавторстве с сотрудниками ЛМГМ С.З. Миндлин, Ж.М. Горленко, Г.Я. Холодием, H.A. Хачикян, H.A. Щербатовой. Образцы многолетнемерзлых пород и их геологическая характеристика были предоставлены Д.А. Гиличинским (Лаборатория криологии почв, Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН). Некоторые штаммы бактерий были предоставлены B.C. Соиной (Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова) и В.А Щербаковой (Всероссийская коллекция микроорганизмов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, двух приложений и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 187 страницах машинописного текста и содержит 28 рисунков и 21 таблицу. Библиографический список включает 324 названия, в том числе 21 на русском языке и 303 - на английском.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Создание коллекции древних бактерий, устойчивых к ртути и антибиотикам

Для выделения бактерий использовали образцы многолетнемерзлых древних осадочных пород, ледового грунта (ледогрунта) и льда, отобранные в приполярных районах Арктики и. Антарктики. Арктические образцы были отобраны в районе Колымской низменности и побережья моря Лаптевых. Антарктические образцы были отобраны в свободных ото льда полярных пустынях Антарктиды (Victoria Land, Dry Valleys) вблизи американской

Рисунок 1. Места отбора образцов многолетнемерзлых грунтов в районе Колымской низменности (а) и Антарктиде (б) обозначены черными точками.

антарктической станции Мс Мигёо (рис. 1). Возраст пород, из которых были отобраны исследованные образцы, составляет от 5 тысяч до 3 млн. лет. Методика отбора, доставки и хранения образцов исключала возможность их оттаивания и заражения посторонними микроорганизмами (Звягинцев и др., 1985; УогоЬуоуа е1 а1., 1997).

Перед началом работ по выделению устойчивых бактерий из этих образцов необходимо было иметь гарантии того, что выделяемые из мерзлоты микроорганизмы действительно являются древними, а не были занесены туда

позднее с водой по микротрещинам из современной почвы или в процессе отбора образцов. Без строгого доказательства этого, сравнение древних детерминант устойчивости с современными теряло бы всякий смысл.

На сегодняшний день результаты многочисленных микробиологических исследований многолетнемерзлых грунтов дают нам все основания считать, что штаммы, выделяемые из мерзлоты, являются действительно современниками мамонтов. В пользу этого вывода свидетельствуют следующие микробиологические и геологические данные:

1) Миграция почвенной микрофлоры в более глубокие подпочвенные слои не может происходить из-за наличия мерзлоты, которая полностью препятствует просачиванию воды с поверхности, т.к. даже если в подпочвенном слое и образуются микротрещины, попавшая в них вода тут же замерзает. Ведь температура мерзлоты и зимой, и летом составляет -10-18 °С. Сезонное оттаивание происходит лишь до глубины 0,5-0,6 м, т.е. только в пределах почвенного профиля (УогоЬуоуа е1 а1., 1997).

2) Обнаружение в пробах многолетнемерзлых пород анаэробных микроорганизмов (Ш\кта е1 а1., 1998), которые не могли попасть туда из воздуха в процессе отбора образцов.

3) Выделение из мерзлоты редких видов микроорганизмов, не характерных для современных тундровых почв (УогоЬуоуа й а1., 1997).

4) Обнаружение образцов, в которых отсутствуют жизнеспособные микроорганизмы (УогоЬуоуа е! а1., 1997, а также наши данные).

5) Отсутствие существенных различий по численности и качественному составу микроорганизмов, выделяемых из одних и тех же образцов, проанализированных в экспедиции, сразу же после извлечения их из скважины, и затем после хранения и доставки их в лабораторию в Москве (Звягинцев и др., 1985).

6) При разных вариантах искусственного заражения керна или образцов тест-культурой, ее никогда не удавалось обнаружить при последующем посеве, проведенном по стандартной методике (Хлебникова и др., 1990 и наши данные).

7) При сравнении результатов метагеномного анализа структуры бактериальных сообществ (по анализу нуклеотидных последовательностей генов 165 РНК) с результатами идентификации выделенных штаммов из одних и тех же образцов оказалось, что все группы бактерий, идентифицированные с помощью метагеномного метода, обнаруживаются и при посеве. Более того, часть сиквенсов генов 16Б РНК клонов и штаммов полностью идентичны. Следует особо подчеркнуть, что метагеномные и микробиологические исследования проводились в разное время и в разных лабораториях (У1зЬтуе15кауа е1 а!., 2006).

8) Метагеномными методами гены устойчивости к антибиотикам (тетрациклину - 1е1М, лактамам - Ыа и ванкомицину - х'шгХ), родственные современным, в том числе и клиническим, были обнаружены в образцах мерзлоты Аляски возрастом 30 тысяч лет (0'СоБ(а й а1., 2011).

Следовательно, микроорганизмы, в том числе и устойчивые к антибиотикам, выделяемые из мерзлоты, действительно являются представителями древних микробных сообществ. Таким образом, многолетнемерзлые отложения представляют собой уникальный природный субстрат, где микроорганизмы законсервированы в течение сотен и тысяч лет в замороженном состоянии,

Таблица 1. Характеристика мерзлых образцов и численность выделяемых из них жизнеспособных бактерий (выборочные данные)_

Район отбора Название Возраст Глубина Численность

образцов скважины отложений1 отбора жизнеспособ-

образцов, м ных бактерий2

Побережье моря ■ Лаптевых 1/01-DAV 15-40 тыс. лет 28,0 1,5x101

03/03-Тикси 220-290 тыс. лет 2.0 1,2x10'

16,0 2,2x10'

12/03-Тикси 220-290 тыс. лет 5,0 7,2x10"

3/01-DC 220-290 тыс. лет 22,5 1,0x10'

Колымская низменность

Берег р. Хомус-Юрях 11/89 2-3 млн. лет 24,0 6,8x10

25,5 l,4xlOJ

Берег р. Б. Чукочья 1/91 2-3 млн. лет 34,0 4,2x104

Берег р. Б. Чукочья 2/94 2-3 млн. лет 39,9 4,4x10^

Берег р. Хомус-Юрях 4/93 200-220 тыс. лет 4,0 8,7x104

Берег р. Хомус-Юрях 3/93 200-600 тыс. лет 6,0 6.2x10J

Побережье Восточносибирского моря 4/99 15-35 тыс. лет 13,6 2,0x10"

14,6 5,0x10'

Берег Б. Олерского оз.. 1/95 3-5 тыс. лет 1,8 4,8x104

8,8 7,8x104

Соответствует периоду нахождения осадков в мерзлом состоянии. 2 Численность жизнеспособных бактерий по числу колоний (КОЕ), выросших на питательной среде при 25°С.

сохраняя при этом специфические особенности, присущие древним микробоценозам.

В данной работе исследовано более 130 образцов многолетнемерзлых отложений. В большинстве из них обнаружены жизнеспособные бактерии в количестве, "превышающем 104 КОЕ на 1 г грунта. Как это уже отмечалось другими авторами, среди выросших бактерий преобладают грамположительные штаммы. Однако устойчивыми к соединениям ртути и антибиотикам чаще оказывались грамотрицательные штаммы. Как грамположительные, так и грамотрицательные устойчивые бактерии, удалось выделить из образцов разного возраста, генезиса и географического положения (см. табл. 1).

Большинство выделенных штаммов древних бактерий способны расти при температуре от-1°С до +25(30)°С, и соответственно являются психротрофами. Среди отобранных для дальнейших исследований штаммов грамположительных бактерий, устойчивых к ртути и антибиотикам, были представители родов Paenibacillus, и Exiguobacierium, а среди грамотрицательных Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Brevundimonas, Psychrobacter, Xanthomonas, Plesiomonas, Sphingomonas. Следует отметить, что бактерии тех же систематических групп были выделены из других образцов многолетнемерзлых отложений, и среди них, так же, как и в нашей коллекции, было много штаммов-психротрофов (Vörobyova et äl., 1997).

Таблица 2. Спектры устойчивости штаммов палеобактерий

Штамм Район' Возраст, тыс. лет2 Систематическое . положение Спектр устойчивости^

ED23-35 А 15-40 Acinetobacter sp. Hg, Sm

М2-7 А 15-40 Acinetobacter jonsonn Hg, Ap, Tp

MR5-8 А 15-40 Acinetobacter sp. Ap, Cm, Gm, Km, Tb

VS15 А 200 Acinetobacter sp. Ap, Cm, Sm, Sp

MR29-12 А 15-35 Psvchrobacter maritimus Sm, Tc, Tp

MR7-1 А 200-390 Stenotrophomonas sp. Cm, Gm, Cb, Km, Nm, Sp, Tc, Tp

MR7-3 А 200-390 Stenotrophomonas maltophilia Ap, Cm,Gm,Km, Nm, Sp, Tp

MR9-2 А 15-40 Stenotrophomonas retroflexus Ap, Cm, Gm, Km, Nm, Sp,Tp

ED23-9 А 15-40 Sphingomonas sp. Gm, Km, Nm, Sm,Tb

ЕК42 В 50-300 Sphingomonas mucosissima (Ap), Sm

ED94-62a А 20-40 Pseudomonas sp. Hg

А19-1 А 5-10 Pseudomonas sp. Hg

ED23-10 А 15-40 Pseudomonas libanensis Hg, Cb, Cm, Sp, Tp

ED23-26 А 15-40 Pseudomonas fluorescens IHg, Cb, Cm, Km, Sp, Tp

EDM6-1 А 15-40 Pseudomonas sp. Hg, Cb, Tp

VS38 А 3-5 Pseudomonas sp. Cm, Cb, Sm, Sp, Su, Tc,Tp, Nal

Tikl А 200-600 Pseudomonas putida Hg, Cm, Cb, Sm, Sp, Tp

Tik3 А 200-600 Pseudomonas sp. Cm, Sm, Sp, Su, Tp

ЕК41 Б 50-300 Brevundimonas vesicularis Ap, Sm

MRI-1 А 3-5 Paenibacülus amvloliticus Sm, (Sp)

VSH72 А 200-600 Paenibacillus amvloliticus Sm, (Ap)

EK63 Б 50-300 Paenibacülus sp. Sm, (Ap), (Sp)

'А-Арктика, Б-Антарктида 2Использованные концентрации антибиотиков (мкг/мл) и их обозначения: Ампициллин (Ар) - 200, карбенициллин (Cb) - 400, хлорамфеникол (Сш) - 20, гентамицин (Gm) - 5, канамицин (Km) - 25, неомицин (Nrh) - 25, тобрамицин (ТЬ) - 40, стрептомицин (Sm) - 50, спектиномицин (Sp) - '100, сульфатиазол (Su) - 25, налидиксовая кислота (Nal) - 20, тетрациклин (Тс) - 15, триметопрйм (Тр) - 25, HgCh (Hg) - 5; наличие скобок указывает на низкий уровень устойчивости. Устойчивости к карбенициллину всегда сопутствовала и устойчивость к ампициллину.

При изучении спектра устойчивости выделенных штаммов оонаружено, что многие из них обладают устойчивостью одновременно к нескольким антибиотикам, причем различных классов. Данные о спектрах устойчивости выделенных штаммов палеобактерий выборочно представлены в таблице 2. Полученные данные были достаточно неожиданными, поскольку в литературе имеются сведения о том, что до начала применения антибиотиков в медицине устойчивые клинические штаммы бактерий составляли менее. 3%, причем устойчивы они были только к одному антибиотику. Полученные нами

результаты показали1, что у природных штаммов бактерий происходит формирование множественной устойчивости, по-видимому, в результате длительного тесного контакта в почве с продуцентами антибиотиков.

Таким образом, была создана коллекция древних бактерий, устойчивых к соединениям ртути (Г^-г) и различным антибиотикам, которая использовалась в дальнейших исследованиях детерминант устойчивости и ассоциированных с ними мобильных элементов.

2. Первичный анализ детерминант устойчивости у древних штаммов

2.1. Определение наличия тег-оперона

Устойчивость бактерий к соединениям ртути, в большинстве случаев, обеспечивается присутствием /яег-оперонов. Однако, Известны и другие механизмы устойчивости. Чтобы оценить перспективность дальнейшего использования коллекции палеобактерий для проведения сравнительных исследований . транспозонов, участвующих в распространении генов устойчивости к ртути у древних и современных бактерий, прежде всего, было необходимо определить, содержат ли древние Hg-r штаммы тег-опероны. Для определения наличия генов тег-оперона использовали гибридизацию иммобилизованных на нитроцеллюлозных фильтрах бактериальных колоний со специфическим' зондом, содержавшим большую часть тег-оперона (гены merRTPCA) (см; рис. 4а). Подавляющее большинство (34 из 37) исследованных грамотрицательных штаммов палеобактерий давали четкую гибридизацию с использованным зондом и, следовательно, содержали тег-оперон.

2.2. Идентификация генов устойчивости к стрептомицину

Гены устойчивости к стрептомицину отличаются небольшим разнообразием по своей молекулярной структуре и механизмам устойчивости по сравнению с генами устойчивости к другим антибиотикам. В то же время эти гены широко распространены как среди клинических, так и среди современных природных бактерий. - Поэтому для оценки перспективности изучения детерминант устойчивости к антибиотикам палеобактерий был проведен скрининг генов, определяющих устойчивость именно к стрептомицину.

Для этих исследований были отобраны 25 штаммов, пять из которых были устойчивы только к стрептомицину, а 20 обладали множественной устойчивостью. У этих штаммов был проведен скрининг генов устойчивости к стрептомицину: slrA-slrB, кодирующих аминогликозидфосфотрансферазы, и aadA, кодирующих аминогликозид-аденилилтрансферазы (Shaw et al., 1993). Поиск этих генов проводили с помощью ПЦР, а затем подтверждали их наличие с помощью Саузерн-гибридизации со специфическими зондами к каждому гену. Гены устойчивости к стрептомицину были обнаружены в 18 штаммах (таблица 3). Гены strA-strB были впервые' обнаружены в геномах нескольких независимо выделенных штаммов грамположительных бактерий, принадлежащих к роду Paenibacillus, а также у штамма грамотрицательной бактерии Psychrobacter. Гены strA-strB преимущественно' встречаются у грамотрицательных бактерий, однако они были обнаружены и у грамположительных штаммов рода

Таблица 3. Характеристика устойчивых к стрептомицину штаммов бактерий, выделенных из мерзлоты (выборочные данные)

Штамм

ED23-35

ED45-25

Происхождение и возраст мерзлых осадков"

Берег р. Хомус-

Юрях, 15-40 тыс. лет

Систематическое положение

Acinetobacter sp.

Фенотип °

Hg, Sm

Выявленные

гены устойчивости

strA-sírB, aadA

strA-strB

MM8-2

MM8-10

MR5-11

Колымская низменность, 5 тыс. лет

Pseudomonas putida

aadA

Flavobacterium/Cytophaga

Gm, Km. Sm

Acinetobacter sp.

MR1-1

Paenibacillus amvloliticus

strA-strB, aadA

Cm, Sm

strA-strB

strA, strB

MR29-12

Берег моря Лаптевых, 15-40 тыс. лет

Psychrobacter psychrophilus

Sm, Тс, Tp

strA-strB

Tiki

T¡k3

Берег моря Лаптевых, 200-600 тыс. лет

Pseudomonas putida

Hg, Cm, Cb, Sm. Sp, Tp

strA-strB,

Pseudomonas sp.

Cm, Sm, Sp, Su, Tp

strA-strB, aadA

VS27

Колымская низменность, 2-3 млн. лет

Pseudomonas sp.

Cm, Sm

strA-strB, aadA

VS15

Берег Восточно-Си бирского моря, 15-35 тыс. лет

Acinetobacter sp.

Cm. Sm

strA-strB, aadA

VSH31

VS48

VS50

Колымская низменность, 3-5 тыс. лет

Paenibacillus amvloliticus

strA-strB, aadA

Pseudomonas (fluorescens?)

Cm, Sm

aadA

Pseudomonas (fluorescens?)

Cm, Sm

aadA

VS51

Pseudomonas sp.

