Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение детерминант устойчивости к ртути у бактерий, обитающих в ртутных месторождениях

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение детерминант устойчивости к ртути у бактерий, обитающих в ртутных месторождениях"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

ЛОМОВСКАЯ ОЛЬГА ЛЕОНИДОВНА

УДК 575:579.252.5

ИЗУЧЕНИЕ ДЕТЕРМИНАНТ УСТОЙЧИВОСТИ К РТУТИ У БАКТЕРИЙ, ОБИТАЩИХ В РТУТНЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЯХ.

( специальность 03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1987

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ генетики Института молекулярной генетики АН СССР.

Научные руководители: член-корреспондент АН СССР Р.Б.Хесин,

доктор биологических наук В.Г.Никифоров.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Л.С.Чернин

кандидат биологических наук И.А.Хмель

Ведущее учреждение: институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи.

"с^ 1988 г. в

Защита состоится "с^Сйо 1988 г.

часов на заседании Специализированного совета Д.025.01.01.при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: П3545, Москва, Дорожный проезд, I. ■■

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИгенетика ' ■ /£ //

Автореферат разослан " ' п/1987 г.

Ди^е/За*

Ученый секретарь специализированного совета. » кандидат биологических наук

. ....... .

I

(»я;:«^

гд-л |

".1:1Актуальность темы. Открытие подвианых генетических элементов породило новые концепции эволюция, придающие существенное, если не решающее значение, обмену генами между далекими видами организмов. Несмотря на наличие отдельных эффектных примеров, оценить реальную роль горизонтального переноса генов в эволюции пока не удается. Бактерии обладают колоссальными потенциальными возможностями горизонтального переноса, благодаря наличия плазмид широкого круга хозяев и транспозонсв. Однако горизонтальный перенос геноЕ вне лабораторных условий более или менее бесспорно продемонстрирован лишь для детерминант множественной лекарственной устойчивости, которые получили чрезвычайно широкое распространение в связи с массовым применением антибиотиков в медицине и ветеринарии. Остается неясным вопрос, какую роль подобный перенос генов играет э естественных условиях, в частности в почве,' из которой, как предполагают, и пришли детерминанты лекарственной устойчивости к патогенным бактериям.

Цель работы и задачи исследования. Целью данной работа был поиск примеров горизонтального переноса генов в природных популяциях бактерий. В качестве модели использовали детерминанты устойчивости к ртути. Это было обусловлено следующими причинами:

1. Устойчивость к соединениям ртути широко распространена среди бактерий разных систематических групп.

2. Хорошо изучен молекулярный механизм устойчивости к соединениям ртути.

3. Гены устойчивости к ртути, сбраующие 1ШГ-оперон, часто сцеплены с генами устойчивости к антибиотикам в составе одних и тех же плазмид и транспозонов.

4. Несмотря на наличие серьезного антропогенного загрязнения ртутью, существуют места, в которых повышенные концентрации ртути возникли естественным путем. Такими местами являются районы ртутных месторождений.

В соответствии с целью работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

I. Поиск потенциальных путей распространения детерминант устойчивости к Нд&л_в природных популяциях почвенных бактерий. В связи с этим - характеристика плазмидного состава резистентных бактерий ртутных месторождеий, поиск кон'югативных плазмид и

транспозонов; "несущих детерминанты резистентности.

2. Клонировние mer-оперонов из разных почвенных бактерий. Сравнение ртутных оперонов на уровне рестрикционных карт и частичных нуклеотидных последовательностей.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые охарактеризованы детерминанты устойчивости к ртути грам-от-рицательных бактерий, обитающих в районах ртутных месторождений. В бактериях рода Acinetobacter обнаружена кон югационная система способная обеспечивать перенос генов Hg-г в широкий круг грам-отрицательных бактерий. У бактерий родов Pseudomonas и Xanto-monas обнаружено 2 новых ртутных транспозона. Получены данные о горизонтальном переносе одного из этих транспозонов.

Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов ¡пег-опероноз из крупных и мелких плазмид Acinetobacter показало, что в этих плаэмидах uer-опероны входят в состав транспозонов, родственных птутным транспоэонам из бактерий клинических изолятов. Анализ нуклеотидных последовательностей позволяет предполагать, что mer-опероны мелких плазмид являются рекомбинангами меиду тег оперонами крупных плазмид и mer-опероном Гп501.

Результаты работы свидетельствуют о широком распространении горизонтального переноса генов устойчивости к ртути в природных популяциях почвенных бактерий. Плазмиды, сконструированные в работе, могут быть использованы в качестве зондов для изучения структуры и динамики популяций бактерий. ' '

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы изложены на конференции памяти А.Н.Белозерского (Москва, 1986), Всесоюзной конференции "Синтез ферментов микроорганизмами" ( Ко-булети, 1986), юбилейной,конференции Института молекулярной генетики, семинаре ВНИИГенетика.

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 4 печатных работах.

Об'ем работы. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста. Содержит 41 рисунок и 13 таблиц. Список лите-ртуры включает 171 наименовние отечественных и зарубежных работ.

'МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Выращивание культур бактерий- проводилии, используя среды Хоттингера, Адамса и L-среду (Миллер, 1976).

Трансформацию клеток E.coii проводили по методу ( Monds:, hl8a, 1970), клеток Pseudomonas по МЕТОДУ (Bagdasarian et al, 1982), клеток Acinetobacter..„ По методу (Juni^ 1972).

