Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие бактерий и грибов в черноземе при разных уровнях аэрации

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Развитие бактерий и грибов в черноземе при разных уровнях аэрации"

На правах рукописи

Горбачева Мария Александровна

РАЗВИТИЕ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ В ЧЕРНОЗЕМЕ ПРИ РАЗНЫХ УРОВНЯХ АЭРАЦИИ

Специальность 03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

14 т 2013

Москва—2013

005535908

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Полянская Любовь Максимовна

Официальные оппоненты: Ананьева Надежда Дмитриевна

доктор биологических наук, Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Семёнова Татьяна Александровна

кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Российский государственный аграрный

университет — Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева

Защита состоится 19 ноября 2013 года в 15:30 в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, корп. 12, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 17 » октября 2013 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета р^ШіІ^ Зенова Галина Михайловна

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Почва с микробиологической позиции представляет собой гетерогенную среду и не может рассматриваться как единая однородная среда обитания (Звягинцев, 1987). Благодаря своей структурированности и микрозональности, она должна быть изучена как набор различных макро-, мезо- и микросред, в каждой из которых создаются различные и часто прямо противоположные условия доя развития отдельных групп микроорганизмов. Микро- и мезозоны разделены в пространстве и во времени. Во всех почвах и в разных почвенных горизонтах микрозональность основывается на локальном поступлении органических остатков и корневых выделений, а также на микрозональности распределения физико-химических условий и минералогических факторов. Во всех почвах и в разных почвенных горизонтах имеются аэробные и анаэробные макро-, мезо- и микрозоны, резко различающиеся по величине окислительно-восстановительного потенциала (Eh). Анаэробные условия могут сохраняться на протяжении больших временных периодов (Зайдельман, 1985; Орлов, 1987).

Однако до настоящего времени изучены в основном аэробные микроорганизмы и их активность в аэробных условиях, причем, главным образом, эта работа проводилась с использованием метода посева и изучались чистые культуры микроорганизмов. В то же время неоднократно отмечалось, что изучать микроорганизмы необходимо непосредственно в почве (Виноградский, 1952; Звягинцев, 1987, 2005). В настоящее время такое изучение сукцессий микроорганизмов проводится, главным образом, на микрокосмах — почвенных образцах, поставленных в строго контролируемые условия температуры, влажности, аэрации и питания (Polyanskaya, Zvyagintsev, 1995). В ходе микробной сукцессии изменения проходят вполне закономерно, в определенной последовательности, так что их можно исследовать. Начало сукцессии может быть наиболее просто задано увлажнением почвенного образца или внесением в почву различных органических веществ (Сахаров, хитина, целлюлозы, лигнина).

В почвоведении и почвенной микробиологии анализ микробных сообществ способствует углублению понимания экологических функций почвы, связанных с ее биотой, детализирует такие аспекты экологии почв как структура почвенных микробных комплексов, их происхождение, трофические связи, баланс элементов питания. Микроорганизмы могут быть чуткими индикаторами различного рода антропогенных воздействий. Таким образом, для понимания микробиологических процессов, происходящих в почве, и решения проблем охраны окружающей среды необходимо изучение микробных сукцессий в условиях, близких к нативным.

Цель исследования — изучить развитие микроорганизмов в почве в ходе микробной сукцессии, инициированной увлажнением, и увлажнением с внесением хитина в микрокосмах с помощью метода люминесцентной микроскопии и «каскадной» фильтрации в аэробных и анаэробных условиях.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику численности бактерий и длины грибного мицелия в аэробных и анаэробных условиях в черноземе типичном (целина, пашня) в ходе микробной сукцессии при температуре инкубации 18°С и 28°С с помощью метода люминесцентной микроскопии.

2. Сравнить отклик биомасс разных групп почвенных микроорганизмов на внесение субстрата (хитин) в аэробных и анаэробных условиях при температуре инкубации 18°С и 28°С.

3. Определить численность бактерий и распределение их доминирующих групп по размеру в аэробных и анаэробных условиях в черноземе типичном (пашня) с помощью метода «каскадной» фильтрации.

4. Определить объем и биомассу бактерий в аэробных и анаэробных условиях в верхнем слое горизонта Айв горизонте В чернозема типичного пахотного.

5. Установить связь между численностью разных групп микроорганизмов и стадиями сукцессии, горизонтами почвы, внесением субстрата и уровнем аэрации.

Научная новизна. Впервые было показано, что при температуре инкубации 18"С в анаэробных условиях в почве происходит развитие мицелия грибов, тогда как при температуре инкубации 28°С в анаэробных условиях бактерии развивались, но рост грибного мицелия отсутствовал. Было установлено, что уровень аэрации и слой почвы оказали решающее воздействие на исследуемые группы микроорганизмов. В ходе микробной сукцессии практически все клетки бактерий были жизнеспособны. Изучение влияния аэробных и анаэробных условий на размер бактерий показало, что в анаэробных условиях клетки бактерий мельчали, резко возрастала численность их мелких форм, что приводило к увеличению биомассы последних.

Практическая значимость. Изучено влияние разных температур и уровней аэрации на рост и развитие почвенных бактерий, актиномицетов и грибов, что дает возможность управлять их численностью и выделять популяции, которые будут развиваться в этих условиях. Преобладание мелких форм бактерий в анаэробных условиях показало, что в почве отсутствуют благоприятные условия для их развития. Данное исследование помогает расширить представления о предотвращении последствий неблагоприятных экологических ситуаций в почвах, связанных с антропогенным воздействием на них, и тем самым поможет целенаправленно изменять экологическое состояние почв с помощью оценки

функционирования микроорганизмов в желаемом направлении. Полученные данные о роли различных групп микроорганизмов в разложении хитина при разных уровнях аэрации могут быть использованы для характеристики разных почв, их горизонтов, а также для определения жизнеспособности прокариотных микроорганизмов в них. На основании этих показателей можно более точно установить сходство и различие не только разных почв, но и их горизонтов.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях «Ломоносов-2008» (Москва, 2008г.), «Ломоносов-2009» (Москва, 2009г.), Всероссийская научная конференция XIII Докучаевские молодежные чтения, (Санкт-Петербург, 2010г.), «Ломоносов-2012» (Москва, 2012г.); I Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011г.), VI съезд Общества почвоведов имени В.В. Докучаева Всероссийская с международным участием научная конференция «Почвы России современное состояние, перспективы изучения и использования (Петрозаводск, 2012г.), Международная ассамблея EGU-2012 (Вена, Австрия, 2012г.), Европейский конгресс микробиологов FEMS-2013 (Лейпциг, Германия, 2013г.).

Публикации. По теме исследований опубликованы 4 работы: 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК и 1 в сборнике, а также тезисы, изданные в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, объектов и методов, заключения, выводов, списка литературы ( 195 источников, из них 108 на иностранных языках). Работа иллюстрирована 34 рисунками, содержит 2 таблицы.

Личный вклад автора в работу. Автором проведены аналитический обзор литературы, лабораторные эксперименты, а также микробиологические анализы исследуемой почвы, интерпретация полученных результатов и статистическая обработка данных.

Автор благодарит проф., д.б.н., Д.Г. Звягинцева, сотрудников кафедры биологии почв: к.б.н. Т.А. Грачеву, к.б.н. Е.В. Лапыгину за помощь в проведении исследования, а таже автор выражает глубокую признательность д.б.н. Л.В. Васильевой (ИНМИ РАН) за помощь и консультации при работе по просвечивающей микроскопии и инженеру И.В. Матыченкову (Межкафедральная лаборатория электронной микроскопии Биологического ф-та МГУ) за помощь при работе по сканирующей микроскопии.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования послужили образцы чернозема типичного: целина и пашня (Классификация и диагностика почв СССР, 1977). Образцы чернозема типичного (целина) были отобраны из Центрально-Черноземного государственного природного биосферного заповедника имени Алехина, Курская область. Образцы чернозема типичного (пашня) отобраны из Курского Научно-исследовательского института агропромышленного производства.