Cm, Sm

aadA

VSH72

VSH76

Колымская низменность, 200-600 тыс. лет

Paenibacillus amvloliticus

strA-strB, aadA

Paenibacillus amvloliticus

strA-strB, aadA

EK41

Антарктида, 50-300 тыс. лет

Brevundimonas vesicularis

Ар, Sm

strA-strB

время нахождения отложении

в мерзлом состоянии. ° Обозначения, как в таблице 2.

Corynebacterium (Schroder et al., 2012). Этот факт свидетельствует о возможности горизонтального переноса генов strA-strB между грамположительными и грамотрицательными бактериями. Перемещению генов strA-strB способствует то, что они входят в состав широко распространенных транспозонов типа Tn5J9J, а также различных плазмид, в том числе и широкого круга хозяев (см. далее). Стоит отметить, что многие штаммы древних бактерий одновременно содержали гены устойчивости обоих типов. Причина этого явления неясна, однако, штаммы Е. coli, также одновременно обладающие генами strA-strB и aadA, были выделены у домашних животных в Норвегии (Sunde &Norstrum, 2005).

Что же касается идентификации других генов устойчивости, то тут следует отметить, что штаммы с соответствующими устойчивостями с помощью

гибридизации )и\или ПЦР были проверены на наличие у них известных генов устойчивости -к канамицину и/или гентамицину (аас№, аасА4, аасС1, аасС2, аасС4, арИЛ), хлорамфениколу (смА, смВ, ст1А) и тетрациклину(/е/Л, 1е1В, 1е1С). Однако только штамм МК29-12 давал слабую гибридизацию с зондом на ген 1е1С. Ни один другой из вышеперечисленных генов обнаружить не удалось.

3. Локализация детерминант устойчивости у древних бактерий

В распространении генов устойчивости к ртути у современных бактерий основная роль принадлежит плазмидам и транспозонам. Устойчивость к антибиотикам у бактерий может быть врожденной (intrinsic), что может быть связано, например, с наличием хромосомных генов устойчивости, а также различных систем активного выброса (efflux systems). Также устойчивость к антибиотикам может быть связана с присутствием плазмид и\или транспозонов, содержащих детерминанты устойчивости. Именно «мобилизованные» гены, которые могут' быть легко переданы от одной клетки к другой с помощью горизонтального переноса и интересовали нас в первую очередь. В связи с этим мы провели исследования плазмидного состава и осуществили поиск транспозонов у устойчивых штаммов палеобактерий.

3.1. Детерминанты устойчивости, локализованные на плазмидах

Прежде всего, была изучена способность выделенных штаммов передавать гены устойчивости к ртути и антибиотикам при конъюгации. Для опытов по конъюгативному переносу плазмид в качестве доноров были взяты 7 штаммов рода Acinetobacter (5 устойчивых только к Hg и 2 - к Hg и стрептомицину), 10 -Pseudomonas (1 с множественной устойчивостью к антибиотикам и 9 - к антибиотикам и Hg), и один - Psychrobacter с множественной устойчивостью к антибиотикам. Следует отметить, что многие из содержащих плазмиды древних штаммов устойчивых к ртути были одновременно устойчивы и к антибиотикам. Такая устойчивость одновременно к ртути и антибиотикам часто наблюдается и у современных бактерий.

Таблица 4. Плазмидная локализация детерминант устойчивости

Штамм Спектр устойчивости Детерминанты устойчивости, локализованные на плазмидах

Acinetobacter sp. ED23-35 Hg, Sm, Sp Hg, Sm

Acinetobacter sp. ED45-25 Hg, Sm Hg, Sm

Acinetobacter jonsonii M2-7 Ap, Hg, Tp Hg

Psychrobacter maritimus MR29-12 Sm, Tc, Tp Sm, Tc

Pseudomonas fluorescens ED23-26 Hg, Km, Cb, Cm, Sp, Tp Hg

Pseudomonas sp. ED94-71 Hg, Km, Cb, Cm, Sp, Tp Hg

Pseudomonas sp. EDM6-1. Hg,Cb, Tp Hg

Pseudomonas putida Tikl Hg, Sm, Cb, Cm, Sp, Tp Hg, Sm

Pseudomonas sp. Tik3 ' - Sm, Su, Cm, Sp, Tp Sm, Su

Жирным шрифтом выделены антибиотики, локализацию которых невозможно было определить при мобилизации плазмид, по причине устойчивости к ним реципиентного штамма Pseudomonas.

В качестве реципиента для штаммов Acinetobacter и Psychrobacter был взят штамм Acinetobacter calcoaceticus BD413rif, а для псевдомонад - штамм Pseudomonas ßuorescens Р22-1. Последний штамм, как это свойственно многим псевдомонадам, обладал устойчивостью к четырем антибиотикам (Cb, Cm, Sp, Тр). По этой причине перенос детерминант устойчивости к этим антибиотикам не мог быть прослежен.

Кроме того, локализацию генов устойчивости к ртути дополнительно определяли с помощью гибридизации с зондом на /ие/'-оперон препаратов плазмидных ДНК.

В результате проведенных исследований было обнаружено, что у всех древних штаммов Acinetobacter и пяти псевдомонад детерминанты устойчивости к ртути локализованы на конъюгативных или неконъюгативных плазмидах, так же, как и у современных представителей этих родов (выборочные данные представлены в табл. 4). У двух древних штаммов Acinetobacter и одного Pseudomonas одновременно с детерминантами устойчивости к ртути на конъюгативных плазмидах были также локализованы гены устойчивости к стрептомицину. Кроме того, у одного штамма Pseudomonas и штамма Psychrobacter в состав конъюгативных плазмид входят только гены устойчивости к антибиотикам (стрептомицину и сульфатиазолу и к стрептомицину и тетрациклину, соответственно). Полученные данные свидетельствуют о том, что и в природе, задолго до начала практического применения антибиотиков, существовали конъюгативные плазмиды, несущие уже один или несколько генов устойчивости к антибиотикам. Этим фактом можно частично объяснить быстрое появление и распространение множественной устойчивости среди патогенных бактерий.

3.2. Поиск интегронов У современных штаммов бактерий различные гены устойчивости часто включены в состав интегронов. Интегроны - это природные системы клонирования и экспрессии, способные интегрировать и затем экспрессировать так называемые генные кассеты (Rowe-Magnus, 1999, Rowe-Magnus. 2001). Впервые интегроны были найдены в составе мобильных генетических элементов, ответственных за, возникновение множественной лекарственной устойчивости у патогенных бактерий, выделенных от человека, животных и растений (Collis, 1993, Stokes 1989). Каждый интегрон состоит из двух частей. Одна из них представляет собой стационарную "платформу", включающую ген intl, кодирующий интегразу, относящуюся к семейству тирозиновых сайтспецифических рекомбиназ (Nunes-Duby, 1998), и прилегающие к этому гену сильный промотор Рс. необходимый для экспрессии встраиваемых генных кассет, и сайт интеграции, attl (см. рис. 2) (Hall, 1997, Hall, 1995, Rowe-Magnus, 1999, Rowe-Magnus, 2003). Вторая часть представлена мобильными генными кассетами, состоящими из открытых рамок считывания (ORF), лишенных промотора, и сайтов рекомбинации attC. Интеграза Intl катализирует сайт-специфическую рекомбинацию между сайтами attl и attC, в результате чего происходит интеграция или вырезание кассеты (Collis, 1992; Collis, 1998). Генетическая организация интегронов способствует коэкспрессии генных кассет, входящих в его состав, с общего промотора Рс интегрона.

Рисунок 2. Структура интегрона.

а. Структура стационарной интегронной платформы и генной кассеты в свободной кольцевой форме, int - ген интегразы; Рс - кассетный промотор; attl - простой рекомбинационный сайт (изображен в виде белого полукруга); ORF - открытая рамка считывания генной кассеты; attC - а«С-сайт (изображен, как черный овал), б. Интегрон с одной, встроенной в интегронную платформу, кассетой. Рекомбинантные сайты attClattl, образовавшиеся после интеграции кассеты, представлены как черно-белые элементы

Среди клинических бактерий преимущественно встречаются интегроны 1 класса, тогда как среди природных штаммов их разнообразие намного выше (Nield et al., 2001). Все устойчивые к антибиотикам штаммы палеобактерий с помощью ПЦР были проверены на наличие у них интегронов 1, 2, 3 классов, наиболее часто встречающихся и хорошо изученных. Также были поставлены опыты с использованием универсальных праймеров, позволяющих амплифицировать интегразы по меньшей мере, 12 классов, а также любые интегрированные кассетные гены. В результате всех этих опытов интегрон, содержащий кассетный ген aadA2, был обнаружен в единственном штамме ТжЗ. В то же время имеются данные о том, что в современных почвах интегроны различных классов встречаются со значительной частотой (Nield et al., 2001). Все это может свидетельствовать о том, что на распространение интегронов в природе могло повлиять загрязнение биосферы, вызванное хозяйственной деятельностью человека.

3.3. Детерминанты устойчивости, входящие в состав транспозонов

Поиск транспозонов, содержащих гены устойчивости к ртути и антибиотикам, был проведен среди штаммов грамотрицательных палеобактерий. Для этого использовали три подхода: (1) выявление активных транспозонов при их мобилизации с помощью плазмид широкого круга хозяев, (2) обнаружение известных транспозонов грамотрицательных бактерий с помощью гибридизации по Саузерну со специфическими зондами и (3) ПЦР со специфическими праймерами на гены соответствующих транспозаз и детерминант устойчивости. . . тЗозояэ всжхто!! н

Природный штамм, __,_..„, предположительно

содержащий RP1 (RP1'2> <Тс R>

Этап 1. Введение конъюгативной плазмиды широкого круга хозяев в природный штамм, устойчивый к ртути или антибиотику, предположительно содержащий транспозон Этап 2. 2-3 пересева отобранных клонов природного штамма, содержащих плазмиду. Ожидается, что в это время транспозон перемещается на крупную плазмиду.

Этап 3. Скрещивание со штаммом Е. coli.

Этап 4. Отбор трансконъюгантов Е. coli и пересев их отдельных клонов на селективной среде.

Этап 5. Скрещивание с другим штаммом Е. coli.

Этап 6. Определение сцепления маркеров устойчивости предполагаемого транспозона и крупной плазмиды.

Рисунок 3. Схема процедуры выявления функционально активных транспозонов.

Для выявления активных транспозонов устойчивости к ртути и антибиотикам применили метод мобилизации детерминант устойчивости с помощью крупных плазмид широкого круга хозяев: RP1 и производных от нее RP1.2 и RP4-5M. Последовательность этапов выделения активных транспозонов на примере ртутных представлена на схеме (рис. 3). Следует особо отметить, что не во все штаммы можно ввести плазмиду RP1 (Kelly, Reanney, 1984; Kholodii et al., 1997; Mindlin et al., 2001).

В данной работе из 23 проверенных Hg-r штаммов реципиентом для RP1 и ее производных служили только 10. Из них удалось мобилизовать 6 транспозонов устойчивости к ртути. Только в 28 из 38 проверенных штаммов устойчивых к антибиотикам, удалось ввести крупную плазмиду. Из двух из них удалось мобилизовать активные транспозоны.

Из таблицы 5 видно, что по активности перемещения транспозоны из древних штаммов различались на несколько порядков. Самым активным оказался транспозон из штамма ED23-33.

Таблица 5. Результаты опытов по выделению активных транспозонов

Скрещивание с Е. coli АВ1456' • Выявленный мобильный

Штамм Tc-r Str-r, Hg-r Str-r, Частота элемент

в 0,1 мл " [N] в 0.1 мл [Т] переноса [T/N]

1 Содержащие/иег-оперон

ED23-33 '• 3.0x10" 3,0x10Ь ю-' Тп5058

ED94-62a 3,0x10" 2,0x10'. 7,0x10"" Тп5042

ED23-5 6,0x10" 2,0x10' 3,3x10'" Тп5053 v8

ED23-70 ' 3,0x10" 4,5x10' 1.5Х10"4 Тп5041В

ED72-65 2.0x10" 7.5x10' 3,7x10° Тп5053 v9

А19-1 5.0x10" 4,0x10' в^хЮ"4 Тп5060

Содержащие гены устойчивости к антибиотикам

Штамм Скрещивание с Е. coli JF2382 Выявленный мобильный

Km-r Nal-r, в Nal-r Str-r, Частота элемент

0,1 мл ; fNl в 0,1 мл. П1 переноса [T/N]

MR29-12 2,0x10' 1,1x10' 5,5x10-' Тп5080, 15/3/?у/+прилегающис гены tet(H) и strA-strB

Tik3 3,0x10" 2,0x10' 7,0x10"" Тп5045

Плазмида-реципиент: RP1.2; ш Плазмида -реципиент: RP4-5M (Кгп-г)

проверены на наличие у них всех основных типов транспозонов, содержащих тег-опероны. С этой целью были использованы зонды на транспозазы Тп2/, Тп5041 и Тп5044, относящиеся к семейству ТпЗ, а также Тп5053. На рис. 4а представлена молекулярно-генетическая структура этих транспозонов и фрагменты, использованные в качестве зондов при их поиске в коллекции штаммов палеобактерий. Из проверенных 23 штаммов 7 дали гибридизацию с одним из четырех зондов. Таким образом, в коллекции палеобактерий были обнаружены все основные типы ртутных транспозонов, распространенных среди современных природных бактерий.

В связи с тем, что при идентификации генов устойчивости к антибиотикам у древних штаммов бактерий были обнаружены лишь известные гены устойчивости к стрептомицину, среди палеобактерий мы провели скрининг транспозона Тп5393, играющего ведущую роль в распространении генов strA-strB. Все древние штаммы, содержащие strA-strB (см. табл. 3), были проверены с помощью гибридизации колоний на наличие у них транспозазы Тп5393 (см. рис. 46). Нам удалось обнаружить транспозазу Tn539i у 4 (ED23-35, ED45-25, Tiki и ЕК41) из 14 исследованных штаммов. Другой ген устойчивости к стрептомицину, aadA, у современных бактерий чаще всего является кассетным геном в составе различных интегронов. Но, как было сказано ранее, интегрон 1 класса, содержащий; кассетный ген aadA, был обнаружен только в штамме ТкЗ. Сложный транспозон из этого штамма удалось мобилизовать и детально охарактеризовать (см. далее).

^ In2 (10999 Ьр)

1 тп-н: тегА ШЕГ^Р^Щ tnpA »Тп 21

Kl _orfY 1«рС_

ща-й—издо—стил "<егл урру-гк _и тпsw

„ ___ _orfm га г^

Рштщщ—ША ^щщмтж прл irrt»Bf|

'InpR '

Тп5044

_res

|( tnpA |ир»>Г strA Г" strB )j Tn5393c

Рисунок 4. Молекулярно-генетическая структура транспозонов различных типов и зонды, использованные в работе.

Использованные зонды обозначены черными линями под молекулярно-генетическими картами транспозонов. tnpA, tnpR, tnpC, tniA, miß, tniO, tniR - гены транспозиции различных транспозонов. а. Зонды, использованные для поиска генов лгег-оперона и основных типов ртутных транспозонов. R, Т, Р, С, merA, D, Е, urfl, 1. 2 - гены, входящие в состав различных отег-оперонов; orjY, orß58, sigY, orf408. orf237 - открытые рамки с неизвестными функциями; ку, аХ, R', orfl, orfO, orfR - фрагменты генов и мобильных элементов, входящих в состав Тп5041. б. Зонды, использованные для поиска Тп5393 и генов устойчивости к стрептомицину strA-slrB.

4.1. Транспозоны подгруппы Тп5044

С зондом на транспозазу Тп5044 дали гибридизацию 2 штамма. Отличительной особенностью Тп5044 является наличие у него гена sigY, гомологичного сигме субъединице РНК-полимеразы (см. рис. 4а). Однако указанные древние штаммы не дали гибридизацию с зондом на этот ген.

Осуществить транспозицию мобильных элементов из этих двух штаммов на плазмиду RP1 не удалось. После обработки различными рестриктазами, у древних штаммов гибридизовались фрагменты, отличные от таковых Тп5044 и родственных ему транспозонов Тп 1412 и Тп5046, а также различающиеся между собой. По-видимому, штаммы палеобактерий содержат какие-то новые транспозоны, родственные Тп5044. Среди современных бактерий различные родственные этому транспозону варианты также очень распространены, тогда как сам Тп5044, является эндемиком (Горленко и др., 2004).