Изучение несовместимом^ плазмид проводили по методу ( Barth et al, 1976).

Тест на гиперчувствительность к HgCLz проводили по методу (Foster et al, 197Э ).

Электрофоретическое разделение клеточных лизатов для выделения крупных плазмид проводили ПО методу (Eckhard et al , 1978).

Традиционные генно-инженерные методы: выделение хромосомной и плаэмидной ДНК, рестрикцию, лигирование, ник-трансляцию, электрофорез ДНК в агарозном и полиакриламидном гелях, элюцию ДНК из гелей, определение нуклеотидной последовательности.ДНК (по методу Максама и Гилберта) проводили по методическому руково детву по генной инженерии (Маниатис, 1978).

Анализ и сравнение последовательностей ДНК проводили с помощью разработанного в имг АН СССР пакета программ seqbus на машине "Искра 226".

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ -

К моменту начала работы мы располагали коллекцией устойчивых бактерий, выделенных из грунта Хайдаркзнского ртутно-сурьмя-ного месторождения, расположенного в Киргиизии. Коллекция была собрана Р.Б.Хесиным в мае 1983 года. В.Г.Никифоровым, А.И.Граге-ровым и Э.С.Каляевой были собраны еще 2 коллекции - на месторождении Большой Шаян в Закарпатье (сентябрь 1984 г.) и на месторождении Сахалинское в Краснодарском крае ( июнь 1985 г.). Наиболее полно была изучена коллекция бактерий из Хайдарканского месторождения. Определение видового состава этих бактерий показало, что большинство из них относится к тривиальной почвенной микрофлоре: различные виды псевдомонзд, ацинетобактеры, ксантомонады.

Изучение плазмид бактерий, выделенных из почв ртутных месторождений 3 большинстве известных случаев гены утойчивости к HgCL локализованы на плазмидах. В связи с этим была начата работа по характеристике плазмидного состава Hg^r бактерий.

Изучение плазмидного состава, кон гагативных свойств плазмид из бактерий Хайдарканского месторождения показало, что в большин-

стве штаммов псевдомонад, ксантомонад и ацинетобактеров гены устойчивости к HgCL^ локализованы на плазмидах. Только в нескольких штаммах псевдомонад и ксантомонад гены Hg-r были локализованы в составе хромосомы. Наиболее подробно были изучены плазмиды Acinetobacter. В 34 изученных.штаммов этих бактерий было обнаружено 2 типа Hg-r плазмид, различающихся по размеру: крупные (60 т.п.н.) и мелкие (7,5 т.п.н.). Были обнаружены штаммы, содержащие только крупные плазмиды (30 шт.) и штаммы, содержащие обе плазмиды одновременно (4 шт.). В экспериментах по внутривидовым и межвидовым скрещиваниям было показано, что крупные плазмиды являются кон'югативными, но способными только к внутривидовому переносу. Однако крупные плазмиды оказались способными мо-билизовываь мелкие плазмиды в бактерии самых разных систематических групп. Свойства кон югационной'системы Acinetobacter изучали на примере штамма Ps-I8. Крупная плазмида из штамма rs-I8 , получила назвние piCLH2, мелкая - pKLHl. Круг бактерий, в которые плазмида pKLHl может быть перенесена при кон югации, предсавлен в таблице I. Из таблицы видно, что тиазмида- pKLHl, переходя в одних представителей семейства Enterobacteria'ceae ( Erwiniai Serratia), не переходит в другие (Escherichia, Proteus)-. Однако когда в pKLHl была встроена последовательность, обеспечивающая репликацию в E.coli, полученная гибридная плазмида оказалась способной мобилизовываться в E.coli плазмидой ркьн2. Т.0- круг хозяев, в которые pKLHl может быть мобилизовна, шире, чем круг хозяев, в которых эта плазмида способна реплицироваться.

Была построена рестрикционная карта плазмиды pklhI (рис.1). Для удобства изучения плазмиды были.получены ее гибриды с широко используемыми векторами E.coli рис19 и рвв322.

- С помощью делеционного картирования в составе pKLH-I были локализованы участки, необходимые для репликации. Было показано, что для репликации абсолютно необходим участок, обозначенный как repl на рис. I. Однако одного этого участка недостаточно. Реплицируются только плазмиды, которые, помимо участка repl, несут участки гер2 или герЗ.

С помощью делеционного картирования, опытов по гибридизации и сравнения с Тп501 и тп21 в плазмиде pKLHl была локализована область nier-оперона (рис. I). Определение частичной нуклеотидной

• Таблица I. Перенос плазмиды рКЬН! из Ас1песоЬас1эг Рз-18

в клетки различных бактерий (совместно с С.З.Миндлин).

Бактерии реципиенты Частота переноса

видовая принадлежность обозначение исходного штамма

~3

Pseudomonas aeruginosa 20р 1,1.10

-5

flucrescens ЗОр 1,1.10

-4.

putida 19р 1,0.10

-3

aur'eofaciens 35 1,0.10

"4

ovalis 3,0.10

-.4

Moraxella МБР 1,0.10

-4

Flavcfcacterium arborescens 966 5,0.10

-5

Eruinia caratovora 2,0.10

-3

Serratia marcescens W203 1,3.10

-8

Escherichia coli ABI456 1,0.10

-9

Proteus mirabilis PGI04 5,0.10

последовательности рКЬН1 показало, что в тег-опероне рКЬН1 имеет ся вставка в 500 п.н. относительно шег^оперона Тп501. Размеру этой вставки примерно соответствует длина гена тегС, отсутствующего в тег_опероне Тп501 и имеющегося в шег-опероне Тп21. Не исключено, что РК1-Н1, в отличие от Тп501 и подобно Тп21, содержит ген пегс.

