Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика численности грамотрицательных бактерий в почвах в аэробных и анаэробных условиях

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Динамика численности грамотрицательных бактерий в почвах в аэробных и анаэробных условиях"

На правах рукописи

ИВАНОВ Константин Евгеньевич

ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВАХ В АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I в ФЕВ 2013

Москва-2013

005050045

005050045

Работа выполнена на кафедре биология почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Полянская Любовь Максимовна

Официальные оппоненты:

Ананьева Надежда Дмитриевна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Тульская Елена Михайловна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микробиологии, старший паучный сотрудник

Ведущая организация:

Российский государственный аграрный университет — Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева

Защита состоится 26 марта 2013 г. в 15:30 в аудитории М2 на заседании диссертационного совета Д.501.002.13, при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова, 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » февраля 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета: Зенова Галина Михайловна

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Основные параметры, характеризующие микробное население почв, изменяются в ходе годового цикла. Меняются как общая численность микроорганизмов, так и соотношение численностей различных функциональных и таксономических групп, а, соответственно, и интенсивность и направление биохимических процессов. В системе почва -микроорганизмы происходят вполне закономерные изменения численности и видового состава микробной компоненты, а также направленности микробиологических процессов. Эти события описываются как сукцессия почвенного микробного сообщества (Ро1уапзкауа, Zvyagintsev, 1994).

Микробная сукцессия в почве поддается наиболее детальному изучению в модельных стабильных условиях, что достигается при работе с почвенными образцами, помещенными в лаборатории в контролируемые условия (температура, влажность и аэрация). В ходе микробной сукцессии меняется численность разных групп микроорганизмов: одни группы (например, грибы и бактерии) доминируют на ранних стадиях сукцессии, а другие, такие как актиномицеты, - на поздних стадиях (Полянская, 1996) . Изучение сукцессии комплекса почвенных микроорганизмов позволило расширить круг параметров, по которым можно сопоставить почвы разных типов, оценить разнообразие комплексов на различных сукцессионных этапах, прогнозировать события в связи с конкретными воздействиями, а также индицировать степень экологической сохранности почв (Полянская, Звягинцев, 2005; Полянская и др., 2012).

При анализе развития микробного сообщества важно знать то, как меняются соотношение и численность представителей разных физиологических и таксономических групп, в частности, грамотрицательных и грамположительных бактерий. Традиционно считается, что среди почвенных прокариотных микроорганизмов, прежде всего, грамположительным бактериям отведена роль гидролитиков (Звягинцев, 1988). Изучение микробных сукцессии с внесением полимеров естественного происхождения, таких как целлюлоза и хитин, позволяет оценить роль грамотрицательных бактерий в разложении этих веществ в почве. В естественной среде обитания почвенных бактерий, за счет специфических условий эти вещества могут находиться в разной степени доступности, однако, помимо этого факта важно учесть, что различные свойства почв влияют так же и на доступность кислорода для микроорганизмов (Тейт, 1991).

Во всех почвах и в разных почвенных горизонтах имеются аэробные и анаэробные макро-, мезо- и микрозоны, резко различающиеся по ОВП . Анаэробные условия могут сохраняться на протяжении длительных временных периодов, тем самым, оказывая значимое влияние на экологию почвенных микроорганизмов. Изучение влияния анаэробиоза на численность грамотрицательных бактерий позволит оценить их вклад в разложение природных полимеров в анаэробных условиях в почве.

Цели исследования. Целью диссертационной работы являлась оценка динамики численности грамотрицательных бактерий в почвах в ходе микробной сукцессии, инициированной увлажнением и увлажнением с внесением полимеров в аэробных и анаэробных условиях.

Задачи исследования. Для достижения указанной цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучение общей численности бактерий в ходе микробной сукцессии в черноземе и торфянике с помощью прямого люминесцентного метода.

2. Исследование динамики численности грамотрицательных бактерий в разных горизонтах чернозема и торфяника.

3. Сравнение динамики численности грамотрицательных бактерий в ходе исследуемой сукцессии в черноземе и торфянике в аэробных и анаэробных условиях.

4. Оценка влияния внесения хитина и целлюлозы на численность грамотрицательных бактерий в черноземе в аэробных и анаэробных условиях

5. Анализ доли грамотрицательных бактерий в ходе микробной сукцессии в черноземе и торфянике в аэробных и анаэробных условиях.

6. Определение численности филогенетических групп грамотрицательных бактерий в черноземе при инициации сукцессии увлажнением с внесением хитина и увлажнением с внесением целлюлозы.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые с помощью прямых люминесцентно-микроскопических методов оценена динамика численности грамотрицательных бактерий при внесении природных полимеров в аэробных и анаэробных условиях в разных горизонтах почв. Для определения численности жизнеспособных грамотрицательных почвенных бактерий разработан и применен модифицированный метод с налидиксовой кислотой (с подращиванием клеток на предметных стеклах). Показано, что разработанная модификация позволяет учесть в 3,5 раза больше клеток грамотрицательных бактерий в почве.