4.2. Транспозоны подгруппы Тп5041

С зондом на транспозазу Тп5041 дал гибридизацию штамм Р. ßuorescens ED23-70 (см. таблицу 5). У ED23-70 размер гибридизовавшегося фрагмента был значительно больше (около 8 т.п.н), чем соответствующий фрагмент у Tu5041 (1,7 т.п.н). Впоследствии этот штамм был подробно исследован в нашей лаборатории.

Было установлено, что ED23-70 действительно содержит активный ртутный транспозон Тп504!В, близкородственный Тп5041 (Kholodii et al., 2002).

4.3. Транспозоны подгруппы Тп21

С зондом на транспозазу Тп21 дал гибридизацию единственный штамм Pseudomonas sp. А19-1. Транспозон Тп2/ и многочисленные члены его подгруппы играют ведущую роль в распространении не только тег-оперонов, но и различных генов устойчивости к' антибиотикам (Liebert et al., 1999). Чаще всего такие транспозоны обнаруживаются у штаммов, выделенных из клиник. Все известные члены данной подгруппы являются сложными (комплексными) транспозонами, возникшими в результате инсерции в базовый ртутный транспозон транспозона типа Тп402, содержащего интегрон, с последующей делецией части транспозиционного модуля последнего. Транспозиционный модуль Тп402, родственен генам транспозиции Tn505J. Поэтому все штаммы, содержащие подобные сложные транспозоны, дают одновременно гибридизацию с зондами на обе транспозазы. Штамм А19-1 был способен гибридизоваться только с зондом на транспозазу Тп2/, что наводило на мысль о том, что ртутный транспозон из этого штамма не содержит интегрона, в отличие от самого Тп2/ и близкородственных ему транспозонов. Эти данные дали нам основания предполагать, что штамм А19-1 содержит новый безинтегронный транспозон, родственный Тп2/. Подробные данные о структуре транспозона этого штамма представлены далее.

4.4. Транспозоны семейства Тп5053

Транспозон TnJOJJ относится к семейству мобильных элементов, неродственному семейству Tni. С зондом на транспозазу Тп5055 дали гибридизацию 3 штамма: Pseudomonas sp. ED23-5, Р. pulida ED23-33 и ED72-65. Транспозоны, содержащиеся в этих штаммах удалось мобилизовать с помощью плазмиды pRP1.2 (табл. 5). Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид pRP1.2::Hg-r с транспозонами из ED23-5 и ED72-65 показал, что переместившиеся мобильные элементы по рестриктной карте полностью идентичны TnJOJi. Частичные сиквенсы транспозона из ED23-5 подтвердили, что он действительно является вариантом TnJOJi.

Транспозон, переместившийся на pRP1.2 из штамма ED23-33, обладал рестриктной картой, отличной от всех известных транспозонов. Полный сиквенс транспозона из этого штамма, обозначенного Tn5055, (Y17897), подтвердил, что это действительно новый транспозон, родственный Тп5053. Практически идентичный ему транспозон Тп50580 (АМ048832) был обнаружен у современных бактерий из р. Нуры (Казахстан) (Smalla et al., 2006).

5. Исследование молекулярно-геиетической структуры ранее неизвестных транспозонов устойчивости к ртути.

В опытах по мобилизации генов устойчивости (см. раздел 3.3.) в коллекции Hg-r древних бактерий был обнаружен ряд штаммов, содержавших новые функционально активные ртутные транспозоны, способные перемещаться в плазмиды широкого круга хозяев. В данной работе были детально охарактеризованы два таких транспозона, обнаруженных в штаммах Pseudomonas sp. А19-1 и Pseudomonasßuorescens ED94-62a (см. табл. 5).

У первого штамма была обнаружена гомология с транспозазой Тп2/, при отсутствии интегрона. Кроме того, А19-1 содержал активный транспозон. Такие

свойства транспозона из А19-1 позволяли предположить, что он может являться безинтегронным предшественником Тп 21, существование которого было предсказано рядом авторов (Tanaka et al., 1983; Liebert et al., 1999).

У второго штамма, Pseudomonas fluorescens ED94-62a, в опытах по блот-гибридизации не удалось обнаружить гомологии с транспозазами известных транспозонов и, тем не менее, из него удалось получить транспозицию мобильного элемента, обуславливающего устойчивость к ртути. Поэтому было решено подробно исследовать переместившийся неизвестный транспозон из этого штамма.

5.1. "Древний" транспозон Тп5060 - безинтегронный предшественник Тп21

Была определена полная нуклеотидная последовательность нового транспозона из штамма А19-1, названного Tr\5060 (AJ 551280). Результаты сравнительного анализа структуры Тп2/ и ТюОбО схематически представлены на рис. 5. В отличие от Тп2/, ТпЗОбО не содержит интегрона In2 протяженностью 11 т.п.н. Остальные составные элементы обоих транспозонов полностью идентичны, за исключением 4 нуклеотидных замен. Их ше;--опероны протяженностью 4 т.п.н. содержат гены merRTPCADE, гомологичные между собой более чем на 99.9% (две замены обнаружили в гене merR и одну замену в гене urß). Транспозиционные модули обоих транспозонов, состоящие из концевых повторов, генов tnpA и tnpR и res-сайта и имеющих протяженность 3,6 т.п.н отличаются единственной заменой в гене tnpA.

Ранее было высказано предположение (Brown et al., 1986; Liebert et al., 1999) о том, что в результате внедрения In2 в транспозон-предшественник Тп21 исходная рамка urf-2 (Liebert et al., 1997, 2000) разделилась на две части: 5'-концевую (сохранившую название urf-2) и З'-концевую, названную tnpM. Структура Тп5060, который имеет полноразмерный, ген urf-2, подтверждает эту гипотезу. Полностью соответствуют ей и результаты сравнения структуры и размера гена urf-2 Тп5060 с таковыми гипотетического "гибридного" гена urßM Тп21 (Liebert et al., 1999), образованного путем слияния последовательностей urf-2 и tnpM, остающихся после исключения интегрона (и вычетом прилежащих 5-ти пар нуклеотидов, возникших при дупликации мишени).

1п2 (10999 Ьр)

1 Т. П. н.

merTI'CADEurjl )| tnpKA \

res

merTPCADEurß >1 tnpRA >

)) Тп21

Рисунок 5. Молекулярно-генетическая карта Тп5060 и Тп21.

Обозначения генов такие же, как и на рис. 4. 1п2 - интегрон 1-класса с генами устойчивости к антибиотикам, входящий в состав Тп21/

В соответствии с общепринятой гипотезой, . предшественником ряда современных сложных транспозонов множественной лекарственной устойчивости (МОИ транспозонов) клинических бактерий, родственных Тп2/, был ртутный транспозон, не содержащий интегрона ^¡еЬей е1 а1., 1999). В связи с этим в ряде работ проводили сравнительный анализ структуры Тп2/ и

близкородственных ему безинтегронных транспозонов (Tanaka et al., 1983; Lett et al., 1985; Liebert et al., 1999; Mindlin et al., 2001; Essa et al., 2003). Однако оказалось, что ни один из них не может считаться транспозоном-предшественником Та21. Из всех известных простых транспозонов, устойчивости к ртути, родственных Тп2/, Тп5060 является самым близким к нему по своей структуре и свойствам. И если не он сам, то ближайший его родственник может рассматриваться в качестве предшественника Тп21 и всей подгруппы родственных ему транспозонов.

Встраивание интегрона 1п2 в простой транспозон устойчивости к ртути, прототипом которого является Тп5060, оказалось чрезвычайно важным по своим последствиям, ибо привело к формированию обширной группы комплексных MDR транспозонов, распространившихся по всему миру (Grinsted et al., 1990; Osbornetal., 1997).

По-видимому, нельзя считать случайным тот факт, что именно в коллекции древних штаммов, распространенных в природе задолго до наступления антибиотичской эры, нам удалось обнаружить простой транспозон-предшественник сложных MDR транспозонов подгруппы Тп2/, тогда как ни одного комплексного транспозона у устойчивых к ртути палеобактерий обнаружить не удалось. Это свидетельствует о том, что именно искусственное селективное давление, вызванное массированным применением антибиотиков, привело к быстрому формированию и распространению комплексных транспозонов, содержащих как гены лекарственной устойчивости, так и тег-опероны.

5.2. Новый транспозон Тп5042: его структура и распространение среди современных и древних бактерий

Анализ полученной нами полной нуклеотидной последовательности транспозона из древнего штамма Pseudomonas fluoresceins ED94-62a, обозначенного Тп5042 (AJ563380), подтвердил, что это новый транспозон, неродственный описанным ранее. Данный транспозон является одним из самых маленьких ртутных транспозонов: его размер составляет всего 6987 п. н. Оказалось, что транспозиционный модуль Тп5042 родственен мобильным элементам из семейства IS66. Мобильные элементы из этого семейства обычно кодируют три открытые рамки считывания tnpA, tnpB, tnpC, вовлеченные в процесс транспозиции. У некоторых представителей семейства имеется дополнительно четвертый ген, orf4, функции которого неизвестны. IS элементы данного семейства ограничены несовершенными инвертированными повторами размером от 13 до 30 п. н. При транспозиции члены семейства IS66 вызывают дупликацию последовательности мишени размером 8 п. н. Элементы из семейства IS66 широко распространены среди грамотрицательных бактерий, принадлежащих к родам ,Agrobacíerium, Rhizobium, Escherichia, Pseudomonas и Vibrio (Mahillon & Chandler, 1998; Han et al., 2001).

Транспозон Тп5042 . кодирует три полноразмерные открытые рамки считывания, проявляющие гомологию с генами tnpA, tnpB и tnpC других членов семейства (рис. 6а). Длина генов tnpA, tnpB и tnpC составляет 390, 345 и 1506 п. н. соответственно.- .Транспозиционный модуль Тп5042 наиболее схож с генами транспозиции. ,V£>Pre3, также принадлежащему к семейству IS65, согласно сделанному нами: анализу его нуклеотидной последовательности. Гомология

1 т. п. н.

«НЖШЕЕ^ёд:

о rf4'

ЗХЛ

Тп5042

фз тегТ,Р£~4~

Транспозон. родственный Т я5М1

Ипсерция

i-I—.-.—--[. iSO.ICMCH I

Ор'П <«пС | [ И1 ctkicHcrra IS66

<|М таТ.Р.СЖ« I I "PC I I |) Тп5042

Рисунок 6. Структура Тп5042 и гипотетическая схема его образования.

а. Молекулярно-генетичсекая карта Тп5042. Обозначения генов тел-оперона такие же, как и на рис. 4; А, В, С - гены транспозиции tnpA, tnpB, tnpC; orf4' и 'orf4 - фрагменты открытой рамки с неизвестными функциями orf4, входящей в состав некоторых IS-элементов из семейства IS66. Длинной жирной линией обозначен фрагмент, использованный в качестве зонда для скрининга Тп5042. б. Схема происхождения Тп5042 (не в масштабе). Предполагается, что Тп5042 возник в результате транспозиции ТпэО^/-подобного транспозона в IS-элемент из семейства IS66 и последовавших за этим двух внутренних делеций, а также инсерции гена merB. Заштрихованный прямоугольник обозначает левый фланг Tn5£W.

между белковыми последовательностями TnpA, TnpB, ТпрС из Тп5042 и IS/VeJ, составляет соответственно 53,5%, 91% и 77,7%. Кроме того Тп5042 содержит фрагмент рамки orf4 (342 п. н.), гомологичной на 70% соответствующему гену из ISРгеЗ (ее протяженность в 1SРгеЗ составляет 594 п. н.). Последовательность orf4 у Тп5042 обрывается за 34 нуклеотида до конца гена тегВ (рис. 6а). Кроме того, недалеко от места обрыва эта рамка повреждена возникшим терминирующим кодоном TGA. По две копии IS/VeJ обнаружены в составе крупных конъюгативных плазмид pCARl (АВ088420) и pCAR1.2. (АВ474758) из штаммов Pseudomonas resinovorans CA 10 и Р. putida HS01, соответственно. Анализируя последовательности из базы данных, родственные Тп5042, мы обнаружили в плазмиде рОСТ из штамма Р. putida TF4-1L (AJ245436) фрагмент /5-элемента, содержащего только участок гена tnpC, прилегающий к orf4, концевой инвертированный повтор, и полноразмерную открытую рамку, гомологичные соответственно tnpC, TIR и orf4 из Тп5042. По-видимому, /^-элементы, родственные Тп5042 и IS/Vei, часто встречаются у природных псевдомонад.

Тп5042 ограничен несовершенными инвертированными повторами размером 20 п. н, гомологичными на 75% концевым повторам IS элементов из семейства IS66. При своем перемещении Тп5042 вызывает дупликацию ДНК-мишени 8 п. н, как и все другие представители семейства IS66.

Транспозон Тп5042 содержит тег-оперон размером около 4,5 т. п. н., состоящий из генов merR, merT, merP, merC, merA и merB. Ближайшие по

нуклеотидным последовательностям /иег-опероны входят в состав острова патогенности Р. aeruginosa PAGI-5 (EF611301) (85% гомологии) и Тп5041 (Х98999) из штамма Pseudomonas sp. КНР41 (82% гомологии). Однако в отличие от этих двух тег-оперонов транспозон Тп5042 содержит дополнительно ген органомеркуриатлиазы тегВ, нуклеотидная последовательность которого на 93% гомологична тегВ из тег-оперона другого транспозоиа TnJ05S (Y17897), обнаруженного в штамме Pseudomonas sp. ED23-33, также выделенного из «вечной» мерзлоты. Кроме того, гены тег В, с таким же уровнем сходства, часто входят в состав плазмид современных штаммов бактерий, например pbyi_2p (СР003091) из штамма Burkholderia sp. YI23, выделенного из почвы на поле для гольфа, и pMCBFö (EF107516) и рТРб (АМ048832) из ДНК, выделенных из морских и речных донных отложений, соответственно.

Гомология с Тп504! у Тп5042 продолжается левее тег-оперона, который обрамлен остатками рамки orf4, принадлежащей IS-элементу. Такая молекулярно-генетическая структура Тп5042 указывает на то, что он возник в результате инсерции транспозона, родственного Тп5041 в IS элемент из семейства IS56 (см. рис. 66). Однако механизм и момент интеграции тегВ остается неясным.

Чтобы • определить частот}' распространения Тп5042 среди древних и современных бактерий, был проведен поиск этого транспозона в коллекциях устойчивых к ртути бактерий, имеющихся в нашей лаборатории. Сначала был осуществлен предварительный скрининг Тп5042 в коллекциях современных устойчивых к ртути штаммов бактерий, выделенных из образцов собранных на территории европейской части России (77 штаммов) и в Новой Зеландии (17 штаммов). В качестве зонда был использован меченый фрагмент Тп5042, содержащий весь транспозиционный модуль и часть тег-оперона (см. рис. 6а). Отобранные 16 штаммов, дававшие в колониях гибридизацию с этим зондом, были повторно проверены на наличие гомологии с Тп5042 с помощью Саузерн-гибридизации. Оказалось, что у 12 из 16 исследованных штаммов размеры внутренних фрагментов, гибридизующихся с зондом, полностью совпадают с величиной фрагментов у Тп5042.

Из препаратов суммарной ДНК 4 штаммов (LS22-3, NZ2, NZ13, NZ15), идентичных по рестрикционной карте с Тп5042, были клонированы фрагменты, содержащие целиком Тп5042. У клонов этих четырех вариантов Тп5042 были определены участки нуклеотидных последовательностей, соответствующих генам тег А, tnpC и tnpA. Суммарный размер отсеквенированных фрагментов для каждого варианта Тп5042 составлял от 440 до 680 п. н., и в них не было обнаружено ни одной нуклеотидной замены относительно исходного варианта Тп5042. Кроме того, в базе данных мы обнаружили последовательность плазмиды PQBR103 содержащей транспозон на 99,3% гомологичный Тп5042. Данная плазмида была обнаружена в штамме Р. fluorescens SBW25, выделенном в Англии с поверхности листьев и корней сахарной свеклы.