Рис. I. Р.естрикционная карта плазмиды рЮ-Н^ на рисунке обозначены области необходимые для репликации (геР1; геР2; геРЗ) и область ртутного оперона (Нг-Г)

ЕсоЯ!

Рис. 2. Гибридизация КОЛОНИЙ штаммов Ас1пе1сЬас1ег из разных

месторождений с фрагментом ДНК плазмиды Рк1-Н2; не содержащим последовательностей ртутного оперона. Гибридизуют-ся только штаммы Асгпе^ЬэсСег из Хайдарканского месторождения-, в котором была обнаружена плазмида Рк1-Н2. • •

• • %

• •

Поиск плазмиды pKLHl в популяциях устойчивых бактерий.

Для того чтобы определить, насколько широко плазмида pKLHl распространена в популяциях устойчивых бактерий, осуществили поиск этой плазмиды среди резистентных бактерий, выделенных из районов различных ртутных месторождений (совместно с Ж.М.Горленко). Для поиска pKLHl использовали метод гибридизации колоний. В качестве меченного зонда использовли рис19 с клонированным фрагментом pKLHl, который не содержав последовательностей ртутного оперона.

В этих экспериментах было показано, что pKLHl широко распространена среди бактерий рода Acinetofcacter. Ее удалось обнаружить в штаммах Acinstcbacter из всех исследуемых ртутных месторождений. Сходство мелких плазмид, получивших название pKLHl-no-добных, из географически удаленных ртутных месторождений было подтверждено с помощью рестрикциенного анализа. Однако он выявил некоторые различия в плазмидах. Было показано, что 4 плазмиды, обнаруженные в Хайлзрканском месторождении и единственная плазмида, обнаруженная на месторождении Б. Шаян ( получила название ркьн 102), имеют идентичное распределение сзйтое рестрикции EcoRl и Hindin. Однако анализ фрагментов ДНК, полученных после обра-сотки этих плазмид мелкощепящей ресгриктазой BspRl, показал, что эти плазмиды не являются идентичными.

Анализ фрагментов EcoRl-Hindill pKLHl-подобиых плазмид, выделенных из кавказских атаммов, показал/ что 2 из них идентичны плазмидам, описанным выше (одна из них была названа ркьн104), а 2 другие отличаются делецией в ЗСО п. н..локализованной в области, которая не содержит последовательностей mer-оперона. Фрагмент EcoRl-Hindill, содержащий делецию, обозначен звездочкой на рис. I. Одна из плазмид второго типа была назвна ркьнЮЗ.

3 целях сравнения крупных плазмид Acineobacter из разных месторождений были проведены опыты по гибридизации колоний, в которых в качестве меченного зонда использовали pucl9 с клонирован ным фрагментом плазмиды ркьн2, который не содержал последовательностей mer-оперона. В этих опытах было показано, что с зондом гибридизуются все штаммы Acinetobacter с крупными плазмидами из Хайдарканского месторождения и не гибридизуются штаммы из других месторождений (рис. 2). ..Кроме того, в генетических экс-

периментах было показано, что крупные плазмиды из разных месторождений различаются по способности к конъюгации и к мобилизации pKLfl (совместно с Ж.М.Горленко и С.З.Миндлин). Таким образом, если ркьй-подобные плазмиды распространены в штаммах AcinetobacterBcex 3 исследованных ртутных месторождений, то крупные плазмиды, по-видимому, специфичны для каждого Поиск перемещающихся элементов у бактерий ртутных месторождений. • Многочисленные литературные данные, полученные на клиническом материале, свидетельствуют о том, что перемещающиеся элементы играют важнейшую роль в распространении генов резистентности среди бактерий. Было интересно установить, имеются ли ртутные транспсзоны у бактерий из ртутных месторождений. Для этого проводили стандартные эксперименты по транспозиции (совместно с С.З.Миндлин). В клетки изучаемых бактерий с помощью кон югации вводили плазмиду reï с широким кругом хозяев, несущую гены устойчивости к ампициллину^ ( А р), тетрациклину (Тс) и канамицину (•Km). Полученные транскон юганты скрещивали с е-сои и отбирали транскон югантов, устойчивых к HgCL^. Прежде всего, сделали попытку перенести на rpI гены Hg-г из бактерий рода Acinetcbacter-В этих экспериментах не удалось обнаружит^>перемещающиеся элементы НИ В крупных ни В мелких плазмидах Acinetobacter-