Почва характеризовалась высоким содержанием углерода (3.96%, слой 10-20 см горизонта А; 3.8%, слой 20-30 см горизонта А; 2.9% — слой 40-50 см горизонта А; 0.79% слой 120-130 см горизонта В), в составе обменных катионов преобладает кальций (17.6% СаО и 3.2% \^0). Почва имеет нейтральные значения рН=7-7.5. Модельный инкубационный эксперимент проводили на образцах целинного чернозема из горизонтов: А( 10-20), А' (20-30), А" (40-50 см) и горизонта В (120-130 см), а также из слоев и горизонтов пахотного чернозема горизонта А(0-10), А' (15-25), А" (40-50 см) и горизонта В (140-160 см).

2. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

Методика инкубации почвенных образцов. Почвенные образцы увлажняли дистиллированной водой (контроль) и водой с добавлением 0.1 % хитина до уровня полевой влагоемкости (27 мае. %). Пробу разделяли на две части для эксперимента в аэробных и анаэробных условиях. Анаэробный (микроаэрофильный) режим создавали в анаэростататах путем 10-кратного вакуумирования и заполнения азотом. Герметичность контролировали по небольшому избыточному давлению смеси газов в анаэростате. В ходе инкубации давление незначительно возрастало из-за продуцируемых биотой газов. Вода на дне анаэростата обеспечивала постоянную влажность пробы во время эксперимента, температура инкубации была 18°С и 28°С.

Методика определения численности и биомассы микроорганизмов методом люминесцентной микроскопии. В качестве основного приема предварительной обработки образцов (просеянных через 0.25 мм) для микробиологического анализа использовали ультразвуковое диспергирование на низкочастотном диспергаторе типа УЗДН-1 (22 кГц, 0.44 А, 2 мин) (Звягинцев, 1968). Препараты готовили обычным способом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Суспензии образцов почвы (1:100) наносили микропипеткой на тщательно обезжиренные предметные стекла (0.02 мл на препарат для бактерий и 0.04 мл на препарат для грибов) и равномерно распределяли петлей по площади 4см2. Фиксирование препаратов на пламени горелки проводили после полного их высыхания. Для одного образца готовили 12 препаратов. Для каждого стекла просматривали

6

по 150 полей зрения. Препараты для подсчета бактерий и мицелия актиномицетов окрашивали раствором акридина оранжевого ( 1:10000, в течение 2-3 минут), для учета спор и мицелия грибов — калькофлуором белым (Fluorescent Brightener 28) в течение 15 минут (Полянская, 1988).

Расчет количества клеток (мицелия) на 1 г почвы проводили по формуле:

N=S,*a*n/v*S2*c,

где: N — число клеток (длина мицелия, мкм) на 1 г почвы; Si- площадь препарата (мкм2); а — количество клеток (длина мицелия, мкм) в одном поле зрения (усреднение производится по всем препаратам); п — показатель разведения почвенной суспензии (мл); V — объем капли, наносимой на стекло (мл); S2 — площадь поля зрения микроскопа (мкм2); с — навеска почвы (г).

Расчеты биомассы проводили, учитывая что биомасса сухого вещества для одной бактериальной клетки объемом 0.1 мкм3 составляет 2х10"м г, 1 м актиномицетного мицелия диаметром 0.5 мкм 3.9х10"8 г (Кожевин и др., 1979). С учетом замеренного диаметра спор и мицелия грибов реальную биомассу вычисляли по формуле: для споры — 0.0836г3х!0""г, для 1 м грибного мицелия — О.бгвАсЮ"6 г (Полянская, 1996).

Методика учета численности бактерий с помощью метода «каскадной» фильтрации. При определении размеров бактерий использовался метод «каскадной» фильтрации с помощью колбы Бунзена. Были взяты ядерные фильтры с диаметром пор 1.85; 0.43; 0.38 и 0.23 мкм и мембранные фильтры «Сынпор» с диаметром пор 0.17 мкм (Полянская и др., 2013).

Методика проверки анаэробных условий в анаэростате. Для проверки анаэробного (микроаэрофильного) режима создаваемого в анаэростатах при инкубации почвенных образцов в ходе основного эксперимента был разработан метод, основанный на наблюдении за прорастанием спор актиномицета St. pluricolorescens на предметных стеклах при температуре инкубации 28°С. В работе использовали моноспоровую суспензию актиномицета (2x105 кл/г).

Методика оценки жизнеспособности клеток бактерий in situ. Физиологическое состояние бактерий оценивали с помощью окрашивания двухкомпонентным флуоресцентным красителем (LIVE/DEAD L7012 BacLight bacterial viability kit) в соответствии с рекомендациями производителя (Molecular Probes, 1994). Применение этого красителя позволяет определить как общую численность бактерий, так и физиологическое состояние клеток. Клетки бактерий с неповрежденными мембранами (интактные, «живые») окрашивались в зеленый цвет, а клетки с поврежденными мембранами («мертвые») — в красный цвет. Препараты просматривали в люминесцентный микроскоп со светофильтром 450-490 нм. При подсчете клеток просматривали по 150 полей зрения для каждого предметного стекла. Всего готовили на образец 2 стекла. Оценивали общую численность бактерий в почве и долю клеток с поврежденной и неповрежденной клеточной мембраной.

Расчеты общей численности бактерий на 1 г почвы проводили по общепринятой методике, используемой при работе с акридиновым оранжевым приведенной выше.

Изучение морфологии и структуры клеток бактерий in situ. Морфологию бактерий, полученных методом «каскадной» фильтрации из почвенной суспензии чернозема типичного (пашня) изучали в сканирующем электронном микроскопе, для чего образцы сконцентрированных клеток напыляли слоем золота толщиной примерно 20 нм в атмосфере аргона в установке IIB-Зс фирмы Eiko. Использовали сканирующий электронный микроскоп JSM-6380 LA фирмы JEOL. Для изучения морфологии клеток в просвечивающем электронном микроскопе готовили препараты целых клеток бактерий и контрастировали их 1% раствором уранилацетата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Специфика развития микроорганизмов в черноземе типичном (целина) при внесении хитина в аэробных и анаэробных условиях при температуре инкубации 18 "С

На первом этапе исследования была поставлена задача, оценить динамику численности бактерий, актиномицетов и длины грибного мицелия в черноземе типичном (целина) при температуре инкубации 18°С. В эксперименте использовали слои горизонта А (10-20) и А"(40-50 см) и слой (120-130 см) горизонта В.

Бактерии

Динамика численности почвенных бактерий в аэробных и анаэробных условиях представлена на рис. 1. В аэробных условиях во всех слоях горизонта А и горизонта В наблюдался рост численности бактерий на 7-е сутки инкубации чернозема. Внесение хитина оказало не только положительное влияние на динамику бактерий во всех слоях горизонта А и В, но и ускорило темпы роста численности бактерий (3-7-е сутки) (рис. 1-Б). Уровень стабилизации этого показателя во всех слоях горизонта А в варианте с внесением хитина был существенно выше по сравнению с контролем.

В анаэробных условиях кривая динамики численности бактерий в верхнем слое горизонта А была аналогична таковой в аэробных условиях. В анаэробных условиях в нижнем слое горизонта А численность бактерий снизилась на 3-й сутки в 3 раза и в дальнейшем существенно не менялась. В горизонте В общая численность бактерий практически не менялась на протяжении всего срока инкубации почвенных образцов типичного чернозема (целина). Влияние хитина на рост почвенных бактерий в этих вариантах опыта менее значимо, чем для аналогичного варианта в аэробных условиях.