Все древние грамотрицательные устойчивые к ртути бактерии (включая ED94-62а), (табл. 4) также были проверены на наличие в них штаммов, содержащих Тп5042. Из 23 штаммов, кроме ED94-62a, еще 5 дали гибридизацию с использованным зондом. Причем у 4 штаммов (ED23-10, ED23-26, ED23-26a, ED94-71) число и размер внутренних фрагментов, гибридизующихся с зондом, полностью совпадали с таковыми у Тп5042.

Таким образом, впервые обнаруженный и описанный нами транспозон Тп5042 широко распространен как среди современных бактерий в географически удаленных областях Земного шара, так и среди древних бактерий, выделенных из многолетнемерзлых грунтов Колымской низменности.

В обширном семействе 1566, Тп5042 является единственным известным примером формирования транспозона, содержащего тег-оперон, на основе 18-элемента.

6. Характеристика транспозонов устойчивости к стрептомицину, родственных Та5393

Гибридизация устойчивых к стрептомицину палеобактерий с зондом на транспозазу широко распространенного среди современных бактерий Тп.5393 выявила четыре штамма (ED23-35, Tiki, ED45-25 и ЕК.41), предположительно содержащих данный транспозон. С помощью ПЦР удалось получить фрагменты генов strA-strB (704 п. н.), транспозазы (1046 п. н.), а также продукт, включающий одновременно часть гена резольвазы и начало гена sir А (1075 п. н.), что свидетельствует о сцеплении транспозиционного модуля Тп5393 с генами

IR_res_,_._1R

Тп5393(c) 4 tnpA Ш tnpR | strA I st,В ►

if ir

3F 2R

1046 п. н.

1075 п. н.

Рисунок 7. Выявление генов транспозиционного модуля, родственных ТюЗ'А? у устойчивых к стрептомицину штаммов палеобактерий.

а. Черными стрелками показаны места отжига праймеров при получении ПЦР продуктов, содержащих фрагменты Тп5393: ген транспозазы (праймеры 1Р и 1Я); стык генов резольвазы и з!гА-з1гВ (2Р и 2Я); гены устойчивости к стрептомицину $1гА-$1гВ (ЗР+ЗЯ). Обозначение генов такое же, как на рис. 4. На фотографиях представлены продукты ПЦР с праймерами 1Р+1Я (6) и 2Р+2И (в). Цифры над фотографиями соответствуют: 1-Е023-35, 2-1-35 (современный штамм, содержащий Тп5393с), 3-весовой маркер (ДНК фага лямбда, рестрицированная Рэй), 4-Т1к1, 5-ЕК41, 6-Н045-25.

устойчивости к стрептомицину^ strA-strB в исследуемых древних штаммах (см. рис. 7). Шесть из восьми известных современных-вариантов транспозона Тп5393 отличаются друг от друга инсерциями различных мобильных элементов в участок между генами inpR и strA (варианты a, b, е, g, h, I по Cain & Hall, 2011). Поэтому образование ПЦР продуктов размером 1075 п. н., включающих одновременно участки генов tnpR и strA (праймеры 2F+2R), свидетельствует об отсутствии каких-либо инсерций в данном районе у транспозонов из мерзлоты. Еше один вариант, Tn5393d, содержит инсерцию в гене strA. Размер ПНР продуктов генов устойчивости к стрептомицину (праймеры 3F+3R) свидетельствует об отсутствии инсерций в данном участке у древних штаммов. Вероятнее всего, в древних штаммах содержится самый простой вариант транспозона, не содержащий никаких инсерций: Tn539i (ранее Тп5393с), впервые обнаруженный на плазмиде pRAS2 в патогенном для рыб штамме Aeromonas salmonicida, выделенном в Норвегии (L'Abee-Lund & Sorum, 2000).

7. Исследование ранее неизвестных мобильных элементов, участвующих в распространении генов устойчивости к антибиотикам

В опытах по мобилизации транспозонов (см. раздел 3.3.) в двух штаммах палеобактерий удалось обнаружить два функционально активных мобильных элемента, содержащих гены устойчивости к антибиотикам. Первый из них был обнаружен в штамме Pseudomonas sp. ТжЗ (см. табл. 5) и содержал гены устойчивости к стрептомицину/спектиномицину и сульфонамидам. Второй - в штамме Psychrobacter maritimus MR29-12 (см. табл. 5) обеспечивал устойчивость к стрептомицину и тетрациклину. В данной работе было проведено детальное исследование этих мобильных элементов.

7.1. Новый сложный транспозон Тп5045

Предварительный анализ транспозона, переместившегося из древнего штамма Pseudomonas sp. TiK3 на плазмиду RP1.2, позволил заключить, что он по ряду свойств отличается от всех известных. В частности, с помощью частичного секвенирования продуктов ПЦР, было установлено, что данный транспозон содержит интегрон 1 класса с единственным кассетным геном устойчивости к стрептомицину/спектиномицину aadA2. Существование такого интегрона было предсказано, но сам он ранее нигде не был обнаружен (Bissonnette and Roy, 1992). Поэтому была определена полная нуклеотидная последовательность нового транспозона,' названного Тп5045. Результаты анализа нуклеотидной последовательности TnJ045 (FN821089) показали, что это новый сложный транспозон размером около 22 т. п. н., состоящий из трех различных генетических модулей.': (1) базового транспозона, родственного Тп 1013 (АМ261760), обозначенного нами Тп/0/j*; (2) ранее неизвестного интегрона 1 класса 1пС*, содержащего гены лекарственной устойчивости; (3) варианта недавно описанного транспозона TnOtChr (AF313472), TnOtC.hr*, содержащего гены устойчивости к шестивалентным ионам хрома. В составе Тп3045 транспозон

Щ'трЯ2___ chrF_

chrA Мс7.гС>Г~>1 >|) Тп ОН 8724................-.......................................................... 15903

,Ri anil аиС __I_ _

^ mili j аа^42){ГТ suit >| ифХ tiiiBb ¡ K~ <niA p III С*

--------------------qacEA 1 ...........

3703 .............................................--..........""' 17800

IRr

tnpAl К'нрА'Д orfA Я <><ß >TH orjp )» Tniöü*

res 21894

Рисунок 8. Молекулярно-генетнческая структура Tn5045.

Цифры под изображениями мобильных элементов, входящих в состав Ti\5045, обозначают позицию первого и последнего нуклеотида данного элемента по последовательности FN821089. orfA, оф. orjC, or/D - структурные гены транспозонов, родственных Тп 1013; chrB, ehr A, chrC, chrF - гены, входящие в оперон устойчивости к хрому из TnOtChr*', intll - ген интегразы; qacEAl, sull и orfi - гены, входящие в консервативный район З'-CS интегрона; aadA2 - кассетный ген устойчивости к стрептоминину/спектиномипину, входящий в состав интегрона InC. Остальные обозначения, как на предыдущих рисунках.

Тп 1013* разделен на две части инсерцией интегрона InC*, а тот, в свою очередь, разделен инсерцией Tn OtChr* (см. рис. 8). Все мобильные генетические элементы, входящие в состав Тп5045 близкородственны соответствующим современным элементам.

Транспозон, являющийся базовым для Tn5(MJ, относится к подгруппе Тп2/ из семейства ТпЗ. Поскольку ближайшим родственным ему транспозоном является Тп 1013, отличающийся единственной нуклеотидной заменой, мы обозначили его Тп 1013* (см. рис. 8). Он содержит концевые инвертированные повторы (IR) размером 37 п. н. и ограничен прямыми дупликациям мишени размером 5 п. н. Транспозиционный модуль базового транспозона Тп 1013* в составе Тп5045 разделен на две части инсерцией интегрона 1 класса, произошедшей в reí-сайт между районами resl и resll. Левая часть Тп 1013*, размером 3697 п. н., содержит левый концевой повтор, гены транспозиционного модуля (гя/?Л-транспозазы и tapÄ-резольвазы) и большую часть /-es-сайта. Правая часть Тп 1013*, в состав которой входят оставшаяся часть /-es-сайта, дополнительные гены orfA, orß, orfC, orfD и правый концевой повтор транспозона, имеет размер 4094 п. н. Продукты, кодируемые генами orfA и orfC, были ранее определены, как гомологи сульфат пермеазы и DksA-подобного белка, соответственно (Schnabel and Jones. 1999). Белок OrfB родственен ряд}' белков, аннотированных как универсальные белки стресса (UspA) (Stokes et al., 2007). Продукт гена orfD является неизвестным белком. Ближайшие последовательности, родственные генам, расположенным в правой части Тп 1013*, были обнаружены в Thl403 (AF13472), в частично отсеквенированном Тп 1404* и в составе плазмид pND6-l (AY208917) и pDTGl

In 2

■ П

Ц---Л IS/J53

От

IS1326

_attll attC _ _ _ _,

{{ intll ftaadAiyriL suit >Гorf?K tniBA 1 Ц tniA "ft

qacEAl

5v-conserved _ segment

In С'

B'-conserved segment

attll attC

jf intll

qacEA 1 .......

Tn OtChr*

Вариант Посл-ть Спейсер Посл-тъ промотора -35 промотора -10 района района

Infl PcW In 2 PCW in С* РЛ1

TGGACA N„ TAAGCT P2 XGGACA N,7 TAAGCT P2 TGGACA N„ TAAACT P

Посл-ть Спейсер Посл-ть

-35 промотора -10 района района

ТГСТГА N,4 ТАС А ОТ

ТТСТТА N,7 ТАСАвТ

ТТСТТА N,4 ТАСАСТ

Рисунок 9. Молекулярно-генетическая организация интегронов 1п2 и 1пС".

а. Структура интегронов. ап1 - сайт рекомбинации интегрона, аПС - кассетный сайт рекомбинации (59Ье-элемент). Короткие вертикальные линии указывают местоположение инсерций мобильных элементов 18/326, 15/353 и ТпО/САг* в соответствующие интегроны. Остальные обозначения, как на рис. 8. б. Варианты промоторов; обнаруженные в интегронах. Неактивная форма промотора Р2 со спейсером длиной 14 п. н. выделена курсивом (форма промотора Р2 со спейсером длиной 17 п. н. - активна). Нуклеотиды промоторов из интегронов 1п2 и 1пС* отличные от 1п0, выделены жирным шрифтом.

(АР491307). Подобно Тп/0/3, Тп 1013* содержит делецию в гене ог/С размером 78 п. н. по сравнению с транспозоном Тп 1403.

Интегрон 1 класса, разделяющий на две части Тп 1013*, относится к 1п2-1п5 семейству интегронов. Его инсерция фланкирована прямыми повторами размером 5 п. н. Интегрон обрамлен концевыми повторами размером 25 п. н. и содержит два характерных консервативных района, так называемые э'-СЭ и 3'-СБ, и единственный кассетный ген устойчивости к стрептомицину/'спектиномицину аас!А2 (см. рис. 9а). Среди генных кассет, входящих в состав современных интегронов из клинических бактерий, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость, наиболее часто встречаются гены устойчивости к стрептомицину/спектиномицину аас1А1 или аа<1А2. В зависимости от наличия той или другой кассеты все интегроны, содержащие ген аас!А подразделяются на две подгруппы аа(1А1 и аас!А2. Предполагают, что интегрон 1п2, в состав которого входит единственная кассета

aadAl, является предшественником всей aadAl подгруппы. Однако интегрон, являющийся предшественником подгруппы aadA2, до настоящего времени не был обнаружен. Поэтому ранее была предложена структура гипотетического интегрона-предшественника для этой группы, аналогичного In2, содержащего единственную кассету aadA2 (Bissonnette and Roy, 1992). Этот гипотетический интегрон был назван InC. Поскольку структура интегрона, входящего в состав Тп5045, сходна со структурой гипотетического интегрона InC, мы обозначили интегрон из Тп5045 как InC*. Как свойственно н другим интегронам из семейства In2-InJ, 5'-CS в составе InC* содержит ген intll, кодирующий интегразу, сайт интеграции кассетных генов attll и промотор Рс необходимый для экспрессии кассетных генов, а З'-CS - ген устойчивости к сульфонамидам sull и еще две открытые рамки считывания: orf5 и qacEAl (Stokes and Hall, 1989). Как было показано ранее, последняя рамка кодирует делеционную производную гена устойчивости к четвертичным аммониевым соединениям qacE. В отличие от других членов семейства интегронов множественной лекарственной устойчивости In2-InJ, содержащих кассету aadAl и поэтому принадлежащих к так называемой подгруппе aadAl, InC* содержит кассету aadA2 и, следовательно, принадлежит к подгруппе aadA2. Кроме того, в гене tniBAl интегрона InC* не содержится IS-элементов IS 1326 и IS 1353, а вместо них имеется инсерция транспозона устойчивости к хрому (см. рис. 9а). InC* и 1п2 также имеют различия в структуре промоторного района, ответственного за экспрессию кассетных генов. Согласно номенклатуре интегронных промоторов (Jove et al., 2010), интегрон InC* содержит вариант промотора РСН1 без дополнительного промоторного района Р2, тогда как 1п2 содержит гораздо более сильный вариант промотора PCW+P2 (см. рис. 96). Организация промоторных областей у интегронов InC* и 1п2 также хорошо согласуется с моделью происхождения интегронов подгруппы In2-InJ от общего предшественника InO, предложенной Биссонетом и Роем. Оба промотора могли произойти от варианта слабого промотора PCW, содержащегося в InO, путем или единичной замены в -10 области PCW, приведшей к возникновению более сильного промотора РСН1, как у InC*. или инсерции трех остатков гуанина в спейсер промотора, приведшей к возникновению второго сильного промотора Р2 в дополнение к PCW, как в интегроне 1п2 (см. рис. 96).

Транспозон, включившийся в ген tniBAl интегрона InC*, близкородственен недавно описанному транспозону устойчивости к хрому ТпOtChr из семейства ТпЗ, обнаруженному в хромосоме устойчивого к хрому штамма Ochrobactrum tritici (Branco et al., 2008). Поэтому транспозон, входящий в состав TnJ045, был назван Тп OtChr*. Транспозоны Тп OtChr и TnOtChr* имеют размер 7189 и 7180 нуклеотидных пар, соответственно, и содержат ' два гена транспозиции (транспозазу и резольвазу), транскрибируемые в разных направлениях, что свойственно транспозонам подгруппы ТпЗ (см. рис. 8). Концевые повторы обоих элементов, размером 38 п. н., полностью идентичны. Между генами транспозиции располагаются четыре гена (chrB, А, С, F), входящие в состав оперона устойчивости к хрому. Нуклеотидные последовательности этих генов из обоих транспозонов высокогомологичны между собой (см. табл. 6). Единственным заметным отличием является делеция 9 нуклеотидов в гене chrA из TnOtChr* по сравнению с TnOtChr.

Таблица 6. Сравнительный анализ ТпОЮи* и ближайших родственных ему транспозонов _

Генный район Координаты2 Уровень гомологии по нуклеотидной посл-ти (длина района, п. н ./ %)

ТпОЮи^/ТпОЮи- Тп<Ж7г/-*/Тп из С. 1ев1ов1егот

трА+Ш.г 1-3000 2987/99,6 2998/99,9

с/ггР+прилегающий р-н 3001-3481 477/99.2 480/99,8

сИгС 3482-4088 607/100 607/100

с/;гЛ+прилегающий р-н 4089-5460 1369/99,8 1370/99.8

с/ггВ+прилегающий р-н 5461-6569 1102/99,4 1109/100

/лрЯ+Ш 6570-7180 607/99.5

а Координаты приведены по последовательности ТпОгСйг (ЕР469735). ° Ген трЯ отсутствует

Однако мы обнаружили еще один подобный транспозон, также имеющий аналогичную делецию, в недавно отсеквенированном геноме Сотатопав ¡ев^егот (00281704). Помимо этого в данном транспозоне полностью делегирован ген ШрК (см. табл. 6).