Положительный результат в опытах по транспозиции генов н^-г был получен со штаммом p. riucrescens Ps-З. При скрещивании штам ма Рз-3, в который была введена rpI, с е. coli, с частотой 10 были получены транскон юганты E.ccii, устойчивые к HgCL • Для того, чтобы подтвердить транспозицию, был проведен рестрикцион-ный анализ независимо полученных Hg-г производных ppl. днализ показал, что преобретение Hg-г фенотипа двумя незаЕисмыми производными нрГ (получили названия яр1: : ps-3-I и rpI : : ps-3-2 ) сопровождалось встройкой одного и того же фрагмента ДНК в разные сайты плазмиды rpI. Для того чтобы изучить распространение обнаруженного транспозона среди Hg-r бактерий, использовали метод гибридизации колоний. 8 качестве меченного зонда использовали рцС1Э с фрагментом последовательности Ps-З, который непосредственно прилегает к ртутному оперону ( ртутный оперон из ps-3 был пред-, варительно клонирован, см. ниже). Предполагали, что этот фраг-

мент должен содержать гены транспозиции. Эксперименты показали, что последовательность, входящая в состав меченного зонда, распространена среди многих псевдомонад и ксантомонад Хайдар-канского месторождения. В штаммах ¿cinetobacter этой последовательности обнаружено не было. В стандартных экспериментах нами была продемонстрирована транспозиция генов Hg->~ из одного из гибридизтйщихся с зондом штаммов xanccmonas, а именно, w,l7. В этом штамме не было обнаружено плазмид, что указывало на хромосомную локализацию генов Hs-r. рестрикционный анализ плазмиды ярт с Нг-детерминантай из !'-17 показал, что в эту плазмиду встро. ился, по-видимому, такой же фрагмент ДНК как и в плазмиды RPI::Ps-3-I,2. Мег-спероны из производных RPI были клонированы в Рис19. Была продемонстрирована идентичность рестрикцион-ных карт ®е^-оперонов из Рз-3 и W-I7 (рис. 3), а также идентичность нуклеотидных последовательностей 3-х различных фрагментов глег-оперонов (вправо и влево от сайта EccHj и влево от правого сайта Hindill на рис. 3). Таким образом,-было показано, что, по-видимому, сходные перемещающиеся элементы присутствуют в бактериях различных систематических групп.

По предварительным данным среди бактерий Хайдарканского месторождения распространены и другие транспозоны. Так была осуществлена транспозиция генов Hg,г из штамма Ps-4I Pseudomonas Sp. в котором ранее не было обнаружено плазмид. Рестрикционный анализ соответствующих Hg-r производных RpI показал, что фрагмент ДНК, встроившийся в bpi viз штамма Ps-41, отличается от фрагментов ДНК, встроившихся в я PI из штаммов ?з-3 и w-17.

Мег -оперон из плазмиды HPi:;Ps-4I был клонирован в плазми-де puci9. Была построена его рестрикционная карта. Было показано, что по рестрикционным картам шег-опероны из Ps-3/W-I7, Ps-4I и pKLHl отличаются друг от друга (рис. 3). Опыты по перекрестной гибридизации продемонстрировали различную степень гомологии этих mer-оперонов. Было показано, что эффективность гибридизации тег-опероноз pKLHl и Рз-3/«-17 самих на себя практически такая же как эффективность гибридизации между mer-оперонами. В случае сравнения mer-оперонов pklhl и Rs-4I степень гибридизации mer-оперонов самих на себя была значительно выше, чем степень гибридизаци между mer-оперонами (рис. 4).

Рис. 3. Рестрикционные карты гибридных плазмид с шег-оперонами ИЗ Рз-З (рКЬН300.2); И-17 (рКЬН.71), рКШ (pKLHl.II); Рэ-41 (рКЬН.45); а Ьанже Тп501 и Тп21.

Р

кш зоо.г

I

рК1Н.71

Тп 501

3

III

Я с

Iй

Е з

с2 ¿о

а со сп сп

pKLHi.ll

Г I

с з са^

1=1 -а с

— 1=1

ос -о

3 §

111

I I

г

.81 ^ 3

— 53 ш

и

£ <

131 -а с

О с. и

II 1

с Ю

Е з 3 а

СО СП

сс о о

шэ

<§<3* 1 \

Тп 21

рК1М5

е

с2

I _1

8 а в

II

Несмотря на. высокую эффективность гибридизации, сравнение нуклеогидньгх последовательностей выявило нуклеотидные замены в тег'оперонах ркьн1 и рз-3/и-Т7( рис. 7). Определение нуклеотид-ной последовательности позволило установить, что в шег-опероне чрКЬн1 имеется вставка примерно из 400-500 л. н. по сравнению с шег-оперонами Рз-З/ы-17. Не исключено, что в мег-оперонах Рэ-З/ ц-17 подобно Тп501 и в оьличие от Рк1.н1, нет гена тегС.

Таким образом было показано, что бактерии разных видов могут иметь очень сходные шег-опероны. По-видимому, это связано с распространением среди этих бактерий одного и того же транспо-зона. Наряду с этим продемонстрированы и различия между тег-опе-ронами ркьн1, Рз-3/ы-17 и Рэ-41. Это означает, что у бактерий, обитающих в районе одного месторождения, имеется разнообразие ртутных оперонов.

А Л г . Ь Л

- ию-

1

Рис. 4. Перекрестная гибридизация по Саузерну шег-оперонов ркьн1 и Рэ-41. а) мечена р плазмида ркьн. 45: 1,2 - Есоя1-нмш фрагменты ркьн. '45 и ркьн1 соответственно, б) ме чена р плазмида р'<ьн1: 1,2 - Есой1-Н1псИИ фрагменты рК1.н. 45 и ркьн! соответственно.