Установлено, что в черноземе динамика численности грамотрицательных бактерий различается не только в разных горизонтах, но и в пределах одного гумусового горизонта. Впервые проанализировано влияние анаэробиоза на численность грамотрицательных бактерий в черноземе при различных условиях доступности питательных веществ (глюкозы, хитина и целлюлозы). В работе показано, что в зависимости от источника питания, в черноземе грамотрицательные бактерии могут увеличивать свою численность на ранних или поздних стадиях сукцессии.

Выявлено, что при наличии в почве доступного хитина грамотрицательные бактерии и актиномицеты (грамположительные бактерии) доминируют на разных стадиях сукцессии.

Отмечено, что в присутствии доступной целлюлозы в черноземе эти группы микроорганизмов развиваются одновременно на поздних стадиях сукцессии.

Сформулированные в диссертации положения позволяют расширить представление о роли грамотрицательных бактерий в разложении природных полимеров в почве в аэробных и анаэробных условиях. Полученные выводы позволяют оценить экологическую стратегию данной группы микроорганизмов в почвенной микробной сукцессии.

В частности, предложено оценить роль грамотрицательных бактерий в разложении хитина (основного компонента клеточной стенки почвенных грибов и покровов насекомых, обитающих в почве). В настоящее время первостепенная роль хитинолитических микроорганизмов отведена грамположительным бактериям — актиномицетам. В работе показано, что данная группа микроорганизмов развивается лишь на последних стадиях микробной сукцессии, а на начальном этапе в присутствии доступного хитина развиваются именно грамотрицательные бактерии.

Практическая значимость. Предложена модификация традиционного метода с налидиксовой кислотой, позволяющая более полноценно оценить численность грамотрицательных бактерий в почве. Использование данной модификации имеет важное значении в исследованиях внесенных популяций бактерий, в частности, клубеньковых бактерий ризосферы и ризопланы. Полученные представления о роли грамотрицательных бактерий в разложении природных полимеров в аэробных и анаэробных условиях могут быть использованы в оценке комплекса почвенных микроорганизмов и при микробиологическом анализе почв. В работе показано, что в зависимости от субстрата и доступа кислорода грамотрицательные бактерии могут доминировать как на начальных этапах микробной сукцессии, так и на её конечных стадиях, то есть в ситуации, когда легкометаболизируемые вещества уже использованы гидролитиками с высокой скоростью роста.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Положения работы изложены в материалах к 4 всероссийским и международным конференциям, в том числе: V Всероссийском съезде почвоведов им. В.В. Докучаева, (Ростов-на-Дону, 2008), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), Третьем Международном полевом симпозиуме «Западносибирские торфяники и цикл углерода: прошлое и настоящее» (Ханты-Мансийск, 2011), VI Всероссийском съезде почвоведов им. В.В. Докучаева, (Петрозаводск, 2012).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура н объем работы. Диссертация изложена на страницах, содержит 2г

рисунка, состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследований, экспериментальных результатов, заключения, выводов и списка литературы источников).

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 07-04-00628.

Автор глубоко признателен Манучаровой Наталии Александровне за помощь и консультации при использовании метода FISH в работе.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования послужили образцы чернозема типичного, находящегося под целинной растительностью (Центрально-Черноземный государственный природный биосферный заповедник имени Алехина, Курская область). Детальное морфологическое описание профиля и основные аналитические характеристики данной почвы широко представлено ^ литературе (Афанасьева, 1960). Модельный инкубационный эксперимент проводили на образцах из горизонтов А (10-20см), А' (20-30см), А" (40-50см) и В (120-130см). Почва характеризуется высоким содержанием углерода (3,96% - слой 10-20 см горизонта А; 3,8% - слой 20-30 см горизонта А; 2,9% - слой 40-50 см горизонта А; 0,79% - слой 120-130 см горизонта В), в составе обменных катионов преобладает кальций (17,6% СаО и 3,2% MgO). Почва имеет нейтральные значения pH.

Так же были исследованы образцы торфяной почвы, отобранные на одной из площадей Западно-Двинского стационара Института лесоведения РАН. По классификации этот торфяник соответствует олиготрофной остаточно-эутрофной торфяной почве. Были проанализированы образцы, взятые из четырех слоев почвенного профиля, представленные сфагновым верховым торфом. Это слои: ТО (5-10 см), Т1 (10-15 см), Т2 (15-30 см), Т4 (80-100см). Степень разложенности торфа составляла от 5 до 12% (Головченко и др., 2009).

2. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

Методика инкубирования. Воздушно-сухие растертые и просеянные через сито 0,25мм образцы увлажняли дистиллированной водой (контроль) и водой с добавлением 0,1% глюкозы, хитина и целлюлозы (опыт) до уровня полевой влагоемкости (27 масс. %). Проба разделяли на две части для эксперимента в аэробных и анаэробных условиях. Анаэробный (микроаэрофильный) режим создавали путем пятикратного вакуумирования анаэростатов и заполнения их азотом. Герметичность контролировалась по небольшому избыточному давлению смеси газов в

анаэростате. В ходе инкубирования давление незначительно возрастало из-за продуцируемых биотой газов. Вода на дне анаэростата обеспечивала постоянную влажность пробы в ходе эксперимента, температура инкубирования - 18°С.

