Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение транспозонов устойчивости к ртути в природных популяциях грамотрицательных бактерий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение транспозонов устойчивости к ртути в природных популяциях грамотрицательных бактерий"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ■ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Р Г Б Од На правах рукописи

УДК 571214

ЮРЬЕВА Ольга Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСПОЗОНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К РТУТИ В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

03.00.15 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва—1994

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.Г.Никифоров

Официальные оппоненты: . доктор биологических наук,

И.А. Хмель доктор биологических наук, C.B. Машко

Зшдита состоится 11 октября 1994 г. в 14.00 на заседании специализированного совета Д098.12.01 при ШШ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИГенетика Автореферат разослан 11 сентября 1994 г.

Ведущая организация:

Кафедра генетики Биологического факультета.МГУ им. М.В.Ломоносова

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.И.Щербакова

Актуальность проблемы. Вопрос о роли горизонтального перемещения генов в эволюции и популяционной динамике природных сообществ бактерий является принципиально важным не только с общебиологической точки зрения, но и для решения многих практических задач, в частности для оценки риска интродукции в окружающую среду бактерий,.сконструированных методами генной инженерии. Горизонтальному переносу генов устойчивости к антибиотикам среди клинических бактерий посвящено бесчисленное количество работ (Levy, Novick, 1986)..Однако очевидно, что перемещения этих генов, вызванные искусственно созданным чудовищным давлением отбора, обусловленным массированным применением антибиотиков в медицине и ветеринарии, могут не отражать закономерностей перемещения генов в естественных условиях среды. Поэтому много работ (давших, впрочем, весьма скромные результаты) посвящено изучению межвидового переноса генов почвенных бактерий в модельных системах путем внесения в образцы почвы специально сконструированных донорных или, реже, реципиентных штаммов (Levy, Miller, 1989). Однако попыток изучения реального распределения потенциально мобильных генов в природных популяциях почвенных или водных бактерий, особенно в глобальном масштабе, практически не предпринималось, по-видимому, из-за отпугивающей сложности задачи.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования, являющегося частью обширной работы, проводимой в Отделе молекулярных основ генетики ИМГ РАН, -было описание распределения генов устойчивости к ртути и связанных с ними генов транспозиции среди грамотрицательных бактерий, обитающих в местах с естественно повышенным содержанием этого токсичного элемента. В задачи исследования входило:

1. Изучение инсерционной специфичности и физических карт обнаруженных в ОМОГ транспозонов устойчивости к ртути. Изучение распределения последовательностей ДНК, близкородственных этим транспозонам, среди разных видов бактерий различного географического происхождения.

2. Определение полной нуклеотидной последовательности тег-оперона, обнаруженного ранее в штамме Ас^пеЬоЬасЬег. Поиск и определение близкородственных последовательностей в других родах бактерий. Изучение транспозиционных генов, отвечающих за перемещения этого тег-оперона.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые обнаружено, что в природе существуют транспозоны устойчивости к ртути, которые существенно отличаются по структуре от транспозонов, описанных для клинических бактерий. Продемонстрировано, что в природе происходят межродовые перемещения генов устойчивости к ртути. Показано, что географически эти перемещения могут иметь глобальный характер и сопровождаются актами гомологичной рекомбинации между дискретными вариантами шег-оперо-нов. Результаты работы свидетельствуют, что, несмотря на значительное разнообразие шег-оперонов почвенных и водных бактерий, генетическая структура популяции этих оперонов и несущих их транспозонов относительно проста, является единой для всего земного шара и доступна для исследования.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на семинаре -Отдела молекулярных основ генетики Института молекулярной генетики РАН (1994), на конференции Ас1пе1оЬас1ег'94 (1994, Эдинбург).

Структура и объем работы. Текст диссертации организован стандартным образом и включает следующие разделы: "введение", "обзор литературы", " результаты исследования", "заключение", "выводы". Техт иллюстрирован рисунками и таблицами и содержит список цитируемых литературных источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Тп5044

Транспозон Гп5044 был обнаружен в данной работе в устойчивом к ртути штамме Pseudomonas sp. ТАР44-3 (из термального источника на Камчатке) по способности переметаться на плазмиду широкого круга хозяев RP1. Размер Тп5044 оказался около 12 т.н.п. Распределение сайтов инсерций Тп5044 в RP1 представлено на рис.1. Области предпочтительного встраивания Тп5044 существенно отличаются от областей предпочтительного встраивания классического транспозона устойчивости к ртути Тп501. Гибридизационный анализ Hg-г производных RP1, а также отдельных фрагментов Тп5044, с зондом, содержащим Тп1721 (этот транспозон ке содержит rner-оперона, но его гены транспозиции почти ке отличаются от таковых у классического транспозона ртутной устойчивости Тп501), не еыяеил в Тп5044 последовательностей, гомологичных генам транспозиции Тп501.

