Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение оперонов и транспозонов устойчивости к ртути палеобактерий и современных бактерий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение оперонов и транспозонов устойчивости к ртути палеобактерий и современных бактерий"

На правах рукописи

Петрова Майя Александровна

Сравнительное изучение оперонов и транспозонов устойчивости к ртути палеобактерий и современных бактерий

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кадидата биологических наук

Москва-2003 __________________

О Б 9 о А ПИЛЬНЫЙ

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Института молекулярной генетики (ИМГ) РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук

Мин длин Софья Захаровна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Прозоров Александр Александрович доктор биологических наук, профессор Хмель Инесса Александровна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Государственное учреждение научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи

Защита состоится «_»_2003 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3, факс: (095) 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомится в билиотеке ИОГен РАН Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.Н. Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время горизонтальный перенос генов признан одним из основных механизмов эволюции, обеспечивающих быстрые изменения генома микроорганизмов, позволяющие им адаптироваться к неблагоприятным условиям внешней среды. Горизонтальный перенос генов является причиной вспышек эпидемий, возникновения патогенных штаммов у ранее непатогенных видов бактерий, быстрого появления и стремительного распространения множественной лекарственной устойчивости у разных клинических бактерий. Однако, преимущественно данные о роли горизонтального переноса были получены при изучении клинических бактерий, которые живут в условиях сильного искусственного давления отбора, вызванного применением лекарственных препаратов. Вопрос о масштабах и механизмах горизонтального переноса генов в природных популяциях до сих пор изучен недостаточно, хотя, несомненно, он представляет большой научный интерес, с точки зрения исследования механизмов эволюции геномов бактерий, и имеет прикладное значение в связи с оценкой риска интродукции в природные экосистемы бактерий, созданных методами генной инженерии. В лаборатории молекулярных основ генетики (ЛМГМ) ИМГ РАН на протяжении почти 20 лет ведется изучение горизонтального переноса генов на примере детерминант устойчивости к соединениям ртути из природных экосистем. Как известно, устойчивость к ртути обусловлена тег-генами, входящими в состав /яег-оперонов, которые, в свою очередь, часто входят в состав транспозонов. Было показано, что в природных популяциях обнаруживается сравнительно небольшое число одних и тех же типов ртутных транспозонов и тег-оперонов, составляющих общий генофонд различных групп грамотрипательных бактерий на всей планете. В связи с этими данными возникает вопрос: не является ли такое доминирование небольшого числа детерминант устойчивости в природных микробоценозах следствием антропогенного загрязнения биосферы. Чтобы ответить на этот вопрос, надо исследовать экосистемы, никогда не подвергавшиеся антропогенному воздействию. Таким уникальным природным хранилищем микробных сообществ, никогда не испытывавших влияния хозяйственной деятельности человека, являются многолетнемерзлые отложения. К настоящему времени показано, что содержание бактерий в многолетнеме

не намного уступает таковому в современных тундровых почвах. Однако до сих пор никто специально не выделял из мерзлоты микроорганизмы, устойчивые к соединениям ртути, антибиотикам и т.п. с делью сравнительного изучения их детерминант устойчивости с современными.

Цель работы и задачи иследования. Целью данной работы, являющейся частью обширного исследования, ведущегося в ЛМГМ, было создание коллекции бактерий, устойчивых к соединениям ртути, из многолетнемерзлых отложений и сравнительное изучение детерминант устойчивости к ртути у древних и современных бактерий. В задачи данного исследования входило:

1. Выделение устойчивых к ртути бактерий из образцов многолетнемерзлых отложений и определение их систематического положения.

2. Мобилизация детерминант устойчивости к ртути и выделение активных транспозонов штаммов древних бактерий.

3. Идентификация с использованием специфических зондов известных транспозонов устойчивости к ртути, распространенных среди современных почвенных бактерий, у штаммов из мерзлотной коллекции.

4. Молекулярно-генетическое исследование ранее неизвестных транспозонов устойчивости к ртути у древних бактерий.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые была создана и охарактеризована коллекция устойчивых к ртути бактерий из многолетенемерзлых отложений. Показано значительное разнообразие содержащихся у штаммов этой коллекции детерминант устойчивости к ртути. У древних бактерий были обнаружены транспозоны, высокогомологичные широко распространённым современным природным транспозонам. Впервые был обнаружен и исследован простой транспозон, названный Тп5060, близкородственный предку сложного траспозона множественной лекарственной устойчивости Тп21, широко распространенного среди клинических штаммов бактерий. Также обнаружен и охарактеризован ранее неизвестный транспозон нового типа, Тп5042, и показано его широкое распространение как в мерзлоте, так и среди штаммов современных природных бактерий.

Полученные данные свидетельствуют о том, что широко распространенные среди современных природных штаммов бактерий детерминанты устойчивости

Ряс. 1. Схема строения четвертичных отложений Колымской низменности.

Условные обозначения:

1 - современная тундровая почва

2 - отложения едомяой свиты

3 - жилы льда

4 - аласные отложения

5 - олер

6- русло реки

-4

к ртути возникли и начали перемещаться задолго до начала антропогенного загрязнения биосферы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и 2 приложений. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 15 рисунков и 8 таблиц. Библиография включает названий, в том числе русских и иностранных.

1. Выделение устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений

Образцы почв и многолетнемерзлых пород для данного исследования были отобраны в районе Колымской низменности (Якутия) в 1988-1992 годах. Методика отбора, доставки и хранения образцов исключала возможность их оттаивания и заражения посторонними микроорганизмами (Звягинцев и др.,

Образцы, использованные в данной работе можно разделить на 4 группы (см. рис. 1):

1. Почва, сформировавшаяся на мерзлоте в пределах слоя сезонного оттаивания.

2. Отложения едомной свиты с характерными жилами льда толщиной в несколько метров. Промерзание пород едомного комплекса шло одновременно с осадконакоплением. Возраст пород от 16 до 50 тыс лег.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1985).

3. Голоценовые аласные отложения, первоначально сформированные одновременно с едомными. Но 5-8 тыс. лет назад они протаяли, после чего вновь промерзли. Таликовые зоны расположены в виде четких языков в толще едомных отложений, которые никогда не оттаивали.

4. Отложения олерской свиты возрастом 1-3 млн. лет.

Перед началом опытов по выделению устойчивых к ртути бактерий из этих образцов необходимо было иметь гарантии того, что выделяемые из мерзлоты микоорганизмы действительно являются древними, а не были занесены туда позднее. Без строгого доказательства этого, сравнение древних детерминант устойчивости с современными теряло бы всякий смысл. В пользу того, что выделяемые из мерзлоты бактерии действительно являются современниками мамонтов, говорят следующие данные:

1) Миграция почвенной микрофлоры в более глубокие подпочвенные слои не может происходить из-за наличия мерзлоты, которая полностью препятствует просачиванию воды с поверхности.

2) Обнаружение в пробах многолетнемёрзлых пород анаэробных микроорганизмов, которые не могли попасть туда из воздуха в процессе отбора образцов.

3) Выделение из мерзлоты редких видов микроорганизмов, не характерных для современных тундровых почв.

4) Обнаружение образцов, в которых отсутствуют жизнеспособные микроорганизмы.

5) Было показано, что нет существенных различий ни в численности, ни в качественном составе микроорганизмов, выделяемых из одних и тех же образцов, проанализированных в экспедиции сразу же после извлечения их из скважины, и затем после хранения и доставки их в лабораторию в Москве.

6) При разных вариантах искусственного заражения керна или образцов тест-культурой, ее никогда не удавалось обнаружить при последующем посеве, проведенном по стандартной методике.

Следовательно, микроорганизмы, выделяемые из мерзлоты, действительно являются представителями древних микробных сообществ. В данной работе были исследованы 64 образца многолетнемерзлых отложений. В 45 из них были обнаружены жизнеспособные бактерии в количестве, превышающем 104 клеток на 1г грунта; в 14 образцах содержание бактерий было

Генезис и Глубина Число Hg-r Число отобранных Hg-r штаммов

возраст отбора жизнеспо- бакте-

образцов проб, м собных рии, % Грам+ Грам'

клеток на 1г Всего Всего Ps. Acinet. Др-

Аласные 7,6 2,0x105 0,2 3 1 - - 1

отложения 9,0 l,9xlOs 0,4 2 1 1 - -

5-10тыс.лет

Отложения 2,5 6,6x10" 0,1 3 1 1 - -

едомной 2,9 2,0x105 1,3 1 3 - 3 -

свиты 4,5 1,5х106 1,2 4 11 8 1 2

15-40 тыс. 6,0 2,2x105 1,3 3 5 2 1 2

лет 8,6 8,0х105 2,7 - 1 1 - -

10,0 3,0х105 1Д 4 - - - -

Отложения 2,5 7,0x104 0,05 - 2 2 - -

олерской 12,3 1,5x10® 0,2 4 1 - 1 -

свиты 19,7 1,0x105 0,1 1 1 - - 1

1,8-2,5 млн.

лет

меньше, а в пяти образцах бактерии обнаружены не были. Содержание устойчивых к ртути бактерий колебалось от 0 до 2% .

Данные о выделении устойчивых к ртути штаммов бактерий выборочно представлены в таблице 1 (приведены данные для образцов, содержащих наибольшее количество Hg-r бактерий). Как грамположительные, так и грамотрицательные устойчивые к ртути бактерии, удалось выделить из образцов разного возраста, генезиса и географического положения. Среди грамотрицательных бактерий преобладали представители рода Pseudomonas. Кроме того, были выделены штаммы родов Acinetobacter, Plesiomonas и порядка Myxobacteriales. Среди грамположительных бактерий были представители родов Bacillus, Micrococcus, Arthrobacter и Exiguobacterium. Таким образом, была создана коллекция древних бактерий, устойчивых к соединениям ртути.

2. Первичный анализ детерминант устойчивости к ртути в штаммах мерзлотной коллекции

2.1. Определение наличия тег-оперона в мезофильных штаммах налеобактерий

Устойчивость бактерий к соединениям ртути, в большинстве случаев, обеспечивается присутствием тег-оперонов. Однако, известны и другие

А.

(к||тРС)ГтегА }|р)

Б.