А

Б

Рис.1. Динамика численности бактерий в разных слоях горизонта А (1,2) и в горизонте В (3) чернозема типичного (целина) в контроле (А) и при внесении хитина (Б). 1 — горизонт А (10-20 см), 2 — горизонт А" (40-50 см), 3 — горизонт В (120-130 см), 1х, 2х, Зх — тс же горизонты опыта, но с внесением хитина

Актиномииеты

В аэробных условиях во всех слоях и горизонтах чернозема типичного (целина) отмечался рост длины актиномицетного мицелия к 7-13 суткам (рис. 2). Внесение хитина оказало существенное влияние как на рост длины актиномицетного мицелия, так и на уровень его стабилизации.

Рис.2. Динамика длины актиномицетного мицелия в разных слоях горизонта Айв горизонте В чернозема типичного в контроле (А) и при внесении хитина (Б). Обозначение см. рис. 1.

В анаэробных условиях акгиномицеты не развивались. В обоих слоях горизонта А, в которых сукцессия инициировалась увлажнением и внесением хитина, в анаэробных условиях длина актиномицетного мицелия снижалась не так резко (к 7-ым суткам в контроле длина мицелия актиномицетов составляла 30-40% от исходной, а в варианте с внесением хитина — 50% и выше).

Грибы

На рис. 3 представлена динамика мицелия грибов в разных слоях горизонта А и горизонте В. В аэробных условиях в верхнем слое горизонта А длина мицелия грибов в контрольном варианте опыта возрастала в 2-3 раза на 3-7-и сутки, затем снижалась и стабилизировалась на исходном уровне (нижний слой горизонта А), либо на уровне в 1.5-2 раза превышающем исходный (верхний слой горизонта А и горизонт В). Внесение хитина повлияло как на рост грибного мицелия (длина мицелия грибов возросла примерно в 3 раза во всех изученных горизонтах чернозема), так и на сроки: длина мицелия грибов достигла своего максимума уже на третьи сутки инкубации чернозема. В нижнем слое горизонта А и горизонте В, в аэробных условиях также наблюдался рост длины грибного мицелия в 1.5-2 раза превышающий исходные уровни. Внесение хитина сказалось на росте длины мицелия грибов в горизонте А и горизонте В, максимальный рост был зарегистрирован на третьи сутки и превысил исходный в 2-3 раза.

32 Сутки

Рис.3. Динамика длины грибного мицелия в разных слоях горизонта А (1,2) и в горизонте В (3) чернозема типичного в контроле (А) и при внесении хитина (Б). Обозначение см. рис. 1.

В анаэробных условиях в контрольном варианте и в варианте с хитином в верхнем слое горизонта А также наблюдался рост длины мицелия в 1.5-2 раза по сравнению с исходным уровнем, но позже на 7-15 сутки. Внесение хитина в этом варианте опыта не

оказало заметного влияния на развитие мицелия грибов. В анаэробных условиях увеличение длины грибного мицелия не наблюдалось и в нижнем слое горизонта Айв горизонте В. Интересно отметить, что в этом варианте эксперимента на протяжении всего опыта уменьшался диаметр грибных гиф с 4 до 3-х мкм.

Споры грибов

Численность спор грибов во всех вариантах опыта в аэробных условиях возросла в 1.5-2 раза к концу опыта, а в анаэробных условиях во столько же уменьшилась. Внесение хитина и в аэробных, и в анаэробных условиях практически не сказалось ни на динамике численности спор, ни на численности спор, зарегистрированных в конце опыта.

Поля прокариот

В верхнем слое 10-20 см горизонта А, где развивались все группы микроорганизмов в аэробных и анаэробных условиях была рассчитана доля прокариот в общей биомассе микроорганизмов. Как видно из рис. 4 доля прокариот (бактерии и актиномицетный мицелий) была невысока и колебалась от 1-2.0 % - в аэробных условиях до 0.7-1.9% — в анаэробных условиях. Таким образом, было подтверждено, что и в аэробных и анаэробных условиях в горизонтах, где происходит рост микроорганизмов, доминируют грибы, доля которых в общей биомассе микроорганизмов составляет 98% и выше (Полянская, Звягинцев, 2005).

Рис.4. Доля (%) биомассы прокариот в общей биомассе микроорганизмов в слое 10-20 см горизонта А в аэробных (аэ) и анаэробных (анаэ) условиях при увлажнении (1) и увлажнении с внесением хитина (1х).

Специфика развития микроорганизмов в черноземе типичном (целина и пашня) при внесении хитина в аэробных и анаэробных условиях при температуре инкубации 28°С.

Развитие мицелия грибов в анаэробных условиях раньше никогда не отмечалось. Была предпринята попытка понять, какие факторы могли оказать влияние на развитие грибов в анаэробных условиях в черноземе типичном (целина): температура, тип почвы или тип землепользования. В литературе было отмечено, что мицелиальные грибы лучше разлагают

органическое вещество при низких температурах. При изучении сфагновых болот Канады в модельных экспериментах было показано, что бактерии и грибы участвовали в этих процессах, но при температуре 14°С этот процесс деструкции проходил лучше, чем при 20°С (ТЬогтапп е1 а1., 2004). Поэтому была предпринята попытка проверить, как будет проходить развитие микроорганизмов при более высокой температуре (28°С).

Чернозем типичный (целина)

Бактерии

В черноземе типичном (целина) в аэробных условиях при температуре 28°С во всех слоях горизонта А и горизонте В наблюдалось незначительное увеличение численности бактерий. Внесение хитина оказало положительное влияние на динамику почвенных бактерий во всех слоях и горизонтах чернозема (рис.5).

А Б

о 3 7 15 30

Рис.5. Динамика численности бактерий в разных слоях горизонта А (1,2) и в горизонте В (3) чернозема типичного (целина) в контроле (А) и при внесении хитина (Б) анаэробных условиях при температуре инкубации 28°С.

1 — горизонт А (10-20 см),

2 — горизонт А"(40-50 см),

3 — горизонт В (120-130 см),

1х, 2х, Зх — те же горизонты опыта, но с внесением хитина

В анаэробных условиях кривая динамики численности бактерий в верхнем слое горизонта А аналогична таковой в аэробных условиях. Влияние хитина на рост почвенных бактерий в этом варианте опыта менее значимо, чем для аналогичного варианта в аэробных условиях.

Грибы

Как видно из рис. 6 при температуре инкубации 28°С не отмечалось развития мицелия грибов в черноземе типичном (целина) ни в одном горизонте, как в аэробных, так и в анаэробных условиях, как в контроле, так и в варианте с внесением хитина.

Сутки

Рис.6. Динамика длины грибного мицелия в разных слоях горизонта А (1, 2) и в горизонте В (3) чернозема типичного (целина) в контроле (А) и при внесении хитина (Б). Обозначение см. рис. 5.

Чернозем типичный (пашня)

Бактерии

Динамика развития бактерий в аэробных и анаэробных условиях во всех слоях горизонта Айв горизонте В чернозема типичного (пашня) при 28°С аналогична таковой в черноземе типичном (целина) при 28°С. Внесение хитина оказало положительное влияние на динамику численности бактерий во всех слоях горизонта А и горизонте В чернозема типичного (пашня) как в аэробных, так и в анаэробных условиях (рис. 7)

Грибы

Мицелий грибов в черноземе типичном пахотном при температуре инкубации 28 "С в анаэробных условиях не развивался (рис. 8).