Методика определения общей численности бактерий. В качестве основного приема предварительной обработки образцов для микробиологического анализа использовали ультразвуковое диспергирование на низкочастотном диспергаторе типа УЗДН-1 (22 кГц, 0,44 А, 2 мин) (Звягинцев, 1968).

Общее количество микроорганизмов определяли с помощью метода люминесцентной микроскопии. Препараты приготавливали по стандартной методике (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Суспензии образцов почвы наносили микропипеткой на тщательно обезжиренные предметные стекла в объеме 0,02 мл на препарат при равномерном распределении петлей на площади 4см2. Для одного образца готовили 12 препаратов, фиксирование которых проводили на пламени горелки после их полного высыхания. Окрашивание препаратов производилось в течение 2-3 минут раствором акридина оранжевого, разведенного в соотношении 1:10000.

Расчет количества клеток на 1 г почвы проводился по формуле: N = *а*п/ 8г*С

N - число клеток на 1 г почвы; 3| - площадь препарата (мкм2); а - количество клеток в одном поле зрения (усреднение производилось по всем препаратам); п - показатель разведения почвенной суспензии (мл); V - объем капли, наносимой на стекло (мл); Бг - площадь поля зрения микроскопа (мкм2); с - навеска почвы (г).

Методика определения численности грамотрицательиых бактерий. В основе метода лежит использование налидиксовой кислоты, которая ингибирует ферменты, необходимые для репликации ДНК, и является активной только в отношении грамотрицательиых бактерий. Это вещество останавливает процесс деления бактерий, что приводит к удлинению их формы. Первоначально налидиксовая кислота по стандартной методике вносили в почвенную суспензию в концентрации 0,002% об., затем добавляли дрожжевой экстракт в концентрации 0,025% и проводииь инкубирование в течение 6-часов при 18° в темноте. При помощи люминесцентного микроскопа анализировали 50 полей зрения в каждом препарате путем подсчета увеличившихся клеток, регистрируя, таким образом, численность грамотрицательиых бактерий. (Кодиге с1 а1., 1979).

В ходе исследования этот метод был нами модифицирован. Из суспензии с внесенными налидиксовой кислотой и дрожжевым экстрактом приготавливали препараты, и, не фиксируя их, помещали во влажную камеру, а затем инкубировали в течение 3 и 6 часов в термостате при температуре 28° С. Затем стекла извлекали, фиксировали и окрашивали препараты красителем акридином оранжевым.

Методика определения численности филогенетических групп грамотрицательных бактерий. В работе был так же использован Метод in situ-гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH). Данный метод совмещает возможности идентификации и определение численности отдельных филогенетических групп микроорганизмов в различных природных субстратах и широко используется в современных исследованиях микробных сообществ в морских и пресноводных экосистемах, торфах и ризосфере растений, (Amann, Ludwig, 2000, Манучарова, 2008). Этот молекулярно-биологический метод основан на идентификации микроорганизмов по последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК, и дает возможность исследовать микробное разнообразие непосредственно in situ, минуя стадии высевов на питательные среды. Данный метод позволяет учесть живые, метаболически активные клетки, в том числе и в почвенных образцах различной природы. В работе были использованы, согласно прописи (Манучарова, 2008, Amann 1995), олигонуклеотидные зонды на следующие группы грамотрицательных бактерий: Alphaprotcobacteria, Betaproteobacteria, Gammaprotcobacteria, Deltaproteobacteria и Bacteroidetes.

Статистическую обработку результатов учета численности бактерий проводили с использованием программы STATISTICA общепринятыми методами: определение среднего, дисперсии, доверительных интервалов. Для численности бактерий среднее квадратичное отклонение (5„.i) не превышало 10 % от выборочного среднего.

3. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА УЧЕТА ЧИСЛЕННОСТИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬННЫХ

БАКТЕРИЙ

За основу определения численности грамотрицательных бактерий был взят метод (Kogure et al., 1979), основанный на применении налидиксовой кислоты и предложенный для определения численности жизнеспособных клеток морских бактерий, особенно некультивируемых на стандартных средах. Согласно стандартной прописи, налидиксовую кислоту вносили в почвенную суспензию, которую затем инкубировали на качалке при 18° С в течение 6 часов и затем из нее приготавливали препараты. Определение этим методом количества жизнеспособных клеток грамотрицательных бактерий показало, что их численность в исследуемой почве невысока, и сами клетки грамотрицательных бактерий не так сильно отличались размерами от клеток, которые выявлялись в препаратах без добавления налидиксовой кислоты.

Проведенная нами модификация этого метода, описанная ранее, позволила получить более достоверные результаты при определении численности грамотрицательных бактерий в почвенных образцах. После внесения налидиксовой кислоты в почвенную суспензию из нее сразу приготавливали препараты и инкубировали их во влажной камере при 28° С в течение 3-х и 6-ти часов. Затем препараты, фиксировали, окрашивали и анализировали.

На рис. 1 представлены данные, сравнительного анализа численности грамотрицательных бактерий, полученные стандартным и модифицированным методами. Важно отметить, что

Рис. 1. Клетки грамотрицательных бактерий в черноземе (увеличение хЮОО): а, б - стандартный метод Когуре;

в, г - модифицированный метод (в - 3 часа инкубации с налидиксовой к-той, г - 6 часов); д, е, ж, з - грамотрицательные бактерии, выявленные на последних стадиях сукцессии модифицированным методом.