Рис. 2. Скрининг штаммов грамотрицательных палеобактерий на наличие отег-оперона

а) Генетическая карта тег-оперона из плазмиды pKLHl. Неправильные прямоугольники обозначают гены, а заостренные концы указывают направление их транскрипции. R, Т, Р, С, merA, D- гены merR, merT, merP, merC, merA, merD. Под генами серой линией указан фрагмент, использованный в качестве зонда.

б) Результаты гибридизации колоний in situe фрагментом тег-оперона из плазмиды pKLHl. Приведены данные по гибридизации мерзлотных штаммов грамотрицательных бактерий. "Ячейки" двух самых верхних и двух нижних рядов соответствуют современным бактериям, содержащим или не содержащим тег-оперон, использованным в качестве положительных и отрицательных контролей.

механизмы устойчивости. Очевидно, что для оценки перспективности использования коллекции для проведения сравнительных исследований mer-оперонов древних и современных бактерий необходимо было определить механизм устойчивости к ртути выделенных Hg-r штаммов. Для этого применяли два подхода. При анализе грамотрицательных бактерий использовали гибридизацию in situ бактериальных колоний со специфическим зондом для генов /иег-оперона. На рисунке показан фрагмент mer-оперона, использованный в качестве зонда, и представлены результаты гибридизации колоний грамотрицательных палеобактерий (рис. 2а). 34 из 37 исследованных грамотрицательных бактерий давали четкую гибридизацию с использованным зондом (рис. 26).

Метод гибридизации in situ колоний неприменим для анализа большинства штаммов грамположительных бактерий из-за трудностей лизиса их клеток. Кроме того, учитывая высокий уровень дивергенции и малое количество известных нуклеотидных последовательностей их генов устойчивости к ртути,

поиск жег-оперонов с помощью специфических зондов представлялся нецелесообразным. У штаммов грамположительных бактерий о присутствии /пег-оперона судили по наличию активности ртутъ-редуктазы, кодируемой ртутным опероном. В этих экспериментах было доказано, что устойчивость к ртути у большинства древних штаммов обеспечивается наличием тег -оперона. 2.2. Сравнительный анализ структуры тег-оперонов древних и современных штаммов термофильных бацилл Ранее в нашей лаборатории был охарактеризован тег-оперон из штамма Bacillus thermoleovorans СТТ45-1. В данной работе мы исследовали распространение этого варианта wer-опсрона среди современных и древних термофильных бацилл. Мы использовали коллекцию природных штаммов современных и древних термофильных устойчивых к ртути бацилл, имеющуюся в ЛМГМ (табл. 2). Исследованная коллекция содержала 18 современных штаммов, выделенных из гидротермальных источников Курильских островов и Камчатки, коллекционный модельный штамм B.thermocatenulatus 178, а также штаммы из многолетнемерзлых отложений Колымской низменности (7 штаммов) и Канады (2 штамма). Суммарные ДНК всех исследуемых штаммов были обработаны смесью рестриктаз HindlW и PvuU и проверены в опытах по ДНК-ДНК гибридизации по Саузерну на наличие тег-оперонов. В качестве зонда был использован фрагмент ген тегА размером 1,8 т.п.н. из штамма СТТ45-1 (рис. 3).

Таблица 2. Гибридизация тег-оперонов современных и древних термофильных бацилл с зондом на ген тегА из штамма СТТ45-1_

Название штамма Возраст отложений Источник штамма Размер Hindlli-Pvull фрагментов, kb

СТТ45-1 современный Курильские о-ва 2,1

В thermocat. 178 современный коллекция ИМГ 1,05+0,9

КИР22 современный Камчатка 2,2+2,0

СТТ52 современный Курильские о-ва 1,0+1,1

ТЗ 0,5 млн. лет Канада 1,0+1,1

5168 2,0 млн. лет р. Хомус-Юрях 1,0+1,1

332 1,5 млн. лет р. Коньковая 1,0+1,1

5105 2,0 млн. лет р. Хомус-Юрях 1,0+1,1

0205 1,8 млн. лет р. Алазея 1,1+1,8

113 8 тыс. лет р. Коньковая 1,1+1,8

0227 20-40 тыс. лет р. Алазея 1,1+1,8

2381 20-40 тыс. лет мыс Чукочий 1,1+1,8

ВатН1 РуиН РулИ ШшНН ватН!

|_0,7 ._2^1_

СТТ45-1

тегА

Рис. 3 Поиск варианта т«г-оперона из штамма ВЛкегто1еоуогапх СТТ45-1 в коллекции современных и древних термофильных бацилл.

В верхней части рисунка представлена рестрикционная карта тег-оперона из штамма СТТ45-1. Стрелкой под ней указано метоположение гена тегА, а вытянутым прямоугольником - фрагмент, использованный в качестве зонда. На нижней части рисунка представлены результаты одного из опытов по гибридизации ДНК штаммов термофильных бацилл.

Л/ег-опероны, гомологичные оперону СТТ45-1, с высокой частотой встречались в коллекции штаммов, выделенных из многолетнемерзлых отложений. На рисунке приведены результаты гибридизации. Все 7 штаммов из мерзлоты Колымской низменности и один из двух штаммов из Канадской мерзлоты с высокой эффективностью гибридизовались с использованным зондом. В коллекции современных термофильных бацилл только три из 19 исследованных штаммов давали гибридизацию с фрагментом тег А СТТ45-1 (табл. 2). Таким образом тег-опероны, гомологичные оперону из современного термофильного штамма СТТ45-1, с очень высокой частотой обнаруживаются у термофильных бацилл, выделенных из многолетнемерзлых отложений, что свидетельствует об их относительно древнем (не менее 2 млн, лет) и широком распространении.

2.3. Анализ структуры тет-оперонов штаммов рода Асте^Ьас1ег

На следующем этапе исследования с помощью гибридизации по Саузерну у древних штаммов АстеЮЬааег был осуществлен поиск фрагмента размером 2,7 т.п.н., характерного для тег-оперонов современных представителей этого рода

Рве. 4. Анализ структуры лдо-оперонов мерзлотных штаммов Аст&оЬасиг.

В верхней части рисунка приведена генетическая карта варианта тег-оперона из плазмиды рКШ1 (обозначение генов, как на рис. 2); линией под ней указан фрагмент, использованный в качестве зонда. На нижней части рисунка представлены результаты одного из опытов по гибридизации штаммов палеобактерий (1, 2, 3, 5 и 6 дорожки соответствуют штаммам АапеюЬаоег, а на 4-й дорожке нанесена ДНК фага Я, рестрицированная РвИ).

(Уипеуа & а!., 1997). Этот фрагмент вырезается рестриктазой ЕсоШ и включает в себя гены тегК, тегР тегТ, а также фрагмент гена тегА (рис. 4). В качестве зонда был использован фрагмент, содержащий ген тегЯ (рис. 4). Оказалось, что у всех выделенных из мерзлоты Н§-г штаммов Ас1пеГоЬас1ег с использованным зондом гибридизуется фрагмент размером 2,7 т.п.н., как и у большинства современных представителей этого рода (на рис. 4 приведены данные только для 5 штаммов).

3. Локализация детерминант устойчивости к ртути

В распространении генов устойчивости к ртути у современных бактерий основная роль принадлежит плазмидам и транспозонам. В связи с этим мы провели работу по изучению плазмидного состава и поиску транспозонов у штаммов устойчивых к ртути палеобактерий

3.1. Детерминанты устойчивости к ртути, локализованные на плазмидах

Прежде всего была изучена способность выделенных штаммов передавать гены устойчивости к ртути при конъюгации. Для опытов по конъюгативному переносу плазмид в качестве доноров были взяты 7 штаммов рода Acinetobacter и 7 - Pseudomonas, а в качестве реципиентов коллекционные штаммы бактерий соответствующих родов. Кроме того, локализацию генов устойчивости к ртути определяли с помощью гибридизации с зондом на тег-оперон препаратов плазмидных ДНК (в качестве зонда был использован тег-оперой из плазмиды pKLHl, рис.4). Благодаря этим экспериментам было установлено, что тег-опероны у всех древних штаммов Acinetobacter и большинства псевдомонад локализованы на конъюгативных или неконъюгативных плазмидах, также как и

EcoRl EcoRI

Рис. S. Последовательные этапы выделения активных транспозонов Этап!

Этап 2 Этап 3

Этап 4 Этап 5

Этап 6 Определение сцепления Тс-r и Hg-r маркеров (100% сцепление свидетельствует о перемещении Hg-r транспозона на конъюгативную плазмиду)

у современных представителей этих родов. 3.2. Детерминанты устойчивости к ртути, входящие в состав транспозонов

Поиск транспозонов устойчивости к ртути был проведен среди штаммов грамотрицательных бактерий мерзлотной коллекции. Для этого использовали два подхода: (1) мобилизация Hg-r транспозонов с помощью плазмид широкого круга хозяев и (2) обнаружение известных Hg-r транспозонов грамотрицательных бактерий с помощью гибридизации по Саузерну со специфическими зондами.

Для поиска активных транспозонов устойчивости к ртути из штаммов палеобактерий применили метод мобилизации Hg-r детерминант с помощью плазмиды широкого круга хозяев RP1. Последовательность этапов выделения активных транспозонов представлена на схеме (рис.5). Следует особо отметить, что не во все штаммы можно ввести плазмиду RP1 (Kelly, Reanney, 1984; Kholodii et al., 1997; Mindlin et al., 2001).

В данной работе из 23 проверенных штаммов реципиентом для RP1 служили только 10. Из них удалось мобилизовать 6 транспозонов устойчивости к ртути. Из таблицы 3 видно, что по активности перемещения транспозоны из мерзлотных штаммов различались на несколько порядков. Самым активным оказался транспозон из штамма ED23-33.