Внутренние фрагменты вставок Тп5044 в RP1, а таг?:? фрагменты, содержаще фланговые последовательности Тп5044, были клонированы в pUC19. В опытах по гибридизации в этих фрагментах были локализованы гены шег-оперона merR и шегА, а также определено расположение тег-оперона в левом плече Тп5044. По рестриктной карте пег-оперон из Тп5044 'отличался от всех известных на тот момент времени тег-сперонов. К этому же выводу приводили и данные по перекрестной гибридизации с фрагментами других шег-оперо-нсб. Анализ распространения этого транспозона в природных популяциях бактерий показзд, что он повсеместно распространен в природных штаммах Pseudomonas.

Тп5053

Транспозон Тп5053 был обнаружен в устойчивом к ртути штамме Xsnthomonas sp. W17 (из почвы Хайдарканского ртутного месторож-

3

Рис. 1. Распределение инсерций транспозонов Тп 5041, Tri5044 и Tn5053 а плазм ид в RP1.

0 úííÚ !10ill!lj J EÜOi-i- If L 11160—

3 с

ISS20!

H

« s

ь

is.

- Trv504 J;

- ТП504-С

-TnS053

Обозначения рестрмкционных сайтов: В • BamHI.BII - Bglll.E - Ecoñl, H -

Hindill, P - Pstl, S - SalGI.

5нил в Киргизии) по его способности перемещаться на плазмиду ирокого круга хозяев RF1 (Ломовская, 1987).

По данным определения нуклеотидных последовательностей не-олыпих фрагментов шег-оперона Тп5053, выполненного О.Л.Ломовс-ой, он оказался ближайшим родственником шег-оперона из Тп501. цнако по характеру распределения инсерций в RP1 Тп5053 полостью отличается от Тп501. Действительно, все независимо полу-еннке транспозанты Тп5053 оказались расположенными в Pstl-C рагменте RP1, тогда как Тп501 предпочтительно внедряется побли-ости от концов ТпЗ, расположенного .в RP1 вне фрагмента Pstl-C. ы предположили, что эти отличия обусловлены тем, что транспози-ионный модуль Тп5053 не гомологичен Тп501. Для проверки этого редположения были поставлены опыты по Саузерн-гибридизации про-зводных RP1, содержащих инсерции Тп5053, с последовательностью П1721 (как уже отмечалось, Тп1721 не содержит тег-оперона, но меет гены транспозиции, которые по нуклеотидной последователь-ости всего в 21 позиций отличаются от Тп501) и :coRI:EcoRI-i|?parMäHTOM tnpA Тп21 длиной 1,3 т.н.п. (отличие от п501 - 29%). На основании того, что эти опыты не выявили в сос-аве Тп5053 фрагментов, гомологичных Тп1721 и фрагменту tnpA 'п21, мы сделали вывод, что шег-транспозон Тп5053 отличается по :труктуре своего транспозиционного модуля от распространенных в цинических штаммах транспозонов ртутной устойчивости.

Для дальнейшего изучения структуры Тп5053 он был клонирован 1 pUC19 в составе Pstl-C фрагмента RP1. Рестриктный анализ пока-;ал, что длина Тп5053 составляет примерно 8 т.н.п. Сравнение )естрикционной карты Тп5053 с известной рестриктной картой ier-оперона Тп5053 (Ломоескэя, 1987) позволило заключить, что •¡ег-оперон располагается в левой части Тп5053. В последующих ра-ютах лаборатории (Kholodii et al., 1993, 1994) было устанобле-ю, что Гп5053 ограничен концевыми повторами длиной 25 нуклеоти-юв и что правое плечо Тп5053 содержит гены транспозиции. Конце-зые повторы и гены транспозиции Тп5053 оказались близкородствен-шми таковым у транспозиционного модуля транспозона Тп402, несу-

щего ген устойчивости к триметоприму в составе интегрона (Radstrom et al., 1994; в этой работе Тп402 фигурирует под названием Тп5090).

йункциональное родство транспозиционных модулей Тп5053 и fn402 было продемонстрировано нами в опытах по комплементации полноценным Тп402 транспозиционной активности делеционного производного Тп5053, не содержащего собственных генов транспозиции, и по иммунности репликонов, содержащих один из транспозонов, к внедрению другого.

Рассмотрение рестриктных карт тег-оперонов, клонированных из ряда шгьюгативных плазмид бактерии, выделенных из реки Мерси (Великобритания), показало, что три из них похожи на шег-оперон Тп5053. Мы анализировали клонированные.фрагменты двух таких природных плазмид рМЕЙЗЭО и pMER05 в плазмидах pMJ200 и pMJ300. Рестриктный анализ и опыты по гибридизации pMJ200 и рШЗОО с фрагментами, содержащими правое и левое плечо Тп5053, показали, что в рШЗОО клонирован полноценный транспозон Тп5053-типа, тогда как структура, клонированная в pMJ200, видимо, дефектная, так как. в ней отсутствуют фрагменты, соответствующие правому плечу Тп5053. -

Результаты нашего исследования показывают, что Тп5053 является не 'описанным ранее тег-транспозоном. • Он не содержит генов транспозиции, родственных генам Тп501 и Тп21, и проявляет структурное и функциональное родство с Тп402, несущим интегрон. Для транспозиции Тп5053 и его вариантов характерна узкая регионспе-цифичность, не свойственная транспозонам ТпЗ-типа. Этот необычный ■ транспозон повсеместно распространен в природных штаммах Pseudomonas и Xanthomonas.