численность грамотрицательных бактерий, определенная модифицированным методом, в 2-3.5 раза превышает значения, полученные при использовании традиционного метода (Кхщиге е! а!., 1979), что было показано для 7-х и 15-х суток сукцессии бактериального почвенного сообщества (рис. 2).

модифицированный метод (6 часов инкубации)

модифицированный метод (3 часа инкубации)

0,94

стандартный метод (Ко^иге е! а1.5 1979)

}0,42

10,075

И 5 сутки ! 7 сутки

Рис. 2. Численность (млрд кл./г почвы) грамотрицательных бактерий при использовании различных методов их учета.

С использованием модифицированного нами метода была изучена динамика численности грамотрицательных бактерий в почвах в ходе микробной сукцессии, инициированной увлажнением и увлажнением с внесением полимеров в аэробных и анаэробных условиях.

4. ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ

ВНЕСЕНИИ ХИТИНА В АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ

На следующем этапе работы мы попытались подтвердить выдвинутое нами предположение о том, что грамотрицательные бактерии, максимум которых был зафиксирован на последних этапах сукцессии, относятся к прокариотам с хитинолитической активностью. С этой целью сукцессия во взятых образцах почвы инициировалась увлажнением и увлажнением с внесением хитина. Были взяты два слоя гумусированного горизонта А и один слой горизонта В. Образцы исследуемых почв инкубировали как в аэробных, так и анаэробных условиях.

На рис. 3 представлена динамика численности грамотрицательных бактерий в черноземе в аэробных и анаэробных условиях при внесении хитина.

О 10 20 -Я0 40 0 10 20 30 40

Сутки

Рис. 3. Динамика численности (млрд кл./г) грамотрицательных бактерий в разных слоях горизонтов А и В типичного чернозема в аэробных и анаэробных условиях. Обозначения:

«контроль» - контрольные варианты (сукцессия инициировалась увлажнением), «хитин» - опыт (увлажнение и внесение хитина).

I — гор. А, 10-20 см,

II - гор. А, 40-50 см, III-гор. В, 120-130 см.

Традиционно считается, что в почве хитин утилизируется преимущественно актиномицетами. В ходе микробной сукцессии увеличивает свою длину актиномицетный мицелий, то есть грамотрицательные бактерии заменяются на этом этапе грамположительными бактериями, главная роль среди которых принадлежит актиномицетам. Однако, грамотрицательные бактерий, обладая более высокой удельной скоростью роста, при внесении в почву хитина увеличивали свою численность на ранних этапах сукцессии. Как таковое, внесение хитина не повлияло на значение численности грамотрицательных бактерий, но ускорило сроки их развития в микробной сукцессии. В данных вариантах опыта максимальная численность грамотрицательных прокариот регистрировалась не на 7-15 сутки, а гораздо раньше — на 3-7-е сутки.

5. ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ

ИНИЦИАЦИИ СУКЦЕССИИ ВНЕСЕНИЕМ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

Следующий этап работы был связан с изучением грамотрицательных бактерий при внесении в почву целлюлозы. Было взято три слоя гумусированного горизонта А и тот же слой горизонта В. На рис. 4 представлена динамика численности грамотрицательных бактерий при инициации сукцессии увлажнением и увлажнением с внесением целлюлозы (в аэробных и анаэробных условиях). Как видно из рисунка, наибольшая исходная численность грамотрицательных бактерий была зарегистрирована во всех слоях гор. А и составляла от 14 до 19 млн кл./г. В ходе сукцессии в аэробных условиях их численность возрастала: во всех слоях гор. А на 14-е сутки опыта на порядок и более. При этом в горизонте В численность грамотрицательных бактерий также возросла, но увеличилась только в четыре раза. Начиная с 22-х суток, численность грамотрицательных бактерий резко уменьшилась во всех слоях гор. А, к концу опыта она снизилась в 2-3 раза по сравнению с 14-ми сутками опыта.

Внесение целлюлозы не оказало существенного влияния на увеличение численности грамотрицательных бактерий, за исключением верхнего слоя гор. А. Наоборот, в конце опыта в вариантах, где микробная сукцессия инициировалась только увлажнением, численность грамотрицательных бактерий уменьшалась не так сильно, как в варианте с инициацией сукцессии, вызванной внесением целлюлозы. В гор. В динамика численности грамотрицательных бактерий выражена слабее, хотя в конце опыта уровень стабилизации был несколько выше исходного уровня.

В анаэробных условиях к 14-м суткам опыта численность грамотрицательных бактерий возросла примерно на порядок в опытах с внесением целлюлозы в двух верхних слоях гор. А, и далее значительно не менялась. В варианте с простым увлажнением численность в этих слоях увеличилась примерно в четыре раза на 7-е сутки сукцессии, и далее она уменьшалась до исходного уровня. При этом в горизонте В численность бактерий менялась незначительно и была практически на исходном уровне.