Введение плазмиды широкого круга хозяев (ЯР1 или Ю?1.2) в клетки Щ-г штамма; отбор Тс-г ^-г трансконъюгантов

А

2-3 пересева отобранных клонов на селективной среде 1

Скрещивание со штаммом Е.соН К12 АВ1456 (Щ-б Б1т-г Л ¡й-); отбор Тс-г вй-г и Щ-г БЬг-г трансконъюгантов

I

Рассев ^-г 8й--г колоний на селективной среде

I

Скрещивание со штаммом Е.соН К12 №238 (Щ-в Ка1-г); отбор Тс-г Ыа1-г транскоъюгантов

Таблица 3 Результаты опытов по выделению активных транспозонов

Штамм Скрещивание с Е. coli АВ1456 Скрещивание с К coli JF238

Tc-r Str-r, в 0,1 мл [N1 Hg-r Str-r, в 0,1 мл m Частота переноса [T/N] Tc-r Nal-r всего Из них Hg-r Nal-r

ED23-33 3x106 3x105 10" 20 20(100%)

ED94-62a 3x10" 2x10' 7,0x1o"6 18 18 (100%)

ED23-5 6x10" 2x10' 3,3x10"5 15 15(100%)

ED23-70 3x10" 4,5x10'' 1,5x10Ч 16 16(100%)

ED72-65 2x106 7,5x10' ЗДхЮ-5 10 10(100%)

А19-1 5x106 4x10' в.ОхЮ"4 12 12 (100%)

Таблица 4 Поиск транспозонов устойчивости к ртути в коллекции _ штаммов грамотрицательных древних бактерий_

Штамм Скважина Возраст, тыс.лет Род Гибридизация с зондом на транспозазу:

Тп21 Тп5041 Тп5053 Тп5044 Тп5042

ED23-1 6ХЮ 20-40 Р. sp - - - - -

ED23-5 6ХЮ 20-40 Р. sp - - + - -

ED23-9 6ХЮ 20-40 Р. sp - - - - -

ED23-10 6XIO 20-40 Р. sp - - - - +

ED23-26 6ХЮ 20-40 P. fluor. - - - - +

ED23-26a 6ХЮ 20-40 P. fluor. - - - - +

ED23-26b 6XIO 20-40 P.sp - - - - -

ED23-33 6ХЮ 20-40 P. putida - - + - -

ED23-70 6ХЮ 20-40 P. fluor. - + - - -

EDM6-1 6ХЮ 20-40 P. putida - - - - -

ED72-65 6ХЮ 20-40 P. putida - - + - -

ED94-62a 6ХЮ 20-40 P. fluor. - - - - +

ED94-71 6ХЮ 20-40 P. fluor. - - - - +

EDM7-2 6ХЮ 20-40 Plesiomonas sp - - - - -

5143-1 6ХЮ 20-40 h/o* - - - - -

M4-4 3/89 300 h/o - - - - +

A19-1 4/90 5-10 P. sp + - - - -

0227-1 13/91 1800 h/O + - + - -

107 5/93 1000 P. putida - - - - -

120 5/93 1000 h/O - - • - -

135 4/93 2000 h/o - - - + -

165 5/93 1000 h/o - - - - -

200-2 3/93 600 P. putida - - - + -

* н/о означает, что систематическое положение штамма не установлено.

Затем коллекция устойчивых к ртути древних бактерий была проверена на наличие в ней известных ранее транспозонов грамотрицательных бактерий: Тп21, Тп5053, Тп5041, Тп5044.

Tn 21 дс)г1дтаг ш »

Tn5041

М М

tnpA I»

т orfP - orf Y (прС

с

Tn5044 КР№Ё§

2

Tn5053 шетс^зМ^в^с^э F T| , 1 kb t c

Рис.6. Зонды, использованные при поиске основных типов ртутных транспозонов.

Обозначение генов mer-оперона такое же, как на рис. 2. Гены tnpA и шрВ кодируют транспозазу и резольвазу соответственно; гены tniA, tniB и tmQ контролируют транспозицию, а глрЯ-резолюцию Тп5053; res - res-область. 1 (orf'J), 2 (iorJ2), orfY, uijX58 - гены с неизвестными функциями, входящие в состав mer~ оперонов. ку, аХ, Rorfl, orfQ, orfR -фрагменты генов и мобильных элемен-тов, входящие в состав Тп5041. £г°У-сигма-подобный фактор, входящий в состав wer-оперона Тп5044.

На рис. 6 представлена молекулярно-генетическая структура этих транспозонов, а также фрагменты, использованные в качестве зондов при их поиске в коллекции штаммов мерзлотных бактерий.

Из проверенных 23 штаммов 8 дали гибридизацию по крайней мере с одним из четырех зондов (табл. 4). В мерзлотной коллекции были обнаружены все основные типы ртутных транспозонов, распространенных среди современных природных бактерий.

4. Исследование молекулярно-генетической структуры новых транспозонов устойчивости к ртути.

В опытах, описанных в предыдущем разделе, в коллекции устойчивых к ртути древних бактерий был обнаружен ряд штаммов, содержавших функционально активные ртутные транспозоны, способные перемещаться в

ТпХ (8667 Ьр)

TIR

TIR

гипотетический предшественник

«

тег орегол

In2(11 kb)

Тп21 (1Э672 Ьр)

1783

15383

19263

',19305

Тп5060 (8667 Ьр)

Рис. 7. Сравнительный анализ структуры Тп5060 и Тп21

Обозначение генов такое же, как на рис. 6. Концевые инвертированные повторы (TIR) изображены без соблюдения масштаба. Координаты замен указаны по последовательности Tri21 (АР000342). Замены в нуклеотидной последовательности Тп5060 относительно Тп21 были следующими: 1783, G->A; 15383. Т-»С (lle->Val); 19263, A->G (Thr->Ala); 19305, G->C (Gly->Arg).

плазмиды широкого круга хозяев. В данной работе для дальнейшего исследования транспозонов было отобрано два таких штамма: Pseudomonas sp. AI 9-1 и Pseudomonas fluorescens ED94-62a.

У первого штамма была обнаружена гомология с транспозазой Тп21, при отсутствии гибридизации с зондом на интегразу. Кроме того А19-1 содержал активный транспозон. Такие свойства транспозона из А19-1 позволяли предположить, что он может являться безинтегронным предшественником Тп21, существование которого было предсказано рядом авторов (Tanaka et al., 1983; Liebert et al„ 1999).

Штамм Pseudomonas fluorescens ЕД94-62а в опытах по гибридизации не проявлял гомологии пи с одним из использованных зондов на транспозазы известных транспозонов и, тем не менее, из него удалось получить транспозицию мобильного элемента, обуславливающего устойчивость к ртути. Поэтому было решено подробно исследовать переместившийся неизвестный транспозон из этого штамма.

4.1. «Древний» транспозон Тп5060 - безинтегронный предшественник Тп21

Была определена полная нуклеотидная последовательность нового транспозона из штамма А19-1, названного Тп5060 (регистрационный номер AJ551280). Результаты сравнительного анализа структуры Тп21 и Тп5060 схематически представлены на рис. 7. Видно, что, в отличие от Тп21, Тп50б0 не содержит интегрона 1п2 протяженностью 1 lkb. Остальные составные элементы обоих транспозонов почти полностью идентичны. Их отег-опероны

протяженностью 4 т.п.н. содержат гены merRTPCADE, гомологичные между собой более, чем на 99.9% (две замены обнаружили только в гене merR и одну замену в гене иг/2). Транспозиционные модули обоих транспозонов, состоящие из концевых повторов, генов tnpA и tnpR и res-сайта и имеющих протяженность 3,6 т.п.н отличаются единственной заменой в гене tnpA (рис. 7).

Ранее было высказано предположение (Brown et al., 1986; Liebert et al., 1999) о том, что в результате внедрения In2 в транспозон-предшественник Тп21 исходная рамка urf-2 (Liebert et al., 1997, 2000) разделилась на две части: 5'-концевую (сохранившую название urf-2) и 3'-концевую, названную tnpM. Структура Тп5060, который имеет полноразмерный ген urf-2, подтверждает эту гипотезу. Полностью соответствуют ей и результаты сравнения структуры и размера гена urf-2 Тп5060 с таковыми гипотетического «гибридного» гена urf2M Тп21 (Liebert et al., 1999), образованного путем слияния последовательностей urf-2 и tnpM, остающихся после исключения интегрона (и вычетом прилежащих 5-ти пар нуклеотидов, возникших при дупликаци мишени).

В соответствии с общепринятой гипотезой, предшественником ряда современных транспозонов клинических бактерий, родственных Тп21, был ртутный транспозон, не содержащий интегрона (Tanaka et al., 1983; Liebert et al., 1999). В связи с этим в ряде работ проводили сравнительный анализ структуры 7л2/ и близкородственных ему безинтегронных транспозонов (Tanaka et al., 1983; Lett et al., 1985; Liebert et al., 1999; Mindlin et al., 2001; Essa et al., 2003), но ни один из них не удовлетворял требованиям, необходимых для транспозона-предшественника. Из всех известных безинтегронных транспозонов, Тп50б0 является самым близким по своей структуре и свойствам транспозону Тп21. И если не он сам, то ближайший его родственник может рассматриваться в качестве предшественника Тп21 и родственных ему транспозонов.

По-видимому, факт обнаружения ТпЗОбО в коллекции штаммов, изолированных из многолетнемерзлых отложений, т.е. распространенных в природных источниках задолго до наступления антибиотичской эры, нельзя считать случайным. В то же время ряд данных указывают на возможность существования 7п50б0-подобных транспозонов среди современных бактерий окружающей среды: 1) среди исследованных природных ртуть-устойчивых

штаммов грамотрицательных бактерий многие гибридизовались со специфическими зондами на гены tnpA и tnpR Тп21 (Dahlberg et al., 1995; Pearson et al., 1996); 2) 2 штамма, псевдомонад, содержащих транспозон Тп21А1п2, обнаружили в коллекции ртуть устойчивых штаммов, изолированых из ртутного месторождения в Киргизии (Kholodii et al., 2002).

Встраивание интегрона In2 в транспозон, прототипом которого является Тп50б0, оказалось чрезвычайно важным по своим последствиям, ибо привело к формированию обширной группы транспозонов с факторами множественной лекарственной устойчивости, распространившихся по всему миру (Grinsted et al., 1990; Osborn et al., 1997).

4.2. Ранее неизвестный транспозон TnS042: его структура и распространение среди современных и «древних» бактерий Исследование транспозона из штамма ЕД94-62а было начато с проведения рестрикционного анализа мобильного элемента, переместившегося в опытах по транспозиции на плазмиду RP1. Рестрикционный анализ переместившегося транспозона, названного Тп5042, подтвердил его уникальность. Данный транспозон является одним из самых маленьких ртутных транспозонов: его размер около 7 т.п.н.