ТП5041

Транспозон Тп5041 был обнаружен в устойчивом к ртути штамме .Pseudomonas sp. Рз41 (из почвы Хайдарканского ртутного месторож-

6

дения в Киргизии) по его способности перемещаться на плазииду широкого круга хозяев RP1 (Ломовская, 1987).

По данным определения нуклеотидных последовательностей небольших фрагментов шег-оперона Тп5041, выполненного О.Л.Ломовс-кой, он отличался от известных mer-оперонов грамотрицательных бактерий (различия между которыми составляли 10-2Ш) в 307. позиций. По области предпочтительного встраивания в RP1 Тп5041 отличался от Тп501 и Тп5053, но оказался похожим, хотя не идентичным, Тп5044 (рис.1). Опыты по Саузерн-гибридизации не выявили в составе Тп5041 последовательностей, гомологичных генам транспо1 зиции Тп501 и Тп21. Опыты по перекрестной гибридизации фрагментов Тп5041, Гп5044 и Тп5053, не содержащих шег-оперона, ' тоже Hè обнаружили очевидной гомологии между этими последовательностями. Следовательно, mer-транспозон Тп5041 отличается по структуре своего транспозиционного модуля от распространенных как в клинических, так и в природных штаммах транспозонов ртутной устойчивости.

Рестриктный анализ показал, что суммарный размер Тп5041 составляет примерно 16 т.н.п. Сравнение рестрикционной карты Тп5041 с известной рестрикционной картой шег-оперона Тп5041 (Ломовая, 1987) позволило заключить, что шег-оперон располагается практически в центре Тп5041. Б последующих работах Г. Я. Холодий установил, что Тп5041 ограничен концевыми повторами длиной 46 нуклеотидов и что праьое плечо Тп5041 содержит ген, который, по-видимому, кодирует транспозазу. Концевые повторы Тп5041 оказались близкородственными таковым у транспозона Тп4б51, несущего гены деградации толуола (Tsuda, lino, 1987).

Мы клонировали по маркеру устойчивости к ртути EcoRI:EcoRI-$parMeHTbi ДНК из четырех штаммов Pseudomonas различного географического происхождения, дававших гибридизацию с транспозиционным модулем Тг.5041. Частичное определение нуклеотидных последовательностей фрагментов разных клонов, в которых не было обнаружено различий от Тп5041 по рестрикционным картам, показало, что они практически идентичны и по нуклеотидной после-

7

Рис. 2. Нуклеотадные последовательности вариантов транспозона Tn 5041 из штаммов Pseudomonas разного географического происхождения.

El

fcsH223~

El Н

V^p

6 7 El H

SNNI NPvEV

W 1Г

PSS P S NPvSEI

rTPCA

11

10 11 12 13

I

14

-в-ш-

E1 H

I ЙШН

B H b—l--

i-e—d-

-f

El H

0 H

W-

ln5041

штамм регион Ps41 Кмргиэи

P22 Киргизм! TC97 Карпать ТСЗ 6-1 Карпать KR16-2 Кавказ ED23-70 Колыш

8

I

Прямоугольники обозначают участки ДНК, для которых определены нуклео-тидные последовательности. Штриховка символизирует последовательности, идентичные последовательностям из:

В-Тп5041, Ш-1прАТп^/;0 -рКШ2;1--рШ1358;

- - участки ДНК, для которых не определены нуклеотадные последовательности:

Обозначения рестрикционных сайтов: В - Вд!П, Е - ЕсоЯ1, ЕУ - ЕсоНУ, Н • НтсНП, N • №01, ■ РэИ, Ру - Р\ги11, Б • БаЮ!.

Нуклеотидную последовательность Тп 5041 определил Г.Я. Холодий;

дсвательности (рис.2). Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов, отличающихся по рестрикционным картам от Тп5041, выявило, что изменения в штамме Р22 вызваны вставкой ДКК, близкородственной Тп21. Та часть этой встазки, которая оказалась клонированной в составе ЕсоИ:Есо!?1-фрагмента, практически идентична 3'-части гена транспозазы Тп21, и ограничена соответствующим концевым повтором Тп21 (рис.'2.), В опытах по Сау-герн-гибридизаиии мы продемонстрировали наличие з исходном штш*-ме Р22 всего гена 1прА, близкородственного 1прА Тп21, и отсутствие последовательностей интегронной вставки Тп21, гомологичных Тп402. Кроме того, мы обнаружили в штамме Р22 второй тег-оперон, отличающийся от тег-оперона Тп5041-типа.

В другом штамме (ТС97) отличия были связаны с тем, что тег-оперон из этого штамма оказался рекомбинантным. Он .состоит из последовательностей, практически идентичных соответствующим фрагментам из Тп5041, рКШ2 и рОШ358 (рис.2).

Результаты нашего исследования показывают, что Тп5041 является не описанным ранее ¡г,ег-транспозоном. Он не содержит генов транспозиции, родственных генам Тп501, Тп21, Тп5044-и Тп5053. По расположению области предпочтительного встраивания в плазмиду

Тп5041 отличается от перечисленных выше транспозонов. Различные варианты этого необычного транспозона повсеместно распространены в природных штаммах РзеисЗояопаБ. В составе этих вариантов обнаружены последовательности, практически идентичные фрагментам из транспозазы Тп21 и шег-оперонов из рШ1358 и рКЬН2, • выделенных из клинических и природного штаммов бактерий других систематических групп.

ТпБОЗб и родственные ему дефектные пег-структуры

В устойчивом к ртути штамме Ас1пе1оЬас1ег эр.- КНР18 (из Хайдарканского ртутного месторождения в Киргизии) было обнаруже-

Рис. 3. Нуклеотидные последовательности /т»г-транслозонов ацинетобактерного типа природных штаммов грамотрицательньк бактерий разных систематических групп из различных географических регионов.

О 1 2_3 4 5 6 7 8 т.н.п.

мг^тан^! * i

pKLH1, Acineiobacter, Киргизия pKLH102, Acinetobacter, Карпаты PKLH104, Acineiobacter, Карпаты pKLH2, Acinetobacter, Киргизия PKLH201. Acineiobacter. Киргизия хромосома, Acinetobacter, Карпат pKLH203,Acineiobacter, Кавказ pMJ501, Alcaligenes, Англия pKLH272, Enterobacter, Киргизия pKLH247, Acinetobacter, Волга

PKLH2S6, Enterobacter, Карпаты

pLYl, Yersinia, франция

Прямоугольники обозначают участки ДНК, для которых определены нуклеотидные последовательности. Штриховка символизирует последовательности, идентичные соответствующим последовательностям из В -pKlH2;Q -PUJ501. B-PENT7Z D-TnSOi.

IS26, < —и - IS-элементы, родственные IS26;

■ резные варианты последовательностей, флажирующих тег - транспоэоны,

------ участки ДНК, для которых не определены нуклеотидные последовательности;

-вставкаЗОнп.;

Нуклеотидные последовательности 1-3 и 5-9 определил Г.Я.Холодий, 4,10 и 11 -определены в данной работе, 12 - в работе Тигпег, Сгтаей, 1989.

но два тег-оперона. Один из- них расположен на большой (60 т.н.п.) кониогативной плазмиде рКЬН2, а другой - на мелкой (7.5 т.к.п) плазмиде рКШ (Ломовская, 1987).

В результате проведенного совместно с Г.Я. Холодием определения нуклеотидной последовательности фрагмента рКЬН2, содержащего тег-оперон, . в зтой плазмиде был обнаружен дефектный транс-позон Тп21-типа (рис.3). Б общи чертах структура тег-оперона из рЫН2 оказалась такой же как в Тп21, Тп501 и плазмиде р0111358 из клинических изолятоз. Область гомологии между последовательностями из рК1Н2, Тп21, Тп501 и рШ1358 начинается с концевого повтора длиной 38 н.п., типичного для транспозонов Тп21-типа. Сразу за позтором следует 3'-конец регуляторного гена ггга^, причем последовательность из рКЬН2 в этой области содержит вставку 21 н.п. по сравнению с Тп21 и Тп501. Вставка такой же длины в этом же месте обнаружена и в гене тегР из плазмиды р0111358. За геном тегР расположен оператор-промсторный район, из которого дквер-гентно транскрибируются тегр и структурные гены тег-оперона. В следующей за этим районом последовательности находятся • легкоуз-наЕаемые гены транспорта ионов ртути тегТРС, ген тегА, кодирующий ртутьредуктазу, и ген пегО, которому приписывается роль в тонкой регуляции тег-оперена. Далее, как и во всех известных шег-оперонах, обнаруживается область, содержащая открытые рамки •считывания 1КР-1 и иРР-2, Функциональная роль которых неизвестна. Последовательность иРР-2 в рК1Н2 искажена двумя делециями (33 и 685 н.п.) и двумя вставками (1 н.п. и 9 н.п.). Если учесть, что область №-2, которая у рКЬН2 затронута делецией 685 н.п., в Тп21 прерывается вставкой 11.2 т.н.п., содержащей гены устойчивости к антибиотикам, можно заключить, что 1^-2 не играет существенной роли в функционировании тег-оперона.

Гомология между последовательностями, содержащими тег-опе-рон в рКЬН2 и Тп21, обрывается в сайте, по которому в норме происходит разрешение коинтеграта, образуемого в процессе транспозиции. Возможно, что структура в рК1Л2 образовалась из полноценного транспозона Тп21-типа после его внедрения в предшественник

п

pKLH2 в результате аберрантной резолюции между последовательностями res-сайта этого транспозона и имевшейся в составе плазмиды последовательности, напоминающей res-сайт (псевло res-сайт).

Мы клонировали тег-опероны из двух штаммов Acinetobacter, один из которых выделен из реки Волги под Саратовом, а другой -из почвы Подмосковья (Троице-Сергиева Лавра). Более подробно был исследован шег-оперон плазмиды pKLH247 штамма Acinetobacter S47 (Волга). По данным рестрикционного анализа и частичного определения куклеотидной последовательности этот шег-транспозон не от-.алея от дефектного тег-транспозона из -pKLH272 (штамм Enterobacter 7.2 из кишечника мыши, обитавшей в районе Хайдарканского ртутного месторождения в Киргизии), полную последовательность которого определил Г.Я. Холодий. (рис.3.). Дефектность обоих транспозонов обусловлена внедрением IS-элемента, идентичного IS26, в одно и то же положение гена tnpR Тп21-типа. Последовательности, непосредственно примыкающие к инвертированному повтору, проксимальному гену merR плазмид pKLH247 и pKLH272, оказались также идентичными (но отличными от соответствующих фланговых последовательностей тег-оперона pKLH2). Однако, уже на расстоянии около 1 т.н.п.' во фланговом районе, прилегающем к merR, в клонированных фрагментах, содержащихлег-транспозоны pKLH247 (Acinetobacter) и pKLH272 (Enterobacter), обнаружились различия в расположении сайтов рестрикции. Рестриктный анализ исходных плазмид pKLH247 и pKLH272 также не выявил сходства между ними в областях, не связанных пространственно с ггег-опероками. Это позволяет предполагать,, что дефектный шег-транспозон, обнаруженный в этих плазмидах, подобно дефектному тег-транспозо-ну рК1Н2, распространился уже после повреждения своего Тп21-по-добного транспозиционного модуля в составе другого, не родственного Тп21, транспозона. С одной из сторон дефектный транспозон фланкирован IS26, возможно, принимавшем участие в расселении этого тег-транспозона.

В поисках полноценного транспозона Тп21-типа набор штаммов Acinetobacter, Pseudomonas и кишечной микрофлоры был проанаякзи-й

рован в опытах по гибридизации колоний с EcoRI:EcoRI -фрагментом tnpA Тп21 длиной 1,3 т.н.п. Оказалось, что последовательности, гомологичные этому зонду, встречаются в 4 из 45 (87.) штаммов Acinetobacter, в 10 из 78 (132) штаммов Pseudomonas, в 25 из 39 (632) штаммов килечных бактерий. В 13 из 15 (87%) случайно выбранных устойчивых к ртути штаммов кишечных бактерий был обнаружен EcoRI:EcoRI-фрагмент шег-оперона (2,7 т.н.п.), который характерен для ацинетобактеркых шег-оперонов. Основызаясь на этих данных, sä предположили, что в группе кишечных бактерий может быть распространен полноценный транспозон Тп21-типа, несущи ¡пег-оперон аиинетобактерного типа.

При клонировании с.отбором на устойчивость к ртути из штамма Enterobacter cloacae ТС256, выделенного из кишечника жерлянки, обитавшей в районе ртутного месторождения в Закарпатье, был получен клон, который содержал полноценный транспозон устойчивости к ртути. Присутствие транспозазы в клонированном фрагменте было показано з опытах по гибридизации с EcoRkEcoR]-фрагментом tnpA Тп21 (1,3 т. н.п.). Подвижность этого трачспозсна была продемонстрирована е опыте, в котором мы получили транспозантов клонированного Тп5036 в кскъюгативную плазмиду RP1.2. На уровне рестриктного анализа были проверены 4 независимых транспозанта. Все они внедрились в разные сайты RP1. У одного из транспозантов продемонстрирована дупликация мишени размером 5 н.п. в сайте ин-серции. Транспсзону дали название Тп5036.

Данные по частичному определению нуклеотидной последовательности Тп503б представлены на рис.3. Оказалось, что тег-опе-рон Тп5035 имеет рекомбкнантную структуру: основу ее составляет последовательность, практически идентичная последовательности mer-оперона pKLH2. Кроме этой последовательности, вычленяются, как минимум, 4 фрагмента другого происхождения: фрагмент, захва-■ тываший" ртегР, оказался идентичен по последовательности аналогичному фрагменту из шег-оперона, выделенного из шгаммз Aicaligenes sp. (река Мерси в Англии), причем в обеих последовательностях совпадало также положение левой границы рекомбинации

(Г.ЯХолодий), фрагменты из первой и последней трети тегА не проявляли близкого родства с известными mer-оперонами; фрагмент из середины merA отличался на 1.52 по последовательности от соответствующего фрагмента из Тп501. Последовательность тег-оперо-на Тп5036 оказалась практически идентичной последовательности тег-оперона из другого штамма Enterobacter КН7.2, выделенного иг кишечника мыши, обитавшей в Хаидарканском ртутном местрождении (Г.Я. Холодий).

По данным частичного определения нуклеотидных последовательностей генов транспозиции ТпВДЗб оказался практически идентичным известному из литературных источников Тп3926 из Yersinia enterocolitica (плазмида pLl, штамм, выделенный из коровьего молока во Франции)' (Osbourn, личное сообщение). Предварительные данные по последовательностям merR, 0RF-1 и ORF-2 Тп3926 также указывают на его идентичность с Тп503б. Нужно отметить, что по последовательностям гена tnpR Тп503б и Тп3926 отличаются от соответствующих последовательностей из pKLH272 и pi.iJ501, что говорит о рекомбинантной структуре Тп5036 и Тп3926.

Описанные в настоящем разделе 4 варианта тег-структур, представляют собой производные одного и того же тег-транспозо-на Тп21-типа. Мег-оперон алияетобактерной кониогативной плазмиды pKLH2 мы рассматриваем как базовый, так как.он не проявляет достоверных признаков рекомбинантной структуры. Три рекомбинантных варианта являются производными первого; в этих трех оперонах, кроме базовой"последовательности, обнаруживаются фрагменты,' которые. отличаются от соответствующих фрагментов из pKLH2 в 10-201% позиций (рис.3). Последовательности некоторых этих фрагментов оказались практически идентичными последовательностям соответствующих фрагментов других известных тег-оперонов. Так, например, .в тег-оперонах небольших аиинетобактерных плазмид (pKLHl-вариант тег-оперона) выявляются фрагменты Тп501 (клинический штамм Pseudomonas) (Ломовская, Никифоров, 1988). Б составе pKLK272-£äpHäHTä ,тег-оперона (Enterobacter• выявлены 4 рекэм-бинантных фрагмента, причем последовательности двух из них уже

встречались в других известных тег-оперонах: в Тп501 и в качестве рекомбинантной вставки в рШ501-варианте тег-оперона (AlcalIrenes).

Все четыре варианта шег-оперонов обнаружены в составе структур, не содержащих полноценного транспозиционного модуля Тп21-типа. Предполагается, что такие дефектные транспозоны обрели способность перемещаться в составе других мобильных структур при участии 1526-подобных элементов или в' составе плазмиды (pKLHl-вариант шег-оперонов). pKLH272-вариант тег-оперона обнаружен нами, кроме того, в составе полноценного транспозона Тп21-типа -ТпбОЗб. ТпбОЗб, по-видимому, не является прямым потомком транспозона - общего предка всех 4 описанных вариантов дефектных тег-транспозонов, а также, как в перечисленных выше случаях, приобрел гены транспозиции вторично. Возможно, ТпбОЗб образовался в результате рекомбинации дефектной структуры и полноценного транспозона Тп21-группы.

Изучение представителей тег-транспозонов в природных популяциях бактерий показало, что pKLH2-вариант преобладает в природных устойчивых к ртути штаммах рода Acinetobacter. Дефектный транспозон, содержащий pKLH272-вариант тег-оперона, встречается в природных штаммах Enterobacter и Acinetobacter. ТпбОЗб, по-видимому, доминирует в устойчивых к ртути природных штаммах рода Enterobacter. Однако по всем известным нуклеотидным последовательностям ТпбОЗб практически идентичен Тп3926, выделенному из штамма Yersinia. Все это говорит о том, что горизонтальный перенос шег-оперонов происходит достаточно эффективно не только между бактериями внутри рода, но даже при весьма ограниченной., выборке проверенных штаммов обнаруживается и между представителями разных родов.

tr

Закличение

В данной работе мы охарактеризовали 4 mer-транспозона из природных популяций грамотрицательных бактерий. Три из них (Тп5053, Гп5041 и Тп5044) отличаются друг от друга и от всех известных на данный момент тег-транспозонов, а один - Тп503б -практически идентичен описанному в литературе Тп3926, относящемуся к Тп21-группе (Lett et al., 1985. Turner, Grinsted, 1989). Последовательности транспозиционных модулей Tn5041, Тп5С44 и Тп5Р53 не проявляют гомологии на гибридизационном уровне с генами tnpA и tnpR транспозонов Тп21-группы. Тп5053 по сеоим мобильных! свойствам оказался близкородственным Тп402, который яЕляется представителем широко распространенной в клинике группы мобильных элементов, содержащих интегроны и способных с их помощью встраивать в себя гены антибиотикоустойчивостей.

тег-опероны всех этих столь различных по транспозиционным модулям мобильных элементов гомологичны-друг другу и различия между их нуклеотидными последовательностями составляют всего 10-ЗШ. Таким образом, в нашей выборке транспозонов мы не наблюдаем корреляции между уровнями дивергенции тег-оперонов и перемещающих их транспозиционных модулей. Следовательно, все обнаруженные нами ¡пег-трачспозоны представляют собой мозаичные структуры, компоненты которых (тег-опероны и перемещающие их транспозиционные модули) эволюционируют независимо друг от друга.

Помимо .транспозиционно активных транспозонов нами обнаружены дефектные транспозоны. Для представителей Тп5041-группы это показано по неспособности перемещаться на конъюгативную плазмиду RP1, для представителей Тп5053 - на уровне рестрикционных карт и для структур, родственных ТпбОЗб, - на урозне куклеотидных последовательностей. Представители структур,. родственных Тп5036, утеряли гены транспозиции Тп21-типа в результате аберрантной резолюции (рКШ-вариант), из-за внедрения IS-элемента

рКЬН272-вариант) или транспозона (pKLHl-вариант) (Г.Я.Холодий, еопубликованные данные). pKLHl-вариант расселился по разным ви-ам Acinetobacter в составе плазмиды, став ее органичной частью Яомовская, Никифоров, 1988). Другие дефектные варианты транспо-онов вместе с короткими фланкирующими последовательностями ока-злись распространенными на разных плазмидах в разных штаммах риродных популяций бактерии. Можно предположить, что их рассе-эние произошло за счет приобретения новых мобильных функции, ьшолняемых встроившимися поблизости от тег-оперона IS-элемента-и (pKLH2 и pKLH272-варианты), или восстановления функционирую-их генов транспозиции в результате рекомбинации с близкородс-венным транспозоном (Тп503б).

Похожая ситуация была описана при изучении обнаруженных в линических штаммах бактерий представителей транспозонов Тп2 и п21: среди 4-х описанных вариантов Тп2 два утеряли ген tnpA и аспространились в составе мелкой неконъюгативной плазмиды, ти-ичной для Haemophlllus (Chen and Clowes, 1987b). Среди 150 редставителей Tn21 около трети оказались лишенными тех или иных рагментов tnp-onepoHa (Zühlsdorf and Wiedemann, 1992). Все эти анные говорят о том, что значительная доля распространенных в актериальных штаммах транспозонов представлена дефектными вари-нтами.

В сумме, по данным нашей лаборатории, а также из литера-урных источников, известны полные или частичные нуклеотидные оследовательности 26-ти тег-оперонов, локализованных на полно-енных и дефектных транспозонах. При сравнении последователькосей этих тег-оперонов между собой они оказываются либо практи-ески идентичными друг другу (0-0.51% дивергенции), либо отличатся друг от друга в 8-Э0%% позиций. В терминах популяционной енетики бактерий практически идентичные последовательности, не роявляющие достоверных признаков рекомбинантной структуры* редставляюг один клон. Последовательности, отличающиеся в бо-:ее, чем в 51 позиций относятся к разным клонам. Каждый клон мо-йт быть представлен одной последовательностью, называемой базо-

вой. Анализ 26-ти известных последовательностей тег-опероно: позволяет выделить среди них 9 базовых последовательностей Мег-опероны, состоящие из фрагментов разных базовых последова тельностей, мы рассматривали как рекомбинантные варианта. В нашей работе получены данные по двум наиболее подробно изучении клонам тег-оперонов, базовыми последовательностями которых являются тег-опероны из плазмиды pKLH£ и из Тп5041. Среди представителей первого клона преобладающими оказались два варианта последовательностей: практически идентичные mer-oneроку непосредственно из плазмиды pKLH2 (4 представителя) и его рекомбинантном\ варианту из плазмиды pKLH272 (3 представителя). В составе рК1Л272-варианта тег-оперона выявлены 4 рекомбинактных фрагмента, причем последовательности двух из них уже встречались в других известных тег-оперонах: в Тп501 и в качестве рекомбинантно^ вставки в pMj'501-варианте тег-оперона (рис. 3).

Мег-опероны Тп5041-клона также представлены двумя вариантами последовательностей: тег-оперон, практически идентичный Тп5041, (5 представителей) и его рекомбинантный вариант (1 представитель). В составе рекомбинантного варианта обнаруживаются фрагменты 3-х известных базовых последовательностей: из 7n5041, pKLHS .(почвенные бактерии) и pDU1353 (клинический изс-

Подэбная картина была получена, хотя и на гораздо меньшем материале, при изучении распространенных е клинике транспозонов Tnl, Тп2 и ТпЗ. Было обнаружено 4 представителя клона Inl-ТпЗ и 4 представителя Тп2, являющегося рекомбкнантным вариантом ТпЬТпЗ (Cnen and Clowes, 1987а, b).

Исследуя тег-транспозоны в природных популяциях бактерий мы в пределах достаточно небольшой выборки природных штаммов обнаружили примеры горизонтального переноса mer-транспозонов между разными родами грамотрицательных бактерий. Эти события горизонтального переноса генетического материала можно отнести к двум типам: перенос целых транспозонов (внедрение чужеродной ДНК за счет негомологичной рекомбинации, приводящее к появление 18