Сравнительная характеристика шег-оперонов Acinetobacter

. Результаты, полученные на первом этапе работы при характеристике плазмид Acinetobacter> поставили целый ряд вопросов:

1. Одинаковые или разные шег-опероны распространены среди различных плазмид Acinetobacter?

2. До какой степени сходны между собой ркьн^подобные пла-змиды, обнаруженные на разных месторождениях?

3. Связана ли неспособность к транспозиции генов Hg^r из этих плазмид с тем, что эти гены входят в состав деффектных транспозонов?

Для получения ответов на эти вопросы клонировали тег-оперо-ны из различных плазмид Acinetobacter и определили частичные нук-леотидные последовательностей этих шег,оперонов.

Мег-опароны из крупных плазмид ркьнг, ?KLH20I (Средняя Азия) PKLH202 (Закарпатье) сравнивали между собой и с шег-оперонами из мелких плазмид pKLHi (Средняя Азия) pKLHJ02 (Закарпатье), рКЬНюз и pKLHJ04 (Сев. Кавказ). Рестрикционные карты клонированных гоег-оперонов представлены на рис. 5. Рестрикционный анализ и гибридизация по Саузерну с плазмидой pKLHi показали, что сайты EcoRI, обозначенные цифрами I и 2, и сайт Hindin, обозначенный цифрой I, входят в состав и имеют одинаковое расположение в последовательностях ДНК всех исследованных ^г-оперонов.

Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ЕсоН] ■„Hindill плазмиды РК1-Н2 (531 п. н.) показало, что он содержит весь ген мегй, высоко гомологичный гену мегй транспозона Tngoi (88% гомологии) (рис. 6). Наибольшие отличия наблюдаются в участке гена, кодирующее с-концевую последовательность белка merR. Здесь на участке из 30 п. н. имеется 15 нуклеотидных замен, 7 из которых приводят к аминокислотным заменам. Кроме того, в гене raers pKLHg была обнаружена дополнительная последовательность , удлиняющая merR pKLH2 на 7 аминокислот относительно merR Tn50I. В составе фрагмента EcoRijUndlli были найдены 26 п.н., высокогомологичные 26 из 38 п.н. инвертированных повторов Тп501 и Тп21. Было показано, что сайт EccHj расположен в pKLH2 внутри инвертированного повтора в том же самом месте, что и в тп501. к сожалению остальные 12 п. н. инвертированного повтора не вошли в сос

гав отклонированного нами-фрагмента.

В/бд - Н* ЯКН-1 ИМ В/йо

I I п I г

% Р НИН Н! 8/5.

[ [ (М_I

Я1 н кг

I [ I

«I н н

Й1Н Ш

'!«ТрДС ' А Б

1ПРВ__ЬПРА

pKLHi.il

рКЬН 201А

9д Н М Вд Я1

|1 III

рИЬН2.5

1*1

рКЬН202.3

Тп501

Рис. 5. Рестрикционные карты гибридных плазмид с тег -оперонами из различных штаммов Асз.пеьоЬасьег. Мег-опероны обозначены толстой линией, я,т,р,а,о - гены п-ег-оперона, tnpR> ьпрА гены резольвазы и транспозазы Тп501 соответственно. Н1-ЕсоИ1, Н-ШпсЛИ, Р-РгсI, В-ЗэтН1, З-БаиЗА -, В8-Вв111. Звездочкой обозначен фрагмент ЕссЯ1 л-Цпаш, в котором имеется делеция в 300 п.н. в плазмиде рКЬНЮЗ относитель но других рКЬН1-подобных плазмид. Двумя звездочками обоз начен фрагмент Есой1-Н1п«ии 1,6 т. п. н. плазмиды рК1.Н2.5, который не содержит последовательностей тег-оперона ( использовался в качестве зонда при гибридиза-

ционнда сравнении крупных плазмид - см. выше ).

Обнарувение .в pKLH2 псследовательности-, гомологичной инвертированным повторам тп501 и Tn2I-, позволило предположить; что шег-оперон в плазмиде PKLH2 входит в состав транспозона-, родственного т"501 и ~п21. Так как попытки продемонстрировать транспозицию генов Hg-r из плазмиды pKLH2 кончились неудачей, мы предположили; что имеем дело с деффектным транспозоном.

Определение нуклеотидной последовательности в гене тегЛ плазмид PKLH20I и PKLH2Ô2 показало; что в этих участках все 3 детерминанты идентичны друг другу. Были определены нуклеотид-ные последовательности фрагментов генов merА из крупных плазмид Acinetobacter (в районе сайта EcoRI,1). В этом районе было обнаружено 2 нуклеотидные замены между pKLH2/pKLH20I и PKLH202. Данный фрагмент мегА оказался гомологичен соответствующему фрагменту ТпбОГ в той же степени; что мегй (рис. 7).

Определение нуклеотидных последовательностей мелких плазмид от сайта EcoRi_2 в сторону гена merR показало; что в них имеются все характерные элементы соответствующей последовательности pKLH2:- транспозонный концевой повтор и дополнительная последовательность merR (рис. 6). Более того; последовательности тегя у всех крупных и мелких плазмид оказались идентичными за исключением 2-х замен в плазмидах PKLHI02 и pKLKЮЗ.