млрд кл/г

Сутки

Рис.7. Динамика численности бактерий в разных слоях горизонта А (1, 2) и в горизонте В (3) чернозема типичного (пашня) в контроле (А) и при внесении хитина (Б) при температуре инкубации 28°С. 1-горизонт А (0-10 см), 2- горизонт А" (40-50 см), 3- горизонт В (140-160 см) 1х, 2х, Зх - те же горизонты опыта, но с внесением хитина.

Рис.8. Динамика длины грибного мицелия в разных слоях горизонте А (1х,2х) и в горизонте В (Зх) чернозема типичного (пашня) в аэробных (А) и анаэробных (Б) условиях при внесении хитина Обозначение см. рис.7.

Таким образом, было показано, что температура инкубации оказала влияние на развитие мицелия грибов в исследуемом черноземе (целина, пашня).

Отклик разных групп микроорганизмов в черноземе типичном (,иелина) при температуре инкубации /<УС

Отклик разных групп микроорганизмов на внесение дополнительного источника углерода и азота (хитин) при температуре инкубации 18°С в черноземе типичном (целина) оценивали по отношению биомассы в каждый конкретный момент к исходной биомассе в слое 10-20 см горизонта А (рис. 9). В аэробных условиях наиболее активно на внесение хитина реагировали актиномицеты и грибы, а в анаэробных - бактерии и грибы, но их реакция была намного слабее той, которая наблюдалась для изученных групп в аэробных условиях (Белова и др., 2006).

А Б

I6

О 3 7 15 32 0 3 7 15 32

Сутки

Рис.9. Величина отклика биомасс Ы=(Б„+1/Б„0) разных групп микроорганизмов на внесение хитина в слое 10-20 см горизонта А чернозема типичного (целина) в контроле (А) и при внесении хитина (Б).

МГ — мицелий грибов (споры и мицелий), МА —мицелий актиномицетов, Б —бактерии,

МГ(хит), МА(хит), Б(хит) —те же варианты с внесением хитина.

Отклик разных групп микроорганизмов в черноземе типичном (иелина) при температуре инкубаиии 28'С

В черноземе типичном (целина) во всех слоях горизонта А и горизонте В при температуре инкубации 28°С, отклик микроорганизмов на внесение хитина наблюдался только у бактерий в аэробных и анаэробных условиях (рис. 10). Мицелий грибов в черноземе типичном не развивался, и отклик этой группы микроорганизмов не значим, как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

А Б

Рис.10. Величина отклика биомасс М=(Бп+|/Бю) бактерий и грибов на внесение хитина в слое 10-20 см горизонта А чернозема типичного (целина) в аэробных (А) и анаэробных (Б) условиях.

Отклик разных групп микроорганизмов в черноземе типичном (пашня) при температуре инкубации 28'С

Наибольший отклик при внесении хитина в черноземе типичном (пашня) наблюдался у почвенных бактерий при температуре инкубации 28°С в аэробных и анаэробных условиях. Развития грибов в типичном черноземе (пашня) не происходило, и отклик этой группы не значим в обоих вариантах опыта (рис. 11).

Слой 1

Рис. 11. Величина отклика биомасс Ы=(Бп+1/Б„о) бактерий и грибов на внесение хитина в слое 0-10 см горизонта А чернозема типичного (пашня) в аэробных (а) и анаэробных (ан) условиях.

Факторный анализ

Для обработки большого массива данных по численности различных групп микроорганизмов (прокариот и эукариот) в обоих вариантах опыта в ходе сукцессии был применен четырехфакторный дисперсионный анализ. В качестве факторов рассматривали вариант опыта (аэробные и анаэробные условия); этап сукцессии (0, 3, 7, 15, 30-е сутки),

слой чернозема (А, А', А" и В) и субстрат (хитин). Проведенный анализ подтвердил, что длина грибного мицелия, численность спор грибов и бактерий в большей степени зависели от слоя чернозема и варианта опыта. Длина мицелия актиномицетов в большей степени зависела от варианта опыта, что было подтверждено в ходе эксперимента, т.к. актиномицеты не развивались в анаэробных условиях во всех слоях и горизонтах чернозема типичного (целина) при внесении хитина. Этап сукцессии и субстрат не были определяющими факторами ни для одной из групп микроорганизмов.

Оценка жизнеспособности почвенных бактерий в черноземе типичном (.целина и пашня) с помощью красителя LIVE/DEAD CL70I2) при температуре инкубации 28 "С

При изучении динамики численности бактерий в ходе микробной сукцессии в черноземе типичном (целина, пашня) необходимо было проверить, что клетки бактерий были жизнеспособны. Был поставлен эксперимент с помощью окрашивания клеток бактерий и спор актиномицетов двойным красителем LIVE/DEAD (L7012) в исследуемых образцов почвы. В ходе опыта проводили два контрольных эксперимента. В начале клетки бактерий чернозема типичного инкубировали 48 часов при 37°С и после этого окрашивали их двойным красителем LIVE/DEAD (L7012) по специальной методике, рекомендованной производителем, затем готовили препараты. При просмотре препаратов в люминесцентный микроскоп все клетки были зеленые — «живые». Во втором эксперименте препараты клеток бактерий снова инкубировали 48 часов при 37°С. Потом готовили суспензию с клетками бактерий и прогревали ее при 95°С в течение 10 минут, после этого при просмотре новых препаратов после прогревания в люминесцентный микроскоп почти все клетки бактерий были окрашены красным цветом, что означало, что эти клетки были «мертвые» (Pawlowski et al., 2011). При этом клетки бактерий и спор актиномицетов невозможно было с абсолютной уверенностью отличить от почвенных частиц. В ходе основного эксперимента по оценке жизнеспособности клеток бактерий в черноземе типичном (целина и пашня) оценивали общую численность бактерий в почве окрашенных акридином оранжевым и долю клеток с поврежденной и неповрежденной клеточной мембраной окрашенных LIVE/DEAD (L7012). Использование красителя LIVE/DEAD (L7012) для изучения физиологического состояния клеток бактерий в черноземе типичном (целина, пашня) позволило установить, что доля клеток с неповрежденной наружной мембраной составляла около 90% как в контроле, так и в варианте с внесением хитина в обоих вариантах опыта (рис. 12).

Рис 12. Ироиент численности жизнеспособных клеток бактерий, окрашенных красителем иУЕ/ОЕАО (1.7012) в верхнем слое горизонта А чернозема типичного при инициации сукцессии увлажнением (1) н увлажнением с внесением хитина (IX) в аэробных (А) и анаэробных (Б) условиях.