На сегодняшний день Тп5045 является единственным известным транспозоном множественной лекарственной устойчивости, содержащим интегрон, обнаруженным в древнем штамме. Кроме того, интегрон 1 класса 1пС*, входящий в состав Тп5045 представляет собой единственный известный интегрон, возникший задолго до начала использования антибиотиков. Согласно недавно предложенной модели эволюции интегронов (ОШ^э е1 а!., 2008), предшественником клинических интегронов 1 класса послужил хромосомный интегрон, который в какой-то момент оказался включенным в состав транспозона близкородственного Тп402, локализованного на плазмиде. Также было предположено, что отбор интегронов, содержащих гены устойчивости к антибиотикам, произошел в клинике спустя несколько десятков лет после начала «антибиотической» эры. Однако обнаружение в штамме палеобактерии из мерзлоты интегрона \пС*, содержащего кассетный ген устойчивости к стрептомицину/спектиномицину аас1А2, заставляет пересмотреть предложенную модель, поскольку с очевидностью свидетельствует о возникновении таких интегронов в природных популяциях бактерий задолго до начала применения антибиотиков. Массированное использование антибиотиков привело лишь к быстрому распространению интегронов, содержащих гены устойчивости, среди клинических штаммов, а также к их структурным изменениям.

Анализ нуклеотидных последовательностей всех известных сложных транспозонов, содержащих интегроны 1 класса, показывает, что в настоящее время выявлено, по крайней мере, девять независимых случаев внедрения интегронов в различные транспозоны из семейства ТпЗ (см. табл. 7). Для большинства из них базовыми элементами служат простые транспозоны устойчивости к ртути. Самой большой кластер подобных элементов образует подгруппа транспозона Тп2/, возникшая в результате инсерции интегрона 1п2 в транспозон близкородственный Тп5060 и последующих интеграции кассетных генов устойчивости к различным антибиотикам. Данная подгруппа широко распространена как среди клинических, так и среди современных природных

Таблица 7. Перечень независимо возникших сложных' транспозонов, содержащих интегроны.__• _

Название транспозона Базовый транспозон Интегрон 1 класса Кассетные гены Место инсерции интегрона

Транспозоны, содержащие гены устойчивости к ртути

Тп2/ типа Тп5060 1о2 aadA 1 >350 п. н. от res-сайта

Тп 1696 типа Тп5036 In 4 aacCl-orfE-aadA2-cmlAl Между сайтами resll и resl

Без имени типа Тп5036 In-tó oxa30-aadAl Между сайтами resll и resl; с отступом в 8 п. н. от места инсерции у Тп1696

Тп6005 типа Тп5036 In(Tn<500<5) Кассетный ген с неизвестными функциями Между сайтами resll и resl; с отступом в 6 п. н. от места инсерции у Тп/бРб

Без имени типа Тп505/ Без имени blaimpl3-aacA4 -200 п. н. от reí-сайта

Без имени типа Тп5051 In70.2 blavim 1-аасА 4-aadA2-mlA 1 В сайт resl

Другие транспозоны

Тп1412 ТпЭ"565 | In 32 blaNPS-l-aphA la В res-сайт

Тп 1403 типа Тп1013 In2S blaPl-cmlA 1-aadA В сайт resl

Тп5045 типа Тп/0/5 InC* aadA 2 Между сайтами resll и resl

штаммов бактерий (То1етап е1 а!., 2003). В отличие от данной подгруппы, Тп5045 произошел от транспозона Тп/0/3, не содержащего генов устойчивости к ртути. В настоящее время, помимо Тп5045, известно еще два случая подобных независимо возникших транспозонов, не содержащих те/'-оперона (см. табл. 7). Для одного из таких транспозонов, Тп¡403, как и для Тп5045, базовым элементом послужил транспозон Тп 1013. Однако Тп 1403 содержит интегрон 1п2§ вместо 1пС*, обнаруженного у Тп5045, и инсерцию транспозона типа Тп5393с вместо ТпО/Огг*.

Существенное преобладание транспозонов, обуславливающих устойчивость к ртути, среди содержащих интегроны сложных транспозонов, выделенных их клиники, может объясняться тем, что еще до начала использования антибиотиков препараты ртути применялись в качестве лекарств и дезинфектантов, что привело к распространению среди больничных штаммов транспозонов, содержащих тег-опероны. В течение последующего периода активного использования антибиотиков именно эти транспозоньт стали базовыми для внедрения интегронов и формирования сложных транспозонов множественной лекарственной устойчивости. В отличие от клинических, среди древних природных ртутных транспозонов не было обнаружено ни одного, содержащего интегрон.

Таким образом, полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что формирование сложных транспозонов, содержащих различные типы мобильных элементов и детерминант устойчивости к антибиотикам, происходило в популяциях природных бактерий задолго до начала применения антибиотиков в медицинской практике.

7. 2. Новый /5-элемент ¡БРру 1 и его роль в горизонтальном переносе генов устойчивости к антибиотикам.

В ходе опытов по транспозиции, из древнего штамма Рц'скгоЪас1ег тагШтиъ МЯ29-12, устойчивого к стрептомицину и тетрациклину, удалось перенести оба гена устойчивости на плазмиду ЯР4-5М. Образовавшуюся плазмиду обозначили КР4-5М80-1. С помощью дополнительных опытов по мобилизации, из ЯР4-5М80-1 удалось переместить интересующий нас транспозон на векторную плазмиду

1 т.п.н. а

[Гуж»;—[^ОСЖЕНЭЧЕИМВЕ ркьвдо

трл пг/У' 1сгК 1с!Н ог/А Iпг/Х___ ШРру!

кг?вл т зояо

ог/,4 чг]\ "''К ичн ——

II I I I I I I I I I I II III I I I II II I I II I I I I I I

1Иг ТАТААТАСТСССаЗААААСТАСАССААААААТТвТАОСАААТААвАТАОА

Рисунок 10. Молекулярно-генетическая структура \SPpyl и образованных им составных транспозонов.

а. Молекулярно-генетическая структура района рКЬН80, содержащего гены устойчивости к антибиотикам и образованных на его основе Тп5080а и Тп5080. Серым цветом обозначены последовательности РзусИгоЬаМег (районы 1 и 5, см. табл. 8), белым - АстеюЬааег (район 2), черным - AIcaligenes (район 3), штриховкой -Нуз^рИИив (район 4). 1е/Н(К) - гены устойчивости к тетрациклину; огог/О, ог/Хи ог^' - открытые рамки считывания (см. текст); ог/А и ог/В - гены транспозиции \SPpyl. Левая копия \SPpyl имеется только в составных транспозонах Тп5080 и Тп5080а. Жирной линией обозначено местоположение зонда на \SPpyl, использованного в опытах по гибридизации. Остальные обозначения, как на предыдущих рисунках, б. Выравнивание последовательностей правого (1Яг) и левого (1Ш) концевых инвертированных повторов \SPpyl.

рОЕМ7. Секвенирование переместившегося в рОЕМ7 мобильного элемента показало, что он представляет собой типичный составной транспозон, размером 7193 п. н., содержащий гены устойчивости к стрептомицину и к

тетрациклину Н), фланкированный двумя идентичными копиями ранее неизвестного [Б-элемента, принадлежащего к обширному семейству 155 (см рис. 10а). Новый транспозон был назван Тп5(Ш (АМ992204), а Ш-элемент - \SPpyl. Поскольку процесс перемещения Тп5080 проходил в несколько этапов со сменой различных хозяев и плазмид, что могло привести к изменениям в структуре транспозона такого типа, мы сочли необходимым выяснить локализацию района ДНК, входящего в состав Тп5080 в исходном штамме, а также количество содержащихся в нем копий \?>Рру1. Кроме этого было поставлено еще несколько независимых опытов по перемещению генов устойчивости из исходного штамма на плазмиду ИР4-5М и проведен анализ отобранных клонов

1 2 1 2 3 4 5 6

а б

Рисунок 11. Определение количества копий ISPpyl.

Результаты Саузерн-гибридизации

препаратов ДНК обработанных рестриктазой Avail. При такой рестрикции количество полос, гибридизующихся с

зондом на Шру1 (см. рис. 10а), соответствует количеству копий 15-элемента, содержащихся в анализируемой ДНК.

а. Определение числа копий 1БРру1 и его локализации в исходном штамме Р. тагШтш МЯ29-12. 1 - ДНК плазмиды рКШ80, содержащейся в МП29-12, 2 -суммарная ДНК МЯ29-12. б. Определение числа копий \SPpyl у клонов, полученных в опытах по перемещению генов устойчивости из исходного штамма на плазмиду ЯР4-5М. Продукты

одноконцевой транспозиции: 1 - ЯР4-5М11, 3 - ЯР4-5МШ и 4 - ЯР4-5М1У; 2-плазмида ЯР4-5М1, содержащая Тп5080, 5 - рКЬН80; б - ЯР4-5М.

транспозантов. С помощью Саузерн-гибридизации, а также ПЦР, было установлено, что в исходном штамме содержится только одна копия IS Ppyl (находящаяся правее генов устойчивости), которая вместе с генами strA-strB и tetR{Н) локализована на конъюгативной плазмиде, обозначенной нами pKLH80 (см. рис. 11а). Результаты Саузерн-гибридизации трех новых независимо полученных транслокаций генов устойчивости на плазмиду RP4-5M показали, что во всех этих случаях перемещение произошло за счет единственной копии YbPpyl (см. рис 116), что свидетельствует о способности этого элемента к одноконцевой транспозиции. Впоследствии в опытах по перемещению генов устойчивости на pGEM7 был обнаружен еще один независимо возникший составной транспозон, обозначенный нами Тп5080а. Секвенирование этого вновь возникшего транспозона, показало, что он, по сравнению с Тп5(Ш, содержит более протяженный фрагмент ДНК из pKLH80, также обрамленный двумя копиями IS Ppyl (см. рис 10а). В остальном молекулярно-генетические структуры обоих транспозонов полностью идентичны.

Анализ района из pKLH80, содержащего гены устойчивости к антибиотикам и входящего в составные транспозоны, показал, что он является мозаичным и состоит из нескольких фрагментов ДНК, высокогомологичных нуклеотидным последовательностям, обнаруженным в различных бактериях (см. рис. 10а и табл. 8), что указывает на активное участие горизонтального переноса в формировании данной области. На левом фланге этой последовательности (район 1) располагается участок, входящий в состав только более протяженного Тп5080а (см. рис 10а и табл. 8). Он включает в себя последовательности, обнаруженные в плазмидах из различных штаммов психробактера, и содержит IS-элемент, родственный 1S4. Значительная часть данного района не содержит известных генов и ORF. Далее следует район 2, левая часть которого также содержится только в Тп5080а (см. рис 10а и табл. 8). В этот район входит IS-элемент, не имеющий гомологии с YbPpyl, хотя и относящийся к тому же семейству IS5, и три открытые рамки считывания. Две из них, orfZ и orfQ, по-видимому, повреждены концевыми делениями и функции их неясны. Третья рамка, обозначенная orpi, предположительно кодирует белок рестрикции/модификации

ДНК,.участвующий.в мобилизации плазмид. Последовательность района 2 имеет гомологию с хромосомной и плазмидной ДНК из штаммов Acinetobacter baumanii. Район 3 содержит гены устойчивости к стрептомицину и на 100% идентичен участку транспозона Tn5393d (Chiou & Jones, 1993: Mantengoli & Rossolini, 2005). Как уже было сказано выше, Тп5393 и его производные широко распространены среди современных бактерий, обитающих в самых различных экологических нишах (Sundin, 2000). В составе pKLH80 имеется только правая часть этого транспозона, включающая в себя гены устойчивости к стрептомицину strA-strB, некодирующий район ДНК размером 40 п. и., примыкающий к 5'-концу гена strA, и правый концевой повтор (см. рис 10а и табл. 8). Район 4 включает в себя гены teíR(H) и проксимально прилегающий к ним фрагмент ORF (ог/У). В целом, данный район, за исключением одного нуклеотида, полностью идентичен участку геномной ДНК из клинического штамма Histophilus somni 2336 (см. рис 10а и табл. 8). Фрагмент orff имеет размер 446 п. н. и соответствует З'-части (нуклеотиды с 73 по 518) открытой рамки считывания с неизвестными функциями, обнаруженной в геноме Н. somni. Вероятне всего, 5'-конец orfï был утрачен в результате внедрения транспозона типа Тп5393. Гены íetR-tet{H), обладающие высокой гомологией с генами устойчивости к тетрациклину из штаммов родов Pasteurella, Mannheimia, Acinetobacter, Moraxella и Actinobacillus, вызывающих различные инфекционные заболевания у человека и животных (Kehrenberg et al., 2001, Miranda et al., 2003, Blanco et al, 2006). В составе pKLH80 концевой фрагмент гена tet{H), размером 21 п. н., делетирован, вероятнее всего, в результате инсерции ISPpyl. Такой укороченный вариант белка TetH состоит из 393 аминокислотных остатков вместо 400, входящих в состав полноразмерного продукта. Однако эта делеция не влияет на функции белка и обуславливает устойчивость к тетрациклину, как исходного древнего штамма P. maritimus, так и всех лабораторных штаммов Acinetobacter и Е. coli, в которые мы переносили

Таблица 8. Молекулярно-генетический анализ района плазмиды рКЫ180, содержащего гены устойчивости к антибиотикам.__

Район Размер п. н. G+C % Ближайшие последовательности Гомология с pKLH80, %

1. 15-элемент, родственный 18</ и прилежащий район 2040 43 Psychrobacter cryohalolentis К5, плазмида1 (СР000324) 96(1-991); 67(1580-2040)

2. ог/2,15-элемент, семейства 155/189//, ог/О, огрС и прилежащие участки 1282 35 Acinetobacter baumannii MDR-ZJ06 (СР001937) 100

698 Acinetobacter baumannii SDF p2ABSDF плазмида (CU468232) 68

523 63

3. $1гА->ХгВ И прилежащий район 1786 56 Alcaligenes faecalis Tn5393d (AJ627643) 100

4. Аог/¥-1е1Р-1еЦИ) 2346 41 Histophilus somni 2336 (CP000947) 99

5. \SPpyl 1275 43 Psychrobacter sp. (AFHU01000091, AFHU01000198) 99 98,0

плазмиды, содержавшие данный ген. Правее генов устойчивости к тетрациклину располагается ISPpyl (см. рис 10а и табл. 8). Два фрагмента IS-элемента, практически идентичного IS Ppyl, были обнаружены в составе двух контигов из сданного в конце 2011 г. в Генбанк (GenBank) и еще полностью не отсеквенированного генома штамма Psychrobacter sp. 1501, выделенного из крови человека. Первый контиг (AFHU01000091) содержит левый фланг IS-элемента, включающий в себя фрагмент гена orfA, на 99% (три замены на 343 нуклеотида) идентичный последовательности IS Ppyl, и левый концевой повтор, полностью идентичный левому TIR из IS Ppyl. Другой контиг (AFHU01000198) содержит правую часть IS-элемента, состоящую из концевого повтора, полностью идентичного правому TIR из ISPpyl и полноразмерного гена orfB, на 98% (18 замен на 848 нуклеотидов) идентичного последовательности из ISPpyl.

В связи с тем, что были выявлены необычные свойства IS Ppyl, в частности его способность с необычайно высокой частотой формировать составные транспозоны, и эффективно мобилизовывать близлежащие гены устойчивости к антибиотикам, мы решили детально изучить свойства этого нового IS-элемента. IS Ppyl обладает рядом свойств, характерных и для других представителей семейства IS3: (1) размер элемента сходен с другими членами данного семейства и составляет 1275 п. н.; (2) содержит две, расположенные друг за другом, открытые рамки считывания (orfA и or В), кодирующие транспозиционные белки (см. рис 10а); (3) содержит сигнал запрограммированного сдвига рамки считывания (frameshifting signal; FS-сигнал) между orfA и orfB, необходимого для образования слитого белка транспозазы OrfAB (Mahillon & Chandler, 1998). Однако ряд свойств IS Ppyl отличают его от типичных представителей семейства IS3. Так, терминальные концевые повторы ISPpyl имеют больший размер (49 и 50 п. н.) и заканчиваются 5-ТА-...-ТА-3' (см. рис. 106), в отличие от большинства других членов семейства IS3, для которых характерны TIR длиной 20-40 п. н., оканчивающиеся 5'-TG-...-CA-3 (Mahillon & Chandler, 1998).