ег-оперона там, где он ранее отсутствовал) и перенос фрагментов ег-оперонов за счет гомологичной рекомбинации, приводящий к по-влению нового рекомбинантного варианта последовательности уже уществовавшего шег-оперона. К первому типу событий горизонталь-ого переноса генов относятся факты обнаружения нами Тп5036 и одственных ему структур в разных систематических группах бакте-ий. Ко второму типу событий относятся часто обнаруживаемые ре-омбинантные варианты mer-оперонов. Такой тип горизонтального ереноса характерен для хромосомных генов внутри вида (E.coli). случае тег-оперонов мы наблюдаем рекомбинационные события межу последовательностями, распространенными в разных родах гра-отрицательных бактерий. Несмотря на то, что к настоящему време-и известно лишь ' 9 вариантов базовых последовательностей ег-оперонов, участники рекомбинационных событий узнаваемы в ольшинстве случаев обнаружения гибридных последовательностей, то указывает на относительно небольшое количество распростра-енных базовых вариантов тег-оперонов в природных популяциях рамотрицательных бактерий. Их, видимо, больше, чем аллелей ка-:ого-либо хромосомного гена E.coli, но, безусловно, количество аспространенных тег-оперонов несравнимо меньше суммарного коли-ества хромосомных аллелей какого-либо гена во всей группе гра-отрицательных бактерий. Видимо, это то небольшое количество ¡ег-оперонов, которое оказалось способным эффективно распростра-:иться в этой группе бактерий с помощью механизмов горизонтально переноса первого типа.

В небольшой выборке изученных mer-транспозонов природных шуляций грамотрицательных бактерий обнаружены фрагменты всех рех mer-транспозонов, выделенных из клинических изолятов, что оворит об общности резервуара mer-транспозонов клинических и .риродных грамотрицательных бактерий.. Таким образом, тег-опероны ;сей совокупности грамотрицательных бактерий можно рассматривать ак некую популяцию активно рекомбинирующих, и, следовательно, ювместно эволюционирующих.последовательностей.

ВЫВОДЫ:

1. Среди транспозонов устойчивости к ртути грамотрицатель ных почвенных и водных бактерий преобладают не описанные ране> типы, которые отличаются по структуре от классических транспозонов устойчивости к ртути Тп21-типа, распространенных среди клинических бактерий. Охарактеризованы три таких новых транспозона Тп5041, Тп5044 и Тп5053. Б кишечном штамме Enterobacter обнаружен транспозон Тп21-типа Тп5036.

2. В устойчивых к ртути бактериях встречаются дефектные варианты транспозонов. В некоторых случаях потеря транспозиционно) функции вызвана аберрантной резолюцией, в некоторых - внедрение] IS-элемента. Дефектные транспозоны, по-видимому, могут восстанавливать способность к перемещению.

3. Анализ нуклеотидных последовательностей позволяет выделить среди тег-оперонов грамотрицательных бактерий не менее девяти дискретных клонов, различия между которыми варьируют в пределах от 8 до 3071, Изученные в работе нуклеотидные последовательности тег-оперонов относятся к двум клонам (Tn5041 i Тп503б), кавдый из которых имеет мозаичную структуру. Основ; этой структуры составляет базовая последовательность, вариацт которой внутри клона составляют доли процента. Отдельные фрагменты того или иного оперона отличаются по последовательности ог. базовой и принадлежат к другому клону.

4. Полученные в работе данные демонстируют широкое распространение горизонтального переноса тег-оперонов как внутри рода (Acinetobacter), так и мевду родами (Acinetobacter i Enterobacter; Pseudomonas и Acinetobacter). Обнаружены два типе такого переноса: (а) перемещения целых тег-оперонов в составе того или иного транспозона, (б) перемещения фрагментов тег-опе-ронов за счет гомологичной рекомбинации. Полученные результать указывают на то, что тег-опероны грамотрицательных бактерий можно рассматривать как единую популяцию активно рекомбинирующих и, следовательно, совместно эволюционирующих последовательностей. 20

СПИСОК РАБОТ, опубликованных автором по теме диссертации

Kholodii 6., Gorlenko Zh., Lomovskaya 0,, Mindlin S., Yurieva 0.,. and Nikiforov V. 1993. Molecular characterization of an aberrant mercury resistance. transposabie element from an environmental Acinetobacter strain. Plasmld, 30:303-308.

Kholodii, G. Ya., Yurieva, 0. V., Lomovskaya, 0. L., Gorlenko, Zh. M., Mindlin, S. I., and Nikiforov,. V. G. (1993) Tn5053, a mercury resistance transposon with integron's ends. J Mol Biol, 230:, 1103-1107.

Hobman, J., Kholodii, G., Nikiforov, Y., Ritchie, D. A.. Strike P., and Yurieva 0. (1994) The sequence of the mer operon of pMER327/419 and transposon ends of pMER327/419, 330 and 05. Gene, 146: 73-78.

Kholodii G. Ya., Mindlin S. Z., Bass I. A., Yurieva 0. V., Mlnakhlna S. V.,and Nikiforov V. G.(1994) Four genes, two ends, and a res region are involved In transposition of Tn5053: a paradigm for a novel family of transposons carrying either a mer operon or an integron. Mol. Microbiol., в печати

Технический редактор Н.Н, Егорова

Подписана а печать 06.09.94. Формат 60x84/16 Уч.-над, л. 1,0. Тираж 100. Закаэ 131

. Отпечатано в РНЦ «Курчатовский гтпетнтут» 127182, Мсскм, пл. Академика Курчатоаа