Специфика ранмиин бактерий и чериокме типичном (пашня) при внесении хитина к аэробных и анаэробных условиях с помощью метола «каскадной» фильтрации при температуре инкубации 28 *С

В ходе микробной сукцессии при 18°С и 28°С градусах, бактерии а отличие от грибов рапвивались примерно одинаково в двух типах землепользования (целина и пашня) Поэтому следующим этапом в данном исследовании стало изучение особенностей распределения клеток бактерий по их размерам в черноземе типичном (пашня). В литературе было показано, что малый размер клеток бактерий в почве, определяют естественные условия, которые лимитируют их разлитие питательными веществами и стрессовыми ситуациями (Вайнштейн, Кудряшом, 2000, Лысяк и др. 2010). При этом о размерах клеток бактерий в аэробных и анаэробных условиях, а последние можно с большой уверенностью отнести к стрессовым факторам, ничего не известно Методом «каскадной.» фильтрации была предпринята попытка оценить размеры клеток бактерий и их численность при равных уровнях аэрации

Динамика численности бактерий по их размерам во все* слоях горизонта А и горизонте В чернозема типичного (пашня)

В верхнем слое горизонта А и гор«зо1пе В чериоэсма типичного (пашня) в аэробных условиях (рис. 13-1) была велика численность бактерий с размерами >0 38 н >0 23 мкм на 7-14 сутки. В анаэробных условиях (рис 13-11) клика численность этих групп бактерий на 7 сутки опыта При этом также была велика численность бактерий с размерами >0.17 мкм

I И

Сутки

Рис. 13 Динамика численности бактерий на фильтрах в черноземе типичном (пашня) при внесении хитина I аэробных (I) и анаэробных (II) условиях в верхнем слое горизонта А (0-10 см) и горизонте В

Динамика обшей численности всех групп бактерий по нх размерам в хате микробной сукцессии в аэробных и анаэробных условиях

В верхнем слое горизонта А в аэробных условиях (рис. 14-1-А) общая численность бактерий составила на 7-14 сутки около 1 млрд. кл /г почвы, а в анаэробных условиях (14-11-А) их численность была клика на 7 сутки, которая достигала почти 2 млрд кл /г почвы В аэробных условиях доминировали бактерии с размерами >0.23 и >0.38 мкм В анаэробных условиях к ним присоединялись бактерии с размерами >0.17 мкм (рис. 14-П-Б). В горизонте В общая численность бактерий на 7 сутки опыта так же была велика в аэробных условиях, и составляла немного больше 1 млрд кл./г почвы, а в анаэробных условиях нх численность достигала почти 2 млрд. клУг почвы, среди которых также доминировали бактерии с размерами >0.38 и >0 23 мкм.

I

II

».as «1.43 MLM XU3 »0.17 al.« >0.«1 M.M «в.» Ю.17

Рис.14 Общая численность бактерий на фильтрах в слое 0-Ю см горизонта А чернозема типичного (пашня) при »нссснии хитина (А) и распределение по размерам пор доминирующих групп бактерий на 7-ые и 14-ые сутки опита (Б) в аэробных (I) и анаэробных условиях (II).

Распределение бактерий по их размеру на всех стадиях микробной сукцессии

В аэробных и анаэробных условиях в верхнем слое горизонта А распределение бактерий с размерами >043 и >0.17 мкм в ходе микробной сукцессии составило 5-20% для бактерий с размерами >043 мкм и 1-20% для бактерий с размерами >0.17 мкм Распределение бактерий с размерами >0.23 мкм отличалось только в анаэробных условиях на тридцатые сутки опыта, где их численность составляла примерно 70%.

В отличие от верхнего слоя горизонта А в горизонте В (рис. 15) численность бактерий с размерами >043 мкм (5-38%) и >0.17 мкм (3-12%; возросла в аэробных и анаэробных условиях Численность бактерий с размерами >0.23 мкм увеличилась с четырнадцатых по тридцатые сутки опыта в аэробных условиях (около 50%), а в анаэробных условиях - с третьих суток и до конца опыта (с 30 до 60%). Следовательно. * анаэробных условиях к концу опыта преобладали бактерии мелких фракций Полученные данные подтверждают литгрятурнмг нгтпчннк'н *тп а плчяг при мебпягплрияпшх факторах бактерии приобретают мелкие размеры, меньше чем на микробиолошческих питательных средах (Новогрудскнй, 1935. Краснльников. 1954).

Рис I $ Распределение бактерий по крупным размеряла пор (>0.43 и >0.38) и мелким (>0.23 н >0.17 мкм) в черноземе типичном пашня) в аэробных (А) и анаэробных условиях (Б) в слое 140-160 см горизонта В

Изучение морфологии и структуры клеток бактерий in thu

Изучение морфологии бактерий, полученных методом «каскадной» фнлыраиии из почвенной суспензии чернозема тшнчного (пашня) проводили в сканирующем электронном микроскопе (рис. 16). Било покыано. что клетки мелких бактерий округлой формы достигали размеров 0 18 и 0.22 мкм и обнаружены клетки больших размеров 0.35 и 0 64 мкм Для изучения морфологии клеток в просвечивающем электронном микроскопе готовили препараты целых клеток бактерий (рис. 17) Выявленные клетки имели покровы сходные с внешними капсулярнмми слоями, хтракторными для почвенных бактерий

Процент биомассы доминирующих групп бактерий <>0.43 и >0.J8 мкм)

В верхнем слое почвы биомасса бактерий с размерами >0.43 мкм (с нулевых по четырнадцатые сутки) была значительна (10-15%) в обоих вариантах опыта При этом биомасса бактерий с размерами > 0 38 мкм была примерно одинакова как в аэробных, так и в анаэробных условиях (20-30%). В отличие от верхнего слоя горизонта А. в горизонте В процент биомассы бактерий с размерами > 0 43 мкм был максимален с третьих по четырнадцатые сутки, составляя грн этом 10-30% в аэробных условиях, в анаэробных условиях он составлял 3-10% (рнс.18). Процент биомассы бактерий с размерами 20.38 мкм был значим в аэробных условиях с седьмых по тридцатые сутки опыта (20-40%), а в анаэробных условиях — только на седьмые сутки (45%).

Таким образом, на протяжении всего эксперимента в анаэробных условиях происходил рост биомассы бактерий за счет увеличения численности мелких форм бактерий

21

Рис. 16. Клетки из фильтрате» чернозема типичного (пашня), выявляемые методом сканирующей электронной микроскопии.

ом

ч^/

0.23/ 0.7 МКМ <40 ООО 0.23 /0.7 МКМ X40 000 0.23/0.7 МКМ х20 000

0.23/051МКМХ 28 (Й0 0.23/05 МКМ х 10 000 0.23/05 МКМ х 48 000 |

0.23/05МКМX 40 ООС 0.23/1.0 МКМХ40000 0.23/0*МКМ х40 000

Рис 17. Препараты целых клеток бактерий из фильтратов чернозема типичного (пашня).

л

Б

50 40 М 20 10 о

Рис. 18. Доля (%) биомассы доминирующих групп бактерий с диаметрами >043 и >0.38 мкм в слое 140-160 см горизонта В чернозема типичного (пашня) в аэробных (А) н анаэробных условиях (Б).

Общим биомасса бактерий

Как показывают полученные данные в аэробных условиях в верхнем слое горизонта А биомасса бахтерий была максимальной с третьих по тридцатые сутки, составляя при этом 812 мкг/г почвы В горизонте В она была вдвое больше на третьи сутки опыта. В анаэробных условиях в горизонте А уже на седьмые сутки биомасса бактерий составляла 12 мкг/г почвы, а в горизонте В она была максимальной на третьи сутки опыта, составив при этом около 16 мкг/г (рис. 19),

А Б

----- - ~Г-----г ~ 14 12 10 * /¡2ч -Л-А -О-ах

/ ^^

/ * ;

\ ^^

---------. 0 ж

0 э 7 14 м 017 14 м

Сутки

Рис 19 Общая биомасса бактерий в верхнем слое (0-10 см) горизонта А (А) и нижнем слое (140-160 см) горизонта В (Б) пахотного чернозема при аэробных и анаэробных условиях

Объем и диаметр бактериальных клеток

В верхнем слое горизонта А и горизонте В были рассчитаны объем и диаметр клеток бактерий в холе сукцессии в аэробных и анаэробных условиях (рис. 20). Диаметр клеток бактерий в начале опыта был выше в горизонте В, составив 0 84 мкм, а в горизонте А он был 0 34 мкм . В ходе опыта в горизонте В происходит снижение этого показателя, это можно объяснить преобладанием мелких фракций бактерий (рис 20-11).

I

;

0 з Т и X

а* азм 0.3 озгг о.*

ООм ам от еле азн

ООП

шы>

• 3 г и за

в V* о.агг аог» ооп ааг» воя

О V» ат Л013 аам а«» 0.017

0 3 | 1 и I 30

яош от от ам ал > в»

оо*> ей »»¡») " О.!»! 034

0 0 * 7 и x

• vi ал вам 0013 ООН вой

а» ею 0014 ¡0.017 ООН

Рис 20 Диаметр и объем бактерий в слое 0-10 см гориэоита А (I) и горизонте В (II) чернозема типичного (пашня) в аэробных и анаэробных условиях

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, впервые было показано развитие мицелия 1рибов в анаэробных условиях при (■ 18°С в черноземе типичном, тогда как при I - 28°С бактерии развивались, но рост грибного мине лня отсутствовал При I- 18°С в аэробных условиях наибольший отклик на внесение хитина был у минелиальных микроорганизмов (грибы и актиномниеты), а в анаэробных условиях у бактерий Показано, что в ходе микробной сукцессии практически все клетки бактерий были жизнеспособны Изучение влияния аэробных и анаэробных условий гш размер бактерий покапано, что в анаэробных условиях клетки мельчают, резко возрастает численность их мелких форм

выводы

1. Показано, что в условиях модельного анаэробиоза при температуре 18°С происходит развитие мицелия грибов только в верхнем слое горизонта А чернозема типичного (целина).

2. При моделировании сукцессии при температуре 28°С бактерии развивались одинаково в аэробных и анаэробных условиях, как в целине, так и в пашне, при этом развитие грибов наблюдали только в аэробных условиях.

3. Изучение жизнеспособности бактериальных клеток в ходе микробной сукцессии показало, что практически все клетки бактерий жизнеспособны. Данные показали, что расхождение по окрашиванию клеток красителем акридином оранжевым и LIVE/DEAD составило 10 %, что укладывается в ошибку люминесцентно-микроскопического метода.

4. Изучено распределение бактерий на фильтрах в черноземе типичном (пашня), в котором общая численность бактерий в аэробных условиях в обоих горизонтах составляла 1 млрд кл./г почвы, а в анаэробных условиях она составляла около 2-х млрд кл./г почвы. Показано, что в анаэробных условиях происходит рост численности бактерий за счет увеличения численности их мелких форм: в начале опыта доминируют бактерии с размерами >0.23 и >0.38 мкм, и в дальнейшем на 7-ые сутки опыта появляются бактерии с размерами >0.17 мкм.

5. Рассчитаны объем и диаметр бактерий в ходе микробной сукцессии, показано что в горизонте В диаметр клеток к концу опыта значимо снижался в 2.5 раза, что можно объяснить преобладанием мелких фракций бактерий. В горизонте А снижение диаметра клеток бактерий не отмечено.

6. С помощью метода «каскадной» фильтрации показано, что в аэробных и анаэробных условиях в верхнем слое горизонта А пахотного чернозема биомасса бактерий составила 8-12 мкг/г почвы, а в горизонте В она составила 16 мкг/г почвы.

7. Изучено влияние различных факторов на численность основных групп микроорганизмов в черноземе типичном. Показано, что наиболее значимыми факторами для всех групп микроорганизмов являются слой чернозема и вариант опыта (аэробные и анаэробные условия).

III. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горбачева М.А. Динамика численности разных групп микроорганизмов в аэробных и анаэробных условиях в черноземе. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». М., 2008. С. 22-24.

2. Горбачева М.А. Микробная сукцессия в черноземе (аэробные и анаэробные условия) Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». М., 2009. С. 29-30

3. Полянская Л.М., Горбачева МЛ., Милановский Е.Ю., Звягинцев Д.Г. «Развитие микроорганизмов в аэробных и анаэробных условиях в черноземе» // Почвоведение. 2010. №3. С. 356-360.

4. М.А. Горбачева Специфика развития микроорганизмов в аэробных и анаэробных условиях в типичном черноземе (при внесении целлюлозы) Материалы Всероссийской научной конференции XIII Докучаевские молодежные чтения, Санкт-Петербург, 2010 г., с. 1.

5. Горбачева М.А., Полянская Л.М., «Распределение бактерий по их размерам в аэробных и анаэробных условиях в черноземе в ходе микробной сукцессии» Вестник Уральской Медицинской Академической науки №4/1 (38), 2011 г., с. 78-79.

6. Полянская Л.М., Горбачева М.А., Звягинцев Д.Г. «Размеры бактерий в черноземе в ходе микробной сукцессии при инкубировании почвы в аэробных и анаэробных условиях» Почвоведение. 2012. №11. С. 1181-1187.

7. Горбачева М.А., Полянская Л.М. Специфика развития микроорганизмов в аэробных и анаэробных условиях в типичном черноземе (при внесении хитина и целлюлозы) / Мат. докладов VI съезда Общества почвоведов им. В.В. Докучаева. Всероссийская с международным участием научная конференция «Почвы России современное состояние, перспективы изучения и использования, Петрозаводск, Карельский научный центр РАН, 2012. Кн. 2.510. С. 327-328.

8. Горбачева М.А. Размеры бактерий в черноземе в ходе микробной сукцессии (аэробные и анаэробные условия) Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012». М., 2012. С. 10-12.

9. Полянская Л.М., Горбачева М.А. Размеры бактерий в аэробных и анаэробных условиях в черноземе. Международный сборник научных трудов, посвященный году Германии в России, 2012.,С.180-186.

10. М.А. Gorbacheva, L.M. Polyanskaya The determination of the real nano-scale sizes of bacteria in chernozem during microbial succession by means of hatching of a soil in aerobic and anaerobic conditions. EGU-2012-797. Vol. 14.

11. M. Gorbacheva, L.M. Polyanskaya The size of bacteria in chernozem during

microbial succession by hating of soil in aerobic and anaerobic conditions. 5 th - FEMS. 2013.

26

Подписано в печать 16 октября 2013 г. Объем 1,0 усл. п. л. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «Реглет». Заказ № 141 119526 г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 www. reglet. Ru, тел. +7 495 363 78 90

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горбачева, Мария Александровна, Москва

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Факультет почвоведения Кафедра биологии почв

04201364060 ^а пРавахрукописи

Горбачева Мария Александровна

РАЗВИТИЕ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ В ЧЕРНОЗЕМЕ ПРИ РАЗНЫХ УРОВНЯХ АЭРАЦИИ

Специальность 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Л.М. Полянская

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1 СПЕЦИФИКА РАЗВИТИЯ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ В ПОЧВЕ 10

ГЛАВА 2 СПЕЦИФИКА РАЗЛОЖЕНИЯ ХИТИНА МИКРООРГАНИЗМАМИ В ПОЧВЕ ПРИ

РАЗНЫХ УРОВНЯХ АЭРАЦИИ 26

2 1 Хитин — один из наиболее распространенных полимеров в природе 26

2 2 Механизм деградации хитина в природе 26

2 3 Микроорганизмы, разлагающие хитин 28

ГЛАВА 3 РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ МЕЛКИХ ФОРМ БАКТЕРИЙ В ПРИРОДЕ 31

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 41

4 1 Почва 41

4 2 Методика инкубации почвенных образцов 42

4 3 Методика проверки анаэробных условий 43 4 4 Методика определения численности и биомассы микроорганизмов методом

люминесцентной микроскопии 45

4 5 Методика учета численности бактерий с помощью метода «каскадной» фильтрации 48