Наличие высокой функциональной активности IS Ppyl и происходящих от него мобильных элементов в клетках E.coli позволило нам провести следующую серию экспериментов по определению частоты и механизмов перемещения, а также структуры продуктов транспозиции. В этих опытах мы использовали ранее апробированный генетический метод скрещивания с отбором рекомбинантных плазмид (mating out experiments). В качестве плазмиды-мишени взяли плазмиду среднего размера R388. В качестве донорных плазмид нами были использованы специально отобранные для этих опытов рекомбинантные плазмиды, производные pBR325 (см. рис. 12а). Первая из них, pBR325-Ppyl, содержала только IS Ppyl, вторая, pBR325-80.1, - IS Ppyl с генами устойчивости к антибиотикам, третья, pBR325-80.2, - транспозон Тп5080а. Все эти плазмиды содержали ISPpyl и производные мобильные элементы в гене Ыа, что позволяло более адекватно сравнивать частоты их перемещения и структуру образующихся продуктов. Указанные плазмиды с помощью трансформации совмещали с R388 в клетках штамма E.coli JF238. После инкубации выросшие культуры скрещивали со штаммом E.coli C600rif и определяли частоту транспозиции и фенотип транспозантов.

Анализ полученных данных выявил существенные отличия в характеристиках перемещения сложного транспозона Тп5080а, фланкированного двумя копиями ISPpyl, и неполного транспозона, содержащего только одну копию этого

1 2 3 4 5 6

б В

Рисунок 12. Структура рекомбинантных плазмид, содержащих мобильные элементы в гене Ыа pBR325, и результаты анализа различных посадок мобильных элементов в R388.

а. Схематические изображения использованных плазмид: pBR325-Ppyl содержит только одну копию ISPpyl, pBR325-80.1 - одну копию ISPpyl и прилежащие гены устойчивости, pBR325-80.2 - Tn5080а. IS Ppyl изображен серой стрелкой; участок плазмиды pKLH80, содержащий гены устойчивости к стрептомицину и тетрациклину, -серой линией, б. Предполагаемая структура коинтегратов, образующихся в результате одноконцевой транспозиции из плазмиды pBR325-80.1 и перемещения TnJOSOa из pBR325-80.2 в плазмиду R388. Последовательность pBR325 обозначена жирной линией, в. Результаты Саузерн-гибридизации с зондом на ISPpyl плазмидных ДНК, обработанных Avail (см. подпись к рис. 11): 1 - ДНК R388; 2 - ДНК транспозанта из pBR325-80.1 (одноконцевая транспозиция); 3, 5 и 6-ДНК транспозантов Tni080а; 4-ДНК фага X, рестрицированная Pstl (весовой маркер).

элемента (табл. 9). При использовании неполного транспозона не только резко снижалась частота перемещения генов устойчивости, но и способность образовывать простые инсерции. Оказалось, что все изученные транспозанты представляют собой продукты объединения ДНК обеих плазмид (коинтеграты) (табл. 9 и рис ¡2 б): об этом свидетельствовали, в частности, данные по их одновременной устойчивости к хлорамфениколу (маркер pBR325) и триметоприму (маркер R388). Среди продуктов транспозиции Тп5080а обнаруживались как коинтеграты, так и простые инсерции с преобладанием последних. Самая высокая частота транспозиции была получена при перемещении самого \SPpyl (без прилегающих генов). Следует отметить, что в этом случае было возможно отбирать только коинтеграты (табл. 9).

R388

PBR325-80.2

R388

Таблица 9. Частота образования транспозантов при перемещении ISPpyl и

содержащих его элементов из pBR325 в R388

Плазмида-донор Частота Всего проверено Из них:

перемещения в транспозантов

R388* Tp-r Sm-r Rif-r Tp-r Cm-r Rif-r • Cm-s Cm-r

pBR325-80.2 1,1x10 "6 94 - 83 (88,3%) 11 (11,7%)

pBR325-80.1 2,6x10 8 21 - 0 21 (100%)

pBR325-Ppyl 2.2x10 "5 - 40 0 40(100%)

Сводные данные 2-х опытов. *Sm-rRif-rAp-rRif-r в первых двух скрещиваниях и Cm-rRif-r/Tp-rRif-r- в 3-ем скрещивании

Чтобы получить данные о механизмах перемещения IS Ppyl и содержащих его мобильных генетических элементов, мы проанализировали молекулярную структуру образовавшихся в этих опытах продуктов транспозиции. Для этого плазмидная ДНК 6 транспозантов IS Ppyl, 5 - Tn5080а и 13 продуктов одноконцевой транспозиции была рестрицирована Avail и прогибридизована с зондом на IS Ppyl. Сводные данные по анализу структуры транспозантов различных типов представлены на рис 12в. Выводы, полученные при фенотипическом анализе структуры продуктов транспозиции при перемещении полного и неполного транспозона, были подтверждены с помощью Саузерн-гибридизации. Видно, что продукты одноконцевой транспозиции содержат по две копии IS Ppyl (дорожка 2), что свидетельствует о возникновении коинтегратов. При перемещении Тп5080а возникают 2 типа продуктов транспозиции: прямые инсерции (дорожки 5 и 6) и коинтеграты (дорожка 3, а также рис. 126). При перемещении самого IS Ppyl, также как и сложного транспозона, образуются как прямые инсерции, так и коинтеграты (данные не представлены).

Полученные результаты выявили значительно более высокую эффективность перемещения генов устойчивости, фланкированных двумя копиями IS Ppyl, по сравнению с эффективностью их мобилизации посредством одной копии этого элемента, а также способность сложных транспозонов, фланкированных двумя копиями IS Ppyl, образовывать простые инсерции в процессе транспозиции.

Мы провели серию специальных экспериментов, чтобы выяснить инсерционную специфичность IS Ppyl. Для этого был разработан метод получения посадок IS Ppyl и производных мобильных элементов в ген Ыа векторных плазмид. Это позволило получить ряд независимых посадок IS Ppyl и Тп5080а и проанализировать места инсерций и размер прямых дупликаций мишени, а также ориентацию внедрившихся мобильных элементов. Были исследованы 3 инсерции IS Ppyl и Tn5080а в pBR325 и 7 инсерций Тп5080а в pGEM-5Z. Было обнаружено, что обе возможные ориентации инсерций наблюдались с одинаковой частотой (см. рис. 13). В местах посадок наблюдались прямые дупликации мишени длиной 3-5 п. н., что характерно для всех представителей семейства 1S3. Все инсерции были равномерно распределены по всей протяженности гена Ыа. Такой характер распределения посадок указывает на то, что, в отличие от других представителей IS5 семейства, IS Ppyl не обладает выраженной инсерционной специфичностью. . , ,

^-3 9-^10-

3594 3688 3801 3895 3981

3325 3596 3749

1 ttaatcagtgaggcacctat CTC agcgatctgtctatttcgtt

2 tcccgtatcgtagttatcta CACGA cggggagtcaggcaactatg

3 cagcaataaaccagcoagcc GGA agggccgagcgcagaagtgg

4 gccagttaatagtttgcgca ACGT tgttgccattgctgcaggca

5 cagttaatagtttgcgcaac GTT gttgccattgctgcaggcat

6 caacgatcaaggcgagttac ATG atcccccatgttgtgcaaaa

7 gtcctccgatcgttgtcaga AG taagttggccgcagtgttat

8 tacggatggcatgacagtaa GAG aa ttatgcagtgctgcca ta

9 tgtatgcggcgaccgagttg CTC ttgcccggcgtcaacacggg

10 tggaaaacgttcttcggggc GAA aactctcaaggatcttaccg

Рисунок 13. Инсерционная специфичность ISPpyl.

Места инсерций IS Ppyl и Тп5080а в ген Ыа плазмид pBR325 и pGEM-5Zf(-). Горизонтальные стрелки указывают местоположение и ориентацию посадок мобильных элементов: белые - ¡SPpyl, черные - Тп5080а. Номера над стрелками указывают порядковый номер посадки, цифры под линией - местоположение инсерции по последовательности pBR325 (L08855). Ниже приведены нуклеотидные последовательности, обрамляющие инсерции. Номера слева указывают порядковый номер посадки: последовательность прямых дупликаций мишени показана в центре.

Нами было проведено исследование распространения IS Ppyl среди современных и древних природных грамотрицательных бактерий. С помощью гибридизации колоний мы провели скрининг коллекции, содержащей 7 штаммов, относящихся к роду Psychrobacter, 20, принадлежащих к близкому к психробактеру роду Acinetobacter и 26 штаммов из родов других грамотрицательных бактерий, на наличие в ней IS-элементов, близкородственных IS Ppyl. Однако ни один из штаммов, включая P. maritimus 3pS, не содержал последовательностей, родственных IS Ppyl. Эти данные свидетельствуют о низкой транспозиционной активности ISPpyl в его природном хозяине и близкородственных ему штаммах.

Чтобы выяснить происхождение IS Ppyl и найти родственные ему элементы, мы провели биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей из общедоступных баз данных. Как уже было упомянуто выше, фрагменты IS-элемента, высокогомологичного IS Ppyl, были обнаружены в недосеквенированном геноме Psychrobacter sp. 1501. Вероятнее всего, в данном штамме содержится полноразмерная копия варианта IS Ppyl. Больше IS-элементов, близкородственных IS Ppyl, в Генбанке найдено не было. Однако мы обнаружили обширную группу IS-элементов со значительно более низкой, но всё же существенной гомологией с IS Ppyl. Один из этих элементов был идентифицирован нами в штамме Cyanothece sp. АТСС 51142 (Welsh et al., 2008). Мы обозначили этот IS-элемент как IS Cysp20 и сравнили его структуру с IS Ppyl. Оказалось что гомология между IS Ppyl и IS Cysp20 по аминокислотным последовательностям, кодируемых ими белков OrfA и Orffi, составляет

соответственно 45 и 56%, причем гомология в наиболее консервативном районе (DD(35)E мотиве) размером 102 а.о. достигает 62%/Необходимо отметить, что по всей вероятности, подобно ISPpyl, ISCysp20 также не способен активно перемещаться в хозяйском штамме. Об этом свидетельствует наличие единственной копии ISCvsp20 в штамме Cyanothece 51142 в составе линейной хромосомы (429701 п. н.), тогда как ни на кольцевой хромосоме (4, 934 т. п. н.), ни на одной из четырех плазмид, которые содержит данный штамм, не было обнаружено дополнительных копий элемента.

Чтобы выяснить эволюционные связи между IS Ppyl и родственными ему элементами и другими хорошо изученными членами семейства IS.?, нами были построены филогенетические деревья на основании анализа аминокислотных последовательностей белков OrfA и OrfB (рис. 14а и б). Результаты проведенного анализа показали, что IS Ppyl, IS Cysp2Q и другие родственные им элементы образуют отдельную, ранее не выявленную подгруппу внутри семейства IS3. Мы назвали данную новую подгруппу ^/^./-подгруппой. lS-элементы из данной подгруппы часто обнаруживаются в геномах бактерий, принадлежащих к самым разным семействам. В частности, в составе хромосом и на плазмидах мы обнаружили такие IS-элементы у представителей альфа (Gluconobacter, Azospirillum, Magnetospirillum, Methylobacterium, Sphingobium, Acetobacter, Asticcacaulis, Paracoccus, Sphingomonas, Rhizobium и другие), бета (Nitrosomonas, Azoarcus, Polaromonas), гамма (Acidithiobacillus, Marinobacter, Halorhodospira) и дельта (Geobacter, Pelobacter, Desulfatibacillum, Desulfovibrio) групп протеобактерий, а также v штаммов из таксонов Deferribacteres (Denitrovibrio), Firmicutes (Moorella, Desulfotomaculum, Pelotomaculum, Syntrophomonas, Bacillus, Sulfobacillus), Bacteroidetes (Spirosoma, Leadbetterella), Spirochaetes (Spirochaeta), Chlorobi (Chlorobium, Pelodictyon), Actinobacteria (Mycobacterium), Nitrospirae (Nitrospira) и цианобактерий (Cyanothece, Acaryochloris). Некоторые из этих IS-элементов представлены в таблице 10.

Как было показано ранее (Mahillon & Chandler, 1998), транспозазы всех членов семейства IS3 содержат общие для всех них консервативные аминокислоты в каталитическом домене (так называемом DD(35)E мотиве). Кроме того, каждая из подгрупп этого семейства дополнительно имеет свой собственный набор консервативных аминокислот в данном районе, характерный лишь для данной подгруппы. Мы выяснили, что члены ISP/Л'/-подгруппы также содержат в составе DD(35)E мотива свой собственный набор консервативных аминокислот, отличный от всех других описанных до этого подгрупп из семейства ISJ (см. рис. 14в). Следует отмстить, что все проанализированные нами элементы из ISPpyi-подгруппы на месте сигнала запрограммированного сдвига рамки считывания содержали сигналы нетипичные для IS-элементов (Baranov et'al., 2002). Так вместо типичного для известных представителей семейства ISJ сигнала запрограммированного сдвига рамки считывания (A)6G,' y ISPpyl имеется мотив (A)8G, содержащий два дополнительных остатка аденина, а у ISCysp20 - (A)9G), содержащий три лишних остатка. У других представителей из ISP/rt'./-подгруппы мы обнаружили последовательности сигналов ранее не описанные у IS-элементов: (U)6G, (U)6A, (A)9U (см. табл. 10). Следует, однако, отметить, что функциональная активности этих сигналов исследована не была.

S107 I SI 222—1

ГЦ

-IS JO' -I

-ISR:

-is:

-ISC,,; I -ISAili -ISfpvl

-IS AS: 13 -|S(i!«<!

IS407 IS2

OrfA

-ISCysrt«' . —tS! 597—Г -IS 15d J -IS,

-ISi.iiO _|

-1451 —1 -IS »01 J

IS Ppy1

IS15 0

IS3

IS57

-1S«W -is: -isi -is I -ISti\>l " -is.-Mi's

-1М,|<У> -ISO. spin —1'рч I

-ISAfcl3 .

IS3 ISI50

OrfB

-is; i —ISIlll

-ISRml -IS2 -ISJC -IS 122:

и 1 -a

IS Ppy1

IS5f

IS2

IS407

IS407 vs-DFv- ¡58) i-sDnGpEfts (35) I-pGkP-QNgy-EsFNgr-R

IS2 WCSDGfE (63-67) -LtDnGS-f-a (35) T-v-sPqsHG-aE-Fvkt-K

IS3 w—DiTy (58-601 -HsD-Gs-y-s (35) s--G—dN---Esi---IK

IS5Y KV-D-TY (58-64) HHsDrG-QV-s (35) GS-qdSyDNAlAE-iN'q-yK

IS 750 v-TDvTe (57-60) -hsDqGw-Y- (35) S-kGnc-dM---E-«~lK

IS Ppyl к—Ditv (56-57) FHtDQGsQfT (35) Dg-Gr--DN-f-ERlWr--K

Рисунок 14. Филогенетические дендрограммы, построенные на основании анализа аминокислотных последовательностей белков OrfA (а) и OrfB (б) методом максимального правдоподобия (maximum likelihood method).

Использованы последовательности двух представителей из каждой ранее описанной подгруппы IS3 семейства (Mahillon & Chandler, 1998), а также членов обнаруженной нами новой подгруппы ISPpyl. ACs: IS2 АР009048, 1S3 АМ946981, IS5/ М14365, ISI50 Х07037, IS401 L09108, IS407 M82980, IS600 X05952, 1S9H CP000034, IS/222 X78052, IS 1296 BX293980, ISRml X56563, IS Ppyl AM992204, ISCysp20 CP000807, ISAfel3 CP002985, ISAli5 FQ311868, ISG/об CP001090, ISGxyl AP012160. в. Сравнение DD(35)E - консервативного района новой подгруппы IS Ppyl и ранее известных подгрупп IS5 семейства (IS-/07, IS2, IS3, ISJ/ and IS/50). Схема построена на основании рис. 3 из статьи Mahillon and Chandler, 1998, с модификациями и дополнениями. Указаны аминокислоты, образующие отдельные участки консервативного района, свойственные каждой из подгрупп 1S3 семейства. Жирными заглавными буквами обозначены аминокислоты, имеющиеся у всех членов семейства, обычными прописными' - консервативные для каждой подгруппы; строчными -встречающиеся у большинства представителей каждой подгруппы. Цифры в скобках указывают количество аминокислотных остатков между аминокислотами консервативных мотивов.