6. ДИНАМИКА ДОЛИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ВНЕСЕНИИ

ХИТИНА В АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ

В аэробных условиях исходная доля грамотрицательных бактерий в верхнем слое горизонта А составляла около 3% (рис. 5). На ранних стадиях микробной сукцессии (до 13 суток) был характерен низкий процент грамотрицательных бактерий, как в контрольном образце, так и в варианте опыта с внесением хитина (около 12%). На 17 сутки доля грамотрицательных бактерий в контроле возросла на порядок по сравнению с исходной численностью и составила 37% от общей численности бактерий, а в варианте опыта с хитином - только 19%. В дальнейшем численность

грамотрицательных бактерий снижается: в контроле до 17%, а в варианте с внесением хитина до 11%. Однако и в конце опыта, численность грамотрицательных в обоих вариантах опыта превышала исходную в 4-5 раз.

III

IV

АЭРОБНЫЕ УСЛОВИЯ

АНАЭРОБНЫЕ УСЛОВИЯ

млрд кл/г 0.30

Рис. 4. Динамика численности (млрд кл./г) грамотрицательных бактерий в разных слоях гор. А и В типичного чернозема в аэробных и анаэробных условиях:

«контроль» - сукцессия инициировалась увлажнением; «целлюлоза» - увлажнением и внесением целлюлозы. 1-гор. А, 10-20 см;

II - гор. А, 20-30 см;

III - гор. А, 40-50 см; IV- гор. В, 120-130см.

АЭРОБНЫЕ УСЛОВИЯ

АНАЭРОБНЫЕ УСЛОВИЯ

II

III

Рис. 5. Динамика доли (%) грамотрицательных бактерий в разных слоях горизонта А и горизонта В в аэробных и анаэробных условиях в типичном черноземе, «контроль» - сукцессия инициировалась увлажнением «хитин» - увлажнением и внесением хитина

I — гор. А, 10-20 см,

II - гор. А, 40-50 см, III-гор. В, 120-130 см.

В нижнем слое горизонта А исходная доля грамотрицательных бактерий от общей численности бактерий составила чуть более 3%. Было отмечено значительное увеличение численности грамотрицательных бактерий в контрольном опыте уже к 13 суткам микробной сукцессии (до 46%). В дальнейшем доля грамотрицательных бактерий в общей численности бактерий возросла до 73%. К этому моменту сукцессии общая численность бактерий резко снизилась, поэтому максимальный процент можно объяснить уменьшением общей численности

бактерий. К концу опыта доля грамотрицательных бактерий в контрольном опыте превышает начальное значение более чем в 15 раз. В варианте с внесением хитина наблюдалось двукратное увеличение доли грамотрицательных бактерий в общей численности бактерий.

В горизонте В доля грамотрицательных бактерий в исходном образце почвы была вдвое выше исходной доли грамотрицательных бактерий в разных слоях горизонта А и составляла около 7%. Отмечено, что на протяжении всего опыта доля численности грамотрицательных бактерий колебалась в пределах 6% как в контроле, так и в варианте опыта с хитином, и к концу опыта доля составляла такой же процент, как и вначале инициации сукцессии.

В анаэробных условиях для верхнего слоя горизонта А было отмечено незначительное колебание доли грамотрицательных бактерий (рис. 5). В контрольном варианте, она в среднем составляла 4%, а в варианте с внесением хитина - 7%. Конечные значения процентного содержания грамотрицательных бактерий не отличались от исходных.

Доля грамотрицательных бактерий в анаэробных условиях в нижнем слое горизонта А возросла в ходе сукцессии: в контроле на 3 сутки до 28%, а в варианте с внесением хитина на 7 сутки до 36%. На этих же этапах сукцессии зафиксированы и максимумы численности грамотрицательных бактерий. К концу опыта доля численности грамотрицательных бактерий практически не отличается от их исходной доли.

На 3 сутки опыта в горизонте В в опыте с внесением хитина в анаэробных условиях отмечалась максимальная доля грамотрицательных бактерий - 15%. В ходе микробной сукцессии, в целом, не зарегистрировано существенных колебаний процентного содержания грамотрицательных бактерий. В среднем доля грамотрицательных бактерий составила около 5%.

7. ДИНАМИКА ДОЛИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ВНЕСЕНИИ

ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ

Доля грамотрицательных бактерий в исследованиях сукцессии чернозема при инициации увлажнением с внесением целлюлозы так же различалась в зависимости от вариантов опыта. На рис. 6 представлены данные о доле грамотрицательных в общей численности бактерий в опыте целлюлозой.

Во всех контрольных вариантах опыта в аэробных условиях высокая доля грамотрицательных бактерий наблюдалась на 14-32-е сутки, составляя от 9% до 39%.

В тех вариантах опыта, где сукцессия инициировалась внесением целлюлозы, высокая доля грамотрицательных бактерий отмечается также на 14-22-е сутки опыта, которая составляет 1022%. На 32-е сутки опыта она снижалась и составляла 7-15%.

Доля грамотрицательных бактерий в анаэробных условиях в контрольных вариантах не велика на протяжении всех стадий микробной сукцессии. Максимальные значения 11% и 16%

зарегистрированы в нижнем слое гор. А. В тех вариантах, где сукцессия инициировалась увлажнением с внесением целлюлозы, максимальная доля грамотрицательных бактерий наблюдалась на 14-е сутки опыта На последних стадиях сукцессии к 32-м суткам доля грамотрицательных бактерий составила в гор. А до 15% и около 6% - в гор. В.

Рис. 6. Динамика доли (%) грамотрицательных бактерий в разных слоях гор. А и В типичного чернозема в аэробных и анаэробных условиях:

«контроль» - сукцессия инициировалась увлажнением «целлюлоза» - увлажнением и внесением целлюлозы 1-гор. А, 10-20 см; II - гор. А, 20-30 см;

III-гор. А, 40-50 см;

IV-гор. В, 120-130 см.

8. ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ ПРОРОСШИХ СПОР АКТИНОМИЦЕТОВ ПРИ

ВНЕСЕНИИ ХИТИНА И ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

Внесение хитина. В результате проведенных исследований показано, что и в анаэробных условиях хитин, внесенный в почву, повлиял на сроки выявления максимумов численности грамотрицательных бактерий. На основании данных, полученных в опыте с внесением хитина, можно сделать предположение о том, что грамотрицательный компонент бактериального сообщества в первой половине исследуемой сукцессии может быть представлен прокариотами с хитинолитическими функциями. Главными "конкурентами" за доступный хитин могут выступать актиномицеты, но они, являясь гидролитиками, появляются лишь на последних стадиях сукцессии.

В ходе разработки метода определения численности грамотрицательных бактерий установлено, что в опытах в аэробных условиях с внесением хитина или целлюлозы в препаратах прорастали споры актиномицетов (рис. 7).

11

ЙЯ11

Рис. 7 Проросшие споры актиномицетов в поле зрения микроскопа на последних стадиях микробной сукцессии в черноземе, инициированной увлажнением с внесением полимеров (целлюлозы и хитина).

В контрольных опытах с инициацией сукцессии простым увлажнением споры прорастали на 17 сутки опыта . В верхнем слое горизонта А процент проросших спор был относительно высоким (рис. 8). В вариантах опыта, где сукцессия инициировалась увлажнением с внесением хитина, споры проросли уже на 13 сутки инкубации. В верхнем слое горизонта А доля проросших спор была такой же, как и в контроле.

хитин

II

III

Сутки

Рис. 8. Динамика доли (%) грамотрицательных бактерий и спор актиномицетов в разных слоях гор. А и В типичного чернозема в аэробных условиях при инициации сукцессии увлажнением и увлажнением и внесением хитина. 1-гор. А, 10-20 см, II - гор. А, 40-50 см, III-гор. В, 120-130 см.

Прорастание спор актиномицетов отмечается к концу проведения эксперимента, в это время наблюдается максимум развития мицелия актиномицетов и, скорее всего, в это же время происходит спорообразование. Вновь образованные споры начинают интенсивно прорастать, что хорошо видно при просмотре препаратов.

Внесение целлюлозы. В разложении целлюлозы принимают участие как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии, преимущественно актиномицеты. В отличие от предшествующего исследования с внесением хитина, споры актиномицетов во всех

вариантах опыта (контрольных и с внесением целлюлозы) прорастают на 14-е сутки опыта; при этом их доля составляет до 15% от всей бактериальной компоненты. В контроле (во всех слоях и горизонтах) доля проросших спор возрастает в ходе микробной сукцессии, составляя к концу опыта до 10—20% (рис. 9).

II

III

IV

КОНТРОЛЬ

ЦЕЛЛЮЛОЗА

п

14 22 32 0

О-грамотрицательные бактерии И—споры актиномицетов

14 22 32 Сутки

Рис. 9. Динамика доли грамотрицательных бактерий и спор актиномицетов от общей численности бактерий в разных слоях гор. А и В типичного чернозема в аэробных условиях при инициации сукцессии увлажнением и увлажнением и внесением целлюлозы. 1 - гор. А, 10-20 см; II-гор. А, 20-30 см; III - гор. А, 40-50 см; IV-гор. В, 120-130 см.

В аэробных вариантах опыта, где сукцессия инициировалась внесением целлюлозы, доля проросших спор была высока в двух верхних слоях горизонта А, и в зависимости от стадии сукцессии она составляла от 13 до 26%. В нижнем слое горизонта Айв горизонте В доля проросших спор была невелика и колебалась в пределах 2-8%.

Таким образом, как в варианте с инициацией сукцессии хитином, так и в варианте с инициацией сукцессии целлюлозой, доля проросших спор была ниже таковой в контрольных вариантах опыта. Высказанное предположение, что это связано с интенсивным спорообразованием в контроле и менее интенсивньм в вариантах с внесением дополнительного источника питания, кажется уместным и для этого варианта опьгга. Возможно, более высокую долю проросших спор можно также объяснить резким уменьшением общей численности бактерий в контрольных вариантах опыта по сравнению с опытными вариантами (хитин, целлюлоза).

9. ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В

ТОРФЯНИКЕ

На рисунке 10 представлена динамика общей численности почвенных бактерий в торфянике при инициации сукцессии увлажнением. Исходная численность бактерий в исследованных образцах составляет примерно 1,5 млрд клеток в грамме почвы в двух верхних слоев (это толща почвы 5-15 см) и 0,3-0,7 млрд для нижних (это образцы с глубины 15-30 см и 80-100 см). В ходе инициированной сукцессии численность возрастает: на 7 сутки опыта во всех исследуемых образцах зарегистрирован ее максимум. Для двух верхних слоев отмечено двукратное увеличение численности к этому сроку, а для нижних - трехкратное. Затем, общая численность бактерий снижается и после 15 суток сукцессии стабилизируется на уровне, который для верхних слоев незначительно отличается от исходного уровня, а для нижних - превышает его в 2 раза.

Динамика численности грамотрицательных бактерий в аэробных условиях отличалась от динамики общей численности почвенных бактерий. В трех верхних исследованных образцах торфяника (это толща 5-30 см) исходная численность грамотрицательных бактерий составила 2123 миллионов клеток в грамме почвы, а в нижнем слое - вдвое меньше. Максимум численности грамотрицательных бактерий был зарегистрирован не на 7, а уже на 3 сутки сукцессии, исключение составил лишь самый нижний горизонт (80-100 см). Таким образом, в отличие от динамики общей численности, в этом опыте рост был зафиксирован на более ранних этапах сукцессии в трех верхних слоях. На период 3 суток в самом верхнем слое отмечена относительно высокая численность грамотрицательных бактерий, составившая 220 млн кл./г почвы. В нижележащей толще (горизонты Т2 и Т4) этот показатель был втрое меньше, а в самом нижнем слое численность грамотрицательных бактерий увеличившись к 7-ым суткам микробной сукцессии, составила около 20 млн кл./г.

ОБЩАЯ ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ ЧИСЛЕННОСТЬ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

II

III

IV

Рис. 10. Динамика общей численности бактерий и численности грамотрицательных бактерий (*108 кл./г) в торфянике в аэробных условиях.

I-гор. ТО (5-10 см),

II-гор. Т1 (10-15 см), Ш-гор. Т2 (15-30 см), IV - гор. Т4 (80-100см).

Для опыта в анаэробных условиях (рис. 11) картина динамики общей численности бактерий в торфянике ощутимо отличалась от таковой, наблюдаемой в аэробных условиях.

ОБЩАЯ ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИИ

ЧИСЛЕННОСТЬ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИИ

55 « » а зз и

г-

р. 4 -

2

! И 21 2} а й

5 /-К

А. .

(

5 >5 2 5 25 » »

г:- г* ю

О 5 » Й 25 25 Й

V:

Рис. 11. Динамика общей численности бактерий и численности грамотрицательных бактерий (*108 кл./г) в торфянике в анаэробных условиях.

I — гор. ТО (5-10 см),

II - гор. Т1 (10-15 см),

III - гор. Т2 (15-30 см), IV-гор. Т4 (80-100см).

Для 2-х верхних слоев торфяной почвы отмечено негативное воздействие бескислородной среды на развитие почвенных бактерий: их численность к 15 суткам сукцессии уменьшилась в 2-3

раза и сохранялась на этом уровне до конца опыта. В третьем слое был отмечен незначительный рост общей численности, максимум которой пришелся на 7 сутки сукцессии.

Но на этот же период, в слое Т4 торфяника было зарегистрировано значение численности, составившее около 900 млн кл./г почвы, таким образом в 3 раза превышающее исходное. Картина динамики численности бактерий в исследованных образцах торфяника выглядит закономерно: анаэробные условия негативно повлияли на бактериальную компоненту верхней части профиля, которая представлена, по-видимому, преимущественно аэробами.

Микробная сукцессия грамотрицательных бактерий в анаэробных условиях претерпевала иную динамику, нежели вся бактериальная компонента. Во всех четырех изученных слоях был отмечен рост их численности в анаэробных условиях, по сравнению с динамикой общей численности бактерий. Однако динамика грамотрицательных бактерий не различалась в опытах, проведенных в аэробных и анаэробных условиях. Возможно, такая картина может быть обусловлена тем, что грамотрицательная компонента бактериального сообщества проанализированных торфяных почв представлена факультативными анаэробами.

10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛЕННОСТИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В

ЧЕРНОЗЕМЕ МЕТОДОМ FISH.

С помощью метода FISH была оценена численность различных филогенетических групп грамотрицательных бактерий в верхнем слое чернозема (10-20 см). Для анализа были использованы олигонуклеотидные зонды на следующие группы грамотрицательных бактерий: Alphaproteobacteria, Betaproteobactcria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobactcria и Bactcroidetes.

Было установлено, что в анализируемом слое чернозема филум Bactcroidetes составляет 35%, а филум Proteobacteria 65% от всей численности грамотрицательных бактерий, определяемых при использовании стандартных зондов (рис 12).

Результаты анализа показали, что в филуме Proteobacteria доминируют представители класса Alphaprotcobacteria этого крупного таксона, прежде всего в разложении хитина. По-видимому, общие физиологические свойства грамотрицательных бактерий существенно влияют и на их экологические функции в почвенном микробном сообществе чернозема.

АЭРОБНЫЕ УСЛОВИЯ

контроль хитин целлюлоза

АНАЭРОБНЫЕ УСЛОВИЯ

контроль хитин целлюлоза

Рис. 12. Численность (в млрд кл./г) филогенетических групп грамотрицательных бактерий, определяемая по методу FISH на 15 сутки сукцессии в черноземе (слой 10-20 см).

выводы

1. Для определения численности жизнеспособных грамотрицательных почвенных бактерий нами впервые разработан и применен модифицированный метод с налидиксовой кислотой (с подращиванием клеток на предметных стеклах). Регистрируемая этим методом численность грамотрицательных бактерий в ходе сукцессии больше в 3,5 раза, по сравнению с традиционным методом.

2. Показано, что в черноземе динамика грамотрицательных бактерий различалась не только в разных горизонтах, но и в пределах одного горизонта А. Максимальная численность грамотрицательных бактерий была зарегистрирована в верхнем слое горизонта А, а наименьшая численность - в горизонте В. В ходе сукцессии в аэробных условиях численность грамотрицательных бактерий возрастала в зависимости от горизонта в 3-15 раз и стабилизировалась на уровне, превышающем исходный.

3. В анаэробных условиях в черноземе численность грамотрицательных бактерий возрастала в ходе сукцессии всего в 2-4 раза, и уровень стабилизации был ниже, чем исходный. Увеличение численности грамотрицательных бактерий в контроле наблюдалось на 7-15 сутки. Внесение хитина в качестве дополнительного источника углерода и азота способствовало увеличению численности грамотрицательных бактерий па более ранних стадиях сукцессии, как в аэробных, так и анаэробных условиях.

4. Изучение сукцессии в торфянике показало, что численность грамотрицательных бактерий претерпевает свой максимум на 3 сутки опыта. Отмечено, что динамика численности грамотрицательных бактерий в аэробных и анаэробных условиях значимо не отличалась. Доля грамотрицательных бактерий в ходе сукцессии в торфяной почве составляет не более 10% от общей численности бактериальной компоненты.

5. Показано, что в зависимости от источника питания, в черноземе грамотрицательные бактерии могут увеличивать свою численность на ранних или поздних стадиях сукцессии. В случае с хитином грамотрицательные бактерии и актиномицеты доминируют на разных стадиях сукцессии, при внесении целлюлозы они развиваются одновременно, на поздних стадиях сукцессии.

6. Отмечено, что на поздних этапах сукцессии в черноземе в аэробных условиях прорастают споры актиномицетов, доля которых в общей численности бактерий может составлять от 10 до 40% в зависимости от стадии сукцессии и варианта опыта.

7. Установлено, что в слое 10-20 см чернозема филум Bactcroidetes составляет 35%, а филум Proteobacteria 65% от численности грамотрицательных бактерий, определяемых по методу FISH. Как в исходных образцах, так и на 15 сутки опыта в аэробных условиях в контроле наибольшая численность была зарегистрирована у бактерий класса Alphaproteobacteria и филума

Bacteroidetes. В аэробных условиях в опыте с хитином наибольшая численность отмечена у филума Bacteroidetes, а в анаэробных условиях в варианте с внесением целлюлозы — у класса Bctaproteobacteria.

8. Проведенные исследования показали, что в почве грамотрицательные бактерии могут играть важную роль в разложении хитина в почве на ранних этапах микробной сукцессии. Отмечено, что в присутствии хитина грамотрицательные бактерии и актиномицеты доминируют на разных стадиях сукцессии, при внесении целлюлозы они развиваются одновременно на поздних стадиях сукцессии.

III. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полянская Л.М., Иванов К.Е., Гузев B.C., Звягинцев Д.Г. Оценка динамики численности грамотрицательных бактерий в почве // Микробиология, 2008, Т.77, №6, С.848-853.

2. Полянская Л.М., Иванов К.Е., Звягинцев Д.Г. Новый метод учета численности грамотрицательных бактерий в почве // Материалы V, Всероссийского съезда почвоведов им. В.В. Докучаева, 18-23 августа 2008, С. 124.

3. Иванов К.Е. Динамика численности грамотрицательных бактерий в черноземе в аэробных и анаэробных условиях // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов», 24-27 декабря 2009, С. 71.

4. Иванов К.Е., Полянская JI.M. Динамика численности грамотрицательных бактерий в торфянике в аэробных и анаэробных условиях // Материалы Третьего Международного полевого симпозиума «Западносибирские торфяники и цикл углерода: прошлое и настоящее», 27 июня-5 июля 2011, С. 19.

5. Иванов К.Е., Полянская Л.М. Влияние хитина и целлюлозы на численность грамотрицательных бактерий в черноземе в аэробных и анаэробных условиях // VI Всероссийский съезд почвоведов им. В.В. Докучаева, 13-17 августа 2012. Кн.2. С.348-349

6. Полянская Л.М., Иванов К.Е., Звягинцев Д.Г. Изменение численности грамотрицательных бактерий в черноземе при инициации сукцессии увлажнением и внесением хитина и целлюлозы // Почвоведение, 2012, №10, С. 1089-1098.

Подписано п печать:

19.02.2013

Заказ № 8168 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorcferat.ru