.Если в районе гена. MerR детерминанты устойчивсти к ртути Сольших и малых плазмид оказались практически идентичными друг другу; то е районе сайта EcoRI гена merа между ними обнаружились значительные различия - до 10% нуклеотидных замен (рис. 7). Было замечено; что последовательное« тегА плазмид pKLHl02 и pfCLHI03; сильно отличающиеся от гсегА других плазмид Acinetcbac- г ter (12-18 замен), в то же время близки соответствующей последовательности Тп501 (2 замены). На рис. 8 представлена схема распределения и характера нуклеотидных замен между фрагментами ге- . нов пегА различных плазмид Acinetobacter и Тп501. Такая картина является указанием на участие рекомбинации в образовании мег-оперонов из мелких плазмид. Они могут быть представлены в виде продукта рекомбинации между последовательностью крупной плазмиды и последовательностью Тп501. Эти рекомбинации в разных плазмидах по-видимому; произошли в разных.; но близко расположенных точках;

АСАСАТСАТТТСАСССТААААСАСААТСАСААТТАТАТЛАТСАСАСССТПТАТСТАААААСЛАААССОСБТАТАСССААС пШ н 1ЛП ТСССААСТТТСАТТТААСАСАЛТАСАСТСАСТТТСАААССААСАСТТААААТТТСТСТСААССбАСАТААТАААТТСААТ -80

КОНЦЕВОЙ ПОВТОР -:-СТОП ПЕШ)

1 - -(- .

СССОТССТСССТОААТТСССААТАТАЛАОСАССГГААСПССТА.ТСАССССГТСАСТССССССССС .АТС С А БС Б А Б СТ рКШ102

(!ЛАДТСССААТАТААА0САСССТААС;;СС..ТА6ТСАСССССТСАСТССССССС0СС0АТССА6ССАССТ рКЬН2 **'*.* *** *******

С.СССТССТСТСАбААААСССААААТАААССАСОСТААГ,с ЛТ А ОС Св А АС С Т ОС С А АС С Тп 501

81__;_.

100

ТСаТТСС6ТСТТ6СА6Т6АС6САА1САСС600СА6САЛССвТТСССТТТССГ,С6САТ6ССА66С6САСАТСА6ТТСА6АС рКЬН 102

ТС6ТТСС?ТСТТ6САаТСАСОСААТСАОССГ.Г.САС6АААС6ПСССТТТССГ>СОСАТСГ,САОСС6САСАТСАОТТСАОАС рКЬН?. ****** * ** * * **

7ГВСТССЛССС7Г,ТАВТВАСБСеА1САеСССССАС6АЛЛСВТТСССССТТСССБСЛТсесЛС,ССвСЛСАССААСТСАеЛС Тп 501 180

АССАСССССТСГАТССеТСССААСТСССТСАТСТГСТС ьНШ102 * * 200

АССАСбСССТССАТАССТСССААСТСССССАТСТТСТСССССЛСАТССТТОАССТТБТССТСПОССАбСССССТСОСТТС рКЬН2

♦***,* * * * ►г г r,J

АССАСесССГССМесёСвССАбаСАвССАТТТТСТСССйСАССТССТТСАБСПСТБСТСаССАОАСТССХОССГГС Тп 501

300

СТСОСААТСССТСССАТССТССАСССБТАСТАССТСПССОАТТТСОТССАСССТАААОССТАСССССТССССССАТТТСА рК1.Н2

** ** * * *

СТСПСААТОССТСССАТССТССАСССССАаСАОСТСССССАТСТСАТССАСССТСААССССАСССССТССССТСАТТТСА Тп 501

зво

CGAACCGCACTCGTGTTACATCCGCCTCGCCATAGCGGCGAATGCTGCCATAGGGCTTGTCTGGCTCCGGCAGCAGGCCC *** * ****

CGAAGCGCACCCGCGTTACATCCGCCTCGCCATAGCGGCGGATGCTGCCATAGGGCTTGTCAGC. CTCCAGCAACAAGCCC

'.SO

pKLH2 Tn50J

TTGCGCTGGTAGAACCGGATGGTCTCCACATTGACCCCGGCCGCCTTGGCAAAAACGCCAATGGTCAGATTCTCAAAATT pKLH2 * * * * *

TTGCGCTGATAGAAACGGATGGTCTCCACATTGACCCCGGCCGCCTTGGCGAAAACGCCAATGGTCAGGTTCTCCAAATT Tn5Dl

'СТАРТ MERR

! 500

AATTTGCATATCGCTTGÀCTCCGTACATAACTACGGAAGTAAGCTT * * * *

ATTTTCCATATCGCTTGACTCCGTACATGAGTACGGAAGTAAGGTT 580

pKLHZ Tn501

РИС. е. НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ MERR. ПРИВЕДЕНА ПОЛНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА MERR ИЗ ПЛАЗМИДЫ PK L Н2 И ПРИЛЕГАЮЩАЯ К HERR ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 26 П.Н. КОНЦЕВОГО ПОВТОРА ТРАНСП030НА. ПРИВЕДЕНА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ З'КОНЧА ГЕНА HERR ИЗ ПЛАЗИИДЫ PKLH10Z (162 П.Н.), Л ТАКЖЕ ПОЛНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ КОНЦЕВОГО ПОВТОРА ТРАНСП030НА (38 П.Н., ПОДЧЕРКНУТА) И ПРИПиКАВУАЯ К НЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (160 П.Н.) ПЛАЗМИДЫ Р KLH2,',B КОТОРУЮ ПРОИЗОШЛО ВНЕДРЕНИЕ ТРАНСПОЗОМА. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ КОНЦЕВОГО ПОВТОРА ИДЕНТИЧНЫ У PKLH1-ПОДОБНЫХ ПЛАЗМИД: PKLH1, PKL Н102, PKLH103, PKLH104. ПЛАЗМИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, ПРИМЫКАЮЩАЯ К ИНВЕРТИРОВАННОМУ. ПОВТОРУ, ИДЕНТИЧНА У ПЛАЗМИД PKLH1 И PKLH102. У ОСТАЛЬНЫХ PKLHI-ПОДОБ-НЫХ ПЛАЗМИД ЭТА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТЬ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛАСЬ. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ З'КОНЦА ГЕНА MERR ИДЕНТИЧНЫ У PKLH1, PKLH104, PKLH2, PKLH201 И ОТЛИЧАЮТСЯ ОТ СООТВЕТСТВУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ PKLH102 И PKLH103 2-МЯ НУКЛЕОТ ИДНЫМИ ЗАМЕНАМИ. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ИЗ 178 П.Н, ОТ САЙТА Н1П0ХИ (5'КОНЕЦ ГЕНА HERR) ИДЕНТИИЧНА У ПЛАЗМИД PKLH1, PKLH2. У ОСТАЛЬНЫХ ПЛАЗМИД ЭТА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НЕ ОПРЕДЕЛЯЛАСЬ

?200 225 0

cgcaagcctttgcccggctgggcagcaaggtcacggtcctggcgcgcaataccttgttcttccgtgaagacccggccatc **

cgcaagccttgccccggctgggcagcaaggtcacggtcctggcgcgcaataccttgttcttccgtgaagacccggccatc

* * * * * **. * * ,

CGCAAGCCTTGCCCCGGCTGGGCAGCCAGGTCACGATCCTAGCTCGCAACACGCTGTTCTrcCGCGACGACCCGGCCATC CGCAAGCCTTGCCCCGGCTGGGCAGCCAGGTCACGATCCTAGCTCGCAACACGCTGTTCTTCCGCGACGACCCGGCCATC

CÚCAAGCCTTGCCCCGGCTGGGCAGCCAGGTCACGATCCTAGCTCGCAACACGCTGTTCTTCCGCGACGACCCGGCCATC * *

cgcaagccttcgcccggctgggcagccaggtcacgatcctagctcgcaacacgctgttcttccgcgacgacccggccatc * ■ * * * * * * * * *

CGCAAGCCTTTGCTCGGCTCGGCAGCAAGGTCACfiATCCTGGCACGCAGCACCTFGTTCTTCCGGGAAGACCCGGCCATC

****

* *

CGCAGGCGTTCGCCCGACTCGGAGCGAAGGTGACG ATfCTGGCTCGCAGCACGCTGTTCTTCCGCGAAGACCCAGCTATA

Tn501 pKLH 102/103 рКШЮ^ pKLHl pKLH2/201 pKLH202 Ps-3/W-17 Tn2j

■2300

GGCGAGGCGGTGACAGCCGCTTTCCGTGCf. GAGGGCATCGAGGTGCTGGAGCACACGCAAGGCAGCCAGGTCGCCCATAT Tn501 GGCGAGGCGGTGACAGCCGCTTTCCGTGCCGAGGGCATCGAGGTGCTGGAGCACACGCAAGCCAGCCAGGTCG pKLH Ю2//03

GüCGAG.CCGGTGACAGCCGCTTTCCGTGCCGACGGCA.TCGAGGTGCTGGAG pKLHIO^

* * . * *

GGCGAGGCCGTTACAGCCGCGTTCCGTGCCGAGGGCATrGAGGTGCTGbAACACACGCAAGCfAGCCAGGTCGCCCATAT pKLHJ

* * * * * *

GGCGAGGCCGTTACAGCCGCGTTCCGTGCCGAAGGGATCAAGGTACTGGAACACACGCAAGCCAGCCAGGTCGCGCATGT pHLH2/20i

GGCGAGGCCGTTACAGCrGCGTTCCGTr.CCGAAGGGATCAAGGTACTGGAACACACGCAAGOCAGCCAGGTCG pKLM 202

* * *****

GGCGAGGCCGTGACAGCCGCTTTCCGCGCCGACGGCATCGAGGTGCTGGAGCACACGCAAGCCAGCCAGGTCG PS -3/W-/7

******* *****

GGCGAAGCCGTCACGGCCGCATTCCGCATGGAGGGCATCGAGGTGAGGGAACACACCCAGGCCAGCCAGGTCGCGTATAT Tn 21

Puc.7. ну к л e 0 tu л hu e последопательности орагг1ент0в геноо mera влеео от сайта ec0r1, начиная с г- 5 7 h.h.- от i1hiui и ii рую"1 е г о кокона mera. (218641.н. в последовательности tü501).

TN501

PKLH102

PKLH103 *

PKtMIOA

PKLH1

PKLH2 -1-

РИСУНОКЯ . СХЕМА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН ВО.®РАГПЕНТЕ ГЕНА MERA ИЗ РАЗЛИЧНЫХ КРУПНЫХ И МЕЛКЦХ ПЛАЗМ ИД А С I НЕ ТСША С Т Е R (НЕ. В МАСШТАБЕ). ЧЕРТОЧКИ ОБОЗНАЧАЕТ НУКЛЕОТИДИ, ОС«Ш£ ДЛЯ ВСЕХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ. КРУПКАМИ ОБОЗНАЧЕНЫ НУКЛЕО-ТИДЫ, ПО КОТОРЫМ ХОТЯ БН ОЛНА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ ОСТАЛЬНЫХ. КРУЖКИ ОДНОГО ЦВЕТА ОБОЗНАЧАЮТ ОДИНАКОВЫЕ НУКЛЕОТИДЫ. ТЕПНЫЕ КРУЖКИ С СОТВЕТСТВУОТ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ PKLH2, А СВЕТЛЫЕ - ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ТМ501.

• ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ PKLH1-ПОДОБНЫX ПЛАЗМИД ПРЕДСТАВЛЯЮТ СОБОЙ ПРОДУКТЫ РЕКОМБИНАЦИИ НЕЙДУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО

которые указаны звездочками на рис. 3. Создается впечатление> что обнаружен довольно узкий район, проявляющий свойства "горячей точки" рекомбинации. Определение нуклеотицных последовательностей других фрагментов ДНК из плазмид Acinetobacter подтверждает предположение о рекомбинации, при которой " левое плечо"-, включающее ген мегК с характерной вставкой, гены транспортных белков и примерно 2/3 гена тегА в мелких плазмидах происходят из ртутного транспозона ИЗ крупных плазмид- Acinetobacter J а - "правое плечо", включающее 3 концевую последовательность гена merA „ из Тп501.

Поскольку Тп501 исходно Обнаружен В штамме Pseudomonas aeruginosa, то обнаружение рекомбинантных транспозонов указывает на мел-видовой перенос генов устойчивости к ртути. Совпадение последовательности "правого плеча" детерминант устойчивости мелких плазмид с одной из 2-х известных в литературе последовательностей пег-оперонов (а именно, Тп501) свидетельствует о высоких частотах этого переноса-, о том-, что в популяциях некоторых^ грам-отрица-тельных бактерий преобладает относительно небольшое число разных последовательностей детерминант устойчивости." - .

3КБОДЫ

1. Обнаружены и охарактеризованы не описанные ранее плазми-ды бактерий рода Acinetobacter 2-х типов: а) мелкие некон'юга-тивные, но мобилизуемые плазмиды, способные реплицироваться в бактериях разных систематических групп, обнаруженные в 3-х географически удаленных ртутных месторождениях, б) крупные плазмиды

/ . / или некон югативные вообще или кон югативные с узким кругом

хозяев; специфичные для каждого месторождения.

2. Сравнение рестрикционных карт, перекрестной гибридизации и частичных нуклеотидных последовательностей клонированных mer-оперонов показало, что у бактерий разных систематических групп шег-опероны эволюционно родственны, но отличаются значительным разнообразием нуклеотидных последовательностей.

3. У бактерий рода Pseudomonas, обитающих в районе Хайдар-канского месторождения, обнаружено 2 ртутных транспозона-, которые отличаются друг от друга и от описанных в литературе ртутных транспозонов по рестрикционным картам. У бактерий рода Xanthcao, nas обнаружен ртутный транспозон, идентичный по рестрикционной

карте и по частичным нуклеотидным последовательностям одному из транспозонов Pseudomonas.

■ 4. Обнаружено; что распространение ^„детерминант по различным крупным плазмадам Acinetobacter произошло за счет перемещения транспозона; родственного описанным ртутным транспозонам я бактерий клинических изолятов. В мелких плазмидах Acinetobacter обнаружены рекомбинантные транспозоны; "левое плечо" которых получено от транспозона-из крупных плазмид. а "правое плечо" - от транспозона TN50I-, исходно обнаруженного в P. aeruginosa.

5. Обнаружение практически идентичных нуклеотиднах последовательностей генов устойчивости к ртути у бактерий разных систематических групп свидетельствует о широкой распространенности межвидового переноса генов в природных популяциях почвенных бактерий.

Ломовская 0.; Миндлин С.З., Хеснн Р.Б. -Изучение устойчивости К HgCL¿y Acinetobacter// Генетика. I9S5. Т.21. С. 1945.

Loniovskaya 0.; Mindlin Gorlenkc Zh., Khesin R. A nonco-njugative mobilizable broad-nost-range plazraid cf Acinetobacter sp. that determines HgCL, resistans// MolGen . Genet, 1986. V.202, P. 286.

Миндлин С.; Горленко Ж.; Ломовская 0.-, Богданова Е., Каляева Э., Грагеров А., Никифоров В. Плазмиды, определяющие устойчивость к HgCL¿ у Acinetobacter: распространенность в различных ртутных месторождениях// Генетика. 1986. Т.22. С.2025.

Ломовская 0.; Богданова Е.; Горленко Я.; Миндлин С. Сравнение mer-оперонов из Hg-r'бактерийj обитающих в районах ртутных месторождений// Тезксы Всесоюзной конференции "биосинтез ферментов микроорганизмами". Кобулети. 1986.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

Т-22425.подл.к печЛ/ХП-37г Зак.й I¿15,тар.100. ОРТД МГТ