Таблица 10. Сравнение структуры 18-элементов типичной для представителей 183 семейства и членов [Б/УнУ-подгруппы_

Название/хозяин Локализация Длина, п.н. Концевые повторы Прямые повторы Frame- shifting signals AC

Длина, лев/прав Концевые нуклеотиды

1S3 семейство ° - 12001550 20-40 5'-TG-CA-3' 5'-ТА-СА-3' - .3,4. (A)6G -

IS Ppyl, Psychrobacter niaritimus MR29-12 рКЬН80 1275 49\50 э'-ТА-ТА-З' 2-5 . . (A)8G AM992204

IS CysplO, Cyanothece sp. ATCC 51142, Линейная хромосома 1283" 42\53 0 S'-TG-TG^'" (A)9G CP000807

\SAfel3 Acidithiobacillus ferrivorans SS3 хромосома 1334 48\54 5'-ТА-ТА-3' 3 (A)gG CP002985

IS AUS, Azospirillum lipoferum 4B Основная хромосома 1266 42\51 5'-TG-CA-3' (U)6GC FQ311868

\SGIo6, Geobacter lovleyi SZ рОШУСП 1281 0 42\51 0 5'-CT-AG-3''' (A),UC CP001090

IS Gxyl, jluconacetobacter xylinus NBRC 3288 рвХУОЮ 1313° 41 \43" 5'-AG-CT-3'b. (U)<AC AP012160

а обобщенные данные; 0 определено приблизительно; с предполагаемые сигналы запрограммированного сбоя рамки считывания, не описанные ранее у 15-элементов.

Помимо этого, подобно \SPpyI, все проанализированные нами представители из его подгруппы имеют более длинные, по сравнению с членами других подгрупп из семейства 183, терминальные инвертированные повторы, оканчивающиеся также нехарактерными нуклеотидами (см. табл. 10).

Таким образом, нами открыта ранее неизвестная подгруппа 18-элементов, единственным функционально изученным представителем которой является \SPpyI, обнаруженный нами в древнем штамме РзуЫггоЬаШг тагШтиБ МГ129-12. Нами охарактеризованы основные свойства \SPpyl и получены данные, свидетельствующие о важной роли этого элемента в мобилизации генов устойчивости к антибиотикам. '

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Благодаря тому, что нам удалось создать коллекцию палеобактерий, обладающих устойчивостью к соединениям ртути и различным антибиотикам, стало возможным проведение сравнительного изучения молекулярно-генетической структуры детерминант устойчивости современных и древних бактерий и их распространения до начала активного антропогенного воздействия на биосферу. Было обнаружено, что, как и, у современных штаммов, у палеобактерий детерминанты устойчивости к ртути часто входят в состав плазмид

и транспозонов., Среди совсем небольшого числа штаммов из созданной коллекции были обнаружены все основные типы известных современных транспозонов, участвующих в распространении генов устойчивости к ртути и стрептомицину (табл. И). Обнаруженный нами в мерзлоте ранее неизвестный транспозон нового типа, Тп5042, также оказался широко распространен как среди древних, так и среди современных бактерий. В ходе данной работы мы выявили ряд ярких примеров горизонтального переноса различных детерминант устойчивости и ^-элементов (табл. 11).

Таблица 11. Примеры горизонтального переноса мобильных элементов, обнаруженных у древних бактерий.

Древние мобильные элемент!

Современные мобильные элементы

Название

Хозяин

Название

Хозяин

Место выделения

ТпэТШ var8

TniOiJ var9

Тп5(Ш (Y17897)

Pseudomonas 1Ei

Транспозоны, содержащие /яег-оперон

P. putida

Тп5(Ш прототип (L40S85)

Тп50580 (АМ048832)

Xanthomonas campestris

Средняя Азия (грунт из Хайдарканского месторждения)

Некультивируемый микроорганизм

Казахстан (речная _вода)_

Тп5042 прототип (AJ563380)

Р. ßuorescens

Тп5042var 1 (АМ235768)

P. ßuorescens

Англия (сахарная свекла)

Тп5060 (AJ551280)

Pseudomonas sp.

Тп 21 (+Int) (АР000342)

Тп5075 (без 1т) (АР457211)

Тп5041В

Р. ßuorescens

Тп5041 прототип (Х98999)

Shigella ßexnery

Япония (больница)

Е. coli

Англия (больница)

Pseudomonas sp.

Tn559ic

Транспозон, содержащий гены устойчивости к стрептомицину

Средняя Азия (грунт из Хайдарканского месторждения)

Р. putida Acinetobacter sp.

Brevundimonas vesicularis

Tn5393c (AF262622)

Aeromonas salmonicida

Норвегия (рыба)

Tn OtChr* (FN821089)

Другие мобильные элементы

Pseudomonas sp.

Tn OtChr (AF313472)

Ochrobactrum tritici

Португалия (земля, загрязненная заводскими стоками)

ISPpyl прототип (АМ992204)

Psychrobacter maritimus

IS Ppylvl (AFHUO 1000198, AFHUO1000091)

Psychrobacter sp.

США (больница)

Из таблицы 11 видно, что формирование и широкое распространение всех основных типов транспозонов произошло уже в древности. До сих пор многие из

из них продолжают встречаться по всему миру у штаммов, обитающих в природных сообществах. Некоторые же обнаруживаются у клинических штаммов, убедительно свидетельствуя о том, что именно природные популяции бактерий служат основным источником как самих детерминант устойчивости, так и их отдельных частей, для клинических штаммов.

Хозяйственная деятельность человека привела к быстрому формированию из уже существовавших до этого мобильных генетических элементов новых сложных транспозонов, типа Тп21, несущих одновременно детерминанты множественной лекарственной устойчивости и /яег-оперон. Об этом мы можем судить по обнаружению в мерзлоте как простого, содержащего только гены устойчивости к ртути, транспозона Тп5060, практически не отличающегося по нуклеотидной последовательности от гипотетического предшественника Тп21, так и интегрона 1шС*, содержащего единственный кассетный ген устойчивости аас!А2, и, в свою очередь, также близкородственного гипотетическому предшественнику группы современных клинических интегронов.

выводы

1. Впервые из многолетнемерзлых отложений выделена коллекция устойчивых к соединениям ртути и различным антибиотикам палеобактерий, относящихся к родам Pseudomonas, Xanthomonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Brevundimonas, Psychrobacter, Plesiomonas, Sphingomonas, Paenibacillus, Exiguobacterium.

2. Продемонстрировано наличие у древних штаммов бактерий конъюгативных и неконъюгативных плазмид, содержащих тег-опероны и гены устойчивости к антибиотикам.

3. У Hg-r палеобактерий обнаружены все основные типы содержащих тег-оперон транспозонов, повсеместно распростаненных среди современных природных бактерий, что свидетельствует об их широком распространении еще до начала антропогенного загрязнения биосферы.

4. В древнем штамме Pseudomonas sp. обнаружен простой транспозон Тп5060, практически идентичный гипотетическому предку, сложного MDR транспозона Тп 21, что служит подтверждением гипотезы о происхождении сложных клинических MDR транспозонов подгруппы Тп21 от простого ртутного транспозона.

5. В штамме Pseudomonas ßuorescens из мерзлоты обнаружен ртутный транспозон нового типа, названный Тп5042, транспозиционный модуль которого гомологичен мобильным элементам из семейства IS66. Тп5042 широко распространен как среди древних, так и среди современных бактерий.

6. У ряда штаммов палеобактерий обнаружены гены устойчивости к стрептомицину aadA2 и strA-strB, а также транспозоны близкородственные Тп.5393, активно участвующему в горизонтальном переносе генов strA-strB среди современных клинических и природных бактерий. Это свидетельствует о возникновении детерминант устойчивости к стрептомицину и их широком распространении среди природных бактерий задолго до начала использования антибиотиков.

7. В природной плазмиде древнего штамма Psychrobacter maritimus обнаружен новый IS-элемент, названный ISPpyl, относящийся к семейству 1S3, а также гены устойчивости к стрептомицину strA-strB и к тетрациклину tetR-tet(H), высоко гомологичные генам современных клинических штаммов бактерий. IS Ppyl способен осуществлять горизонтальный перенос этих генов устойчивости либо путем одноконцевой транспозиции, либо за счет формирования составных транспозонов.

8. Открыта новая подгруппа IS-элементов в составе семейства IS5, единственным функционально охарактеризованным представителем которой является \SPpyl.

9. В хромосоме древнего штамма Pseudomonas sp. обнаружен новый сложный транспозон, названный Тп5045, состоящий из трех различных мобильных элементов, вставленных последовательно один в другой. Все мобильные элементы, входящие в состав Тп5045, высокогомологичны современным, но в целом образуют уникальный ранее неизвестный сложный транспозон.

10. Составные элементы (простые ртутные транспозоны, интегроны и кассетные гены устойчивости к антибиотикам) сложных транспозонов множественной лекарственной устойчивости подгруппы Тп2/ возникли у природных штаммов бактерий задолго до начала хозяйственной деятельности

человека, а в результате применения ртутных препаратов и антибиотиков в медицине в клинике произошло быстрое формирование сложных транспозонов из подгруппы Тп21 и их распространение. '

11. Природные бактерии являются естественным «резервуаром» генов устойчивости, попадающих в клинические штаммы бактерий путем горизонтального переноса. '

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых научных журналах из списка ВАК:

1. Bogdanova E.S., Bass 1.А., Minakhin L.S., Petrova M.A., Mindlin S.Z., Volodin A., Kalyaeva E.S., Tiedje J.M., Hobman J.L., Brown N.L., and Nikiforov V.G. 1998. Horizontal spread of mer operons among Gram-positive bacteria in natural environments. Microbiology 144:609-620.

2. Никифоров В.Г., Басс И.А., Богданова Е.С.. Горленко Ж.М., Каляева Э.С., Коптева А.В., Ломовская О.Л., Минахин Л.С., Минахина С.В., Миндлин С.З., Петрова М.А.. Холодий Г.Я., Юрьева О.В. 1999. Распространение транспозонов устойчивости к ртути в природных популяциях бактерий. Мол. биология 33: 5562.

3. Миндлин. С.З., Басс И.А., Богданова Е.С., Горленко Ж.М., Каляева Э.С., Петрова М.А.. Никифоров В.Г. 2002. Горизонтальный перенос генов устойчивости к соединениям ртути в природных популяциях бактерий. Мол. биология 36(2): 216-227.

4. Mindlin S., Kholodii G., Gorlenko Zh., Minakhina S., Minakhin L., Kalayeva E., Kopteva A., Petrova M.. Yurieva 0., Nikiforov V. 2001. Mercury resistance transposons of Gram-negative environmental bacteria and their classification. Res. Microbiol. 152: 811-822.

5. Петрова M.A., Миндлин C.3., Горленко Ж.М., Каляева Э.С., Соина B.C., Богданова Е.С. 2002. Резистентные к соединениям ртути бактерии из мкоголетнемерзлых отложений и перспективы их использования в сравнительных исследованиях детерминант ртуть-устойчивости. Генетика 38(11): 1569-1574.

6. Kholodii G., Mindlin S., Petrova M.. Minakhina S. 2003. Tn5060 from the Siberian permafrost is most closely related to the ancestor of Tn21 prior to integron acquisition. FEMS Microbiol. Lett. 226(2): 251-255.

7. Kholodii G., Mindlin S., Gorlenko Zh., Petrova M.. Hobman J. and Nikiforov V. 2004. Translocation of transposition-deficient (TndPKZ.W2-like) transposons in the natural environment: mechanistic insights from the study of adjacent DNA sequences. Microbiology, 150: 979-992.

8. Горленко Ж. M., Каляева Э. С., Басс И. А., Петрова М. А., Миндлин С. 3., 2004. Распространение в природных популяциях бактерий транспозонов Тп5044 и Тп5070, несущих неканонические тег-опероны. Генетика 40(12): 1717-1721.

9. Mindlin S„ Minakhin L., Petrova M„ Kholodii G„ Minakhina S., Gorlenko Zh., Nikiforov V. 2005. Present-day mercury resistance transposons are common in bacteria preserved in permafrost grounds since the Upper Pleistocene. Res. Microbiol. 156: 9941004.

10. Vishnivetskaya Т., Petrova M.. Urbance J., Ponder M., Moyer C., Gilichinsky D., Tiedje J. 2006. Bacterial Community in Ancient Siberian Permafrost as Characterized by Culture and Culture-Independent Methods. Astrobiology 6(3): 400-414.

11. Миндлин С. 3., Петрова M. А., Басс И. А., Горленко Ж. М. 2006. Происхождение, эволюция и миграция генов лекарственной устойчивости. Генетика 42(11): 1495-1511.

12. Миндлин С.З., Соина B.C., Петрова М. А.. Горленко Ж. М. 2008 Выделение устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий из многолетнемерзлых отложений Восточной Сибири. Генетика 44(1): 36-44.

13. М.А. Петрова. Ж.М. Горленко, B.C. Соина, С.З. Миндлин. 2008. Изучение ассоциации генов strA-strB с плазмидами и транспозонами у современных и древних бактерий. Генетика 44(9): 112-116

14. Petrova М.. Gorlenko Zh., Mindlin S. 2009. Molecular structure and translocation of a multiple antibiotic resistance region of a Psychrobacter psychrophilus permafrost strain. FEMS Microbiology Letters 296: 190-197. •

15. Petrova M.. Gorlenko Zh., Mindlin S. 2011. Tn5045, a novel integron-containing antibiotic and chromate resistance transposon isolated from a permafrost bacterium. Res Microbiol. 162: 337-345.

16. М.А. Петрова, Ж.М. Горленко, Н.А.Щербатова, С.З. Миндлин. 2012. Новый мобильный элемент IS Ppyl древнего штамма Psychrobacter maritimus: перемещение в клетках Escherichia coli К-12 и образование сложных транспозонов. Генетика 48(3): 324-332.

Главы в монографиях:

1. Миндлин С.З., Басс И.А., Богданова Е.С., Горленко Ж.М., Каляева Э.С., Петрова М.А.. Холодий Г.Я., Никифоров В.Г. "Горизонтальный перенос генов в природных популяциях бактерий. Гены и транспозоны устойчивости к соединениям ртути" в сборнике: Проблемы и перспективы молекулярной генетики, изд. "Наука", 2003, 124-146

2. David Gilichinsky, Tatiana Vishnivetskaya, Mayva Petrova, Elena Spirina, Vladimir Mamikin, Elizaveta Rivkina. Bacteria in permafrost in Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology, Berlin Heidelberg, Springer-Verlag, 2008, 83-102.

3. Sofia Mindlin, Mavva Petrova, Zhosefine Gorlenko, Vera Soina, Natalia Khachikian, Ekaterina Karaevskaya. "Multidrug-resistant bacteria in permafrost: isolation, biodiversity, phenotypic and genotypic analysis" in New permafrost and glacier research, Hauppauge, NY, Nova Science Publishers, Inc. 2009, 89-105.

4. Sofia Mindlin and Mayva Petrova. Mercury resistance transposons. In: Bacterial Integrative Mobile Genetic Elements. Landes Bioscience. 2012, 32-52.

Материалы всероссийских и медуиародных конференций:

1. Tiedje J., Petrova M.. Moyer С. 1998. Phylogenetic diversity of bacteria from ancient Siberian permafrost. Eighth International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), August 9-14, 1998, Halifax, Canada.

2. Миндлин C.3., Горленко Ж.М., Петрова M.A.. Хололий ГЛ., Басс И.А. «Транспозоны устойчивости к ртути и их роль в распространении множественной лекарственной устойчивости.» 3-й съезд ВОГиС, 6-12 июня 2004 г., Москва.