Анализ определенной нами нуклеотидной последовательности Тп5042 (AJ563380, AJ563381) ещё раз подтвердил, что это новый несоставной транспозон, неродственный описанным ранее в литературе. Оказалось, что больше всего транспозиционный модуль Тп5042 сходен с мобильными элементами из семейства IS66. Мобильные элементы из этого семейства обычно кодируют три или четыре открытые рамки считывания (tnpA, tnpB, tnpC, вовлеченные в процесс транспозиции, и у некоторых представителей семейства имеется дополнительно orf4, функции которого неизвестны) и ограничены несовершенными инвертированными повторами размером от 13 до 30 п.н. (Mahillon & Chandler, 1998; Han et al., 2001) При транспозиции члены семейства IS66 вызывают дупликацию последовательности мишени размером 8 п.н. (Han et al., 2001). Элементы из семейства IS66 широко распространены среди грамотрицательных бактерий, принадлежащих к родам Agrobacterium, Rhizobium, Escherichia, Pseudomonas и Vibrio (Han et al., 2001).

♦©с

Е N

i '

Т. р| 9, А, Р

Тп5042 ГЕР94-62а)

Т L 1 Î

JUL

JJL

Рис. 8. Структура Тп5042ц его распространение среди штаммов современных бактерий.

А Генетическая органн )аиня Тп504> и рестрикционныс карты его вариантов В верхней части рисунка приведена рестрикии-_ Тп5042 vl онная/1енс1ическая карта Тп5042. (NZ2) под которой длинным белым прямоугольником обозначен фраг-- Tn5042 v2 мент, использованный в качестве (NZ13) зонда Обозначение генов mer-оперона такое же, как на рис. 2: А, _ Тп5042 v3 В, С-гены транспозиции тпрЛ, tnpB (NZ15J „ tnpC. Черные треугольники

изображают TIR Тп5042 (не в мас-т 115042 »4 штабе). Серыми линиями под "(LS22-3) картой обозначены отссквсниро-ванные районы последовательности Тп5042. Ниже приведены рес-фшошонные карш чешрех современных вариантов Тп5042 (отсек-венированные участки показаны черными прямоугольниками). Обозначения рестрикционных сайтов: B-ig/П; E-EcoRI; N-A'col. Б. Результаты одного из опытов по поиску вариантов Тп5042 среди 9гп современных штаммов бактерий

Названия штаммов приведены над Итпи фотографией, а справа указан раз-

i в т п н меР характерных внутренних фраг-

ментов, вырезаемых EcoKUNcol.

Тп5042 кодирует три полноразмерные открытые рамки считывания, проявляющие гомологию с генами tnpA, tnpB и tnpC других членов семейства (рис. 8 и 9). Длина генов tnpA, tnpB и tnpC составляет 390, 345 и 1506 п.н. соответственно. Ближайшим гомологом транспозиционного модуля Тп5042 является ISPreí (Maeda et. al., 2003) (53,5%, 91% и 77,7% гомологии по а.к. последовательности белков TnpA, TnpB TnpC, соответственно), также принадлежащий к семейству IS66, согласно сделанному нами анализу последовательности плазмиды pCARl из штамма Ps. resinovorans СА10 (АВ088420). Кроме того Тп5042 содержит фрагмент рамки orf4 (342 п.н.), гомологичной на 70% соответствующему гену из ISPre3 (ее протяженность в ШРгеЗ составляет 594 п.н.). Последовательность orf4 у Тп5042 обрывается за 34

Б

5' - СТААССв---3'

5' - СТААССетСССЮССАОСАСС------- 3' 1x6042 1Ы.

5' - СТААСССТССОААСТАСАСС------- 3' Та5042 1М1

5' - вТААСССТАСОСТСОСТАСС------- 3' ШРгеЗ ЮЬ

5' - СТААСССТССОСССТССАСС------- 3' ШРгеЗ тя

5' - СТААСССТАСАОССТСА АСССТ----- 3' 1Ш8 ЖЬ

5' - СТААСССТАСАОСОАОООСССТ----- 3' 18Ес8

5' - СТААССССАТСАТТ ТАААССОТСТТ--- 3' 18679 ШЬ

5' - СТААСССОСТСОССАОААСССТАТТ--- ■3' \S679

5' - СТАТСССССОССТССАТСССАТТСАТТ - 3' Ш866 ШЬ

5' - СТАТСССОСТССТССОТСССАТТСАТТ - 3' 1Ш6 та

Рис. 9. А. Схема строения транспозиционного модуля Тп5042 и некоторых представителей семейства 1566. Прямоугольниками обозначены гены 1прА, ШрВ, ШрС и ог/4; размер рамок указан под ними в п.н. Концевые инвертированные повторы обозначены черными треугольниками (не в масштабе).

Б. Нуклеотидные последовательности концевых инвертированных повторов Тп5042 и некоторых представителей семейства 1566. Наверху представлена косенсусная последовательность Г/Лэ 1Б элементов семейства №66. Регистрационные номера в вепБапк последовательностей К элементов семейства 1866: Тп5042-А1653380и А1563381; /ЯРгеЗ-АВ088420; /5£св-АР071034; 15679-АВ024946; 15866- 1М25805

нуклеотида до конца гена тегВ (рис. 8 и 9). Кроме того недалеко от места обрыва эта рамка повреждена возникшим терминирующим кодоном TGA. Анализируя последовательности из базы данных, родственные Тп5042, мы обнаружили в плазмиде рОСТ из штамма Ps. putida TF4-1L (AJ245436) фрагмент /5-элемента, содержащего только участок гена tnpC, прилегающий к orf4, концевой инвертированный повтор, и полноразмерную открытую рамку, гомологичные соответственно tnpC, HR и orf4 из Тп5042. По-видимому IS-элементы, родственные Тп5042 и ISPre3, часто встречаются среди природных псевдомонад.

Тп5042 ограничен несовершенными инвертированными повторами размером 20 п.н, гомологичными на 75% концевым повторам IS элементов из семейства IS66 (рис. 9). При своем перемещении Тп5042 вызывает дупликацию ДНК-мишени 8 п.н, как и все другие представители семейства IS66. Транспозон Тп5042 содержит тег-оперон размером около 4,5 т.п.н. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов merR и merA проявляют 83% гомологии аналогичным генам Тп5041 (Х98999). Гомология с другими известными тег-оперонами 70-80%. В отличие от тег-оперона транспозона Тп5041, Тп5042 содержит дополнительно ген тегВ, нуклеотидная последовательность которого на 93% гомологична тегВ из отег-оперона другого мерзлотного транспозона Тп5058 (Y17897), обнаруженного в штамме Ps. sp ED23-33. Наличие merC в опероне Тп5042 мы доказали с помощью гибридизации со специфическим зондом на последовательность этого гена. Для проверки функциональной активности гена тег В, обнаруженного в тег-опероне Тп5042, были использованы изогенные штаммы, сконструированные на основе Pseudomonas putida BSA394-1 (табл. 5). Штаммы содержали одну из следующих плазмид: RP1, RPl::7n505.J, RP1::7>j505S, RPl::Tn5046, RP\::Tn5042, pED23-26, pED94-71 (две последние плазмиды - природные, выделенные из мерзлотных штаммов ED23-26 и ED94-71, соответственно, содержащие Тп5042). Все изогенные штаммы были рассеяны до отдельных колоний на чашках со средой LA, содержащей разные концентрации HgCb или фенилртуть ацетата (РМА). Результаты этих опытов представлены в таблице 5. Из таблицы 5 ясно видно, что тегВ транспозона Тп5042 функционально активен, т.к. штаммы, содержащие этот транспозон, устойчивы не только к солям ртути, но и к органомеркуриатам.

Таблица 5. Опыты по определению функциональной

активности гена тегВ Тп5042

Штамм Устойчивость к соединениям ртути:

НёС12 (10 мкг/мл) РМА (5мкг/мл)

В8А394-1 [суз, эи-г, Щ-в, РМА-э] — -

В8А394-1 (ЯР1) р^-в, РМА-в] — —

ВвА394-1 (К?\::Тгг5046) [Щ-г, РМА-в] + -

ВЭ АЗ 94-1 (ЯР1::Гл5055) [^-г, РМА-в] + -

В8А394-1 (Ш>1::Тю058) [Н§-г, РМА-г] + +

В8А394-1 (рЕБ23-26) [^-г, РМА-г] + +

В8А394-1 (рЕ094-71) [Нё-г, РМА-г] + +

В БАЗ 94-1 (ШЧ::Тп5042) [^-г, РМА-г] + +

«+»-хороший рост; «-»-отсутствие роста

Чтобы выяснить и сравнить частоту распространения Тп5042 среди древних и современных бактерий, был проведен поиск этого транспозона в коллекциях бактерий, имеющихся в ЛМГМ. Сначала был осуществлен предварительный скрининг Тп5042 в коллекциях современных устойчивых к ртути штаммов бактерий, выделенных из образцов собранных на территории европейской части России (77 штаммов) и в Новой Зеландии (17 штаммов). В качестве зонда был использован меченый №о1-№;о1 фрагмент Тп5042, содержащий всю его транспозонную часть. Суммарные ДНК, отобранных 16 штаммов, дававшие в колониях гибридизацию с этим зондом, были рестрицированы смесью рестриктаз Исо\ и ЕсоШ и затем повторно проверены на наличие гомологии с Тп5042 с помощью Саузерн-гибридизации. Для гибридизации по Саузерну был использован другой зонд, содержащий всю транспозонную часть Тп5042, а также ген тегВ и часть тегА (рис.8). Оказалось, что у 12 из 16 исследованных штаммов размеры внутренних фрагментов, гибридизующихся с зондом, полностью совпадают с величиной фрагментов у Тп5042; 2 штамма не дали положительного сигнала с зондом, а у двух штаммов число и размер гибридизующихся фрагментов отличались от таковых у Тп5042, но были сходны между собой

Из препаратов суммарной ДНК 4 штаммов (ЬЭ22-3, N7,2, N213, N215), идентичных по рестрикционной карте с Тп5042, были склонированы фрагменты, содержащие Тп5042. У клонов этих четырех вариантов Тп5042 были

определены участки нуклеотидных последовательностей, соответствующих генам тег А, 1прС и ЩрА (рис. 8). Суммарный размер «прочитанных» фрагментов для каждого варианта Тп5042 составлял от 440 до 680 п.н., и в них не было обнаружено ни одной нуклеотидной замены относительно исходного варианта Тп5042.

Все 23 штамма (включая ЕП94-62а) из коллекции грамотрицательных устойчивых к ртути бактерий, выделенных из мерзлоты (табл. 4), с помощью Саузерн-гибридизации с вышеописанным зондом были проверены на наличие в них штаммов, содержащих Тп5042. 6 из них (включая ЕП94-62а) дали четкую гибридизацию с использованным зондом (табл. 4); у 4 штаммов (ЕВ23-10, Е023-26, ЕВ23-26а, Е094-71) число и размер внутренних фрагментов, гибридизуюпдахся с зондом, полностью совпадали с таковыми у Тп5042. У штамма М4-4 гибридизовались только два фрагмента размером около 6,0 и 1,8 т.п.н..

Таким образом, впервые обнаруженный и описанный нами транспозон Тп5042 широко распространен как среди современных бактерий в географически удаленных областях Земного шара, так и среди древних бактерий, выделенных из многолетнемерзлых грунтов Колымской низменности.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Создание коллекции устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений позволило провести сравнительное изучение детерминант устойчивости к ртути современных и древних бактерий. Было обнаружено, что, как и у современных бактерий, у палеобактерий детерминанты устойчивости к ртути часто входят в состав плазмид и транспозонов (Миндлин и др., 2002). Весьма интересен тот факт, что среди совсем небольшого числа штаммов (23 штамма) из коллекции грамотрицательных ^-г палеобактерий были обнаружены все основные типы транспозонов, участвующих в распространении генов устойчивости к ртути среди современных почвенных бактерий. Обнаруженный нами в мерзлоте транспозон нового типа, Тп5042, оказался широко распространен как среди древних, так и среди современных бактерий. Полученные данные свидетельствуют о том, что все основные типы детерминант устойчивости к ртути были распространены в природе задолго до начала антропогенного загрязнения биосферы. Хозяйственная деятельность

человека вызвала образование новых сложных транспозонов, таких, как например Тп21, несущего одновременно детерминанты множественной лекарственной устойчивости и тег-оперон. Об этом мы можем судить по обнаружению в мерзлоте простого, содержащего только гены устойчивости к ртути, транспозона Тп5060, практически не отличающегося по нуклеотидной последовательности от Тп21.

выводы

1. Впервые была создана коллекция устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений, относящихся к родам Arthrobacter, Bacillus, Exiguobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Plesiomonas и порядку Myxobacteriales.

2. Показано, что у всех мерзлотных штаммов Acinetobacter и некоторых псевдомонад /яег-опероны локализованы на конъюгатнвных или неконъюгативных плазмидах.

3. В коллекции устойчивых к ртути палеобактерий обнаружены детерминанты устойчивости к ртути, высокогомологичные ртутным транспозонам и тег-оперонам, широко распространенным среди современных природных бактерий. Обнаружение у современных и древних бактерий пракшчески идентичных по нуклеотидным последовательностям детерминант устойчивости к ртути свидетельствует об их широком распространении еще до начала антропогенного загрязнения биосферы.

4. Впервые обнаружен и охарактеризован транспозон Тп50б0, практически идентичный Тп21, но не содержащий интехрона с кассетными генами множественной лекарственной устойчивости. Обнаружение Тп5060 служит подтверждением гипотезы о том, что клинические транспозоны из подгруппы Тп21 произошли от безинтегронного ртутного транспозона.

5. В штамме Ps. fluorescens из мерзлоты обнаружен и охарактеризован ртутный транспозон нового типа, названный Тп5042. Транспозиционный модуль Тп5042 гомологичен мобильным элементам из семейства IS66. Показано широкое распространение Тп5042 как среди мерзлотных, так и среди современных бактерий.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1.) Bogdanova E.S., Bass LA., Minakhin L.S., Petrova M.A., Mindlin S.Z., Volodin A.A., Kalyaeva E.S., Tiedje J.M., Hobman J.L., Brown N.L., Nikiforov V.G. (1998) Horizontal spread of mer opérons among gram-positive bacteria in natural environments. Microbiology: 144 (Pt 3), 609-620.

2.) Mindlin S., Kholodii G., Gorlenko Zh., Minakhina S., Minakhin L., Kalayeva E., Kopteva A., Petrova M., Yurieva O., Nikiforov V. (2001) Mercury resistance transposons of Gram-negative environmental bacteria and their classification. Res. Microbiol., 152,811-822.

3.) Петрова M.A., Миндлин C.3., Горленко Ж.М., Каляева Э.С., Соина B.C., Богданова Е.С. (2002) Резистентные к соединениям ртути бактерии из многолетпемерзлых отложений и перспективы их использования в сравнительных исследованиях детерминант ртуть-устойчивости. Генетика: 38, №11,1569-1574

4.) Петрова М.А., Миндлин С.З., Соина B.C., Горленко Ж.М., Никифоров В.Г. (1992) Устойчивые к ртути бактерии в посгоянномерзлых отложениях Колымской низменности. 1-я международная конференция «Криопедология» (Пущино, 10-14 ноября). Материалы конференции, стр. 206-217.

5.) Миндлин С.З., Богданова Е.С., Горленко Ж.М., Каляева Э.С., Холодий Г.Я., Коптева A.B., Минахин JI.C. , Минахина C.B., Петрова М.А., (1996) Коллекция природных штаммов бактерий, устойчивых к ртути, в исследованиях генов и транспозонов, определяющих ртуть-устойчивость. Международная конференция. Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы (Пермь, 8-11 октября). Тезисы докладов, стр.68.

6.) Миндлин С.З., Петрова М.А., Минахина C.B., Холодий Г.Я. (2000) Транспозоны устойчивости к ртути древних бактерий. II съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 1-5 февраля), Тезисы докладов, стр. 13.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 16.07.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 545. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

»12784

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петрова, Майя Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. МИКРООРГАНИЗМЫ В МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ ОТЛОЖЕНИЯХ.

1.2. УСТОЙЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ К РТУТИ.

1.2.1. Содержание устойчивых к ртути бактерий в природных популяциях.

1.2.2. Механизмы устойчивости к ртути.

1.2.3. Строение тег-оперонов и их распространение в природных популяциях бактерий.

1.2.4. Участие плазмид в переносе детерминант устойчивости к ртути.

1.2.5. Транспозоны устойчивости к ртути.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. ОТБОР И ДОСТАВКА ОБРАЗЦОВ.

2.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБРАЗЦОВ ПОЧВ И ПОРОД.

2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАЛОВОГО СОДЕРЖАНИЯ РТУТИ В ОБРАЗЦАХ.

2.4. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И АНТИБИОТИКИ.

2.5. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ И КАЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА МИКРООРГАНИЗМОВ, УСТОЙЧИВЫХ К РТУТИ.

2.6. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР.

2.7. ЛАБОРАТОРНЫЕ ШТАММЫ БАКТЕРИЙ.

2.8. ПЛАЗМИДЫ.

2.9. ОПЫТЫ ПО КОНЪЮГАТИВНОМУ ПЕРЕНОСУ ПЛАЗМИД.

2.10. МЕТОД ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ ДНК.

ГРУБЫХ ЛИЗАТОВ.

2.11. ОПЫТЫ ПО ТРАНСПОЗИЦИИ.

2.12. ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ МЕТОДЫ.

2.12.1. Выделение суммарной ДНК из штаммов грамотрщательных бактерий.

2.12.2. Выделение суммарной ДНК из штаммов грамположительных бактерий.

2.12.3. Рестрикция ДНК.

2.12.4. Клонирование фрагментов ДНК.

2.12.5. Трансформация Е.соИ.

2.12.6. Электрофорез ДНК.

2.12.7. Элюция ДНК из легкоплавкой агарозы.

2.12.8. Радиоактивное мечение зондов для гибридизации.

2.12.9. Блоттинг-гибридизация ДНК-ДНК.

2.12.10. Секвенирование ДНК.

2.12.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. ВЫДЕЛЕНИЕ УСТОЙЧИВЫХ К РТУТИ БАКТЕРИЙ ИЗ МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ ОТЛОЖЕНИЙ.

3.1.1. Гарантии древности бактерий, выделяемых из мерзлоты.

3.1.2. Создание коллекции устойчивых к ртути бактерий.

3.2. ПЕРВИЧНЫЙ АНАЛИЗ ДЕТЕРМИНАНТ УСТОЙЧИВОСТИ К РТУТИ В ШТАММАХ МЕРЗЛОТНОЙ КОЛЛЕКЦИИ.

3.2.1. Определение наличия тег-оперона в мезофильных штаммах древних бактерий.

3.2.2. Сравнительный анализ структуры тег-оперонов древних и современных штаммов термофильных бацилл.

3.2.3. Анализ структуры тег-оперонов ацинетобактеров с помощью специфического зонда

3.3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ДЕТЕРМИНАНТ УСТОЙЧИВОСТИ К РТУТИ.

3.3.1. Детерминанты устойчивости к ртути, локализованные на плазмидах.

3.3.2. Детерминанты устойчивости к ртути, входящие в состав транспозонов.

3.4. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ НОВЫХ ТРАНСПОЗОНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К РТУТИ.

3.4.1. «Древний» транспозон Тп5060 - безинтегронный предшественник Тп21.

3.4.2. Ранее неизвестный транспозон Тп5042: его структура и распространение среди современных и «древних» бактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное изучение оперонов и транспозонов устойчивости к ртути палеобактерий и современных бактерий"

В настоящее время горизонтальный перенос генов считается одним из основных механизмов эволюции, обеспечивающих быстрые изменения генома микроорганизмов, позволяющие им адаптироваться к неблагоприятным условиям внешней среды. Это было показано при исследовании в основном клинических бактерий. Горизонтальный перенос генов является причиной вспышек эпидемий, возникновения патогенных штаммов у ранее непатогенных видов бактерий, быстрого появления и стремительного распространения множественной лекарственной устойчивости у разных видов клинических бактерий. После открытия островов патогенности у бактерий у исследователей еще больше возрос интерес к изучению горизонтального переноса генов. Однако, совершенно очевидно, что все эти данные имеют ограниченное значение в связи с тем, что были получены при изучении клинических бактерий, которые живут в условиях сильного искусственного давления отбора, вызванного применением лекарственных препаратов.

Вопрос о масштабах и механизмах горизонтального переноса генов в природных популяциях до сих пор мало изучен, хотя, несомненно, он представляет большой научный интерес, с точки зрения исследования механизмов эволюции геномов бактерий, и имеет прикладное значение в связи с оценкой риска интродукции в природные экосистемы бактерий, созданных методами генной инженерии.

В лаборатории молекулярных основ генетики (ЛМГМ) ИМГ РАН на протяжении почти 20 лет ведется изучение горизонтального переноса генов на примере детерминант устойчивости к соединениям ртути из природных экосистем (почв, водоемов, ртутных месторождений и т.п.). Полученные данные позволили сделать вывод о том, что в природе разнообразие плазмид и транспозонов, несущих систему генов, обеспечивающих устойчивость к соединениям ртути (тег-оперон), значительно больше, чем в клинике. Тем не менее, в разных частях земного шара обнаружено относительно небольшое число одних и тех же детерминант устойчивости или их гомологов, присутствующих у большинства выделяемых устойчивых к ртути бактерий. В связи с этими данными возникает вопрос: является ли такое доминирование небольшого числа детерминант устойчивости в природных микробоценозах естественным, или оно явилось следствием антропогенного загрязнения биосферы на протяжении последнего столетия. Чтобы ответить на этот вопрос, надо исследовать экосистемы, никогда не подвергавшиеся антропогенному воздействию. Таким, пожалуй единственным в мире, природным хранилищем микробных сообществ, никогда не испытывавших влияния хозяйственной деятельности человека, являются многолетнемерзлые отложения («вечная» мерзлота). К настоящему времени не только достоверно установлен факт длительного (до 5 млн лет) сохранения жизнеспособных микроорганизмов в мерзлоте, но и показано, что их содержание в многолетнемерзлых грунтах, как правило, не намного уступает таковому в современных тундровых почвах. Учитывая, что устойчивые к ртути бактерии, хотя бы в небольших количествах, встречаются даже в незагрязненных экосистемах, можно предположить, что их можно выделить и из многолетнемерзлых отложений. Однако до сих пор никто специально не выделял из «вечной» мерзлоты микроорганизмы, устойчивые к соединениям ртути, антибиотикам и т.п. с целью сравнительного изучения их детерминант устойчивости с современными.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы, являющейся частью обширного исследования, ведущегося в ЛМГМ ИМГ РАН, было создание коллекции бактерий, устойчивых к соединениям ртути, из многолетнемерзлых отложений и сравнительное изучение детерминант устойчивости к ртути у древних и современных бактерий. В задачи данного исследования входило:

1. Выделение устойчивых к ртути бактерий из образцов многолетнемерзлых отложений Колымской низменности и определение их систематического положения.

2. Мобилизация детерминант устойчивости к ртути и выделение активных транспозонов Нд-г штаммов древних бактерий.

3. Идентификация с использованием специфических зондов известных транспозонов устойчивости к ртути, распространенных среди современных почвенных бактерий, у штаммов из мерзлотной коллекции.

4. Молекулярно-генетическое исследование ранее неизвестных транспозонов устойчивости к ртути у древних бактерий.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые была создана и охарактеризована коллекция устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений. Показано значительное разнообразие содержащихся у штаммов этой коллекции детерминант устойчивости к ртути. У древних бактерий были обнаружены транспозоны, высокогомологичные широко распространённым современным природным транспозонам. Впервые был обнаружен и исследован простой транспозон, названный Тп5060, близкородственный предку сложного траспозона множественной лекарственной устойчивости Тп21, широко распространенного среди клинических штаммов бактерий. Также обнаружен и охарактеризован ранее неизвестный транспозон Тп5042 и показано его широкое распространение как в мерзлоте, так и среди штаммов современных природных бактерий. Полученные данные свидетельствуют о том, что широко распространенные среди современных природных штаммов бактерий детерминанты устойчивости к ртути возникли и начали перемещаться задолго до начала антропогенного загрязнения биосферы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Петрова, Майя Александровна

выводы

1. Впервые была создана коллекция устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений, относящихся к родам Arthrobacter, Bacillus, Exiguobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Plesiomonas и порядку Myxobacteriales.

2. Показано, что у всех мерзлотных штаммов Acinetobacter и некоторых псевдомонад тег-опероны локализованы на конъюгативных или неконъюгативных плазмидах.

3. В коллекции устойчивых к ртути палеобактерий обнаружены детерминанты устойчивости к ртути высокогомологичные ртутным транспозонам и тег-оперонам широко распространенным среди современных природных бактерий.

4. Обнаружение у современных и древних бактерий практически идентичных по нуклеотидным последовательностям детерминант устойчивости к ртути свидетельствует об их широком распространении еще до начала антропогенного загрязнения биосферы.

5. Впервые обнаружен и охарактеризован транспозон Тп5060, практически идентичный Тп21, но не содержащий интегрона с кассетными генами множественной лекарственной устойчивости. Обнаружение Тп5060 служит подтверждением гипотезы о том, что клинические транспозоны из подгруппы Тп21 произошли от безинтегронного ртутного транспозона.

6. В штамме Ps. ßuorescens из мерзлоты обнаружен и охарактеризован ртутный транспозон нового типа, названный Тп5042. Транспозиционный модуль Тп5042 гомологичен мобильным элементам из семейства IS66. Показано широкое распространение Тп5042 как среди мерзлотных, так и среди современных бактерий.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Создание коллекции устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений позволило провести сравнительное изучение детерминант устойчивости к ртути современных и древних бактерий.

Было обнаружено, что у бактерий из мерзлоты детерминанты устойчивости к ртути часто входят в состав плазмид и транспозонов, что характерно и для современных штаммов (Миндлин и др., 2002).

Весьма интересен тот факт, что среди совсем небольшого числа штаммов (23 штамма) из коллекции грамотрицательных ^-г бактерий из мерзлоты были обнаружены детерминанты устойчивости к ртути, гомологичные всем основным группам ртутных транспозонов, широко распространенных среди современных почвенных бактерий. Обнаруженный нами в мерзлоте новый транспозон Тп5042 также оказался широко распространен как среди древних, так и среди современных бактерий. Полученные данные свидетельствуют о том, что все основные типы детерминант устойчивости к ртути были распространены в природе задолго до начала антропогенного загрязнения биосферы. Хозяйственная деятельность человека вызвала образование новых сложных транспозонов, таких как, например, Тп21, несущего одновременно детерминанты множественной лекарственной устойчивости и тег- оперон. Об этом мы можем судить по обнаружению в мерзлоте простого, содержащего только гены устойчивости к ртути, транспозона Тп50б0, практически не отличающегося по нуклеотидной последовательности от Тп21.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петрова, Майя Александровна, Москва

1. Бабьева И.П., ЗеноваГ.М. 1983. Биология почв. М: МГУ.

2. Богданова Е.С., Миндлин С.З., Каляева Э.С., Никифоров В.Г. 1988. Изучение горизонтального переноса генов устойчивости к ртути в природных популяциях бактерий с помошью антител к ртуть-редуктазам. Мол. Генетика, Микробиология и вирусология 12: 16-23.

3. Бурашникова E.H., Гоготов И.Н. 1994. Свойства пурпурной несерной бактерии, выделенной из многолетней мерзлой породы Колымской низменности. Микробиология 63: 868-875.

4. Вайнштейн М.Б., Гоготова Г.И., Хиппе X. 1995. Сульфатвосстанавливающая бактерия из вечной мерзлоты. Микробиология 64: 514-518.

5. Виткус Г.А., Зелюкова Ю.В., Полуэктов Н.С. 1974. Атомно-адсорбционное определение ртути. Заводская лаборатория 40: 949-951.

6. Данилевич В.Н., Степашин Ю.Г., Воложанцев H.H., Волковой А.И. 1980. Выделение и характеристика делеционных мутантов ts плазмиды pEGl. Генетика 16: 1958-1966.

7. Звягинцев Д.Г., Благодатский С.А., Гиличинский Д.А., Воробьева Е.А., Хлебникова Г.М, Архангелов A.A., Кудрявцева Н.И. 1985. Длительность сохранения микроорганизмов в постоянномерзлых осадочных породах и погребенных почвах. Микробиология 54: 153-163.

8. Звягинцев Д.Г., Федоров-Давыдов Д.Г., Хлебникова Г.М, Кудрявцева Н.И., Воробьева Е.А., Гиличинский Д.А. 1988. Микробиологические исследования почв и педолитов в криолитозоне. в сб. «Естественная и антропогенная эволюция почв», Пущино, 57-73.

9. Звягинцев Д.Г. 1992. Микроорганизмы в вечной мерзлоте. Успехи микробиологии 25: 3-21.

10. Кабата-Пендиас А., Пендиас X. 1986. Микроэлементы в почвах и растениях. М: Мир.

11. Каляева Э.С., Холодий Г.Я., Басс И.А., Горленко Ж.М., Юрьева О.В., Никифоров В.Г. 2001. Тп5037 Тп2/-подобный ртутный транспозон, обнаруженный у Thiobacillus ferrooxidans. Генетика 37: 1160-1164.

12. Краткий определитель бактерий Берджи. 1997. М: Мир.

13. Лакин Г.Ф. 1990. Биометрия. М: Высшая школа.

14. Ломовская О.Л., Миндлин С.З., Хесин Р.Б. 1985. Изучение устойчивости к HgCh у Acinetobacter sp. Генетика 21: 1945-1952.

15. Межведомственный стратиграфический комитет СССР. 1982. Решения межведомственного стратиграфического совещания по четвертичной системе Востока СССР. Магадан.

16. Методы почвенной микробиологии и биохимии. 1980. М: МГУ.

17. Миллер Дж. 1976. Эксперименты в молекулярной генетике. М: Мир.

18. Миндлин С.З., Минахина C.B., Холодий Г.Я., Коптева A.B., Никифоров В.Г. 1996. Изучение встраивания Тп5053 и Тп402 в различные плазмиды. Генетика 32: 1426-1430.

19. Миндлин С.З., Басс И.А., Богданова Е.С., Горленко Ж.М., Каляева Э.С., Петрова М.А., Никифоров В.Г. 2002. Горизонтальный перенос генов устойчивости к соединениям ртути в природных популяциях бактерий. Мол. биология 36: 216-227.

20. Соина B.C., Лебедева Е.В., Голышина О.В., Федоров-Давыдов Д.Г., Гиличинский Д.А. 1991. Нитрифицирующие бактерии из вечномерзлых отложений Колымской низменности. Микробиология 60: 187-190.

21. Хлебникова Г.М., Гиличинский Д.А., Федоров-Давыдов Д.Г., Воробьева Е.А. 1990. Количественная оценка микроорганизмов в многолетнемерзлых отложениях и погребенных почвах. Микробиология 59: 148-155.

22. Цымбалюк Е.С. 1992. Электроиндуцируемая трансформация грамотрицательных бактерий. Автореф. дисс. канд. биол. наук. М.

23. Altschul S.F., Gish V., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403 410.

24. Barkay Т., Fouts D., Olson O. 1985. Preparation of a DNA probe for deteciton of mercury resistance genes in gram-negative bacteria communities. Appl. Environ. Microbiol. 49: 686-692.1. Л I

25. Barkay T. 1987 Adaptation of aquatic microbial communities to Hg stress. Appl. Environ. Microbiol. 53: 2725-2732.

26. Bogdanova E.S., Mindlin S.Z. 1991. Occurence of two structural types of mercury reductases among Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 91: 277-280.

27. Bogdanova E.S., Mindlin S.Z., Pakrova E., Kocur M., RouchD.A. 1992. Mercuruc resistance in environmental Gram-positive bacteria sensitive to mercury. FEMS Microbiol. Lett. 97: 95-100.

28. Bogdanova E.S., Minakhin L.S., Bass I.A., Volodin A.A., Hobman J. L., Nikiforov V.G. 2001. Class II broad-spectrum mercury resistance transposons in Grampositive bacteria from natural environments. Res.Microbiol.152: 503-514.

29. Brown N.L., Ford S.J., Pridmore R.D., Fritzinger D.C. 1983. Nucleotide sequence of gene from the Pseudomonas transposon Tn501 encoding mercuric reductase. Biochem. 22: 4089-4095.

30. Brown H.J., Stokes H.W. and Hall R.M. 1996. The integrons InO, In2, and In5 are defective transposon derivatives. J.Bacteriol. 178: 4429-4437.

31. Chang A.C., Cohen S.N. 1978. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacterid. 134: 1141-1156.

32. Collis C.M., Hall R.M. 1992a. Gene cassettes from the insert region of integrons are excised as covalently closed circles. Mol Microbiol. 6: 2875-2885.

33. Collis C.M., Hall R.M. 1992b. Site-specific deletion and rearrangement of integron insert genes catalyzed by the integron DNA integrase. J Bacteriol. 174: 1574-1585.

34. Dahlberg C. and Hermansson M. 1995. Abundance of Tn3, Tn21, and Tn507 transposase (tnpA) sequences in bacterial community DNA from marine environments. Appl. Environ. Microbiol., 61: 3051-3056.

35. De la Cruz F., Grinsted J. 1982. Genetic and molecular characterization of Tn21, a multiple resistance transposon from R100.1. J Bacteriol. 151: 222-228.

36. Dower W.J., Miller J.F., Ragsdale C.W. 1988. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic. Acids. Res. 16: 6127-6145.

37. Droge M., Puhler A., Selbitschka W. 2000. Phenotypic and molecular characterization of conjugative antibiotic resistance plasmids isolated from bacterial communities of activated sludge. Mol Gen Genet. 263:471-482.

38. Echardt T. 1978. A rapid method for the identification of plasmid desoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid 1: 584-588.

39. Essa A.M.M., Julian D.J., Kidd S.P., Brown N.L., Hobman J.L. 2003. Mercury resistance determinants related to Tn21, Tn 1696, and Tn5053 in Enterobacteria from the Preantibiotic era. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 1115-1119.

40. Gilichinsky D.A., Vorobyova E.A., Erokhina L.G., Fedorov-Davidov D.G., Chaikovskaya N.R. 1992. Long-term preservation of microbial ecosystems in permafrost. Adv. Space Res. 12: 255-263.

41. Gilichinsky D. 2002. Permafrost as a microbial habitat. In: Encyclopedia of environmental microbiology, Willey: 932-956.

42. Griffin H. G., Foster T. J., Silver S., Misra T. K. 1987. Cloning and DNA sequence of the mercuric- and organomercurial-resistance determinants of plasmid pDU1358. PNAS. 84:3112-3116.

43. Grinsted J., de la Cruz F., Altenbuchner J., Schmitt R. 1982. Complementation of transposition of tnpA mutants of Tn3, Tn21, Tn501, and Tnl721. Plasmid 8: 276-286.

44. Grinsted J., and Brown N. L. A 1984. Tn2/ terminal sequence within Tn501\ complementation of tnpA gene function and transposon evolution. Mol. Gen. Genet. 197: 497-502.

45. Grinsted J., De La Cruz F., Schmitt R. 1990. The Tn27 subgroup of bacterial transposable elements. Plasmid. 24: 163-189.

46. Gupta A., Phung L.T., Chakravarty L., Silver S. 1999. Mercury resistance in Bacillus cereus RC607: transcriptional organization and two new open reading frames. J.Bacteriol.181: 7080-7086.

47. Hall R.M., Stokes H.W. 1993 Intégrons: novel DNA elements which capture genes by site-specific recombination. Genetica90: 115-132.

48. Hall R.M., Brown H.J., Brookes D.E., Stokes H.W. 1994. Intégrons found in different locations have identical 5' ends but variable 3' ends. J. Bacteriol. 176: 6286-6294.

49. Han. C.-G., Shiga Y., Tobe T., Sasakawa C., Ohtsubo E. 2001. Structural and functional characterization of IS679 and ZStftf-family elements. J. Bacteriol. 183: 42964304.

50. Hart M.C., Elliott G.N., Osborn A.M., Ritchie D.A., Strike P. 1998. Diversity amongst Bacillus mer A genes amplified from mercury resistant isolates and directly from mercury polluted soil. FEMS Microbiol. Ecology. 27: 73-84.

51. Hobman J., Kholodii G., Nikiforov V., Ritchie D. A., Strike P., Yurieva O. 1994. The sequence of the mer operon of pMER327/419 and transposon ends of pMER327/419, 330 and 05. Gene 146: 73-78.

52. Hobman J.L., Brown N.L. 1997. Bacterial Mercury Resistance Genes. In Metal Ions in Biological Systems, NY: Marcel Dekker, 527-567.

53. Holt R. J., Strike P., Bruce K. D. 1996. Phylogenetic anlysis of tnpR genes in mercury resistant soil bacteria: the relationship between DNA sequencing and RFLP typing approaches. FEMS Microbiol. Lett. 144: 95-102.

54. Jobling M.G., Peters S.E., Ritchie D.A. 1988a. Plasmid-borne mercury resistance in aquatic bacteria. FEMS Microbiol. Letters 49: 31-37.

55. Jobling M.G., Peters S.E., Ritchie D.A. 1988b. Restriction pattern and polypeptide homology among plasmid-borne mercury resistance determinants. Plasmid. 20: 106112.

56. Kamali-Moghaddam M., Sundstrom L. 2000. Transposon targeting determined by resolvase. FEMS Microbiology Letters 186: 55-59.

57. Karasev, S., L. Gourina, E. Gavrish, D. Adanin, D. Gilichinsky, and L. Evtoushenko. 1998. Viable actinobacteria from the ancient Siberian permafrost. Earth Cryosphere 2: 67-75.

58. Kelly W.J., Reanney D.C. 1984. Mercury resistance among soil bacteria; ecology and transferability of genes, encoding resistance. Soil Biol. Biochem. 16: 1-8.

59. Khesin R.B., Karasyova E.V. 1984. Mercury-resistant plasmid in bacteria from a mercury and antimony deposit area. Mol. Gen. Genet. 197: 280-285.

60. Kholodii G. Ya., Gorlenko Zh. M., Lomovskaya O. L., Mindlin S. Z., Yurieva O. V., Nikiforov V. G. 1993a. Molecular characterization of an aberrant mercury resistance transposable element from an environmental Acinetobacter strain. Plasmid 30: 303-308.

61. Kholodii G.Ya., Yurieva O.V., Lomovskaya O.L., Gorlenko Zh.M., Mindlin S.Z., Nikiforov V.G. 1993b. Tn5053, a mercury resistance transposon with integron's ends. J. Mol. Biol. 230:1103-1107.

62. Kholodii, G., O. Yurieva, S. Mindllin, Z. Gorlenko, V. Rybochkin, and V.G. Nikiforov. 2000. Tn5044, a novel Tn3 family transposon coding for temperature-sensitive mercury resistance. Res. Microbiol. 151: 291-312.

63. Kholodii G., Gorlenko Zh., Mindlin S., Hobman J. and Nikiforov V. 2002. Tn5041-like transposons: molecular diversity, evolutionary relationships and distribuyion of distinct variants in environmental bacteria. Microbiology 148: 3569-3582.

64. Kholodii G.Ya., Bogdanova E.S. 2002a. Tn5044-conferred mercury resistance depends on temperature: the complexity of the character of thermosensitivity. Genetica 115: 233-241.

65. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. 1954. J. Lab. Clin. Med. 44:301-307.

66. Mahler I., Levinson H.S., Wang Y., Halvorson H.O. 1986. Cadmium- and mercury-resistant Bacillus strains from a salt marsh and from Boston Harbor. Appl. Environ. Microbiol. 52: 1293-1298.

67. Manafi M. and Kneifel W. 1990. Rapid methods for differentiating gram-possitive from gram-negative aerobic and facultative anaerobic bacteria. J. Appl. Bacteriol. 69: 822-827.

68. Martinez E., de la Cruz F. 1990. Genetic elements involved in Tn21 site-specific integration, a novel mechanism for the dissemination of antibiotic resistance genes. EMBOJ.9: 1275-81.

69. Maynard S.J., Dowson C.G., Sprott B.G. 1991. Localized sex in bacteria. Nature 349: 29-31.

70. Miller S.M., Massey V., Wiliams C.H., Ballou D.P., and Walsh C.T. 1991. Communication between the active sites in dimeric mercuric ion reductase: an alternating sites hypothesis for catalysis. Biochemistry 30: 600-2612.

71. Minakhina S.V., Kholodii G.Ya., Mindlin S.Z., Yurieva O.V., Nikiforov V.G. 1999. Tn5053 family transposons are res site hunters sensing plasmidal res sites occupied by cognate resolvases. Mol. Microbiol. 33: 1059-1068.

72. Misra T.K., Brown N.L., Haberstroh L., Schmidt A., Goddette D., Silver S. 1985. Mercuric reductase structural genes from plasmid R100 and transposon Tn501: functional domains of the enzyme. Gene 34: 253-262.

73. Misra T.K. 1992. Bacterial resistances to inorganic mercury salts and organomercurials. Plasmid 27: 4-16.

74. Nakamura K., Fujisaki T., Tamashiro H. 1986. Characteristics of Hg-resistant bacteria isolated from Minamata Bay sediment. Environ. Res. 40: 58-67.

75. Nakamura K., Silver S. 1994. Molecular analysis of mercury-resistant Bacillus isolates from sediment of Minamata Bay, Japan. Appl. Environ. Microbiol. 60: 4596-4599.

76. Newby D.T., Josephson K.L., Pepper I.L. 2000. Detection and characterization of plasmid pJP4 transfer to indigenous soil bacteria. Appl Environ Microbiol.66: 290296.

77. Ogawa H.I., Tolle C.L., Summers A.O. 1998. Physical and genetic map of the organomercury resistance (Omr) and inorganic mercury resistance (Hgr) loci of the IncM plasmid R831b. Gene 32: 311-320.

78. Olsen R.H., Shipley P.L. 1975. RP1 properties and fertility inhibition among P, N, W, and X incompatibility group plasmids. J Bacteriol.123: 28-35.

79. Olson B.H., Barkay T., Colwell R.R. 1979. Role of plasmids in mercury transformation by bacteria isolated from the aquatic environment. Appl. Env. Microbiol. Sept., 478-485.

80. Osborn A. M., Bruce K. D., Strike P., Ritchie D.A. 1995. Sequence conservation between regulatory mercury resistance genes in bacteria from mercury polluted and pristine environments. Syst. Appl. Microbiol. 18: 1-6.

81. Osborn A. M., Bruce K. D., Ritchie D.A. Strike P. 1996. The mercury resistance operon of the iricJ plasmid pMERPH exhibits structural and regulatory divergence from other Gramnegative mer operons. Microbiology 142: 337-345.

82. Osborn A.M., Bruce K.D., Strike P., Ritchie D.A. 1997. Distribution, diversity and evolution of the bacterial mercury resistance (mer) operon. FEMS Microbiol. Rev. 19: 239-262.

83. Osbourn S.E.V., Turner A.K. Grinsted J. 1995. Nucleotide sequence within Tn3926 confirms this as Tn2i-like transposable element and provides evidence for the origin of the mer operon carried by plasmid pKLH2. Plasmid 33: 25-29.

84. Pearson A.J., Bruce K.D., Osborn A.M., Ritchie D.A., Strike P. 1996. Distribution of class II transposase and resolvase genes in soil bacteria and their association with mer genes. Appl Environ Microbiol. 62: 2961-5.

85. Radstrom P., Skod O., Swedberg G., Flensburg J., Roy P.h., Sundstrom L. 1994. Transposon Tn5090 of plasmid R751, which carries an integron, is related to Tn7, Mu, and the retroelements. J.Bacteriol. 176: 3257-3268.

86. Recchia G.D., Hall R.M. 1995. Gene cassettes: a new class of mobile element. Microbiology 141: 3015-3027.

87. Reniero D., Mozzon E., Galli E., Barbieri P. 1998 Two aberrant mercury resistance transposons in the Pseudomonas stutzery plasmid pPB. Gene 208: 37-42.

88. Riha V., Namburska K. 1985. The frecuency of bacteria resistant to heavy metals in ponds of southern Bohemia. Heavy Metals Water Organ: 155-167.

89. Rivkina, E., D. Gilichinsky, S. Wagener, J. Tiedje, and J. McGrath. 1998. Biogeochemical activity of anaerobic microorganisms from buried permafrost sediments. Geomicrobiology Journal 15: 187-193.

90. Saitia S., Narula N. 1989. Heavy metals resistance and hydrocarbon utilization by Azotobacter chroococcum. Indian J. Microbiol. 29: 213-215.

91. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab. Press.

92. Shapiro J.A., Sporn P. 1977. Tn402: a new transposable element determining trimethoprim resistance that inserts in bacteriophage lambda. J. Bacteriol. 129: 16321635.

93. Shi, T., R. H. Reeves, D. A. Gilichinsky, and E. I. Friedmann. 1997. Characterization of viable bacteria from Siberian permafrost by 16S rDNA sequencing. Microbial Ecology 33: 169-179.

94. Schmidt F.R., Nocken E.J., Henschke R.B. 1989. Structure and function of hot spots providing signals for site-directed specific recombination and gene expression in Tn21 transposons. Mol. Microbiol. 3: 1545-1555.

95. Silver S., Kinscherf T.G. 1982. Genetic and biochemical basis for microbial transformations and detoxification of mercury and mercurial compounds. In Biodegradation and detoxification of environmental pollutants., Boca Raton, Florida, CRC Press, 85-103.

96. Silver S., Phung L.T. 1996. Bacterial heavy metal resistance: new surprises. Annu. Rev. Microbiol. 50: 753-789.

97. Smit E., Wolters A., van Elsas J.D. 1998. Self-transmissible mercury resistance plasmids with gene-mobilizing capacity in soil bacterial populations: influence of wheat roots and mercury addition. Appl. Environ. Microbiol. 64: 1210-1219.

98. Spangler W., Spigarelli J., Rose J., Flippiu., R., Miller H. 1973. Degradation of methylmercury by bacteria isolated from environmental samples. Appl. Microbiol 25: 448-493.

99. Stanish V.A., Arwas R., Bennett P.M., de la Cruz F. 1989. Characterization of Pseudomonas mercury-resistance transposon Tn502, which has a preferred inswertion in RP1. J. Gen. Mcrobiol. 135: 2909-2915.

100. Stokes H.W., Hall R.M. 1989. A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons. Mol. Microbiol. 3: 16691683.

101. Summers A.O., Silver S. 1978. Microbial transformation of metals. Ann. Rev. Microbiol.32: 637-672.

102. Summers A.O. 1986. Organization, expression, and evolution of genes for mercury resistance. Ann. Rev. Microbiol. 40: 607-634.

103. Tanaka M, Yamamoto T, Sawai T. 1983a. Fine structure of transposition genes on Tn2603 and complementation of its tnpA and tnpR mutations by related transposons. Mol Gen Genet. 191: 442-50.

104. Tanaka M, Yamamoto T, Sawai T. 1983b. Evolution of complex resistance transposons from an ancestral mercury transposon. J Bacteriol. 153: 1432-8.

105. Tiedje, J. M., M. A. Petrova, and C. Moyer. 1998. Phylogenetic diversity of archaea from ancient Siberian permafrost, p. 323. In: Abstract of 8 International Symposium on Microbial Ecology (ISME-8), Halifax, Canada.

106. Tsuda M., Minegishi K.-I., Lino T. 1989. Toluene transposons Tn4651 and Tn4653 are classll transposons. J. Bacteriol. 171: 1386-1393.

107. Turner A.K., de la Cruz F., Grinsted J. 1990. Temperature sensitivity of transposition of class II transposons. J. Gen. Microbiol. 136: 65-67

108. Vega C. 1986. Resistance to heavy metals by Pseudomonas aureus clinical isolates. Microbios 48: 159-163.

109. Velasco A., Acebo P., Flores N., Perera J. 1999. The mer operon of the acidophilic bacterium Thiobacillus ferrooxidans counterpart. Extremophiles 3: 35-43.

110. Vishnivetskaya, T., S. Kathariou, J. McGrath, D. Gilichinsky, and J. M. Tiedje. 2000. Low-temperature recovery strategies for the isolation of bacteria from ancient permafrost sediments. Extremophiles 4: 165-173.

111. Vorobyova, E., V. Soina, M. Gorlenko, N. Minkovskaya, N. Zalinova, A. Mamukelashvili, D. Gilichinsky, E. Rivkina, and T. Vishnivetskaya. 1997. The deep cold biosphere: facts and hypothesis. Fems Microbiology Reviews 20: 277-290.

112. Walker J., Colwell R. 1974. Mercury-resistant bacteria and petroleum degradation. Appl. Microbiol. 27: 285-287.

113. Wang Y., Moore M., Levinson H.S., Silver S., Walsh C., Mahler I. 1989. Nucleotide sequence of a chromosomal mercury resistance determinant from a Bacillus sp. with broad-spectrum mercury resistance. J. Bacteriol. 171: 83-92.

114. Womble D.D., Rownd R.H. 1988. Genetic and physical map of plasmid NR1: comparison with other IncFII antibiotic resistance plasmids. Microbiol Rev. 52: 43351.

115. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene. 33: 103-19.

116. Yurieva O., Kholodii G., Minakhin L., Gorlenko Zh., Kalyaeva E., Mindlin S., Nikiforov V. 1997. Intercontinental spread of promiscuous mercury resistance operons in environmental bacteria. Mol. Microbiol. 24: 321-329.

117. Zhou, J. Z., M. E. Davey, J. B. Figueras, E. Rivkina, D. Gilichinsky, and J. M. Tiedje. 1997. Phylogenetic diversity of a bacterial community determined from Siberian tundra soil DNA. Microbiology-Uk 143: 3913-39191. БЛАГОДАРНОСТИ

118. Я глубоко благодарна С.3. Миндлин за руководство работой, критическое обсуждение ее результатов и постоянную моральную поддержку.

119. Я также благодарна В.Г. Никифорову за постановку проблемы данного исследования и обсуждение полученных результатов.

120. Я хочу сказать огромное спасибо Ж.М. Горленко, Г.Я. Холодию, И.А. Басс, B.C. Соиной, A.B. Кульбачинскому, Э.С. Каляевой, Е.С. Богдановой за обучение методикам, а также интерес к данному исследованию и неоценимую помощь на всех этапах работы.

121. Я признательна И.А. Басс и Ж.М. Горленко за критические замечания и помощь при редактировании рукописи.