4 6 Методика оценки жизнеспособности клеток бактерий in situ 50

4 7 Изучение морфологии и структуры клеток бактерий in situ 52

ГЛАВА 5 СПЕЦИФИКА РАЗВИТИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В ЧЕРНОЗЕМЕ ТИПИЧНОМ (ЦЕЛИНА) ПРИ ВНЕСЕНИИ ХИТИНА В АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ ПРИ

ТЕМПЕРАТУРЕ ИНКУБАЦИИ 18 °С 53

5 1 Бактерии 53 5 2 Актиномицеты 57 5 3 Грибы 59 5 4 Споры грибов 63 5 5 Биомасса мицелия и спор грибов 64

5 6 Доля прокариот 70

ГЛАВА б СПЕЦИФИКА РАЗВИТИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В ЧЕРНОЗЕМЕ ТИПИЧНОМ (ЦЕЛИНА И ПАШНЯ) ПРИ ВНЕСЕНИИ ХИТИНА В АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ

ПРИ ТЕМПЕРА ТУРЕ ИНКУБАЦИИ 28"С 75

6 1 Чернозем типичный (целина) 75

611 Бактерии 75

612 Грибы 11

6 2 Чернозем типичный (пашня) 78

6 2 1 Бактерии 78

62 2 Грибы 78

6 3 Отклик разных групп микроорганизмов в черноземе типичном (целина) при температуре

инкубации 18°С 78 6 4 Отклик разных групп микроорганизмов в черноземе типичном (целина) при температуре

инкубации 28°С 80 6 5 Отклик разных групп микроорганизмов в черноземе типичном (пашня) при температуре

инкубации 28°С 83

6 6 Факторный анализ 83 6 7 Оценка жизнеспособности почвенных бактерий в типичном черноземе (целина и пашня) с

помощью красителя LIVE/DEAD (L7012) при температуре инкубации 28 °С 87

ГЛАВА 7. СПЕЦИФИКА РАЗВИТИЯ БАКТЕРИЙ В ЧЕРНОЗЕМЕ ТИПИЧНОМ (ПАШНЯ) ПРИ ВНЕСЕНИИ ХИТИНА В АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА

«КАСКАДНОЙ» ФИЛЬТРАЦИИ ПРИ ТЕМПЕРА ТУРЕ ИНКУБАЦИИ 28°С..................................91

7.1. Динамика численности бактерий по их размерам во всех слоях горизонта Айв горизонте В чернозема типичного (пашня)............................................................................................................91

7.2. Динамика общей численности всех групп бактерий по их размерам в ходе микробной сукцессии в аэробных и анаэробных условиях................................................................................93

7.3. Распределение бактерий по их размеру на всех стадиях микробной сукцессии...................96

7.4. Изучение морфологии и структуры клеток бактерий in situ..................................................100

7.5. Доля (%) биомассы доминирующих групп бактерий (>0,43 и >0,38 мкм)...........................101

7.6. Общая биомасса бактерий.........................................................................................................103

7.7. Объем и диаметр бактериальных клеток.................................................................................104

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................................................107

ВЫВОДЫ.................................................................................................................................................115

ЛИТЕРАТУРА.........................................................................................................................................117

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Почва с микробиологической позиции представляет собой гетерогенную среду и не может рассматриваться как единая однородная среда обитания (Звягинцев, 1987). Благодаря своей структурированности и микрозональности, она должна быть изучена как набор различных макро-, мезо- и микросред, в каждой из которых создаются различные и часто прямо противоположные условия для развития отдельных групп микроорганизмов. Микро- и мезозоны разделены в пространстве и во времени. Во всех почвах и в разных почвенных горизонтах микрозональность основывается на локальном поступлении органических остатков и корневых выделений, а также на микрозональности распределения физико-химических условий и минералогических факторов. Во всех почвах и в разных почвенных горизонтах имеются аэробные и анаэробные макро-, мезо- и микрозоны, резко различающиеся по величине окислительно-восстановительного потенциала (Eh). Анаэробные условия могут сохраняться на протяжении больших временных периодов (Зайдельман, 1985; Орлов, 1987).

Однако до настоящего времени изучены в основном аэробные микроорганизмы и их активность в аэробных условиях, причем, главным образом, эта работа проводилась с использованием метода посева и изучались чистые культуры микроорганизмов. В то же время неоднократно отмечалось, что изучать микроорганизмы необходимо непосредственно в

почве (Виноградский, 1952; Звягинцев, 1987, 2005). В настоящее время такое изучение сукцессий микроорганизмов проводится, главным образом, на микрокосмах — почвенных образцах, поставленных в строго контролируемые условия температуры, влажности, аэрации и питания (Ро1уапзкауа, Zvyagintsev, 1995). В ходе микробной сукцессии изменения проходят вполне закономерно, в определенной последовательности, так что их можно исследовать. Начало сукцессии может быть наиболее просто задано увлажнением почвенного образца или внесением в почву различных органических веществ (сахаров, хитина, целлюлозы, лигнина).

В почвоведении и почвенной микробиологии анализ микробных сообществ способствует углублению понимания экологических функций почвы, связанных с ее биотой, детализирует такие аспекты экологии почв как структура почвенных микробных комплексов, их происхождение, трофические связи, баланс элементов питания. Микроорганизмы могут быть чуткими индикаторами различного рода антропогенных воздействий. Таким образом, для понимания микробиологических процессов, происходящих в почве и решения проблем охраны окружающей среды необходимо изучение микробных сукцессий в условиях, близких к нативным.

Цель исследования — изучить развитие микроорганизмов в почве в ходе микробной сукцессии, инициированной увлажнением, и увлажнением с внесением хитина, в микрокосмах с помощью метода люминесцентной микроскопии и «каскадной» фильтрации в аэробных и анаэробных условиях.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику численности бактерий и длины грибного мицелия в аэробных и анаэробных условиях в черноземе типичном (целина, пашня) в ходе микробной сукцессии при температуре инкубации 18°С и 28°С с помощью метода люминесцентной микроскопии.

2. Сравнить отклик биомасс разных групп почвенных микроорганизмов на внесение субстрата (хитин) в аэробных и анаэробных условиях при температуре инкубации 18°С и 28°С.

3. Определить численность бактерий и распределение их доминирующих групп по размеру в аэробных и анаэробных условиях в черноземе типичном (пашня) с помощью метода «каскадной» фильтрации.

4. Определить объем и биомассу бактерий в аэробных и анаэробных условиях в верхнем слое горизонта Айв горизонте В чернозема типичного пахотного.

5. Установить связь между численностью разных групп микроорганизмов и стадиями сукцессии, горизонтами почвы, внесением субстрата и уровнем аэрации.

Научная новизна. Впервые было показано, что при температуре инкубации 18°С в анаэробных условиях в почве происходило развитие мицелия грибов, тогда как при температуре инкубации 28°С в анаэробных условиях бактерии развивались, но рост грибного мицелия отсутствовал. Было установлено, что уровень аэрации и слой почвы оказали решающее

воздействие на исследуемые группы микроорганизмов. В ходе микробной сукцессии практически все клетки бактерий были жизнеспособны. Изучение влияния аэробных и анаэробных условий на размер бактерий показало, что в анаэробных условиях клетки бактерий мельчали, резко возрастала численность их мелких форм, что приводило к увеличению биомассы последних.

Практическая значимость. Изучено влияние разных температур и уровней аэрации на рост и развитие почвенных бактерий, актиномицетов и грибов0, что дает возможность управлять их численностью и выделять популяции, которые будут развиваться в этих условиях. Преобладание мелких форм бактерий в анаэробных условиях показало, что в почве отсутствуют благоприятные условия для их развития. Данное исследование помогает расширить представления о предотвращении последствий неблагоприятных экологических ситуаций в почвах, связанных с антропогенным воздействием на них и тем самым поможет целенаправленно изменять экологическое состояние почв с помощью оценки функционирования микроорганизмов в желаемом направлении. Полученные данные о роли различных групп микроорганизмов в разложении хитина при разных уровнях аэрации могут быть использованы для характеристики разных почв, их горизонтов, а также для определения жизнеспособности прокариотных микроорганизмов в них. На основании этих показателей можно более точно установить сходство и различие не только разных почв, но и их горизонтов.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008г), «Ломоносов - 2009» (Москва, 2009г), Всероссийская научная конференция XIII Докучаевские молодежные чтения, (Санкт-Петербург, 20 Юг), «Ломоносов - 2012» (Москва, 2012г); I Всероссийская с международным участием школа-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011 г), VI съезд Общества почвоведов имени В.В. Докучаева Всероссийская с международным участием научная конференция «Почвы России современное состояние, перспективы изучения и использования (Петрозаводск, 2012г), Международная ассамблея EGU -

2012 (Вена, Австрия, 2012г), Европейский конгресс микробиологов FEMS -

2013 (Лейпциг, Германия, 2013г).

Публикации. По теме исследований опубликованы 4 работы: 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК и 1 в сборнике, а также тезисы, изданные в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, объектов и методов, заключения, выводов, списка литературы (195 источников, из них 108 на иностранных языках). Работа иллюстрирована 34 рисунками, содержит 2 таблицы.

Личный вклад автора в работу. Автором проведены аналитический обзор литературы, лабораторные эксперименты, а также микробиологические

анализы исследуемой почвы, интерпретация полученных результатов и статистическая обработка данных.

Автор благодарит д.б.н., профессора Д.Г. Звягинцева, сотрудников кафедры биологии почв: к.б.н. Т.А. Грачеву, к.б.н. Е.В. Лапыгину за помощь в проведении исследования, а таже автор выражает глубокую признательность д.б.н. Л.В. Васильевой (ИНМИ РАН) за помощь и консультации при работе по просвечивающей микроскопии и инженеру И.В. Матыченкову (Межкафедральная лаборатория электронной микроскопии Биологического ф-та МГУ) за помощь при работе по сканирующей микроскопии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СПЕЦИФИКА РАЗВИТИЯ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ В ПОЧВЕ

Почва содержит огромный качественный и количественный пул микроорганизмов, в котором находятся самые разнообразные и наиболее приспособленные для данных условий виды организмов (Добровольский, Никитин, 1990; Тейт, 1991). Изучение особенностей жизнедеятельности биоты в почве необходимо для развития экологического знания о ней (Hornberg et al., 1999). Для этого проводятся исследования о разнообразии видового состава микробных комплексов, их биохимической активности и описание содержания микробной биомассы микроорганизмов в различных почвах, которые зависят от многих факторов: агрохимических показателей и хозяйственного использования территорий (Sysova, Panikov, 1993). Микробная биомасса — важный живой компонент почвы (Fry, 1990; Nannipieri, 1990). Ее запасы и структура — основная характеристика в экологических исследованиях (Herbert, 1990; Gray, 1990). Почва обладает высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам благодаря наличию в ней « пула» микробной биомассы (Полянская, 1996). Необходимо знать запасы живых микроорганизмов в почвах разных типов и в их различных горизонтах. Благодаря прямым люминесцентно-микроскопическим методам в изучении запасов биомассы в почвах были достигнуты хорошие результаты (Князева и др., 1985). Микробную биомассу можно определить и непрямыми (физиологический, биохимический) методами (Паников и др., 1991; Ананьева

и др., 2008). Было отмечено, что полученные результаты микробной биомассы прямыми и непрямыми методами положительно коррелировали друг с другом (г=0,74-0,90). Показано, что микробная биомасса была выявлена в большем количестве в тундровой почве (8134 мкг С/г почвы и в меньшем в темно-каштановой почве (163 мкг С/г). При этом в пахотных аналогах микробная биомасса была ниже. В основном большую долю биоты составляли грибы. В тундровой, черноземной (целина, пашня), дерново-подзолистой (хвойный лес, луг, пашня) и серой лесной (лиственничный лес) почвах было проведено разделение вклада грибов и бактерий в субстрат-индуцированное дыхание (СИД) с использованием антибиотиков. Для почв с высоким содержанием органического вещества (тундровая, чернозем — 12 и 8% соответственно) оптимизирована процедура селективного ингибирования СИД, которая заключалась в применении высоких концентраций стрептомицина (50-120 мг/г почвы) и циклогексимида (50-80 мг/г почвы), и уменьшении навески анализируемого почвенного образца. В исследованных почвах был обнаружен доминантный вклад грибов (63-82%) в общее СИД. В почве естественных экосистем (0-5 см, без подстилки) величина отношения грибы/бактерии составила 4:3; 2:1; 1:5 и 1:5 для тундровой почвы, целинного чернозема, хвойного (дерново-подзолистая) и лиственничного (серая лесная) леса соответственно. В нижних слоях дерново-подзолистой (5-10 см) и серой лесной (48-58 см) почвы леса было обнаружено уменьшение содержания грибной и увеличение бактериальной компоненты в общем СИД (Beare et al., 1990; Hassink, 1993; Ананьева и др., 2006). Биомасса прокариот в отличии от

грибов составляет в разных почвах от 1% (каштановая почва) до 12% (серая лесная почва) (Полянская и др., 1995а, 19956).

Перспективным представляется сранительное изучение микробных комплексов в почвах антропогенных ландшафтов с таковыми в сохранных биотопах (Звягинцев, 2001; Полянская и др., 2001). Антропогенные воздействия влияют на видовой и количественный состав почвенных микроорганизмов (Ро1уашкауа, Zvyagintsev, 1995). Подобные сопоставления помогают оценить величину антропогенной нагрузки и последствий после их вмешательства. Так были получены данные о запасе суммарной биомассы микробного сообщества и ее метаболического состояния в черноземе типичном Молдавии. Было установлено, что в пахотном черноземе содержалось 419-1033 мкг С/г почвы, а в лесополосе — 1002-1432 мкг С/г почвы. Содержание микробной биомассы в лесополосе было в 2,1-2,9 раза больше, чем в пашне. Функциональная активность микробных сообществ чернозема была разнообразна, доминировали г-стратеги. Содержание активной части биоты в лесополосе составило 29,9%, а в пашне 9,8-21% (Фрунзе, 2013). Была проведена оценка содержания углерода микробной биомассы и кинетических характеристик дыхательного отклика микроорганизмов на внесение субстрата для черноземов под разными угодьями: пашней 10, 46 и 76 лет использования, залежью косимой, залежью некосимой и лесополосой. Микробная биомасса и доля микробного углерода в составе гумуса (Смик/Сорг) уменьшались в ряду: лесополоса-залежь косимая-пашня (10 лет) — пашня (46 и 76 лет). Пахотные почвы характеризовались

меньшим метаболическим разнообразием микробного сообщества и наибольшей долей микроорганизмов, способных к непосредственному росту на вносимой в почву глюкозе (Благодатский и др., 1987).

Исследовали луговато-черноземную почву в системе залежь-лесополоса-пашня. Было установлено, что длительное сельскохозяйственное использование черноземов приводило к уменьшению содержания общего азота и изменению состава микробного сообщества. В комплексе почвенных грибов возрастала доля фитопатогенов: Fusarium, Aspergillus ustus, Penicillium daleae, Penicillium rubrum. Ухудшалось фитосанитарное состояние почвы, что было подтверждено с помощью метода биотеста (Стахурлова и др., 2007). Черноземы характеризовались высоким плодородием, при их длительной распашке доля азота резко уменьшалась.

Шир