3. Миндлин С.З., Горленко Ж.М., Петрова М.А. «Распространение ртуть-устойчивых бактерий в природе и мобильные элементы (плазмиды и транспозоны), несущие детерминанты устойчивости к соединениям ртути». VI Международная научная конференция «Экология человека и природа». 5-11 июля 2004 г., Москва-Плес.

4. Петрова М.А. «Распространение генов устойчивости к стрептомицину среди современных и древних бактерии». Российская школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. 28 ноября-1 декабря 2006 г., Москва-Пущино.

5. Petrova М.А.. Soina V.S., Mindlin S.Z., Gorlenko Zh.M. Antibiotic resistance of bacteria from permafrost sediments and its similarity to that of present bacteria. II

International Conference "Biosphere Origin and Evolution", October 28 - November 2, 2007, Loutraki, Greece.

6. Mavva Petrova. Vera Soina., Zhosefme Gorlenko., Sofia Mindlin "Multidrug resistance of bacteria isolated from Arctic permafrost sediments" II International Conference BioMicroWorld2007, 28 November - 1 December, 2007, Seville, Spain.

7. Mavva Petrova. Zhosefine Gorlenko, Vera Soina, Sofia Mindlin. "Antibiotic resistance and mobile elements of bacteria isolated from Arctic permafrost sediments." XX International Congress of Genetics, July 12-17, 2008, Berlin, Germany.

8. Петрова M.A., Горленко Ж.М., Миндлин С.З. «Новый IS-элемент древнего штамма Psychrobacter psychrophilus и его роль в распространении устойчивости к антибиотикам». V съезд ВОГиС, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина. 21-28 июня 2009 г., Москва.

9. Mavva Petrova. "Mechanisms of antibiotic resistance in natural bacterial populations" Bilateral scientific seminar franco-russian "Transcription - from basic mechanisms to drugs", October 19-22, 2009, Montpellier, France.

10. Petrova M.A., Soina V.S., Gorlenko G.M., Mindlin S.Z. "Genetic characterization of ancient permafrost bacteria as compared with modern-day soil and water bacteria". X European Workshop on Astrobiology, September 6-8, 2010, Pushino, Russia.

Подписано в печать: 11.02.2013 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 277 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул. Бауманская, д. 33, стр. 1 (495) 979-96-99; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Петрова, Майя Александровна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

лРГ(Г>А, На правах рукописи

052013^0507 гтт~

Петрова Майя Александровна

ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К СОЕДИНЕНИЯМ РТУТИ И АНТИБИОТИКАМ В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ

ПАЛЕОБАКТЕРИЙ

03.02.07 - «генетика»

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук Миндлин С.З

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................10

1. ОБНАРУЖЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ БАКТЕРИЙ В МНОГОЛЕТНЕМЁРЗ ЛЫХ ОТЛОЖЕНИЯХ.................................................................10

2. ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ..............................................................14

3. ДЕТЕРМИНАНТЫ УСТОЙЧИВОСТИ К СОЕДИНЕНИЯМ РТУТИ И ИХ ГОРИЗНОТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС.....................................................................................21

3.1. Содержание устойчивых к соединениям ртути бактерий в природных популяциях.........................................................................................................................21

3.2. Механизмы устойчивости к ртути..........................................................................21

3.3. Строение /нег-оперонов и их распространение в природных популяциях

бактерий..............................................................................................................................22

3.3.1. Мозаичная структура тег-оперонов и их распространение в природных популяциях...........................................................................................................................26

3.4. Участие плазмид в переносе детерминант устойчивости к ртути....................27

3.5. Транспозоны устойчивости к ртути.......................................................................28

3.5.1. Транспозоны семейства ТпЗ.....................................................................................31

3.5.1.1. Транспозоны из подгруппы Тп2У...........................................................................31

3.5.1.2. Транспозоны из подгруппы Тп5041.......................................................................37

3.5.1.3. Транспозоны из подгруппы Тп5044.......................................................................40

3.5.1.4. Транспозоны из подгруппы Тп5070.......................................................................41

3.5.2. Транспозоны Тп5053/Тп402 семейства...................................................................42

3.5.3. Транспозоны грамположительных бактерий..........................................................45

3.5.4. Рекомбинантные /нег-транспозоны и механизмы их образования.......................47

3.5.5. Распространение /не/'-транспозонов и их горизнотальный перенос.....................50

4. ПРОИСХОЖДЕНИЕ, ЭВОЛЮЦИЯ И ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ...........................................................52

4.1. Возникновение проблемы лекарственной устойчивости..................................52

4.2. Биохимические механизмы устойчивости к антибиотикам.............................53

4.2.1. Энзиматическая инактивация..................................................................................54

4.2.2. Модификация молекулы мишени............................................................................55

4.2.3. Ограничение доступа антибиотика к мишени.......................................................56

4.2.4. Другие механизмы устойчивости............................................................................59

4.2.5. Многообразие механизмов устойчивости бактерий к одному антибиотику......61

4.3. Разнообразие генов устойчивости к антибиотикам............................................62

4.4. Происхождение детерминант устойчивости к антибиотикам..........................63

4.4.1. Сравнительный анализ структуры генов продуцентов-антибиотиков и генов клинических штаммов бактерий........................................................................................64

4.4.2. Происхождение детерминант устойчивости к антибиотикам от хромосомных генов домашнего хозяйства (house-keeping genes)...........................................................66

4.5. Горзонтальный перенос генов устойчивости к антибиотикам........................69

4.5.1. Классические IS-элементы и составные транспозоны...........................................69

4.5.2. \SEcpl и родственные элементы..............................................................................71

4.5.3. ISC7? элементы...........................................................................................................71

4.5.4. Роль транспозонов в распространении генов устойчивости к антибиотикам.....71

4.5.4.1. Гены устойчивости к стрептомицину и роль транспозона Тп5393 и его производных в их распространении...................................................................................73

4.5.5. Интегроны и их роль в распространении множественной лекарственной устойчивости........................................................................................................................76

4.5.5.1. Общие свойства интегронов.................................................................................76

4.5.5.2. Классы мобильных ишпегронов.............................................................................79

4.5.5.3. Проксхоз/сдепие генных кассет.............................................................................81

4.5.5.4. Распространение мобильных ишпегронов и их роль в обеспечении

множественной лекарственной устойчивости...............................................................82

4.5.6. Плазмиды и их эволюция.........................................................................................84

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................................90

1. ОТБОР И ДОСТАВКА ОБРАЗЦОВ..............................................................................90

2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБРАЗЦОВ.................................................................................91

3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И АНТИБИОТИКИ..........................................................92

4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ И КАЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА МИКРООРГАНИЗМОВ, УСТОЙЧИВЫХ К РТУТИ И АНТИБИОТИКАМ...............................................................................................................93

5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР.................................94

6. ЛАБОРАТОРНЫЕ ШТАММЫ БАКТЕРИЙ..............................................................96

7. ПЛАЗМИДЫ......................................................................................................................97

8. ОПЫТЫ ПО КОНЪЮГАТИВНОМУ ПЕРЕНОСУ ПЛАЗМИД.............................97

9. ОПЫТЫ ПО ТРАНСПОЗИЦИИ...................................................................................98

10. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.....................................................99

10.1. Выделение геномной ДНК....................................................................................100

10.2. Выделение плазмидной ДНК для ссквенированпя..........................................100

10.3. Упрощенное приготовление препаратов геномной ДНК для ПЦР..............101

10.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозы................................................................101

10.5. Использованные праймеры..................................................................................101

10.6. Очистка ПЦР продуктов.......................................................................................102

10.7. Зонды для гибридизации, использованныс в работе.......................................102

10.8. Секвеннрование ДНК............................................................................................103

11. БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ..........................................................................................103

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................105

1. ВЫДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВЫХ К РТУТИ БАКТЕРИЙ ИЗ МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ ОТЛОЖЕНИЙ..................................................................105

1.1. Гарантии древности бактерий, выделяемых из мерзлоты..............................105

1.2. Создание коллекции бактерий, устойчивых к соединениям ртути и антибиотикам...................................................................................................................108

2. ПЕРВИЧНЫЙ АНАЛИЗ ДЕТЕРМИНАНТ УСТОЙЧИВОСТИ У ШТАММОВ МЕРЗЛОТНОЙ КОЛЛЕКЦИИ........................................................................................111

2.1. Определение наличия шег-онерона в мезофильных штаммах древних бактерий............................................................................................................................111

2.2. Идентификация генов устойчивости к стрептомицину..................................112

3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ДЕТЕРМИНАНТ УСТОЙЧИВОСТИ У ДРЕВНИХ БАКТЕРИЙ...........................................................................................................................114

3.1. Детерминанты устойчивости, локализованные на плазмидах......................114

3.2. Поиск интегронов....................................................................................................116

3.3. Детерминанты устойчивости, входящие в состав транспозонов....................117

3.3.1. Транспозоны подгруппы Тп5044...........................................................................119

3.3.2. Транспозоны подгруппы Тп5041...........................................................................119

3.3.3. Транспозоны подгруппы Тп2/...............................................................................120

3.3.4. Транспозоны семейства Тп5053.............................................................................120

4. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ РАНЕЕ НЕИЗВЕСТНЫХ ТРАНСПОЗОНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К РТУТИ.......................121

4.1. "Древний" транспозон Тп5060 - безинтегронный предшественник Тп21... 122

4.2. Новый транспозон 1п5042\ его структура и распространение среди современных и древних бактерий................................................................................124

5. ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСПОЗОНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К СТРЕПТОМИЦИНУ, РОДСТВЕННЫХ Тп5393..........................................................130

6. ИССЛЕДОВАНИЕ РАНЕЕ НЕИЗВЕСТНЫХ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В РАСПРОСТРАНЕНИИ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К АНТИБИОТИКАМ.............................................................................................................132

6.1. Новый сложный транспозон Тп5045...................................................................132

6.2. Новый IS-элемент ISPpyl и его роль в перемещении генов устойчивости к антибиотикам...................................................................................................................141

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................................155

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................157

Приложение 1. Использованные в диссертационнной работе штаммы бактерий,

выделенные из многолетнемёрзлых отложений.......................................................159

Приложение 2. Праймеры, использованные для обнаружения генов устойчивости к антибиотикам, компонентов интегронов, генов

траспозиционного модуля Тп5393................................................................................162

БЛАГОДАРНОСТИ................................................................................................................164

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................165

ВВЕДЕНИЕ

Посвящается светлой памяти Д.А. Гиличинского

Актуальность проблемы

Результаты многочисленных исследований полных геномов прокариот и эукариот свидетельствуют о существовании горизонтального переноса генов между разными видами и даже царствами живых организмов. В связи с этим механизмы эволюции предстают в совершенно ином свете. Биосфера теперь представляется единой информационной средой, в которой вирусы и другие мобильные элементы распространяют генетическую информацию. Особенно активно горизонтальный перенос происходит у прокариот. Получается, что любое "удачное изобретение" одного из видов бактерий становится доступным и может быть заимствовано всеми остальными, что позволяет им быстро адаптироваться к самым различным изменениям и неблагоприятным воздействиям внешней среды. Неприятными для человека последствиями такой способности бактерий являются возникновение новых патогенных штаммов у ранее непатогенных бактерий, а также быстрое распространение множественной устойчивости к антибиотикам среди клинических штаммов, что создает проблемы для медицины и вызывает уже сильную тревогу в связи с неэффективностью дальнейшего использования антибиотиков в лечебных целях (Gillings & Stokes, 2012; Millar, 2012).

Несмотря на огромное количество работ, выполненных по этой теме, интерес к таким исследованиям не снижается. Следует отметить, что все современные теории, касающиеся происхождения как самих генов устойчивости к антибиотикам, так и мобильных элементов, участвующих в их горизонтальном переносе, в основном базируются на изучении клинических бактерий, которые живут в условиях сильного искусственного селективного давления, вызванного применением лекарственных препаратов. Несомненно, что для их подтверждения необходимо изучение природных бактерий. Но таких работ крайне мало. К тому же, по мнению самих исследователей, в этих случаях нельзя исключить возможности вторичного занесения детерминант устойчивости, например из больниц или фермерских хозяйств, что не позволяет делать однозначных выводов из этих исследований (Davies, 1997; D'Costa et al., 2006). Очевидно одно, что проблема антибиотикорезистентности среди клинически значимых микроорганизмов уходит своими корнями в сложные экологические и эволюционные отношения между самими микроорганизмами, сложившиеся задолго до появления человека как биологического вида.

В лаборатории молекулярных основ генетики (ЛМГМ) ИМГ РАН на протяжении многих лет на примере детерминант устойчивости к соединениям ртути велось изучение горизонтального переноса генов среди бактерий из природных источников. Было показано, что в природных популяциях обнаруживается сравнительно небольшое число одних и тех же типов ртутных транспозонов и /яег-оперонов, составляющих общий генофонд различных групп грамотрицательных бактерий на всей планете. В связи с этими данными возник вопрос: не является ли такое доминирование небольшого числа детерминант устойчивости в природных микробоценозах следствием антропогенного загрязнения биосферы. С другой стороны, гены устойчивости к ртути и антибиотикам часто входят в состав одних и тех же R-плазмид и транспозонов, преимущественно из подгруппы Тп21 (Liebert et al., 1999), причем такие транспозоны обнаруживаются не

только в клинике, но и в природе. Из всего вышесказанного становится очевидным, что для разрешения всех вопросов, связанных с возникновением, эволюцией и распространением детерминант устойчивости как к ртути, так и к антибиотикам, необходимо исследовать бактерии из экосистем, никогда не подвергавшиеся антропогенному воздействию. Уникальную возможность для изучения всего комплекса проблем, связанных с происхождением детерминант устойчивости и механизмами их переноса у природных штаммов, предоставляют бактериальные сообщества из многолетнемерзлых отложений. К настоящему времени показано, что микробные сообщества, законсервированные естественным путем в толще мерзлых пород, способны сохранять жизнеспособность в течение тысяч и даже миллионов лет (Vorobyova et al., 1997). Часто в многолетнемерзлых грунтах содержание жизнеспособных бактерий не намного меньше, чем в современных тундровых почвах. Однако, несмотря на принципиальную значимость исследований устойчивых штаммов микроорганизмов из мерзлоты, до самого последнего времени их изучению почти не уделяли внимания. Были опубликованы только отдельные работы, свидетельствующие о присутствии устойчивых к антибиотикам штаммов среди бактерий, выделенных из мерзлых осадков (Tiedje et al., 1994; Ponder et al., 2005). Однако каких-либо систематических исследований с целью сравнительного изучения детерминант устойчивости древних и современных бактерий до последнего времени не проводилось.

Цель работы и задачи исследования

Целью данной работы было сравнительное изучение детерминант устойчивости к ртути и антибиотикам древних (выделенных из многолетнемерзлых грунтов) и современных бактерий. В задачи данного исследования входило:

3. Выявить плазмиды, содержащие гены устойчивости к ртути и антибиотикам у штаммов палеобактерий.

6. Провести сравнительный анализ молекулярно-генетической структуры транспозонов древних и современных бактерий.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые была создана и охарактеризована коллекция устойчивых к ртути и антибиотикам бактерий из многолетнемерзлых отложений. Штаммы из созданной коллекции используются в фундаментальных научных исследованиях не только в нашей лаборатории, но и в других российских и зарубежных научных коллективах (например Мтс1оск е1 а1., 2001; АгЬа1зку е1 а1., 2010 и др.). В настоящей работе показано значительное разнообразие детерминант устойчивости, содержащихся у штаммов этой коллекции. У древних бактерий обнаружены транспозоны, высокогомологичные широко распространённым современным природным транспозонам. В то же время у древних бактерий выявлены ранее неизвестные мобильные элементы. Так, впервые обнаружен и исследован простой транспозон, содержащий /??<?г-оперон, названный Тп5060, близкородственный гипотетическому предку сложного транспозона множественной лекарственной устойчивости Тп21, широко распространенного среди современных, в том числе и клинических, штаммов бактерий. Одновреме

Информация о работе

Петрова, Майя Александровна
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.07

Диссертация

Горизонтальный перенос генов устойчивости к соединениям ртути и антибиотикам в природных популяциях палеобактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы